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Dissertação apresentada à Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em

Ciências

Área de Concentração: Genética

Leonardo Arduino Marano

ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE

MC1R ASSOCIADOS A FENÓTIPOS

HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA

POPULAÇÃO BRASILEIRA

Orientador: Prof. Dr. Celso Teixeira Mendes Junior

Ribeirão Preto

2011

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por

qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa,

desde que citada a fonte.

Catalogação da Publicação

Departamento de Genética

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

da Universidade de São Paulo

Marano, Leonardo Arduino

ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R ASSOCIADOS A

FENÓTIPOS HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA POPULAÇÃO

BRASILEIRA/ Leonardo Arduino Marano ; orientador Celso

Teixeira Mendes Junior – Ribeirão Preto, 2011.

Número de páginas: 130

Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, 2011

1 – MC1R. 2 – polimorfismos. 3 – pigmentação. 4 – população brasileira

Dissertação apresentada à Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em

Ciências

Área de Concentração: Genética

Nome: Leonardo Arduino Marano

Título: ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R

ASSOCIADOS A FENÓTIPOS HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA

POPULAÇÃO BRASILEIRA

Aprovado em:_______________

Banca Examinadora

Prof. Dr. ________________________Instituição_____________

Julgamento:_____________________Assinatura_____________





Dedico este trabalho aos

meus pais e amigos

Agradecimentos

Inicialmente agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Celso Teixeira Mendes

Junior, pela disponibilidade, boa vontade, paciência e ensinamentos oferecidos.

Agradeço por ter sido tão brilhante em sua primeira orientação de Mestrado e por ter

colaborado infinitamente em minha formação profissional;

Ao Prof. Dr. Aguinaldo Luiz Simões por todo conhecimento compartilhado e

ensinamentos durante esses mais de dois anos de convivência;

Ao Prof. Dr. Eduardo Antônio Donadi, por ter gentilmente cedido seu

laboratório, sem o qual, esse trabalho não teria sido realizado;

A todo o pessoal que conviveu comigo no laboratório do anexo A (Maria, Olívia,

João, Yara, Breno, Erick, Luciana, Camila e o amigo Rafael (Xixa), que mesmo

preferindo o laboratório do HC, aparecia às vezes por lá;

A todas as meninas da genética (Nadia, Lidia, Edilene, Natália, Cláudia Caixeta,

Edna, Cláudia Wiezel, Juliana, Renata, Yara (novamente) e Flávia Japa (Just Call my

Name, Just Call my Name, Salzano!!! Hahaha);

Ao pessoal da 41ª turma de Biologia da USP Ribeirão, por ainda tentarmos

manter contato, mesmo com a correria que nossa vida se tornou (graças a Deus) e

principalmente às meninas da Terra do Nunca (Carol, Gi e Carlinha), por entenderem

que às vezes eu dou uma desaparecida, mas que não me esqueço de vocês;

Às queridas técnicas Maria e Ana Lúcia, por todo o apoio, disposição e

conhecimento compartilhado (prometo dar menos trabalho pra vocês hehehe);

Às técnicas do anexo A, Flávia e Sandra, pela convivência, pelos ensinamentos,

pela paciência e pela disponibilidade em sempre me ajudar;

À minha família, por todo apoio que sempre me deram nessa minha caminhada

como pesquisador, pelo orgulho que têm de mim e pelo amor de sempre;

Ao Gustavo, não só por toda ajuda possível no ambiente de trabalho, me

acompanhando e me ensinando a rotina de laboratório, mas por ser, antes de tudo,

um grande amigo. Merci, mon ami.

A todos os doadores voluntários, sem o qual essa pesquisa não poderia ser

desenvolvida;

À Deus, por estar sempre pronto para nos auxiliar, mesmo quando nos

esquecemos de sua presença.

“When you open your mind to the impossible,

sometimes you find the truth”

Dr. Walter Bishop

RESUMO

Marano, L.A. ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R ASSOCIADOS A

FENÓTIPOS HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA POPULAÇÃO BRASILEIRA. 2011. 130 f.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de

São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.

Dentre os genes conhecidos por influenciarem a variação normal de pigmentação de

olhos, pele e cabelos em humanos, o gene MC1R (receptor de melanocortina 1) é o

mais bem caracterizado até o momento. A atuação do MC1R ocorre pela produção de

uma proteína transmembrana nos melanócitos, responsável pela regulação da

produção de melanina nos mesmos. Sabe-se que a atuação do MC1R determina a

proporção entre eumelanina (coloração castanha/preta) e feomelanina (coloração

amarela/vermelha) presente nos melanócitos. O presente trabalho tem como objetivo

analisar os SNPs conhecidos do gene MC1R com o propósito de se avaliar a influência

da diversidade deste gene em características como a presença de sardas e variação da

pigmentação dos olhos, pele e cabelos em humanos. Foram analisados 29 SNPs

conhecidos da região codificadora do gene MC1R em 131 indivíduos da região de

Ribeirão Preto, SP. A extração do DNA foi feita pela técnica de salting-out. A região

codificadora do gene MC1R (951pb) foi amplificada em uma única reação de PCR, a

qual foi seqüenciada em um analisador genético ABI-PRISM 310 por eletroforese

capilar, utilizando-se os mesmos primers empregados para a amplificação. Dos 29 SNPs

avaliados, 22 deles mostraram variação nas amostras estudadas, sendo que metade

deles demonstrou estar associados a características de pigmentação. Observou-se um

conjunto de SNPs associados claramente à fenótipos relacionados à feomelanina

(+1645 A, +1831 T,+1858 T e +2260 C), enquanto outros se relacionam à ocorrência de

eumelanina (+1558 G, +2322 G, +2346 A).A reconstrução de haplótipos gerou 31

haplótipos, sendo que quatro deles estavam associados à pele escura e dois outros

tinham freqüências significativamente baixas em pele clara. Um haplótipo se associou

a olhos verdes, enquanto dois outros tiveram associação com olhos castanho escuros.

Cores escuras de cabelo se relacionaram à seis haplótipos distintos enquanto cabelos

ruivos estavam associados à dois e um outro associado à cabelos loiros. Por fim, a

ocorrência de sardas foi significativamente relacionada à três haplótipos. O presente

trabalho apresenta associações significativas entre SNPs individuais e pigmentação de

olhos, cabelos e pele, sendo que nosso dados confirmam que tal gene também

desempenha papel relevante na variação de pigmentação na população Brasileira.

Palavras-chave: MC1R; polimorfismos; pigmentação; pele; olhos; cabelo; população

brasileira

ABSTRACT

Marano, L.A. MC1R GENE POLYMORPHISMS ANALYSIS ASSOCIATED WITH HUMAN

PIGMENTATION PHENOTYPES ON THE BRAZILIAN POPULATION. 2011. 130 f.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de

São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.

Among the known genes influencing eye, skin and hair normal pigmentation

variation, the MC1R (melanocortin 1-receptor) gene is the best characterized so far.

The activity of MC1R occurs due the production of a transmembrane protein in

melanocytes, responsible for regulating the production of melanin. It is known that the

performance of MC1R determines the ratio of eumelanin (brown color / black) and

pheomelanin (yellow / red) present in melanocytes. This study aims to analyze known

SNPs of the MC1R gene in order to evaluate the influence of this gene diversity on

features like freckles and pigmentation variation of eyes, skin and hair in humans. We

analyzed 29 known SNPs in the coding region of MC1R gene in 296 individuals from the

region of Ribeirão Preto, Brazil. DNA extraction was performed using the salting-out

technique. The MC1R gene coding region (951pb) was amplified in a single PCR

reaction, which was sequenced on a ABI PRISM-310 genetic analyzer by capillary

electrophoresis, using the same primers used for amplification. Of the 29 SNPs

evaluated, only 22 showed variation in the samples studied, half of them showing to

be associated with pigmentation characteristics. We observed a set of SNPs clearly

associated to pheomelanin (+1645 A, +1831 T,+1858 T e +2260 C), while others related

to eumelanin occurrence (+1558 G, +2322 G, +2346 A).Haplotype reconstruction

generated 31 haplotypes. Four of them were associated with dark skin and two had

significantly low frequencies in fair skin. One haplotype was associated with green

eyes, while two other had association with dark brown eyes. Darker hair color was

associated with six different haplotypes, whereas red hair was associated with two and

blonde hair with one haplotype. Finally, the absence or presence of freckles was

significantly related to three haplotypes. Our study shows significant associations

between individual SNPs and eyes, hair and skin pigmentation. The results presented

here confirm that this gene also plays a relevant role in the pigmentation variation in

the Brazilian population.

Keywords: MC1R; polymorphisms; pigmentation; skin; eyes; hair; brazilian

population

SUMÁRIO 1 – INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1

1.1 Identificação humana com fins forenses ............................................................................ 2

1.2 Polimorfismos de DNA ........................................................................................................ 3

1.3 Associação entre marcadores genéticos e características físicas ....................................... 8

1.4 Biologia da pigmentação ................................................................................................... 10

1.5 População Brasileira .......................................................................................................... 19

2 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS .................................................................................................. 22

2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................... 24

2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 24

3 – MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 25

3.1 Amostra populacional ....................................................................................................... 26

3.2 Determinação das características dos indivíduos ............................................................. 26

3.3 Análise Laboratorial .......................................................................................................... 27

3.4 Análises estatísticas dos dados ......................................................................................... 33

4 – RESULTADOS ......................................................................................................................... 41

4.1 Amostra populacional ....................................................................................................... 42

4.2 Freqüências alélicas e heterozigose .................................................................................. 44

4.3 Equilíbrio de Hardy Weinberg ........................................................................................... 45

4.4 Reconstrução haplótipos .................................................................................................. 46

4.5 Desequilibrio de ligação .................................................................................................... 53

4.6 Network ............................................................................................................................ 61

4.7 Associações encontradas .................................................................................................. 63

5 – DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 69

5.1 Dificuldades laboratoriais ................................................................................................. 70

5.2 Aspectos Populacionais ..................................................................................................... 71

5.3 Associações encontradas .................................................................................................. 77

6 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................................. 88

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 91

APÊNDICES ................................................................................................................................ 100

1

1 – INTRODUÇÃO

Introdução 2

1.1 Identificação humana com fins forenses

A identificação pode ser definida como um conjunto de procedimentos diversos

para individualizar uma pessoa ou objeto em meio a outros. Identificar uma pessoa é

determinar uma individualidade e estabelecer caracteres ou conjunto de qualidades

que a tornem diferente de todas as outras e igual apenas a si mesma (França, 2001).

A identificação humana se baseia principalmente em métodos provenientes das

áreas de antropologia forense, odontologia forense e radiologia (Alonso et al., 2005).

Dentre as características que auxiliam na identificação individual, pode-se citar como

sendo as principais: características morfológicas do esqueleto, arcada dentária,

impressões digitais, perfil de DNA, existência de defeitos congênitos, tatuagens,

cicatrizes e implantes médicos (Budowle et al., 2005).

Entretanto, no caso de acidentes, homicídios e outros crimes, diferentes níveis

de fragmentação e degradação corporal ocorrem de acordo com uma série de

circunstâncias, tais como forte impacto, elevadas temperaturas devido a explosões de

combustíveis, exposição dos cadáveres a condições ambientais variáveis, fogo, água e

até mesmo o atrito mecânico provocado pelos equipamentos utilizados pelas equipes

de busca e salvamento (Budimlija et al., 2003).

Desta maneira, o cadáver humano pode ser recuperado em um estado que

varia de praticamente intacto até totalmente degradado (Budowle et al., 2005). Nessas

situações nas quais ocorre a fragmentação do cadáver, algumas das técnicas de

identificação acima citadas podem se tornar ineficazes e, nesses casos, o perfil

genético determinado pelos polimorfismos de DNA pode se tornar a única ferramenta

informativa (Brenner e Weir, 2003; Budowle et al., 2005).

Introdução 3

Através de análises e comparações do DNA de indivíduos, diversos aspectos

legais podem ser solucionados, tais como testes de paternidade, casos criminais que

envolvam amostras biológicas, questões de heranças, identificação de vítimas de

desastres coletivos e identificação de pessoas desaparecidas a partir de restos mortais

(Alonso et al., 2005)

1.2 Polimorfismos de DNA

Os constantes progressos na área de biologia molecular vêm aumentando a

variedade de marcadores genéticos disponíveis para fins forenses. Apesar de o

genoma ser 99,9% compartilhado entre todos os humanos, existem variações em suas

seqüências chamadas polimorfismos, que podem ser usados tanto para diferenciar

como correlacionar indivíduos. O termo polimorfismo se refere à presença de mais de

um alelo em um gene ou marcador genético em uma população; um locus é dito

polimórfico quando o seu alelo mais comum tem freqüência igual ou inferior a 99%

(Cavalli-Sforza et al., 1994). Dentre os principais polimorfismos de DNA, destacam-se

os VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) ou minissatélites, os STRs (Short

Tandem Repeats) ou microssatélites, os retroelementos (inserções Alu e L1), as

Inserções/Deleções (InDels) e os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Estes

marcadores, caracterizados por mecanismos e taxas mutacionais peculiares, se

distribuem pelos cromossomos X, Y e autossômicos e pelo DNA mitocondrial (nesta

última molécula ocorrem basicamente apenas SNPs e InDels), os quais apresentam

padrões de herança distintos.

Introdução 4

A análise de marcadores polimórficos de DNA é atualmente reconhecida

mundialmente como uma técnica forense padrão para a investigação de uma ampla

variedade de crimes, desde pequenos delitos (tais como arrombamentos com

finalidade de furto, furto de automóveis ou lesões corporais) até crimes hediondos

(estupros ou latrocínios) (Bond, 2007). O material biológico eventualmente coletado

na cena do crime é processado para se obter um perfil de DNA que, ao ser comparado

com o perfil de DNA de suspeitos, auxilia a polícia a estabelecer uma conexão entre o

criminoso e a cena do crime, ou até mesmo a eliminar suspeitos durante as

investigações (Bond, 2007).

Os polimorfismos de DNA também vêm sendo empregados para a identificação

de vítimas de guerra ou de desastres de massa (Brenner e Weir, 2003; Alonso et al.,

2005). Um desastre de massa é a ocorrência súbita e inesperada de um evento que

resulta em grande número de vítimas fatais, sobreviventes com ferimentos graves,

dano material significativo, deslocamento considerável de pessoas e/ou perturbação

significativa da sociedade. Os desastres de massa podem ser de natureza acidental

(quedas de aviões, descarrilamento ou colisões de trens, incêndios e acidentes

químicos ou nucleares), natural (terremotos, tornados, enchentes e tsunamis) ou

provocada (ataques diretos em alvos significativos, bombardeamento de áreas

populosas, ataques suicidas, carros bombas e utilização de armas químicas e

biológicas) (Alonso et al., 2005; Budowle et al., 2005). Até mesmo fatos isolados, como

o desaparecimento de pessoas sob situações suspeitas ou que não deixam quaisquer

vestígios, quando acumulados ao longo do tempo, apresentam impacto no processo

de identificação humana que equivale ao de um desastre de massa (Budowle et al.,

2005).

Introdução 5

Os STRs, ou microssatélites, são os marcadores genéticos mais utilizados na

identificação humana. São polimorfismos gerados por um arranjo em sequência (in

tandem) de múltiplas cópias de um pequeno segmento de DNA (2 a 6 pares de base

apenas). Os STRs mais informativos podem apresentar mais de uma dezena de alelos

diferentes e milhares desses polimorfismos já foram identificados em humanos, sendo

que algumas estimativas apontam para a existência de cerca de um milhão de STRs

distribuídos pelo genoma humano (Butler, 2005; Goodwin et al., 2011).

Devido à diversidade observada em cada locus, tais marcadores são altamente

informativos. Os STRs mais polimórficos apresentam elevado poder de discriminação

(probabilidade de que dois indivíduos selecionados aleatoriamente possuam genótipos

distintos) e baixa probabilidade de match (probabilidade de que dois indivíduos

selecionados aleatoriamente possuam genótipos idênticos) (Butler, 2005; Goodwin et

al., 2011).

Após uma série de estudos relacionados à variabilidade dos STRs, o FBI (Federal

Bureau of Investigation), agência governamental norte-americana, selecionou um

conjunto de 13 STRs que passaram a compor o sistema CODIS (Combined DNA Index

System) em 1997. Em conjunto, esses 13 marcadores apresentam probabilidade de

match de aproximadamente 1,7 x 10-15, sendo que o perfil composto pelos genótipos

mais freqüentes de cada um dos 13 marcadores apresenta uma probabilidade de

ocorrência estimada em cerca de 1 em 160 bilhões (Butler, 2005). Em termos práticos,

esses valores asseguram que cada indivíduo da população mundial (exceto no caso de

gêmeos idênticos) apresente um perfil de marcadores genéticos polimórficos exclusivo

no que se refere aos 13 CODIS.

Introdução 6

No entanto, existem situações nas quais o material biológico se encontra tão

degradado que as amostras de DNA obtidas não estão intactas o suficiente para que o

protocolo padrão de tipagem de alguns tipos de polimorfismos proporcione resultados

suficientes para a obtenção de uma identificação confiável (Budowle et al., 2005).

Nesses casos, a análise de SNPs surge como uma abordagem alternativa para a

obtenção de maior quantidade de dados a partir de amostras biológicas altamente

degradadas (Budowle et al., 2005), atraindo, portanto, crescente interesse na área

forense (Sobrino et al., 2005). Os SNPs podem ser definidos como polimorfismos

criados por uma mutação de ponto que resulta na substituição de um nucleotídeo por

outro, proporcionando o surgimento de diferentes alelos. Embora estes marcadores

possam apresentar até quatro alelos, em sua grande maioria são bi-alélicos, o que os

tornam menos informativos para identificação humana do que os marcadores STRs já

validados (Brookes, 1999; Budowle et al., 2005).

Apesar da menor informatividade, os SNPs apresentam diversas características

que os tornam apropriados para aplicações forenses: (1) apresentam elevada

estabilidade e taxas de mutação muito reduzidas, (2) são facilmente analisados em

larga escala por meio de tecnologias modernas, (3) são facilmente adaptáveis a novas

tecnologias de automação laboratorial e, principalmente, (4) podem ser analisados em

pequenos fragmentos amplificados (amplicons de 60 a 80 pares de bases), o que é

vantajoso pelo fato de o tamanho do produto amplificado pela reação em cadeia da

polimerase (PCR) ser determinante para o sucesso da análise de amostras degradadas

(Sobrino et al., 2005). Estima-se que existam mais de 10 milhões de SNPs nas mais

diversas regiões do genoma; quando presentes em exons promotores, eles estão mais

Introdução 7

propensos a apresentarem alelos funcionalmente ou fisiologicamente ativos (Brookes,

1999; Sobrino et al., 2005).

Atualmente a aplicação do DNA humano no contexto forense se restringe

apenas a uma base comparativa, na qual perfis de DNA, normalmente baseados na

análise de STRs, são obtidos de materiais de cenas de crimes e comparados àqueles de

suspeitos em potencial. O mesmo ocorre nos casos de desastres em massa ou de

desaparecimentos, nos quais o perfil obtido de um indivíduo desconhecido é

comparado aos de familiares em potencial, ou mesmo a amostras obtidas nos

pertences da pessoa desaparecida (Prinz et al., 2007).

Se forem encontradas similaridades nos perfis de DNA, pode-se estabelecer

uma probabilidade de identidade ou parentesco. No entanto, suspeitos desconhecidos

(ou pessoas desaparecidas sem parentes conhecidos ou amostras de referência) não

poderão ser identificados utilizando-se os marcadores atualmente utilizados para

tipagem de DNA. Uma alternativa consiste na comparação de seu perfil genético com

aqueles inclusos em um banco de dados de DNA nacional, devido à crimes cometidos

anteriormente.

Outros países possuem seus bancos de perfis de DNA próprios. Nestes bancos,

como por exemplo, os do Reino Unido (http://www.npia.police.uk/en/13338.htm) e

dos Estados Unidos (http://www.fbi.gov/about-us/lab/codis/ndis-statistics), uma

grande quantidade de perfis está armazenada, sendo de grande utilidade para a

polícia. No Brasil, no entanto, o CODIS, cedido pelo FBI, está em fase de

implementação pela Polícia Federal, dependendo ainda de uma legislação que

regulamente a inclusão de perfis genéticos no país.

http://www.npia.police.uk/en/13338.htm

http://www.fbi.gov/about-us/lab/codis/ndis-statistics

Introdução 8

Mesmo quando estes bancos de perfis de DNA estão disponíveis, eles não são

grandes e completos o suficiente para representar a totalidade dos criminosos.

Portanto, muitas investigações acabam sem um suspeito conhecido, terminando como

casos que não podem ser solucionados com os marcadores de DNA usados atualmente

(Kayser e Schneider, 2009).

1.3 Associação entre marcadores genéticos e características físicas

Nos casos em que os bancos de DNA não podem auxiliar na identificação, seria

esperado que predições genéticas de características externamente visíveis de um

indivíduo pudessem ser de grande ajuda nas investigações policiais e no rastreamento

de suspeitos. Avanços recentes na genética parecem ter identificado marcadores

potencialmente úteis no futuro para a predição dessas características (Kayser e

Schneider, 2009).

Muitas mutações (SNPs) localizadas em regiões codificantes ou regulatórias

podem determinar substituições de aminoácidos na proteína, alterando as

propriedades funcionais da proteína traduzida e sendo expressas em fenótipos, que

são as características que se manifestam de maneira detectável no indivíduo. Estudos

que correlacionam genótipos a fenótipos, direcionados principalmente para

associações entre variantes genéticas e determinadas doenças (O'rahilly, 2009) ou

entre variantes genéticas e resposta de pacientes a determinadas drogas (Wang et al.,

2011), vêm sendo sistematicamente conduzidos. Neste contexto, em vista do grande

volume de dados produzidos, pode ocorrer a identificação de marcadores associados a

características aplicáveis no processo de identificação individual (Branicki et al., 2007).

Introdução 9

Na tentativa de se obter informações sobre as características físicas de

indivíduos a partir do material genético extraído de material biológico, como gotas de

sangue, fios de cabelos ou pequenos fragmentos corporais, para aplicações na área de

identificação forense, a associação entre marcadores genéticos e características

morfológicas vem sendo intensamente pesquisada pela comunidade científica. Alguns

estudos já avaliaram a existência de polimorfismos associados à cor da pele, cabelos e

olhos (Frudakis et al., 2007; Graf et al., 2007; Myles et al., 2007; Stokowski et al., 2007;

Sulem et al., 2007; Han et al., 2008; Kayser et al., 2008; Sturm et al., 2008; Branicki et

al., 2009; Duffy et al., 2010; Edwards et al., 2010; Weeden et al., 2011), espessura de

fios de cabelo, formas faciais e estatura (Watson, 2000; Perola et al., 2001; Pulker et

al., 2007; Fujimoto et al., 2008).

Neste contexto, espera-se que a genotipagem desses marcadores em material

biológico encontrado em cenas de crime possa contribuir significativamente com

informações cada vez mais precisas sobre as características físicas dos envolvidos

(Walsh, 2004; Branicki et al., 2007). Embora as inferências daí advindas provavelmente

não apresentarem valor definitivo como prova pericial ou forense, devido ao grau

ainda grande de subjetividade inerente a elas, elas poderão constituir um fator

importante no direcionamento de investigações conduzidas em uma esfera liderada

pelo serviço de inteligência da polícia, podendo reduzir um problema de grandes

dimensões a um conjunto reduzido de suspeitos, e seu valor seria equivalente ao de

uma prova testemunhal (depoimentos de vítimas ou testemunhas) (Walsh, 2004).

Pode-se considerar que, entre as características físicas mais notáveis, a cor da pele,

cabelo e olhos são características humanas amplamente variáveis e facilmente

Introdução 10

reconhecidas (Soejima e Koda, 2007); portanto, sua predição teria grande valor nas

investigações forenses.

1.4 Biologia da pigmentação

1.4.1 Pigmentação dos cabelos, pele e olhos.

A cor da pele é, exceto em raros casos patológicos, o resultado de três

pigmentos ou cromóforos: melanina, hemoglobina e, em uma escala muito menor,

carotenóides presentes na dieta. No entanto, as diferenças observadas entre as cores

de cabelo e pele são resultantes principalmente do conteúdo e distribuição de

melanina na pele dos indivíduos (Rees, 2003).

A melanina é uma substância sintetizada a partir da oxidação enzimática do

aminoácido tirosina, sendo que sua produção ocorre dentro de organelas

denominadas melanossomos em células especializadas, denominadas melanócitos.

Variações nas cores de pele e cabelo, observadas em diferentes regiões geográficas,

resultam da produção, distribuição e empacotamento de dois tipos distintos de

melanina depositadas na epiderme ou fios de cabelo: a eumelanina, que é um

pigmento castanho/preto e a feomelanina que é um pigmento vermelho/amarelo

(Rana et al., 1999; Gerstenblith et al., 2007) (Figura 1).

Introdução 11

Figura 1- Via metabólica da biossíntese de eumelanina/feomelanina a partir da tirosina, mostrando a atuação dos diversos genes/enzimas (retirado de Ito e Wakamatsu, 2010)

Na pele humana, esses melanossomos serão posteriormente distribuídos para

os queratinócitos localizados na junção entre a epiderme e a derme (Mcevoy et al.,

2006) (Figura 2). Considera-se que, em geral, peles mais pigmentadas contêm

partículas melanossomais maiores e mais numerosas, enquanto a pigmentação mais

clara está associada com melanossomos menores e menos abundantes (Yamaguchi et

al., 2007) (Figura 2). Um fator importante a ser mencionado se refere ao fato de esses

padrões distintos de distribuição estarem presentes desde o nascimento, não sendo

necessariamente determinados pela exposição ao sol (Sturm et al., 1998).

Introdução 12

Figura 2- Esquema da arquitetura da pele clara e escura. BM, membrana basal; D, derme. Tipos celulares: K, queratinócito; M, melanócito; F, fibroblasto; formas ovais, melanossomos (adaptado de Yamaguchi et al., 2007)

Clara Escura

Ainda a respeito da pigmentação da pele, a ocorrência de sardas (pequenos

aglomerados de melanina concentrado em certos pontos na pele), que comumente

incide em indivíduos de pele clara, ocorre por conta da reação da pele à exposição ao

sol, tendo função de proteção aos raios UV. A reação aos raios UV promove um

aumento na produção de melanina nos melanócitos, tornando-os mais escuros

(Bastiaens et al., 2001).

Com relação aos cabelos, pessoas de cabelos ruivos apresentam um aumento

relativo das quantidades de feomelanina comparadas às de eumelanina, enquanto nos

cabelos negros as quantidades de eumelanina prevalecem e nos cabelos loiros há um

Introdução 13

pouco de cada tipo (Rees, 2003). Além disso, apesar da origem embrionária comum

dos melanócitos da pele e do cabelo, os genes que afetam a pigmentação podem se

expressar de maneira independente, gerando combinações conhecidas de cabelos

escuros e pele clara ou cabelos claros e pele escura (Sturm et al., 2001).

Já no caso dos melanócitos dos olhos, os melanossomos não são secretados,

mas mantidos no citoplasma (Nordlund et al., 1998) (Figura 3). Sabe-se que, apesar de

todas as colorações de olhos possuírem um número similar de melanócitos, os olhos

azuis contêm um mínimo de pigmentos e poucos melanossomos; olhos verdes são

resultado de moderados níveis de pigmentos, intensidade de melanina e número de

melanossomos, enquanto olhos castanhos são resultado de níveis altos de melanina e

grande quantidade de partículas melanossomais (Sturm e Frudakis, 2004). Entretanto,

estudos acerca das proporções eumelanina/feomelanina que possam vir a determinar

a cor dos olhos ainda são inconclusivos (Prota et al., 1998) (Figura 3).

Um aspecto interessante relacionado à pigmentação está ligado à evolução dos

humanos. Os seres humanos se diferem dos outros primatas e de muitos mamíferos

por terem perdido a maior parte dos pêlos do corpo. A explicação mais aceita se refere

à vantagem evolutiva conferida por serem capazes de transpirar de maneira mais

eficiente, o que contribui no processo de regulação da temperatura corporal. No

entanto, a ausência de pêlos leva à necessidade da elaboração de uma proteção contra

a radiação ultravioleta (UV), particularmente em áreas da pele com alta exposição ao

sol. A principal maneira de se alcançar isso é através da síntese da melanina. A

melanina é capaz de absorver radiação eletromagnética no comprimento de onda UV,

Introdução 14

Melanócitos e melanossomos da íris

Figura 3- Pigmentação dos olhos - diferenças entre os tipos e quantidade de melanossomos nos melanócitos dos olhos mais claros aos mais escuros (adaptado de Sturm e Frudakis, 2004)

protegendo assim o DNA, as proteínas e outras macromoléculas dos efeitos nocivos

desses raios (Rees, 2003)

A variação geográfica com relação à pigmentação da pele faz sentido quando

analisada em função da radiação UV: a pele negra oferece maior proteção em

ambientes caracterizados por elevada incidência de radiação UV (baixas latitudes),

enquanto que a pele clara facilita o processo de biossíntese de vitamina D em regiões

onde a incidência de radiação UV não é tão alta (elevadas latitudes) (Soejima e Koda,

2007).

1.4.2 Genética da pigmentação

Estima-se que mais de 120 genes estejam envolvidos com a produção,

distribuição e secreção da melanina através dos melanócitos, contribuindo com o

Introdução 15

processo da pigmentação (Branicki et al., 2007). A enzima tirosinase, codificada pelo

gene TYR, é a conversora da tirosina em dopaquinona (Figura 1), precursora por sua

vez da eumelanina e feomelanina. Mutações nesse gene podem levar à ausência da

proteína funcional, impedindo totalmente a produção de melanina, condição chamada

de albinismo oculocutanêo tipo 1. Mutações nulas no gene OCA2 podem também

resultar em outro tipo de albinismo, por reduzir a produção de eumelanina. Acredita-

se que dois outros genes, SLC24A5 e SLC45A2, codifiquem proteínas responsáveis pelo

transporte transmembrana de sódio-cálcio e sódio-prótons nos melanócitos,

respectivamente. Além disso, o SLC45A5 também está relacionado ao transporte de

proteínas melanossomais (tirosinase) juntamente com o OCA2 (Ito e Wakamatsu,

2010).

Um aspecto interessante da melanogênese consiste no fato de que o pH dos

melanócitos pode ter uma grande influência nas vias de produção de melanina.

Observou-se que melanócitos obtidos de peles claras possuem melanossomos de pH

ácido, enquanto aqueles obtidos de peles escuras possuíam um pH próximo do neutro

(Smith et al., 2004). Evidências recentes levam a acreditar que polimorfismos dos

genes OCA2 e SLC24A5 possam levar à acidificação dos melanossomos (Ito e

Wakamatsu, 2010).

Até o momento, o gene MC1R (receptor de melanocortina 1 [MIM 155555]) é

o mais bem caracterizado dentre os genes descritos que influenciam a variação normal

de pigmentação em humanos (Gerstenblith et al., 2007). Estudo publicado na revista

Science envolvendo a análise por seqüenciamento de polimorfismos deste gene

revelou que os Neandertais, grupo extinto de hominídeos que habitou a região da

Introdução 16

Eurásia entre 28.000 e 400.000 anos atrás, possuíam cabelos ruivos e pele clara

(Culotta, 2007; Lalueza-Fox et al., 2007). Dentre os vários genes envolvidos na

pigmentação, o MC1R constitui um determinante chave em tal processo (Wong e Rees,

2005).

O MC1R é um gene composto por apenas um exon de 951 pares de bases,

localizado no cromossomo 16 (16q24.3), responsável pela codificação de uma proteína

transmembrana de 7 passos (317 aminoácidos), chamada de receptor de

melanocortina 1 (Figura 4). Esse receptor está localizado na superfície celular dos

melanócitos e desempenha papel importante na via de produção da melanina.

Observou-se que o gene MC1R regula a produção dos principais constituinte da

pigmentação humana, a eumelanina e a feomelanina (Makova e Norton, 2005).

O receptor de melanocortina 1 pertence à família dos receptores associados à

proteína G (GPCRs). Em mamíferos, esse receptor responde ao hormônio melanócito-

estimulante (α-MSH) e, quando ligado, ativa a proteína G, que por sua vez ativa a

adenilato-ciclase a sintetizar AMP cíclico (cAMP), elevando seus níveis. Por

conseqüência, com os níveis de cAMP aumentados, a transcrição de uma série de

genes é alterada, entre eles o gene TYR, aumentando os níveis de tirosinase (Figura 5),

Figura 4 - Estrutura do MC1R na superfície celular do melanócito, com suas 7 hélices transmembrana (retirado de Lalueza-Fox et al. (2007)

Introdução 17

Figura 5- Via de sinalização da melanocortina (α-MSH). O α-MSH se liga ao MC1R, ativando-o. As proteínas G transmitem o sinal para a adenilato-ciclase (AC), que converte ATP em cAMP, induzindo a expressão de fatores de transcrição (como o MITF) que promovem a síntese da tirosinase (retirado de Kabbarah e Chin (2006)

levando por fim à produção de eumelanina, de cor castanha/preta. No entanto, a

ausência ou redução parcial dessa sinalização leva à produção de feomelanina

(Makova e Norton, 2005).

Alguns estudos indicam que alterações conformacionais desse receptor podem

alterar significativamente sua atividade. Yang et al. (1997) mostraram que a

substituição de aminoácidos constituintes do MC1R (Glu94, ASp117 e Asp121) levou a

uma diminuição da capacidade dele se ligar ao hormônio sinalizador, levando a uma

alteração na sinalização intracelular dos melanócitos, o que gera aumento na síntese

de feomelanina. Um outro estudo (Robbins et al., 1993) revelou que modificações nos

aminoácidos Ser69, Glu92 e Leu98 desse receptor, situados no segundo domínio

Introdução 18

transmembrana, o tornam permanentemente ativo, independente da ligação com o

hormônio sinalizador, o que gera aumento na síntese de eumelanina.

Diversos estudos em diferentes populações, realizados durante a última

década, têm demonstrado que a região codificadora do gene MC1R é altamente

polimórfica em europeus, apresentando mais de 70 variantes já identificadas

(Gerstenblith et al., 2007), e apresenta impacto significativo no fenótipo de

pigmentação neste grupo étnico (Harding et al., 2000; Sturm, 2006). Alguns estudos

demonstram que vários alelos de SNPs do gene MC1R (em particular Arg151Cys,

Arg160Trp e Asp294His), descritos como alelos de função reduzida ou alelos que

afetam a expressão do receptor na membrana dos melanócitos, estão

significantemente associados a um aumento na produção de feomelanina, que se

manifesta em cabelos ruivos, cor de pele clara e presença de sardas (Harding et al.,

2000; Sturm, 2006).

Em outros estudos, por outro lado, evidencia-se o fato de que existe uma

pequena taxa de mutações não-sinônimas (isto é, mutações que levam à alteração de

aminoácidos) na seqüência do gene MC1R em populações africanas, indicando que tal

gene está sob forte pressão seletiva direcionada à manutenção da função gênica na

África. A inexistência de mutações não-sinônimas na África sugere que este gene de

pigmentação esteja sob forte pressão purificadora, o que resulta na manutenção de

poucos alelos funcionais distintos, permitindo assim manter os altos níveis de

eumelanina, provavelmente como forma de minimizar os efeitos da exposição à

radiação UV. Comparando-se a diversidade em sítios silenciosos observa-se que a

Introdução 19

diversidade africana é de 0,25%, comparada com 0,08% e 0,09% na Europa e Ásia,

respectivamente (Harding et al., 2000; Norton et al., 2007; Sulem et al., 2007).

A alta taxa de mutações não-sinônimas existente na Europa e Leste Asiático

demonstra um relaxamento da pressão seletiva purificadora sobre o gene MC1R, uma

vez que a perda de função gênica poderia ser tolerada. A pigmentação clara da pele

teria sofrido seleção positiva nessas altas latitudes, levando essa característica a ser

praticamente fixada. Observa-se ainda nas regiões Sudeste e Leste da Ásia a existência

de algumas variantes específicas a tal continente (Thr157Ile e Pro159Thr), bem como

variações significativas nas freqüências de alguns alelos de SNPs do MC1R (por

exemplo, Arg163Gln e Val92Met), sendo que eles aparentemente inexistem na região

Sul do continente (Nakayama et al., 2006; Sturm, 2006).

1.5 População Brasileira

A composição genética da população brasileira é reflexo de cinco séculos de

mistura inter-étnica envolvendo principalmente povos de três continentes (Europa,

África e Américas), o que a caracteriza como uma das populações mais heterogêneas

do mundo (Parra et al., 2003). No ano de 1500, com a chegada dos primeiros

colonizadores, mais de dois milhões de indígenas já habitavam a região. Os nativos

sofreram então uma drástica redução populacional tanto devido aos conflitos com os

colonizadores e quanto às doenças trazidas por eles, tais como catapora e sarampo.

Antes de 1820, a colonização européia se deu quase que exclusivamente por

portugueses. Entre 1820 e 1975, a grande maioria dos seis milhões de imigrantes

europeus que chegaram ao Brasil era de origem predominantemente portuguesa e

Introdução 20

italiana (70% do total), tendo ocorrido também a entrada de espanhóis, alemães, sírios

e japoneses (IBGE). Entre os séculos XVI e XIX, aproximadamente 3,5 milhões de

africanos foram trazidos como escravos para o Brasil, vindos principalmente das

regiões Oeste, Centro-Oeste e Sudeste da África (Ferreira et al., 2006).

De acordo com o censo realizado em 2000 (IBGE), dos 170 milhões de

brasileiros entrevistados, 53% se auto-declararam como “brancos”, 38% como

“pardos”, 6% como “negros” e 3% disseram pertencer a outras categorias. As

proporções aqui mostradas variam consideravelmente entre as diferentes regiões

geográficas brasileiras, reflexo das particularidades de sua colonização. No estado de

São Paulo (com aproximadamente 40 milhões de habitantes), as freqüências foram de

70%, 23%, 4% e 3% respectivamente.

Atualmente estudos baseados em marcadores genéticos consideram que a

população urbana de Ribeirão Preto é altamente miscigenada, sendo os brancos

caracterizados por contribuições de 79%, 14% e 7% de Europeus, Africanos e

Ameríndios, respectivamente (Ferreira et al., 2006), os mulatos caracterizados por

contribuições de 62%, 26% e 12% de Europeus, Africanos e Ameríndios,

respectivamente (Muniz et al., 2008) e os negros caracterizados por contribuições de

37%, e 63% de Europeus e Africanos, respectivamente (Muniz et al., 2008).

Todos estes dados demonstram que o povo brasileiro possui elevada taxa de

miscigenação, representada pelas contribuições de indivíduos de origens étnicas

distintas, como europeus de diversas regiões, africanos vindos principalmente da

região do Niger-Congo da África equatorial e populações ameríndias (França,

2001)nativas. Tal heterogeneidade étnica se reflete na alta diversidade fenotípica vista

Introdução 21

nos brasileiros. Dessa forma, pode-se considerar os brasileiros como uma população

que apresenta condições propícias para a identificação de novos alelos e haplótipos

em genes de pigmentação e para avaliação genética relacionada aos fenótipos

morfológicos.

22

2 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Justificativa e Objetivos 23

Considerando que a genotipagem do material biológico encontrado em cenas

de crime pode contribuir significativamente com informações cada vez mais precisas

sobre as características físicas dos envolvidos (Walsh, 2004; Branicki et al., 2009), tais

dados seriam importantes no direcionamento de investigações, podendo levar a um

conjunto reduzido de suspeitos.

A análise de um conjunto de polimorfismos localizados na região codificadora

de genes de pigmentação em populações urbanas permite avaliar o potencial destes

marcadores para a realização de inferências fidedignas relacionadas às cores de pele e

cabelos de indivíduos brasileiros. O MC1R é o único gene identificado até agora que

explica variações fenotípicas substanciais na pigmentação humana (Gerstenblith et al.,

2007). Harding et al. (2000) afirmam que várias características do MC1R o tornam ideal

para o estudo de genética de populações, tais como: (a) facilidade no seqüenciamento

completo, por se tratar de um gene pequeno; (b) papel funcional do gene nas vias

bioquímicas da melanogênese bem conhecido; (c) detalhes sobre associações entre

genótipo-fenótipo e as variantes do MC1R já terem sido estabelecidos

Além disso, considerando-se a grande variabilidade fenotípica e genética da

população brasileira, com padrões alélicos e haplotípicos distintos, nota-se a

importância da realização de estudos genéticos em uma população tão miscigenada. A

confirmação dos resultados obtidos em trabalhos realizados em outras populações

geneticamente mais homogêneas, como a européia pode ser de extrema importância.

A partir das confirmações desses estudos, uma melhor compreensão das associações

já encontradas pode ser obtida.

Justificativa e Objetivos 24

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a diversidade genética revelada pelo seqüenciamento completo da

região codificadora do gene MC1R em uma amostra da população brasileira,

estratificada de acordo com a pigmentação da pele, cabelos e olhos e presença de

sardas.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar as freqüências de alelos, genótipos e haplótipos de SNPs descritos

no gene MC1R;

• Avaliar a intensidade do desequilíbrio de ligação entre alelos de SNPs

encontrados na região codificadora do gene MC1R;

• Avaliar a intensidade de correlação entre alelos/haplótipos de SNPs do gene

MC1R e características fenotípicas;

• Identificar um conjunto de polimorfismos do gene MC1R que contribuam

para a determinação da pigmentação da pele, cabelos e olhos, e presença de

sardas, em indivíduos da população brasileira.

25

3 – MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos 26

3.1 Amostra populacional

Foram coletadas amostras de sangue de um total de 296 voluntários não

aparentados dos sexos masculino e feminino dos diferentes grupos étnicos que

compõe a população brasileira, com idade variando de 18 a 40 anos, recrutados, em

sua grande maioria, no Hemocentro de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP). Estes indivíduos

foram classificados através de um questionário (APÊNDICE 1) em grupos de acordo

com a cor dos olhos, cabelos e pele, segundo o sistema proposto por Fitzpatrick

(1988), utilizado em outros estudos que abordam a pigmentação humana (Rana et al.,

1999). Além disso, foi avaliada a presença ou ausência de efélides (sardas).

Cada indivíduo assinou um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

(APÊNDICE 2) permitindo o uso de seu material biológico (amostra de sangue) para

estudo. O material coletado foi armazenado em tubos rotulados de modo que o

doador não pudesse ser diretamente identificado, mantendo, assim, o caráter

confidencial da informação.

O projeto de pesquisa do presente trabalho, juntamente com o questionário

sobre características étnicas e morfológicas foi aprovado pela Comissão de Ética em

Pesquisa da Instituição (FFCLRP-USP) de acordo com o processo CEP-FFCLRP n°

433/2008 – 2008.1.2316.59.4 (APÊNDICE 3).

3.2 Determinação das características dos indivíduos

O sistema elaborado por Fitzpatrick ainda é muito utilizado em estudos para a

classificação dos tipos de pele (Odunze et al., 2007; Emmett et al., 2008; Ruiz-


Rodriguez et al., 2008; Szell et al., 2008; Elfakir et al., 2010), por ser relativamente

preciso e de fácil aplicação. A classificação é feita por meio de uma tabela, baseada em

características do indivíduo associadas à reação do mesmo à exposição ao sol,

resultando na determinação do tipo de pele em seis grupos:

Tipos de pele

Descrição

I Pele extremamente clara, sempre se queima, nunca bronzeia

II Pele clara, sempre se queima, bronzeia às vezes

III Pele média, algumas vezes se queima, sempre bronzeia

IV Pele morena clara, raramente se queima, sempre bronzeia

V Pele morena moderadamente pigmentada, nunca se queima, sempre

bronzeia

VI Pele negra marcadamente pigmentada, nunca se queima, sempre

bronzeia

A cor dos olhos foi caracterizada e dividida em categorias compreendendo azul,

verde, mel, castanho claro e castanho escuro. A cor dos cabelos, por sua vez, foi

caracterizada e dividida em categorias compreendendo ruivo, loiro, castanho e preto

3.3 Análise Laboratorial

3.3.1 Extração de DNA

Logo após a coleta, as amostras de sangue foram submetidas a centrifugação,

sendo o sobrenadante (plasma) estocado em frascos a -80°C para eventuais usos

futuros. O DNA das amostras de sangue foi então extraído através do protocolo de

salting-out (Miller et al., 1988) detalhado a seguir.


Cerca de 10 mL de sangue foi coletado em tubo contendo EDTA como

anticoagulante. O sangue foi transferido para um tubo de 50mL e adicionado tampão

de lise I (Tris-HCl 0,01M-pH 7,5; Sacarose 0,3M; MgCl2 0,005M; Triton 1%; H2O qsq)

gelado até completar o volume final. Misturou-se delicadamente o conteúdo do tubo

por inversão e centrifugou-se os tubos por 10 minutos a 3300 rotações por minuto

(rpm) a 4°C. Esta etapa é responsável pela lise dos glóbulos vermelhos da amostra.

O sobrenadante (hemácias lisadas) foi então descartado cuidadosamente e a

extração prosseguiu com o pellet de células retido no fundo do tubo. O pellet de

células foi ressuspendido em 4,5mL de tampão de lise II (NaCl 0,075M; NaEDTA

0,024M), 125 μL de SDS 10% e 1,1mL de perclorato de sódio 5M. A mistura foi agitada

num Vortex por 10 segundo a temperatura ambiente. Esta etapa é responsável pela

lise dos glóbulos brancos. Adicionou-se 2mL de NaCl 6M saturado e agitou-se no

Vortex por 15 segundos também à temperatura ambiente. Este passo é responsável

por lisar as proteínas presentes.

Centrifugou-se o tubo por 10 minutos à 3300 rpm a temperatura ambiente. O

sobrenadante foi transferido cuidadosamente para um tubo de 50mL limpo.

Adicionou-se 5mL de isopropanol absoluto à temperatura ambiente ao sobrenadante

no tubo e homogeneizou-se gentilmente até que o DNA se precipitasse.

O DNA foi então retirado com auxílio de uma pipeta estéril e colocado em um

tubo de 1,5mL contendo 1mL de etanol 75% gelado. O tubo então foi centrifugado por

10 minutos a 4°C e posteriormente o sobrenadante foi descartado. O tubo então foi

colocado em uma centrífuga à vácuo por 10 minutos para que o restante do etanol


fosse removido. O DNA no fundo do tubo foi então dissolvido em 400 μL de água

estéril e armazenado em freezer a -20°C.

3.3.2 Amplificação por PCR do gene MC1R

A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi utilizada para amplificação

completa de toda a região codificante do gene MC1R com os primers 5’-

GCAGCACCATGAACTAAGCA-3’ e 5’-CAGGGTCACACAGGAACCA-3’. Os reagentes foram

empregados em quantidades específicas e a mistura de reação foi submetida a ciclos

definidos de temperaturas, de acordo com as condições descritas na literatura

(Kanetsky et al. 2004; Branicki et al. 2007), gerando um produto de amplificação de

1124pb, o qual abrange completamente o único exon de 951pb (317 códons) do gene

MC1R.

Reagentes utilizados para amplificação por PCR do gene MC1R

REAGENTES MC1R

DNA genômico (0,6 μg/μl) 1,00 μl

Água deionizada autoclavada 8,25 μl

Tampão de reação 2,75 μl

Primer forward (2,5mM) 2,50 μl

Primer reverse (2,5mM) 2,50 μl

Solução de dNTPs (20mM) 2,50 μl

Bovine Serum Albumine (50mg/ml) 0,4 μl

Taq polimerase (5U/μl) 0,10 μl

Volume total da reação 20,00 μl


Regime de temperaturas utilizado na reação de PCR do MC1R

TEMPERATURAS TEMPO

Denaturação inicial 94°C 5 minutos

Denaturação 94°C 1 minuto

32 Ciclos Pareamento 58°C 1 minuto

Extensão 68°C 2 minutos

Extensão final 72°C 10 minutos

Tamanho do fragmento 1124 pb

Sendo o tampão de reação da marca Invitrogen (TRis/HCl 75mM pH 9,0; KCl

50mM; (NH4)2SO4 20mM; MgCl2 2,0mM), a solução de dNTPs Promega, a albumina

bovina (BSA) Applied Biosystems, a Taq polimerase Platinum® (Invitrogen) e o DNA

das amostras encontrava-se em concentração de 0,6μg/μl em média.

3.3.3 Eletroforese em gel de agarose

Os produtos da reação de PCR foram inicialmente avaliados através da

separação eletroforética em gel de agarose 0,8%, preparado através da mistura de 0,8

mg de agarose com 100 mL de tampão TBE 1x (Tris-HCl 0,9M – pH 8,0; EDTA; Ácido

Bórico). A mistura é aquecida até que se dissolva toda a agarose. Após um pequeno

período de resfriamento, adiciona-se 2 μL de brometo de etídio e coloca-se a mistura

para solidificar em uma cubeta horizontal.

Após a polimerização do gel, este é colocado em uma cuba de eletroforese

horizontal, e adiciona-se tampão TBE 1x até que ele seja totalmente coberto. Em cada


poço do gel, aplica-se 3 μL de produto da PCR, juntamente com 2 μL de tampão de

carregamento (loadding buffer – TBE 1x; Xilenocianol 0,25%; Azul de Bromofenol

0,25%; EDTA 0,1M pH 8,0; Ficoll 15%). A cuba de eletroforese é conectada a uma fonte

de eletroforese de alta voltagem e a separação dos fragmentos é realizada durante 60

minutos a 100 volts, com corrente liberada.

Após o término da eletroforese, o gel é retirado da cuba e analisado em

transluminador UV, para verificar se houve a amplificação correta das bandas

específicas do gene alvo (1124bp). Além de verificada a presença da banda do MC1R,

deve-se atentar para a ausência de outras bandas inespecíficas, que poderiam

atrapalhar as etapas seguintes de seqüenciamento. Foram tiradas fotos de cada gel,

permitindo que a leitura fosse armazenada caso houvesse necessidade de análises

posteriores

3.3.4 Seqüenciamento completo do gene MC1R

Após a confirmação da amplificação e da avaliação da qualidade do produto de

PCR purificado, foi realizada a reação de seqüenciamento, utilizando-se o conjunto de

reagentes ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit®

(Amersham Pharmacia Biotech, EUA). Adicionou-se 1,2 μL de BigDye, 1,28 μL de primer

específico para a extremidade a ser seqüenciada, 3 μL de tampão da reação e 4,32 μL

de água deionizada autoclavada a 0,2 μL de produto de PCR. Os mesmos primers

utilizados inicialmente na reação de PCR foram empregados na reação de

seqüenciamento (primer forward ou reverse) seguindo o regime de temperaturas

indicado pelo fabricante.


Regime de temperaturas utilizado na reação de seqüenciamento

TEMPERATURAS TEMPO

Denaturação inicial 96°C 1 minuto

Denaturação 96°C 10 segundos

25 Ciclos Pareamento 50°C 5 segundos

Extensão 60°C 4 minutos

O produto da reação de seqüenciamento foi então precipitado em isopropanol.

Em um tubo de 1,5 mL adiciona-se 10 μL do produto resultante da reação de

seqüenciamento e 80 μL de isopropanol 75%; agita-se rapidamente e mantém em

temperatura ambiente por 15 minutos. Centrifuga-se o conteúdo dos microtubos a

14.000 rpm durante 20 minutos. Retira-se então o sobrenadante, acrescenta-se 250 μL

de isopropanol 75% e centrifuga-se novamente o conteúdo dos microtubos a 14.000

rpm durante 5 minutos. O sobrenadante é descartado e o conteúdo do microtubo é

seco por pelo menos 10 minutos em secadora à vácuo. O precipitado é então

ressuspendido em 20 μL de formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems, EUA), incubado em

temperatura de 94°C por 2 minutos e em seguida mantido em gelo moído por 15

minutos. Por fim, as amostras foram encaminhadas para o seqüenciador automático

de DNA ABI PRISM® 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, EUA).

A leitura e alinhamento das seqüências foram feitos pelo programa Lasergene

SeqMan 7.0® (DNASTAR, Inc., EUA). As seqüências obtidas foram analisadas com

ênfase em 29 loci polimórficos previamente descritos (Rees, 2003; Wong e Rees, 2005;

Mengel-From et al., 2009). Esses loci foram selecionados por serem reconhecidamente


polimórficos e por terem sido empregados em diversos estudos sobre a genética da

pigmentação humana envolvendo o gene MC1R, sendo muitos deles já associados a

características fenotípicas em populações européias (Rees, 2003; Wong e Rees, 2005;

Mengel-From et al., 2009).

3.4 Análises estatísticas dos dados

As análises estatísticas foram realizadas tomando-se como base os 29 SNPs

selecionados conforme descrição em item anterior. Algumas análises levaram em

consideração a estratificação dos indivíduos de acordo com a presença/ausências de

sardas, pigmentação dos olhos (azul, verde, mel, castanho claro ou castanho escuro),

pigmentação dos cabelos (ruivo, loiro, castanho ou preto), ou tipo de pele baseado na

classificação de Fitzpatrick (1988) [clara (tipo I + II), média (tipo III + IV) ou escura (tipo

V + VI)].

A nomenclatura utilizada para os SNPs segue a lógica da posição ocupada por

cada base no mRNA, considerando a posição +1 como sendo a primeira base transcrita

do gene. A Tabela 1 abaixo mostra a nomenclatura dos 29 SNPs utilizada nesse

trabalho, seguida por suas variações conhecidas, além de fazer referência à posição

ocupada por cada base na região codificadora do gene e à mudança de aminoácido

gerada pela mutação, se for o caso, além de seu número de referência (rs number) no

banco de dados dbSNP do NCBI (Sherry et al., 2001).


Tabela 1 – Posições dos 29 SNPs analisados em relação à base ocupada no RNA mensageiro

(mRNA), na região codificadora (951pb), nos aminoácido da proteína (314 aminoácidos) e seu

respectivo número de referência no banco de dados do dbSNP.

Posição mRNA Posição Região

codificadora Posição

Aminoácido rs number

+1513 TC 133 Phe45Leu 61996344

+1558 GT 178 Val60Leu 1805005

+1580 GA 200 Arg67Gln 34090186

+1627 TC 247 Ser83Pro 34474212

+1632 CA 252 Asp84Glu 1805006

+1645 GA 265 Gly89Arg 34540312

+1654 GA 274 Val92Met 2228479

+1664 CT 284 Thr95Met 34158934

+1690 GA 310 Gly104Ser 2229617

+1698 GA 318 Leu106 3212364

+1739 TC 359 Ile120Thr 33932559

+1805 GA 425 Arg142His 11547464

+1831 CGT 451 Arg151Cys 1805007

+1844 TC 464 Ile155Thr 1110400

+1846 GC 466 Val156Leu 3212365

+1858 CT 478 Arg160Trp 1805008

+1868 GA 488 Arg163Gln 885479

+1877 CG 497 Ala166Gly 35040147

+1884 CT 504 Ile168 34612847

+1891 GT 511 Ala171Ser 35784916

+1929 CT 549 Tyr183 34209185

+1966 TC 586 Phe196Leu 3212366

+2013 GA 633 Leu211 34564466

+2097 CT 717 Gly239 34490506

+2195 CT 815 Thr272Met 12102534

+2260 GC 880 Asp294His 1805009

+2280 CT 900 Phe300 3212367

+2322 AG 942 Thr314 2228478

+2346 GA - - 3212368

3.4.1 Freqüências alélicas e heterozigose

As freqüências alélicas de cada SNP foram calculadas nas amostras, tanto

separadas por fenótipo quanto globalmente, por contagem direta pelo programa


Genepop 4.0 (Rousset, 2008). Considerando-se a representação da freqüência relativa

de um genótipo AiAj como sendo Xij, temos que a freqüência do alelo i é dada por:

onde Σj≠i Xij indica a somatória de freqüência de todos os genótipos que

apresentam o alelo i, exceto quando i = j (Nei, 1987).

A heterozigose esperada (HS) foi calculada pelo programa Arlequin 3.5

(Excoffier e Lischer, 2010) a partir das equações:

Onde n é igual ao número de cópias gênicas na amostra, k é o número de alelos

e pi é a freqüência do i-ésimo alelo na amostra. O desvio padrão é calculado pela raiz

quadrada de V(H).

3.4.2 Equilíbrio de Hardy-Weinberg

A aderência das freqüências genotípicas ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg

(EHW) foi verificada pelo método de enumeração completa descrito por Louis e

ij

ij

iii

XXx

2

k

i

ipn

nH

1

211

ˆ

k

i

k

i

ii

k

i

i

k

i

i ppppnnn

HV1

2

1

22

2

1

2

1

3)2(2)1(

2)ˆ(


ij ijf

ij ij

m

i i

fn

fn2

!)!2(

!!Pr 1

Dempster (1987), utilizando-se o programa Genepop 4.0 (Rousset, 2008). Este método

avalia todas as possíveis tabelas de distribuições genotípicas que apresentem mesmas

freqüências alélicas e tamanho amostral em relação à amostra original, sendo que o

valor de p do teste corresponde à somatória das probabilidades de todas as tabelas

que apresentarem probabilidades (Pr) iguais ou menores do que a da tabela original.

A hipótese nula deste teste é de que a união dos gametas ocorre de maneira

aleatória.

3.4.3 Inferência computacional de haplótipos

Dada a pequena distância física entre os SNPs considerados e a presença de

desequilíbrio de ligação significativo entre eles, foram utilizados dois programas para a

reconstrução dos haplótipos a partir dos dados de SNPs obtidos das amostras: o

programa Arlequin 3.5 (Excoffier e Lischer, 2010) e o programa PHASE 2.1 (Stephens et

al., 2001; Stephens e Scheet, 2005). O intuito de se utilizar dois programas similares

para a reconstrução se baseia no fato de que cada um utiliza um algoritmo diferente

para os cálculos realizados. Dessa forma, observando-se os resultados e comparando-

se os valores de significância de cada reconstrução, pode-se avaliar se as mesmas

foram bem sucedidas e não diferiram entre si.

O Arlequin 3.5 (Excoffier e Lischer, 2010) se utiliza do algoritmo EM

(Expectation-Maximization) (Excoffier e Slatkin, 1995) para a reconstrução. Nele, um


processo probabilístico iterativo é utilizado objetivando-se obter estimativas de

máxima verossimilhança das freqüências haplotípicas a partir dos dados genotípicos de

fase gamética desconhecida. Deste modo, o par de haplótipos mais provável de cada

indivíduo é inferido levando-se em consideração apenas aspectos probabilísticos.

Já o método do algoritmo utilizado pelo programa PHASE 2.1 (Stephens et al.,

2001; Stephens e Scheet, 2005) se baseia em princípios de estatística Bayesiana

associados a conceitos da teoria da coalescência. Desta forma, o par de haplótipos

mais provável de cada indivíduo é inferido levando-se em consideração não apenas

aspectos probabilísticos, mas também aspectos evolutivos, ao levar em consideração a

semelhança entre as seqüências de DNA que compõem toda a amostra populacional.

Também foram calculadas as diversidades haplotípicas dos haplótipos gerados.

A diversidade haplotípica é equivalente à heterozigose esperada para dados diplóides.

Ela é definida como a probabilidade de dois haplótipos escolhidos aleatoriamente

serem diferentes na amostra. A diversidade e sua variância são calculadas pela mesma

fórmula da heterozigose descrita anteriormente sendo que, nesse caso, n é igual ao

número de cópias gênicas na amostra, k é o número de haplótipos e pi é a freqüência

do i-ésimo haplótipo na amostra. O desvio padrão é calculado pela raiz quadrada de

V(H).

3.4.4 Desequilíbrio de ligação

O desequilíbrio de ligação entre os loci estudados foi testado utilizando-se o

programa Arlequin 3.5 (Excoffier e Lischer, 2010). Após a reconstrução de haplótipos,


r² = D² / (pAqapBqb)

com a fase gamética conhecida, o programa busca pela presença de associações

significativas entre pares de loci. O programa calcula os coeficientes de desequilíbrio D,

D’ e r² onde:

- D é o coeficiente clássico de medida do desequilíbrio, medindo desvios das

associações aleatórias entre os pares de loci diferentes, representado por:

D = pij - pi pj ,

onde pij corresponde a freqüência do haplótipo formado pelos alelos i no

primeiro locus e j no segundo e pi pj corresponde à freqüências dos alelos i e j

- D’ é o coeficiente de desequilíbrio D padronizado pelo valor máximo que ele

pode alcançar (Dmax) de acordo com as freqüências alélicas;

- r² é uma outra medida de desequilíbrio de ligação sendo o quadrado do

coeficiente de desequilíbrio de ligação (D) dividido pelo produto das freqüências

alélicas dos loci envolvidos:

O programa então gera um histograma e uma tabela mostrando as associações

encontradas entre os pares analisados, com seus respectivos níveis de significância.

Também foi utilizada a representação gráfica gerada pelo programa Haploview

4.2 (Barrett et al., 2005), para visualização dos blocos haplotípicos presentes ao longo

max,

'

ij

ij

ijD

DD


do trecho analisado e das regiões com forte desequilíbrio de ligação. O Haploview

permite, através dessa representação, a análise do nível de desequilíbrio entre cada

par de SNPs do segmento de DNA em questão.

3.4.5 Diversidade haplotípica e rede de haplótipos

Foi construída uma network de haplótipos utilizando-se o programa Network

4.6 (Fluxus Engineering), através do algoritmo median-joining (Bandelt et al., 1999)

relacionando todos os haplótipos gerados por nossas reconstruções. Nela, os

haplótipos são representados por círculos enquanto as linhas que os unem

representam as mutações que diferenciam uns dos outros. Esse tipo de recurso é

muito útil na elaboração de inferências a respeito da evolução dos haplogrupos

originados a partir de haplótipos ancestrais, além de permitir a visualização das

relações existentes entre os haplótipos analisados.

3.4.6 Associações de fenótipos aos genótipos

Para verificação da existência de associações entre alelos, genótipos ou

haplótipos e um determinado fenótipo, foi utilizado o Teste exato de Fisher,

empregando-se o programa GraphPad Instat 3.06 (Graphpad Software, 2003). O

GraphPad InStat foi também empregado para determinar a magnitude desta

associação por meio do cálculo de Odds Ratio e seu intervalo de confiança de 95%.

O Odds Ratio corresponde à razão entre a probabilidade de um indivíduo

apresentar um determinado fenótipo quando possuir um determinado


alelo/genótipo/haplótipo e a probabilidade de um indivíduo não apresentar o fenótipo

quando possuir o mesmo alelo/genótipo/haplótipo. Este parâmetro é apropriado para

estudos de associação e representa o risco de uma pessoa apresentar o fenótipo

considerado dado que possua o alelo/genótipo/haplótipo em questão. Por exemplo,

um Odds Ratio igual a 10 significa que o fenótipo considerado ocorre com freqüência

dez vezes maior em indivíduos que apresentem o alelo, genótipo ou fenótipo em

questão do que em indivíduos que não os apresentem.

41

4 – RESULTADOS

Resultados 42

Figura 5 – A)Fotografia mostrando amplificação por PCR do fragmento de 1124 pb

contendo a região codificadora do gene MC1R. B) Eletroferograma mostrando um trecho

do seqüenciamento da região codificadora do MC1R de uma amostra

A

B

4.1 Amostra populacional

Para realizar a genotipagem das amostras, os produtos da reação de PCR foram

avaliados através da separação eletroforética em gel de agarose 0,8%, a fim de se

verificar a amplificação adequada e ausência de fragmentos inespecíficos (Figura 5 A).

As amostras que apresentavam amplificação de boa qualidade eram seqüenciadas

Posteriormente os resultados dos seqüenciamentos eram analisados pelo programa

Lasergene SeqMan 7.0® (DNASTAR, Inc., EUA) (Figura 5 B). Do total de 296 amostras

coletadas, restaram 284 amostras adequadas à análise, após serem desconsideradas

aquelas que não geraram dados viáveis devido ao fato de apresentarem material

insuficiente ou de má qualidade.

A classificação dos indivíduos quanto à ancestralidade foi baseada nos relatos

de cada indivíduo sobre as origens de seus antepassados (avós e bisavós maternos e

paternos). A classificação “Europeu” engloba indivíduos com os quatro ancestrais

Resultados 43

possuindo origem européia (os países mais citados foram Itália, Portugal e Espanha) e,

eventualmente, um ou dois de origem árabe. A classificação “Brasileiro” foi dada aos

indivíduos com todos os avós brasileiros, sem qualquer menção a uma origem indígena

e/ou estrangeira, ou indivíduos que fossem asiáticos miscigenados. Foram classificados

como “Euro-brasileiros” os indivíduos que possuem avós com origens na Europa e avós

cuja origem foi dita brasileira. Os “Afro-brasileiros” são os indivíduos com no mínimo

um avô ou avó de origem africana. “Nativo-brasileiros” são os indivíduos com no

mínimo um avô ou avó com ancestralidade indígena e sem qualquer relato de

ancestrais de origem africana. A classificação “Asiática” foi dada aos indivíduos que

relataram descendência chinesa ou japonesa para os quatro avós.

Considerando-se a classificação de ancestralidade acima descrita, 81 indivíduos

foram considerados europeus, 71 considerados brasileiros, 67 euro-brasileiros, 32

como nativo-brasileiros, 21 classificados como afro-brasileiros e 12 como asiáticos.

Segundo o critério de auto-classificação presente no questionário, 206 indivíduos se

declararam como brancos, 38 como negros, 26 se auto-classificaram como mestiços,

13 como asiáticos, apenas 1 indivíduo como indígena.

Desse total de 284 indivíduos, 7 eram ruivos, 33 eram loiros, 148 tinham

cabelos castanhos e 96 tinham cabelos pretos. Em relação à pele, 148 tinham pele

clara, 95 pele média e 41 pele escura. Vinte e um indivíduos apresentavam olhos azuis,

74 olhos verdes, 13 tinham olhos mel, 69 tinham olhos castanho claros e 107 castanho

escuros. Duzentos e quarenta indivíduos não apresentavam sardas, enquanto 44 as

possuíam. Os gráficos (Figura 6) mostram a distribuição relativa dessas características

ao longo das amostras.

Resultados 44

4.2 Freqüências alélicas e heterozigose

Do total de 29 loci selecionados, observou-se que 7 deles não apresentaram

qualquer variação nas amostras analisadas, possuindo apenas um alelo. Vinte e um dos

22 SNPs restantes se mostraram bialélicos, enquanto que um único SNP (+1690),

previamente descrito como bialélico, apresentou em nossas análises um terceiro alelo

desconhecido até então (alelo T) (APÊNDICE 4). Essa mutação encontrada gera a

alteração do aminoácido Glicina para o aminoácido Cisteína na posição 310 da cadeia

protéica (Tabela 1). Em contrapartida, um locus previamente descrito como trialélico

(+1831) apresentou apenas dois alelos em nossas amostras.

Considerando o critério de definição para que um locus seja considerado

polimórfico (freqüência máxima de 99% para o alelo mais freqüente), observamos que

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Ruivos Loiros Castanhos Pretos

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Clara Média Escura

0%

10%

20%

30%

40%

Azul Verde Mel Cast Claro Cast Escuro

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Ausência Presença

A

D C

B

Figura 6 – Gráficos representativos da distribuição relativa (em porcentagem) das características fenotípicas avaliadas no estudo. A) Distribuição das cores de cabelo; B)Distribuição das cores de pele; C) Distribuição das cores dos olhos; D) Distribuição da presença de sardas.

Resultados 45

do total de 22 loci que apresentaram variabilidade, 13 deles não podem ser

considerados polimórficos na população brasileira. Do total dos 9 loci polimórficos, 3

desses poderiam ser considerados como alelos de variação comum, já que possuem

freqüência maior que 5% no alelo menos frequente.

Todas as distribuições alélicas e genotípicas estão representadas no APÊNDICE

4. Desconsiderando-se os marcadores que não apresentaram variação, o menor valor

de heterozigose observado (HO) foi de zero no locus +1846, enquanto o maior valor foi

de 0,2376 no locus +2322. Já a heterozigose esperada (HS) variou de 0,0035 nos loci

+1580, +1627, +1645 e +1664 até 0,2416 no SNP +2322 (APÊNDICE 4).

4.3 Equilíbrio de Hardy Weinberg

O teste exato que envolve enumeração completa foi realizado utilizando-se as

freqüências genotípicas dos 22 loci que apresentaram variação em nossas amostras

(APÊNDICE 4). Quatro das 22 análises realizadas com a amostra total apresentaram

desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg, estando fora do equilíbrio os loci +1558,

+1846, +1868 e +1966 (APÊNDICE 4). Observou-se que os desvios nesses quatro casos

foram todos devido ao déficit de heterozigotos desses loci nas amostras analisadas

(APÊNDICE 4).

Resultados 46

4.4 Reconstrução haplótipos

Para a reconstrução dos haplótipos através dos algoritmos PHASE e EM, foram

utilizados os dados dos 22 SNPs já mencionados nos 284 indivíduos genotipados. A

utilização do algoritmo PHASE gerou 219 pares de haplótipos (77,11% do total)

inferidos com probabilidade superior a 95%, sendo 204 deles (71,83% do total) com

probabilidade de 100%, tendo-se obtido uma probabilidade média de 94,9%. O

algoritmo EM gerou 256 pares (90,14% do total) com probabilidade superior a 95%,

sendo 223 deles (78,52% do total) com probabilidade de 100%, tendo a probabilidade

média de 97,2%.

Após as reconstruções, os resultados dos dois métodos foram comparados

entre si para verificação das congruências. Observou-se então que 10 reconstruções

diferiam entre os métodos (3,52%), sendo essas amostras descartadas das análises

subseqüentes que envolvem haplótipos. A partir dessas alterações, o total de pares

com possibilidade superior a 95% subiu para 79,9% (PHASE) e 91,6% (EM), sendo suas

probabilidades médias aumentadas para 95,7% e 97,7% respectivamente. Estes

valores asseguram a confiabilidade deste processo de inferência de haplótipos.

Foram então gerados 31 haplótipos (Tabela 2). Levando-se em consideração as

mutações não-sinônimas presentes nos loci avaliados e as mudanças de aminoácidos

geradas, o conjunto de haplótipos obtidos determina 20 proteínas distintas (Tabela 2)

Cada haplótipo foi então designado por uma letra (indicando a proteína por ele

formada) e um número (diferenciando os diferentes haplótipos que geram uma

mesma proteína). É importante enfatizar que a única amostra que apresentava

variação na posição +2013 estava entre as 10 amostras que foram descartadas durante

Resultados 47

a comparação dos resultados gerados pelos métodos EM e PHASE. Por representar

uma mutação sinônima, o haplótipo descartado não levaria ao surgimento de uma

nova proteína.

As Tabelas 3, 4, 5 e 6 mostram que o haplótipo A1 é o mais freqüente (57,85%),

enquanto outros quatorze são de ocorrência única (0,18%). Além de ser o mais

freqüente, o haplótipo A1 é composto pelos alelos mais freqüentes de cada locus,

sendo portanto considerado o haplótipo ancestral de humanos modernos. Em termos

de proteínas distintas, a proteína A é a mais freqüente (68,07%), sendo codificada por

oito haplótipos distintos, enquanto outras oito proteínas (de M a T) apresentam

ocorrência única (0,18%). As quatro proteínas mais freqüentes representam mais de

90% da amostra total.

Resultados 48

1513TC

1558GT

1580GA

1627TC

1632CA

1645GA

1654GA

1664CT

1690GAT

1698GA

1739TC

1805GA

1831CGT

1844TC

1846GC

1858CT

1868GA

1877CG

1884CT

1891GT

1929CT

1966TC

2013GA

2097CT

2195CT

2260GC

2280CT

2322AG

2346GA

A1 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

A2 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C G G

A3 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C G A

A4 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G T A G

A5 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A A

A6 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G T C G C A G

A7 T G G T C G G C G A T G C T G C G C C G C T G C C G C G G

A8 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G T C G C G G

B1 T T G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

C1 T G G T C G G C G G T G C T G C A C C G C T G C C G C A G

C2 T G G T C G G C G G T G C T G C A C C G C T G C C G T A G

D1 T G G T C G A C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C G G

D2 T G G T C G A C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

E1 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C C C A G

F1 T G G T C G G C G G T G T T G C G C C G C T G C C G C A G

G1 T G G T C G G C G G T G C T G T G C C G C T G C C G C A G

H1 T G G T C G G C G G T G C T C C G C C G C T G C C G C A G

I1 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C C G C C G C G G

I2 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C C G T C G C G G

I3 T G G T C G G C G G T G C T G C G C C G C C G C C G C A G

J1 T G G T C G G C A G T G C T G T G C C G C T G C C G C A G

K1 T G G T C G G C G G T A C T G C G C C G C T G C C G C A G

L1 T G G T C G G C T G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

M1 T G A T C G G C G G T G C T G C A C C G C T G C C G C A G

N1 T G G T C A G C G G T G C T G T G C C G C T G C C G C A G

O1 T G G T C G G C G G T G C C G C G C C G C T G C C G C G G

P1 T G G T C G G C G G T G C T G C A C C G C C G C C G C A G

Q1 T G G T C G G T G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

R1 T T G C C G G C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

S1 T T G T C G A C G G T G C T G C G C C G C T G C C G C A G

T1 T T G T C G G C G G T G C T G C G G C G C T G C C G C A G

Tabela 2 – Seqüência de DNA dos 31 haplótipos gerados (A1 a T1) a partir dos 29 loci analisados. Haplótipos designados por mesma letra diferem apenas por mutações sinônimas enquanto que os designados por letras distintas diferem por mutações não-sinônimas, resultando em proteínas distintas. Os loci marcados em preto foram aqueles que não apresentaram variação. As mutações não sinônimas estão destacadas em cinza.

Resultados 49

Azul Verde Mel Castanho

Claro Castanho

Escuro Total

A1 0,6190 0,6370 0,7308 0,5469 0,5291 0,5785

A2 0,0714 0,0479 0,0769 0,1016 0,0728 0,0730

A3 - - - - 0,0243 0,0091

A4 0,0238 - - - 0,0194 0,0091

A5 - - - - 0,0097 0,0036

A6 - - - 0,0078 0,0049 0,0036

A7 - - - - 0,0049 0,0018

A8 - - - - 0,0049 0,0018

A 0,7143 0,6849 0,8077 0,6563 0,6699 0,6807

B1 - 0,1644 0,0769 0,1016 0,0728 0,0985

C1 0,1190 0,0342 0,0385 0,0938 0,1117 0,0839

C2 - 0,0068 - 0,0078 - 0,0036

C 0,1190 0,0411 0,0385 0,1016 0,1117 0,0876

D1 0,0476 0,0205 0,0385 0,0391 0,0534 0,0401

D2 0,0238 - - - - 0,0018

D 0,0714 0,0205 0,0385 0,0391 0,0534 0,0420

E1 0,0238 0,0137 0,0385 0,0234 0,0146 0,0182

F1 - 0,0205 - 0,0234 0,0194 0,0182

G1 0,0476 0,0274 - 0,0078 0,0097 0,0164

H1 - - - - 0,0194 0,0073

I1 - - - - 0,0049 0,0018

I2 - - - - 0,0049 0,0018

I3 - - - 0,0078 - 0,0018

I - - - 0,0078 0,0097 0,0055

J1 - - - 0,0156 - 0,0036

K1 - 0,0068 - - 0,0049 0,0036

L1 - 0,0068 - - 0,0049 0,0036

M1 - - - - 0,0049 0,0018

N1 0,0238 - - - - 0,0018

O1 - 0,0068 - - - 0,0018

P1 - - - 0,0078 - 0,0018

Q1 - 0,0068 - - - 0,0018

R1 - - - 0,0078 - 0,0018

S1 - - - 0,0078 - 0,0018

T1 - - - - 0,0049 0,0018

Diversidade Haplotípica

0,6051 ± 0,0835

0,5656 ± 0,0442

0,4677 ± 0,1176

0,6735 ± 0,0422

0,6951 ± 0,0329

0,6416 ±

0,0220

2n 42 146 26 128 206 548

Tabela 3 – Diversidade haplotípica e freqüências dos 31 haplótipos e 20 proteínas na amostra

total e nos grupos derivados da estratificação pela cor dos olhos.

Resultados 50

Ruivo Loiro Castanho Preto Total

A1 0,5909 0,4000 0,6189 0,5215 0,5785

A2 0,0606 - 0,0524 0,1129 0,0730

A3 - - 0,0035 0,0215 0,0091

A4 - - 0,0035 0,0215 0,0091

A5 - - - 0,0108 0,0036

A6 - - - 0,0108 0,0036

A7 - - 0,0035 - 0,0018

A8 - - - 0,0054 0,0018

A 0,6515 0,4000 0,6818 0,7043 0,6807

B1 0,1061 - 0,1364 0,0430 0,0985

C1 0,0606 - 0,0664 0,1237 0,0839

C2 - - 0,0035 0,0054 0,0036

C 0,0606 - 0,0699 0,1290 0,0876

D1 0,0606 - 0,0280 0,0538 0,0401

D2 0,0152 - - - 0,0018

D 0,0758 - 0,0280 0,0538 0,0420

E1 - 0,1000 0,0280 0,0054 0,0182

F1 0,0152 0,3000 0,0070 0,0215 0,0182

G1 0,0606 0,1000 0,0105 0,0054 0,0164

H1 - - 0,0070 0,0108 0,0073

I1 - - - 0,0054 0,0018

I2 - - - 0,0054 0,0018

I3 - - 0,0035 - 0,0018

I - - 0,0035 0,0108 0,0055

J1 - - 0,0070 - 0,0036

K1 0,0152 - - 0,0054 0,0036

L1 - - 0,0035 0,0054 0,0036

M1 - - - 0,0054 0,0018

N1 - 0,1000 - - 0,0018

O1 0,0152 - - - 0,0018

P1 - - 0,0035 - 0,0018

Q1 - - 0,0035 - 0,0018

R1 - - 0,0035 - 0,0018

S1 - - 0,0035 - 0,0018

T1 - - 0,0035 - 0,0018


0,8000 ±

0,1001 0,6336 ±

0,0641 0,5913 ± 0,0316

0,6970 ±

0,0333 0,6416 ±

0,0220

2n 10 66 286 186 548


total e nos grupos derivados da estratificação pela cor dos cabelos.

Resultados 51

Clara Média Escura Total

A1 0,5734 0,5924 0,5641 0,5785

A2 0,0490 0,0761 0,1538 0,0730

A3 - 0,0054 0,0513 0,0091

A4 0,0035 0,0054 0,0385 0,0091

A5 - - 0,0256 0,0036

A6 - 0,0109 - 0,0036

A7 0,0035 - - 0,0018

A8 - - 0,0128 0,0018

A 0,6294 0,6902 0,8462 0,6807

B1 0,1154 0,1087 0,0128 0,0985

C1 0,0909 0,0870 0,0513 0,0839

C2 0,0035 0,0054 - 0,0036

C 0,0944 0,0924 0,0513 0,0876

D1 0,0524 0,0380 - 0,0401

D2 0,0035 - - 0,0018

D 0,0559 0,0380 - 0,0420

E1 0,0210 0,0163 0,0128 0,0182

F1 0,0210 0,0054 0,0385 0,0182

G1 0,0245 0,0109 - 0,0164

H1 - 0,0217 - 0,0073

I1 - - 0,0128 0,0018

I2 - - 0,0128 0,0018

I3 0,0035 - - 0,0018

I 0,0035 - 0,0256 0,0055

J1 0,0035 0,0054 - 0,0036

K1 0,0070 - - 0,0036

L1 - 0,0054 0,0128 0,0036

M1 0,0035 - - 0,0018

N1 0,0035 - - 0,0018

O1 0,0035 - - 0,0018

P1 0,0035 - - 0,0018

Q1 0,0035 - - 0,0018

R1 0,0035 - - 0,0018

S1 0,0035 - - 0,0018

T1 - 0,0054 - 0,0018


0,6450 ± 0,0298

0,6247 ± 0,0382

0,6567 ±

0,0557 0,6416 ±

0,0220

2n 286 184 78 548


total e nos grupos derivados da estratificação pela cor da pele.

Resultados 52

Presença Ausência Total

A1 0,3929 0,6121 0,5785

A2 0,0238 0,0819 0,0730

A3 - 0,0108 0,0091

A4 0,0119 0,0086 0,0091

A5 - 0,0043 0,0036

A6 - 0,0043 0,0036

A7 0,0119 - 0,0018

A8 - 0,0022 0,0018

A 0,4405 0,7241 0,6807

B1 0,1667 0,0862 0,0985

C1 0,1310 0,0754 0,0839

C2 - 0,0043 0,0036

C 0,1310 0,0797 0,0876

D1 0,0833 0,0323 0,0401

D2 - 0,0022 0,0018

D 0,0833 0,0345 0,0420

E1 0,0119 0,0194 0,0182

F1 0,0476 0,0129 0,0182

G1 0,0595 0,0086 0,0164

H1 - 0,0086 0,0073

I1 - 0,0022 0,0018

I2 - 0,0022 0,0018

I3 0,0119 - 0,0018

I 0,0119 0,0043 0,0055

J1 - 0,0043 0,0036

K1 0,0119 0,0022 0,0036

L1 - 0,0043 0,0036

M1 0,0119 - 0,0018

N1 - 0,0022 0,0018

O1 - 0,0022 0,0018

P1 0,0119 - 0,0018

Q1 - 0,0022 0,0018

R1 0,0119 - 0,0018

S1 - 0,0022 0,0018

T1 - 0,0022 0,0018


0,7958 ±

0,0334 0,6048 ±

0,0252 0,6416 ±

0,0220

2n 84 464 548


total e nos grupos derivados da estratificação de acordo com a presença ou ausência de sardas.

Resultados 53

4.5 Desequilibrio de ligação

O desequilíbrio de ligação entre os loci estudados foi testado através dos

programas Arlequin 3.5 e Haploview 4.2. Após a reconstrução dos haplótipos, já com a

fase gamética conhecida, estes programas avaliam a presença de associações

significativas entre alelos de dois pares de loci distintos. Dentre os 22 SNPs que

apresentaram variação, o SNP +2013 foi desconsiderado de todas estas análises de

desequilíbrio de ligação pelo fato de a única amostra que apresentava variação nesta

posição ter sido descartada durante a comparação dos resultados gerados pelos

métodos EM e PHASE. Adicionalmente, o SNP trialélico +1690 foi retirado das análises

realizadas pelo programa Haploview, uma vez que o mesmo aceita apenas a inclusão

de marcadores bialélicos.

Do total de 210 pares de SNPs gerados, 36 deles apresentaram desvios

significativos de acordo com o teste exato de desequilíbrio de ligação ao nível de 5%

(marcados em negrito na Tabela 7). O gráfico gerado pelo Haploview 4.2 (Figura 7)

sumariza o desequilíbrio de ligação entre os 190 pares de SNPs avaliados, destacando

suas posições e distâncias relativas ao longo do gene e seus valores de D’ e LOD (log of

the likelihood odds ratio). As cores dos quadrados representam a intensidade de

desequilíbrio entre os pares. A cor branca representa pares com valor baixo de D’,

indicando ausência de desequilíbrio; a cor vermelha representa pares com valor alto

de D’ e de LOD, indicando desequilíbrio elevado e significativo, enquanto a cor azul

representa valores altos de D’, mas baixo LOD, representativo de um desequilíbrio

elevado, mas não-significativo.

Resultados 54

Todos os pares de SNPs marcados em vermelho no gráfico do Haploview (figura

7) foram significativos pelos testes realizados pelo Arlequin, segundo o critério de 5%

para o valor de p (Tabela 7), sendo que esses pares envolviam principalmente os loci

+1558 e +2322.

Resultados 55

Tabela 7 – Pares de SNPs analisados (SNP1 e SNP2) e seus respectivos valores de D’ com

intervalo de confiança (IC), r², LOD e p com desvio padrão (DP).

SNP1 SNP2 D’ (IC) r² LOD p (±DP)

1558GT 1580GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,05 1,000 ± 0,0000

1558GT 1627TC 1,0 ( 0,15 - 0,99 ) 0,0160 0,99 0,102 ± 0,0030

1558GT 1645GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,05 1,000 ± 0,0000

1558GT 1654GA 0,6 ( 0,06 - 0,89 ) 0,0020 0,28 0,494 ± 0,0051

1558GT 1664CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,05 1,000 ± 0,0000

1558GT 1690GA - - - 0,329 ± 0,0041

1558GT 1698GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,05 1,000 ± 0,0000

1558GT 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,10 1,000 ± 0,0000

1558GT 1831CGT 1,0 ( 0,07 - 0,98 ) 0,0020 0,48 0,608 ± 0,0049

1558GT 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,05 1,000 ± 0,0000

1558GT 1846GC 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,19 0,354 ± 0,0052

1558GT 1858CT 1,0 ( 0,09 - 0,99 ) 0,0030 0,58 0,365 ± 0,0047

1558GT 1868GA 1,0 ( 0,48 - 1 ) 0,0120 2,51 0,00465 ± 0,0007

1558GT 1877CG 1,0 ( 0,15 - 0,99 ) 0,0160 0,99 0,11 ± 0,0028

1558GT 1966TC 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,19 0,354 ± 0,0041

1558GT 2097CT 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,19 0,35 ± 0,0050

1558GT 2260GC 1,0 ( 0,07 - 0,98 ) 0,0020 0,48 0,608 ± 0,0046

1558GT 2280CT 1,0 ( 0,06 - 0,98 ) 0,0020 0,34 0,55 ± 0,0049

1558GT 2322AG 1,0 ( 0,62 - 1 ) 0,0180 3,70 0,000396 ± 0,0002

1558GT 2346GA 1,0 ( 0,06 - 0,98 ) 0,0020 0,34 0,545 ± 0,0057

1580GA 1627TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1645GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1654GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1580GA 1664CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1690GA - - - 1,000 ± 0,0000

1580GA 1698GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1831CGT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1580GA 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1580GA 1868GA 1,0 ( 0,15 - 0,99 ) 0,0180 1,04 0,000 ± 0,0000

1580GA 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1580GA 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1580GA 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0123 ± 0,0010

1580GA 2322AG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1580GA 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0136 ± 0,0011

1627TC 1645GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 1654GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1627TC 1664CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 1690GA - - - 1,000 ± 0,0000

1627TC 1698GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

Resultados 56

Continuação Tabela 4


1627TC 1831CGT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1627TC 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1627TC 1868GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0923 ± 0,0028

1627TC 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1627TC 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1627TC 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0144 ± 0,0012

1627TC 2322AG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1627TC 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0132 ± 0,0012

1645GA 1654GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1645GA 1664CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 1690GA - - - 1,000 ± 0,0000

1645GA 1698GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 1831CGT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1645GA 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 1858CT 1,0 ( 0,2 - 0,99 ) 0,0820 1,68 0,0189 ± 0,0013

1645GA 1868GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0952 ± 0,0033

1645GA 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1645GA 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1645GA 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0125 ± 0,0011

1645GA 2322AG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1645GA 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0136 ± 0,0010

1654GA 1664CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1654GA 1690GA - - - 1,000 ± 0,0000

1654GA 1698GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1654GA 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0769 ± 0,0027

1654GA 1831CGT 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,20 0,368 ± 0,0046

1654GA 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1654GA 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,08 1,000 ± 0,0000

1654GA 1858CT 1,0 ( 0,05 - 0,98 ) 0,0010 0,24 1,000 ± 0,0000

1654GA 1868GA 1,0 ( 0,16 - 0,99 ) 0,0050 1,02 0,0605 ± 0,0019

1654GA 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1654GA 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,08 1,000 ± 0,0000

1654GA 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,08 1,000 ± 0,0000

1654GA 2260GC 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,20 0,359 ± 0,0052

1654GA 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0010 0,14 0,281 ± 0,0043

1654GA 2322AG 0,904 (0,73 -0,97) 0,2470 17,93 0 ± 0,0000

1654GA 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0010 0,14 0,262 ± 0,0046

1664CT 1690GA - - - 1,000 ± 0,0000

1664CT 1698GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

Resultados 57



1664CT 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1664CT 1831CGT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1664CT 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1664CT 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1664CT 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1664CT 1868GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,092 ± 0,0027

1664CT 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1664CT 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1664CT 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1664CT 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1664CT 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0109 ± 0,0010

1664CT 2322AG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1664CT 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,013 ± 0,0012

1690GA 1698GA - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 1805GA - - - 0,0218 ± 0,0012

1690GA 1831CGT - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 1844TC - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 1846GC - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 1858CT - - - 0,00149 ± 0,0004

1690GA 1868GA - - - 0,309 ± 0,0039

1690GA 1877CG - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 1966TC - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 2097CT - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 2260GC - - - 1,000 ± 0,0000

1690GA 2280CT - - - 0,0641 ± 0,0018

1690GA 2322AG - - - 0,427 ± 0,0047

1690GA 2346GA - - - 0,0589 ± 0,0023

1698GA 1805GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1698GA 1831CGT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1698GA 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1698GA 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1698GA 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1698GA 1868GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0872 ± 0,0027

1698GA 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1698GA 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1698GA 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1698GA 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1698GA 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0121 ± 0,0009

1698GA 2322AG 1,0 ( 0,13 - 0,99 ) 0,0120 0,88 0,135 ± 0,0033

1698GA 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0105 ± 0,0009

1805GA 1831CGT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,0372 ± 0,0016

1805GA 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1805GA 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0132 ± 0,0010

1805GA 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 1,000 ± 0,0000

1805GA 1868GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,08 0,175 ± 0,0037

1805GA 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1805GA 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0124 ± 0,0011

Resultados 58



1805GA 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0135 ± 0,0010

1805GA 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,033 ± 0,0015

1805GA 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1805GA 2322AG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0010 0,12 0,243 ± 0,0042

1805GA 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1831CGT 1844TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1831CGT 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,03 1,000 ± 0,0000

1831CGT 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,10 1,000 ± 0,0000

1831CGT 1868GA 1,0 ( 0,07 - 0,98 ) 0,0020 0,42 0,222 ± 0,0046

1831CGT 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1831CGT 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,03 1,000 ± 0,0000

1831CGT 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,03 1,000 ± 0,0000

1831CGT 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,08 0,17 ± 0,0039

1831CGT 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1831CGT 2322AG 1,0 ( 0,09 - 0,99 ) 0,0030 0,62 0,133 ± 0,0041

1831CGT 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1844TC 1846GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1844TC 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1844TC 1868GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0888 ± 0,0028

1844TC 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1844TC 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1844TC 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1844TC 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1844TC 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0134 ± 0,0012

1844TC 2322AG 1,0 ( 0,13 - 0,99 ) 0,0120 0,88 0,14 ± 0,0033

1844TC 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0113 ± 0,0010

1846GC 1858CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 1,000 ± 0,0000

1846GC 1868GA 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,17 0,323 ± 0,0049

1846GC 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1846GC 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1846GC 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1846GC 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,03 1,000 ± 0,0000

1846GC 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,0477 ± 0,0023

1846GC 2322AG 1,0 ( 0,05 - 0,98 ) 0,0010 0,25 0,427 ± 0,0050

1846GC 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,0522 ± 0,0022

1858CT 1868GA 1,0 ( 0,08 - 0,98 ) 0,0020 0,50 0,321 ± 0,0051

1858CT 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1858CT 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 1,000 ± 0,0000

1858CT 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 1,000 ± 0,0000

1858CT 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,10 1,000 ± 0,0000

1858CT 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,07 1,000 ± 0,0000

1858CT 2322AG 1,0 ( 0,11 - 0,99 ) 0,0030 0,74 0,38 ± 0,0044

1858CT 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,07 1,000 ± 0,0000

1868GA 1877CG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0905 ± 0,0027

1868GA 1966TC 0,175 (0,02 -0,64) 0,0020 0,19 0,0425 ± 0,0019

1868GA 2097CT 1,0 ( 0,05 - 0,97 ) 0,0010 0,17 0,315 ± 0,0050

1868GA 2260GC 1,0 ( 0,07 - 0,98 ) 0,0020 0,42 0,235 ± 0,0037

Resultados 59



1868GA 2280CT 0,214(0,03 - 0,57) 0,0060 0,48 0,0172 ± 0,0011

1868GA 2322AG 1,0 ( 0,58 - 1 ) 0,0150 3,22 0,00277 ± 0,0005

1868GA 2346GA 1,0 ( 0,06 - 0,98 ) 0,0010 0,29 0,484 ± 0,0048

1877CG 1966TC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1877CG 2097CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,00 1,000 ± 0,0000

1877CG 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 1,000 ± 0,0000

1877CG 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0105 ± 0,0011

1877CG 2322AG 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

1877CG 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,96 ) 0,0000 0,01 0,0132 ± 0,0011

1966TC 2097CT 0,244(0,06 - 0,59) 0,0600 1,23 0,0286 ± 0,0018

1966TC 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,03 1,000 ± 0,0000

1966TC 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,0517 ± 0,0022

1966TC 2322AG 0,424(0,08 - 0,79) 0,0090 0,69 0,00901 ± 0,0009

1966TC 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,0452 ± 0,0019

2097CT 2260GC 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,03 1,000 ± 0,0000

2097CT 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,051 ± 0,0020

2097CT 2322AG 0,424(0,08 - 0,79) 0,0090 0,69 0,00703 ± 0,0008

2097CT 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,02 0,0492 ± 0,0020

2260GC 2280CT 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

2260GC 2322AG 1,0 ( 0,09 - 0,99 ) 0,0030 0,62 0,116 ± 0,0033

2260GC 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,06 1,000 ± 0,0000

2280CT 2322AG 1,0 ( 0,07 - 0,98 ) 0,0020 0,43 0,232 ± 0,0042

2280CT 2346GA 1,0 ( 0,04 - 0,97 ) 0,0000 0,04 0,0898 ± 0,0033

2322AG 2346GA 0,67 ( 0,3 - 0,88 ) 0,0390 2,77 0 ± 0,0000

Resultados 60

Figu

ra

7 –

G

ráfi

co

gera

do

p

elo

H

aplo

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4

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2.

Resultados 61

4.6 Network

Foi construída uma network utilizando-se o programa Network 4.6,

relacionando os 31 haplótipos gerados por nossas reconstruções (figura 8). Nela, os

haplótipos são representados pelos círculos enquanto as linhas que os unem,

representam as 22 mutações avaliadas que os diferenciam. O diâmetro de cada círculo

é proporcional à freqüência do haplótipo em questão.

Observa-se, pela disposição dos haplótipos, que 15 haplótipos derivam por um

único passo mutacional do haplótipo ancestral A1. Dentre estes 15 haplótipos estão

outros quatro haplótipos relativamente freqüentes (A2, B1, C1 e G1), a partir dos quais

derivam de dois a seis haplótipos secundários. Apenas um haplótipo da rede (I2) não

se conecta por um único passo mutacional a pelo menos um destes cinco haplótipos

centrais.

Resultados 62

Fi

gura

8 –

Red

e d

e H

apló

tip

os

gera

da

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ork

4.6

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SNP

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apló

tip

o.

Resultados 63

4.7 Associações encontradas

Foram avaliadas as associações entre fenótipos e genótipos, representadas

pelos respectivos valores obtidos de significância (p) pelo teste exato de Fisher e seus

valores de Odds Ratio (OR). As Tabelas 8 e 9 possuem as categorias fenotípicas

utilizadas nas análises, separadas por locus a fim de se avaliar a presença da

associação. Estão mostradas as associações com valores de probabilidade inferiores a

10%, a fim de apresentar não apenas as associações significativas ao nível de 5%, mas

também algumas tendências de associação que possam ser melhor avaliadas em

estudos subseqüentes em outras amostras populacionais.

A Tabela 8 mostra as associações encontradas a nível alélico e genotípico,

enquanto a Tabela 9 mostra as associações a nível haplotípico e de proteínas.

Resultados 64

Tabela 8 - Associações dos Alelos e Genótipos de cada locus com as características fenotípicas

avaliadas. OR: Odds Ratio (valores de p não significativos estão sublinhados)

SNP Alelo/Genótipo Característica Valor p OR

+ 1 5 5 8

T Cabelo Castanho 0,0004 2,8784

G Cabelo Preto 0,0006 3,4892

GG Cabelo Castanho 0,0003 0,3004

GT Cabelo Castanho 0,0005 3,4497

GG Cabelo Preto 0,0019 3,3077

GT Cabelo Preto 0,0155 0,3661

G Olhos Azuis 0,0152 10,4990

T Olhos Verdes 0,0061 2,2951

GG Olhos Azuis 0,0181 10,5200

GT Olhos Azuis 0,0315 0,1107

GG Olhos Verdes 0,0080 0,4150

GT Olhos Verdes 0,0252 2,2061

G Pele Escura 0,0013 10,6479

GG Pele Escura 0,0034 10,4712

GT Pele Escura 0,0094 0,1119

T Presença de Sardas 0,0319 2,1233

TT Presença de Sardas 0,0506 5,7317

+ 1 6 4 5

A Cabelo Ruivo 0,0247 122,7800

AG Cabelo Ruivo 0,0247 127,6200

GG Cabelo Ruivo 0,0247 0,0078

+ 1 6 5 4

A Pele Clara 0,0929 2,3058

G Pele Escura 0,0357 8,8170

AG Pele Escura 0,0907 0,1302


A Presença de Sardas 0,0796 2,3333

+ 1 8 3 1

T Cabelo Ruivo 0,0002 23,8667

C Cabelo Castanho 0,0470 3,7339

CC Cabelo Ruivo 0,0019 0,0455

CT Cabelo Ruivo 0,0265 11,7333

TT Cabelo Ruivo 0,0250 126,2300


+ 1 8 4 6

G Pele Clara 0,0534 9,8110

C Pele Média 0,0124 18,1710

C Olhos Castanho Escuros 0,0217 14,5910

Resultados 65



+ 1 8 5 8

T Cabelo Ruivo 0,0385 8,1364

C Cabelo Preto 0,0702 6,3000

CC Cabelo Ruivo 0,0312 0,0947

CT Cabelo Ruivo 0,0263 11,7778

CC Olhos Azuis 0,0450 0,2024

CT Olhos Azuis 0,0353 5,5809


CC Ausência de Sardas 0,0255 4,2125

+ 1 8 6 8

A Cabelo Preto 0,0090 2,1916

AA Cabelo Preto 0,0344 4,8258

AG Olhos Castanho Claros 0,0040 3,1250

AA Olhos Castanho Escuros 0,0154 6,8000

+ 2 0 9 7

C Pele Clara 0,0256 12,0360

CC Pele Clara 0,0251 12,2640

CT Pele Clara 0,0251 0,0815

T Cabelo Preto 0,0457 8,0652

CC Cabelo Preto 0,0450 0,1216

CT Cabelo Preto 0,0450 8,2222

+ 2 2 6 0

C Cabelo Ruivo 0,0031 14,5636


CG Cabelo Ruivo 0,0025 19,6500

GG Cabelo Ruivo 0,0025 0,0509

+ 2 3 2 2

A Cabelo Castanho 0,0023 2,1758


AA Cabelo Castanho 0,0042 2,2527

AG Cabelo Castanho 0,0174 0,5020

AA Cabelo Preto 0,0009 0,3827

AG Cabelo Preto 0,0080 2,1571


A Olhos Verdes 0,0184 2,1757

G Olhos Castanho Escuros 0,0330 1,7271

AA Olhos Verdes 0,0131 2,4321

AG Olhos Verdes 0,0169 0,4139

AA Olhos Castanho Escuros 0,0498 0,5706

A Pele Clara 0,0522 1,6242

G Pele Escura 0,0008 2,7339

AA Pele Clara 0,0303 1,8228

AG Pele Clara 0,0352 0,5344

AA Pele Escura 0,0032 0,3344

AG Pele Escura 0,0173 2,3843


Resultados 66



+ 2 3 4 6

G Cabelo Castanho 0,0045 11,1508

A Cabelo Preto 0,0017 8,8994

AG Cabelo Castanho 0,0042 0,0864

GG Cabelo Castanho 0,0042 11,5702

AG Cabelo Preto 0,0015 9,3176


G Olhos Verdes 0,0426 8,5330

A Olhos Castanho Escuros 0,0041 7,4328

AG Olhos Verdes 0,0407 0,1136

GG Olhos Verdes 0,0407 8,7990

AG Olhos Cast Escuro 0,0038 7,7344

GG Olhos Cast Escuro 0,0038 0,1293

G Pele Clara 0,0313 4,9802

A Pele Escura 2,19817E-05 16,5405

AG Pele Clara 0,0297 0,1950

GG Pele Clara 0,0297 5,1270

AG Pele Escura 1,65215E-05 18,4242

GG Pele Escura 1,65215E-05 0,0543

Resultados 67

Tabela 9 – Associações dos Haplótipos (Hapl) e Proteínas (Prot) com as características

fenotípicas avaliadas. OR: Odds Ratio (valores de p não significativos estão sublinhados)

Haplótipo/Proteína Característica Valor p OR

Hapl A1 Cabelo Castanho 0,0470 1,4151

Hapl A1 Ausência de Sardas 0,0003 2,4384

Hapl A2 Pele Clara 0,0316 0,4672

Hapl A2 Pele Escura 0,0075 2,8701

Hapl A2 Cabelo Preto 0,0144 2,2976

Hapl A3 Pele Clara 0,0245 0,0817


Hapl A3 Olhos Castanho Escuros 0,0073 18,6970





Prot A Pele Clara 0,0078 0,6071

Prot A Pele Escura 0,0006 2,9202

Prot A Ausência de Sardas 8,32229E-07 3,3345

Hapl B1 Pele Escura 0,0033 0,1022

Hapl B1 Olhos Azuis 0,0259 0,0977

Hapl B1 Olhos Verdes 0,0032 2,4393

Hapl B1 Cabelo Castanho 0,0023 2,6000

Hapl B1 Cabelo Preto 0,0013 0,3087

Hapl B1 Presença de Sardas 0,0289 2,1200

Prot B Pele Escura 0,0033 0,1022

Prot B Olhos Azuis 0,0259 0,0977

Prot B Olhos Verdes 0,0032 2,4393

Prot B Cabelo Castanho 0,0023 2,6000

Prot B Cabelo Preto 0,0013 0,3087

Prot B Presença de Sardas 0,0289 2,1200

Hapl C1 Olhos Verdes 0,0090 0,3122

Hapl C1 Cabelo Preto 0,0220 2,0798

Prot C Olhos Verdes 0,0250 0,3673

Prot C Cabelo Preto 0,0167 2,0864

Hapl F1 / Prot F Cabelo Ruivo 0,0005 32,5102

Resultados 68


Haplótipo/Proteína Característica Valor p OR

Hapl G1 / Prot G Cabelo Loiros 0,0152 6,1548

Hapl G1 / Prot G Presença de Sardas 0,0057 7,2785

Hapl H1 Pele Média 0,0124 18,1750

Hapl H1 Olhos Castanho Escuros 0,0196 15,2220

Prot H Pele Clara 0,0516 0,1003

Prot H Pele Média 0,0124 18,1750

Prot H Olhos Castanho Escuros 0,0196 15,2220

Hapl N1/Prot N Cabelo Ruivo 0,0182 170,0500

69

5 – DISCUSSÃO

Discussão 70

5.1 Dificuldades laboratoriais

As principais dificuldades encontradas para a realização deste projeto estavam

relacionadas à coleta e classificação das amostras. Houve grande dificuldade nas

coletas de amostras em certo período da pesquisa, devido ao movimento no

Hemocentro do HCFMRP-USP, principal local de obtenção de voluntários, ter se

reduzido enormemente durante alguns meses. Além disso, a classificação dos

indivíduos no que se refere à pigmentação da pele também constituiu um processo

complexo. A classificação utilizada por Fitzpatrick (1988), apesar de relativamente

precisa e de fácil utilização, não foi exatamente simples de ser aplicada às nossas

amostras. As categorias de I a VI de Fitzpatrick levam em consideração a exposição ao

sol e a ocorrência de bronzeamento e queimaduras. No entanto, essas categorias

parecem ter sido elaboradas para classificação ligada ao risco de doenças de pele, uma

vez que a mesma subdivide os tons de pele clara em varias categorias (I,II e III),

enquanto deixa a pele negra restrita a apenas uma delas (VI).

Desse modo, as categorias sofreram pequenas alterações na classificação de

nossas amostras. A reação ao sol passou a não ser o fator determinante na

categorização dos tipos I a VI, uma vez que praticamente todos os indivíduos

respondiam “nunca” quando perguntados se se queimavam quando tomavam sol.

Além disso, pareceu extremamente impreciso situar indivíduos de tons de pele

distintos na categoria VI somente por considerar a presença de “pele negra”. Sendo

assim, passamos a classificar na categoria VI somente indivíduos de pele

marcadamente escura e incluir na categoria V os indivíduos de pele negra de tons mais

claros.

Discussão 71

Além das questões relacionadas à coleta e classificação das amostras, é

importante mencionar que houve, ainda, certa dificuldade na padronização da PCR do

gene MC1R, uma vez que o protocolo descrito nunca havia sido utilizado em nosso

laboratório por nenhum pesquisador.

5.2 Aspectos Populacionais

5.2.1 Polimorfismos genéticos do gene MC1R

A análise dos 29 SNPs conhecidos do gene MC1R revelou que 7 deles não

apresentavam qualquer variação nas amostras avaliadas. Observa-se que esses 7 loci

apresentam seus alelos menos freqüentes em freqüências extremamente baixas

(maioria em torno de 1%) nos bancos de dados de outros estudos realizados

(www.genecards.org), podendo ser esse um dos motivos de não termos encontrado

qualquer variabilidade nos mesmos em nossas amostras.

Um levantamento de diversos trabalhos da literatura feito por Savage et al.

(2008) contendo as freqüências de diversos SNPs do MC1R revelou diferenças

consideráveis entre as populações selecionadas. Quando comparamos nossos dados

de freqüência com as freqüências mundiais de 19 loci que são comuns entre os

trabalhos (Tabela 10), observamos que enquanto as populações do Brasil, do norte e

sul da Europa e dos Estados Unidos apresentavam variação em entre 57,89% e 84,21%

nos marcadores, as amostras populacionais da África (26,32%) e da Ásia (31,58%)

apresentavam reduzida variabilidade.

Discussão 72

Tabela 10 – Distribuição das freqüências relativas de 19 loci do gene MC1R entre as populações africana, asiática, européia e norte-americana (Savage et al., 2008) comparadas àquelas obtidas nos presente trabalho.

SNPs África Ásia Norte da Europa

Sul da Europa

EUA Brasil

+1513 0 0 0 0,24 0 0

+1558 0 0 10,69 15,75 13,21 10,14

+1580 0 1,17 0 0,06 0 0,18

+1627 0 0 0,15 0,12 0,19 0,18

+1632 0 0 1 0,12 1,51 0

+1654 0 13,41 8 3,7 9,06 4,29

+1664 0 0 0,08 0,12 0 0,18

+1698 1,71 0 0 0,12 0 0,36

+1739 0 1,75 0 0,06 0 0

+1805 0 0 0,62 1,31 0,75 0,54

+1831 0 0 5,62 3,16 6,42 2,34

+1844 0 0 0,23 0,48 1,51 0,36

+1858 0 0 8,31 1,85 7,17 2,33

+1868 0 75,51 4,62 1,61 4,15 9,35

+1884 0,43 0 0 0 0 0

+1966 2,14 0,15 0,08 0 0 0,72

+2260 0 0 1 1,43 2,45 2,35

+2280 2,99 0 0 0 0 1,42

+2322 44,44 13,27 7,69 2,33 10,75 13,88

n 117 343 650 838 265 284

A análise destes dados permite ainda concluir que não é inesperado o fato de

que 11 destes loci tenham se apresentado monomórficos (+1513, +1580, +1627,

+1632, +1664, +1698, +1739, +1805, +1844, +1884, +1966), segundo o critério de 99%,

uma vez que todos esses marcadores possuem uma freqüência extremamente baixa

em todas as outras amostras populacionais analisadas. Considerando-se os outros 8

loci polimórficos, quando as populações são comparadas entre si, observa-se

diferenças notáveis nas freqüências em algumas delas. Quatro destes SNPs foram

monomórficos nos africanos e asiáticos analisados, dois SNPs foram monomórficos

Discussão 73

apenas entre os africanos, e um deles foi polimórfico apenas entre africanos. Um único

SNP (+2322) se mostrou polimórfico em todas as populações consideradas; ainda

assim, a freqüência do alelo menos freqüente variou de 2,33% (sul da Europa) a

44,44% (África). Vale a pena ressaltar que todos esses loci polimórficos diferiam

visivelmente entre as populações avaliadas por Savage et al. (2008).

5.2.2 Equilíbrio de Hardy-Weinberg

Os 4 desvios encontrados nos loci +1558, +1846, +1868 e +1966 estão fora do

esperado para o nível de significância de 5%, que aceitaria em torno de 1 desvio em

um grupo de 22 testes. Esta diferença é estatisticamente significante ( 2 = 8,0478; p =

0,0046). É interessante ressaltar que dois destes marcadores (+1558 e +1868) estão

entre os três SNPs que possuem alelos classificados como variação comum, isto é,

possuem alelos com freqüência superior a 5%.

Mesmo que fosse encontrado um valor de desvio dentro do esperado para os

testes, isso não significaria que a população em questão esteja totalmente livre da

ação de fatores evolutivos. Muitas das premissas do princípio de equilíbrio podem

estar sendo quebradas simultaneamente, fazendo com que os fatores de desvio

estejam se anulando uns aos outros (Guo e Thompson, 1992). Dentre esses possíveis

desvios concomitantes, podemos mencionar alguns como a ocorrência de mistura

étnica, de acasalamentos não aleatórios, de deriva genética, de seleção e de

endogamia, entre outras.

Discussão 74

Em nossas amostras, muito provavelmente, um dos fatores de desvio atuante

seja a presença de mistura étnica. Sabe-se da alta miscigenação da população de

Ribeirão Preto, já tendo sido caracterizada para marcadores de ancestralidade, com

proporções européia, africana e ameríndia de 59%, 34% e 7% em média,

respectivamente (Ferreira et al., 2006; Muniz et al., 2008). Este fator, associado à

ocorrência de casamentos preferenciais no que se refere à ancestralidade e

pigmentação da pele, pode resultar em estratificação populacional, caracterizando

deficiência de heterozigotos na amostra total (efeito Wallund). De fato, estes quatro

marcadores apresentam deficiência de heterozigotos.

Outro aspecto que pode ter influenciado significativamente está relacionado

ao processo de amostragem. As primeiras 150 amostras foram coletadas de forma

completamente aleatória. Entretanto, após verificarmos que alguns fenótipos estavam

pouco representados, buscamos enriquecer a amostra quanto aos fenótipos menos

freqüentes em nossa população, fazendo com que os indivíduos não fossem

amostrados aleatoriamente. De fato, a realização do teste de aderência ao Equilíbrio

de Hardy-Weinberg realizado com a amostra de 150 indivíduos inicialmente coletados

evidencia desvios do equilíbrio apenas com relação aos SNPs +1846 e +1966 (dados

não apresentados), o que é estatisticamente esperado ( 2 = 0,7751; p = 0,3786).

Portanto, estes fatores podem ter contribuído simultaneamente para a

determinação dos desvios observados em relação às proporções esperadas segundo o

modelo de Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Discussão 75

5.2.3 Haplótipos do gene MC1R

Através da reconstrução de haplótipos em nossas amostras, observamos que o

haplótipo mais freqüente A1 (Tabela 3 a 6) também se trata do haplótipo considerado

ancestral, contendo apenas os alelos selvagens (Tabela 2). O banco de dados do dbSNP

(Sherry et al., 2001) confirma que os alelos que constituem o haplótipo A1 são os

ancestrais em humanos, enquanto que o UCSC Genome Browser (Kent et al., 2002;

Fujita et al., 2011) informa qual alelo desses marcadores é encontrado em outras

espécies de primatas, embora não especifique se os marcadores são monomórficos em

tais espécies e qual o tamanho amostral considerado. A composição dos dados destes

SNPs indica que orangotangos compartilham o haplótipo A1 com humanos, enquanto

chimpanzés e macacos rhesus possuem os haplótipos A2 e D1, respectivamente. É

interessante ressaltar que estes três haplótipos estão entre os cinco haplótipos mais

freqüentes em humanos (Figura 8) e diferem entre si em apenas uma ou duas posições

(+1654 e/ou +2322) (Tabela 2). Tal fato nos permite sugerir que os haplótipos A1 e/ou

A2 estavam representados no pool gênico ancestral dos grandes primatas.

O haplótipo A1 se posiciona no centro da rede haplotípica construída para o

gene MC1R (Figura 8). Todos os demais haplótipos encontrados se diferenciam do

haplótipo A1 por um (15 dos haplótipos), dois (14) ou três(1) passos mutacionais. Este

padrão de rede haplotípica, conhecido como star-like ou star-shaped, normalmente é

interpretado como sendo consistente tanto com eventos populacionais (expansão

demográfica recente), quanto com seleção purificadora, por serem processos que

resultam em um excesso de haplótipos pouco freqüentes e que diferem por poucos

passos mutacionais a partir de um haplótipo ancestral (Nachman et al., 1996; Forster

Discussão 76

et al., 2001). Entretanto, o fato de os haplótipos B1, C1 e D1, que codificam proteínas

distintas, estarem em freqüências relativamente elevadas pode estar refletindo

seleção positiva a favor de novas variantes protéicas que teria ocorrido após a

expansão do homem moderno em direção à eurásia.

Quando se considera a estrutura dos haplótipos do gene MC1R, observa-se que

a magnitude do desequilíbrio de ligação entre os SNPs é elevada. O parâmetro D’

atingiu valor máximo em 95,79% dos 190 pares de SNPs analisados. Apesar dos valores

altos de D’ encontrados ao longo de todo o gene, observamos a predominância de

baixos valores de r² (Figura 7 e Tabela 7) em praticamente todos os pares, chegando ao

máximo a 0,247 no par +1654/+2322. Isto se explica pelo fato de que estes dois

parâmetros são complementares e refletem aspectos distintos do desequilíbrio de

ligação: à medida que D’aumenta, r2 pode assumir qualquer valor entre zero e (D’)2

(Hartl e Clark, 2007). Enquanto D’, na ausência de um dos quatro haplótipos possíveis

para um par de SNPs bialélicos, atingirá valor igual a 1,0, o r2 dependerá das

freqüências dos alelos dos SNPs em questão. Sendo assim, D’ pode ser definido como

uma medida influenciada pela quantidade de recombinação, enquanto que r2 traz

informações sobre quando e onde as mutações ocorreram na genealogia dos

haplótipos (Hartl e Clark, 2007).

Portanto, a combinação dos valores desses índices permite indicar a presença

de desequilíbrio de ligação completo (valor de D’ igual a 1, independente do valor de

r2; caso o valor de r² também fosse igual a 1, seria observado um desequilíbrio de

ligação perfeito) entre 95,79% dos SNPs do gene MC1R, o que caracteriza que o gene

MC1R é alvo de poucos eventos de recombinação.

Discussão 77

Por fim, o teste exato de desequilíbrio de ligação proporciona informações

relacionadas à significância do desequilíbrio. Dos 210 pares de loci submetidos a esta

análise, apenas 36 se mostraram significantes ao nível de 5% e 50 ao nível de 10%.

Sabe-se que a presença de loci que possuem alelos com freqüências menores que 5%,

como é o nosso caso, pode reduzir o poder estatístico dos testes da análise de

desequilíbrio. Isto é consistente com a presente análise, na qual 31 dos 36 testes

(86,11%) foram significantes ao nível de 5%; enquanto 45 dos 50 testes (90%)

significantes ao nível de 10% envolvem ao menos um dos SNPs do par considerado

polimórfico. Dos demais 160 testes, apenas 99 (61,88%) envolvem um ou dois SNPs

considerados polimórficos (Tabela 7).

5.3 Associações encontradas

Alguns aspectos da melanôgenese podem ser comprometidos ou

potencializados pelas mutações no MC1R, notadamente a capacidade do receptor se

ligar ao hormônio sinalizador, a capacidade dele se ligar à proteína G e produzir cAMP

e a viabilidade dele se expressar na superfície celular do melanócito. Sendo assim, as

associações com características de pigmentação encontradas no presente estudo

podem ser interpretadas com base em aspectos evolutivos, estruturais do gene e da

proteína MC1R, e em resultados de alguns estudos funcionais in vitro realizados com o

MC1R.

A estrutura da proteína codificada pelo gene MC1R revela a existência de

alguns loops intracelulares (Figura 9). O segundo loop intracelular do MC1R foi

apontado como sendo uma região altamente conservada entre os vertebrados, bem

Discussão 78

como entre os subtipos humanos de receptores de melanocortina (MC2R, MC3R,

MC4R e MC5R) (Sanchez-Laorden et al., 2009). Esse domínio dos GPCRs (receptores

associados à proteína G) foi demonstrado como sendo um dos mais importantes no

funcionamento desses receptores, por ser justamente o sítio de acoplamento e

ativação das proteínas G (Shan et al., 2010).

Se considerarmos a disposição do receptor na membrana e seus domínios

isoladamente (hélices transmembrana, loops intracelulares e loops extracelulares),

podemos observar que a maior parte das associações de SNPs (+1831, +1846, +1858,

+1868) encontradas no presente estudo relacionam-se com aqueles aminoácidos

situados nesse segundo loop intracelular (Figura 9). Do total de 317 aminoácidos do

MC1R, 21% estão situados em loops intracelulares, sendo que 8 destes correspondem

a sítios contendo mutações (12%). Comparando-se a ocorrência de mutações nos

domínios mencionados, essa proporção de 12% é a mais elevada entre eles (9% para

hélices transmembrana e 4% para loops extracelulares), mostrando que essa região do

gene MC1R sofreu alteração no regime seletivo a ela imposto, deixando de ser

conservada para se tornar alvo de mutações sinônimas e não-sinônimas.

Não seria de se esperar que houvesse tantas mutações num trecho tão

conservado evolutivamente e tão essencial na função do receptor. No entanto, o fato

de, ao longo da evolução, o homem ter perdido os pêlos que o protegiam da radiação

solar pode ser a explicação para tais mutações nesse trecho. A partir do momento que

as migrações para fora da África começaram, para regiões de menor incidência solar,

pode-se considerar que houve um relaxamento da pressão seletiva sobre o MC1R,

permitindo o surgimento e manutenção de mutações que gerassem novos receptores

Discussão 79

com função reduzida, inviáveis até então numa região tão sujeita a radiação UV como

a África. Esses receptores menos eficientes, por outro lado, possivelmente foram

selecionados positivamente em regiões de baixa latitude por gerarem fenótipos mais

claros, úteis na fixação da vitamina D, pela absorção através da pele da pouca

quantidade de luz disponível (Rees, 2003; Soejima e Koda, 2007).

5.3.1 Mutações não sinônimas

A literatura aponta para alguns estudos in vitro realizados com o MC1R

selvagem (proteína A) e suas variantes (Val60Leu, Asp84Glu, Val92Met, Arg142His,

Arg151Cys, Ile155Thr, Arg160Trp, Arg163Gln e Asp294His) (vide Tabela 1), utilizando-

se de estímulos com o hormônio α-melanócito estimulante (α-MSH). Foi observado

que quase a totalidade dos receptores que possuíam alguma variante apresentavam

níveis reduzidos de cAMP quando comparados aos níveis gerados pelo receptor

selvagem (Beaumont et al., 2007; Perez Oliva et al., 2009). Esse fato evidencia a

interrupção de uma das etapas de sinalização do MC1R, ou seja, a incapacidade desses

receptores se ligarem à proteína G, responsável pela ativação da adenilato-ciclase e

conseqüente produção do cAMP, demonstrando assim a função reduzida de

sinalização desses receptores mutantes (Beaumont et al., 2007). Apenas uma dessas

variantes (Val92Met) apresentou níveis de cAMP maiores ou iguais aos gerados pelo

receptor selvagem.

Ao observarmos nossos dados relativos aos loci +1831 (Arg151Cys), +1858

(Arg160Trp) e +2260 (Asp294His) (Tabela 8) pode-se sugerir então que as associações

de cabelos ruivos encontradas em nossas amostras sejam devidas ao fato de essas

Discussão 80

mutações acima gerarem variantes do receptor MC1R deficientes no acoplamento à

proteína G e, conseqüentemente, na produção de cAMP. A mutação Asp294His até

apresenta uma pequena redução na afinidade pelo α-MSH, no entanto, como seus

níveis de cAMP são extremamente baixos, esse fato seria provavelmente explicado

unicamente pela incapacidade de se acoplar a proteína G (Beaumont et al., 2007).

Mesmo não tendo sido associada significativamente à nenhum fenótipo no

presente estudo, a mutação Arg142His também é mencionada como sendo importante

no MC1R, uma vez que a essa posição do aminoácido está situada no meio de um

motif DRY (Asp Arg Tyr), que foi apontado como sendo de grande importância no

acoplamento do receptor à proteína G (Beaumont et al., 2007).

Os GPCRs, como o MC1R, em geral passam por certas etapas da dinâmica

celular, que envolvem desde sua maturação no retículo endoplasmático (RE) até seu

transporte para a membrana plasmática. Um sistema de controle de qualidade celular

envolvendo chaperonas do RE avalia a existência de proteínas consideradas aberrantes

ou montadas erroneamente, as retendo no RE, até que sejam degradadas por

proteossomos no citossol (Anelli e Sitia, 2008).

Assim, a disponibilidade de GPCRs na superfície celular depende diretamente

desse tráfego de receptores originado do RE. Estudos recentes mostraram que

algumas variantes do MC1R podem apresentar padrões anômalos desse transporte

intracelular, resultando numa localização celular alterada do receptor (Beaumont et

al., 2007; Sanchez-Laorden et al., 2007; Perez Oliva et al., 2009; Sanchez-Laorden et al.,

2009). Enquanto o esperado seria que o receptor selvagem fosse encontrado na

superfície celular dos melanócitos, estes estudos mostram que algumas variantes do

Discussão 81

MC1R (Arg151Cys e Arg160Trp) podem ter seu número de receptores reduzido na

superfície, devido à retenção no interior da célula parcial ou totalmente, geralmente

no RE; enquanto outras mutações (Asp294His) podem até ter uma densidade de

superfície maior que o selvagem (Sanchez-Laorden et al., 2007).

As associações encontradas de alelos com cabelos ruivos (+1831 T [Arg151Cys]

e +1858 T [Arg160Trp]), olhos azuis e sardas (+1858 T), poderiam, portanto, ser

explicadas por esse processo de retenção.

Um estudo de Pérez Oliva et. al. (2009) mostrou que algumas mutações do

MC1R, presentes no primeiro domínio transmembrana, se associaram com a retenção

do receptor no RE, permitindo concluir em seu trabalho que esse domínio teria

importância no tráfego celular. Nosso único locus localizado nessa primeira hélice

transmembrana (+1558) mostrou algumas associações, como o alelo G associado a

cabelos pretos, pele escura e olhos azuis, e o alelo T associado a cabelos castanhos,

olhos verdes e presença de sardas.

Essa associação de olhos azuis e pele negra em um mesmo alelo pode ser

aparentemente contraditória, no entanto, sabe-se que o MC1R não é o único gene que

controla as vias da melanogênese. Diversos outros genes são conhecidos por atuarem

na biossíntese da melanina, como aqueles relacionados à síntese da tirosinase (TYR),

ao controle do pH nos melanossomos (SLC24A5 e OCA2), influenciando a proporção

feo/eumelanina e aqueles atuantes no transporte de proteínas melanossomais

(SLC45A2) (Ito e Wakamatsu, 2010). Além disso, sabe-se que algumas mutações do

MC1R podem afetar de maneiras diversas a proporção feo/eumelanina nos diferentes

Discussão 82

tecidos, com a ocorrência de indivíduos de pele escura e cabelos claros e vice-versa

(Van Raamsdonk et al., 2009).

Recentemente foi demonstrado que o MC1R passa por um processo de

dimerização, provavelmente no RE, no qual as proteínas expressas seriam acopladas

em pares antes de serem enviadas à superfície celular (Sanchez-Laorden et al., 2006).

Esse é um processo comum em vários dos GPCRs, possivelmente relacionado aos

processos de sinalização, regulação, expressão na superfície celular e transporte

desses receptores (Sanchez-Laorden et al., 2009).

Existe a hipótese de que esse processo de dimerização possa atuar como um

efeito dominante negativo no MC1R. Como mencionado anteriormente, algumas

variantes de GPCRs podem ficar retidas no RE, não chegando a se expressar na

superfície celular. Essa hipótese afirma que, através da dimerização, existe a

possibilidade de um receptor totalmente funcional acabar não se expressando

adequadamente na superfície por ter ficado preso no RE, dimerizado a uma dessas

variantes retidas. Obviamente, alguns receptores funcionais poderiam se dimerizar

entre si, chegando à superfície celular normalmente; porém, vale ressaltar que a

expressão superficial na presença de uma variante retida acabará reduzindo a

capacidade de sinalização deste receptor como um todo na célula (Beaumont et al.,

2007).

Essa seria uma explicação possível para as associações com sardas, olhos azuis

e cabelos ruivos mencionadas anteriormente nos loci +1831, +1858 e +2260 mesmo

esses alelos estando em heterozigose (Tabela 8). Estudos in vitro mostram que, de

fato, as proteínas do MC1R que contêm essas variantes podem se dimerizar com uma

Discussão 83

proteína funcional, mantendo ambas retidas no RE e resultando em uma redução

drástica de sua expressão na superfície do melanócito e, por conseqüência, a

manifestação em fenótipos claros, associados à feomelanina (Beaumont et al., 2007).

Por fim, os alelos A dos loci +1645 e +1654 se mostraram associados a cabelos

ruivos, pele clara e presença de sardas. Apesar de essas mutações ainda não terem

sido relacionadas a nenhuma alteração funcional no MC1R, as associações encontradas

sugerem que os receptores que as possuem favorecem a síntese de feomelanina. Seria

aceito pressupor que essas variantes tenham aumentado suas freqüências nos

humanos a partir do momento que as populações chegaram à regiões de menor

incidência solar, como a Europa.

Quando se considera estas mutações arranjadas em haplótipos, verifica-se que

os haplótipos B1, F1, G1, H1 e N1 e suas respectivas proteínas estão associados à

pigmentação clara (Tabela 9) e função reduzida do gene MC1R, enquanto que o C1,

associado com cabelos pretos, estaria relacionado a maior atividade do gene MC1R.

5.3.2 Mutações sinônimas

Nota-se pelas associações e estudos relatados acima que, com raras exceções,

as mutações levam a redução de função do receptor. Nossos resultados apresentados

são consistentes com a hipótese de que a proteína A (receptor ancestral) apresenta

elevada atividade, uma vez que o conjunto de haplótipos que a codificam (haplótipos

A1, A2, A3, A4 e A5, os quais diferem apenas por mutações sinônimas) se encontraram

Discussão 84

associados à pele escura, olhos castanho escuros, ausência de sardas e cabelos

castanhos e pretos (Tabela 9).

Existe a idéia que todas as mutações sinônimas são neutras à seleção natural, já

que elas não têm qualquer efeito sob a respectiva proteína, inferindo-se a partir disso

que nenhuma alteração fenotípica ocorreria. No entanto, avanços científicos vêm

mostrando que ainda não conhecemos todos os meios de atuação e força da seleção

natural sob esse tipo de mutação (Chamary et al., 2006). Alguns mecanismos celulares

que desempenham papéis importantíssimos no processo de expressão gênica podem

ser alvos da influência de algumas mutações sinônimas. Focando na tradução das

proteínas, para um dado conjunto de códons sinônimos, pode não existir uma

quantidade idêntica dos diferentes tRNAs que se ligam a esses códons. A partir desse

fato, pode-se presumir que a seleção natural favoreceria aqueles códons que fossem

traduzidos mais rapidamente, ou seja, aqueles que possuíssem maior quantidade de

tRNA disponível. Assim, uma mutação sinônima seria capaz de, em teoria, favorecer ou

dificultar a taxa de tradução de toda uma proteína.

Outro fator potencialmente dependente das mutações sinônimas é a

estabilidade do mRNA nas células, já que algumas estruturas secundárias do mRNA

podem conferir resistência à degradação prematura (Chamary e Hurst, 2005). Assim, a

seleção poderia favorecer aquelas mutações que aumentassem a chance de

pareamentos entre bases na estrutura secundária do mRNA, resultantes em estruturas

resistentes.

Das sete mutações sinônimas analisadas no MC1R, observamos associações de

dois SNPs com fenótipo de pigmentação em nossas análises (+2097 e +2322) (Tabela

Discussão 85

8). O alelo C do locus +2097 se associou à pele clara, enquanto o alelo T se mostrou

associado à presença de cabelos pretos. No caso do locus +2322, observa-se que o

alelo A se relaciona com olhos verdes, pele clara e cabelos castanhos, enquanto o alelo

G se associa à fenótipos de hiperpigmentação (pele escura, cabelos pretos e olhos

castanho escuros). As mutações relacionadas à fenótipos mais claros poderiam gerar

códons sinônimos que, como citado acima, resultassem em alterações nos processos

de tradução ou na estabilidade do mRNA nos melanócitos, mudando a

biodisponibilidade das proteínas que as possuíssem e conseqüentemente o processo

de melanogênese da célula.

5.3.3 Região 3’ não traduzida

Foram encontradas associações com um SNP situado fora da região codificante

(+2346), mais exatamente na região 3’ não traduzida (3’UTR) do MC1R. Atualmente,

diversos estudos vêm mostrando que a região 3’UTR é um dos principais alvos de

micro RNAs (miRNAs). Em células de mamíferos, os miRNAs são capazes de

desestabilizar seus transcritos-alvo através de vários mecanismos, como a

desadenilação e a remoção do cap 5’ (Lim et al., 2005).

Considerando-se que algumas mutações nessa região podem gerar trechos-alvo

no mRNA para os miRNAs, as associações de loci encontradas nesse trecho

provavelmente estariam relacionadas à atuação dos miRNAs. O alelo A do locus +2346

se associou à características de alta pigmentação, como cabelos pretos, pele escura e

olhos castanho escuros; por outro lado, o alelo G se associou a cabelos castanhos, pele

clara e olhos verdes (Tabela 8). Análises in silico (dados não apresentados)

Discussão 86

evidenciaram a existência de mais de 10 miRNAs que apresentam maior afinidade por

esta porção da região 3´UTR na presença do alelo G do que na presença do alelo A. O

alelo G poderia atuar diminuindo a estabilidade do mRNA do MC1R como um todo,

levando à quedas nos níveis de expressão, que poderiam resultar em fenótipos claros,

como em nosso caso, pele clara e olhos verdes. Entretanto, esta hipótese precisa ser

comprovada por meio de estudos funcionais que avaliem se tais microRNAs se

expressariam nos melanócitos e se haveria alteração de expressão causada pelos

miRNAs. Considerando-se as associações dos haplótipos aqui relatadas (Tabela 9),

observa-se que os haplótipos que contém o alelo A nesse locus (Haplótipos A3 e A5)

apresentam associações com pele escura, olhos castanho escuros e cabelos pretos, o

que é consistente com o raciocínio apresentado. Pode-se sugerir que estes haplótipos

tenham níveis de expressão ainda maiores do que os outros haplótipos que codificam

a mesma proteína A, resultando em uma maior produção de eumelanina.

Discussão 87

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88

6 – CONCLUSÕES E

PERSPECTIVAS FUTURAS

Conclusões e Perspectivas 89

Este foi o primeiro estudo de associação de fenótipos de pigmentação em uma

população tão miscigenada quanto a brasileira envolvendo o MC1R. O presente estudo

mostra a relevância da região codificadora do MC1R e consistência com diversos

estudos funcionais. Observa-se um conjunto de SNPs associados claramente à

fenótipos relacionados à feomelanina, enquanto outros se relacionam à ocorrência de

eumelanina. Nosso estudo permitiu a constatação dessas associações a níveis alélico,

genotípico, haplotípico e de proteína tanto com SNPs sinônimos quanto não-

sinônimos.

A avaliação de um SNP da 3’UTR e seus microRNAs, sugere que a regulação da

expressão gênica do MC1R pode ser tão importante quanto as variações estruturais da

proteína. As regiões promotora e UTR, normalmente envolvidas no controle da

expressão gênica são pouco estudas .

Atualmente não se tem muito conhecimento a respeito da possível influência

da região promotora na atuação do MC1R. Ibarrola-Villava et al. (2010) apresentam o

único trabalho envolvendo a análise da região promotora deste gene, no qual foram

utilizados 3 tag SNPs da promotora do MC1R para verificação das freqüências dos

haplótipos gerados na população espanhola, em comparação com aquelas do

HapMap. Observaram que as freqüências dos haplótipos formados diferiam entre as

populações européia, africana e asiática, sem realizarem, no entanto, nenhuma

tentativa de associação com qualquer fenótipo de pigmentação. Nenhum trabalho

envolvendo a região 3’UTR do MC1R foi encontrado durante o desenvolvimento de

nosso trabalho.

Conclusões e Perspectivas 90

Em estudos futuros seria de grande interesse a genotipagem da região

promotora e da 3’UTR do MC1R, a fim de se avaliar sua influência na pigmentação em

humanos. Variações nestas regiões poderiam elucidar a atuação sobre o MC1R,

principalmente em relação a possíveis aumentos ou reduções nos níveis de expressão

gênica, que poderiam se refletir em variações fenotípicas da pele, olhos e cabelos.

91

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

92

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100

APÊNDICES

101

APÊNDICE 1

102

APÊNDICE 2

104

APÊNDICE 3

Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa-FFCLRP

105

SNP Azuis Verdes Mel Castanho

Claros Castanho Escuros

Total

+1558

G 1,0000 0,8356 0,9231 0,8897 0,9252 0,8989 T - 0,1644 0,0769 0,1103 0,0748 0,1011

GG 1,0000 0,7123 0,9231 0,8088 0,8505 0,8191 GT - 0,2466 - 0,1618 0,1495 0,1596 TT - 0,0411 0,0769 0,0294 - 0,0213

2n 42 146 26 136 214 564

pEHW - 0,3902 0,04 0,1706 1,0000 0,049 Ho - 0,2466 - 0,1618 0,1495 0,1596

Hs - 0,2766 0,1477 0,1977 0,1390 0,1820

+1580

A - - - - 0,0047 0,0018 G 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9953 0,9982

AA - - - - - - AG - - - - 0,0093 0,0035 GG 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9907 0,9965

2n 42 148 26 136 214 566

pEHW - - - - - - Ho - - - - 0,0094 0,0035

Hs - - - - 0,0094 0,0035

+1627

C - - - 0,0074 - 0,0018 T 1,0000 1,0000 1,0000 0,9926 1,0000 0,9982

CC - - - - - - CT - - - 0,0147 - 0,0035 TT 1,0000 1,0000 1,0000 0,9853 1,0000 0,9965

2n 42 148 26 136 214 566

pEHW - - - - - - Ho - - - 0,0147 - 0,0035

Hs - - - 0,0147 - 0,0035

+1645

A 0,0238 - - - - 0,0018 G 0,9762 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9982

AA - - - - - - AG 0,0476 - - - - 0,0035 GG 0,9524 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9965

2n 42 148 26 136 214 566

pEHW - - - - - - Ho 0,0476 - - - - 0,0035

Hs 0,0476 - - - - 0,0035

+1654

A 0,0714 0,0203 0,0417 0,0441 0,0514 0,0426 G 0,9286 0,9797 0,9583 0,9559 0,9486 0,9574

AA - - - 0,0147 0,0093 0,0071 AG 0,1429 0,0405 0,0833 0,0588 0,0841 0,0709 GG 0,8571 0,9595 0,9167 0,9265 0,9065 0,9220

2n 42 148 24 136 214 564

pEHW 1,0000 1,0000 - 0,1086 0,2369 0,0813 Ho 0,1429 0,0405 0,0833 0,0588 0,0841 0,0709

Hs 0,1359 0,0400 0,0833 0,0850 0,0980 0,0816

Freqüências Alélicas e Genotípicas relativas, distribuídas em categorias segundo a cor dos olhos (pEHW –

significância do Equilíbrio de Hardy-Weinberg/ Ho – Heterozigose Observada/ Hs – Heterozigose Esperada)

APÊNDICE 4

106

Continuação



Total

+1664

C 1,0000 0,9932 1,0000 1,0000 1,0000 0,9982 T - 0,0068 - - - 0,0018

CC 1,0000 0,9865 1,0000 1,0000 1,0000 0,9965 CT - 0,0135 - - - 0,0035 TT - - - - - -

2n 42 148 26 136 214 566

pEHW - - - - - - Ho - 0,0135 - - - 0,0035

Hs - 0,0135 - - - 0,0035

+1690

A - - - 0,0147 - 0,0036 G 1,0000 0,9932 1,0000 0,9853 0,9952 0,9929 T - 0,0068 - - 0,0048 0,0036

AA - - - - - - AG - - - 0,0294 - 0,0071 GG 1,0000 0,9863 1,0000 0,9706 0,9905 0,9857 AT - - - - - - GT - 0,0137 - - 0,0095 0,0071 TT - - - - - -

2n 42 146 26 136 210 560

pEHW - - - 1,0000 - 1,0000 Ho - 0,0137 - 0,0294 0,0095 0,0143 Hs - 0,0137 - 0,0292 0,0095 0,0142

+1698

A - - - - 0,0095 0,0036 G 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9905 0,9964

AA - - - - - - AG - - - - 0,0190 0,0071 GG 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9810 0,9929

2n 42 146 26 136 210 560

pEHW - - - - 1,0000 1,0000 Ho - - - - 0,0191 0,0071

Hs - - - - 0,0190 0,0071

+1805

A - 0,0135 - - 0,0047 0,0053 G 1,0000 0,9865 1,0000 1,0000 0,9953 0,9947

AA - - - - - - AG - 0,0270 - - 0,0093 0,0106 GG 1,0000 0,9730 1,0000 1,0000 0,9907 0,9894

2n 40 148 26 136 214 564

pEHW - 1,0000 - - - 1,0000 Ho - 0,0270 - - 0,0094 0,0106

Hs - 0,0268 - - 0,0094 0,0106

107

Continuação



Total

+1831

C 1,0000 0,9797 1,0000 0,9627 0,9766 0,9768 T - 0,0203 - 0,0373 0,0234 0,0232

CC 1,0000 0,9595 1,0000 0,9403 0,9533 0,9571 CT - 0,0405 - 0,0448 0,0467 0,0393 TT - - - 0,0149 - 0,0036

2n 38 148 26 134 214 560

pEHW - 1,0000 - 0,0743 1,0000 0,1337 Ho - 0,0405 - 0,0448 0,0467 0,0393 Hs - 0,0400 - 0,0724 0,0459 0,0454

+1844

C - 0,0068 - 0,0075 - 0,0036 T 1,0000 0,9932 1,0000 0,9925 1,0000 0,9964

CC - - - - - - CT - 0,0137 - 0,0149 - 0,0071 TT 1,0000 0,9863 1,0000 0,9851 1,0000 0,9929

2n 38 146 26 134 216 560

pEHW - - - - - 1,0000 Ho - 0,0137 - 0,0149 - 0,0071

Hs - 0,0137 - 0,0149 - 0,0071

+1846

C - - - - 0,0185 0,0071 G 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9815 0,9929 CC - - - - 0,0185 0,0071 CG - - - - - - GG 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9815 0,9929

2n 38 146 26 134 216 560

pEHW - - - - 0,0001 0,0000 Ho - - - - - -

Hs - - - - 0,0365 0,0142

+1858

C 0,9250 0,9726 1,0000 0,9776 0,9861 0,9769 T 0,0750 0,0274 - 0,0224 0,0139 0,0231

CC 0,8500 0,9589 1,0000 0,9552 0,9722 0,9573 CT 0,1500 0,0274 - 0,0448 0,0278 0,0391 TT - 0,0137 - - - 0,0036

2n 40 146 26 134 216 562

pEHW 1,0000 0,0412 - 1,0000 1,0000 0,1332 Ho 0,1500 0,0274 - 0,0448 0,0278 0,0391

Hs 0,1423 0,0537 - 0,0441 0,0275 0,0453

+1868

A 0,1316 0,0411 0,0385 0,1119 0,1250 0,0964 G 0,8684 0,9589 0,9615 0,8881 0,8750 0,9036

AA 0,1053 - - - 0,0833 0,0393 AG 0,0526 0,0822 0,0769 0,2239 0,0833 0,1143 GG 0,8421 0,9178 0,9231 0,7761 0,8333 0,8464

2n 38 146 26 134 216 560

pEHW 0,0116 1,0000 - 1,0000 0,0000 0,0000 Ho 0,0526 0,0822 0,0769 0,2239 0,0833 0,1143

Hs 0,2347 0,0794 0,0769 0,2003 0,2198 0,1746

108

Continuação



Total

+1877

C 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9954 0,9982 G - - - - 0,0046 0,0018 CC 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9907 0,9964 CG - - - - 0,0093 0,0036 GG - - - - - -

2n 38 146 26 134 216 560

pEHW - - - - - - Ho - - - - 0,0093 0,0036 Hs - - - - 0,0093 0,0036

+1966

C - - - 0,0149 0,0093 0,0071 T 1,0000 1,0000 1,0000 0,9851 0,9907 0,9929

CC - - - 0,0149 0,0093 0,0071 CT - - - - - - TT 1,0000 1,0000 1,0000 0,9851 0,9907 0,9929

2n 40 148 26 134 214 562

pEHW - - - 0,0075 0,0047 0,0000 Ho - - - - - -

Hs - - - 0,0296 0,0186 0,0142

+2013

A - - - - 0,0047 0,0018 G 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9953 0,9982

AA - - - - - - AG - - - - 0,0094 0,0036 GG 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,9906 0,9964

2n 40 148 24 134 212 558

pEHW - - - - - - Ho - - - - 0,0094 0,0036

Hs - - - - 0,0094 0,0036

+2097

C 1,0000 1,0000 1,0000 0,9926 0,9811 0,9911 T - - - 0,0074 0,0189 0,0089

CC 1,0000 1,0000 1,0000 0,9853 0,9623 0,9821 CT - - - 0,0147 0,0377 0,0179 TT - - - - - -

2n 40 148 24 136 212 560

pEHW - - - - 1,0000 1,0000 Ho - - - 0,0147 0,0377 0,0179

Hs - - - 0,0147 0,0372 0,0177

+2260

C 0,0250 0,0139 0,0385 0,0373 0,0187 0,0233 G 0,9750 0,9861 0,9615 0,9627 0,9813 0,9767 CC - - - - - - CG 0,0500 0,0278 0,0769 0,0746 0,0374 0,0466 GG 0,9500 0,9722 0,9231 0,9254 0,9626 0,9534

2n 40 144 26 134 214 558

pEHW - 1,0000 - 1,0000 1,0000 1,0000 Ho 0,0500 0,0278 0,0769 0,0746 0,0374 0,0466

Hs 0,0500 0,0276 0,0769 0,0724 0,0369 0,0456

109

Continuação



Total

+2280

C 0,9750 0,9932 1,0000 0,9853 0,9769 0,9841 T 0,0250 0,0068 - 0,0147 0,0231 0,0159

CC 0,9500 0,9865 1,0000 0,9706 0,9537 0,9682 CT 0,0500 0,0135 - 0,0294 0,0463 0,0318 TT - - - - - -

2n 40 148 26 136 216 566

pEHW - - - 1,0000 1,0000 1,0000 Ho 0,0500 0,0135 - 0,0294 0,0463 0,0318 Hs 0,0500 0,0135 - 0,0292 0,0454 0,0314

+2322

A 0,8750 0,9189 0,8846 0,8529 0,8178 0,8599 G 0,1250 0,0811 0,1154 0,1471 0,1822 0,1401

AA 0,7500 0,8514 0,7692 0,7206 0,6729 0,7411 AG 0,2500 0,1351 0,2308 0,2647 0,2897 0,2376 GG - 0,0135 - 0,0147 0,0374 0,0213

2n 40 148 26 136 214 564

pEHW 1,0000 0,3837 1,0000 1,0000 0,7472 0,8017 Ho 0,2500 0,1351 0,2308 0,2647 0,2897 0,2376

Hs 0,2244 0,1500 0,2123 0,2527 0,2995 0,2413

+2346

A - - - 0,0159 0,0429 0,0202 G 1,0000 1,0000 1,0000 0,9841 0,9571 0,9798

AA - - - - - - AG - - - 0,0317 0,0857 0,0404 GG 1,0000 1,0000 1,0000 0,9683 0,9143 0,9596

2n 38 144 26 126 210 544

pEHW - - - 1,0000 1,0000 1,0000 Ho - - - 0,0318 0,0857 0,0404

Hs - - - 0,0315 0,0824 0,0397

110

SNP Clara Média Escura Total

+1558

G 0,8810 0,8883 0,9878 0,8989 T 0,1190 0,1117 0,0122 0,1011

GG 0,7959 0,7872 0,9756 0,8191 GT 0,1701 0,2021 0,0244 0,1596 TT 0,0340 0,0106 - 0,0213

2n 294 188 82 564

pEHW 0,0337 1,0000 - 0,049 Ho 0,1701 0,2021 0,0244 0,1596

Hs 0,2105 0,1995 0,0244 0,1820

+1580

A 0,0034 - - 0,0018 G 0,9966 1,0000 1,0000 0,9982

AA - - - - AG 0,0068 - - 0,0035 GG 0,9932 1,0000 1,0000 0,9965

2n 296 188 82 566

pEHW - - - - Ho 0,0068 - - 0,0035

Hs 0,0068 - - 0,0035

+1627

C 0,0034 - - 0,0018 T 0,9966 1,0000 1,0000 0,9982

CC - - - - CT 0,0068 - - 0,0035 TT 0,9932 1,0000 1,0000 0,9965

2n 296 188 82 566

pEHW - - - - Ho 0,0068 - - 0,0035

Hs 0,0068 - - 0,0035

+1645

A 0,0034 - - 0,0018 G 0,9966 1,0000 1,0000 0,9982

AA - - - - AG 0,0068 - - 0,0035 GG 0,9932 1,0000 1,0000 0,9965

2n 296 188 82 566

pEHW - - - - Ho 0,0068 - - 0,0035

Hs 0,0068 - - 0,0035

+1654

A 0,0578 0,0372 - 0,0426 G 0,9422 0,9628 1,0000 0,9574

AA 0,0136 - - 0,0071 AG 0,0884 0,0745 - 0,0709 GG 0,8980 0,9255 1,0000 0,9220

2n 294 188 82 564

pEHW 0,0697 1,0000 - 0,0813 Ho 0,0884 0,0745 - 0,0709

Hs 0,1093 0,0721 - 0,0816

Freqüências Alélicas e Genotípicas relativas, distribuídas em categorias segundo a cor da pele (pEHW –


111

Continuação


+1664

C 0,9966 1,0000 1,0000 0,9982 T 0,0034 - - 0,0018

CC 0,9932 1,0000 1,0000 0,9965 CT 0,0068 - - 0,0035 TT - - - -

2n 296 188 82 566

pEHW - - - - Ho 0,0068 - - 0,0035

Hs 0,0068 - - 0,0035

+1690T

A 0,0034 0,0054 - 0,0036 G 0,9966 0,9892 0,9875 0,9929 T - 0,0054 0,0125 0,0036

AA - - - - AG 0,0068 0,01075 - 0,0071 GG 0,9932 0,9785 0,9750 0,9857 AT - - - - GT - 0,01075 0,0250 0,0071 TT - - - -

2n 294 186 80 560

pEHW - 1,0000 - 1,0000 Ho 0,0068 0,0215 0,0250 0,0143

Hs 0,0068 0,0215 0,0250 0,0142

+1698

A 0,0034 - 0,0125 0,0036 G 0,9966 1,0000 0,9875 0,9964

AA - - - - AG 0,0068 - 0,0250 0,0071 GG 0,9932 1,0000 0,9750 0,9929

2n 294 186 80 560

pEHW - - - 1,0000 Ho 0,0068 - 0,0250 0,0071

Hs 0,0068 - 0,0250 0,0071

+1805

A 0,0068 0,0053 - 0,0053 G 0,9932 0,9947 1,0000 0,9947

AA - - - - AG 0,0136 0,0106 - 0,0106 GG 0,9864 0,9894 1,0000 0,9894

2n 294 188 82 564

pEHW 1,0000 - - 1,0000 Ho 0,0136 0,0106 - 0,0106

Hs 0,0136 0,0106 - 0,0106

112

Continuação


+1831

C 0,9692 0,9946 0,9634 0,9768 T 0,0308 0,0054 0,0366 0,0232

CC 0,9452 0,9892 0,9268 0,9571 CT 0,0480 0,0108 0,0732 0,0393 TT 0,0068 - - 0,0036

2n 292 186 82 560

pEHW 0,1193 - 1,0000 0,1337 Ho 0,0480 0,0108 0,0732 0,0393 Hs 0,0600 0,0108 0,0714 0,0454

+1844

C 0,0069 - - 0,0036 T 0,9931 1,0000 1,0000 0,9964

CC - - - - CT 0,0138 - - 0,0071 TT 0,9862 1,0000 1,0000 0,9929

2n 290 188 82 560

pEHW 1,0000 - - 1,0000 Ho 0,0138 - - 0,0071

Hs 0,0138 - - 0,0071

+1846

C - 0,0213 - 0,0071 G 1,0000 0,9787 1,0000 0,9929 CC - 0,0213 - 0,0071 CG - - - - GG 1,0000 0,9787 1,0000 0,9929

2n 290 188 82 560

pEHW - 0,0001 - 0,0000 Ho - - - -

Hs - 0,0419 - 0,0142

+1858

C 0,9658 0,9840 1,0000 0,9769 T 0,0342 0,0160 - 0,0231

CC 0,9384 0,9681 1,0000 0,9573 CT 0,0548 0,0319 - 0,0391 TT 0,0068 - - 0,0036

2n 292 188 82 562

pEHW 0,1473 1,0000 - 0,1332 Ho 0,0548 0,0319 - 0,0391

Hs 0,0664 0,0316 - 0,0453

+1868

A 0,1034 0,1011 0,0610 0,0964 G 0,8966 0,8989 0,9390 0,9036

AA 0,0483 0,0426 - 0,0393 AG 0,1103 0,1170 0,1220 0,1143 GG 0,8414 0,8404 0,8780 0,8464

2n 290 188 82 560

pEHW 0,0001 0,0054 1,0000 0,0000 Ho 0,1103 0,1170 0,1220 0,1143

Hs 0,1861 0,1827 0,1159 0,1746

113

Continuação


+1877

C 1,0000 0,9947 1,0000 0,9982 G - 0,0053 - 0,0018 CC 1,0000 0,9894 1,0000 0,9964 CG - 0,0106 - 0,0036 GG - - - -

2n 290 188 82 560

pEHW - - - - Ho - 0,0106 - 0,0036 Hs - 0,0106 - 0,0036

+1966

C 0,0069 1,0000 0,0244 0,0071 T 0,9931 - 0,9756 0,9929

CC 0,0069 1,0000 0,0244 0,0071 CT - - - - TT 0,9931 - 0,9756 0,9929

2n 290 190 82 562

pEHW 0,0035 - 0,0123 0,0000 Ho - - - -

Hs 0,0138 - 0,0482 0,0142

+2013

A - - 0,0125 0,0018 G 1,0000 1,0000 0,9875 0,9982

AA - - - - AG - - 0,0250 0,0036 GG 1,0000 1,0000 0,9750 0,9964

2n 288 190 80 558

pEHW - - - - Ho - - 0,0250 0,0036

Hs - - 0,0250 0,0036

+2097

C 1,0000 0,9842 0,9750 0,9911 T - 0,0158 0,0250 0,0089

CC 1,0000 0,9684 0,9500 0,9821 CT - 0,0316 0,0500 0,0179 TT - - - -

2n 290 190 80 560

pEHW - 1,0000 1,0000 1,0000 Ho - 0,0316 0,0500 0,0179

Hs - 0,0312 0,0494 0,0177

+2260

C 0,0274 0,0215 0,0125 0,0233 G 0,9726 0,9785 0,9875 0,9767 CC - - - - CG 0,0548 0,0430 0,0250 0,0466 GG 0,9452 0,9570 0,9750 0,9534

2n 292 186 80 558

pEHW 1,0000 1,0000 - 1,0000 Ho 0,0548 0,0430 0,0250 0,0466

Hs 0,0535 0,0423 0,0250 0,0456

114

Continuação


+2280

C 0,9898 0,9842 0,9634 0,9841 T 0,0102 0,0158 0,0366 0,0159

CC 0,9796 0,9684 0,9268 0,9682 CT 0,0204 0,0316 0,0732 0,0318 TT - - - -

2n 294 190 82 566

pEHW 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 Ho 0,0204 0,0316 0,0732 0,0318 Hs 0,0203 0,0312 0,0714 0,0314

+2322

A 0,8878 0,8723 0,7317 0,8599 G 0,1122 0,1277 0,2683 0,1401

AA 0,7959 0,7447 0,5366 0,7411 AG 0,1837 0,2553 0,3902 0,2376 GG 0,0204 - 0,0732 0,0213

2n 294 188 82 564

pEHW 0,3929 0,3495 1,0000 0,8017 Ho 0,1837 0,2553 0,3902 0,2376

Hs 0,2000 0,2239 0,3975 0,2413

+2346

A 0,0071 0,0056 0,0976 0,0202 G 0,9929 0,9944 0,9024 0,9798

AA - - - - AG 0,0142 0,0111 0,1951 0,0404 GG 0,9858 0,9889 0,8049 0,9596

2n 282 180 82 544

pEHW 1,0000 - 1,0000 1,0000 Ho 0,0142 0,0111 0,1951 0,0404

Hs 0,0141 0,0111 0,1783 0,0397

115

SNP Ruivos Loiros Castanhos Pretos Total

+1558

G 1,0000 0,8939 0,8562 0,9583 0,8989 T - 0,1061 0,1438 0,0417 0,1011

GG 1,0000 0,8485 0,7397 0,9167 0,8191 GT - 0,0909 0,2329 0,0833 0,1596 TT - 0,0606 0,0274 - 0,0213

2n 14 66 292 192 564

pEHW - 0,0248 0,4999 1,0000 0,049 Ho - 0,0909 0,2329 0,0833 0,1596

Hs - 0,1925 0,2471 0,0803 0,1820

+1580

A - - - 0,0052 0,0018 G 1,0000 1,0000 1,0000 0,9948 0,9982

AA - - - - - AG - - - 0,0104 0,0035 GG 1,0000 1,0000 1,0000 0,9896 0,9965

2n 14 66 294 192 566

pEHW - - - - - Ho - - - 0,0104 0,0035

Hs - - - 0,0104 0,0035

+1627

C - - 0,0034 - 0,0018 T 1,0000 1,0000 0,9966 1,0000 0,9982

CC - - - - - CT - - 0,0068 - 0,0035 TT 1,0000 1,0000 0,9932 1,0000 0,9965

2n 14 66 294 192 566

pEHW - - - - - Ho - - 0,0068 - 0,0035

Hs - - 0,0068 - 0,0035

+1645

A 0,0714 - - - 0,0018 G 0,9286 1,0000 1,0000 1,0000 0,9982

AA - - - - - AG 0,1429 - - - 0,0035 GG 0,8571 1,0000 1,0000 1,0000 0,9965

2n 14 66 294 192 566

pEHW - - - - - Ho 0,1429 - - - 0,0035

Hs 0,1429 - - - 0,0035

+1654

A - 0,0758 0,0308 0,0521 0,0426 G 1,0000 0,9242 0,9692 0,9479 0,9574

AA - - 0,0068 0,0104 0,0071 AG - 0,1515 0,0480 0,0833 0,0709 GG 1,0000 0,8485 0,9452 0,9063 0,9220

2n 14 66 292 192 564

pEHW - 1,0000 0,1193 0,2186 0,0813 Ho - 0,1515 0,0480 0,0833 0,0709

Hs - 0,1422 0,0600 0,0993 0,0816

Freqüências Alélicas e Genotípicas relativas, distribuídas em categorias segundo a cor dos cabelos (pEHW –


116

Continuação


+1664

C 1,0000 1,0000 0,9966 1,0000 0,9982 T - - 0,0034 - 0,0018

CC 1,0000 1,0000 0,9932 1,0000 0,9965 CT - - 0,0068 - 0,0035 TT - - - - -

2n 14 66 294 192 566

pEHW - - - - - Ho - - 0,0068 - 0,0035

Hs - - 0,0068 - 0,0035

+1690T

A - - 0,0068 - 0,0036 G 1,0000 1,0000 0,9898 0,9947 0,9929 T - - 0,0034 0,0053 0,0036

AA - - - - - AG - - 0,0136 - 0,0071 GG 1,0000 1,0000 0,9796 0,9894 0,9857 AT - - - - - GT - - 0,0068 0,0106 0,0071 TT - - - - -

2n 14 64 294 188 560

pEHW - - 1,0000 - 1,0000 Ho - - 0,0204 0,0106 0,0143

Hs - - 0,0203 0,0106 0,0142

+1698

A - - 0,0034 0,0053 0,0036 G 1,0000 1,0000 0,9966 0,9947 0,9964

AA - - - - - AG - - 0,0068 0,0106 0,0071 GG 1,0000 1,0000 0,9932 0,9894 0,9929

2n 14 64 294 188 560

pEHW - - - - 1,0000 Ho - - 0,0068 0,0106 0,0071

Hs - - 0,0068 0,0106 0,0071

+1805

A - 0,0152 0,0034 0,0053 0,0053 G 1,0000 0,9848 0,9966 0,9947 0,9947

AA - - - - - AG - 0,0303 0,0068 0,0105 0,0106 GG 1,0000 0,9697 0,9932 0,9895 0,9894

2n 14 66 294 190 564

pEHW - - - - 1,0000 Ho - 0,0303 0,0068 0,0105 0,0106

Hs - 0,0303 0,0068 0,0105 0,0106

117

Continuação


+1831

C 0,7143 0,9848 0,9897 0,9734 0,9768 T 0,2857 0,0152 0,0103 0,0266 0,0232

CC 0,5714 0,9697 0,9795 0,9468 0,9571 CT 0,2857 0,0303 0,0205 0,0532 0,0393 TT 0,1429 - - - 0,0036

2n 14 66 292 188 560

pEHW 0,4406 - 1,0000 1,0000 0,1337 Ho 0,2857 0,0303 0,0206 0,0532 0,0393 Hs 0,4396 0,0303 0,0204 0,0521 0,0454

+1844

C - 0,0152 0,0034 - 0,0036 T 1,0000 0,9848 0,9966 1,0000 0,9964

CC - - - - - CT - 0,0303 0,0069 - 0,0071 TT 1,0000 0,9697 0,9931 1,0000 0,9929

2n 14 66 290 190 560

pEHW - - - - 1,0000 Ho - 0,0303 0,0069 - 0,0071

Hs - 0,0303 0,0069 - 0,0071

+1846

C - - 0,0069 0,0105 0,0071 G 1,0000 1,0000 0,9931 0,9895 0,9929 CC - - 0,0069 0,0105 0,0071 CG - - - - - GG 1,0000 1,0000 0,9931 0,9895 0,9929

2n 14 66 290 190 560

pEHW - - 0,0035 0,0053 0,0000 Ho - - - - -

Hs - - 0,0138 0,0209 0,0142

+1858

C 0,8571 0,9394 0,9795 0,9947 0,9769 T 0,1429 0,0606 0,0205 0,0053 0,0231

CC 0,7143 0,9091 0,9589 0,9895 0,9573 CT 0,2857 0,0606 0,0411 0,0105 0,0391 TT - 0,0303 - - 0,0036

2n 14 66 292 190 562

pEHW 1,0000 0,0916 1,0000 - 0,1332 Ho 0,2857 0,0606 0,0411 0,0105 0,0391

Hs 0,2637 0,1156 0,0404 0,0105 0,0453

+1868

A - 0,0625 0,0788 0,1421 0,0964 G 1,0000 0,9375 0,9212 0,8579 0,9036

AA - - 0,0274 0,0737 0,0393 AG - 0,1250 0,1027 0,1368 0,1143 GG 1,0000 0,8750 0,8699 0,7895 0,8464

2n 14 64 292 190 560

pEHW - 1,0000 0,0055 0,0003 0,0000 Ho - 0,1250 0,1027 0,1368 0,1143

Hs - 0,1191 0,1456 0,2451 0,1746

118

Continuação


+1877

C 1,0000 1,0000 0,9966 1,0000 0,9982 G - - 0,0034 - 0,0018 CC 1,0000 1,0000 0,9932 1,0000 0,9964 CG - - 0,0068 - 0,0036 GG - - - - -

2n 14 64 292 190 560

pEHW - - - - - Ho - - 0,0068 - 0,0036 Hs - - 0,0069 - 0,0036

+1966

C 1,0000 1,0000 0,0068 0,0104 0,0071 T - - 0,9932 0,9896 0,9929

CC 1,0000 1,0000 0,0068 0,0104 0,0071 CT - - - - - TT - - 0,9932 0,9896 0,9929

2n 12 66 292 562

pEHW - - 0,0034 0,0052 0,0000 Ho - - - - -

Hs - - 0,0137 0,0207 0,0142

+2013

A - - - 0,0053 0,0018 G 1,0000 1,0000 1,0000 0,9947 0,9982

AA - - - - - AG - - - 0,0106 0,0036 GG 1,0000 1,0000 1,0000 0,9894 0,9964

2n 12 66 292 188 558

pEHW - - - - - Ho - - - 0,0106 0,0036

Hs - - - 0,0106 0,0036

+2097

C 1,0000 1,0000 0,9966 0,9787 0,9911 T - - 0,0034 0,0213 0,0089

CC 1,0000 1,0000 0,9931 0,9574 0,9821 CT - - 0,0069 0,0426 0,0179 TT - - - - -

2n 14 66 292 188 560

pEHW - - - 1,0000 1,0000 Ho - - 0,0069 0,0426 0,0179

Hs - - 0,0069 0,0419 0,0177

+2260

C 0,2143 - 0,0310 0,0053 0,0233 G 0,7857 1,0000 0,9690 0,9947 0,9767 CC - - - - - CG 0,4286 - 0,0621 0,0106 0,0466 GG 0,5714 1,0000 0,9379 0,9894 0,9534

2n 14 66 290 188 558

pEHW 1,0000 - 1,0000 - 1,0000 Ho 0,4286 - 0,0621 0,0106 0,0466

Hs 0,3626 - 0,0604 0,0106 0,0456

119

Continuação


+2280

C 1,0000 1,0000 0,9864 0,9740 0,9841 T - - 0,0136 0,0260 0,0159

CC 1,0000 1,0000 0,9728 0,9479 0,9682 CT - - 0,0272 0,0521 0,0318 TT - - - - -

2n 14 66 294 192 566

pEHW - - 1,0000 1,0000 1,0000 Ho - - 0,0272 0,0521 0,0318 Hs - - 0,0269 0,0510 0,0314

+2322

A 1,0000 0,8636 0,9041 0,7813 0,8599 G - 0,1364 0,0959 0,2188 0,1401

AA 1,0000 0,7273 0,8151 0,6146 0,7411 AG - 0,2727 0,1781 0,3333 0,2376 GG - - 0,0068 0,0521 0,0213

2n 14 66 292 192 564

pEHW - 1,0000 1,0000 0,7687 0,8017 Ho - 0,2727 0,1781 0,3333 0,2376

Hs - 0,2392 0,1740 0,3436 0,2413

+2346

A 0,0714 - 0,0035 0,0479 0,0202 G 0,9286 1,0000 0,9965 0,9521 0,9798

AA - - - - - AG 0,1429 - 0,0071 0,0957 0,0404 GG 0,8571 1,0000 0,9929 0,9043 0,9596

2n 14 60 282 188 544

pEHW - - - 1,0000 1,0000 Ho 0,1429 - 0,0071 0,0957 0,0404

Hs 0,1429 - 0,0071 0,0917 0,0397

120

SNP Presença Ausência Total

+1558

G 0,8295 0,9118 0,8989 T 0,1705 0,0882 0,1011

GG 0,7273 0,8361 0,8191 GT 0,2045 0,1513 0,1596 TT 0,0682 0,0126 0,0213

2n 88 476 564

pEHW 0,0857 0,4039 0,049 Ho 0,2045 0,1513 0,1596

Hs 0,2861 0,1612 0,1820

+1580

A 0,0114 - 0,0018 G 0,9886 1,0000 0,9982

AA - - - AG 0,0227 - 0,0035 GG 0,9773 1,0000 0,9965

2n 88 478 566

pEHW - - - Ho 0,0227 - 0,0035

Hs 0,0227 - 0,0035

+1627

C 0,0114 - 0,0018 T 0,9886 1,0000 0,9982

CC - - - CT 0,0227 - 0,0035 TT 0,9773 1,0000 0,9965

2n 88 478 566

pEHW - - - Ho 0,0227 - 0,0035

Hs 0,0227 - 0,0035

+1645

A - 0,0021 0,0018 G 1,0000 0,9979 0,9982

AA - - - AG - 0,0042 0,0035 GG 1,0000 0,9958 0,9965

2n 88 478 566

pEHW - - - Ho - 0,0042 0,0035

Hs - 0,0042 0,0035

+1654

A 0,0795 0,0357 0,0426 G 0,9205 0,9643 0,9574

AA 0,0227 0,0042 0,0071 AG 0,1136 0,0630 0,0709 GG 0,8636 0,9328 0,9220

2n 88 476 564

pEHW 0,2274 0,2562 0,0813 Ho 0,1136 0,0630 0,0709

Hs 0,1481 0,0690 0,0816


+1664

C 1,0000 0,9979 0,9982 T - 0,0021 0,0018

CC 1,0000 0,9958 0,9965 CT - 0,0042 0,0035 TT - - -

2n 88 478 566

pEHW - - - Ho - 0,0042 0,0035

Hs - 0,0042 0,0035

+1690T

A - 0,0042 0,0036 G 1,0000 0,9916 0,9929 T - 0,0042 0,0036

AA - - - AG - 0,00845 0,0071 GG 1,0000 0,9831 0,9857 AT - - - GT - 0,00845 0,0071 TT - - -

2n 86 474 560

pEHW - 1,0000 1,0000 Ho - 0,0169 0,0143

Hs - 0,0168 0,0142

+1698

A 0,0116 0,0021 0,0036 G 0,9884 0,9979 0,9964

AA - - - AG 0,0233 0,0042 0,0071 GG 0,9767 0,9958 0,9929

2n 88 474 560

pEHW - - 1,0000 Ho 0,0233 0,0042 0,0071

Hs 0,0233 0,0042 0,0071

+1805

A 0,0114 0,0042 0,0053 G 0,9886 0,9958 0,9947

AA - - - AG 0,0227 0,0084 0,0106 GG 0,9773 0,9916 0,9894

2n 88 476 564

pEHW - 1,0000 1,0000 Ho 0,0227 0,0084 0,0106

Hs 0,0227 0,0084 0,0106

Freqüências Alélicas e Genotípicas relativas, distribuídas em categorias segundo a ocorrência de sardas (pEHW

– significância do Equilíbrio de Hardy-Weinberg/ Ho – Heterozigose Observada/ Hs – Heterozigose Esperada)

121

Continuação


+1831

C 0,9432 0,9831 0,9768 T 0,0568 0,0169 0,0232

CC 0,9091 0,9661 0,9571 CT 0,0682 0,0339 0,0393 TT 0,0227 - 0,0036

2n 88 472 560

pEHW 0,1129 1,0000 0,1337 Ho 0,0682 0,0339 0,0393 Hs 0,1084 0,0334 0,0454

+1844

C - 0,0042 0,0036 T 1,0000 0,9958 0,9964

CC - - - CT - 0,0085 0,0071 TT 1,0000 0,9915 0,9929

2n 88 472 560

pEHW - 1,0000 1,0000 Ho - 0,0085 0,0071

Hs - 0,0085 0,0071

+1846

C - 0,0085 0,0071 G 1,0000 0,9915 0,9929 CC - 0,0085 0,0071 CG - - - GG 1,0000 0,9915 0,9929

2n 88 472 560

pEHW - 0,0000 0,0000 Ho - - -

Hs - 0,0168 0,0142

+1858

C 0,9318 0,9852 0,9769 T 0,0682 0,0148 0,0231

CC 0,8864 0,9705 0,9573 CT 0,0909 0,0295 0,0391 TT 0,0227 - 0,0036

2n 88 474 562

pEHW 0,1664 1,0000 0,1332 Ho 0,0909 0,0295 0,0391

Hs 0,1285 0,0292 0,0453

+1868

A 0,1477 0,0869 0,0964 G 0,8523 0,9131 0,9036

AA 0,0909 0,0297 0,0393 AG 0,1136 0,1144 0,1143 GG 0,7955 0,8559 0,8464

2n 88 472 560

pEHW 0,0024 0,0005 0,0000 Ho 0,1136 0,1144 0,1143

Hs 0,25 0,16 0,1746


+1877

C 1,0000 0,9979 0,9982 G - 0,0021 0,0018 CC 1,0000 0,9958 0,9964 CG - 0,0042 0,0036 GG - - -

2n 88 472 560

pEHW - - - Ho - 0,0042 0,0036 Hs - 0,0042 0,0036

+1966

C 0,0233 0,0042 0,0071 T 0,9767 0,9958 0,9929

CC 0,0233 0,0042 0,0071 CT - - - TT 0,9767 0,9958 0,9929

2n 86 476 562

pEHW 0,0118 0,0021 0,0000 Ho - - -

Hs 0,0460 0,0084 0,0142

+2013

A - 0,0021 0,0018 G 1,0000 0,9979 0,9982

AA - - - AG - 0,0042 0,0036 GG 1,0000 0,9958 0,9964

2n 86 472 558

pEHW - - - Ho - 0,0042 0,0036

Hs - 0,0042 0,0036

+2097

C 1,0000 0,9894 0,9911 T - 0,0106 0,0089

CC 1,0000 0,9788 0,9821 CT - 0,0212 0,0179 TT - - -

2n 88 472 560

pEHW - 1,0000 1,0000 Ho - 0,0212 0,0179

Hs - 0,0210 0,0177

+2260

C 0,0227 0,0234 0,0233 G 0,9773 0,9766 0,9767 CC - - - CG 0,0455 0,0468 0,0466 GG 0,9545 0,9532 0,9534

2n 88 470 558

pEHW 1,0000 1,0000 1,0000 Ho 0,0455 0,0468 0,0466

Hs 0,0449 0,0458 0,0456

122

Continuação


+2280

C 0,9886 0,9833 0,9841 T 0,0114 0,0167 0,0159

CC 0,9773 0,9665 0,9682 CT 0,0227 0,0335 0,0318 TT - - -

2n 88 478 566

pEHW - 1,0000 1,0000 Ho 0,0227 0,0335 0,0318 Hs 0,0227 0,0330 0,0314

+2322

A 0,8864 0,8550 0,8599 G 0,1136 0,1450 0,1401

AA 0,7955 0,7311 0,7411 AG 0,1818 0,2479 0,2376 GG 0,0227 0,0210 0,0213

2n 88 476 564

pEHW 0,4371 1,0000 0,8017 Ho 0,1818 0,2479 0,2376

Hs 0,2038 0,2484 0,2413

+2346

A 0,0122 0,0216 0,0202 G 0,9878 0,9784 0,9798

AA - - - AG 0,0244 0,0433 0,0404 GG 0,9756 0,9567 0,9596

2n 82 462 544

pEHW - 1,0000 1,0000 Ho 0,0244 0,0433 0,0404

Hs 0,0244 0,0424 0,0397

leonardo arduino marano - teses.usp.br · ruivos estavam associados à dois e um outro associado à...

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