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ROSENI BORTOLON GRASSI DE CARLI
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE
SISTEMAS MICRO E NANOPARTICULADOS
CONTENDO EXTRATO DAS CASCAS DE Rapanea
ferruginea Mez. (PRIMULACEAE)
Itajaí (SC)
2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ROSENI BORTOLON GRASSI DE CARLI
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE
SISTEMAS MICRO E NANOPARTICULADOS
CONTENDO EXTRATO DAS CASCAS DE Rapanea
ferruginea Mez. (PRIMULACEAE)
Tese submetida à Universidade do Vale
do Itajaí como parte dos requisitos para a
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri
Lucinda-Silva
Itajaí (SC)
Agosto de 2017
Ficha Catalográfica
C194d
Carli, Roseni Bortolon Grassi de, 1965-
Desenvolvimento e avaliação biológica de sistemas micro e
nanoparticulados contendo extrato das cascas de Rapanea ferruginea mez.
(primulaceae) [manuscrito] / Roseni Bortolon Grassi De Carli.- Itajaí, SC.
2017.
167 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.
Bibliografias f. 151-166.
Cópia de computador (Printout(s)).
Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
“Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda-Silva.”
1. Quitosana. 2. Produtos naturais. 3. Farmacologia.
4. Nanopartículas. 5. Micropartículas. I. Universidade do Vale do Itajaí. II.
Título.
.
CDU: 615.32
Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE
SISTEMAS MICRO E NANOPARTICULADOS
CONTENDO EXTRATO DAS CASCAS DE Rapanea
ferruginea Mez. (PRIMULACEAE)
Roseni Bortolon Grassi de Carli
Agosto/2017
Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda-Silva.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas
Bioativas.
Número de Páginas: 166
Sistemas de liberação micro e nano estruturados são capazes de controlar o tempo e o
local de liberação dos fármacos a uma taxa específica e apresentam várias vantagens
quando comparados às formas farmacêuticas convencionais. A Rapanea ferruginea
Mez. (Primulaceae) é uma espécie vegetal estudada pelo Núcleo de Investigações
Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI que já demonstrou eficácia como
anti-inflamatória e antinociceptiva. Estudos analíticos de caracterização dos extratos
das cascas e dos marcadores ácido mirsinoico A (AMA) e ácido mirsinoico B (AMB),
demonstraram que os compostos isolados possuem baixa solubilidade em meio
aquoso, oportunizando o emprego de sistemas micro e nanoestruturados como
estratégia para aumentar a solubilidade e consequentemente a biodisponibilidade
destes compostos. Este estudo teve por objetivo desenvolver micropartículas (MP) e
nanopartículas (NP) contendo extrato das cascas de R. ferruginea utilizando a
quitosana como formadora de matriz e avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo.
MP de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea foram preparadas por
spray-drying e caracterizadas. A otimização do processo foi realizada através de
planejamento fatorial 23. A propriedade de bioadesão foi avaliada em modelo ex vivo
e a atividade anti-inflamatória oral in vivo foi avaliada pelo modelo de edema de pata.
Foram desenvolvidos e caracterizados hidrogéis para a incorporação das MP contendo
extrato das cascas de R. ferruginea e a atividade anti-inflamatória tópica in vivo foi
avaliada pelo modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton. Ainda com a
finalidade de aumentar a solubilidade em meio aquoso do extrato das cascas de R.
ferruginea foram desenvolvidas e caracterizadas NP de quitosana pelo método de
geleificação ionotrópica com tripolifosfato. A incorporação do extrato das cascas de
R. ferruginea em MP de quitosana por spray-drying foi realizada com sucesso. As MP
apresentaram tamanho menor que 5 µm, sendo esféricas e sem aglomeração. As MP
apresentaram perfil de liberação modificada dos marcadores do extrato, propriedades
bioadesivas e atividade anti-inflamatória oral em modelo de formalina in vivo tanto
para a inibição da dor inflamatória quanto para a redução do edema. As MP contendo
o extrato das cascas de R. ferruginea incorporadas nos hidrogéis de alginato e
carbômero 940 na concentração de 0,1 e 0,2%, permaneceram como sistemas
microparticulados após incorporação nos hidrogéis, estabilidade esta proporcionada
pela reticulação das MP catiônicas pelos hidrogéis aniônicos. As MP contendo extrato
veiculado nos hidrogéis apresentaram maior potencial anti-inflamatório em
comparação com o extrato incorporado em creme convencional. As NP apresentaram
tamanho inferior a 200 nm e monodisperso, forma esférica e sem aglomerados, sendo
as proporções extrato:polímero e TPP:quitosana importantes para às suas
propriedades físicas. O estudo permitiu desenvolver novos sistemas de liberação para
administração oral e tópica do extrato das cascas de R. ferruginea e, por meio das
estratégias tecnológicas, melhorar as propriedades de dispersão aquosa e eficácia anti-
inflamatória. Os sistemas são viáveis e potenciais veículos no desenvolvimento de um
medicamento fitoterápico inovador contendo o derivado vegetal.
Palavras-chave: Anti-inflamatório.Fitoterápico. Hidrogéis. Micropartículas.
Nanopartículas. Quitosana. Rapanea ferruginea.
DEVELOPMENT AND BIOLOGICAL EVALUATION
OF MICRO- AND NANOPARTICULATE SYSTEMS
CONTAINING STEM BARK EXTRACT OF Rapanea
ferruginea MEZ. (PRIMULACEAE)
Roseni Bortolon Grassi de Carli
August 2017
Supervisor: Dr. Ruth Meri Lucinda Silva
Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.
Number of pages: 166
Micro- and nanostructured systems are applied to drug controlled release and targeted
drug release at a specific site and rate, and have several advantages over conventional
dosage forms. Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) is a plant studied by the
Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) of UNIVALI that has
already shown anti-inflammatory and antinociceptive activities. Analytical
characterization of stem bark extracts and A myrsinoic acid (MAA) and B myrsinoic
acid (MAB) markers have shown that the isolated compounds have low solubility in
aqueous medium, creating an opportunity for the use of micro- and nanostructured
systems as a strategy to increase the solubility and consequently, the bioavailability
of these compounds. This aims of this study were to develop microparticles (MP) and
nanoparticles (NP) containing stem bark extract of R. ferruginea using chitosan as
polymeric matrix, and to evaluate the anti-inflammatory activity in vivo. Chitosan MP
containing extract of R. ferruginea stem bark were prepared by spray drying and
characterized. The process was optimized through 23 factorial design. The
bioadhesion property was evaluated in an ex vivo model, and in vivo oral anti-
inflammatory activity was evaluated by the paw edema model. Hydrogels were
developed and characterized for the incorporation of MP containing extract of R.
ferruginea stem bark and the in vivo anti-inflammatory activity was evaluated by the
model of ear edema induced by croton oil. In order to increase the solubility in
aqueous medium of R. ferruginea stem bark extract, chitosan NP were developed by
ionotropic gelation with tripolyphosphate, and characterized. The incorporation of R.
ferruginea stem bark extract into chitosan MP by spray drying was performed
successfully. MP presented a particle size of less than 5 μm, being spherical and
without agglomeration. The MP presented a modified release profile of the extract
markers, bioadhesive properties and oral anti-inflammatory activity in the formalin
model in vivo both for the inhibition of inflammatory pain and edema. Chitosan MP
containing the extract of R. ferruginea were incorporated into the alginate and
carbomer 940 hydrogels at concentrations of 0.1 and 0.2%. The MP remained
particulated after incorporation into the hydrogels, probably due the crosslinking of
the cationic chitosan MP by polyanionic hydrogels. The extract-loaded MP carried in
the hydrogels presented higher anti-inflammatory potential compared to the extract
incorporated in conventional cream. The NP presented a particle size smaller than 200
nm and was monodisperse, with a spherical shape and without agglomerates. The
extract:polymer and TPP:chitosan ratios are important for the physical properties.
This study will enable the development of new release systems for oral and topical
administration of R. ferruginea stem bark extract and, through technological
strategies, improvements in the properties of aqueous dispersion and anti-
inflammatory efficacy. The systems are viable and potential vehicles for the
development of an innovative phytotherapeutic medicine containing R. ferruginea
stem bark extract.
Keywords: Anti-inflammatory. Chitosan. Herbal medicine. Hydrogels.
Microparticles. Nanoparticles. Rapanea ferruginea.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me dado forças para concluir esta difícil jornada,
sem Ele nada é possível em nossas vidas.
Ao meu marido e filhos que sempre me incentivaram e souberam conduzir as
suas vidas mesmo na minha ausência, entendendo o meu cansaço físico,
mental e emocional quando retornava de cada viagem, foram 1500
km/semana por 4 anos, uma trajetória muito difícil, mas enfim hoje superada.
Aos meus pais que voltaram a morar em minha cidade e auxiliaram muito
com os afazeres domésticos em minha ausência.
As Instituições de ensino em que trabalho, principalmente aos coordenadores
que não mediram esforços para que eu conseguisse terminar o doutorado,
sempre ajustando meus horários.
Aos meus alunos de farmácia e estética que compreenderam os dias em que
eu chegava muito cansada, estressada e com pouca paciência.
Aos meus colaboradores da farmacia que conduziram os trabalhos com minha
supervisão muitas vezes a distância.
Aos meus sobrinhos Angela e Marcel que gentilmente cederam sua casa para
me hospedar durante esta jornada, o que me ajudou muito emocionalmente e
financeiramente.
As várias amigas que fiz durante os 4 anos, Ana Flávia Fischer, Jaqueline
Goes, Thamiris Inoue, Juarana Dal Mas, Mariana Cechetto, Tailyn Zermiani,
Thaisa Baccarin, as conversas, almoços, trabalhos que compartilhamos,
sentirei falta.
As queridas amigas do HPLC, Ana, Clarissa, Milena, que nunca mediram
esforços para me auxiliar.
As alunas bolsistas de iniciação científica Amanda Muller e Morgana que
auxiliaram nos experimentos.
Aos meus amigos Tania e Beto Bresolin que também auxiliaram nesta
jornada.
À Profa. Dra. Angela Malheiros que me auxiliou na interpretação dos
espectros do infra-vermelho.
À Profa. Dra. Márcia Maria de Souza pelo auxílio nos testes farmacológicos.
À Profa. Dra. Joana Lea Meira Silveira da Universidade Federal do Paraná
por possibilitar as análises por microscopia eletrônica de varredura.
Aos professores e funcionários do Programa de Mestrado e Doutorado em
Ciências Farmacêuticas por sempre estarem disponíveis a ajudar e
compartilhar seus conhecimentos.
A minha amiga, professora e orientadora Dra. Ruth Meri Lucinda Silva, que
me orientou no Mestrado e agora no Doutorado, pessoa maravilhosa, humana
e detentora de um grande conhecimento, acho que se não tivesse sido minha
orientadora, talvez não tivesse chegado ao fim. Um exemplo que levarei
sempre comigo.
Ao CNPQ, CAPES e FAPESC (PRONEM) por conceder suporte financeiro
e bolsa de estudos para realização do doutorado.
Enfim, a todos que de alguma forma me auxilaram a completar esta jornada.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTS + - 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico
ACN – Acetonitrila
AD – Agente dispersante
AMA – Ácido Mirsinóico A
AMB– Ácido Mirsinóico B
CLAE- Cromatografo líquido de alta eficiência
CLN - Carreadores lipídicos nanoestruturados
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
DPPH - 1,1-difenil-2-picrilhidrazina
DRS ou DRIFTS - Refletância difusa
DSC - Calorimetria exploratória diferencial
FRAP - Poder Antioxidante de Redução do Ferro
FTIR - Espectroscópio de IV médio com transformada de Fourier
IFA - Insumo farmacêutico ativo
IV – Infravermelho
KBr- Brometo de potássio
Log P - Coeficiente de partição
MEV - Microscopia eletrônica de varredura
MIC – Concentração mínima inibitória
MP- Micropartículas
NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas
NP- Nanopartículas
PCL-Poli ecaprolactona
PGA - Poli acido glicólico
PLA - Ácido poliláctico
PLGA - Poli ácido lático-co-ácido glicólico
QS- quitosana
QTN – Quitina
RF – Rapanea ferruginea
TGA- Termogravimetria
TPP - Na- Tripolifosfato de sódio
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ............................................................................................. 17
Introdução e Objetivos ............................................................................. 17
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ............................................................................................ 21
2.1 Objetivo Geral....................................................................................... 21
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 21
CAPÍTULO II ........................................................................................... 23
Revisão Bibliográfica ................................................................................ 23
1 SISTEMAS PARTICULADOS ............................................................... 25
1.1 Micropartículas ..................................................................................... 27
1.2 Nanopartículas ...................................................................................... 29
2 QUITOSANA .......................................................................................... 33
3 Rapanea ferruginea .................................................................................. 37
CAPÍTULO III .......................................................................................... 43
Desenvolvimento de micropartículas de quitosana contendo extrato das
cascas de Rapanea ferruginea e avaliação da atividade anti-inflamatória
oral .............................................................................................................. 43
1 Introdução ................................................................................................ 45
2 Material e Métodos .................................................................................. 47
2.1 Material................................................................................................. 47
2.2 Obtenção e caracterização do extrato mole de Rapanea ferruginea .... 47
2.3 Seleção do agente de dispersão na obtenção das micropartículas de
Rapanea ferruginea usando spray drying ................................................... 49
2.4 Obtenção e otimização das micropartículas contendo Rapanea
ferruginea usando spray drying ................................................................. 50
2.5 Caracterização das micropartículas ..................................................... 52
2.6 Determinação do Perfil de Dissolução ................................................. 53
2.7 Avaliação da bioadesão em modelo ex vivo .......................................... 55
2.8 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo .................................. 56
3 Resultados e Discussão ............................................................................ 57
3.1 Obtenção do extrato mole de Rapanea ferruginea................................ 57
3.2 Obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea usando spray
drying .......................................................................................................... 59
3.3 Otimização da obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea
usando spray dryer ...................................................................................... 61
3.4 Análise do perfil de dissolução.............................................................. 76
3.5 Análise da bioadesão ex vivo ................................................................ 84
3.6 Avaliação da atividade anti-inflamatória oral ...................................... 85
4 Conclusões ............................................................................................... 88
CAPÍTULO IV ......................................................................................... 91
Incorporação de micropartículas de quitosana contendo extrato das
cascas de Rapanea ferruginea em hidrogeis e avaliação da atividade
anti-inflamatória tópica ........................................................................... 91
1 Introdução ................................................................................................ 93
2 Material e Métodos ................................................................................... 95
2.1 Material ................................................................................................. 95
2.2 Obtenção das micropartículas contendo Rapanea ferruginea usando
spray drying ................................................................................................ 96
2.3 Desenvolvimento dos hidrogéis ............................................................. 96
2.4 Caracterização dos hidrogéis ............................................................... 97
2.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo ....................... 99
3 Resultados e discussão ........................................................................... 100
3.1 Obtenção e caracterização dos hidrogéis contendo micropartículas 101
3.2 Comportamento reológico ................................................................... 108
3.3 Propriedades Mecânicas ..................................................................... 112
3.4 Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória tópica ..................... 115
4 Conclusões ............................................................................................. 116
CAPÍTULO V ......................................................................................... 119
Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo extrato das
cascas de Rapanea ferruginea ................................................................ 119
Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo extrato das
cascas de Rapanea ferruginea ................................................................ 121
Introdução ................................................................................................. 121
2 Material e Métodos ................................................................................. 123
2.1 Material ............................................................................................... 123
2.2 Material vegetal .................................................................................. 123
2.3 Seleção da matriz polimérica .............................................................. 123
2.4 Obtenção e otimização das nanopartículas de QS contendo extrato das
cascas de Rapanea ferruginea (RF) ........................................................ 124
3 Resultados e Discussão .......................................................................... 127
3.1 Seleção da matriz polimérica .............................................................. 128
3.2 Obtenção das nanopartículas de quitosana contendo extrato das cascas
de Rapanea ferruginea (RF) ..................................................................... 129
4 Conclusões ............................................................................................. 144
CAPÍTULO VI ........................................................................................ 145
Considerações Finais ............................................................................... 145
REFERÊNCIAS ...................................................................................... 151
ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS ................................................................................................. 167
17
CAPÍTULO I
Introdução e Objetivos
18
19
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são consideradas um repositório de numerosos
tipos de compostos bioativos que possuem várias propriedades terapêuticas.
O potencial terapêutico das plantas tem sido bem explorado há muito tempo.
Uma vasta gama de efeitos terapêuticos tem sido encontrada em plantas
medicinais como anti-inflamatório, antiviral, antitumoral, antimalárico e
analgésico (RAINA et al., 2014).
A resposta terapêutica dos extratos vegetais geralmente é dependente de
uma mistura complexa de compostos bioativos que têm sua ação
potencializada por efeito sinérgico entre si. No entanto, a maioria dos extratos
vegetais possuem baixa solubilidade em meio aquoso e tempo de meia-vida
curto requerendo administração repetida ou dose mais elevada, tornando
esses produtos fracos candidatos a fármacos. Buscando superar esta
limitação, novos sistemas terapêuticos contendo derivados vegetais têm sido
desenvolvidos (ANSARI; ISLAM; SAMEEM, 2012; NAMDAR et al.,
2017).
O desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados para
veiculação de derivados de plantas medicinais cresceu nos últimos anos
(BIDONE et al., 2014). Estes sistemas atuam como plataformas de
carreamento de fármaco, sendo capazes de promover o aumento da
solubilidade pelo aumento da área superficial, a liberação modificada e a
vetorização para sítios alvos. Tais melhoramentos resultam em aumento de
eficácia e a redução de efeitos colaterais (MISHRA et al., 2010).
Embora estes sistemas tenham sido desenvolvidos para fármacos puros,
alguns tipos de sistemas permitem incorporar com alta eficiência extratos
vegetais brutos, como por exemplo, nanoemulsões (CECHETTO, 2016;
TSAI; CHEN, 2016; XAVIER, 2015; DAL MAS et al., 2016), micro e
nanopartículas poliméricas (DAS et al., 2012; HILL; TAYLOR; GOMES,
2013; RIBEIRO et al., 2013), nanopartículas lipídicas sólidas (DA ROCHA,
2015; LACATUSU et al., 2014; NASSERI et al., 2016), entre outros.
As vantagens das micro e nanopartículas poliméricas estão no aumento
da estabilidade química e física dos princípios ativos, maior disponibilidade
e manutenção do princípio ativo no tecido alvo, maior solubilidade de
princípios ativos hidrofóbicos, redução de efeitos colaterais e de toxicidade,
assim como o número de doses e frequência de administração, o que
20
proporciona maior conforto para o paciente (FARIA-TISCHER; TISCHER,
2012).
Uma espécie vegetal estudada pelo Núcleo de Investigações Químico-
Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI e com potencial aplicação como
fonte de fitoderivados para uso terapêutico é a Rapanea ferruginea Mez.
(Primulaceae). Nesta espécie foram identificados, a partir dos extratos
etanólicos das folhas e caules, o ácido mirsinoico B (AMB) e a partir dos
frutos o ácido mirsinoico A (AMA) (GAZONI, 2009; ZERMIANI, 2015). O
extrato bruto das cascas de R. ferruginea e o AMB, principal componente
isolado do extrato, apresentaram atividade antinociceptiva, anti-hiperalgésica
e anti-inflamatória, em vários modelos animais (BACCARIN, 2010; HESS
et al., 2010; GALVAN, 2007).
Estudos de pré-formulação dos extratos das cascas e dos marcadores
AMA e AMB, demonstraram que os compostos isolados possuem baixa
solubilidade em meio aquoso, sendo classificados como praticamente
insolúveis em água (< 0,50 mg/mL) (ZERMIANI et al., 2015). Este
comportamento de solubilidade é comum para os metabólitos secundários
presentes nos extratos vegetais. Como estratégia para aumentar a solubilidade
e consequentemente a biodisponibilidade destes compostos, a incorporação
em sistemas micro e nanoestruturados tem sido utilizada. Dal Mas et al.
(2016) incorporaram o extrato das cascas de R. ferruginea em nanoemulsões
e observaram uma inibição de 90,50% do edema de orelha induzido pelo óleo
de cróton pela nanoemulsão contendo 0,13% e inibição de 64,65% pelo
extrato incorporado em emulsão convencional a 0,50%, evidenciando que a
incorporação do extrato na nanoemulsão potencializou a atividade anti-
inflamatória in vivo quando comparado com a emulsão.
A partir dos resultados já obtidos da eficácia dos derivados vegetais da
espécie R. ferruginea como anti-inflamatório e antinociceptivo e a potencial
aplicação de sistemas micro e nanoestruturados como carreadores para
derivados vegetais, o presente estudo realizou o desenvolvimento de micro e
nanopartículas contendo o extrato bruto das cascas de R. ferruginea e a
avaliação biológica do potencial anti-inflamatório por via oral e tópico em
modelo in vivo. Como polímero foi empregada a quitosana por ser um
polissacarídeo com ampla aplicação em sistemas de liberação de fármacos,
com reconhecida biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades
mucoadesivas (GERMERSHAUS et al., 2015; NAIKWADE et al., 2009).
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver sistemas micro e nanoparticulados para incorporação de
derivados vegetais das cascas de R. ferruginea usando a quitosana como
polímero e avaliar a influência dos sistemas particulados na atividade anti-
inflamatória oral e tópica em modelos farmacológicos in vivo.
2.2 Objetivos Específicos
- Preparar e caracterizar o extrato mole de R. ferruginea;
- Preparar e caracterizar micropartículas de quitosana por spray dryer
contendo extrato bruto das cascas de R. ferruginea;
- Preparar e caracterizar nanopartículas de quitosana por coacervação
contendo extrato bruto das cascas de R. ferruginea;
- Preparar e caracterizar hidrogel contendo micropartículas de quitosana e
extrato bruto das cascas de R. ferruginea;
- Avaliar a atividade anti-inflamatória das micropartículas de quitosana
contendo extrato bruto das cascas de R. ferruginea administrada por via oral;
- Avaliar a atividade anti-inflamatória tópica dos hidrogéis contendo
micropartículas de quitosana e extrato bruto das cascas de Rapanea
ferruginea.
22
23
CAPÍTULO II
Revisão Bibliográfica
24
25
1 SISTEMAS PARTICULADOS
Durante vários anos, a pesquisa sobre desenvolvimento de formulações
de medicamentos tem se concentrado na adaptação de sistemas de liberação
que são capazes de retardar e sustentar a liberação do fármaco após a
administração. Estas formulações são conhecidas como sistemas de liberação
modificada de fármacos, as quais permitem controlar o tempo e o local de
liberação do fármaco a uma taxa específica. Tais sistemas apresentam várias
vantagens quando comparado às formas farmacêuticas convencionais, como
a capacidade de manter o fármaco em níveis sanguíneos constantes, melhorar
a eficácia, reduzir a toxicidade, e melhorar adesão do paciente ao tratamento
(SÃO PEDRO et al., 2016).
Partículas poliméricas biodegradáveis têm sido exaustivamente
estudadas nos últimos 20 anos, sendo utilizadas em diversas aplicações
médicas, tais como: cicatrização de feridas, dispositivos ortopédicos,
aplicações cardiovasculares, vacinas, entre outros (GUTJAHR et al., 2016).
Os sistemas micro e nanoparticulados são carreadores eficientes devido
às suas propriedades físico-químicas, a versatilidade de uso de diferentes
polímeros, de diferentes métodos de produção e a possibilidade de
modificações na superfície que permitem a vetorização do fármaco para sítios
alvos (GUTJAHR et al., 2016; SCHMIDT et al., 2013; SÃO PEDRO et al.,
2016; SINGH; CHAKRAPANI; HAGAN et al., 2007).
A eficácia dos sistemas micro e nanoparticulados não estão
estabelecidas definitivamente. Há estudos que relatam que as nanopartículas
em comparação com as micropartículas são mais eficazes, enquanto outros
apontam eficácia semelhante ou equivalente das micropartículas. Tais
resultados dependem da estrutura das partículas e da via de administração.
Para modular a liberação do fármaco dos sistemas, diferentes estratégias
podem ser empregadas, como o ajuste do teor de fármaco na matriz
polimérica, o tamanho e a morfologia das partículas (HAN et al., 2016).
O principal aspecto a ser considerado na escolha de sistemas micro ou
nano é a aplicação pretendida. O perfil farmacocinético de micro e
nanopartículas apresentam diferenças significativas no mecanismo de
liberação de fármacos, na absorção e afinidade com as proteínas plasmáticas
(SÃO PEDRO et al., 2016).
Micro e nanopartículas poliméricas têm sido amplamente estudadas
como sistemas para liberação tópica de fármacos devido à sua capacidade de
26
modular a liberação de fármacos nas diferentes camadas da pele. Para fins
tópicos, é desejável que maiores quantidades de fármaco sejam
disponibilizados na epiderme e uma pequena quantidade de fármaco ou, se
possível, nenhuma quantidade seja difundida através da pele e atinja a
corrente sanguínea, evitando assim os efeitos colaterais sistêmicos. Muitos
estudos têm sugerido que a principal via de penetração das micropartículas
na pele é a transfolicular (figura 1). Toll et al. (2004 apud GELFUSO et al.,
2011) constataram que enquanto as micropartículas com mais de 10 µm de
tamanho não podem penetrar na pele, as micropartículas entre 1 e 5 µm
podem atravessar a pele através dos canais foliculares e as nanopartículas
atravessam preferencialmente a barreira da pele através da via
transepidérmica, seguindo a via intercelular através do envelope lipídico do
estrato córneo.
Figura 1- Ilustração esquemática demonstrando as diferentes vias de permeação de
fármacos através do estrato córneo
Fonte: Gratieri; Gelfuso; Lopez (2008).
Fonte: Adaptado de Trommer (2006).
Estudos científicos mostraram que NP ≤ 1000 nm podem penetrar na
pele quando esta se encontra hidratada. A pele danificada é uma via direta
para a penetração de partículas (≤ 7000 nm). A presença de acne, eczema e
feridas pode aumentar a absorção de NP na corrente sanguínea podendo levar
a maiores complicações (RAJ et al., 2012).
As formas farmacêuticas para aplicação tópica são utilizadas para
transportar fármacos para sítios de ação local ou sistêmica. Produtos
dermatológicos de uso tópico carream o fármaco para a pele enquanto um
produto de ação transdérmica libera o fármaco na circulação sanguínea
(SILVA et al., 2010).
Corneócitos
Glândula
sudoripara
Folículo
piloso
Intercelular Transcelular Transfolicular
Transepidermal Via poros
27
A administração de fármacos por via transdérmica oferece algumas
vantagens como, ação prolongada; redução na frequência da dose; maior
uniformidade nos níveis plasmáticos; uso de fármacos potentes; aumento da
biodisponibilidade; redução dos efeitos adversos; flexibilidade para
interromper a administração do fármaco pela remoção do adesivo da pele; e
algumas desvantagens como, possibilidade de irritação no local de aplicação;
irritação na pele ou dermatite de contato devido ao fármaco e aos excipientes;
limitação no número de fármacos que podem ser administrados por esta via
devido a baixa permeabilidade da pele (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012).
Em geral, as vantagens e limitações do uso de nanotransportadores para
administração transdérmica de fármacos são o seu pequeno tamanho, elevada
energia superficial, composição e morfologia. A fim de aumentar a
quantidade de medicamentos disponíveis para a liberação transdérmica, o uso
de nanocarreadores surgiu como uma alternativa interessante e valiosa para a
liberação de fármacos lipofílicos e hidrofílicos no estrato córneo com a
possibilidade de ter um efeito local ou sistêmico para o tratamento de muitas
doenças (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012; POLETTO et al., 2011;
VIANA; SILVA, 2013).
1.1 Micropartículas
As micropartículas (MP) são partículas sólidas e esféricas com tamanho
variando entre 1 e 1000 μm. Subdividem-se em microcápsulas, que são
reservatórios que contêm a substância ativa revestida por polímeros de
espessuras variáveis, os quais constituem a membrana da cápsula, e em
microesferas, sistemas matriciais, nos quais o fármaco se encontra
uniformemente disperso e/ou dissolvido na matriz polimérica. A
microencapsulação consiste de um processo físico no qual um filme fino ou
camada polimérica é aplicada para envolver sólidos, líquidos ou gases,
isolando-os e protegendo-os das condições ambientais, como luz, ar e
umidade (CAMPOS et al., 2013).
As MP podem ser administradas por diferentes vias, como pulmonar,
oral, nasal, colônica, tópica e subcutânea (BOWEY; NEUFELD, 2010;
ESPOSITO; CORTESI, 2014). São sistemas que apresentam algumas
vantagens quando comparados às nanopartículas (NP), pois exigem métodos
de preparação mais simples e um escalonamento mais fácil. A estrutura maior
28
das MP permite a incorporação de quantidades maiores de fármacos, exigindo
assim menores doses das MP para atingir os níveis terapêuticos durante o
tratamento. Por possuírem uma área superficial menor, se comparadas às NP,
resultam em menor susceptibilidade às degradações físico-químicas (SÃO
PEDRO et al., 2016).
As principais vantagens obtidas com o uso das MP poliméricas
abrangem a proteção do princípio ativo contra a degradação, mucoadesão,
gastrorresistência, reprodutibilidade, fracionamento da dose melhorando a
biodisponibilidade dos fármacos. A capacidade de controlar a liberação do
fármaco por um período de tempo especificado depende da composição da
matriz, da solubilidade do fármaco, da estrutura química e física dos
polímeros e seu estado polimorfo (MAHMOOD; SARFRAZ; MAHMOOD,
2016; NAIKWADE et al., 2009; SEVERINO et al., 2011).
As MP podem ser preparadas a partir de polímeros biodegradáveis
(agarose, quitina, quitosana, β-ciclodextrina, carboximetilcelulose e
carregenina) ou não biodegradável (poliestireno, poliacrilamina), entre outros
(MAHMOOD; SARFRAZ; MAHMOOD, 2016; MANIVASAGAN; OH,
2016).
Os métodos de emulsificação, coacervação e spray-drying são
utilizados para produção em grande escala de sistemas particulados (WAN;
YANG, 2016). A secagem por spray-drying é uma excelente técnica para
preparações de MP sólidas, assegurando a estabilidade e proporcionando
melhor eficácia, em comparação com as técnicas que utilizam solventes
orgânicos (KARAVASILI et al., 2014). O spray dryer possui um controle
automático, custo-efetividade, disponibilidade comercial de diferentes
layouts e adequação para diferentes tipos de dispersões (soluções, suspensões
ou emulsões). Os produtos sólidos obtidos após o processo têm a vantagem
de possuir maior estabilidade física e química em comparação com as
formulações líquidas. Além disso, eles podem ser usados como precursores
para a produção de outras formas farmacêuticas, tais como cápsulas ou
comprimidos (SOSNIK; SEREMETA, 2015).
No processo por spray-drying, o fármaco é disperso ou dissolvido numa
solução orgânica ou aquosa de polímero, os quais são nebulizados numa
corrente de ar quente/gás inerte como o nitrogênio, ocorrendo a evaporação
do solvente e formação das micropartículas (WAN; YANG, 2016). Este
método é um processo simples, rápido, de etapa única para preparação de MP.
As variáveis que afetam as características do produto são: (i) parâmetros do
29
processo, (ii) propriedades do material de entrada e (iii) design de
equipamentos (SOSNIK; SEREMETA, 2015). Estas variáveis devem ser
controladas visando à obtenção de alto rendimento e eficiência de
incorporação do fármaco, redução do teor de umidade, aumento da
estabilidade química, minimização da aderência de partículas na câmera de
secagem (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010) e o controle das propriedades
físicas como tamanho e densidade (PARK; HWANG; LEE, 2011; WAN;
YANG, 2016).
Entre as vantagens do método estão a possibilidade de encapsular um
grande número de fármacos/peptídeos/proteínas; não há necessidade de
secagem final; é reproduzível; os atomizadores eliminam a necessidade de
processos de pré-preparação e permitem a fabricação contínua do produto
(HAN et al., 2016). Possui alta flexibilidade para ajustar o tamanho e a
morfologia do produto gerado (BECK-BROICHSITTER; STREHLOW;
KISSEL, 2015). No entanto, este sistema apresenta algumas desvantagens
como a aderência de micropartículas às paredes internas do spray-dryer; não
é adequado para compostos sensíveis à temperatura; e ainda, dependendo da
composição da dispersão, pode ter baixo rendimento e formar partículas
aglomeradas. O tipo de fármaco (hidrofóbico ou hidrofílico), a natureza do
solvente, a velocidade de alimentação e a temperatura de evaporação do
solvente podem afetar a morfologia das microesferas (HAN et al., 2016).
Diferentes polímeros têm sido empregados na obtenção de MP por
spray dryer, como alginato de sódio, quitosana (BOWEY; NEUFELD,
2010), gelatina, albumina (NAGAVARMA et al., 2012), poloxamer 127
(ELKORDY; ESSA, 2010), ε-caprolactona, ácido poliláctico, ácido
poliglicólico (BOWEY; NEUFELD, 2010; ESPOSITO; CORTESI, 2014),
co-polímero de ácido lático-ácido glicólico (BOWEY; NEUFELD, 2010;
WAN; YANG, 2016), e poliésteres metacrílicos (Eudragit®) (YIN; XIANG;
SONG, 2016).
1.2 Nanopartículas
Na área da ciência médica, os nanomateriais ou nanosistemas têm sido
aplicados como plataforma para liberação modificada de fármacos, assim
como no diagnóstico por imagem e molecular. Como resultado, têm-se a
obtenção de imagens melhoradas, diagnóstico mais rápido, aumento na
eficácia terapêutica e redução dos efeitos adversos em comparação com os
30
métodos convencionais. Devido às suas propriedades físico-químicas e
biológicas, as nanopartículas melhoram a solubilidade, a estabilidade, a
biocompatibilidade, a biodisponibilidade além da redução da toxicidade dos
fármacos (JEE et al., 2012).
Estudos recentes têm considerado que partículas que possuem <100 nm
de tamanho são consideradas NP. Dependendo de como o fármaco é
encapsulado, as NP são classificadas em nanocápsulas (invólucro polimérico
contendo um reservatório oleoso, no qual o fármaco pode estar dissolvido no
núcleo e/ou adsorvido na parede polimérica) e nanoesferas (o fármaco fica
retido ou adsorvido na matriz polimérica e não contem óleo em sua
composição) (figura 2). Os fármacos lipofílicos que apresentam solubilidade
na matriz polimérica ou no núcleo oleoso da nanocápsula são mais facilmente
encapsulados em sistemas de nanopartículas, os fármacos hidrofílicos a
adsorção ocorre na superfície da partícula (ESFANJANI; JAFARI, 2016;
HUDSON; MARGARITIS, 2014).
Figura 2 – Esquema da classificação de nanopartículas poliméricas biodegradáveis
(nanocápsulas e nanoesferas)
Fonte: Adaptado de Kumari et al. (2009).
31
O pequeno tamanho das NP facilita a sua passagem através de
biomembranas, aumentando significativamente a biodisponibilidade do
fármaco. A grande superfície das nanopartículas colabora com o aumento da
solubilidade dos fármacos nos fluidos biológicos, além de controlar a
liberação em diferentes locais do corpo. As nanopartículas também podem
proteger os fármacos das reações de oxidação térmica e foto-mediada, bem
como, hidrólise e outras transformações químicas (SÃO PEDRO et al., 2016).
Sistemas de liberação de fármacos nanoparticulados apresentam várias
vantagens, como a passagem por meio de pequenos vasos capilares devido a
seu pequeno volume evitando a eliminação rápida pelos fagócitos,
prolongando a duração no fluxo sanguíneo; podem penetrar nas células e
tecidos para chegar aos órgãos alvo tais como o fígado, baço, pulmão, medula
espinhal e linfa; eles podem melhorar a eficácia dos fármacos e reduzir os
efeitos colaterais tóxicos; podem aprisionar fármacos ou biomoléculas em
sua estrutura interna e/ou absorver em suas superfícies (HUDSON;
MARGARITIS, 2014).
Dentre as desvantagens das NP estão a avaliação insuficiente da sua
toxicidade; a dificuldade encontrada para aumentar a escala de produção para
alguns processos e o tamanho resultante no escalonamento, o qual nem
sempre é suficiente para evitar o sistema imunológico (ESCOBAR-CHÁVEZ
et al., 2012).
As técnicas de preparação de NP são baseadas em suas propriedades
físico-químicas sendo elas a emulsificação-difusão por deslocamento de
solvente, emulsificação-polimerização, polimerização in situ, gelificação,
nanoprecipitação, evaporação/extração de solvente, entre outras
(ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012; YIN; XIANG; SONG, 2016).
Os polímeros utilizados na formação de NP podem ser de origem natural
(colágeno, queratina, celulose, quitosana), onde se acrescenta grupos polares
às cadeias, reduzindo assim o tempo de degradação e, os sintéticos, que
possuem características hidrofílicas e massa molecular menor, sendo mais
propícios à degradação (DE MEDEIROS, 2011).
As NP poliméricas podem ser preparadas a partir de polímeros
biocompatíveis e biodegradáveis onde o fármaco encontra-se dissolvido,
aprisionado, encapsulado ou ligado a uma matriz. O uso de NP poliméricas
tem se expandido rapidamente em diversas áreas como eletrônica, fotônica,
materiais condutores, sensores, medicina, biotecnologia, controle de poluição
e tecnologia ambiental. As NP devido ao fácil preparo e sua variada
32
composição, estrutura e características de superfície são veículos promissores
para a veiculação de fármacos carreando-os para um alvo específico,
melhorando assim a sua eficácia e segurança (NAGAVARMA et al., 2012;
STEICHEN; CALDORERA-MOORE; PEPPAS,2013).
As NP têm sido desenvolvidas para administração por diferentes vias de
administração como oral, tópica, transdérmica, parenteral, pulmonar, ocular,
nasal evaginal (CHENG et al., 2015). A via oral é a mais empregada na
administração de fármacos, porém possui vários inconvenientes, pois os
medicamentos estão expostos a degradação enzimática e também
variabilidade de pH, interação com alimentos no trato gastrointestinal
resultando na baixa biodisponibilidade (PENICHE; PENICHE, 2011).
Alguns estudos concentraram-se na elucidação sistemática do mecanismo de
absorção oral dependente do tamanho das NP, melhorando a estabilidade
contra degradação enzimática e hidrolítica no trato gastrintestinal (HE et al.,
2012).
A biodisponibilidade oral do Psoralidin (princípio ativo isolado da
semente de Psoralea corylifolia) com atividades terapêuticas em vários tipos
de câncer (estômago, pulmão e próstata) foi significativamente aumentada
pela incorporação em nanocápsulas de quitosana-Eudragit® S100. Os
sistemas apresentaram excelente adesão intestinal e permeabilidade
transepitelial, indicamento a melhoria da resposta biológica por meio da
nanoencapsulação (YIN; XIANG; SONG, 2016).
NP poliméricas de extrato de Uncaria tomentosa (unha de gato),
indicado para febre, inflamação, infecções virais e câncer, foram preparadas
pelo método de emulsificação-evaporação do solvente e demonstraram
possuir parâmetros físico-químicos adequados (RIBEIRO et al., 2013).
Nanoparticulas de PLGA com extrato das cascas de Cinnamon zeylanicum
(canela), antibacteriano natural, também foram produzidas pelo método de
emulsificação-evaporação do solvente e apresentaram eficácia na inibição
dos patógenos Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium (HILL;
TAYLOR; GOMES, 2013).
Segundo estudos de Das et al. (2012), a nanoencapsulação do extrato de
Phytolacca decandra (uva turca) aumentou a biodisponibilidade do extrato
melhorando a ação preventiva de quimioterapia contra câncer de pulmão in
vivo e em células A549 in vitro.
NP lipídicas sólidas contendo óleo essencial de Zataria multiflora foram
preparadas pela técnica de homogeneização à alta pressão e demonstraram
33
controlar a atividade antifúngica dos patógenos estudados (NASSERI et al.,
2016)
Os nanocarreadores preparados com óleos de sementes de amaranto
mostraram uma liberação mais sustentada ao longo do tempo do que aqueles
preparados apenas com óleo de semente de amaranto em associação com
lipídios sólidos (LACATUSU et al., 2014).
Em seu estudo, Da Rocha (2015) desenvolveu carreadores lipídicos
nanoestruturados (CLN) contendo o extrato da planta Centella asiatica os
quais foram caracterizados visando à aplicação tópica do asiaticosídeo. Os
CLN foram produzidos com uma mistura de lipídeos sólido e líquido,
taurodeoxicolato de sódio e lecitina de soja pela técnica da microemulsão. Os
resultados sugeriram que estes sistemas aumentaram significativamente a
permeação do asiatiacosídeo apresentando, portanto, potenciais benefícios
para o tratamento de patologias cutâneas como a esclerodermia.
As NP podem aumentar a biodisponibilidade de fármacos pouco
solúveis em água, aumentando a dissolução e/ou permeabilidade. As
propriedades físico-químicas das NP podem ser melhoradas alterando a
absorção, distribuição e eliminação do fármaco. A composição química,
tamanho e morfologia são fatores importantes no transporte de NP através do
intestino (GRAVES et al., 2015).
2 QUITOSANA
Os polissacarídeos e os oligossacarídeos formam o grupo mais
abundante de bipolímeros utilizados em processos biológicos, como
desenvolvimento embrionário, infecção de bactérias/vírus e imunidade
humoral e celular. Eles têm sido utilizados há décadas em várias aplicações
industriais como na área farmacêutica, de biomateriais, alimentos, nutrição.
Os bipolímeros podem ser encontrados em micro-organismos (fungos,
leveduras e bactérias), algas, plantas e animais e estão fisicamente ou
quimicamente ligados a outras biomoléculas, como, proteínas,
polinucleotídeos, lipídeos, lignina e algumas substâncias minerais
inorgânicas (LIU; WILLFOR; XU, 2015).
A quitosana (QS) é um polissacarídeo natural biodegradável,
biocompatível, atóxica, oriunda da desacetilação da quitina, a qual é
encontrada na carapaça de crustáceos, no exoesqueleto de insetos e nas
paredes celulares de fungos (MANIVASAGAN; OH, 2016; PECARSKI et
34
al., 2014). A quitina é um polissacarídeo com ramificações de grupos
acetamina que, quando desacetilados, transformam-se em quitosana. A
molécula da QS é composta por N-acetyl-D-glucosamina e D-glucosamina
disponível em diferentes graus de desacetilação. Dependendo do grau de
acetilação, resulta em um copolímero de β-(1→4)-D-glucosamina.
Normalmente é denominada de poli-β-(1→4)-D-glucosamina (PECARSKI
et al., 2014).
A QS é facilmente solúvel em soluções diluídas de ácidos com valor de
pH menor que 6,0, devido à quaternização dos grupamentos amino que
possuem um valor de pKa de 6,3, tornando-a um polieletrólito catiônico
solúvel em água, evitando o uso de solventes orgânicos tóxicos durante a
formação dos sistemas micro e nanoestruturados (COTA-ARRIOLA et al.,
2013; DASH et al., 2011; SALEEM, 2010).
Devido às suas propriedades físico-químicas, a QS tornou-se um
material atrativo para aplicações em diferentes áreas como farmacêutica,
cosmética, médica, odontológica, biomédica, tratamento de águas residuais,
agricultura, biotecnologia e gastronômica. É um polímero catiônico, muco-
adesivo com importante capacidade de aumentar a penetração de fármacos
através das barreiras das mucosas (PENICHE; PENICHE, 2011). Sistemas a
base de QS podem, por exemplo, atuar como carreadoras de fármacos, DNA
ou proteínas, pela sua capacidade de aumentar a permeabilidade das
membranas (ANITHA et al., 2011; ARAUJO, 2009; BLANCO, 2011;
COTA-ARRIOLA et al., 2013).
O grau de desacetilação e a massa molecular são os dois parâmetros
fundamentais que podem afetar as propriedades e a funcionalidade da QS.
Essas propriedades incluem solubilidade, viscosidade, reatividade de
material proteico, coagulação, quelação de íons de metais pesados e as
propriedades físicas dos filmes formados com QS, como a resistência à
tração, elasticidade e absorção da umidade. A QS com alta massa molecular
e alto grau de desacetilação apresenta um aumento na permeabilidade
epitelial podendo ser comparado a outros polímeros promotores de
permeação tais como os poliacrilatos. A QS pode ser associada com outros
intensificadores de permeação porque age de maneira diferente dos outros
potenciadores, levando a um efeito aditivo ou mesmo sinérgico (ELGADIR
et al., 2015).
A QS apresenta várias aplicações por sua capacidade de quelar íons
metálicos, sua atividade antifúngica e antimicrobiana sobre bactérias gram-
35
positivas e gram-negativas com espectro de ação amplo e por sua baixa
toxicidade em células de mamíferos. A atividade antimicrobiana é
influenciada por inúmeros fatores físico-químicos, como grau de
desacetilação, massa molecular, pH do meio e concentração do polímero
(BLANCO, 2011; COTA-ARRIOLA et al., 2013; DASH et al., 2011).
Sistemas terapêuticos desenvolvidos a partir da QS podem incluir
filmes, fios, comprimidos, membranas, micropartículas e nanopartículas. As
NP de QS são excelentes matrizes poliméricas para o desenvolvimento de
novos sistemas terapêuticos com melhor biodistribuição, maior
especificidade, sensibilidade e menor toxicidade farmacológica. As NP de
QS são consideradas adequadas para administração de fármacos por vias não
invasivas como a via oral, nasal, pulmonar e ocular (PENICHE; PENICHE,
2011).
A QS tem sido utilizada para obtenção de MP e NP pelos métodos de
evaporação de solvente, coacervação, gelificação iônica, microemulsão
reversa, difusão de solvente, spray drying, entre outros. O uso do spray
drying apresenta como vantagem principal a possibilidade de obtenção dos
sistemas em meio aquoso, dispensando o uso de solvente orgânico, bem
como, de adjuvantes como óleo ou emulsionantes que podem deixar resíduos
indesejáveis na formulação de MP. Este método também permite obter MP
de QS com alto rendimento e facilmente escalonável para produção em escala
piloto e industrial (BLANCO, 2011; VASCONCELLOS; GOULART;
BEPPU, 2011).
O método de coacervação/precipitação utiliza a QS como polímero,
devido a sua propriedade físico-química de ser insolúvel em meio de pH
alcalino, formando assim coacervados/precipitados quando entra em contato
com solução alcalina (DASH et al., 2011). Devido à facilidade da QS gelificar
na presença de poliânions específicos, o método de geleificação iônica é
descrito na literatura como um meio para obtenção de nano e micropartículas
usando QS como matriz (BLANCO, 2011). Este método consiste na
reticulação iônica da QS com contra-íons multivalentes como Fe (CN)64-, Fe
(CN)63-, citratos e tripolifosfato de sódio (TPP) (figura 3), sendo o TPP o
poliânion comumente utilizado. O procedimento é realizado em meio aquoso
e não envolve a utilização de solventes orgânicos. As NP podem ser obtidas
pela adição de uma dispersão ácida de QS a uma solução de TPP ou vice-
versa, sob agitação constante. O tamanho e a eficiência de encapsulação das
partículas são dependentes das concentrações de QS, TPP e do pH das
36
soluções de TPP. O principal problema deste método é o tempo de
estabilidade do sistema coloidal que pode requerer a adição de estabilizantes
e a necessidade de usar soluções muito diluídas que se tornam inconvenientes
quando são necessárias grandes quantidades de NP (PENICHE; PENICHE,
2011).
Figura 3 - Esquema da geleificação iônica da quitosana com tripolifosfato de
sódio.
Fonte: Zhao et al., 2011 (adaptado).
NP de QS:TPP preparadas por métodos convencionais geralmente
apresentam uma ampla distribuição de tamanho de partícula e baixa
estabilidade, o que limita a sua utilidade em certas aplicações. Fan et al.
(2012) estudaram diferentes parâmetros no desenvolvimento de NP de
QS:TPP como a concentração da solução de QS, concentração de solução de
TPP, temperatura e pH da solução de QS, proporção de QS:TPP (m/m) e
velocidade de agitação. Bulmer, Margaritis e Xenocostas (2012) desenvolveram NP de QS:TPP
pelo método de geleificação iônica usando QS a 2,0% (m/v). A partir desta
dispersão foram preparadas soluções de QS nas concentrações 0,125, 0,25,
0,5, 1,0 e 2,0 mg/mL. Foram preparadas NP usando a proporção QS:TPP de
2:1, 3:1, 4:1, 5:1 e 6:1. O diâmetro médio das NP aumentou de forma linear
e variou entre 180 e 960 nm, com cargas de superfície entre 40 e 55 mV, e
com distribuições de tamanho de partícula variando entre 0,2 e 0,35 e a
eficiência de encapsulação foi de 47,97 ± 4.10%.
As NP de QS proporcionam a liberação sustentada de fármacos
envolvendo os mecanismos de intumescimento, difusão e erosão. A cinética
de liberação é dependente da massa molecular e do grau de desacetilação do
polímero, bem como, da área superficial das partículas. A distribuição de
37
tamanho das NP também pode interferir na disponibilidade destas no tecido,
sendo que partículas menores podem sofrer depósito no tecido
fisiologicamente alterado, levando ao aumento da taxa de captação celular
(WANG et al., 2011).
3 Rapanea ferruginea
A R. ferruginea Mez pertence à família Primulaceae. Esta espécie é
pantropical e no Brasil é encontrada especialmente nas regiões litorâneas
como Bahia, Espirito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná,
Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Na América latina é encontrada em
países como Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (BACCARIN
et al., 2014; COSTA, 2011). Características botânicas reclassificaram esta
espécie, que passou da família Myrsinaceae para a Primulaceae (FREITAS;
KINOSHITA, 2015). É uma árvore de porte médio de 6-12 m de altura e
tronco de 30 a 40 cm de diâmetro, apresenta frutos de 3-5 mm de diâmetro
globosos e cor negra arroxeada quando estão maduros (Figura 4)
(CARVALHO, 1994; BACCARIN et al., 2014).
A R. ferruginea também está descrita na literatura botânica como
Myrsine floculosa Mar. e Gaballeria ferruginea (PASCOTO, 2007),
entretanto, o nome latino válido é R. ferruginea, popularmente conhecida
como canela-azeitona, Capororoca, azeitona-do-mato, camará, capororocaçu,
capororoca-vermelha, pororoca e capororoca-mirim, utilizada como
alimentação da fauna silvestre, alimentação humana, produção de carvão,
construção civil, lenha, paisagismo, reflorestamento para recuperação
ambiental (LORENZI, 1998; BACCARIN et al., 2014; PASCOTO, 2007).
Popularmente o chá das folhas ou das cascas da R. ferruginea é indicado
como diurético e depurativo, no combate às afecções urinárias, usado
popularmente para coceiras, erupções, urticárias, eczemas, reumatismo,
afecções do fígado (LORENZI, 2002).
38
Figura 4 - Fotografias da planta Rapanea ferruginea: a) partes aéreas, b) frutos e
folhas c) cascas.
Fonte: Zermiani (2015).
Várias substâncias foram isoladas de diversas espécies de Rapanea com
efeitos biológicos conhecidos, os principais representantes são os derivados
de ácidos benzoicos prenilados que possuem estrutura química e atividade
biológicas diferentes (TOMIO, 2011). Nas cascas a R. ferruginea apresenta
grande concentração do ácido mirsinóico B (AMB), um ácido benzoico
prenilado de nome químico, (5-carboxi-2, 3-dihidro-2-(1’, 5’-dimetil-1’-
hidroxi-4’hexenil)-7-(3”-metil-2”butenil) benzofurano) e nos frutos há maior
presença do acido mirsinóico A (AMA), de nome químico (ácido 5-geranil-
4-hidroxi-3-(3”-metil-2”butenil)-benzoico) (ANTONIALLI, 2009;
ZERMIANI, 2015). Estruturas químicas estão demonstradas na Figura 5.
39
Figura 5- Estrutura química dos ácidos mirsinoicos AMA, AMB e AMC.
Fonte: Fronza e Giuradelli, 2009.
Estudos realizados com a R. ferruginea, pelo NIQFAR da UNIVALI
apresentaram resultados promissores com extratos e compostos isolados.
Hess (2006) demonstrou que o AMB possui importante efeito antinociceptivo
na dor induzida pelo ácido acético (150, 200, 300 e 500 mg/kg v.o e nas doses
de 3, 6, 10, 30 e 60 mg/kg i.p), glutamato (10, 30 e 60 mg/kg i.p), capsaicina
e formalina (6, 10, 30 e 60 mg/kg i.p), bem como na dor induzida por
estímulos térmicos (10, 30 e 60 mg/kg i.p). Administrados por via oral ou
pela via intraperitoneal ambos demonstraram ação prolongada, outro
resultado importante foi que o AMB mostrou-se efetivo em reverter
processos hiperalgésicos, sugerindo ação sobre a dor neuropática.
O AMB foi estudado em vários modelos indutores de dor por Antonialli
(2009), utilizando modelos de hipernocicepção inflamatória e neuropática,
modelos de hipernocicepção induzida por carragenina, adjuvante completo
de Freund, modelo de dor neuropática induzida pela constrição parcial do
nervo ciático, entre outros. Os resultados encontrados neste estudo
demonstraram que o AMB, administrado oralmente nas doses de 3 a 30
mg/kg inibiram a hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina e a
sensibilização desenvolvida na pata contralateral de animais injetados com
adjuvante completo de Freund, e reverteram também as respostas
hipernociceptivas (mecânica e térmica) dos animais submetidos pela
constrição parcial do nervo ciático.
40
Os extratos etanólicos das folhas/caules/frutos da R. ferruginea foram
avaliados quanto à atividade anticolinesterásica através do ensaio
bioautográfico, demonstrando inibição da acetilcolinesterase na concentração
de 80 µg. As substâncias isoladas também foram testadas e foi observada a
inibição da acetilcolinesterase para o AMA e AMB nas concentrações de até
8 µg e 2 µg respectivamente (GAZZONI, 2009).
O extrato seco e mole das cascas da R. ferruginea foram padronizados
e a atividade antinociceptiva in vivo foi avaliada por Baccarin (2010), no
modelo da formalina. Nos ensaios farmacológicos foi verificado que as doses
(500 mg/kg) de extrato mole e (60 mg/kg) de extrato seco, obtiveram os
melhores resultados para a dor inflamatória do que para a dor neurogênica e
a v.o mostrou ser mais efetiva do que a via i.p.
Tomio (2011) avaliou a atividade citotóxica do extrato etanólico de
cascas de R. ferruginea, compostos isolados AMA, AMB, AMC (ácido
mirsinoico C) e derivados N-etil-mirinamida B, N-butil-mircinamida B, N-
hexilmircinamida B e N-buodecil-mircinamida, através da microscopia de
fluorescência para identificação dos processos de morte celular apoptóticos
ou necróticos. Tanto o extrato etanólico das cascas de R. ferruginea quanto
os compostos isolados apresentaram limitada toxicidade, com necrose e
apoptose em linhagem celular B16F10. O AMB apresentou atividade
citotóxica nas linhagens celulares K562 e NALM6, mostrando acentuada
redução na viabilidade celular após 48 horas de tratamento com 27,93 e 279
µM deste composto quando comparado com o paclitaxel.
Bella Cruz et al. (2013) avaliaram os extratos das cascas do caule,
ramos, folhas, frutos e seus compostos in vitro contra bactérias e leveduras.
Para avaliação do potencial tóxico foi utilizado o teste com Artemia salina e
de fibroblastos murino (células L929) e para o teste de genotoxicidade foi
utilizado a levedura Saccharomyces cerevisiae (haploides tipo selvagem). Os
compostos AMA e AMB apresentaram atividade antibacteriana significativa
contra Staphylococcus aureus (concentração inibitória minina - MIC de 31,25
μg/mL para ambos) e para o Bacillus subtilis apresentaram um MIC de 7,81
e 62,5 μg/mL, para o AMA e AMB, respectivamente, quando analisados pelo
método de ágar-diluição. Foi observado que os compostos AMA e AMB
apresentaram potencial tóxico moderado frente à Artemia salina, e não
apresentaram atividade citotóxica em fibroblastos L929 e também não foram
mutagênicos em S. cerevisiae.
41
A atividade antimicrobiana do AMA isolado da planta Myrsine coriacea
(Primulaceae) e de dois derivados semi-sinteticos foram testados frente à
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella enterica subsp. Enterica
serovar typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Candida albicans, Candida
krusei e Candida tropicalis pelo método de microdiluição onde foi
determinada o MIC. O AMA não mostrou atividade contra os micro-
organismos selecionados, mas os derivados hidrogenados e acetilados foram
ativos contra B. subtilis, E. coli, S. Aureus e P. aeruginosa (BURGER et al.,
2015). Ao comparar os resultados dos estudos de Bella Cruz et al. (2013) e
Burger et al. (2015) percebeu-se que houve divergência nos resultados com
relação a atividade antimicrobiana do AMA contra os micro-organismos
testados. Isto se deve provavelmente às diferentes técnicas utilizadas.
Estudos realizados por Goes et al. (2016), demonstraram que dentre as
espécies vegetais pesquisadas para determinação da atividade antioxidante
destacou-se o extrato mole preparado com as cascas de R. ferruginea O
potencial antioxidante avaliado pelos métodos de DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazina), ABTS+ (2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6-ácido
sulfônico), FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro), com EC50 de
384,78 ± 9,27, 497,00 ± 15,00 e 171,37 ± 0,96 µg/mL, respectivamente. Este
extrato apresentou também os melhores resultados de atividade de proteção
avaliada pelo sistema β-caroteno/ácido linoleico na concentração de 350,33
µg/mL com 62,31% da inibição da oxidação do ácido linoleico.
Baccarin et al. (2014) otimizaram a obtenção do extrato hidroalcoólico
das cascas e caule da R. ferruginea através do desenho fatorial 33 onde os
parâmetros avaliados foram a concentração do etanol (50, 70 e 90 % v/v),
tempo de extração (2, 6 e 10 h) tamanho da partícula da droga vegetal (0,25,
0,50 e 1,0 mm). Os resultados indicaram que o etanol a 90 % v/v e o tempo
de extração de 2 h representaram as melhores condições para obtenção do
extrato padronizado de R. ferruginea.
Estudos analíticos permitiram desenvolver metodologia para análise
quali e quantitativa dos extratos e de produtos obtidos a partir dos frutos e das
cascas de R. ferruginea tendo como marcadores os ácidos AMA e AMB. O
método gradiente por CLAE permitiu uma boa separação cromatográfica,
sendo específico, linear, preciso, sensível e exato para a determinação de
AMA e AMB nos extratos etanólicos 90 °GL dos frutos e cascas de R.
42
ferruginea, bem como nas nanoemulsões contendo estes marcadores
(ZERMINIANI et al., 2015).
De acordo com os estudos de pré-formulação realizados por Zerminiani
et al. (2015), o AMA é muito pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (0,1
a 1 mg/mL) e o AMB é pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (1 a 10
mg/mL). Ambos são praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL),
constatando-se que estes compostos possuem maior solubilidade em
solventes menos polares. O AMA e AMB apresentaram pKa e coeficiente de
partição (log P) de 4,5 e 3,30; 4,8 e 3,22, respectivamente.
Dal Mas et al. (2015), desenvolveram nanoemulsões contendo extrato
bruto das cascas de R. ferruginea pelo método de edema de orelha induzido
pelo óleo de cróton. Nas concentrações de extrato nas nanoemulsões de 0,13
% e 0,25 %, houve a inibição de 90,50 % e 64,98 % do edema,
respectivamente, e para o creme convencional as inibições para as mesmas
concentrações de extrato foram de 56,53 % e 58,64 %, respectivamente. O
efeito anti-inflamatório do extrato incorporado nas NE foi superior ao
encontrado para o creme convencional demonstrando que as nanoemulsões
proporcionam otimização da atividade biológica e provavelmente está
relacionada com o aumento da solubilidade e disponibilidade dos
constituintes químicos do extrato.
Nanoemulsões contendo o extrato bruto dos frutos da R. ferruginea
foram avaliadas quanto à atividade antinociceptiva em animais nas doses de
10, 50 e 100 mg/kg, mas apenas as doses de 50 e 100 mg/kg inibiram o
processo doloroso induzido por ácido acético em 44,81% e 61,2%,
respectivamente (XAVIER, 2015).
Cechetto (2016) investigou a atividade anti-inflamatória in vivo do
extrato bruto dos frutos da R. ferruginea e de nanoemulsões contendo o
mesmo extrato utilizando o modelo de bolsa de ar. As nanoemulsões
demonstraram redução do número total de leucócitos migrados para a
cavidade formada no modelo de bolsa de ar nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg
enquanto o extrato apresentou melhor efeito na dose de 300 mg/kg,
mostrando que as preparações de nanoemulsões apresentaram maior
atividade inibitória da migração de leucócitos quando comparadas com o
extrato, novamente comprovando o efeito do sistema nanométrico na
atividade biológica de extatos vegetais.
43
CAPÍTULO III
Desenvolvimento de micropartículas de quitosana contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea e avaliação da
atividade anti-inflamatória oral
44
45
Desenvolvimento de micropartículas de quitosana contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea e avaliação da
atividade anti-inflamatória oral
Roseni Bortolon Grassi De Carli; Márcia Maria de Souza; Angela Malheiros;
Ruth Meri Lucinda-Silva
1 Introdução
A Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) é uma árvore encontrada em
vários estados brasileiros e também em outros países como Bolívia, México,
Argentina, Paraguai e Uruguai (BACCARIN et al., 2014; COSTA, 2011).
Derivados vegetais das cascas e frutos têm apresentado potencial aplicação
como fonte de fitoderivados para uso terapêutico. O extrato bruto das cascas
de R. ferruginea e o ácido mirsinoico B (AMB), principal componente
isolado do extrato, apresentaram atividade antinocipectiva, anti-
hiperalgésica, anti-inflamatória em vários modelos animais (BACCARIN et
al., 2016; DAL MAS et al., 2016; GALVAN, 2007; HESS et al., 2010).
Estudos tecnológicos de desenvolvimento e padronização do processo
de extração e obtenção dos extratos mole e seco por spray-drying das cascas
foram conduzidos por Baccarin et al. (2014). Os extratos apresentaram efeito
anti-inflamatório e antinociceptivo em modelo farmacológico in vivo
(BACCARIN et al., 2016). Para análise quali e quantitativa dos derivados
vegetais das cascas, Baccarin et al. (2011) e Zermiani et al. (2015)
desenvolveram metodologia por CLAE usando o AMB e o ácido mirsinoico
A (AMA) como marcadores. Estudos de pré-formulação destes ácidos
demonstraram que estes compostos possuem baixa solubilidade em meio
aquoso, sendo classificados como praticamente insolúveis em água (< 0,50
mg/mL). Os compostos AMA e AMB possuem valor de coeficiente de
partição (log P) de 3,30 e 3,22, respectivamente, sendo semelhantes aos
valores encontrados para fármacos anti-inflamatórios como indometacina e
naproxeno (ZERMIANI et al., 2016). Considerando a solubilidade e o valor
de log P dos marcadores do extrato das cascas de R. ferruginea, estes possuem
características semelhantes ao dos fármacos de classe II do sistema de
classificação biofarmacêutica, podendo a biodisponibilidade ser otimizada
pelo aumento da solubilidade do extrato.
46
O desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados para
compostos derivados de plantas medicinais cresceram nos últimos anos
(BIDONE et al., 2014). As micropartículas (MP) poliméricas têm elevada
eficácia como carreadores de princípios ativos, pois melhoram a estabilidade
do IFA, atuam como matriz polimérica para dispersão do insumo
farmacêutico ativo (IFA) e consequente aumenta a solubilidade, além de
promoverem a liberação modificada dependendo do material de revestimento
ou formação de matriz. Propriedades como diâmetro e distribuição de
tamanho, morfologia e proporção fármaco:polímero podem influenciar
diretamente a biodisponibilidade do IFA e, por consequência, sua eficácia e
segurança. Normalmente os diâmetros das MP são de 10-200 μm. Partículas
com diâmetro < 10 μm podem ser fagocitadas e > 200 μm podem causar uma
resposta imune e inflamação (HAN et al., 2016). Na obtenção de MP como sistema terapêutico são empregados
geralmente polímeros biodegradáveis (COTA-ARRIOLA et al., 2013;
WISUITIPROT et al., 2011). Dentre estes a quitosana (QS) é muito utilizada
devido às suas propriedades únicas como caráter catiônico, fácil complexação
com contraíons como o tripolifosfato (TPP), levando a reticulação da matriz
polimérica; biocompatibilidade e biodegradabilidade (WISUITIPROT et al.,
2011). É um biopolímero empregado nas áreas farmacêutica, cosmética,
gastronômica, médica, odontológica, biomédica, agricultura e biotecnologia
atuando, por exemplo, como carreadoras de fármacos, DNA ou proteínas,
pela sua capacidade de aumentar a permeabilidade das membranas
(ARAUJO, 2009; BLANCO, 2011; COTA-ARRIOLA et al., 2013;
STULZER et al., 2007) e administração vetorizada de vacinas e fármacos
específicos do cólon (MURA et al., 2011).
Vários métodos são descritos para a preparação de MP de QS, tais como
secagem por atomização, coacervação, gelificação iônica e evaporação do
solvente. Alguns desses métodos possuem algumas limitações, como altas
temperaturas, que podem causar degradação dos agentes ativos, dificuldade
na obtenção das partículas ou baixa taxa de encapsulamento dos ativos
(COTA- ARRIOLA et al., 2013; WISUITIPROT et al., 2011).
O método de obtenção de MP por spray-drying é uma das técnicas mais
utilizadas na indústria farmacêutica. Este método proporciona várias
vantagens quando comparada às demais técnicas de obtenção de MP, por ser
um processo consideravelmente simples e em apenas uma etapa. Em um
único equipamento é possível atomizar, secar e coletar o material em forma
47
de pó. Por ser um processo rápido, evita a degradação dos fármacos e
materiais encapsulados, permitindo a conservação das propriedades do
material após o processo de formação das partículas (SOSNIK;
SEREMETA, 2015).
A partir dos resultados já obtidos da eficácia dos derivados vegetais da
espécie R. ferruginea como anti-inflamatório e antinociceptivo e a potencial
aplicação de sistemas microestruturados como carreadores para derivados
vegetais, o presente estudo realizou o desenvolvimento de MP de quitosana
pelo método de spray-drying como carreador farmacêutico para o extrato
bruto das cascas de R. ferruginea e biomonitoramento do potencial anti-
inflamatório por via oral in vivo do produto desenvolvido.
2 Material e Métodos
2.1 Material
A quitosana (QS) com peso molecular médio, viscosidade de 200-800
mPa.s (dispersão a 1% em ácido acético 1%, a 25ºC) e grau de desacetilação
de 72,45% foi adquirida da Sigma-Aldrich® (Sto Louis, Missouri, USA); óleo
de rícino etoxilado (Ultramona® RH400) foi adquirido da Oxiteno (São
Paulo, São Paulo, Brasil); os solventes grau HPLC acetonitrila e metanol
foram adquiridos da JTBaker® (Center Valley, Pennsylvania, USA);
propilenoglicol PA foi adquirido da Biotec®(São Paulo, São Paulo, Brasil).
As cascas do caule de R. ferruginea foram coletadas em Blumenau-SC.
A autenticidade botânica foi verificada através da comparação entre a
exsicata da planta coletada com o exemplar depositado no Herbário Barbosa
Rodrigues (Itajaí-SC) sob o código HBR 52715.
2.2 Obtenção e caracterização do extrato mole de Rapanea ferruginea
Para o preparo do extrato mole de Rapanea ferruginea (RF),
inicialmente foi obtida a solução extrativa pelo método de maceração
dinâmica (BACCARIN et al., 2014). Cerca de 200 g de cascas moídas de RF
foram transferidas para um recipiente de vidro e adicionado 1800 mL de
etanol 90% v/v. A mistura foi agitada (agitador mecânico Fisaton®, mod.
713D), por 2 h a 800 rpm. Em seguida, a solução foi filtrada em tecido
48
Sontara®, seguido de filtração em papel filtro, sob vácuo. O solvente foi
evaporado a aproximadamente 40 ºC até a obtenção do extrato mole.
Para a determinação do resíduo seco da solução extrativa de RF, foram
dessecados 3 cadinhos de porcelana em estufa (Fanem®, mod. 315SE) a 105
ºC por 1 h e resfriados por 15 min em dessecador. Os cadinhos de porcelana
vazios após a dessecação foram pesados e em seguida adicionou-se 5 mL da
solução extrativa de RF, a qual foi evaporada em chapa de aquecimento. Após
a evaporação, os cadinhos foram colocados em estufa a 105 ºC por 3 h,
resfriados e pesados. Para o cálculo do resíduo seco em porcentagem foi
usada a equação 1, em que RS é o resíduo seco; mf massa final e mi massa
inicial.
𝑅𝑆= 𝑚𝑓 . 100 (1)
𝑚𝑖
Para a obtenção do resíduo seco do extrato mole de RF realizou-se o
mesmo procedimento descrito para a solução extrativa, porém usando uma
amostra de aproximadamente 100 mg de extrato mole de RF e dessecação em
estufa sem prévia evaporação do solvente.
O teor dos marcadores AMA e AMB no extrato mole foi determinado
usando metodologia desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2015). Para
estas análises foi utilizado o cromatógrafo Shimadzu® LC 20-AC, uma
coluna de fase reversa Kinetex XB® C18, 150 x 4,6 mm, contendo partículas
core-shell com tamanho de 2,6 µm como fase estacionária e como fase móvel
os solventes grau HPLC, acetonitrila (ACN), metanol degaseificados e água
ultrapura (ultrapurificador – Purelab Classic) acidificada (pH 2,5) com ácido
fosfórico, filtrada à vácuo com membrana de celulose regenerada com 0,45
µm de porosidade. Para a fase móvel foi utilizado o método gradiente
metanol:ACN:água acidificada, o qual foi programado respectivamente da
seguinte forma: 0-2 min (25:5:70), 2-5 min (25:30:45), 5-10 min (25:60:15),
10-12 min (20:70:10), 12-15 min (15:75:10) e 15-20 min (15:84:1),
retornando à condição inicial até 30 min de análise. O fluxo foi de 0,9
mL/min, volume de injeção de 20 µL à 35 °C.
Para a quantificação do extrato mole de R. ferruginea este foi pesado (1
mg/mL) em duplicata, transferido para um balão volumétrico de 5 mL,
adicionado 3 mL de metanol, sonicado por 1 h e o volume foi completado
49
com metanol. As amostras foram filtradas em filtro de celulose regenerada
de 0,45 µm e analisadas por CLAE.
Os marcadores AMA e AMB foram quantificados em 260 e 270 nm,
respectivamente, usando as equações de reta da regressão linear das curvas
analíticas desenvolvidas por Zermiani et al. (2015) para quantificação dos
marcadores AMA e AMB. A curva do AMA é linear na faixa de concentração
de 1 a 100 µg/mL e com equação da reta y = 28082x – 1880 (r² = 0,9994). A
curva do AMB, com equação da reta y = 51940x + 6217,2 (r² = 0,9996),
também foi linear na faixa de concentração de 1 a 100 µg/mL. O limite de
detecção do AMA foi de 0,05 μg/mL e do AMB 0,01 μg/mL e os limites de
quantificação determinados foram de 0,5 e 0,05 μg/mL para o AMA e AMB,
respectivamente.
2.3 Seleção do agente de dispersão na obtenção das micropartículas de
Rapanea ferruginea usando spray drying
Foram preparados 200 mL de solução de quitosana (QS) a 0,5%, em
água ultrapura acidificada em pH 4,0, usando agitador mecânico a 500 rpm
por 3 h. A dispersão foi filtrada à vácuo usando papel filtro de 8 µm.
Para seleção do adjuvante de dispersão do extrato na disperão de QS,
foram testados três tipos de agentes dispersantes (AD): propilenoglicol,
Tween 80 e RH400. Para este teste premilinar de microencampsulação, o
extrato (RF) foi incorporado na proporção 1:10 RF:QS (m/m em teor de
sólidos). Para aumentar a estabilidade e facilitar a manipulação do extrato
mole, este foi diluído em propilenoglicol em proporção para obter um teor de
sólidos de 12,5% (m/m) e incorporado na dispersão polimérica.
Inicialmente foram preparados três lotes de MP para seleção do agente
de dispersão do extrato mole de RF na solução polimérica de QS, conforme
apresentado no Quadro 1.
50
Quadro 1 - Composição das micropartículas de RF:QS (1:10)
contendo diferentes agentes dispersantes para incorporação
do extrato das cascas de Rapanea ferruginea.
Amostra Agente Dispersante
1 Propilenoglicol 1,0%
Tween 80 1,0%
2 Propilenoglicol 1,0%
3 Propilenoglicol 1,0%
RH400 0,5%
As MP foram obtidas pela secagem em spray-drying (Buchi® B290),
com pressão de ar de 6 mBar, fluxo do ar comprimido de 473 NL.h-1,
temperatura de entrada 150 ºC, taxa de aspiração de 90%, e fluxo de
alimentação em 4,0 mL/min, em sistema aberto. Após a secagem, as amostras
foram acondicionadas em frascos bem fechados e mantidas em dessecador.
A seleção do AD foi realizada com base nos resultados das análises de
rendimento, granulométrica e morfológica por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) (Philips XL 30®).
2.4 Obtenção e otimização das micropartículas contendo Rapanea
ferruginea usando spray drying
Para otimização das variáveis do método de obtenção das MP contendo
extrato de RF foi realizado um planejamento fatorial 23, tendo como fatores
a proporção de RF:QS 5 e 10% (m/m) (1:20 e 1:10, respectivamente),
proporção de propilenoglicol (0,5 e 0,75% (m/m)) e proporção de RH400 (0,0
e 0,5% (m/m)), como descrito no Quadro 2.
As amostras foram preparadas usando 200 mL de dispersão de QS 0,5%
contendo extrato mole diluído de RF (12,5%, em propilenoglicol).
Micropartículas brancas foram preparadas com 200 mL de dispersão de QS
0,5%, usando os dois agentes de dispersão propilenoglicol e RH400. Após
obtenção da dispersão, as amostras foram secas em spray-drying sob as
mesmas condições experimentais descritas no item 2.3.
51
Quadro 2- Planejamento fatorial 23 usado no desenvolvimento das micropartículas de QS:RF usando propilenoglicol e RH 400 como
agentes dispersantes.
Amostras
Fator 1 – Proporção RF:QS Fator 2 –Propilenoglicol Fator 3 – RH400
Nível Proporção
%
Massa
(g)1 Nível Proporção
(%)
Massa
(g) Nível
Proporção
(%)
Massa
(g)
1 1 10 0,1 -1 0,5 1,0 -1 0 0
2 1 10 0,1 1 0,75 1,5 -1 0 0
3 1 10 0,1 -1 0,5 1,0 1 0,5 1,0
4 1 10 0,1 1 0,75 1,5 1 0,5 1,0
5 -1 5,0 0,05 -1 0,5 1,0 -1 0 0
6 -1 5,0 0,05 1 0,75 1,50 -1 0 0
7 -1 5,0 0,05 -1 0,5 1,0 1 0,5 1,0
8 -1 5,0 0,05 1 0,75 1,50 1 0,5 1,0
Nota: RF – extrato de Rapanea ferruginea a 12,5% em propilenglicol; QS – dispersão de quitosana 0,5% 1Quantidade em resíduo seco do extrato a 12,5%. A quantidade de propilenoglicol presente no extrato foi subtraída da quantidade de
propilenoglicol a ser adicionado como agente dispersante (Fator 2).
52
2.5 Caracterização das micropartículas
2.5.1 Análise morfológica por MEV
Para a análise da morfologia e tamanho das amostras das
micropartículas do presente estudo foi utilizado o microscópio eletrônico de
varredura (Philips, XL 30®). As amostras foram mantidas em dessecador com
pentóxido de fósforo por 3 dias. Para a análise, as amostras foram depositadas
sobre uma fita dupla face em suporte metálico e posteriormente recoberta
com ouro coloidal.
2.5.2 Análise de tamanho
A partir das fotomicrografias de MEV, a distribuição de tamanho foi
determinada usando o software Size Meter 1.1. Os resultados foram
representados pelo histograma de distribuição de tamanho e frequência. O
tamanho médio e o desvio padrão foram calculados e representados em
unidades Probit (AMONZA, 2001).
2.5.3 Perfil de absorção no Infravermelho (IV)
Para as análises no IV utilizou-se o espectroscópio de IV médio com
transformada de Fourier e refletância difusa (DRIFTS) (Shimadzu Prestige-
21 DRS-8000). A amostra foi misturada com brometo de potássio (KBr) em
gral de vidro e transferida para um suporte metálico até formação de uma
pastilha e submetido à análise.
2.5.4 Teor e eficiência de encapsulação
As análises do teor e eficiência de encapsulação dos marcadores
químicos do extrato mole AMA e AMB foram realizadas com o auxílio da
acadêmica do Curso de Farmácia Ana Gon.
Para a determinação do teor dos marcadores AMA e AMB das
micropartículas de QS contendo RF e da eficiência de encapsulação, a massa
de micropartículas teórica corresponde à 5 mg de extrato de R. ferruginea foi
pesada diretamente em balão volumétrico de 5 mL, resultando em uma
solução com concentração teórica de extrato de 1 mg/mL. Foi adicionado 3
mL de metanol, sonicado por 1 h e em seguida, o volume foi completado para
5 mL com metanol. As amostras foram filtradas em filtro de celulose
regenerada de 0,45 µm e analisadas por CLAE, de acordo com a metodologia
descrita no item 2.2. As amostras foram preparadas em duplicata.
53
A partir da concentração dos marcadores AMA e AMB na solução
amostra, o teor de encapsulação (TE) e a eficiência de encapsulação (EE)
foram calculadas usando as equações 2 e 3, respectivamente.
𝑇𝐸% = (𝐶 . 𝑉
𝑚𝑀𝑃) . 100
(2)
Onde:
TE% = Teor de encapsulação em % m/m
C = concentração de AMA ou AMB em µg/mL, calculado a partir da curva
analítica dos marcadores.
V = volume de diluição da amostra (5 mL)
MMP = massa de micropartículas contendo extrato usado na análise (aprox.
30 mg).
𝐸𝐸% = (𝐶1 . 𝑉
𝑇𝑡 . 𝑇𝐸𝑀 . 𝑚𝑀𝑃) . 100
(3)
Onde:
EE% = Eficiência de encapsulação em % m/m
C1 = concentração de AMA ou AMB na amostra µg/mL, calculado a partir
da curva analítica dos marcadores;
V = volume de diluição da amostra (5 mL);
Tt = Teor teórico de extrato de R. ferruginea na micropartícula (mg/g),
calculado com base na quantidade de extrato e de sólidos totais presentes na
formulação;
TEM = teor do marcador AMA ou AMB no extrato de R. ferruginea (µg/mg)
mMP = massa de micropartículas contendo extrato usada na análise em g
(aprox. 0,030 g).
2.6 Determinação do Perfil de Dissolução
2.6.1 Seleção do meio de dissolução
Como meio de dissolução das MP de QS contendo RF foram testados
meios aquosos contendo lauril sulfato de sódio (LSS) 2,0, 3,0, 4,0 ou 5,0%
ou polissorbato 80 (Tween® 80) a 1,0 e 2,0%. Para estes testes inicialmente
54
pesou-se 0,8 g do extrato mole de RF (diluída à 12,5% em propilenoglicol) e
adicionou-se 500 mL de cada meio. O estudo foi realizado usando aparelho
de dissolução (Erweka DT 80), a 37 °C, 75 rpm por 48 h. Foi realizada uma
única coleta de amostra ao final do ensaio e quantificada por CLAE usando
metodologia descrita no item 2.2.
2.6.2 Ensaio de dissolução das micropartículas
Para análise do perfil de dissolução dos marcadores químicos do extrato
incorporado nas MP, as amostras foram pesadas (o peso de cada amostra foi
calculado com relação à proporção de AMB nas MP) e transferidas para saco
de diálise e fixadas na haste do dissolutor (Figura 1). O volume do meio de
dissolução foi de 30 mL, o qual foi adicionado em tubos de ensaio adaptados
à cuba de dissolução. O estudo foi realizado à temperatura de 37 °C e a 75
rpm. Os tempos de coleta foram de 30 min, 1, 3, 6, 12 e 24 h. Em cada coleta
foi retirado 1 mL do meio através de uma cânula adaptada a uma seringa de
insulina de 1 mL e com reposição do volume. As amostras foram
quantificadas por CLAE usando a metodologia descrita no item 2.2. O perfil
de dissolução foi calculado em relação ao teor do AMB e AMA nas amostras.
Figura 1 – Adaptação da cuba de dissolução. Aparato modificado para
conter 30 mL de meio de dissolução. Amostra ficou retida dentro do saco
de diálise na haste do dissolutor.
2.6.3 Análise do mecanismo de liberação
A cinética de liberação dos marcadores químicos AMA e AMB foi
realizada utilizando os modelos matemáticos de ordem zero, primeira ordem,
Higuchi e Korsmeyer e Peppas, segundo as equações de ordem zero (Qt = Q0
+ K0t), primeira ordem (lnQt = lnQ0 + K1t), Higuchi (Qt = KH √t) e Korsmeyer-
Peppas (Qt =Qo+ Kk tn) (DASH et al., 2010).
Haste
Cuba
Tubo de ensaio
Saco de diálise
contendo a amostra
Ependorf
55
2.7 Avaliação da bioadesão em modelo ex vivo
A bioadesão do extrato mole de R. ferruginea e das MP de quitosana
contendo R. ferruginea foram avaliadas pelo método de bioadesão ex vivo
usando o modelo de saco invertido, com algumas modificações
(FUNDUEANU et al., 2007). O procedimento foi realizado com a
colaboração da Dra. Thaisa Baccarin.
Após eutanásia por deslocamento cervical, o intestino delgado de ratos
machos Swiss Webster foi lavado com tampão fosfato isotônico, contendo 2
mg/mL de glicose, com um pH 7,2, os quais foram mantidos a 4 °C por 12 h.
Em seguida uma porção de 4,0 cm do segmento do intestino foi invertida com
auxílio de uma alça metálica com uma ponta cônica e suavemente lavada com
o tampão fosfato. Uma das extremidades do intestino foi amarrada e em
seguida pela extremidade oposta foram introduzidos 500 µL de tampão
fosfato para preencher o intestino, em seguida foi amarrada a extremidade
que se encontrava aberta. Este sistema foi colocado e fixado dentro do bequer
contendo 5 mL de tampão fosfato e a quantidade equivalente a 5 mg/mL de
extrato mole de R. ferruginea a 12,5%. O mesmo procedimento foi realizado
para as MP de quitosana contendo R. ferruginea e propilenoglicol e MP de
quitosana contendo R. ferruginea e proplienoglicol + RH400. A seguir os
sistemas foram mantidos em agitação orbital (200 rpm) por 3 h a 25 °C.
Posteriormente os intestinos foram retirados dos frascos e a solução tampão
contendo extrato mole de R. ferruginea e as MP restantes no recipiente foram
levadas a estufa (35 ± 3 °C), até peso constante. A porcentagem de bioadesão
das amostras foi calculado usando a equação 4. As análises foram realizadas
em 5 replicatas.
𝐵𝑖𝑜𝑎𝑑𝑒𝑠ã𝑜 (%) = [1 − (𝑚2
𝑚1)] . 100 (4)
Onde:
m1 = massa residual da amostra após retirada do intestino e dessecação;
m2 = massa de amostra usada na análise.
56
2.8 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo
Para avaliar a atividade anti-inflamatória oral in vivo do extrato mole de
R. ferruginea e dos sistemas microparticulados (amostras 2 e 4) foi utilizado
o modelo de dor induzido pela formalina. Os ensaios foram realizados com a
colaboração da Profª. Drª. Márcia Maria de Souza.
2.8.1 Animais
Antes dos experimentos os animais foram mantidos durante três dias para
ambientação no biotério do laboratório de farmacologia (sala 209, bloco F6)
em caixas de polipropileno de 41 cm x 34 cm com no máximo 10 animais.
Nas caixas-moradia, no período de adaptação que antecede aos testes, foi
acrescentado enriquecimento ambiental com intuito de diminuir o estresse. A
maravalha foi trocada a cada 2 dias e tinham ração e água ad libitum. As salas
foram mantidas com controle de temperatura (22-25 oC), umidade constante
(60%) e em ciclos controlados claro/escuro de 12 h cada), conforme
procedimento do laboratório. No dia do teste, os animais foram levados para
a sala de teste para adaptação por um período de 1 h, antes do início dos
mesmos.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios
éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O projeto foi aprovado
pelo CEUA/UNIVALI (parecer nº 020/16p), conforme Anexo A.
2.8.2 Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória oral
As amostras analisadas (extrato mole e MP) foram administradas em
quantidade equivalente a 50, 150 e 300 mg/kg de extrato seco de R.
ferruginea, em dose única, por via oral e, 60 min após, os animais receberam
uma injeção de 20 μL de formalina a 2,5% (0,92% de formaldeído) em salina
estéril na região subplantar da pata posterior direita. Os animais controle
negativo receberam 10 mL/kg de salina (v.o) e os animais controle positivo
receberam o fármaco padrão diclofenaco 10 mg/kg (v.o). O ensaio foi
realizado também usando as MP brancas, sem o extrato de R. ferruginea.
Após a injeção de formalina, os animais foram colocados,
individualmente, sob um funil de vidro circundado por espelhos para facilitar
a observação do comportamento. O tempo em que o animal permaneceu
mordendo a pata injetada com formalina foi cronometrado e considerado
57
como indicativo de dor. Foram cronometrados inicialmente os primeiros 5
min após a injeção (período correspondente à dor neurogênica), em seguida
10 min e contados os próximos 15 min (correspondente a dor inflamatória).
Ao final do tempo de observação os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical, às patas posteriores cortadas na junção tíbio-tarsal e
pesadas em balança analítica para quantificação do edema induzido pela
formalina. A diferença de peso, entre a pata direita e a esquerda foi
considerada como índice de edema (DE SOUZA et al., 2003; BACCARIN et
al., 2016).
Não foram administrados analgésicos nos animais, pois um dos
objetivos do trabalho foi avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório
dos produtos a serem testados. A eutanásia foi feita por deslocamento cervical
uma vez que imediatamente após os experimentos foi quantificado o edema.
2.8.3 Análise estatística dos dados
Para avaliar a atividade anti-inflamatória oral do extrato mole de R.
ferruginea e dos sistemas microparticulados in vivo os resultados foram
submetidos à análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de múltipla
comparação utilizando-se o método de Dunnett, empregando os softwares
Instat e GraphPad Prisma versão 4.0. Os resultados foram apresentados como
a média ± erro padrão da média para cada grupo de experimentos. Os valores
de p<0,05 foram considerados indicativos de significância.
3 Resultados e Discussão
3.1 Obtenção do extrato mole de Rapanea ferruginea
A partir de 200 g da droga vegetal foram obtidos 1400 mL de solução
extrativa de RF (1:7) com resíduo seco de 0,74 ± 0,005%. A solução extrativa
foi concentrada e obtido 10,1281 g de extrato mole (1:0,05) com resíduo seco
de 73,64 ± 9,83%. Para realização dos estudos de microencapsulação do
extrato mole de RF foi preparado uma dispersão deste em propilenoglicol a
12,5% (m/m) a fim de viabilizar a incorporação do extrato na dispersão
aquosa de quitosana e também, pela instabilidade física observada para o
extrato. O extrato mole armazenado em frasco de vidro fechado, sob
refrigeração, aumenta sua consistência e reduz sua solubilidade,
58
inviabilizando o seu manuseio. Foi escolhido o propilenoglicol como agente
dispersante por suas características umectante e solubilizante em formulações
farmacêuticas e cosméticas e também por ser um dos agentes de dispersão
utilizado nas formulações das micropartículas.
O teor dos marcadores AMA e AMB na solução extrativa é de 60,73 e
91,9 mg/g de resíduo seco, e no extrato mole de 47,92 e 74,99 mg/g,
respectivamente. A Figura 2 apresenta o perfil cromatográfico do extrato
mole das cascas de R. ferruginea. Os tempos de retenção dos marcadores no
presente estudo foram de 16,245 e 15,824 min para o AMA e AMB,
respectivamente. O perfil cromatográfico e os respectivos tempos de retenção
dos marcadores AMA e AMB mostraram-se semelhantes aos descritos por
Zermiani et al. (2015).
Figura 2 - Perfil cromatográfico do extrato mole de RF (1 mg/mL) em
270 nm
Analisando os estudos desenvolvidos com soluções extrativas de R.
ferruginea, os resultados encontrados neste estudo são semelhantes aos
obtidos por Baccarin et al. (2014), em que o resíduo seco da solução extrativa
foi de 0,70 ± 0,037%. Enquanto, Dal Mas (2015) obteve um resíduo seco de
0,48 ± 0,02% empregando a mesma metodologia de extração. A diferença
dos resultados de resíduo seco pode estar relacionada com a altura do caule e
espessura da casca. Com relação ao teor dos marcadores, Baccarin et al.
(2014) obteve 79,48 mg/g de teor de AMB, Dal Mas (2015) obteve 42,14
mg/g e 36,88 mg/g de AMA e AMB, respectivamente e Zermiani et al. (2015)
no ensaio de repetibilidade do método analítico gradiente (validação
analítica) encontrou no extrato etanólico das cascas de R. ferruginea na
diluição de 1:5 em metanol 54,38 ± 0,41 mg/g e 30,98 ± 0,43 mg/g, de AMA
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000mAU
270nm,4nm (1.00)
AMB
AMA
59
e AMB respectivamente. Em todos os estudos o teor dos marcadores foi
menor que o obtido no presente estudo.
3.2 Obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea usando spray
drying
Nos estudos de desenvolvimento das MP de QS contendo extrato de RF,
inicialmente foram testados diferentes agentes de dispersão do extrato para
incorporação na solução de QS. O extrato de RF possui baixa solubilidade
em meio aquoso, o que dificulta sua dispersão sem auxílio de adjuvante.
Foram testados três tipos de AD: propilenoglicol, Tween® 80 e RH400.
Para este teste premilinar de microencapsulação, o extrato (RF) foi
incorporado na proporção de 10% RF:QS (1:10 m/m em teor de sólidos) e foi
analisada a influência do tipo de AD no rendimento e na morfologia das MP.
O rendimento obtido na secagem de 200 mL das dispersões com os três
dispersantes está descrito na tabela 1.
Tabela 1 – Resultado do rendimento das MP de RF:QS (1:10)
diferentes agentes dispersantes.
Amostra Dispersante Rendimento
g (%)
1 Propilenoglicol 1,0%
Tween 80 1,0% 1,424 12,08
2 Propilenoglicol 1,0% 0,749 33,92
3 Propilenoglicol 1,0%
RH400 0,5% 1,163 22,42
As amostras 1 e 3, que continham tensoativo não iônico Tween® 80 e
RH 400, respectivamente, apresentaram menor rendimento em comparação
ao lote 2, que continha apenas o propilenoglicol como agente dispersante. Os
tensoativos são incorporados em formulações a fim de reduzir a tensão
superficial da solução, melhorar a molhabilidade e a plasticidade. Segundo
Vieira et al. (2013) os tensoativos não iônicos apresentam um efeito sinérgico
sobre a plasticidade de polióis como glicerina e propilenoglicol, porém os
polióis são menos voláteis que os tensoativos não iônicos, o que
provavelmente influenciou no rendimento das micropartículas.
60
Há vários relatos na literatura que quando se utiliza a QS como polímero
para a formação de MP por spray drying é observado baixo rendimento, isto
porque quando as gotículas da solução polimérica são pulverizadas na câmara
de secagem, elas entram em contato com a parede do equipamento e formam
um filme que fica fortemente aderido, reduzindo o rendimento das
micropartículas. Apesar do baixo rendimento, o método de secagem por
pulverização foi escolhido por apresentar várias vantagens, como
simplicidade de operação, boa reprodutibilidade de lote para lote, facilidade
de aumento de escala. E em grandes escalas de produção, essa perda de
material pode ser menos significativa do que em pequena escala devido a
maior quantidade de produto, portanto a formação do filme não influenciaria
no rendimento final de maneira tão significante (GELFUSO et al., 2011).
Corrigan et al. (2006) ao desenvolveram MP contendo salbutamol
obtidos por spray drying usando concentrações variáveis de QS (0,5 a 2,0%
m/v) observaram que a concentração de 0,5% m/v foi a concentração ideal
frente aos parâmetros de eficiência de encapsulação e perfil de liberação do
fármaco.
As micrografias das MP estão apresentadas na Figura 3. As MP
preparadas apresentaram forma esférica, com a superfície e rugosidade sendo
influenciadas pela composição. MP com a mistura Tween® 80 e
propilenoglicol como dispersantes apresentaram superfície lisa com
deformações (Figura 3A), aspecto este semelhante ao das MP preparadas com
propilenoglicol e RH400 (Figura 3C). As partículas preparadas usando
apenas o propilenoglicol como agente dispersante (Figura 3B) apresentaram
forma esférica, porém mais rugosa quando comparado com as MP contendo
tensoativo. Observou-se que a matriz de QS foi influenciada pela adição dos
tensoativos não iônicos aumentando sua plasticidade e resultando em
matrizes mais homogêneas. Os resultados demonstraram a influência do tipo
de agente dispersante principalmente sobre a morfologia das MP.
61
Figura 3 – Fotomicrografia por MEV das MP de RF:QS (1:10) contendo como
agentes de dispersão propilenoglicol e Tween® 80 (A); propilenoglicol (B) e
propilenoglicol e RH400 (C). Aumento de 5.000x.
Após análise das MP obtidas, foram selecionados o propilenoglicol e
associação de propilenoglicol com RH400 como agentes dispersantes para
prosseguir com o desenvolvimento das MP de RF:QS.
3.3 Otimização da obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea
usando spray dryer
No desenvolvimento da MP de RF:QS foi empregado um planejamento
fatorial 23 para otimização da composição e verificar quais fatores teriam
maior influência na obtenção das MP, sendo eles proporção de RF:QS 5 e
10% m/m (1:20 e 1:10, respectivamente), proporção de propilenoglicol (0,5
e 0,75% m/m) e proporção de RH400 (0,0 e 0,5% m/m).
Para análise da influência dos fatores estudados nas propriedades físicas
e físico-químicas das partículas, estas foram caracterizadas quanto ao
rendimento, morfologia, tamanho médio, teor dos marcadores (AMA e
AMB), eficiência de encapsulação e perfil qualitativo de absorção no
infravermelho.
(A) (B)
(C)
62
Os resultados do rendimento e do tamanho das MP de QS contendo
extrato de R. ferruginea obtido na secagem por spray dryer estão descritos na
tabela 2. Os valores variaram entre 14 e 60%. A análise estatística do
rendimento frente aos fatores estudados no planejamento fatorial mostrou que
somente a proporção de RH400 apresentou influência estatisticamente
significativa (p = 0,019). O valor de p foi de 0,902 para a proporção RF:QS,
enquanto para o fator proporção de propilenoglicol foi de 0,486,
demonstrando que estes fatores não apresentaram uma influência
significativa sobre o rendimento das MP nas proporções estudadas.
O efeito dos fatores estudados sobre o rendimento das MP também pode
ser visualizado na Figura 4. A resposta mais intensa obtida foi para a
proporção de RH400. A inclusão deste tensoativo aumentou de forma
significativa o rendimento.
Tabela 2 – Resultado do rendimento e do tamanho médio das MP de QS contendo
extrato de R. ferruginea preparadas por spray dryer e usando diferentes
proporções extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH 400
(planejamento fatorial 23).
Amostras RF:QS
(%)
PPG
(%)
RH400
(%)
Rendimento
(%)
Tamanho
(µm)
1 10 0,5 0 26,66 1,648 ± 1,195
2 10 0,75 0 14,47 1,697 ± 0,823
3 10 0,5 0,5 30,30 1,218 ± 0,610
4 10 0,75 0,5 58,43 1,215 ± 0,622
5 5 0,5 0 21,77 2,047 ± 0,915
6 5 0,75 0 19,27 1,583 ± 1,35
7 5 0,5 0,5 35,85 1,811 ± 1,446
8 5 0,75 0,5 59,73 1,628 ± 0,402
Nota: RF – extrato de Rapanea ferrugínea a 12,5% em propilenglicol; QS –
dispersão de quitosana 0,5%; PPG – Propilenoglicol.
Resultados expressos em média ± desvio padrão.
Na análise da interação dos fatores estudados, a maior interação foi
observada entre o PPG e o RH400. O aumento da concentração de PPG e a
adição do tensoativo não-iônico RH400 aumentou significativamente o
rendimento das MP, como apresentado na Figura 5. A amostra 6 preparada
com 5% RF:QS e 0,75% de PPG teve um rendimento de 19,27%, enquanto a
63
amostra 8 preparada com estes mesmo componentes porém com a adição de
0,5% de RH400 teve um rendimento de 59,73%. A influência do tensoativo
não-iônico RH400 no rendimento está relacionada com a sua capacidade de
aumentar a dispersibilidade do extrato na dispersão polimérica, influenciando
a homogeneidade da amostra e, provavelmente, no seu rendimento de
secagem.
Figura 4 - Gráfico dos efeitos principais dos fatores proporção extrato:quitosana
(RF:QS), de propilenoglicol (PPG) e de RH400 sobre o rendimento das
micropartículas de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).
Figura 5 - Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção
extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre o rendimento das
MP de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).
64
3.3.1 Análise morfológica e granulométrica
As MP foram caracterizadas quanto à morfologia usando MEV. As
fotomicrografias das MP de QS contendo extrato de RF são apresentadas nas
Figuras 6 e 7. A partir das fotomicrografias foi determinada a distribuição de
tamanho das MP (Figura 8).
As amostras 1 e 2 (Figura 6) foram preparadas com proporção RF:QS
1:10 (10%) e usando somente propilenoglicol como dispersante. Nestas duas
amostras, as MP apresentaram morfologia semelhante com forma esférica,
superfície rugosa e diâmetro médio de 1,648 e 1,697 µm, respectivamente.
A morfologia das MP (amostras 3 e 4) contendo o PPG e o RH400 como
dispersantes e com proporção RF:QS 1:10 foi apresentada na Figura 6. As
MP apresentaram forma esférica, superfície lisa com algumas deformações e
diâmetro de 1,218 e 1,215 µm, respectivamente.
A morfologia das MP preparadas com a proporção RF:QS 1:20 (5%) foi
apresentada na Figura 7 (amostras 5 a 8). As MP apresentaram morfologia
semelhante à das partículas preparadas com proporção 1:10.
O tamanho médio foi de 1,583 µm (amostra 6) a 2,047 µm (amostra 5),
conforme apresentado na Tabela 2.
65
Figura 6 - Fotomicrografia por MEV das MP de QS:RF (amostras 1 a 4). Aumento
de 5.000 e 10.000x.
1
2
3
4
66
Figura 7 - Fotomicrografia por MEV das MP de RF:QS (amostras 5 a 8). Aumento
de 5.000 e 10.000x.
5
6
7
8
67
A morfologia das MP foi influenciada pela presença do tensoativo não-
iônico RH400. As partículas sem o tensoativo apresentam superfície rugosa,
enquanto micropartículas contendo o tensoativo apresentaram superfície lisa,
devido à plasticidade do tensoativo.
Figura 8 – Histograma representativo de distribuição de tamanho e frequência das
amostras de MP de quitosana contendo extrato de Rapanea ferruginea.
Na análise estatística dos resultados, os fatores e os respectivos níveis
estudados não apresentaram influência significativa sobre o tamanho médio
das MP (valores de p > 0,093). Conforme apresentado na Figura 9, na análise
de interação entre os fatores, o aumento da proporção de extrato nas partículas
reduziu o tamanho, principalmente quando a concentração de PPG foi de
0,5% e na presença de RH400. A adição do tensoativo não-iônico, além de
resultar em partículas de superfície lisa, também levou a obtenção de
partículas com menor diâmetro, mostrando assim a influência favorável do
tensoativo na composição das MP.
68
Figura 9. Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção extrato:quitosana
(RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre o tamanho médio das MP de QS
contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).
3.3.2 Teor e eficiência de encapsulação
Na análise do teor de encapsulação do extrato de R. ferruginea nas MP
de QS foi empregada a quantificação dos marcadores AMA e AMB.
Inicialmente, foi verificado a seletividade do método para quantificação dos
marcadores quando incorporados nas MP. Conforme apresentado nas figuras
10 e 11, as MP brancas (sem extrato) não apresentam picos que possam
interferir na quantificação dos ácidos mirsinoicos AMA e AMB. A matriz
polimérica também não influenciou no tempo de retenção dos marcadores
AMA e AMB. Portanto, na determinação do teor e eficiência de encapsulação
do extrato nas MP de QS foi empregada a mesma metodologia analítica
desenvolvida para quantificação dos marcadores em amostras de extrato
mole.
A partir da quantificação das amostras por CLAE, foi determinado o
teor de encapsulação de AMA, AMB e do extrato (a partir do teor de AMB),
assim como, a eficiência de encapsulação. Na tabela 3 estão demonstrados os
resultados de teor e eficiência de encapsulação dos oito lotes de MP.
69
Figura 10 – Sobreposição do perfil cromatográfico das MP de RF contendo AD
propilenoglicol e das MP brancas contendo AD propilenoglicol em 270 nm.
Figura 11 – Sobreposição do perfil cromatográfico das MP de RF
contendo AD propilenoglicol + RH400 e das MP brancas
contendo AD propilenoglicol + RH400 em 270 nm.
O teor de encapsulação de AMA nas MP variou de 0,07 a 0,28%
(amostras 8 e 1, respectivamente). Para o teor de AMB os valores foram de
0,11 a 0,43%. O teor de AMA e AMB no extrato usado na preparação das
MP era de 60,73 e 91,9 mg/g de resíduo seco, representando uma relação de
1:1,5 AMA:AMB, aproximadamente. Esta proporção de marcadores foi
encontrada após microencapsulação em praticamente todas as amostras. A
amostra 2 apresentou uma relação de 1:1,95 e a amostra 4 de 1:1,88. O teor
de encapsulação do extrato variou de 1,43 a 5,72%. A relação de teor de AMA
e AMB foi de 1:1,88 (amostra 4), demonstrando uma perda maior do AMA
durante o processo de secagem, pois o extrato apresentava uma relação de
1:1,5. Comparando os dois marcadores, o AMA apresenta-se como um óleo
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
uV
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
uV
AMB
AMA
MP + RF
MP brancas
MP + RF
MP brancas
AMA
AMB
70
enquanto o AMB é um sólido cristalino (ZERMIANI et al., 2016), o que pode
ter resultado na maior redução de AMA nas micropartículas.
Tabela 3 – Teor dos marcadores AMA e AMB e da eficiência de encapsulação das
micropartículas de quitosana contendo extrato de Rapanea ferruginea. Resultado
expesso através da média e desvio padrão.
Amostras TE % AMA TE % AMB
TE%
RF
EE %
AMA EE % AMB
1 0,28 ± 0,04 0,43 ± 0,05 5,72 ± 0,72 121,34 ± 16,28 120,22 ± 15,14
2 0,10 ± 0,01 0,19 ± 0,02 2,71 ± 0,28 54,44 ± 3,82 67,81 ± 6,71
3 0,19 ± 0,01 0,28 ± 0,01 3,75 ± 0,15 121,95 ± 5,53 116,28 ± 4,62
4 0,08 ± 0,02 0,15 ± 0,03 2,05 ± 0,37 62,14 ± 11,74 73,94 ± 13,33
5 0,16 ± 0,00 0,26 ± 0,02 3,43 ± 0,26 141,59 ± 12,86 140,57 ± 10,65
6 0,1 ± 0,00 0,15 ± 0,00 1,97 ± 0,11 105,05 ± 11,02 100,21 ± 5,58
7 0,08 ± 0,00 0,13 ± 0,00 1,70 ± 0,06 102,11 ± 2,63 103,17 ± 3,91
8 0,07 ± 0,00 0,11 ± 0,00 1,43 ± 0,02 100,97 ± 2,25 101,69 ± 1,64
A análise de interação entre os fatores sobre o teor de encapsulação
(Figura 12) mostrou que o mesmo comportamento de influência foi
observado para o teor dos ácidos AMA e AMB, bem como, para o teor de
extrato.
A presença de PPG a 0,5% e o aumento da proporção de extrato
proporcionaram um aumento do teor do extrato. A adição do tensoativo
RH400 reduziu o teor de marcadores. Embora tenha se observado a influência
dos fatores sobre o teor de encapsulação, os resultados não apresentaram
diferença significativa (p>0,072).
A partir dos resultados de teor de encapsulação foi determinada a
eficiência de encapsulação dos ácidos AMA e AMB. Conforme apresentado
na Tabela 3, os menores valores de AMB (67,81 e 73,94%) e de AMA (54,44
e 62,14%) foram encontrados para as amostras 2 e 4, enquanto a amostra 5
apresentou valor superior a 120%. Por se tratar de uma amostra heterogênea
incorporada na matriz polimérica, os resultados de eficiência se mostraram
satisfatórios.
71
Figura 12. Gráficos da interação entre os fatores estudados, proporção
extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre o teor de
encapsulação do AMA (A), AMB (B) e extrato (C) nas MP de QS contendo extrato de
Rapanea ferruginea (RF).
A
B
C
72
A proporção de PPG mostrou ser um fator que possui influência
significativa sobre as eficiências de encapsulação do AMA e AMB, com
valores de p de 0,036 e 0,027, respectivamente. Para as amostras sem RH400,
o aumento da concentração do PPG resultou em uma redução significativa da
eficiência de encapsulação nas duas proporções de extrato usadas (Figura 13).
Este mesmo comportamento não foi observado na presença do RH400.
Figura 13. Gráficos da interação entre os fatores estudados, proporção
extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre a eficiência de
encapsulação do AMA (A) e AMB (B) nas MP de QS contendo extrato de Rapanea
ferruginea (RF).
A
B
73
3.3.3 Espectroscopia no Infravermelho (IV)
As atribuições das principais frequências de cada banda de absorção, as
características das estruturas químicas do extrato de R. ferruginea, QS e das
MP de RF:QS estão descritas a seguir.
Na figura 14 estão representados os espectros de absorção no IV do
extrato de RF, QS, MP brancas contendo agente de dispersão propilenoglicol
(Bco PPG) e as MP das amostras 1, 2, 5 e 6. Onde se observa no IV da RF na
região entre 3600–2700 cm-1 uma banda alargada, caracterizada pela
deformação axial do grupamento O-H, que juntamente com o estiramento em
1685-1630 cm-1 referente a ligação C=O caracteriza o grupo funcional ácido
carboxilico. Também pode ser observado em 1606 cm-1 uma banda de
deformação axial referente a ligação C=C de alceno ou carbonos do anel
aromático. Na região de 1456 cm-1 se observa uma banda de deformação
angular referente ao grupamento CH3 de alcano. Nas regiões de 1220 cm-1 à
1041 cm-1 há várias bandas de absorção de deformação axial referente ao
grupamento C-O de aril-alquil-éter. As bandas encontradas no espectro de
absorção são semelhantes às encontradas nos espectros do AMA e AMB
(ZERMIANI, 2015) confirmando a presença em maior concentração deste
marcador químico no extrato conforme resultado demonstrado no teor do
extrato.
No espectro de absorção no IV da QS (Figura 14), são observadas as
seguintes bandas de absorção: na região de 3600–3000 cm-1 estiramento
referente ligação O-H atribuída ao grupo hidroxila. Em 2875 cm-1 há presença
de banda referente à deformação axial do grupo Csp3-H. Na região de 1654
cm-1 observa-se uma banda de deformação axial referente ao grupamento
C=O do grupo acetamida, a qual corresponde à parte acetilada da QS. Na
região de 1560 cm-1 observa-se banda de deformação angular referente ao
grupamento CH3. Em 1375 cm-1 banda de deformação axial referente ao
grupamento C-N. Banda de absorção na região 1155 cm-1 refere-se a
deformação axial do grupamento C-O e na região de 1037-900 cm-1 há
presença de bandas de C-O de polissacarídeos.
A QS comercial possui grau de desacetilação entre 70 e 95%. Quanto
maior o grau de desacetilação maior será a proporção de grupamentos amino
livres presentes na cadeia polimérica e maior a solubilidade em soluções
aquosas de ácido acético (CANELLA; GARCIA, 2001).
74
Em estudos realizados por Udrea et al. (2011), o espectro no IV da QS
apresentou bandas de estiramento de O-H em 3439 cm-1 e de C-H alifático
em 2924 cm-1, deformação axial do grupamento C-N em 1382 cm-1 e
deformação axial do grupamento C-O em 1089 cm-1. Apresenta bandas
características do grupamento NH2 em 3000-3500 cm-1 e banda de 1637cm-1
relacionadas ao grupamento amida, resultados estes semelhantes aos
encontrados em nosso estudo. As bandas podem aumentar ou decrescer
dependendo do grau de desacetilação da quitina.
O perfil comparativo das MP com agente de dispersão propilenoglicol
sem e com o extrato também está apresentado na figura 14. As amostras
apresentaram eventos nas regiões de 3350-3200 cm-1 indicativos da presença
do grupamento OH do grupo hidroxila presente na QS e também presente nos
compostos do extrato da RF. Nas regiões de 2974- 2860 cm-1 se encontram
bandas referente a deformação axial do grupo Csp3-H encontrados na QS e no
extrato da RF. Em 1660 cm-1 a presença de bandas de deformação axial
referente à carbonila encontrados na QS e nos compostos do extrato da RF.
Em 1608 - 1456 cm-1 observou-se a presença de bandas de deformação axial
referente a ligação dos carbonos do anel aromático presente no extrato da RF,
em 1377 -1352 cm-1, observa-se bandas de deformação axial referente ao
grupamento C-N também encontrado na QS. Na região de 1249 - 1035 cm-1
a presença de bandas de deformação axial C-O encontrados no extrato da RF.
Na figura 15 estão demonstrados os espectros de absorção no IV do
extrato de RF, QS, MP brancas contendo agente de dispersão propilenoglicol
+ RH400 (Bco RH400) e as MP das amostras 3, 4, 7 e 8. Nesta figura
observam-se as mesmas bandas da QS e RF descritas na figura 14. Nas
amostras sem extrato (Bco RH400) e as amostras 3, 4, 7 e 8 as quais possuem
os agentes dispersantes propilenoglicol + RH400 em sua composição,
observa-se na região de 1734 cm-1 a presença de uma banda de estiramento
referente ao grupamento C=O presente no tensoativo RH400. Na região de
1458 cm-1, há presença de uma banda de deformação angular referente ao
grupamento CH3 presente na QS e no extrato da RF. Na amostra 4 pode-se
observar que entre as bandas 1730-1645 cm-1 há presença de outras bandas
características da RF que não foram observadas nas demais amostras,
provavelmente por esta amostra ser a de maior proporção de RF:QS (1:10) e
conter os dois agentes de dispersão e em maior concentração, nas demais
amostras as bandas características do extrato provavelmente estão
sobrepostas com as bandas do polímero não sendo possível identificá-las.
75
Figura 14 - Espectro de absorção no IV do extrato da Rapanea ferruginea (RF), da
quitosana (QS), MP brancas de quitosana com o AD propilenoglicol (BCO PPG), MP
contendo extrato de R. ferruginea com o AD propilenoglicol, amostras 1, 2, 5 e 6.
Figura 15- Espectro de absorção no IV do extrato da Rapanea ferruginea (RF), da
quitosana (QS), MP brancas de quitosana com o AD propilenoglicol +RH400 (BCO
RH400), MP contendo extrato de R. ferruginea com o AD propilenoglicol + RH400,
amostras 3, 4, 7 e 8.
76
3.4 Análise do perfil de dissolução
O desenvolvimento de teste de dissolução para fármacos pouco solúveis
em água é um grande desafio. Se o fármaco não for solúvel em uma ampla
faixa de pH, a adição de adjuvantes de solubilidade, como os tensoativos,
pode ser requerida. Outras estratégias para aumento também têm sido
utilizadas, como aumento da área superficial, utilização de polimorfos
77
metaestáveis, misturas eutéticas, dispersões sólidas ou formação de
complexos solúveis (GOWTHAMARAJAN; SINGH, 2010).
Estudos de pré-formulação dos marcadores do extrato de RF descrevem
que estes compostos possuem baixa solubilidade em meio aquoso, sendo
classificados como praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL)
(ZERMIANI et al., 2016).
Para análise do perfil de dissolução das MP, inicialmente foi realizado
um estudo para seleção do meio de dissolução.
Em estudos preliminares para a seleção do meio para o teste de
dissolução das MP contendo extrato mole de RF, foram selecionados os
meios tampão fosfato pH 6,8, tampão acetato pH 4,5 e HCl 0,1 M, porém em
nenhum destes foi possível a dissolução do extrato em uma concentração
adequada para dar continuidade aos estudos, sendo então testados o lauril
sulfato de sódio (LSS) a 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0% e o Tween® 80 nas concentrações
de 1,0 e 2,0% como adjuvantes de solubilidade no meio de dissolução. Os
resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 4.
Tabela 4 – Proporção (%) dos marcadores AMA e AMB
dissolvidos em diferentes meios de dissolução, após 24 h de
análise.
Meios de Dissolução Proporção dissolvida (%)
AMA AMB
LSS 2% 57,84 64,70
LSS 3% 41,97 46,72
LSS 4% 35,33 45,98
LSS 5% 35,91 41,40
Tween 80 1% 21,84 25,51
Tween 80 2% 39,67 43,59
O LSS a 2,0% foi o meio que apresentou maior proporção de dissolução
dos marcadores do extrato das cascas de R. ferruginea, sendo 57,84% e
64,70%, para o AMA e AMB, respectivamente. Este meio foi então
selecionado para continuidade dos estudos de dissolução das MP contendo
extrato de RF. Em estudos de dissolução para a seleção do meio realizado
com o ácido mefenâmico, princípio ativo insolúvel em água, Patil et al.
(2010) também obtiveram os melhores resultados de solubilidade do ácido
mefenâmico com o LSS 2,0%, obtendo-se 96,24% de dissolução em 120 min.
78
O ensaio de dissolução das oito amostras de MP de QS contendo RF foi
realizado por um período de 24 h. Os resultados foram expressos em
percentual de AMB e de AMA dissolvidos (Figuras 16 e 19,
respectivamente).
As MP apresentaram diferentes comportamentos de dissolução do
AMB. As amostras contendo extrato na proporção 1:10 (amostras 1 a 4)
apresentram maior velocidade de dissolução do que as MP com proporção
1:20 (amostras 5 a 8). Este comportamento provavelmente está relacionado
com o aumento da capacidade da matriz polimérica de reter os ativos do
extrato quanto na presença de menor teor dos mesmos.
A amostra 2 apresentou maior taxa de dissolução de AMB após 24 h,
seguida pela amostra 1. A diferença entre estas amostras é a proporção de
PPG. A maior proporção de PPG (0,75%) resultou em maior taxa de
dissolução. A incorporação do tensoativo RH400 não promoveu a liberação
do AMB da matriz polimérica.
As amostras 5, 6 e 7 apresentaram baixa dissolução do AMB, pois
dissolveram no final do estudo apenas 2,81, 2,30 e 0,031%, respectivamente.
A influência de cada fator estudado na otimização das MP, assim como
a interação entre eles, sobre a proporção de AMB dissolvido em 1440 min
(24 h) é apresentada na Figura 17 e 18. A proporção extrato:QS foi o fator
com maior influência, seguido da proporção de PPG e de RH400. A análise
ANOVA mostrou que embora tenha sido observado influência dos fatores,
estas não são estatiscamente significantes (p>0,1).
As MP preparadas com propilenoglicol (MP1 e 2) apresentaram maior
taxa de dissolução, enquanto a adição do RH400 resultou em matrizes com
maior retenção dos marcadores. Tais resultados podem estar relacionados
com a capacidade do tensoativo polietoxilado formar uma matriz e retardar a
liberação dos marcadores das MP.
79
Figura 16 - Perfil de liberação do AMB das amostras 1-8 das MP de QS contendo
extrato de R. ferruginea.
Figura 17. Gráfico dos efeitos principais dos fatores proporção extrato:quitosana
(RF:QS), de propilenoglicol (PPG) e de RH400 sobre a proporção de AMB dissolvida
em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).
80
Figura 18. Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção
extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400,sobre a proporção de
AMB dissolvida em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea
ferruginea (RF).
O comportamento de liberação do AMA a partir das micropartículas é
apresentado na Figura 19. Foi observada uma tendência de liberação
semelhante ao do AMB, porém em uma menor proporção. Esta menor taxa
de dissolução do AMA provavelmente está relacionada com sua menor
solubilidade no meio, conforme apresentado na Tabela 4 nos estudos
preliminares de dissolução.
Excetuando as amostras 1 e 2, que apresentaram as maiores taxas de
dissolução, para as demais amostras foi observado um início de dissolução
somente a partir do tempo de 180 min. Não foi possível quantificar a
dissolução do AMA a partir das amostras 5, 6 e 7, o que pode ter sido
provocado pela baixa concentração do AMB nas amostras e o limite de
detecção da metodologia analítica.
Conforme pode ser observado na Figura 20, a proporção
extrato:polímero apresentou maior influência sobre a taxa de dissolução das
amostras, seguido da proporção de PPG. A adição de RH400 à formulação
praticamente não alterou a taxa de dissolução. Dos três fatores estudados, a
proporção RF:QS apresentou influência estatisticamente significativa sobre a
proporção de AMA dissolvido em 24 h (p = 0,038).
81
Na análise da interação entre os fatores, o gráfico permite visualizar
maior interação entre a proporção RF:QS com o PPG, sendo que o aumento
da proporção de extrato (10%) e de PPG (0,75%) resultou em maior taxa de
dissolução de AMA a partir da matriz polimérica (Figura 21).
Figura 19 - Perfil de liberação do AMA das amostras 1-8 das MP de QS contendo
extrato de R. ferruginea.
Figura 20. Gráfico dos efeitos principais dos fatores proporção extrato:quitosana
(RF:QS), de propilenoglicol (PPG) e de RH400 sobre a proporção de AMA dissolvida
em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).
82
Figura 21. Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção
extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre a proporção de
AMA dissolvida em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea
ferruginea (RF).
A cinética de liberação dos marcadores químicos AMA e AMB foram
realizadas utilizando os modelos matemáticos de ordem zero, primeira
ordem, Higuchi e Korsmeyer e Peppas. Os resultados estão descritos na
Tabela 5.
Para análise do AMB, os perfis apresentaram melhor ajuste aos modelos
de primeira ordem e Korsmeyer-Peppas, exceto a MP 4. O mecanismo de
liberação é anômalo, podendo envolver difusão e intumescimento da matriz.
Os perfis de dissolução do AMA apresentaram um baixo ajuste aos modelos
cinéticos empregados, exceto para as MP 4. As amostras 1 e 3 por
apresentarem um baixo ajuste ao modelo de Korsmeyer e Peppas não
permitiram a análise da cinética por este modelo.
A partir dos resultados obtidos, as MP 2 e 4 que continham como agente
dispersante propilenoglicol e propilenoglicol + RH400, respectivamente,
foram selecionadas para avaliação da biodesão em modelo ex vivo e a
atividade anti-inflamatória in vivo por via oral. Estas duas formulações foram
selecionadas por possuírem diferentes agentes dispersantes. A amostra 2,
contendo somente propilenoglicol, foi selecionada pela alta de taxa de
dissolução apresentada, embora não tenha sido a formulação com maior
rendimento ou teor de encapsulação. Já a amostra 8 foi lecionada por ser das
amostras com propilenoglicol + RH400 a com maior rendimento e dissolução
crescente dos dois marcadores químicos ao longo do ensaio de dissolução.
83
Tabela 5. Resultados da análise da cinética de dissolução dos marcadores AMB e AMA das MP de QS contendo extrato de Rapanea
ferruginea (RF).
Amostras Ordem Zero Primeira Ordem Higuchi Korsmeyer e Peppas
r2 K r2 K r2 KH r2 K n
1 AMB 0,986 0,031 0,992 0,00038 0,865 0,92 0,989 0,054 0,92
2 AMB 0,827 0,076 0,984 0,0027 0,935 2,93 0,939 2,11 0,55
3 AMB 0,943 0,038 0,956 0,00047 0,928 0,916 0,977 0,244 0,72
4 AMB 0,687 0,012 0,679 0,00014 0,690 0,406 0,715 0,126 0,67
1 AMA 0,768 0,013 0,690 0,00011 0,435 0,28 nd nd nd
2 AMA 0,759 0,056 0,944 0,0016 0,897 2,215 0,898 1,918 0,52
3 AMA 0,758 0,016 0,777 0,00020 0,793 0,552 nd nd nd
4 AMA 0,977 0,023 0,977 0,023 0,812 0,674 0,974 0,018 1,03
nd – não determinado. Não foi possível ajustar o perfil de dissolução a este modelo.
84
3.5 Análise da bioadesão ex vivo
A bioadesão do extrato mole de R. ferruginea e das MP de quitosana
contendo R. ferruginea preparadas com AD (propilenoglicol e RH400) foram
avaliadas segundo o método descrito por Fundueanu et al. (2007) com
algumas modificações e estão representadas na Figura 23.
Conforme apresentado na Figura 23, o extrato mole de R. ferruginea
quando comparado ao branco e ao tampão apresentou uma porcentagem de
aderência na superfície do muco do tecido intestinal de 8,18 ±1,09. Este
comportamento deve-se provavelmente à característica resinosa do extrato e
a influência do propilenoglicol usado como solvente na obtenção do extrato
glicólico 12,5%. As MP preparadas com PPG 0,75% (amostra 2)
apresentaram maior bioadesão (24,58%), quando comparadas com as MP
preparadas com RH400 (amostra 4) (15,27%).
Figura 23. Resultado do teste de bioadesão ex vivo das MP (amostras 2 e 4) contendo
extrato das cascas de R. ferruginea.
Nota: Branco: extrato + tampão; Tampão: intestino + tampão; Extrato RF: extrato
mole de RF + intestino + tampão; MPB Bca PPG: micropartícula branca com
propilenoglicol; MP PPG: micropartícula com propilenoglicol e extrato (amostra 2);
MP Bca RH400: micropartícula branca c/ propilenoglicol + RH400; MP RH400:
micropartícula c/ propilenoglicol + RH400 e extrato (amostra 4). Todas as amostras
de micropartículas contêm intestino + tampão
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
1
% B
ioad
esã
o
Branco
Tampão
Extrato RF
MP Bca PPG
MP PPG
MP BcaRH400
85
3.6 Avaliação da atividade anti-inflamatória oral
A atividade anti-inflamatória in vivo do extrato das cascas de R.
ferruginea e das MP 2 e 4 contendo extrato das cascas de R. ferruginea foi
determinada usando o modelo de formalina com administração oral do
extrato e das MP.
Inicialmente o extrato foi administrado nas doses de 50, 150 e 300
mg/kg. Conforme observado na Figura 24A (fase I), as doses de 150 e 300
mg/kg apresentaram maior efetividade para a dor neurogênica que o
diclofenaco (controle positivo) apresentando redução da dor em 55,28 e
61,87%, respectivamente, não apresentando diferença estatística entre elas.
A dor neurogênica é avaliada pelo tempo de lambida da pata injetada com
formalina nos primeiros 5 min.
Na figura 24B são apresentados os resultados da resposta a dor
inflamatória (fase II). Após 10 min da avaliação da dor neurogênica, foram
contados o número de lambidas durante 15 min, que corresponde a dor
inflamatória. Foi verificado que a dose que melhor reduziu a dor inflamatória
foi a de 150 mg/kg apresentando 58,49% de eficácia, sendo esta menor que o
diclofenaco (75,68%).
A figura 24C representa a avaliação do edema pela diferença de peso
(mg) entre a pata na qual foi injetada a formalina (agente irritante) e a pata
contra-lateral (sem formalina). A dose que apresentou maior eficácia foi a de
300 mg/kg, com redução de 61,90% do edema. O diclofenaco apresentou uma
redução de 71,42% do edema.
Baccarin et al. (2016) também avaliaram o extrato mole de R. ferruginea
nas doses de 150, 300 e 500 mg/kg, usando a indometacina (10 mg/kg) como
controle positivo. As doses de 300 e 500 mg/kg de extrato mole inibiram de
forma significativa a dor neurogênica, com valores médios de inibição de
27,67% ± 3,86 e 36,56% ± 3,94, respectivamente. Na avaliação da redução
da dor inflamatória todas as doses do extrato mole reduziram de forma
significativa a dor de origem inflamatória com valores médios de inibição de
88,82% ± 10,36, 89,26% ± 9,66 e 93,02% ± 5,80, respectivamente para as
doses de 150, 300 e 500 mg/kg. Ainda nos estudos realizados por Baccarin et
al. (2016), o edema foi reduzido de forma significativa somente com a dose
de 500 mg/kg, apresentando uma inibição de 44,82% ± 0,002 e a
indometacina de 43,10% ±0,005.
86
Figura 24. Resultado da avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória oral do
extrato mole de R. ferruginea (50, 150 e 300 mg/kg v.o) em modelo de formalina. A-
Fase I (dor neurogênica), B – Fase II (dor inflamatória), C (avaliação do edema).
Controle 50 150 300 Diclof0
20
40
60
80 A
*
******
Veículo
R. ferriginea
Diclofenaco
23.15%
55.28%
61.87%
Tratamento (mg/kg, v.o.)
Tem
po d
e R
eaçã
o (s
)
Controle 50 150 300 Diclof0
50
100
150
200 B
**
***
*
58.49%50.10%
75.68%
Tratamento (mg/kg, v.o.)
Tem
po d
e R
eaçã
o (s
)
Controle 50 150 300 Diclof0.00
0.02
0.04
0.06
0.08 C
**
***
61.90%
71.42%
Tratamento (mg/kg, v.o.)
Peso
(mg)
Nota: veículo: salina (controle negativo); R. ferruginea: extrato mole de R. ferruginea;
diclofenaco: controle positivo. Os dados foram expressos como a média ± desvio
padrão de 8 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam *** para P < 0,0001, **
para P < 0,01.
Hess (2006) avaliou o efeito antinociceptivo do AMB isolado das cascas
da R. ferruginea. O AMB foi administrado via i.p. (6 a 60 mg/kg) e
apresentou redução na nocicepção induzida pela formalina na primeira fase e
na segunda fase apenas as concentrações de 30 e 60 mg/kg. Na administração
87
v.o (150-500 mg/kg), o AMB foi efetivo no modelo de ácido acético. O AMB
nas doses de 30 e 60 mg/kg apresentou uma potente ação na redução do
edema de pata causado pela formalina.
A figura 25 apresenta os resultados da avaliação in vivo da atividade
anti-inflamatória oral das MP (lotes 2 e 4) contendo extrato mole de R.
ferruginea. Como a dose de 150 mg/kg do extrato mole de R. ferruginea
apresentou atividade significativa para a dor inflamatória, esta dose foi
escolhida para a análise das MP.
Figura 25. Resultado da avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória oral das MP
(lote 2 e 4) contendo extrato mole de R. ferruginea (150 mg/kg v.o) em modelo de
formalina. A- Fase I (dor neurogênica), B – Fase II (dor inflamatória), C (avaliação
do edema).
Nota: Veículo: salina (controle negativo); MP2B (MP branca com propilenoglicol);
MP4B (MP branca com propilenoglicol+ RH400); MP2RF (lote 2 das MP); MP4RF
(lote 4 das MP); diclofenaco: controle positivo. Os dados foram expressos como a
média ± desvio padrão de 8 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam *** para
P < 0,0001, ** para P < 0,01, *para P < 0,05.
88
Analisando a figura 25A, pode-se perceber que a MP branca contendo
RH 400 (MP4B) demonstrou atividade na dor neurogênica similiar as MP 2
e 4, já na dor inflamatória somente a MP 4 (MP4RF) demonstrou atividade
similar à atividade da RF na mesma concentração bem como atividade na
redução do edema na dose de 150 mg/kg de RF veiculada nas MP enquanto
a RF isolada só foi ativa na dose de 300 mg/kg. A figura 25B mostrou uma
inibição na dor inflamatória de 68,15% para amostra MP 4 (MP4RF) que
contem extrato mole de R. ferruginea e os agentes de dispersão
propilenoglicol+RH400. A figura 25C representa a avaliação do edema de
pata, em que a amostra que obteve maior eficácia foi a MP 4 (MP4RF), com
53,27% de redução do edema e o diclofenaco uma redução de 88,034%.
Os sistemas microparticulados são utilizados para liberação prolongada
de fármacos, resultado este observado na Figura 25, em que o extrato de R.
ferruginea apresentou efeito farmacológico no modelo de formalina superior
aos resultados obtidos com as MP de quitosana contendo R. ferruginea, pois
este modelo farmacológico é utilizado para liberação convencional de
fármacos e conforme os resultados encontrados no perfil de dissolução das
MP após 24 h, apenas 20% do teor dos marcadores AMA e AMB haviam
sido liberados, com exceção da amostra 2 (MP2RF) a qual liberou 100% em
24 h porém não apresentou inibição na dor inflamatória enquanto que a
amostra 4 (MP4RF) inibiu (59,13%) e apresentou um perfil de liberação de
menos de 20% após 24 h, caracterizando que o sistema da amostra 4
(MP4RF) é mais efetivo para liberação prolongada de fármacos.
4 Conclusões
Micropartículas de quitosana contendo extrato de R. ferruginea foram
desenvolvidas por spray drying empregando um planejamento fatorial com
análise dos fatores proporção extrato: polímero, tipo de agente dispersante
(propilenoglicol e tensoativo polietoxilado RH400). Foi observado que a
presença do tensoativo não iônico polietoxilado RH400 como agente
dispersante teve influência significativa no rendimento e morfologia das
micropartículas, resultando em microesferas com superfície lisa. O aumento
da proporção de extrato aumentou o teor, principalmente na presença de
propilenoglicol 0,5%, embora tenha se observado a influência deste fator
sobre o teor de encapsulação, os resultados não apresentaram diferença
89
significativa. Quanto maior a proporção de extrato maior foi a velocidade de
dissolução, efeito este pertinente com a eficiência da matriz em prolongar a
liberação com menor proporção de extrato. Micropartículas preparadas com
propilenoglicol apresentaram maior bioadesão quando comparadas com as
micropartículas preparadas com RH400. As micropartículas contendo extrato
das cascas de R. ferruginea apresentaram atividade anti-inflamatória oral em
modelo de formalina in vivo na dose de 150 mg/kg inferior ao valor obtido
no extrato das cascas de R. ferruginea,. tanto para a inibição da dor
inflamatória quanto para a redução do edema. Por ser o modelo de edema de
pata um método agudo de tratamento e as MP promoverem a liberação
prolongada do extrato, a atividade encontrada no estudo pode estar
relacionada com a velocidade de liberação a partir dos sistemas. Por isto,
sugere-se a avaliação da atividade farmacológica dos sistemas usando um
modelo de dor e inflamação com tratamento subcrônico ou crônico.
A incorporação do extrato das cascas de R. ferruginea em microesferas
de quitosana por spray-drying mostrou-se viável e uma alternativa
farmacêutica para administração do extrato pela via oral colaborando para o
desenvolvimento de um novo medicamento fitoterápico com potencial
atividade anti-inflamatória e analgésica a partir de uma espécie vegetal da
biodiversidade brasileira.
90
91
CAPÍTULO IV
Incorporação de micropartículas de quitosana contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea em hidrogeis e
avaliação da atividade anti-inflamatória tópica
92
93
Incorporação de micropartículas de quitosana contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea em hidrogéis e
avaliação da atividade anti-inflamatória tópica
Roseni Bortolon Grassi De Carli; Márcia Maria de Souza; Angela Malheiros;
Ruth Meri Lucinda-Silva
1 Introdução A busca por novos fármacos e sistemas de liberação como estratégias
para o tratamento de doenças constitui um desafio constante no âmbito
farmacêutico. A eficácia do fármaco em exercer a atividade biológica com
baixa toxicidade é dependente da plataforma tecnológica desenvolvida. As
características mais importantes destes sistemas carreadores são a capacidade
de proteger o fármaco, possuir cinética de liberação compatível com a via de
administração, ser de fácil obtenção e preço acessível. Tais sistemas devem
ser constituídos por biomateriais biocompatíveis, biodegradáveis, estáveis
quimicamente e economicamente viáveis (ZORZI et al., 2017).
Polímeros naturais, semisintéticos e sintéticos têm sido utilizados como
excipientes para a formulação de cosméticos e medicamentos de liberação
convencional e modificada. Atuam como moduladores e direcionadores da
liberação de fármacos em sítios específicos no organismo. Polímeros
biodegradáveis, bioadesivos, biomiméticos e hidrogéis responsivos têm sido
incluídos em formulações farmacêuticas.
Os hidrogéis são redes tridimensionais de polímeros que intumescem
em meio aquoso ou nos fluidos biológicos retendo grandes quantidades de
água na sua estrutura. Esta propriedade de absorção de fluidos é atribuída às
características hidrofílicas do polímero. O alto teor de água e baixa tensão
superficial são alguns dos fatores que proporcionam biocompatibilidade a
estes sistemas (WING-FU; ZEN-DAN, 2016). Vários polímeros hidrofílicos
são utilizados na obtenção de hidrogéis, como a metilcelulose,
carboximetilcelulose sódica, hidroxietilcelulose, alginato de sódio, quitosana
(QS) e carbômero (BRANGEL, 2011; HIRATA; BRUSCHI, 2010;
VILLANOVA; ORÉFICE, 2010).
A Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) é uma espécie vegetal com
potencial aplicação como fonte de fitoderivados para uso terapêutico. É uma
árvore encontrada em vários estados brasileiros e também em outros países
94
como Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (BACCARIN et al.,
2014; COSTA, 2011). O extrato bruto das cascas de R. ferruginea e o
composto majoritário ácido mirsinoico B (AMB), apresentaram atividade
antinociceptiva, anti-hiperalgésica e e anti-inflamatória em estudos pré-
clínicos (BACCARIN et al., 2016; DAL MAS et al., 2016; GALVAN, 2007;
HESS et al., 2010). Estudos de pré-formulação do AMB demonstraram que
este composto, assim como o extrato das cascas, possui baixa solubilidade
em meio aquoso, sendo classificado como praticamente insolúvel em água (<
0,50 mg/mL). Além disso, os compostos ácidos mirsinoico A (AMA) e B
(AMB) possuem valor de log de P de 3,30 e 3,22, respectivamente, sendo
semelhante aos valores encontrados para fármacos anti-inflamatórios como
indometacina e naproxeno (ZERMIANI et al., 2016).
Buscando o desenvolvimento de sistema de liberação para
administração tópica do extrato das cascas de R. ferruginea, foram obtidos
creme convencional e nanoemulsão contendo de 0,13 a 0,5% de extrato. A
atividade anti-inflamatória foi maior quando o extrato foi incorporado em
nanoemulsão O/A (DAL MAS et al., 2016). Os autores observaram um
aumento de aproximadamente 160% na atividade anti-inflamatória em
modelo de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton quando comparado
ao creme. Tais resultados demonstraram que a incorporação do extrato de R.
ferruginea em um sistema nanoemulsionado pode ter promovido o aumento
da eficácia devido ao aumento da solubilidade dos compostos ativos do
extrato.
Para a incorporação do extrato mole de R. ferruginea em hidrogeis,
foram preparados pelo método de spray drying oito lotes de micropartículas
de quitosana contendo extrato mole de R. ferruginea. Entre os lotes
desenvolvidos o lote 4 que continha a proporção de RF:QS 1:10 e agentes de
dispersão propilenoglicol (0,75%) e RH 400 (0,5% ) foi o que se apresentou
mais adequado para incorporação nos géis hidrofílicos, pois apresentou um
rendimento de 58,43%, tamanho de partícula de 1,215±0,622 µm, eficiência
de encapsulação para o AMA e AMB de 62,14± 11,74 e 73,94 ±13,33 %,
respectivamente e teor de encapsulação de 0,08±0,02 e 0,15±0,03 para o
AMA e AMB, respectivamente, apresentando uma relação de 1:1,88
AMA:AMB e no extrato a relação era de 1:1,5 AMA e AMB.
Portanto, visando a obtenção de um sistema de liberação transdérmica
para administração do extrato das cascas de R. ferruginea com maior
biocompatibilidade do que os sistemas emulsionados e que promova o
95
aumento de solubilidade do extrato em meio aquoso, no presente estudo o
extrato foi primeiramente particionado em uma matriz polimérica
microparticulada de quitosana e, posteriormente, as micropartículas foram
dispersas no hidrogel. Os sistemas foram caracterizados demonstrando a
estabilidade das micropartículas no meio hidrofílico e o aumento da resposta
anti-inflamatória tópica foi observada em modelo farmacológico in vivo.
2 Material e Métodos
2.1 Material
Alginato de sódio foi adquirido da Isofar® (Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
Brasil); carbômero 940 foi adqurido da Dinâmica® (Diadema, São Paulo,
Brasil); hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica, goma
xantana e hidroxietilcelulose foram adquirido da All Chemistry (São Paulo,
São Paulo, Brasil); Aristoflex AVC® e Phenonip® (metilparabeno 14,5 -
16,5%, etilparabeno 3,5 - 4,5%, propilparabeno 1,5 - 2,5%, isobutilparabeno
1,5 - 2,5%, butilparabeno 3,5 - 4,5% e fenoxietanol 70 - 75%) foram
adquiridos da Clariant (Muttenz, Suíça); trietanolamina foi adquirida da
Ativa Química (Diadema, São Paulo, Brasil); quitosana (QS), com peso
molecular médio, viscosidade de 200-800 mPa.s (dispersão a 1% em ácido
acético 1%, a 25 ºC) e grau de desacetilação de 72,45% foi adquirida da
Aldrich® (Sto Louis, Missouri, USA); Ultramona® RH400 foi adquirido da
Oxiteno (São Paulo, São Paulo, Brasil) e propilenoglicol foi adquirido da
Biotec®(São Paulo, São Paulo, Brasil).
2.1.1 Material vegetal
As cascas do caule de Rapanea ferruginea foram coletadas em
Blumenau-SC. A autenticidade botânica foi verificada através da comparação
entre a exsicata da planta coletada com o exemplar depositado no Herbário
Barbosa Rodrigues (Itajaí-SC) sob o código HBR 52715.
O extrato das cascas de Rapanea ferruginea (RF), foi obtido a partir da
solução extrativa usando método de maceração dinâmica, conforme descrito
no item 2.2 do capitulo III (p. 42). O extrato usado no presente estudo possui
teor de AMA e AMB de 60,73 e 91,9 mg/g de resíduo seco, representando
uma relação de 1:1,5 AMA:AMB, aproximadamente.
96
2.2 Obtenção das micropartículas contendo Rapanea ferruginea usando
spray drying
As micropartículas (MP) foram preparadas conforme metodologia
descrita no item 2.4 do capítulo III (p. 46). Descrevendo resumidamente a
preparação das MP do lote 4, o extrato mole de RF na concentração de 0,05%
(RF:QS 1:10) foi dissolvido nos agentes dispersantes (propilenoglicol 0,75%
e Ultramona RH 400 0,5%) e incorporado na solução de QS 0,5% (solução
diluída de ácido acético pH 4,0). Após obtenção das dispersões, as amostras
foram secas em spray dryer (Buchi® B290), com pressão de ar de 6 mBar,
fluxo do ar comprimido de 473 NL.h-1, temperatura de entrada 150 ºC, taxa
de aspiração de 90% e fluxo de alimentação em 4,0 mL/min, em sistema
aberto. Após a secagem, as amostras foram acondicionadas em frascos bem
fechados e mantidas em dessecador.
As MP foram caracterizadas quanto ao tamanho, morfologia e teor dos
marcadores químicos do extrato AMA e AMB por CLAE, conforme
procedimentos descritos no item 2.5 do capítulo III (p. 47).
2.3 Desenvolvimento dos hidrogéis
No desenvolvimento dos hidrogéis foi realizado um estudo preliminar
de incorporação das MP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea
em diferentes polímeros dispersos em meio aquoso. Para este estudo foram
usados os polímeros aniônicos co-polímero do ácido sulfônico
acriloildimetiltaurato e vinilpirrolidona neutralizado (Aristoflex® AVC);
carboximentilcelulose sódica (CMC-Na); carbômero 940 (Carbopol® 940);
goma xantana e alginato de sódio; e os polímeros não iônicos
hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e hidroxietilcelulose (HEC, Natrosol®).
As concentrações utilizadas dos polímeros estão descritas no Quadro 1.
Na formulação dos hidrogéis foi utilizado o Phenonip® a 0,5% como
conservante e o propilenoglicol 5,0% como umectante em água purificada.
Foram preparados 100 g de cada hidrogel pelo método a frio que consiste em
colocar água em um bequer, acrescentar o polímero e deixar repouso por 12
h para intumescimento e homogeneizar. A dispersão de carbômero 940 foi
neutralizada com solução de trietanolamina 50% para pH 6,0.
97
Quadro 1. Concentração dos polímeros usada no estudo de incorporação de
MP de quitosana contendo extrato das cascas de Rapanea ferruginea em
hidrogéis.
Polímeros Concentração (%)
Hidroxipropilmetilcelulose 3,0
Aristoflex® 2,5
Carboximetilcelulose Na 5,0
Carbômero 940 2,0
Goma xantana 2,5
Alginato de sódio 8,0
Hidroxietilcelulose 2,0
As MP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea foram
levigadas com propilenoglicol e incorporadas nos hidrogéis nas
concentrações de 0,1 e 0,2% (m/m de teor de extrato). A seleção dos
polímeros foi realizada após análise dos aspectos visuais (cor e
homogeneidade) e análise microscópica da dispersão das MP na base
gelificada usando microscópio óptico (Leica® SME).
2.4 Caracterização dos hidrogéis
Na caracterização dos hidrogéis foram analisados os aspectos visuais,
estabilidade física, pH, morfologia por microscopia óptica e eletrônica de
varredura (MEV), comportamento reológico e propriedades mecânicas.
2.4.1 Aspecto visual e estabilidade física
Os hidrogéis foram analisados após 24 h de preparo quanto aos aspectos
visuais de cor e homogeneidade.
A estabilidade física foi avaliada após centrifugação (Microcentrífuga
Fanem® - 243) das amostras em frasco tipo eppendorf por 30 min a 3000 rpm
(ANVISA, 2004). Esta análise foi realizada nos tempos 24 h e 15 dias e em
triplicata.
2.4.2 Determinação do pH
A determinação do pH das amostras foi realizada pela análise
potenciométrica direta usando potenciômetro (AJ micronal® - AJX-512)
98
previamente calibrado com soluções tampão (pH 6,0 e 7,0). Esta análise foi
realizada nos tempos 24 h e 15 dias e em triplicata.
2.4.3 Características microscópicas
Os hidrogéis foram analisados quanto ao aspecto microscópico nos
tempos 24 h e 15 dias, usando microscópio óptico. As amostras foram
depositadas sobre lâmina de vidro e cobertas com lamínula de vidro. Foram
observadas características como homogeneidade de dispersão das MP,
morfologia e integridade das MP.
2.4.4 Morfologia por MEV
Para a análise da morfologia, os hidrogeis foram dessecados por
liofilização após prévio congelamento. O filme seco foi analisado em
microscópio eletrônico de varredura (Philips, XL 30®). Para a análise, as
amostras foram depositadas sobre uma fita dupla face em suporte metálico e
posteriormente recobertas com ouro coloidal.
2.4.5 Comportamento reológico
A análise reológica dos hidrogéis com e sem extrato das cascas de R.
ferruginea foi realizada através do viscosímetro rotacional tipo cone-placa
(Haake® K-10) a 25 °C. As amostras foram analisadas em três etapas: rotação
de 0-80 1/s; rotação constante de 80 1/s e rotação de 80-0 1/s, retornando ao
ponto estático. Em todas as etapas o tempo de análise foi de 180 segundos e
foram coletados 100 pontos. Para análise das amostras fez-se uso do software
HAAKE Rheowin 4 Data Manager 4.30.0013 e para a coleta e análise dos
dados o software HAAKE Rhewin 4 Job Manager 4.30.0013 (DAL MAS,
2015).
2.4.6 Propriedades Mecânicas
As propriedades mecânicas das amostras com e sem extrato foram
determinadas em analisador de textura usando modo de análise de perfil de
textura (TPA- texture profile analysis). Aproximadamente 10 g de cada
amostra foi transferida para béquer de 25 mL. Em modo TPA, o probe de 10
mm de diâmetro foi forçado a penetrar 10 mm na amostra a uma velocidade
de 1 mm/s com um intervalo de 20 s entre a primeira e a segunda etapa. O
ensaio foi realizado a temperatura de 25 ± 2 °C, em triplicata. A partir do
gráfico de força versus distância e força versus tempo, os parâmetros de
99
dureza, compressibilidade, adesividade, elasticidade e coesividade foram
calculadas com auxílio do software Texture® exponente Lite versão 5.0.9.0
(BRUSCHI et al., 2007; MULLER, 2013).
2.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo
Para avaliar a atividade anti-inflamatória tópica in vivo dos hidrogéis
contendo MP de R. ferruginea foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido pelo óleo de cróton. Os ensaios foram realizados com a colaboração
da Profª. Drª. Márcia Maria de Souza e do Prof. Dr. José Roberto Santin.
2.5.1 Animais
Antes dos experimentos os animais foram mantidos durante três dias para
ambientação no biotério do laboratório de farmacologia (sala 209, bloco F6)
em caixas de polipropileno de 41 cm x 34 cm com no máximo 10 animais.
Nas caixas-moradia, no período de adaptação que antecede aos testes, foi
acrescentado enriquecimento ambiental com intuito de diminuir o estresse. A
maravalha foi trocada a cada 2 dias e tinham ração e água ad libitum. As salas
foram mantidas com controle de temperatura (22-25 oC), umidade constante
(60%) e em ciclos controlados claro/escuro de 12 h cada, conforme
procedimento do laboratório. No dia do teste, os animais foram levados para
a sala de teste para adaptação por um período de 1 h, antes do início dos
mesmos.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios
éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O projeto foi aprovado
pelo CEUA/UNIVALI (parecer nº 020/16p), conforme Anexo A.
2.5.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória pelo modelo de edema de
orelha
O modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton foi utilizado
para avaliar a influência da microencapsulação na resposta anti-inflamatória
tópica do extrato. O experimento foi realizado de acordo com a metodologia
descrita por Calixto et al. (1991), Otuki et al. (2005) e De Carli et al. (2009).
Antes de iniciar o experimento os animais foram anestesiados com
ketamina (80-100 mg/kg, i. p.) e xilazina (10-12,5 mg/kg, i. p.). A orelha
direita dos animais foi medida com o auxílio de um micrômetro digital
100
(medida basal). A cada grupo de oito animais, foi aplicado na superfície
interna da orelha direita o tratamento previsto para cada grupo:
- propilenoglicol (G1-controle negativo);
- gel de alginato de sódio sem MP (G2- gel de alginato branco);
- gel de carbômero 940 sem MP (G3- gel de carbômero 940 branco);
- gel de alginato de sódio contendo MP 0,2% (G4);
- gel de carbômero 940 contendo MP 0,2% (G5) e
- creme de dexametasona 0,1 % (m/m) (G6-controle positivo).
Após 30 min da aplicação dos respectivos tratamentos, foi aplicado na
superfície externa da orelha direita o óleo de cróton 2,5% (v/v) dissolvido em
acetona (agente irritante). Quatro horas após a aplicação do óleo de cróton,
as orelhas foram medidas novamente e o edema de orelha foi avaliado através
da diferença entre a medida basal e a medida realizada após aplicação do óleo
de cróton. A medida do edema foi expressa em Δ edema (µm).
2.5.3 Análise estatística dos dados
Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA),
seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de
Dunnett, empregando os softwares Instat e GraphPad Prisma versão 4.0. Os
resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média para
cada grupo de experimentos. Os valores de p<0,05 foram considerados
indicativos de significância.
3 Resultados e discussão
Para o desenvolvimento dos hidrogéis foram utilizadas as MP de QS
contendo extrato de R. ferruginea do lote 4, conforme descrito no item 2.4 do
capítulo III (p. 46). Esta composição de MP foi selecionada por conter como
agentes dispersantes propilenoglicol e RH 400 com rendimento de 58,43%,
perfil de dissolução do extrato de RF do tipo prolongado e ter apresentado
maior efeito anti-inflamatório no modelo de formalina descrito no item 3.6
do capitulo III (p. 94).
As MP apresentaram forma esférica, superfície lisa com algumas
deformações (Fig. 6, Cap. III, p.64 ) e diâmetro de 1,215 ± 0,622 µm (Tab. 2,
Cap. III, p.60 )
101
As MP de QS apresentaram teor de encapsulação de 0,08 ± 0,02% e
0,15 ± 0,03% de AMA e AMB, respectivamente, que representa um teor
extrato de 2,05 ± 0,37% expresso em AMB. A eficiência de encapsulação foi
de 62,14 ± 11,74% para o AMA e para o AMB de 73,94 ± 13,33%, conforme
resultados apresentados na Tab. 3 (Cap. III, p. 64).
A relação de teor de AMA e AMB foi de 1:1,80, demonstrando uma
perda maior do AMA durante o processo de secagem, pois o extrato
apresentava uma relação de 1:1,5. Comparando os dois marcadores, o AMA
apresenta-se como um óleo enquanto o AMB é um sólido cristalino
(ZERMIANI et al., 2016), o que pode ter resultado na maior redução de AMA
nas micropartículas.
3.1 Obtenção e caracterização dos hidrogéis contendo micropartículas
No presente estudo, para a seleção do agente gelificante foram testados
os polímeros Aristoflex AVC®, CMC Na, carbômero 940, goma xantana,
alginato de sódio, HPMC e HEC. Após incorporação das MP de QS, os
hidrogéis de CMC Na, carbômero, HPMC e alginato de sódio obtidos
apresentaram homogeneidade de cor e dispersão das MP. Enquanto nos géis
preparados com goma xantana, HEC e Aristoflex AVC®, as MP sofreram
aglomeração, formando precipitados. Por isto, foram descartados do estudo.
Na análise microscópica, foi observado que quando incorporadas nos
hidrogéis de CMC Na e HPMC, as MP imediatamente se desintegraram
(Figura 1), comportamento este não desejável, pois o objetivo era manter as
MP contendo o extrato disperso no hidrogel. Este comportamento não foi
observado nos hidrogéis de carbômero 940 e alginato de sódio. Nestes as MP
mantiveram-se como sistema particulado, quando visualizado em
microscópio. Estes polímeros aniônicos são descritos como agentes de
formação de complexos poli-iônicos com a QS, capazes de reticular as MP e
não permitir a desintegração destas no meio aquoso.
102
Figura 1- Aspecto microscópico das MP de quitosana contendo extrato das cascas de
R. ferruginea incorporadas em hidrogéis: A- gel de carboximetilcelulose sódica; B-
gel de hidroxipropilmetilcelulose; C- gel de carbômero 940; D- gel de alginato de
sódio; E- gel de carbômero 940 sem micropartículas; F- gel de alginato de sódio sem
micropartículas. Aumento de 40x.
A B
C D
E F
Após centrifugação, os géis de carbômero 940 e alginato de sódio, com
e sem MP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea, permaneceram
sem segregação das partículas durante o período analisado (15 dias).
Os géis de carbômero sem e com MP de QS apresentaram valores de
pH de 4,32 ± 0,02 e 4,44 ± 0,02, respectivamente. Enquanto os géis de
alginato de sódio apresentaram alteração do valor de pH com a adição das
MP, sendo de 5,33 ± 0,03 para o branco e de 7,35 ± 0,02 e 7,60 ± 0,03 para
103
os hidrogéis contendo 0,1 e 0,2% de extrato incorporado nas MP,
respectivamente. Nenhuma amostra apresentou alterações dos valores de pH
após 15 dias de armazenamento. A morfologia das MP de QS contendo
extrato de R. ferruginea incorporadas nos hidrogéis de alginato de sódio 8,0%
e carbômero 940 2,0% foi analisada por MEV e as fotomicrografias são
apresentadas nas figuras 2 e 4.
O hidrogel de alginato de sódio sem MP, após secagem por liofilização,
resultou em um filme liso e levemente poroso, como consequência da
estrutura reticulada do hidrogel. Enquanto, os hidrogéis contendo 0,2% de
MP de quitosana resultaram em uma estrutura de superfície rugosa. Quando
analisado em maior aumento (5000 e 10000x) foi observada a presença das
MP de QS com forma bem delimitada e esférica, embora recoberta com a
matriz polimérica do hidrogel no qual foram dispersas. Conforme
apresentado na figura 6 (capítulo III, p.59), as MP de QS contendo extrato
das cascas de R. ferruginea e propilenoglicol e óleo de rícino polietoxilado
como agentes dispersores, apresentaram forma esférica e superfície lisa.
Portanto, a superfície rugosa observada após incorporação das MP no
hidrogel está relacionada com a presença do polímero gelificante. Estes
resultados mostram que o hidrogel de alginato é um veículo carreador
adequado para as MP de QS contendo extrato, pois mantém a característica
microparticulada do sistema e, consequentemente, permite dispersar o extrato
de R. ferruginea, que possui caráter lipofílico, em um veículo hidrofílico.
104
Figura 2 - Fotomomicrogafias dos hidrogéis de alginato de sódio 8,0%, após
liofilização. 1- branco; 2 - com 0,2% de extrato microencapsulado. Aumento de: A – 1000x; B – 5000x e C - 10000x.
O alginato de sódio (AL) é um co-polímero extraído de algas marrons e
constituído por uma cadeia polimérica formada por unidades de ácido β-D-
manurônico e ácido α-L-gulurônico com ligação1-4. Este copolímero
1A
1B
1C
2A
2B
2C
105
possui grupos carboxílicos sendo classificado como um polímero
mucoadesivo aniônico (KUMBHAR; PAWAR, 2017).
Figura 3 – Esquema da estrutura das MP de QS contendo o extrato das cascas de R.
ferruginea e a reticulação destas quando incorporadas no hidrogel de alginato de sódio.
A QS, como polieletrólito catiônico formado por unidades (1→4)-β-N-
acetil-D-glucosamina e D-glucosamina, é usada na obtenção de complexo
106
polieletrolítico com polímeros aniônicos como o AL (OLIVEIRA, 2016; YU
et al., 2009). Conforme esquematizado na Figura 3, as MP de QS em meio
aquoso podem apresentar superfície carregada catiônicamente, pois sendo o
pKa da quitosana de 6,2 (Dash et al., 2011) e o hidrogel de AL possuir um
valor de pH de 5,3, a incorporação das MP no hidrogel resultou na reticulação
das MP pela formação do complexo polieletrolítico QS:AL, proporcionando
a manutenção da estrutura das MP mesmo em meio aquoso. A complexação
da QS com AL reduz a porosidade dos géis e diminui a perda do fármaco
encapsulado, pois a solubilidade da QS é reduzida pela reticulação com o
alginato.
Complexos polieltrolíticos de QS-AL têm sido aplicados no
desenvolvimento de diferentes sistemas de liberação, como beads
(LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010), MP (LEE et al.,
2009), scaffold (HO et al., 2009) e esponja (LIN; YEH, 2003). A estrutura e
o rendimento da formação do complexo dependem da proporção dos
biopolímeros. Geralmente são empregadas concentrações menores que 3%
de AL e QS (KUMBHAR; PAWAR, 2017). No presente estudo foi
empregada a dispersão de AL a 8% a fim de obter um produto
semissólido.
O comportamento físico das MP incorporadas no hidrogel de carbômero
(Figura 4) foi semelhante ao observado para o AL.
O hidrogel de carbômero sem MP apresentou superfície lisa e compacta,
enquanto a incorporação das MP de QS resultou em uma estrutura com
superfície irregular. Quando analisada em maior aumento foi observada na
estrutura do hidrogel de carbômero a presença de estrutura esférica e MP,
correspondendo à presença das MP de QS contendo o extrato de R.
ferruginea.
O carbômero, comercialmente chamado de Carbopol, é um polímero
sintético formado por unidades de ácido acrílico. São polímeros com alta
massa molecular reticulados com alil sacarose ou alil éter de pentaeritritol e
contendo de 52 a 68% de grupo carboxílico calculado em base seca (ROWE;
SHESKEY; QUINN, 2009). A estrutura química deste polímero permite a
obtenção de complexo polieletrolítico com a QS, como apresentado na Figura
5. A interação entre os dois polímeros pode ocorrer por ligações iônicas entre
o íon amônio da QS (NH3+) e o íon carboxalato (COO−) do carbômero, assim
como, por pontes de hidrogênio entre o H+ da QS e a OH− do grupo
107
carboxílico do carbômero ou entre o H+ do grupo carboxílico do carbômero
e a OH- da QS (DHANUJA; SMITHA; SRIDHAR, 2005).
Figura 4 - Fotomomicrogafias dos hidrogéis de carbômero 940 2,0%, após
liofilização. 1- branco; 2 - com 0,2% de extrato microencapsulado. Aumento de: A – 1000x; B – 5000x e C - 10000x.
1A
1B
1C
2A
2B
2C
108
Figura 5 – Esquema da formação de complexo polieletrolítico quitosana:carbômero
(ácido poliacrílico).
Fonte: Adaptado de Dhanuja, Smitha e Sridhar (2005).
A formação do complexo polieletrolítico quitosana-carbômero,
conforme esquematizado na figura 5 e descrito para o hidrogel de alginato de
sódio, também proporcionou a incorporação das MP de QS no hidrogel e a
estabilização destes sistemas mesmo em meio aquoso, provavelmente pela
reticulação das superfícies das microesferas de QS quando na presença do
poliânion carbômero.
3.2 Comportamento reológico
O comportamento reológico dos hidrogéis (carbômero 940 2,0% e
alginato de sódio 8,0%) com e sem as MP contendo extrato das cascas de R.
ferruginea foi analisado usando viscosímetro rotacional. Os resultados estão
apresentados na tabela 1.
As amostras de géis de alginato de sódio 8,0% sem MP (branco)
apresentaram uma viscosidade de 3,71 ± 0,31 Pa.s e foi observado que a
incorporação e o aumento progressivo das MP de 0,1 para 0,2% houve um
aumento da viscosidade de 4,86 ± 0,12 para 6,29 ± 0,07 Pa.s,
109
respectivamente, mostrando que a viscosidade do gel é alterada pela
incorporação das MP e dependente da concentração das mesmas. Os
hidrogéis de carbômero 940 2,0% apresentaram comportamento semelhante.
Tabela 1 – Resultados da analise reológica de hidrogéis (carbômero 940 2,0% e
alginato de sódio 8,0%) com e sem micropartículas (MP) de quitosana contendo
extrato das cascas de R. ferruginea nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo ao
extrato.
Amostras Viscosidade
(mPa.s)
Tixotropia
(mPa.s) n
Alginato (branco) 3,71 ± 0,31 1175,5 ± 159,5 0,58± 0,01
Alginato (MP 0,1%) 4,86 ± 0,12 976,75 ± 5,95 0,58 ± 0,01
Alginato (MP 0,2%) 6,29 ± 0,07 982,45 ± 0,25 0,60 ± 0,01
Carbômero (branco) 8,20 ± 0,55 1090,5 ± 4,5 0,16 ± 0,01
Carbômero (MP 0,1%) 10,53 ± 0,50 7763,5 ± 1588,5 0,18 ± 0,00
Carbômero (MP 0,2%) 13,07 ± 0,76 15550 ± 3100 0,13 ± 0,02
Os hidrogéis de alginato de sódio e de carbômero apresentaram
comportamento reológico semelhante. As curvas de fluxo (tensão de
cisalhamento versus gradiente de cisalhamento) mostram o aumento da
resistência ao fluxo com a incorporação das MP nos sistemas, conforme
figuras 6 e 7. Porém, com o aumento do gradiente de cisalhamento, a
viscosidade dos sistemas foi reduzida.
Analisando as curvas de fluxo, os valores de viscosidade média e os
valores calculados de tixotropia, pode-se observar que os hidrogéis
apresentaram um perfil reológico do tipo não-Newtoniano, pseudoplástico e
com tixotropia, pois apresentaram uma redução da viscosidade com o
aumento do gradiente de cisalhamento, comportamento este que é
característico de materiais pseudoplástico.
110
Figura 6 – Perfil reológico, expresso em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade
(B) frente ao gradiente de cisalhamento, dos hidrogéis de alginato de sódio 8,0% com
e sem micropartículas (MP) de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea
nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo ao extrato.
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100
τP
a
ϔ (1/s)
Alginato BrancoAlginato 0,1%Alginato 0,2%
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100
ηP
a.s
ϔ (1/s)
Alginato Branco
Alginato 0,1%
Alginato 0,2%
A
B
111
Figura 7 – Perfil reológico, expresso em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade
(B) frente ao gradiente de cisalhamento, dos hidrogéis de carbômero 940 2,0% com e
sem micropartículas (MP) de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea
nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo ao extrato.
Conforme apresentado na tabela 1, o índice de comportamento de fluxo
(n) foi inferior a 1,0, confirmando que as amostras apresentam um
comportamento reológico não-Newtoniano e pseudoplástico. O valor de n foi
calculado pela equação da lei de potência e, valores de n < 1,0 são
característicos de materiais pseudoplásticos e valores de n > 1,0 são
apresentados por materiais com comportamento de fluxo dilatantes.
Em estudos conduzidos por Hirata e Bruschi (2010) utilizando hidrogéis
de carbopol 934 contendo extrato etanólico de própolis, foi observado
comportamento pseudoplástico e tixotrópico, sendo semelhante aos
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 20 40 60 80
τP
a
ϔ (1/s
Carbômero BrancoCarbômero 0,1%Carbômero 0,2%
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 20 40 60 80 100
ηP
a.s
ϔ (1/s)
Carbômero BrancoCarbômero 0,1%Carbômero 0,2%
A
B
112
resultados obtidos neste estudo. Os autores também observaram que a
viscosidade média foi dependente da concentração do carbopol 934.
3.3 Propriedades Mecânicas
A análise de perfil de textura (TPA) foi realizada buscando determinar
as propriedades de textura dos hidrogéis. Durante a análise as amostras são
comprimidas duas vezes usando um analisador de textura para fornecer
informações sobre como as amostras se comportam quando aplicadas na pele.
As amostras foram analisadas quanto às características de firmeza,
adesividade, gomosidade, espalhabilidade, coesividade e resiliência.
Observando os parâmetros avaliados durante a análise de textura, os
hidrogéis de carbômero 940 apresentaram maior firmeza quando comparados
aos hidrogéis de alginato de sódio e, em ambos os hidrogéis, foi observado o
aumento da firmeza com o aumento da concentração das MP. Estes resultados
confirmam o comportamento encontrado na análise reológica, em que a
incorporação das MP de QS aumentou a resistência da estrutura do hidrogel.
Conforme discutido acima, a provável interação eletrolítica entre a QS e os
hidrogéis polianiônicos resultou no aumento da firmeza e, embora, as MP
possam intumescer em meio aquoso, esta reticulação permitiu manter estas
como unidades multiparticuladas no sistema hidrofílico. Estes dois fatores
devem ter colaborado para o aumento da viscosidade e da firmeza com o
aumento da concentração de MP nos hidrogéis.
A adesividade do hidrogel de alginato de sódio foi proporcional ao
aumento da concentração de MP. Este comportamento não foi observado no
hidrogel de carbômero 940, em que a ausência de MP apresentou maior
adesividade, quando incorporado 0,1% de MP houve uma redução da mesma e
com a adição de 0,2% de MP a adesividade aumentou, porém o valor foi menor
do que a adesividade do hidrogel sem MP.
A quantidade de grupos carboxílicos livres presentes nas cadeias dos
carbômeros está diretamente relacionada à propriedade de mucoadesão deste
polímero. Neste hidrogel a neutralização é importante, pois a neutralização
resulta na linearização do polímero e, consequentemente no aumento da
densidade de carga do polímero. Sabe-se que a natureza expandida da rede do
polímero contribui grandemente para o mucoadesividade (PEREIRA et al.,
2013). A redução da adesividade do hidrogel de carbômero com a incorporação
das MP pode estar relacionada com a interação polieletrolítica dos grupos
carboxílico com a QS, bem como, com a ruptura da estrutura polimérica
provocada pela presença das MP de QS contendo o extrato das cascas de R.
ferruginea.
113
A adesividade pode ser um indicativo de pegajosidade, e o gel da
alginato apresentou um valor maior quando comparado ao gel de carbômero
940. O mesmo comportamento observado na adesividade do hidrogel de
carbômero 940 foi percebido na coesividade dos hidrogéis. Em ambos os
hidrogéis houve uma redução da resiliência com a incorporação e aumento da
concentração das MP.
A espalhabilidade do hidrogel de alginato diminuiu com o aumentou na
concentração das MP, enquanto o hidrogel de carbômero 940 percebeu-se um
comportamento oposto, ou seja, com a adição das MP a espalhabilidade
demonstrou um pequeno aumento com a adição da maior concentração de
MP.
114
Tabela 2 – Resultados da análise das propriedades de textura do hidrogéis de carbômero 940 2,0% e alginato de sódio 8,0%
com e sem micropartículas de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo
ao extrato. (lote 4) nas concentrações de 0,1 e 0,2%, usando modo TPA em analisador de textura.
Amostras Firmeza (g) Adesividade (g.s) Espalhabilidade Coesividade Resiliência
Alginato
(branco) 486,98 ± 6,36 - 2466,82 ± 241,78 0,767 ± 0,03 0,957 ± 0,05 0,238 ± 0,12
Alginato
(MP 0,1%) 538,94 ± 34,17 - 3033,23 ± 101,48 0,709 ± 0,02 0,901 ± 0,01 0,067 ± 0,00
Alginato
(MP 0,2%) 677,79 ± 37,45 - 4542,78 ± 116, 27 0,608 ± 0,02 0,924 ± 0,01 0,052 ± 0,00
Carbômero
(branco) 3368,05 ± 94,36 - 42689,7 ± 4300,99 0,514 ± 0,03 0,917 ± 0,08 0,097 ± 0,01
Carbômero
(MP 0,1%) 5280,82 ± 361,14 - 21197, 2 ± 297, 04 0,516 ± 0,03 0,896 ± 0,02 0,093 ± 0,00
Carbômero
(MP 0,2%)
6475,75 ± 230,17
- 29080,7 ±2446, 65 0,532 ± 0,00 0,941 ± 0,02 0,082 ± 0,00
115
3.4 Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória tópica
Para a avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo dos
hidrogéis contendo MP com extrato das cascas de R. ferruginea foi utilizado
o modelo de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton, os resultados
estão demonstrados na Figura 8.
Figura 8 - Influência do pré-tratamento tópico com micropartículas (MP) de
quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea incorporadas em hidrogéis de
alginato de sódio e carbômero sobre o edema de orelha induzido pela administração tópica de óleo de cróton.
Nota: Naive: animais não tratados; Veículo: salina (controle negativo); MP:
micropartículas de quitosana na dose correspondente a 0,2% de extrato das
cascas de R. ferruginea; Dexametasona 0,1% (controle positivo). Os dados
foram expressos como a média ± desvio padrão de 8 animais em cada grupo. Os
asteriscos indicam a comparação com o grupo naive: *** para p < 0,0001, **
para p < 0,01, *para p < 0,05 e os sustenidos indicam a comparação com o grupo
veículo (controle negativo): ### p < 0,0001, ## para p < 0,01.
O resultado apresentado na Figura 8 indicou que houve redução do
edema induzido pelo óleo de cróton nos hidrogéis contendo 0,2% de MP de
116
R. ferruginea (lote 4) quando comparadas com o naive (animais não tratados)
e com a salina (controle negativo). O extrato incorporado nas MP de QS e
veiculado a 0,2% no hidrogel de carbômero apresentou redução do edema de
76,80% e quando veiculadas no hidrogel de alginato de sódio inibiu o edema
em 83,67%. O potencial de inibição foi comparável ao creme de
dexametasona 0,1%, que é um medicamento usado na clínica para tratamento
de processos inflamatórios tópicos.
Os resultados evidenciaram que a estratégia tecnológica desenvolvida
resultou em um produto com alto potencial anti-inflamatório tópico.
Em estudos desenvolvidos por Dal Mas et al. (2016), o extrato das
cascas de R. ferruginea foi incorporado em creme convencional nas
concentrações de 0,13, 0,25 e 0,5% e em nanoemulsão nas concentrações de
0,13 e 0,25%. Para o creme convencional, as três concentrações apresentaram
resposta semelhante sendo a maior inibição do edema obtida com a
concentração de 0,5% (64,65%). A concentração de 0,25% inibiu 58,64%.
No presente estudo a concentração de 0,2% de MP resultou em inibição do
edema superior a 75%, mostrando que embora o produto desenvolvido seja
um hidrogel convencional, a incorporação do extrato na forma de MP
poliméricas potencializou o efeito anti-inflamatório.
Por outro lado a incorporação do extrato da R. ferruginea em
nanoemulsões mostrou uma inibição de 90,50% do edema na dose de 0,13%
(DAL MAS et al., 2016). Ambos os sistemas hidrogéis contendo MP
poliméricas elaboradas no presente trabalho e nanoemulsões (DAL MAS et
al., 2016) podem ser utilizadas para veicular o extrato mole de RF para a
inibição de processos inflamatórios tópicos. A potencialização pode estar
relacionada com o aumento da solubilidade do extrato pela maior dispersão
na matriz polimérica e, consequentemente no hidrogel, pelas propriedades
bioadesivas e de liberação modificada das micropartículas e do hidrogel. Tais
sistemas além de apresentarem a potencialização da atividade do extrato já
observada para as nanoemulsões, por serem sistemas poliméricos aquosos,
são fisicamente mais estáveis e mais biocompatíveis do que os sistemas
emulsionados.
4 Conclusões
A proposta de nosso estudo foi melhorar as características de
solubilidade do extrato das cascas da R. ferruginea, por meio da
microencapsulação em matriz de quitosana e incorporar este sistema em
hidrogéis poliméricos. Dentre os polímeros selecionados para transportar as
117
micropartículas, o alginato de sódio e o carbômero 940 mostraram ser viáveis,
mantendo as micropartículas reticuladas nos hidrogéis e permaneceram
estáveis sem separação, segregação ou sedimentação durante o período de
análise. A incorporação das micropartículas influenciou na reologia e
propriedades de textura dos hidrogéis, apresentando esta consistência e
adesividade adequadas para este tipo de produto. Ambos os sistemas
desenvolvidos potencializaram a atividade anti-inflamatória tópica do extrato
das cascas de R. ferruginea, sendo que o hidrogel de alginato resultou em
maior inibição do edema e apresentaram características adequadas para
veicular as micropartículas de quitosana contendo extrato das cascas da R.
ferruginea. Estudos posteriores devem ser realizados para verificar o perfil
de liberação do extrato dos hidrogéis, bem como, a estabilidade e segurança
da formulação.
118
119
CAPÍTULO V
Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea
120
121
Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea
Roseni Bortolon Grassi De Carli; Angela Malheiros; Ruth Meri Lucinda-
Silva
Introdução
A resposta terapêutica dos extratos vegetais geralmente é dependente de
uma mistura complexa de compostos bioativos que têm sua ação
potencializada por efeito sinérgico entre si. No entanto, a maioria dos extratos
vegetais possuem baixa solubilidade em meio aquoso e tempo de meia-vida
curto requerendo administração repetida ou dose mais elevada, tornando
esses produtos fracos candidatos a fármacos. Buscando superar esta
limitação, novos sistemas terapêuticos contendo derivados vegetais têm sido
desenvolvidos, incluindo nanopartículas poliméricas, lipossomas,
nanopartículas lipídicas sólidas, nanomeulsão, entre outras. A incorporação
de derivados vegetais em sistemas nanométricos resulta no aumento da
solubilidade e biodisponibilidade, redução de toxicidade, melhoria na
atividade farmacológica, liberação sustentada das substâncias ativas e
proteção contra degradação química e física (ANSARI; ISLAM; SAMEEM,
2012; NAMDAR et al., 2017).
A nanotecnologia tem sido utilizada em estudos com plantas medicinais
e de substâncias ativas isoladas e tem mostrado resultados promissores na
melhoria dos efeitos terapêuticos. Embora estes sistemas tenham sido
desenvolvidos para fármacos puros, alguns tipos de sistemas permitem
incorporar com alta eficiência extratos vegetais brutos, como por exemplo,
nanoemulsões (CECHETTO, 2016; TSAI; CHEN, 2016; DAL MAS et al.,
2016; XAVIER, 2015), micro e nanopartículas poliméricas (DAS et al., 2012;
HILL; TAYLOR; GOMES, 2013; RIBEIRO et al., 2013), nanopartículas
lipídicas sólidas (DA ROCHA, 2015; LACATUSU et al., 2014; NASSERI et
al., 2016), entre outros.
A quitosana é um polímero policatiônico e excepcionalmente adequado
para aplicações em sistemas de liberação de fármacos, uma vez que permite
a formação de complexos polieletrolíticos, frequentemente utilizados para o
122
desenvolvimento de nanopartículas ou retenção de fármacos dentro do
sistema por interação eletrostática (GERMERSHAUS et al., 2015).
As nanopartículas de quitosana-tripolifosfato são destinadas à
administração in vivo, pois não há nenhum resíduo nocivo que possa
comprometer a segurança do organismo. O método de geleificação
ionotrópica atende a esse requisito, uma vez que este método não requer a
adição de solventes orgânicos, evitando o problema da eliminação de resíduos
antes da administração (FABREGAS et al., 2013).
A Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) é uma árvore nativa de
países da América do Sul, incluindo o Brasil. Estudos fitoquímicos das cascas
e frutos tem relatado a identificação e o isolamento dos ácidos mirsinoicos A
(AMA), B (AMB) e C (AMC). O AMA encontra-se principalmente nos
frutos, e o AMB está em maior concentração nas cascas (GAZONI, 2009;
ZERMIANI et al., 2016). Estudos demonstraram que extratos e compostos
isolados do gênero Rapanea possuem comprovada ação anti-inflamatória
(BACCARIN et al., 2016; DAL MAS et al., 2016; HESS, 2006),
antinociceptiva (ANTONIALLI, 2009; HESS, 2006), anticolinesterásica
(FILIPPIN, 2010; GAZONI, 2009) e antioxidante (GÓES et al., 2016), entre
outras.
Estudos de pré-formulação dos ácidos AMA e AMB demonstraram que
estes compostos possuem baixa solubilidade em meio aquoso, sendo
classificados como praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL).
Embora estes compostos possuam grupamento carboxílico, que pode formar
ligações de hidrogênio, a cadeia de hidrocarbonetos longa leva a baixa
solubilidade destes compostos em meio aquoso. Os compostos AMA e AMB
possuem valor de log de P de 3,30 e 3,22, respectivamente, sendo semelhante
aos valores encontrados para fármacos anti-inflamatórios como indometacina
e naproxeno (ZERMIANI et al., 2016). A micro e nanoencapsulação de
derivados vegetais tem sido utilizada como estratégia tecnológica para
aumentar a solubilidade destes compostos, melhorando assim a
biodisponibilidade (ESFANJANI; JAFARI, 2016).
Portanto, no presente estudo foram avaliados os parâmetros de processo
e formulação que influenciam na obtenção de nanopartículas de quitosana
contendo o extrato das cascas de R. ferruginea pelo método de geleificação
ionotrópica com tripolifosfato de sódio (TPP). As nanopartículas
desenvolvidas foram caracterizadas quanto à distribuição de tamanho e
aspectos morfológicos.
123
2 Material e Métodos
2.1 Material
Ácido acético glacial PA foi adquirido da Biotec® (São Paulo, São
Paulo, Brasil), Alginato de sódio foi adquirido da Isofar® (Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, Brasil), Polissorbato 80 (Tween® 80) foi adquirido da Dinâmica®,
Propilenoglicol foi adquirido da Biotec®(São Paulo, São Paulo, Brasil),
Quitosana (QS), com peso molecular médio, viscosidade de 200-800 mPa.s
(dispersão a 1% em ácido acético 1%, a 25 ºC) e grau de desacetilação de
72,45% e o Tripolifosfato de sódio (TPP) foram adquiridos da Sigma
Aldrich® (St. Loius, Missouri, USA); Ultramona® RH400 foi adquirido da
Oxiteno (São Paulo, São Paulo, Brasil).
2.2 Material vegetal
As cascas da R. ferruginea foram coletadas em Blumenau-SC, na Rua
Belo Horizonte, bairro Glória. A autenticidade botânica foi verificada através
da comparação entre a exsicata da planta coletada com o exemplar depositado
no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí-SC) sob o código HBR 52715.
O extrato das cascas de R. ferruginea (RF), foi obtido a partir da solução
extrativa usando método de maceração dinâmica, conforme descrito no item
2.2 do capítulo III (p. 42). O extrato usado no presente estudo possui teor de
AMA e AMB de 60,73 e 91,9 mg/g de resíduo seco, representando uma
relação de 1:1,5 AMA:AMB, aproximadamente.
2.3 Seleção da matriz polimérica
Para obtenção de nanopartículas (NP) poliméricas contendo o extrato
das cascas de R. ferruginea, inicialmente foram realizados testes para seleção
do polímero e o método de obtenção. Foram testados como polímero o
alginato de sódio (AL) e a quitosana (QS), variando o agente de coacervação
e a incorporação do extrato, conforme apresentado no Quadro 1.
A solução de QS a 0,5% foi obtida usando solução aquosa de ácido
acético 0,1 M como solvente. O valor de pH foi ajustado para 4,0 usando
solução diluída de hidróxido de sódio.
O extrato mole de R. ferruginea na concentração de 0,05% foi
adicionado nas dispersões poliméricas, sob agitação (Agitador mecânico-
124
Fisatom®) a 2000 rpm por 10 min, acrescentando propilenoglicol 5,0% e
Tween® 80 0,5%, seguidos de sonicação (banho de ultrassom-Elo Sonics-
Ultrasonic®) por 60 min.
Na obtenção das partículas, a dispersão polimérica foi gotejada
manualmente com auxílio de um conta-gotas sob agitação mecânica a 2500
rpm em um intervalo de 10 min.
Quadro 1 – Composição das NP testadas nos estudos de seleção da matriz polimérica
para as NP contendo extrato das cascas de R. ferruginea.
Teste Solução gotejada Solução aceptora
1 AL 0,5% pH 4,5 (10 mL)
RF 0,05% QS 0,5% (30 mL) pH 4,0
2 AL 0,5% pH 4,5 (10 mL)
TPP 0,2% RF 0,05% QS 0,5% (30 mL) pH 4,0
3 TPP 0,1% (30 mL) QS 0,5% (20 mL) pH 4,0
RF 0,05%
4 QS 0,5% (20 mL) pH 4,0
RF 0,05% TPP 0,1% (30 mL)
5 TPP 0,1% (30 mL)
RF 0,05% QS 0,5% (20 mL) pH 4,0
Nota: AL – alginato de sódio; TPP – tripolifosfato de sódio; QS – quitosana; RF –
extrato das cascas de Rapanea ferruginea.
As NP obtidas foram avaliadas quanto ao tamanho médio e índice de
polidispersidade (PDI) por espalhamento de luz dinâmico (dynamics light
scattering – DLS) (Zeta sizer Malvern® Nano-ZS). A análise foi realizada
sem e com filtração da amostra em filtro 0,45 µm.
2.4 Obtenção e otimização das nanopartículas de QS contendo
extrato das cascas de Rapanea ferruginea (RF)
Para obtenção das NP contendo extrato, foi preparada a solução de QS
a 2,0% pH 5,0, sob agitação mecânica a 700 rpm por 12 h e filtrada a vácuo
com papel Unifil C 41, e a solução aquosa de TPP a 1,0%.
Devido à dificuldade de incorporação do extrato, as NP foram
preparadas usando solução de QS a 0,05% e solução de TPP a 0,0125%.
125
O extrato mole das cascas de R. ferruginea (RF) foi incorporado na
solução de QS na proporção 1:10 RF:QS (m/m), usando Tween® 80 como
dispersante.
Em béquer de 100 mL, foram adicionados 20 mL de solução de QS
contendo extrato na proporção 1:10 RF:QS e gotejados 20 mL de solução de
TPP 0,0125% em um período de 15 min, sob agitação mecânica a 300 rpm.
A solução foi mantida sob agitação por 30 min e acondicionada em frasco de
vidro, até análise de tamanho por DLS.
Para otimizar o método de obtenção das NP de RF:QS, foi elaborado
um planejamento fatorial 32, tendo como fatores a taxa de agitação (300, 500
e 700 rpm) e a taxa de gotejamento da solução de TPP (1,0, 1,5 e 2,0 mL/min),
conforme apresentado no Quadro 2. Neste estudo foi usada a proporção de
RF:QS 1:10 e TPP:QS 1:4 (20 mL de TPP 0,0125% e 20 mL de QS 0,05%).
Quadro 2- Planejamento fatorial 32 usado na otimização do método de obtenção de
NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea, tendo como fatores as
taxas de agitação e gotejamento da solução de TPP.
Amostra
Fator 1 Fator 2
Nível Taxa de
agitação (rpm) Nível
Taxa de gotejamento
(mL/min)
1 -1 300 -1 1,0
2 -1 300 0 1,5
3 -1 300 1 2,0
4 0 500 -1 1,0
5 0 500 0 1,5
6 0 500 1 2,0
7 1 700 -1 1,0
8 1 700 0 1,5
9 1 700 1 2,0
As amostras foram analisadas em triplicata quanto à distribuição de
tamanho, PDI e potencial zeta.
A partir dos resultados obtidos com o planejamento fatorial descrito
acima, foi realizado um novo planejamento para otimização da composição
das NP. No planejamento fatorial 42 foram estudados os fatores proporção
126
extrato:polímero (RF:QS) (1:5, 1:10, 1:15 e 1:20) e TPP:QS (1:3, 1:4, 1:5 e
1:6), conforme descrito no Quadro 3.
Quadro 3- Planejamento fatorial 42 usado na otimização da composição das NP de
QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea, tendo como fatores as
proporções de extrato:polímero (RF:QS) e TPP:QS.
Amostra
Fator 1
RF:QS
Fator 2
TPP:QS
Nível Proporção
(m/m) Fração Nível
Proporção
(m/m) Fração
1 -2 1:5 0,200 -2 1:3 0,33
2 -2 1:5 0,200 -1 1:4 0,25
3 -2 1:5 0,200 1 1:5 0,20
4 -2 1:5 0,200 2 1:6 0,17
5 -1 1:10 0,100 -2 1:3 0,33
6 -1 1:10 0,100 -1 1:4 0,25
7 -1 1:10 0,100 1 1:5 0,20
8 -1 1:10 0,100 2 1:6 0,17
9 1 1:15 0,066 -2 1:3 0,33
10 1 1:15 0,066 -1 1:4 0,25
11 1 1:15 0,066 1 1:5 0,20
12 1 1:15 0,066 2 1:6 0,17
13 2 1:20 0,050 -2 1:3 0,33
14 2 1:20 0,050 -1 1:4 0,25
15 2 1:20 0,050 1 1:5 0,20
16 2 1:20 0,050 2 1:6 0,17
Nota: TPP – tripolifosfato de sódio; QS – quitosana; RF – extrato das cascas de
Rapanea ferruginea.
As NP foram preparadas conforme método descrito acima, usando
solução de QS 0,05% contendo extrato nas proporções estabelecidas no
desenho experimental; taxa de agitação de 500 rpm e taxa de gotejamento de
1,5 mL/min. Após complexação, a dispersão foi mantida sob agitação por 30
min.
127
2.4.1 Análise de distribuição de tamanho
A distribuição de tamanho das NP foi determinada em triplicata através
do equipamento de difração de luz laser (Zeta sizer Malvern® Nano-ZS).
Foram analisados os parâmetros de distribuição de tamanho, PDI) e potencial
zeta.
2.4.2 Análise morfológica por MET
As amostras 9 e 16 foram analisadas por microscopia eletrônica de
transmissão- MET (Jeol, mod. JEM-1200EX II). Para o preparo da amostra,
uma gota da dispersão de NP foi gotejada sobre a grade de cobre de 400 mesh
com filme de FormVar carbono, deixando secar por 20 min. Em seguida foi
gotejado uma gota da solução contraste (acetato de uranila 2%) sobre a grade
com amostra e analisado em MET. A análise foi realizada a 80 kV.
2.4.3 Análise estatística
A análise do planejamento fatorial foi realizada usando software
Minitab® versão 18.1. Foi analisada a influência de cada fator sobre as
respostas e também a interação entre os fatores nas respostas obtidas. Os
resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de um fator,
seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Tukey.
Os valores de p<0,05 foram considerados indicativos de significância.
3 Resultados e Discussão
Para a preparação das NP poliméricas, dois métodos são comumente
utilizados, (a) dispersão e solvatação dos polímeros; (b) polimerização a
partir de macromoléculas naturais. As NP poliméricas biodegradáveis podem
ser produzidas a partir de proteínas (gelatina e proteínas de leite),
polissacarídeos (quitosana, alginato de sódio e amido) e polímeros sintéticos
como ácido poliláctico (PLA), co-polímeros dos ácidos poliláctico-glicólico
(PLGA) e ácido poliglicólico (PLG) (ESFANJANI; JAFARI, 2016). No
presente estudo, a QS foi empregada como polímero na obtenção de NP
contendo o extrato das cascas de R. ferruginea.
128
3.1 Seleção da matriz polimérica
Na obtenção das NP de QS foram inicialmente testados os métodos de
coacervação complexa com alginato de sódio (AL) e geleificação ionotrópica
com o contra-íon tripolifosfato (TPP).
Nos dois primeiros testes realizados (Quadro 1), usando o método de
coacervação complexa, o extrato foi incorporado na dispersão de AL, e a
dispersão foi gotejada na dispersão de QS. No teste 2 foi adicionado TPP na
dispersão de AL na proporção 1:3,5 TPP:QS. As duas condições testadas não
resultaram em sistemas na escala nanométrica, quando analisada a
distribuição de tamanho por DLS. Resultado semelhante foi encontrado por Tagliari (2012) quando avaliou alguns parâmetros como concentração e pH
da dispersão de QS, concentração de AL e concentração de TPP, durante a
formação das NP contendo ácido glicirrízico. Foram obtidos sistemas
agregados com precipitação. Nos testes 3 e 5 (quadro 1) foi empregado o método de salting out
usando o TPP como contra-íon em uma relação 1:4 TPP:QS. Nas amostras
preparadas com o gotejamento da dispersão de TPP na QS, as partículas
apresentaram tamanho menor quando o extrato foi incorporado na QS (Teste
3) do que quando incorporado na solução de TPP (teste 5), conforme
apresentado na Figura 1 e na Tabela 1. A filtração da amostra em filtro 0,45
µm resultou em redução do tamanho médio em ambos os testes devido a
extrusão dos sistemas, porém não reduziu o valor de PDI, mostrando que as
amostras permaneceram polidispersas. No teste 5 houve aumento do PDI
após filtração. Neste teste o extrato foi disperso na solução de TPP. A
heterogeneidade da dispersão do extrato na solução pode ter resultado em
agregado com tamanho acima de 500 nm. Quando filtrado, estes agregados
foram separados e a dispersão polimérica apresentou tamanho entre 76,95 a
170,92 nm e um índice de polidispersão entre 0,556 e 0,630.
129
Tabela 1 - Resultados da análise de tamanho e polidispesidade
(PDI) das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea
usando método de espalhamento de luz dinâmico (DLS), com
leitura direta ou após filtração em filtro 0,45 µm.
Amostras Diâmetro
médio (nm) PDI
3 302,83 0,505
3 filtrado 127,97 0,556
4 170,92 0,506
4 filtrado 102,51 0,640
5 632,87 0,249
5 filtrado 76,95 0,630
A obtenção das NP pelo gotejamento da dispersão de QS na solução de
TPP (teste 4) resultou em partículas com diâmetro médio de 170,92 nm e PDI
de 0,50 (Figura 1 e Tabela 1). Após filtração, o diâmetro médio reduziu para
102 nm, porém a polidispersão aumentou, mostrando a heterogeneidade do
sistema.
A partir dos resultados obtidos, foi dado prosseguimento ao estudo
usando o procedimento usado no teste 3, ou seja, a QS como polímero
formador da matriz, o TPP como contra-íon pelo método de salting out com
gotejamento da solução de TPP na dispersão de QS contendo extrato.
3.2 Obtenção das nanopartículas de quitosana contendo extrato das cascas
de Rapanea ferruginea (RF)
A partir da solução da QS 0,05%, contendo extrato das cascas de R.
ferruginea na proporção 1:10, e da solução de TPP 0,0125% foram obtidas
NP com diâmetro médio de 141,5 nm, PDI de 0,797 e potencial zeta de 61,9
mV.
Embora tenha-se na literatura uma quantidade considerável de registros
de obtenção de sistemas a base de quitosana-tripolifosfato utilizando o
método de geleificação ionotrópica, há muitas variações nas concentrações
iniciais dos componentes. No entanto, há pouco registros sobre a otimização
dos parâmetros do processo sobre o tamanho e carga de superfície das NP
(FABREGAS et al., 2013).
130
Figura 1 – Distribuição de tamanho das NP de QS contendo extrato das cascas de R.
ferruginea usando método de espalhamento de luz dinâmico (DLS), com leitura direta
ou após filtração em filtro 0,45 µm.
3 3 filtrado
4 4 filtrado
5 5 filtrado
Portanto, a partir das condições iniciais estabelecidas, foi realizada a
otimização da obtenção das nanopartículas iniciando pelo estudo da
influência das taxas de agitação e de gotejamento da solução de TPP. Para
tanto, foi empregado um planejamento 32.
131
Conforme apresentado na Tabela 2, as NP apresentaram tamanho menor
que 10 nm, com alto índice de polidispersidade (0,737 a 0,954) e potencial
zeta entre 44 e 47 mV.
Conforme apresentado na Figura 2A, a taxa de agitação não teve uma
resposta linear no tamanho das NP. O ponto central (500 rpm) resultou em
partículas menores quando comparado a velocidade de 300 rpm e 700 rpm.
A diferença observada não foi significativa (p = 0,628).
Tabela 2 - Resultados da análise de tamanho, índice de polidispersidade (PDI) e
potencial zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea a partir
do planejamento fatorial 32*
Amostras Diâmetro médio
(nm) PDI
Potencial
Zeta (mV)
1 8,41 ± 0,62 0,954 46,0
2 8,30 ± 0,36 0,879 46,2
3 7,84 ± 0,50 0,811 45,2
4 9,05 ± 0,15 0,922 45,1
5 7,68 ± 1,30 0,742 45,6
6 6,83 ± 2,92 0,737 45,4
7 7,90 ± 0,43 0,771 46,2
8 8,67 ± 0,67 0,852 47,0
9 8,78 ± 0,64 0,906 44,3
*Planejamento Fatorial 32 – fator 1 – taxa de agitação (300, 500 e 600 rpm);
Fator 2 – taxa de gotejamento da solução de TPP (1,0, 1,5 e 2,0 mL/min).
Fàbregas et al. (2013) analisaram alguns parâmetros que influenciam na
formação de NP pelo método de geleificação ionotrópica como velocidade
de agitação (500 a 900 rpm), tempo de reação (10 e 15 min), tempo de adição
da solução de tripolifosfato (5 e 10 min) e observaram que o tempo de
agitação influenciou no tamanho das NP, sendo o melhor resultado na
velocidade de agitação de 800 rpm (105 e 209 nm).
132
Figura 2 – Gráficos dos efeitos principais dos fatores (A) e de interação entre os
fatores (B) taxa de agitação e taxa de gotejamento da solução de TPP sobre o tamanho
médio das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea.
A
B
A taxa de gotejamento da solução de TPP também não apresentou
influência significativa sobre o tamanho de partícula (p = 0,571), porém
houve uma tendência à redução de tamanho com o aumento da taxa de
gotejamento. Na análise da interação dos dois fatores estudados sobre o
tamanho de partícula (Figura 2B), foi observada a redução do tamanho com
o aumento da taxa de gotejamento de 1,5 para 2,0 mL/min e o aumento da
taxa de agitação de 300 para 500 rpm.
133
Figura 3 – Gráficos dos efeitos principais dos fatores (A) e de interação entre os
fatores (B) taxa de agitação e taxa de gotejamento da solução de TPP sobre o índice
de polidispersidade das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea.
A
B
Os resultados mostram que é necessária uma condição adequada de
gotejamento e agitação para formação do sistema. Este comportamento está
relacionado com a homogeneidade de dispersão das cadeias poliméricas do
polímero em movimento e a disponibilização do contra-íon e consequente
reticulação. Baixas taxas ou altas taxas de agitação podem resultar em
agregação das cadeias poliméricas e, a reticulação destes agregados leva à
obtenção de partículas de maior tamanho.
Os sistemas consistindo de NP coloidais têm uma alta tendência à
agregação. A energia mecânica associada à velocidade de agitação da reação
pode exceder a energia de repulsão eletrostática entre as cargas de superfície
positivas das nanopartículas, eventualmente desencadeando fenômenos de
agregação, representando um problema para a formação de nanopartículas
(FABREGAS et al., 2013).
134
A influência dos fatores sobre o índice de polidispersidade é apresentada
nos gráficos presentes na Figura 3. A influência foi semelhante à observada
para o tamanho médio das NP, bem como, não foram significantes com valor
de p > 0,05. Estes resultados podem ser justificados pela hipótese descrita
acima de influência das taxas de gotejamento e agitação sobre a formação da
NP.
O potencial zeta é uma propriedade importante para dispersões
nanométricas, pois a estabilização do sistema sofre influência da carga de
superfície das partículas poliméricas. No presente estudo, a QS foi usada
como polímero e, por seu caráter catiônico, resulta em partículas com
potencial catiônico. Conforme apresentado na Tabela 2 e na Figura 4, as
partículas apresentaram potencial de carga maior que 40 mV, sendo
considerável um potencial capaz de evitar a floculação e agregação das
partículas.
A taxa de gotejamento da solução de TPP foi o fator com maior
influência sobre o potencial zeta (p = 0,109), embora não seja considerado
estatisticamente significativo. O aumento da taxa de 1 para 1,5 mL/min
aumentou o potencial, porém uma redução foi observada com o aumento para
2 mL/min, mostrando uma maior eficiência de reticulação do polímero,
promovendo uma maior neutralização. Tal resposta pode ser relacionada com
redução do tamanho de partícula com o aumento da taxa de gotejamento, ou
seja, maior reticulação, menor tamanho e carga de superfície.
135
Figura 4 – Gráficos dos efeitos principais dos fatores (A) e de interação entre os
fatores (B) taxa de agitação e taxa de gotejamento da solução de TPP sobre o potencial
zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea.
A
B
Uma menor influência sobre a carga de superfície é observada para o
fator taxa de agitação (p = 0,773). Tal resposta é coerente, pois este é um fator
mecânico, que embora tenha impacto sobre o tamanho das NP, pouco pode
influenciar esta propriedade físico-química.
Após avaliação dos parâmetros que influenciam na formação das NP
Fàbregas et al. (2013), observaram que o valor do potencial zeta não sofreu
alterações significativas dos parâmetros tempo de adição da solução de TPP
e taxa de agitação.
136
A Figura 4B, mostra que o comportamento de alteração do potencial
zeta quando analisada a interação dos dois fatores, diferentemente do
observado para o tamanho e PDI, o comportamento das amostras preparadas
com taxa de gotejamento de 2 mL/min foi diferente dos perfis das taxas de 1
e 1,5 mL/min.
Os resultados obtidos com a análise da influência das taxas de agitação
e gotejamento sobre as propriedades das NP de QS contendo o extrato de R.
ferruginea mostram que estes não apresentam influência significativa, por
isto para continuidade dos estudos de otimização foram selecionados níveis
centrais testados, ou seja, agitação de 500 rpm e taxa de gotejamento de 1,5
mL/min.
Desta forma, a obtenção das NP foi verificada frente a diferentes
proporções extrato:polímero (RF:QS) e agente reticulante TPP e polímero
(TPP:QS). O estudo foi realizado usando planejamento fatorial 42. Tal
desenho foi estabelecido pela necessidade de obter resultados mais
detalhados sobre as propriedades das NP.
Analisando os resultados apresentados na Tabela 3, as NP 1, 2 e 3 tendo
a proporção de RF:QS de 1:5 (0,2) e TPP:QS 1:3 (0,33), 1:4 (0,25) e 1:5 (0,2),
apresentaram tamanhos semelhantes (6,66, 8,66 e 7,13 nm, respectivamente),
já a amostra 4 com a mesma proporção de RF:QS, mas na proporção de
TPP:QS 1:6 (0,17), apresentou tamanho maior de partícula (268,20 nm) e
maior índice de polidispersidade (0,863).
As amostras 5 e 6, preparadas com proporção RF:QS 1:10 e TPP:QS 1:3
e 1:4, respectivamente, apresentaram diâmetro médio semelhante às amostras
1 a 3, ou seja, inferior a 10 nm. Este mesmo comportamento foi observado
para a amostra 10, preparada com proporção RF:QS 1:15 e TPP:QS 1:4.
As demais amostras apresentaram tamanho entre 50 e 270 nm, com
ampla distribuição de tamanho, sendo consideradas polidispersas.
As NP obtidas apresentaram potencial zeta entre 38 e 50 mV, sendo
classificadas como sistemas com alto potencial zeta.
A análise dos resultados de tamanho das NP frente às variáveis
estudadas mostra que a proporção extrato: polímero apresentou fraca
influência sobre o tamanho das NP (p=0,953), com tendência à redução de
tamanho com o aumento da proporção de extrato na matriz polimérica (Figura
5A).
137
Tabela 3 - Resultados da análise de tamanho, índice de polidispersidade (PDI) e
potencial zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea a partir
do planejamento fatorial 42*
Amostras Diâmetro médio
(nm) PDI
Potencial Zeta
(mV)
1 6,66 ± 1,85 0,754 38,8
2 8,66 ± 0,98 0,556 43,8
3 7,13 ± 2,76 0,620 46,4
4 268,20 ± 121,0 0,863 48,6
5 7,96 ± 0,54 0,702 41,3
6 7,68 ± 1,30 0,742 45,6
7 94,88 ± 155,20 0,589 47,9
8 162,50 ± 153,70 0,827 49,8
9 55,49 ± 43,71 0,746 43,1
10 8,63 ± 0,63 0,596 45,6
11 104,10 ± 91,05 0,731 46,3
12 129,60 ± 167,40 0,552 47,5
13 73,64 ± 60,30 0,522 34,7
14 56,14 ± 22,96 0,564 34,8
15 170,20 ± 111,70 0,608 43,2
16 95,59 ± 36,90 0,750 47,7
*Planejamento Fatorial 42 – Fator 1 – Proporção RF:QS (0,05, 0,07, 0,1 e 0,2); Fator
2 – Proporção TPP:QS (0,17, 0,2, 0,25 e 0,33).
A proporção de TPP apresentou significativa influência sobre o
tamanho das NP, com valor de p de 0,011 (Figura 5A). NP com maior
diâmetro foram obtidas usando proporções 1:5 (0,2) e 1:6 (0,17) TPP:QS.
138
Figura 5 – Análise de tamanho médio das NP de QS contendo extrato das cascas de
R. ferruginea preparadas com diferentes proporções extrato:polímero (RF:QS) e
TPP:QS. A) Gráficos dos efeitos principais dos fatores; B) Gráfico de interação entre
os fatores e C) análise de variância do tamanho frente à proporção TPP:QS.
A
B
C
139
Conforme apresentado na Figura 5B, exceto para a proporção TPP:QS
1:6 (0,17), o aumento da proporção de extrato resultou em partículas de
menor diâmetro. O gráfico de interação entre os fatores mostra, que o
diâmetro das NP é dependente tanto da proporção de extrato quanto de TPP
na matriz. Sendo necessário ajustar estes parâmetros para obtenção de
nanopartículas com diâmetro superior a 100 nm.
Por meio da análise de variância, foi verificado que as amostras
preparadas com TPP:QS 1:6 possuem tamanho estatisticamente diferentes
das amostras preparadas com proporções 1:4 e 1:3.
As NP de QS contendo extrato apresentaram alta polidispersidade
mostrando que as amostras possuem ampla faixa de distribuição de tamanho.
Conforme apresentado na Figura 6A, o aumento da proporção de extrato na
matriz resultou em aumento da polidispersidade, mostrando que a formação
da NP de QS é influenciada pela presença do extrato. O aumento da
proporção de TPP reduziu a polidispersidade até a proporção 1:4 (0,25),
porém o aumento para 1:3 (0,33) resultou em partículas mais dispersas. São
vários os fatores que alteram a polidispersidade de um sistema, porém neste
caso o aumento do TPP além de 0,25 pode formar coacervados com a QS de
forma mais desorganizada e amorfa.
Conforme apresentado na Figura 6B, quando confrontada as interações
entre os fatores com o valor de PDI, há variabilidade dos resultados,
mostrando que os sistemas possuem ampla faixa de tamanho, não havendo
uma correlação entre PDI e proporção de RF:QS. As variáveis estudadas não
apresentaram influência significativa sobre o PDI, com valor de p de 0,557 e
0,320 para a proporção de extrato e TPP, respectivamente.
Um outro parâmetro explorado na análise estatística das amostras foi o
valor de potencial zeta. Conforme mostrado na Figura 7 e, já observado no
planejamento fatorial anterior (Figura 4), o aumento da proporção de TPP
resulta em um significante redução do potencial zeta (valor de p = 0,013),
mostrando a formação do complexo TPP:QS pela neutralização dos
grupamentos catiônicos da QS.
O aumento da proporção do extrato na matriz resultou em um leve
aumento do potencial zeta, porém não de forma significativa (p=0,245), o
que fica evidente no gráfico de interação entre os fatores estudados (Figura
7B).
140
Figura 6 – Análise da polidispersidade de tamanho das NP de QS contendo extrato
das cascas de R. ferruginea preparadas com diferentes proporções extrato:polímero
(RF:QS) e TPP:QS. A) Gráficos dos efeitos principais dos fatores; B) Gráfico de
interação entre os fatores.
A
B
A análise de variância dos resultados de potencial zeta (Figura 7C)
permitiu verificar que as amostras preparadas com TPP 1:6 possuem valor de
potencial zeta diferente das NP preparadas com TPP 1:3.
141
Figura 7 – Análise do potencial zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R.
ferruginea preparadas com diferentes proporções extrato:polímero (RF:QS) e
TPP:QS. A) Gráficos dos efeitos principais dos fatores; B) Gráfico de interação entre
os fatores e C) análise de variância do tamanho frente à proporção TPP:QS.
A
B
C
142
A morfologia das NP de QS contendo o extrato de R. ferruginea
(amostras 9 e 16) é apresentada nas Figuras 8 e 9. As NP apresentaram
formato esférico, sem aglomeração, confirmando a formação de
nanopartículas poliméricas e não a simples formação de agregados
poliméricos. O tamanho de partícula verificado por DLS foi confirmado pelas
nanografias por MET.
Figura 8 – Fotonanografia por MET das NP de TPP:QS (1:3) contendo extrato das
cascas de R. ferruginea (1:15). Aumento de 30.000x (A) e 50.000x (B).
A
B
143
Figura 9 – Fotonanografia por MET das NP de TPP:QS (1:6) contendo extrato das
cascas de R. ferruginea (1:20). Aumento de 1.000x.
As NP podem ser preparadas por interação eletrostática resultando na
gelificação ionotrópica da QS pelo TPP, um poliânion forte (SHAO-JUNG
et al., 2013; KANG et al, 2015). Esta interação requer apenas temperatura e
condições de pH moderadas, o tamanho das NP pode ser controlada pela
variação da relação TPP:QS, como observado no presente estudo.
A incorporação de grupos fosfato em QS é particularmente interessante,
pois melhora a sua estabilidade através da reticulação numa única etapa
(PATI; ADHIKARI; DHARA, 2011). Esta simples técnica envolve a mistura
da fase ácida (pH 4 e 6) contendo QS com uma fase alcalina (pH 7 e 9)
contendo TPP. As NP são imediatamente formadas após a mistura destas
duas fases através das ligações intra e intermoleculares criadas entre os
grupos amino da QS e os fosfatos do TPP (ELGADIR et al., 2015).
NP de insulina foram preparadas utilizando diferentes volumes da
solução de TPP contendo insulina a qual foi adicionada em 4 mL da solução
de quitosana sob agitação constante à temperatura ambiente. O tamanho
obtido das NP de QS foram de 300 e 400 nm com uma carga positiva de
superfície desde ± 54 a +25 mV (ELGADIR et al., 2015).
144
4 Conclusões
Nanopartículas de quitosana contendo extrato das cascas de Rapanea
ferruginea foram desenvolvidas. O diâmetro das nanopartículas foi
dependente tanto da proporção extrato:polímero quanto de TPP na matriz,
estando entre 50 e 270 nm, porém polidispersas e com potencial zeta entre 38
e 50 mV. Entre as nanopartículas desenvolvidas as que apresentaram
melhores características foram as amostras 7 (RP:QS 1:10 e TPP:QS 1:5),
amostra 12 (RP:QS 1:15 e TPP:QS 1:6) e a amostra 14 (RP:QS 1:20 e
TPP:QS 1:4), sendo os diâmetros médios de 94,88 ± 155,20; 129,60 ± 167,40
e 56,14 ± 22,96 nm, respectivamente e o PDI e potencial zeta,
respectivamente de 0,589 e 47,9 mV; 0,552 e 47,5 mV; 0,564 e 34,8 mV. As
nanopartículas apresentaram formato esférico confirmando a formação de
nanopartículas poliméricas e a nanoincorporação do extrato na matriz
polimérica. Os fatores estudados permitiram conhecer as variáveis do
processo e da composição que influenciam a formação das nanopartículas de
quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea. Baseado no potencial
que os sistemas nanométricos possuem no aumento da solubilidade e
biodisponibilidade de fitoderivados, o desenvolvimento de nanopartículas
poliméricas contendo o extrato de R. ferruginea será continuado com a
realização de estudos biofarmacêuticos e de eficácia a fim de avaliar a
influência da nanoencapsulação do extrato sobre a resposta biológica.
145
CAPÍTULO VI
Considerações Finais
146
147
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os sistemas de liberação modificada de fármacos representam uma das
áreas mais promissoras para o desenvolvimento de novos medicamentos, pois
oferecem inúmeras vantagens em relação às formas farmacêuticas
convencionais. Entre tais vantagens estão à melhoria da eficácia, redução da
toxicidade, liberação do fármaco no local especifico de ação, redução do
número de doses, otimização da velocidade de liberação, melhoria da
estabilidade com redução da velocidade de degradação e aumento da adesão
e conveniência do paciente. A biodisponibilidade e a solubilidade de
fármacos são fatores que geralmente causam dificuldades para o
desenvolvimento de formas farmacêuticas de liberação e estes sistemas são
capazes de promover o aumento da solubilidade pelo aumento da área
superficial, resultando em aumento de eficácia e redução de efeitos colaterais.
A proposta deste estudo foi desenvolver sistemas nanoestruturados,
micro e nanopartículas poliméricas, para melhorar a solubilidade e
consequente biodisponibilidade do extrato das cascas de R. ferruginea usando
a quitosana como polímero e avaliar a influência destes sistemas na atividade
anti-inflamatória oral e tópica em modelos farmacológicos in vivo.
O primeiro sistema desenvolvido foram as micropartículas (MP)
poliméricas de quitosana (QS) contendo o extrato das cascas de R. ferruginea
(RF) usando a técnica de spray drying. Foi escolhida esta técnica por ser de
fácil reprodutibilidade e escalonamento e também por ser um dos métodos
que proporciona boa estabilidade e eficácia quando comparada as técnicas
que utilizam solventes orgânicos. Além da caracterização do sistema foram
avaliados o teor, e a eficiência de encapsulação e o perfil de dissolução das
MP. As MP que continham como agentes de dispersão o propilenoglicol +
RH400 (0,75 + 0,50%) demonstraram perfis de dissolução de liberação
prolongada dos marcadores AMA e AMB durante 24 h de análise. A partir
destes resultados foi realizada a avaliação de biodesão em modelo ex vivo e a
atividade anti-inflamatória oral pelo modelo de formalina. No teste de
bioadesão ex vivo, as MP do lote 2 e 4 apresentaram bioadesão entre 24,58%
e 15,27%, respectivamente, e foi dependente do agente de dispersão
empregado. MP somente com propilenoglicol apresentaram maior taxa de
bioadesão do que as que continham propilenoglicol e Ultramona RH400.
Para a avaliação da atividade anti-inflamatória oral in vivo das MP de
QS contendo o extrato das cascas de R. ferruginea pelo modelo de formalina
foi escolhido a dose de 150 mg/kg, menor dose que apresentou eficácia nos
148
ensaios com o extrato isolado. As MP brancas contendo Ultramona RH400
demonstrou atividade na dor neurogênica semelhante às MP 2 e 4. O extrato
microencapsulado (lotes 2 e 4) apresentou 63,93% e 68,62%,
respectivamente de inibição na dor neurogênica, valores estatisticamente
similares, o lote 4 apresentou maior atividade na dor inflamatória de 59,13%.
As MP (lote 4) contendo o tensoativo polietoxilado Ultramona RH400
apresentaram maior atividade farmacológica, fator este que provavelmente
potencializou a ação dos marcadores.
As MP de QS contendo o extrato das cascas de R. ferruginea 1:10
extrato:polímero e propilenoglicol+Ultramona RH400 como agentes
dispersantes foram incorporadas em hidrogel aniônico com o objetivo de
promover a administração tópica do extrato. As MP foram dispersas em
hidrogéis de alginato de sódio e carbômero 940. As MP permaneceram
estáveis fisicamente no veículo hidrofílico, mostrando a capacidade dos
hidrogéis em reticular as partículas de quitosana. Os hidrogéis apresentaram
um perfil reológico do tipo não-Newtoniano, pseudoplástico e tixotrópico,
perfil esperado para preparações semissólidas. A incorporação das MP
influenciou na reologia e propriedades de textura dos hidrogéis, apresentando
consistência e adesividade adequadas para este tipo de produto. Neste sistema
foi verificada a atividade anti-inflamatória tópica in vivo pelo modelo de
edema de orelha induzido pelo óleo de cróton e percebeu-se que o hidrogel
de carbômero contendo as MP de QS apresentou redução do edema de
76,80% e quando incorporadas no hidrogel de alginato de sódio a redução do
edema foi 83,67%. O extrato quando incorporado nas MP de QS e veiculado
nos hidrogéis apresentou potencial anti-inflamatório superior ao observado
quanto incorporado em emulsão convencional e semelhante ao obtido para
incorporação em nanoemulsões (DAL MAS et al., 2016). Desta forma pode
ser observado que tanto o sistema de hidrogéis contendo MP poliméricas e
nanoemulsões apresentaram atividade anti-inflamatória tópica in vivo e
podem ser utilizados como veículos para transportar o extrato mole das cascas
de R. ferruginea.
Um terceiro sistema foi desenvolvido com o intuito de avaliar os
parâmetros físico-químicos que influenciam no desenvolvimento de
nanopartículas (NP) poliméricas de QS contendo extrato das cascas de R.
ferruginea. Para esta avaliação foram selecionados 2 métodos, coacervação
complexa com alginato de sódio e geleificação ionotrópica com o contra-íon
tripolifosfato (TPP). Foram testadas duas condições para o método de
149
coacervação complexa e nenhuma delas resultou em sistemas na escala
nanométrica, quando analisada a distribuição de tamanho por DLS, sendo
descartado este método. Várias condições foram testadas no método de
geleificação ionotrópica sendo a condição escolhida para análise dos demais
parâmetros a dispersão de QS a 0,05%, contendo extrato das cascas de RF na
proporção 1:10, e solução de TPP a 0,0125% sendo obtidas NP com diâmetro
médio de 141,5 nm, PDI de 0,797 e potencial zeta de 61,9 mV. A partir desta
condição foi realizado um planejamento 32 para a otimização da obtenção das
NP avaliando a influência das taxas de agitação e de gotejamento da solução
de TPP, porém estas não apresentaram influência significativa sobre as
propriedades das NP de QS. No estudo da influência da composição
(proporção extrato:QS e TPP:QS) foi observado que proporção extrato:
polímero (RF:QS) apresentou fraca influência sobre o tamanho das NP
reduzindo o tamanho com o aumento da proporção de extrato na matriz
polimérica, porém o índice de polidispersidade aumentou com o aumento da
proporção de extrato na matriz, mostrando que a presença do extrato
influenciou na formação de NP de QS. A proporção TPP:QS apresentou
significativa influência sobre o tamanho das NP, sendo que os maiores
tamanhos foram obtidos nas proporções de 1:5 (94,88 a 170,20 nm) e 1:6
(95,50 a 268,20 nm). O aumento da proporção de TPP proporcionou uma
redução significativa do potencial zeta, mostrando a formação do complexo
TPP:QS pela neutralização dos grupamentos catiônicos da QS. Através da
análise dos parâmetros ficou evidenciado que o diâmetro das NP é
dependente tanto da proporção de extrato quanto de TPP na matriz e o
aumento da proporção de TPP reduz significativamente o potencial zeta e o
aumento da proporção do extrato na matriz conduz a um leve aumento do
potencial zeta. A maioria das amostras apresentou tamanho entre 50 e 270
nm, porém polidispersas e com potencial zeta entre 38 e 50 mV, sendo
classificadas como sistemas com alto potencial zeta. Através da análise
morfológica das nanopartículas de QS contendo o extrato de RF ficou
confirmada a formação de NP poliméricas as quais apresentaram formato
esférico.
Através deste estudo podemos concluir que a técnica de spray drying é
adequada para desenvolver MP poliméricas de quitosana contendo o extrato
das cascas de R. ferruginea, e os dois sistemas desenvolvidos, MP e MP
incorporadas em hidrogel, mostraram ser adequados como estratégia para
administração oral e tópica de extrato das cascas de R. ferruginea,
150
respectivamente. A incorporação das MP em hidrogéis potencializou a
atividade anti-inflamatória tópica do extrato das cascas de R. ferruginea e
através do perfil de dissolução das MP ficou evidenciado que o sistema
desenvolvido apresenta um perfil de liberação sustentada do extrato.
Sugere-se a continuidade dos estudos de estabilidade, eficácia e
segurança das MP e dos hidrogéis, bem como, estudos biofarmacêuticos e de
eficácia do extrato incorporado nas NP a fim de avaliar a influência da
nanoencapsulação do extrato sobre a resposta biológica.
151
REFERÊNCIAS
AMONZA, J. L. G. Sólidos Pulverulentos. In: JOSÉ LUIS VILA JATO
(Org.). Tecnologia Farmacêutica. Aspectos Fundamentales de los
sistemas farmacéuticos y operaciones básicas. Espanha: Síntesis, 2001. p.
80-89.
ANITHA, A.; DEEPAGAN, V. G.; DIVYA RANI, V. V.; MENON, D.;
NAIR,S. V.; JAYAKUMAR, R. Preparation, characterization, in vitro drug
release and biological studies of curcumin loaded dextran sulphate–chitosan
nanoparticles. Carbohydrate Polymers, v. 84, p. 1158–1164, 2011.
ANSARI, S. H.; ISLAM, F.; SAMEEM, M. Influence of nanotechnology
on herbal drugs: A Review. Journal of Advanced Pharmaceutical
Technology & Research, v. 3, n. 3,p. 142-146, 2012.
ANTONIALLI, C. de S. Avaliação do efeito do ácido mirsinóico B em
diferentes modelos de hipernocicepção inflamatória e neuropática
persistentes em camundongos. 2009. 97 f. Dissertação (Mestrado) -
Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2009.
ARAUJO, R. S. Desenvolvimento, caracterização e liofilização de
nanopartículas e encapsulamento de antibiótico de uso veterinário,
2009. 131 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Ouro Preto,
2009.
BACCARIN, T., Desenvolvimento e padronização de Extrato seco de
Rapanea ferruginea Ez. (Mirsinaceae) obtido por spray drying e
avaliação in vivo da atividade antinociceptiva, 2010. 145 f. Dissertação
(Mestrado) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí,
Itajaí, 2010.
BACCARIN, T.; MUCENEEKI, R. S.; BRESOLIN, T.M. B.; YUNES,R.
A.; ANGELA MALHEIROS,A.; LUCINDA-SILVA, R. M. Development
and validation of an HPLC-PDA method for the determination of myrsinoic
acid B in the extracts of Rapanea ferruginea Mez. Talanta, v. 85, p. 1221–
1224, 2011.
BACCARIN, T.; FERREIRA, A. GAZONI, V. F.; YUNES, R. A.;
MALHEIROS, A.; LUCINDA-SILVA R. M. Influence of Extraction
Parameters on Hydroalcohol Extracts of the Stem Bark of Rapanea
152
ferruginea Mez Using Myrsinoic Acid B as Marker. Tropical Journal of
Pharmaceutical Research.v.13, n. 7, p. 1113-1119, 2014.
BACCARIN, T.; DEBRASSI, A.; DE SOUZA, M. M.; YUNES, R. A.;
MALHEIROS, A.; LUCINDA-SILVA R. M. Influence of process
conditions on physicochemical properties and antinociceptive activity in
vivo of spray-dried Rapanea ferruginea Mez. stem bark extract. Powder
Technology. v. 291, p. 66–74, 2016.
BECK-BROICHSITTER, M.; STREHLOW, B.; KISSEL, T. Direct
fractionation of spray-dried polymeric microparticles by inertial impaction.
Powder Technology, v. 286, p. 311–317, 2015.
BELLA CRUZ, A.; KAZMIERCZAK, K., GAZONI, V. F.; MONTEIRO,
E.R.; FRONZA, L. M.; MARTINS, P.; YUNES, R. A.; BÜRGER C.;
THAIS A. TOMIO, T. A.; FREITAS, R. A.; MALHEIROS, A. Bio-guided
isolation of antimicrobial compounds from Rapanea ferruginea and its
cytotoxic and genotoxic potential. Journal of Medicinal Plants Research.
v. 7, n. 19, p. 1323-1329, 2013.
BIDONE, J.; ZORZI, G. K.; CARVALHO, E. L.S.; SIMÕES, C. M. O.;
KOESTER, L. S.; BASSANI, V. L.; TEIXEIRA, H. F. Incorporation of
Achyrocline satureioides (Lam.) DC extracts into topical nanoemulsions
obtained by means of spontaneous emulsification procedure. Industrial
Crops and Products, v. 62, p. 421–429, 2014.
BLANCO, M. A., Avaliação da incorporação de nanopartículas de
quitosana ao cimento endodôntico ah plus™, 2012. 78 f. Dissertação
(Mestrado) – Instituto Alberto Luiz Coimbra de Pós Graduação e Pesquisa
de Engenharia – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
2011.
BOWEY, K.; NEUFELD, R.J. Systemic and mucosal delivery of drugs
within polymeric microparticles produced by spray drying. Biodrugs, v. 24,
n.6, p. 359-377, 2010.
BRANGEL, L. M. Desenvolvimento de hidrogéis a base de quitosana e
ácido lactobiônico com adição de nanaoelementos. 2011. 55 f. Trabalho
de conclusão de curso- Universidade Federal do Rio Grande do Sul-
Instituto de Química, Porto Alegre, 2011.
153
BRUSCHI, M.L.; JONES, D.S.; PANZERI, H.; GREMIÃO, M.P.D.; DE
FREITAS,O.; LARA, E.H.G. Semisolid systems containing própolis for the
treatment of periodontal disease: In vitro release kinetics, syringeability,
rheological, textural, and mucoadhesive properties. Journal of
Pharmaceutical Sciences, v.96, n.8, p.2074–2089, 2007.
BULMER, C.; MARGARITIS, A.; XENOCOSTAS, A. Encapsulation and
controlled release of recombinant human erythropoietin from chitosan-
carrageenan nanoparticles. Current Drug Delivery, v. 9, n. 5, p. 527-537,
2012.
BURGER, M. C. M.; TEREZAN, A. P.; CUNHA, G.S. O.; FERNANDES,
J. B.; DA SILVA, M.F.G. F; VIEIRA, P. C.; MENEZES, A. C. S.
Antimicrobial activity of the myrsinoic acid A from Myrsine coriacea and
the semi-synthetic derivatives. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.
25 p. 451–454, 2015. CALIXTO, J.B.; ZANINI, J. C.; CRUZ, A. B.; YUNES, R.A.;
MEDEIROS, Y.S.; Extract and compounds obtained from Mandevilla
velutina inhibit arachidonic acid induced ear oedema in mice, but not rat
stomach contraction. Prostaglandins, n.41, p. 515-526, 1991.
CANELLA, K. M. N. C.; GARCIA, R. B. Caracterização de quitosana por
cromatografia de permeação em gel –influência do método de preparação e
do solvente, Química Nova, v. 24, n. 1, p. 13-17, 2001.
CAMPOS, E.; BRANQUINHO, J.; CARREIRA, A. S.; CARVALHO, A.;
COIMBRA, P.; FERREIRA, P.; GIL, M. H. Designing polymeric
microparticles for biomedical and industrial applications. European Polymer
Journal, v. 49, p.2005–2021, 2013.
CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações
silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Colombo: EMBRAPA,
1994.
CECHETTO, M. C. Nanoemulsões contendo extrato dos frutos da
Rapanea ferruginea: desenvolvimento e atividade anti-inflamatória in
vivo. 2016. 134f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2016.
154
CHENG, C. J.; TIETJEN,G. T.; SAUCIER-SAWYER, J. K. SALTZMAN,
W. M. A holistic approach to targeting disease with polymeric
nanoparticles. Nature Reviews Drug Discovery, p.1-9, 2015.
CORRIGAN, D.O, HEALY, A.M, CORRIGAN, O.I. Preparation and
release of salbutamol from chitosan and chitosan co-spray dried compacts
and multiparticulates. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, v.62, p.295–305, 2006.
COSTA, P. Avaliação da atividade do extrato dos frutos de Rapanea
ferruginea e dos compostos isolados ácido mirsinóico A e triglicerídeo
sobre a memória de animais normais e com Alzheimer induzido. 2011.
133f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011
COTA-ARRIOLA, O.; CORTEZ-ROCHA, M. O.; EZQUERRA-BRAUER,
J. M.; LIZARDI-MENDOZA, J.; ARMANDO BURGOS-HERNA´NDEZ,
A.; ROBLES-SA´NCHEZ, R. M.; PLASCENCIA-JATOMEA, M.
Ultrastructural, Morphological, and Antifungal Properties of Micro and
Nanoparticles of Chitosan Crosslinked with Sodium Tripolyphosphate.
Journal of Polymers and the Environment, v. 21, p. 971–980, 2013.
DA ROCHA, P. B. R. Desenvolvimento de carreadores lipídicos
nanoestruturados contendo extrato de Centella asiatica (L.) Urban
para uso tópico. 2015. 90f. Dissertação de Mestrado - Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Goiás, 2015.
DAL MAS, J. Nanoemulsão contendo extrato da casca de Rapanea
ferruginea com atividade anti-inflamatória tópica. 2015. 167f.
Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, UNIVALI, 2015.
DAL MAS; ZERMIANI, T.; THIESEN, L. C; SILVEIRA, J. L. M.; DA
SILVA, K. A. B. S.; DE SOUZA, M. M.; MALHEIROS, A.; BRESOLIN,
T. M. B.; LUCINDA-SILVA, R. M. Nanoemulsion as a carrier to improve
the topical anti-inflammatory activity of stem bark extract of Rapanea
ferruginea. International Journal of Nanomedicine, v.11, p. 4495–4507,
2016.
DAS, J.; DAS, S.; SAMADDER, A.; BHADRA, K.; KHUDA-BUKHSH,
A.R. Poly (lactide-co-glycolide) encapsulated extract of Phytolacca
decandra demonstrates better intervention against induced lung
155
adenocarcinoma in mice and on A549 cells. Europe Journal
Pharmaceutical Science, v.47, n.2, p.313-24, 2012.
DASH, S.; MURTHY, P.N.; NATH, L.; CHOWDHURY, P. Kinetic
modeling on drug release from controlled drug delivery systems. Acta
Poloniae Pharmaceutica - Drug Research, v. 67, n. 3, p. 217-223, 2010.
DASH, M.; CHIELLINI, F. R.M. OTTENBRITEB, F. R. M.; CHIELLINI,
E. Chitosan - A versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications.
Progress in Polymer Science. v. 36, p. 981-1014, 2011.
DE CARLI, R.B.G; SIQUEIRA, P.R.A.; KAISER, M. L.; FREITAS, R. A.;
DE SOUZA,M. M.; CECHINEL-FILHO, V.; SILVA, R. M. L; Topical
Anti-inflammatory Effect of Creams Containing Kaurenoic Acid Isolated
from Wedelia paludosa in Mice. Latin American Journal of Pharmacy, v.
8, n. 4, p. 594-598, 2009.
DE MEDEIROS, K. A. Desenvolvimento e testes in vitro de
nanoparticulas de quitosana para liberação controlada de peptídeos
antitumorais. 2011. 77 f. Dissertação de Mestrado - Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília, 2011.
DE SOUZA, M. M.; CRUZ, A. B.; SCHUMACHER, M. B.; KRUEGER,
M. R. O.; FREITAS, R. A.; CRUZ, R. C. B. Métodos de avaliação de
atividade biológica de produtos naturais e sintéticos. In: BRESOLIN, T. M.
B.; CECHINEL FILHO, V. Ciências farmacêuticas: contribuição ao
desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Itajaí: UNIVALI,
2003. p. 107-166.
DHANUJA, G.; SMITHA, B.; SRIDHAR, S. Pervaporation of isopropanol–
water mixtures through polyion complex membrane. Separation and
Purification Technology, v. 44, p. 130–138, 2005.
ELKORDY, A. A.; ESSA, E. A. Dissolution of Ibuprofen from spray dried
and spray chilled particles, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,
v. 23, n. 3, p. 284-290, 2010.
ELGADIR, M. A.; UDDIN,MD. S.; FERDOSH, S.; AISHAH ADAM, A.;
CHOWDHURY, A. J. K.; SARKER, MD. Z. I. Impact of chitosan
composites and chitosan nanoparticle composites on various drug delivery
156
systems: A review. Journal of food and drug analysis, v. 2 3, p. 619-629,
2015.
ESCOBAR-CHÁVEZ, J. J.; DÍAZ-TORRES, R.; RODRIGUEZ-CRUZ, I.
M.; DOMINGUEZ-DELGADO, C. L.; MORALES, R. S.; ÁNGELES-
ANGUIANO, E.; MELGOZA-CONTRERAS, L. M. Nanocarriers for
transdermal drug delivery. Research and Reports in Transdermal Drug
Delivery, p. 3-17, 2012.
ESFANJANI, A. F.; JAFARI, S. M. Biopolymer nano-particles and natural
nano-carriers for nano-encapsulation of phenolic compounds. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, v. 146, p.532–543, 2016.
ESPOSITO, E.; CORTESI, R. Polymeric Microparticles for Fenretinide
Administration, Macromolecular Symposia, v. 345, p. 14–23, 2014.
FABREGAS, A.; MI˜NARRO, M.; GARCIA-MONTOYA, E.; PEREZ-
LOZANO, P.;CARRILLO, C. SARRATE, R.; SANCHEZ, N.; TICO, J.R.;
SU˜NE-NEGRE, J.M. Impact of physical parameters on particle size and
reaction yield when using the ionic gelation method to obtain cationic
polymeric chitosan–tripolyphosphate nanoparticles. International Journal
of Pharmaceutics, v. 446, p.199-204, 2013.
FAN, W.; YAN, W.; XU, Z.; NI, H. Formation mechanism of monodisperse,
low molecular weight chitosan nanoparticles by ionic gelation technique.
Colloids Surface B: Biointerfaces, v. 90, p. 21-27, 2012.
FARIA-TISCHER, P. C. S; TISCHER, C. A. Nanobiotechnology: platform
technology for biomaterials and biological applications the nanostructures.
Biochemistry and Biotechnology Reports, v.1, n.1, p. 32-53, 2012.
FILIPPIN, F. B. Avaliação da atividade anticolinesterásica dos ácidos
mirsinóicos A e B, isolados da Rapanea ferruginea.2010. Trabalho de
Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Universidade do Vale do
Itajai, 2010.
FREITAS, M. F.; KINOSHITA, L. S. Myrsine (Myrsinoideae-
Primulaceae) no sudeste e sul do Brasil. Rodriguésia, v. 66, n. 1, p. 167-
189, 2015.
FRONZA, L. M.; GIURADELLI, S. F. Estudos fitoquímicos adicionais
com as cascas da Rapanea ferrugínea. 2009. 53f. Monografia (Graduação)
– Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí Itajaí, SC.
157
FUNDUEANU, G.; CONSTANTIN, M.; BORTOLOTTI, F.; CORTESI,
R.; ASCENZI, P.; MENEGATTI, E. Cellulose acetate butyrate–
pH/thermosensitive polymer microcapsules containing aminated poly(vinyl
alcohol) microspheres for oral administration of DNA. European Journal
of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 66, p. 11–20, 2007.
GALVAN, F. Avaliação da atividade anti-hiperalgésica do extrato bruto
da Rapanea sp. (Myrsinaceae) e do ácido mirsinóico B sobre a
neuropatia diabética. 2007. 39f. Trabalho de Conclusão de Curso
(Graduação) – Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí,
2007.
GAZONI, V. F., Análise Fitoquimica e Avaliação do Efeito
Anticolinesterásico do Extrato e Compostos Isolados da Rapanea
ferruginea, 2009. 84 f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2009.
GELFUSO, G. M. GRATIERI, T.; SIMÃO, P.S.; DE FREITAS, L. A. P.;
LOPEZ, R. F. V. Chitosan microparticles for sustaining the topical delivery
of minoxidil sulphate. Journal of Microencapsulation, v. 28, n. 7, p. 650–
658, 2011.
GERMERSHAUS; LUHMANN, T.; RYBAK, J.-C.; RITZER, J.; MEINEL,
L. Application of natural and semi-synthetic polymers for the delivery of
sensitive drugs, International Materials Review.v, 60,n. 2, p. 101-130,
2015.
GÓES, J.A; LUCINDA-SILVA, R.M.; MALHEIROS, A.; BRESOLIN,
T.M.B.; CECHINEL FILHO, V.; SANTI, J.R. Avaliação da atividade
antioxidante de plantas medicinais tradicionais brasileiras. In: VIII
Simpósio Ibero-Americano de Plantas Medicinais e III Simpósio Ibero-
Americano de Investigação em Câncer, 2016, Itajaí. Anais do VIII
Simpósio Ibero-Americano de Plantas Medicinais e III Simpósio Ibero-
Americano de Investigação em Câncer, 2016.
GOWTHAMARAJAN, K.; SINGH, S. K. Dissolution Testing for Poorly
SolubleDrugs: A Continuing Perspective. Dissolution Technologies, p. 24-
32, 2010.
GRAVES, R.A., LEDET, G.A., GLOTSER, E.Y., MITCHNER, D.M.,
BOSTANIAN, L.A., MANDAL, T.K., Formulation and evaluation of
158
biodegradable nanoparticles for the oral delivery of fenretinide. European
Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 76, p. 1–9, 2015.
GUTJAHR, A.; PHELIP, C.; COOLEN, A.L.; MONGE, C.; BOISGARD,
A.S.; PAUL, S.; VERRIER, B. Biodegradable Polymeric Nanoparticles-
Based Vaccine Adjuvants for Lymph Nodes Targeting. Vaccines v. 4, n. 34,
p.2-16, 2016.
HAN, F. Y.; THURECHT, K. J.; WHITTAKER, A. K.; SMITH, M. T.
Bioerodable PLGA-Based Microparticles for Producing Sustained-Release
Drug Formulations and Strategies for Improving Drug Loading. Frontiers
in Pharmacology, v. 7, p. 1-11, 2016.
HE. C.; Yin, L.; TANG, C.; YIN, C. Size-dependent absorption mechanism
of polymeric nanoparticles for oral delivery of protein drugs. Biomaterials,
v. 33, p. 8569-8578, 2012.
HESS, S. Atividade Antinociceptiva do ácido mirsinóico B. 2006. 108 f.
Dissertação (Mestrado) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do
Vale do Itajaí, Itajaí, 2006.
HESS, S.; PADOANI, C.; SCORTEGANHA. L. C.; HOLZMANN, I.;
MALHEIROS, A.; YUNES, R. A.; MONACHE, F. D.; SOUZA, M. M.
Assessment of mechanisms involved in antinociception caused by
myrsinoic acid B. Biological and Pharmaceutical Bulleti, v. 33, p. 209-
215. 2010.
HILL, L. E.; TAYLOR, T. M.; GOMES, C. Antimicrobial Efficacy of
Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) Nanoparticles with Entrapped
Cinnamon Bark Extract against Listeria monocytogenes and Salmonella
typhimurium, Journal of Food Science, v. 78, n. 4, 2013.
HIRATA, A.N.; BRUSCHI, M. L. Development and characterisation of
semisolid systems to deliver propolis in the oral cavity, Journal of Basic
and Applied Pharmaceutical Sciences, v. 31, n.1, p.33-39, 2010.
HO, Y. C.; MI, F. L.; SUNG, H. W.; KUO, P. L. Heparin-functionalized
chitosan–alginate scaffolds for controlled release of growth factor.
International Journal of Pharmaceutics, v. 376, p. 69-75, 2009.
159
HUDSON, D.; MARGARITIS, A. Biopolymer nanoparticle production for
controlled release of biopharmaceuticals. Critical reviews in
Biotechnology, v. 34, n. 2, p. 161–179, 2014.
HUSSAIN, Z.; THUB, H.E.; SHIOW-FERN N.; KHAND,S.; KATAS, H.
Nanoencapsulation, an efficient and promising approach to maximize
wound healing efficacy of curcumin: A review of new trends and state-of-
the-art. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 150, p. 223–241, 2017.
JEE, J.P.; NA, J.H.; LEE, S.; KIM, S. H.; CHOI, K., YEO, Y.; KWON, I.
C. Cancer targeting strategies in nanomedicine: Design and application of
chitosan nanoparticles. Current Opinion in Solid State and Materials
Science, v. 16, p. 333–342, 2012.
KANG, B. S.; LEE, S. E.; NG, C. L.; KIM, J. K.; PARK, J. S. Exploring the
Preparation of Albendazole-Loaded Chitosan-Tripolyphosphate
Nanoparticles. Materials, v. 8, p. 486-498, 2015.
KARAVASILI, C.; KATSAMENIS, O. L.; BOUROPOULOS, N.;
HAMDE NAZAR, H.;THURNER, P. J.; VAN DER MERWE, S. M.;
FATOUROS, D. G. Preparation and characterization of bioadhesiv
microparticles comprised of low degree of quaternization trimethylated
chitosan for nasal administration: effect of concentration and molecular
weight. Langmuir. v. 30, p. 12337−12344, 2014.
KUMARI, A.; YADAV, S.K.; YADAV, S.C. Biodegradable polymeric
nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, v. 75, p. 1-18, 2009.
KUMBHAR, S. G.; PAWAR, S.H. Self-functionalized, oppositely charged
chitosan-alginate scaffolds. Biotechnology: An Indian Journal, v. 13, n. 2,
2017.
LACATUSU , I.; BADEA, N.; NICULAE , G.; BORDEI, N.; STAN, R.;
MEGHEA, A. Lipid nanocarriers based on natural compounds: An
evolvingrole in plant extract delivery. European Journal of Lipid Science
and Technology, v. 116, p. 1708–1717, 2014.
LEE, M.; LI, W.; SIU, R. K.; WHANG, J.; ZHANG, X.; SOO, C.; TING, K.;
WU, B. M. Biomimetic apatite-coated alginate/chitosan microparticles as
osteogenic protein carriers. Biomaterials, v. 30, p. 6094-6101, 2009.
160
LIN, H. R.; YEH, Y. J. Porous Alginate/Hapsponges for bone tissue
engineering. Materials Science Forum, v. 26, p. 3043-3082, 2003.
LIU, J.; WILLFOR, S.; XU, C. A review of bioactive plant
polysaccharides:Biological activities, functionalization, and biomedical
applications. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, v. 5, p. 31-61,
2015.
LORENZI H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de
plantas arbóreas do Brasil. São Paulo: Instituto Plantarum de Estudos da
Flora 1998; 384 p.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de
plantas arbóreas do Brasil. 2.ed. São Paulo: Instituto Plantarum de
Estudos da Flora, 2002; 368 p.
MANIVASAGAN, P.; OH, J. Marine polysaccharide-based nanomaterials
as a novel source of nanobiotechnological applications. International
Journal of Biological Macromolecules. v. 82, p. 315–327, 2016.
MAHMOOD, A.; SARFRAZ, M. R.; MAHMOOD, A. Hydrogel
Microparticles as an Emerging Tool in Pharmaceutical Field: A Review.
Advances in Polymer Technology, v. 35, n. 2, 2016.
MISHRA, B.; PATEL, B.B.; TIWARI, S. Colloidal nanocarriers: a review
on formulation technology, types and applications toward targeted drug
delivery. Nanomedicine, v. 6, p. 9- 24, 2010.
MURA, C., MANCONI, M.; VALENTI, D.; MANCA, M. L. DIEZ-
SALESB, O.; LOYA, G.; FADDA, A. M. In vitro study of N-succinyl
chitosan for targeted delivery of 5-aminosalicylic acid to colon.
Carbohydrate Polymers, v. 85, p. 578-583, 2011.
NAGAVARMA, B. V. N; HEMANT, K.S.Y.; AYAZ, A.; VASUDHA,
L.S.; SHIVAKUMAR, H. G. Different techniques for preparation of
polymeric nanoparticles- a review. Asian Journal of Pharmaceutical and
Clinical Research. v. 5, n.3, p.16-23, 2012.
NAIKWADE, S. R.; BAJAJ, A. N.; GURAV,P.; GATNE,M.M.; SONI, P.
S. Pulmonary Administration: Design, Characterization, In Vitro
Evaluation, and In Vivo Efficacy Study. American Association of
Pharmaceutical Scientists Technology, v. 10, n 3, 2009.
161
NAMDAR, M.; EATEMADI, A.; SOLEIMANINEJAD, M.; HAMMED, A.
T. A brief review on the application of nanoparticle enclosed herbal medicine
for the treatment of infective endocarditis. Biomedicine &
Pharmacotherapy, v. 87, p. 321–331, 2017.
NASSERI, M.; GOLMOHAMMADZADEH, S.; AROUIEE,H.; JAAFARI,
M. R.; NEAMATI, H. Antifungal activity of Zataria multiflora essential
oil-loaded solid lipid nanoparticles in-vitro condition. Iranian Journal of
Basic Medical Sciences, v. 19, p.1231-1237, 2016.
OLIVEIRA, O. W.; PETROVICK, P. R. Secagem por aspersão (spray
drying) de extratos vegetais: bases e aplicações. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 20, n. 4, p. 641-650, 2010.
OTUKI, M.F.; VIEIRA-LIMA, F.; MALHEIROS, A,; YUNES, R. A.;
CALIXTO, J. B. Topical antiinflammatory effects of the ether extract from
Protium kleinii and alpha-amyrin pentacyclic triterpene. European Journal
of Pharmacology, v. 507, p. 253-259, 2005.
PARK, S.; HWANG, S.; LEE, J. pH-responsive hydrogels from moldable
composite microparticles prepared by coaxial electro-spray drying.
Chemical Engineering Journal, v. 169, p.348–357, 2011.
PASCOTO, M. C. Rapanea ferruginea (Ruiz &Pav.) Mez. (Myrsinacea)
como uma importante fonte alimentar para as aves em uma mata de galeria
no interior do Estado de São Paulo. Revista Brasileira de Zoologia, v.24,
n.3, p. 735-741, 2007.
PATI, F.; ADHIKARI, B.; DHARA, S. Development of chitosan–
tripolyphosphate fibers through pH dependent ionotropic gelation.
Carbohydrate Research, v. 346, p. 2582–2588, 2011.
PATIL, P. B.; GUPTA, V. R. M.; UDUPI, R. H.; SRIKANTH, K.;
PRASADI, B. S. G. Development of dissolution medium for poorly water
soluble drug mefenamic acid. Research Journal of Pharmaceutical,
Biological and Chemical Sciences. n 4, p. 544-549, 2010.
PECARSKI, D. ; KNEŽEVIĆ-JUGOVIĆ, Z.; DIMITRIJEVIĆ-
BRANKOVIĆ, S.; MIHAJILOVSKI, K.; JANKOVIĆ, S. Preparation,
characterization and antimicrobial activity of chitosan microparticles with
thyme essential oil. Hemijska Industrija., v.68, n.6, p. 721–729, 2014.
162
PENICHE, H.; PENICHE, C. Chitosan nanoparticles: a contribution to
nanomedicine. Polymer International, v. 60, p. 883–889, 2011.
PEREIRA, R. R. DE A.; GODOY,J. S. R.; SVIDZINSKI,T. I. S.
BRUSCHI, M. L. Preparation and Characterization of Mucoadhesive
Thermoresponsive Systems Containing Propolis for the Treatment
of Vulvovaginal Candidiasis. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 102,
n. 4, p. 1222-1234, 2013.
POLETTO, F. S.; BECK, R. C. R.; GUTERRES, S. S.; POHLMANN, A.
R. Polymericnanocapsules: conceptsandapplications. In: BECK, R. C. R.;
GUTERRES, S. S.; POHLMANN, A. R. Nanocosmetics and
nanomedicines, Berlin: Springer, 2011. p. 49-68.
RAINA, H.; SONI, G.; JAUHARI, N.; SHARM, N.; BHARADVAJA, N.
Phytochemical importance of medicinal plants as potential sources of
anticancer agents. Turkish Journal of Botany. v. 38, p. 1027-1035, 2014.
RAJ, S.; JOSE, S.; SUMOD, U. S.; SABITHA, M. Nanotechnology in
cosmetics: Opportunities and challenges, Journal of Pharmacy Bioallied
Sciences, v. 4, n.3, p. 186–193, 2012.
RIBEIRO, A. F.; REZENDE, R. L. O.; CABRAL, L. M.; DE SOUSA, V.
P. Poly ε-caprolactone nanoparticles loaded with Uncaria tomentosa extract:
preparation, characterization, and optimization using the Box–Behnken
design, International Journal of Nanomedicine, v.8, p. 431–442, 2013.
ROWE, R. C.; SHESKEY, P. J.; QUINN, M. E. Handbook of
Pharmaceutical Excipients. 6 ed. Londres: Pharmaceutical Press and
American Pharmacists Association, 2009.
SALEEM, S. M. A.; AZHARUDDIN, SK. M. D.; ALI, S.; PATIL, C. C.
Studies on different chitosan polyelectrolyte complex hydrogels for
modified release of diltiazemhydrochlorid. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v. 2, n. 4, p. 64-67, 2010.
SÃO PEDRO, A.; FERNANDES, R.; VILLARREAL,C. F.; FIALHO, R.;
ALBUQUERQUE, E. C. Opioid-based micro and nanoparticulate
formulations: alternative approach on pain management. Journal of
Microencapsulation, p.1-12, 2016.
SCHMIDT, C.; LAUTENSCHLAEGER, C.; COLLNOT, E.M.;
SCHUMANN, M.; BOJARSKI, C.; SCHULZKE, J.D.; LEHR, C.M.;
163
STALLMACH, A. Nano- and microscaled particles for drug targeting to
inflamed intestinal mucosa -A first in vivo study in human patients. Journal
of Controlled Release, v. 165, p. 139–145, 2013.
SEVERINO, P., SANTANA, M. H. A., PINHO, S. C., SOUTO, E. B.
Polímeros sintéticos biodegradáveis: matérias-primas e métodos de
produção de micropartículas para uso em drugdelivery e liberação
controlada. Polímeros, v. 21, n. 4, p. 286-292, 2011.
SHAO-JUNG, W.; TZONG-HORNG, L.; CHAO-HSIEN, Y.; FWU-
LONG, M.; TSUNG-KUAN, L. Preparation and Characterization of Porous
Chitosan–Tripolyphosphate Beads for Copper (II) Ion Adsorption, Journal
of Applied Polymer Science, v.127, n.6, p. 4573 -4580, 2013.
SINGH, M.; CHAKRAPANI, A.; HAGAN, D. Nanoparticles and
microparticles as vaccine-delivery systems. Expert Review Vaccines, v. 6,
n.5, p.797-808, 2007.
SILVA, J.A.; APOLINÁRIO, A.C.; SOUZA, M.S.R.; DAMASCENO,
B.P.G.L.; MEDEIROS, A.C.D.; Administração cutânea de fármacos:
desafios e estratégias para o desenvolvimento de formulações
transdérmicas. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada,
v.31, n. 3, p. 125-131, 2010.
SOSNIK, A.; SEREMETA, K. P. Advantages and challenges of the spray-
drying technology for the production of pure drug particles and drug-loaded
polymeric carriers. Advances in Colloid and Interface Science, v. 223,
p.40–54, 2015.
STEICHEN, S. D.; CALDORERA-MOORE, M.; PEPPAS, N. A. A review
of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer
therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 48, p.
416-427, 2013.
STULZER, H. K.; TAGLIARI, M. P.; SILVA, M. A. S.; LARANJEIRA, M.
C. M. Desenvolvimento, Avaliação e Caracterização Físico Química de
Micropartículas Constituídas de Aciclovir/Quitosana Desenvolvidas pela
Técnica de Spray-drying. Latin American Journal of Pharmacy, v. 26, n.
6, p. 866-871, 2007.
TAGLIARI, M. P. Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana e
alginato de sódio para incorporação de ácido glicirrízico, ácido
164
salicílico ou cafeína visando liberação tópica. 2012. 229 f. Tese de
Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Farmácia, UFSC, 2012.
TOLL R, JACOBI U, RICHTER H, LADERMANN J, SCHAEFER H,
BLUME-PEYTAVI U. Penetration profile of microspheres in follicular
targeting of terminal hair follicles. Journal of Investigative Dermatology,
v. 123, p.168–76, 2004.
TOMIO, T. A. Atividade citotóxica e antitumoral dos extratos e
compostos isolados de Rapanea ferruginea e Piper aduncum. 2011. 171
f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, UNIVALI, 2011.
TROMMER, H. NEUBERT, R. H.H. Overcoming the stratum corneum: the
modulation of skin penetration. Skin Pharmacology Physiology, v. 19, p.
106-121, 2006.
TSAI, Y-J.; CHEN, B-H., Preparation of catechin extracts and
nanoemulsions from green tea leaf waste and their inhibition effect on
prostate cancer cell PC-3, International Journal of Nanomedicine, v.11,
p. 1907–1926, 2016.
UDREA, L. E.; HRITCU, D.; POPA, M. I.; ROTARIU, O. Preparation and
characterization of polyvinyl alcohol—chitosan biocompatible magnetic
microparticles, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, v. 323, p.
7–13, 2011.
VASCONCELLOS, F. C.; GOULART, G. A. S.; BEPPU, M. M.
Production and characterization of chitosan microparticles containing
papain for controlled release applications. Powder Technology, v. 205, p.
65–70, 2011.
VIANA, V. R.; DA SILVA, E. R., Nanopartículas de Quitosana:
aplicações e perspectivas para a adminstração tópica.2013. 31f.Trabalho
de conclusão de curso (Bacharelado)-Instituto Federal de Educação, Ciência
e Tecnologia do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.
VILLANOVA, J. C. O; ORÉFICE, R. L. Aplicações Farmacêuticas de
Polímeros. Polímeros: Ciência e Tecnologia, v. 20, n. 1, p. 51-64, 2010.
165
WANG, J.J.; ZENG, Z. W. ; XIAO, R. Z.; XIE, T.; ZHOU, G. L.; ZHAN,
X. R.; WANG, S. L. Recent advances of chitosan nanoparticles as drug
carriers. International Journal of Nanomedicine, v.6, p. 765–774, 2011.
WAN, F.; YANG, M. Design of PLGA-based depot delivery systems for
Biopharmaceuticals prepared by spray drying. International Journal of
Pharmaceutical, v. 498, p. 82–95, 2016.
WING-FU L.; ZHEN-DAN, H. Design and fabrication of hydrogel-based
nanoparticulate systems for in vivo drug delivery. Journal of Controlled
Release, v. 243, p.269–282, 2016.
WISUITIPROT, W; SOMSIRI, A.; INGKANINAN, K.; WARANUCH,
N. A novel technique for chitosan microparticle preparation using a
water/silicone emulsion: green tea model, International Journal of
Cosmetic Science, v. 33, p.351–358, 2011. (a)
XAVIER, B. B. Desenvolvimento tecnológico e avaliação biológica de
sistemas nanodispersos contendo extrato dos frutos da Rapanea
ferrugínea. 2015. 117f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2015.
YIN, J.; XIANG, C.; SONG, X. Nanoencapsulation of psoralidin via
chitosan and Eudragit S100 for enhancement of oral bioavailability,
International Journal of Pharmaceutics, v. 510, p. 203–209, 2016.
Yu, C.-Y.; Yin, B.-C.; Zhang, w.; Cheng, S.-X.; Zhang, X.-Z.; Zhuo, R.-X.
Composite microparticle drug delivery systems based on chitosan, alginate
and pectin with improved pH-sensitive drug release property, Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, v. 68, p. 245–249, 2009.
ZHAO, L-M.; SHI, L-E.; ZHANG, Z-L.; CHEN, J-M.; SHI, D-D.; YANG,
J.; TANG, Z-X. Preparation and application of chitosan nanoparticles and
nanofibers. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 28, n. 3, p.
353-362, 2011.
ZERMIANI, T. Estabelecimento e caracterização de marcadores para a
avaliação de nanossistemas contendo extrativos de Rapanea ferruginea.
2015. 172f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2015.
ZERMIANI, T.; DAL MAS, J.; XAVIER, B. B.; MALHEIROS, A.;
SILVA, R. M. L. COUTO, A. G.; BRESOLIN, T. M. B. Stability indicating
166
HPLC method for determination of myrsinoic acids A and B in Rapanea
ferruginea extracts and nanoemulsions. International Journal of
Pharmaceutical Sciences and Research, v. 6, n. 11, p. 4639-4649, 2015.
ZERMIANI, T.; MALHEIROS, A.; LUCINDA DA SILVA, R. M.;
STULZER, H. K.; BRESOLIN, T. M. B. Structural and physicochemical
characterization and purity assessment of myrsinoic acids A and B, active
compounds isolated from Rapanea ferruginea barks. Arabian Journal of
Chemistry, v.9, p. 872–881, 2016.
ZORZI, G. K.; SCHUHA, R. S.; DE CAMPOS, A. M , CARVALHO , E. L.
S. ; ROTTD, M. B.; TEIXEIRA, H. F. Biomateriais para formulações de
base nanotecnológica visando terapia genética ocular. Quimica Nova, v.
40, n. 1, p. 74-84, 2017.
167
ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO
DE ANIMAIS
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