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Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC

Farmacologia Clínica

Universidade Mogi das Cruzes

Março 2004

Princípios Gerais

Em uma análise quantitativa de fármacos em matriz

biológica deve-se tomar cuidado em todas as etapas, para

evitar erros. A amostra a ser analisada deve ser

representativa do total; não deve haver perdas e nem

contaminações durante seu preparo.

A etapa de separação dos componentes da amostra

no cromatógrafo também pose ser fonte de erros como:

• Adsorção irreversível de parte da amostra na fase

estacionária

• Resposta do detector afetada por alterações de

temperatura e vazão

• Quantidade de amostra injetada for da faixa linear

do detector e etc.

Após a obtenção do cromatograma, faz a in-

tegração dos sinais, que tem por finalidade trans-

formar a intensidade do sinal emitido pelo detector

em uma medida relacionada com a quantidade da

substância analisada na amostra.

A integração dos sinais pode ser feita usando

os seguintes métodos:

• Altura do pico: Este método não é muito usado

porque sofre influência de variações

instrumentais. Trata-se de uma perpendicular à

linha de base passando pela inflexão máxima do

pico; a medida desde a linha de base até este

ponto de inflexão máxima deste pico;

corresponde a altura do pico.

• Área do pico: Pode-se calcular a área do pico

traçando -se tangentes nos dois lados do pico; a

intersecção destas duas tangentes com a linha

de base fornece um triângulo cuja área pode ser

calculada pela fórmula:

A = a x w 2

Onde: A = área do pico

a = altura do pico

w = largura do pico na linha de base

A área também pode ser calculada

utilizando-se a largura na meia meia altura, isto é,

formando um triângulo na metade superior do

pico. Neste caso, a area é calculada:

A = a x wH

onde: W H = largura do pico na meia altura

1 2 3

aa

w

a2

WH

Métodos para a integração dos sinais fornecidos pelo registrador:

1. altura pelo pico

2. área do pico

3. área na meia altura

Com base nas medidas obtidas na

integração,

estas poderão ser relacionadas com a

concentração de uma dada substância na amostra,

através dos seguintes métodos:

• Normalização: Este método requer que todas as

substâncias presentes na amostra sejam eluídas,

e que a resposta do detector seja idêntica para

todas. Consiste em comparar a área obtida no

cromatograma com a porcentagem da

composição da mistura.

% A = área A x 100

área total

• Fator de resposta: Se o detector não responde de

maneira similar para todas as substâncias

presentes na amostra, é necessário corrigir esta

equação usando o chamado fator de resposta que é

determinado como a porcentagem conhecida e

observada para cada composto. Assim por

exemplo:

fA = % A conhecida

% A observada

Para calcular a porcentagem da substância

presente na amostra, basta multiplicar a área

obtida pelo fator de resposta e dividir pela

somatória de todas as áreas multiplicadas pelos

respectivos fatores de resposta.

• Calibração externa: Este método compara a área da

substância a ser quantificada na amostra com as

áreas obtidas desta mesma substância em

soluções padrão de concentrações conhecidas.

Dessa forma obtém-se um gráfico, relacionando as

áreas obtidas com as concentrações estabelecidas.

Utilizando este gráfico, pode-se calcular a

concentração desta substância com a amostra.

Este método é sensível a erros de injeção das

soluções padrão e das amostras, bem como a

erros relacionados com a preparação dos padrões.

Calibration curve

0 250 500 750 1000 1250

0

500

1000

1500

Slope

Y-intercept

X-intercept

1/slope

95% Conf idence Intervals

Slope

Goodness of Fit

r²

0.9644 ± 0.03746

-5.000

5.185

1.037

0.8727 to 1.056

0.9910

C (ng/mL)

Áre

a

• Padronização interna: Consiste em adicionar uma

quantidade conhecida de uma sunstância padrão na

amostra a ser analisada, e relacionar ad duas áreas

resultantes. Normalmente, uma substância

empregada como padrão interno deve possuir

características:

– mesma similaridade à substância em análise

– ter concentração e tempo de retenção a

substância em exame

– inerte

– não fazer parte da amostra analítica

– ter um perfil cromatográfico característico e

diferente das demais substâncias presentes na

amostra

Após a análise dessas substâncias constrói-se um

gráfico, relacionando a razão de áreas (Ax/Api) com a

concentração desta substância. Através da razão de

áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração

da substância na amostra, utilizando o gráfico da

calibração externa.

Este método é menos sensível a erros de

injeção, variações instrumentais, etc. É o melhor

método para análise quantitativa.

Calibration curve

0 250 500 750 1000 1250

0

500

1000

1500

Slope

Y-intercept

X-intercept

1/slope

95% Confidence Intervals

Slope

Goodness of Fit

r²

0.9644 ± 0.03746

-5.000

5.185

1.037

0.8727 to 1.056

0.9910

C (ng/mL)

Ra

tio

(A

x /

AP

I)

General Procedure of Liquid/Liquid

Extraction

Applied Bioequivalence Studies

Step 1 Step 2 Step 3

SampleSample

+Internal standard

Vortexmixing

Step 4 Step 5 Step 6

Adittion OrganicSolvent

sample extractionvortex mixing

Centrifugation

Separation phases Collection organic phase

Driedorganic phase

N2

Step 7 Step 8 Step 9

Reconstitutedsample

Brief mixing

Injection sample

Step 10 Step 11 Step 12

Phase Solid Extraction

Quantitative Determination of Drugs in Serum by HPLC

Applied Bioequivalence Studies

Determination of diclofenac in Human Plasma by HPLC

Method:

• System Chromatography: consisted of a LKB-Bromma 2150

HPLC, pump coupled to a VWM 2141 dual wavelenght UV

detector (Pharmacia-LKB,Uppsala, Sweden). The output sinal

was registered in a Nryans 28000 chart recorder ( Bryan

Souththern Instruments, Kent, Great Britain)

• Mobile Phase: acetonitrile;water (40:60, v/v) and 0.1 mol/L

acetic acid solution; the pH was ajusted to 5.6 with 3 mol?L

sodium hidroxide.

• Flow rate: 2.3 mL/min

• Column Chromatography: Spherisorb ODS-25mm, 4.6 mm x

250mm Sigma Aldrich (ST. Louis,MO,USA

• Detection: 276nm (U.V absorbance)

500 µL calibretion point or serum sample + 580 ng Indometacina (I.S) + 200 µL of 5% phosphoric acid

4 mL Dicloromethane

Phase organic washed with 200 µL amonium acetate 1:20 in water

Brief vortex mixing

Extraction Procedure

Vortex mixing 1 min

Centrifuged 2000 rpm 10 min

Centrifuged 2000 rpm 2 min

Organic Phase 45 ºC under nitrogen stream

The residue

100 µL of acetonitrile

Analytical Sample

20 µL

Determination of Terbinafine in Human Plasma by LC/MS-MS

Method:

• System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard

HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser,

thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The

Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a

electrospray source.

• Mobile Phase: Acetonitrile:water (80:20) containing 10 mmol/L

formic acid

• Flow rate: 0.50 mL/min

• Column Chromatography: Genius C18 4um analytical

column (150 mm x 4.6 mm i.d) 40°C

• Detection: The Quatro II equipped with a electrospray

source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)

and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 292.2>140.7

and. 288.2>116.9 for terbinafine and naftifine, repectively.

The cone voltage and collission energy were 35V and 15 eV

for terbinafine and 12 eV for naftifine.

200 µL calibretion point or serum sample + 20 µL Naftifine ( 1 µg/mL methanol: water 50:50)

4 mLDiethyl Ether:Hexane (80:20)

Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream

Brief vortex mixing

Extraction Procedure

Vortex mixing 1 min

Centrifuged 2000 rpm 10 min

The residue200 µL of acetonitrile: water (80:20)

containing 10 mmol/L formic acid

Analytical Sample

50 µL

Determination of Fluconazole in Human Plasma by LC/MS-MS

Method:

• System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard

HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser,

thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The

Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped

with a electrospray source.

• Mobile Phase: Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM

acetic acid pH= 3.7

• Flow rate: 0.9 mL/min isocratic gradient

• Column Chromatography: Genesis C18 4um analytical

column (10 mm x 4.0 mm i.d) 40°C

• Detection: The Quatro II equipped with a electrospray

source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)

and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 171.8>127.7

and 306.9>219.8 for metronidazole and fluconazole,

repectively. The cone voltage and collission energy were

30V and 20eV, respectively.

200 µL calibretion point or serum sample + 200 µL of carbonate-bicarbonate buffer containing metronidazole (I.S) 1 µg/mL

3 mL Diethyl ether/dicloromethane (70:30)

Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream

Brief vortex mixing

Extraction Procedure

Vortex mixing 5 min

Centrifuged 2000 rpm 10 min

The residue

Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM acetic acid

Analytical Sample

10 µL

Propanolol in Serum

HPLC Method

• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm

• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm

• Mobile Phase: 20mM phosphate potassium, pH 7/methanol

39:62

• Flow rate: 1 mL/min

• Injection volume: 20 µL porcine serum

• Temperature: 30 Cº

• Detection: 254 nm (U.V)

• Components: Propanolol and Butyl Paraben (I.S)

Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

Condition1mL methanol/1ml water

Load1mL spicked porcine serum

Wash1mL 5% Methanol in water

Eluent1mL Methanol + 5µg butyl

paraben

Evaporate and Constitute40 ºC under nitrogen stream

200µL Methanol

Tetracyclines in Serum

HPLC Method

• Sample: 1 mL spicked porcine serum / 2% phosphoric acid

solution / demecycline as I.S

• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm

• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm

• Mobile Phase: 0.1 % TFA in water Acetonitrile:methanol (91:7:2)

• Flow rate: 0.9mL/min

• Injection volume: 20 µL porcine serum

• Temperature: 30 Cº

• Detection: 279 nm (U.V)

Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

Prepare SampleMix 20µL (H2 PO4) to 1mL serum

Condition1mL methanol

Rinse 1mL water

Load1mL sample

Elute1mL Methanol

Evaporate to 0.2 mL

Reconstitute with mobile phase

Wash1mL 5% Methanol in water

Sulfa Drugs in Serum

HPLC Method

• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm

• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm

• Mobile Phase: 1% glacial acetic acid and 4% methanol in water

• Flow rate: 1 mL/min

• Injection volume: 10 µL porcine serum

• Temperature: 25Cº

• Detection: 254 nm (U.V)

• Components: Sulfadiazine, Sulfathiazole (I.S) and Sulfamerazine

Condition1mL methanol/1ml water

Load1mL spicked porcine serum with 10µg/mL sulfathiazole

(I.S), 20 µL phosphoric acid

Wash1mL 5% Methanol in water

Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

Eluent1mL Methanol

Evaporate and Constitute40 ºC under nitrogen stream

1mL mobile phase