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DESCOBERTA DE COMPOSTOS ANTIFÚNGICOS DE ORIGEM VEGETAL EM ESPÉCIES UTILIZADAS NA MEDICINA POPULAR

Prof. Susana A. ZacchinoFarmacognosia

Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas

Os FUNGOS PRODUZEM infecções

denominadas MICOSES

Que tipo de micoses produzem?

Micoses  SUPERFICIAIS da pele e mucosas

Dano do tecido epitelial

From

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artm

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genicity M

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Institu

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te 

(HKI).

Micoses SISTÊMICAS

O fungo entra nos tecidos profundos ou nos órgãos internos

Em pacientes hospitalizados

Erna M. Kojic and Rabih O. Darouiche Candida Infections of Medical Devices Clinical Microbiology Reviews, 17 255–267, 2004.

Existem drogas antifúngicas o suficientemente úteis para 

combater às infecções fúngicas ?

POLIENOS

AZOLES

ALILAMINAS

CASPOFUNGINA

No entanto, todas possuem MUITOS INCONVENIENTES.TODAS LEVAM AO DESENVOLVIMENTO DE 

RESISTÊNCIA.

Como tem que ser o antifúngico ideal ?• Amplo espectro• Fungicida• Não tóxico• Não muito caro• Via oral e intravenosa

As plantas provêem ilimitadas oportunidades para o isolamento de novos compostos

antifúngicos por sua disponibilidade inigualável de diversidade química. Mas,

como selecioná-las para começar seu estudo?

Entonces, dentro de uma região, cómo las escogemos? baseando‐nos em dados etnofarmacológicos ?

A esmo ?

Hay trabajos que se basan em dados etnofarmacológicos 

Otros las eligen al azar

Por famílias vegetais?

¿ Por regiões geográficas ?

E encontramos

Nós fizemos um estudo com plantas de sete países de Latinoamerica financiado pela 

Organização de Estados AmericanosDirector: Prof. Dr. Mahabir Gupta

Svetaz, et al., J. Ethnopharmacol., enviado Julio 2009

Além da forma de selecionar as plantas, o sucesso depende de muitos outros fatores

por exemplo

MÉTODOS sem alvo específico 

PARA BIOGUIAR O ESTUDO

BIOAUTOGRAFIA EM CAPA DE ÁGAR

QUALITATIVO QUANTITATIVO

Método de DILUIÇÃO

ALGUNS RESULTADOS UTILIZANDO MÉTODOS SEM ALVO ESPECÍFICO

Vejamos resultados com diferentesextratos de partes aéreas

Avaliação da atividade antifúngica dos extratos pelo método de microdilución em caldo:

Ca: Candida albicans; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cn: Cryptococcus neoformans; Afum: Aspergillus fumigatus; Afl:Aspergillus flavus; An: Aspergillus niger; Mg: Microsporum gypseum; Tr: Trichophyton rubrum; Tm: Trichophytonmentagrophytes. ≥1000: no activo.

Hex DCM AcOEt MeOH

Poligodial

Isopoligodial

Derita, M., et al., J. Ethnopharmacol. 124, 377‐383, 2009

Detecção de compostos antifúngicos em todos os extratos que apresentaram atividade por 

microdiluição em caldo.

No entanto, quando começamos a extração com metanol em lugar de hexano

Sub-extracto hexánico

Marco

Sub-extracto DCM

Marco

Material residualSub-extracto AcOEt

Hexano

DCM

AcOEt

MeOHExtrato MeOH

Avaliação da atividade antifúngica dos extratos pelo método de microdilución em caldo:

Ca: Candida albicans; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cn: Cryptococcus neoformans; Afum: Aspergillus fumigatus; Afl:Aspergillus flavus; An: Aspergillus niger; Mg: Microsporum gypseum; Tr: Trichophyton rubrum; Tm: Trichophytonmentagrophytes. ≥1000: no activo.

INACTIVO

Ying, B et. al. (1995) Phytochemistry 38, 909-15

Que pode ter pasao ?

Se evidenció que la actividad de Polygonum acuminatum se debía a los dialdehidos poligodial e isopoligodial,los cuales se inactivaban en MeOH. 

Para comprobar que eran realmente los dialdehidos sesquiterpénicos los responsables de la actividad

Fizemos um estudo da variação doconteúdo de poligodial e relação de esteconteúdo com a atividade antifúngicaVariáveis

Coleta em diferentes estações do ano

Partes da planta

Solvente

Solvente

Se estudou o conteúdo de poligodial nas diferentes partes da planta nos diferentes solventes

folhas

frutos

tallos

raiz

Coleta em diferentes estações do ano

Extrato DCM

Verão

PrimaveraOutono Inverno

FOLHAS: Correlação do conteúdo de poligodial e a atividade antifungica em extratos DCM

Derita, M., et al., J. Ethnopharmacol. 124, 377‐383, 2009Derita M., et al., Biochem. System. Ecol. 36, 55‐58, 2008 

Resumo:

A atividade antifúngica de Polygonum acuminatum se deve principalmente a poligodial, mas para mostrar atividade o extrato não deve ser alcoólico. 

A atividade é maior em outono e em inverno em que a concentração de poligodial é maior. 

O sucesso depende de muitos fatores

Panel de hongosprueba

Método semalvo específico

Extractos a probar

Metodologíaa utilizar

Método con alvoespecífico

Outrasestratégias

Mostras

Fungos

Candida albicans

C. tropicalis

Saccharomyces cerevisiae

Cryptococcus neoformans

FUNGOS que atacam a humanos

leveduras fungos filamentosos

Microsporum gypseum

M. canis

Trichophyton rubrum

T. mentagrophytes

Epidermophyton floccosum

Aspergillus nIger

A. fumigatus

A. flavus

O ideal é usar um painel amplo

E também podemos usar fungos que atacam aos cultivos ou a animais

Vamos ver os resultados diferentes que se obtêm quando se usam diferentes tipos de fungos con Zuccagnia punctata Cav.

Quando a provamos contra fungos patogénicos oportunistas para o humano com método sem alvo específico

HEXANO

Material Vegetal ResidualAHex, FHex 

DCM

ADCM, FDCM Material Vegetal Residual

MeOH

Frutos

AMeOH, FMeOH

BIOEN

SAiOS

Partes Aéreas

CIM de extratos de las partes aéreas

fueron aisladas dos chalconas como los compuestos responsables de la actividad.

No entanto, quando se provou Zuccagnia punctata Cav. Contra fungos que causam infecções em soja

O extrato DCM de partes aéreas

2',4'‐Dihidroxi‐3'‐metoxichalcona (1) 2',4'‐Dihidroxichalcona (2)

7‐Hidroxiflavanona (3) Cafeato de 1‐metil‐3‐(4'‐hidroxifenil)‐propilo (4)

Cafeato de 1‐metil‐3‐(3', 4'‐dihidroxifenil)‐propilo (5)

Comparação da atividade antifúngica (CIM em µg/mL) dos compostos 1-5 isolados de Z. punctata frente a tudo

o painel de fungos patogenicos para soja.

Svetaz L., et al., J. Agric. Food Chem. 52, 3297‐3300, 2004

O sucesso depende de muitos fatores

Panel de hongosprueba

Método semalvo específico

Extractos a probar

Metodologíaa utilizar

Método con alvoespecífico

Outras estratégias

Mostras

Fungos

Quais são os alvos possíveis para um fungo ?

Membrana citoplásmicaMembrana citoplásmica Pared celularPared celular Otras dianasOtras dianasMetabolismointermediarioMetabolismointermediario

A maioria de ANTIFÚNGICOS em uso clínico tem como alvo a membrana fúngica

Membrana

Un mecanismo muy importante es la UNIÓN AL ERGOSTEROL 

de la membrana fúngica, que es el mecanismo por el que actúa 

Anfotericina B

O

O

OHOH

OHOH

OH

OHOH

H3C

CH3

O

OH NH2OH

CH3

COOHHO

H3C

O

Anfotericina B

Que compostos se liberan ?

Que tienen un máximo de absorción a 260 nm

União ao ergosterol da membrana celular fúngica dos compostos isolados de Zuccagnia punctata

Composto antifungico

Se consideró que el ácido perclórico 

produce un leakage celular del 100 %.

Sólo chalcona 2 resultó activa para este ensayo 

Svetaz, L., et al., Planta Med. 73, 1074‐1080, 2007

ENSAIO PARA DETERMINAR ROTURA DA MEMBRANA

Panel de hongosprueba

Método semalvo específico

Extractos a probar

Metodologíaa utilizar

Método con alvoespecífico

Outras estratégias

Mostras

Fungos

Cambios en la morfología fúngica

permiten inferir que ese compuesto es antifúngico

y además da idea de su mecanismo de acción.

Seiler et al., MBC, 14, 4352‐4364, 2003Gunji, S. Agric. Biol. Chem. 47, 2061‐2069, 1983

Fitolacósido B

Phytolacca tetramera Hauman

Escalante A, et al. J Ethnopharmacol. 82, 29-34 2002.

(a) Cultivo controle; (b) Micrografías de contraste de fase (400x) deSaccharomyces cerevisiae em presença de Fitolacósido B (37 μM).

Escalante et al, J. Nat. Prod. 2008

Efeito de Fitolacósido B sobre 

Saccharomyces cerevisiae

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB)

Crecimiento normalCrecimiento en presencia de Fitolacósido B

Escalante, A., et al., J. Nat. Prod., 71, 1720‐1725, 2008.

Comparação das atividades antifúngicas das chalconas mais ativas

Polygonum ferrugineum Wedd. (Polygonaceae)

pashanonaOOH

OHH3CO

H3CO

cardamoninaOOCH3

OHHO

OH

O

MeO

O

OMe

O

CIM= 5 μg/ml frente a dermatofitos

Configuración relativa ERITRO

Del arilo de Myristica fragrans (macis)

Crescimento normal

Crescimento em presença do neolignano

Crescimento de um fungo filamentoso

Zacchino, S. et al., J. Ethnopharmacol. 62, 35‐41, 1998.

O sucesso depende de muitos fatores

(CH 2)2N

O

O(CH3)2N

(CH 2)2N

O

O(CH3)2N

Filantimida

Phyllanthus sellowianus

Obtener análogos de Productos obtendios de plantas

Sortino, M., et al., Tetrahedron: Asimmetry 20, 1106–1108, 2009Sortino et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 560‐568, 2008López, S. et al. Arzn. Forsch. (Drug. Res.) 55, 123‐132, 2005.Zamora, et al., Intern. J. Quant. Chem. 93, 32‐46, 2003. 

Sortino et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 560‐568, 2008Sortino et al., Tetrahedron: Asimmetry, 20 1106–1108, 2009López et al., Arzn. Forsch. (Drug. Res.) 55, 123‐132.Zamora et al., J. Quant. Chem. 93, 32‐46, 2003. 

Qual estrategia escolher?

Todas as estratégias são úteis !!

É necessário usar las estratégias que tenemos y encontrar 

novas estratégias que permitam aproveitar a grande diversidade química da natureza

Outra estrategia es voltar a testar os extratos inativos com outros bioensaios 

Las metodologías se publicaron en un librocon el apoio de CYTED

CIBE, Merck Sharp & Dohme de España, Madrid

Instituto de Microbiología Bioquímica, Salamanca

Instituto de Salud Carlos III, Madrid

Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, IVIC , Caracas

Ciflorpan, Panamá

Instituto Malbrán, Buenos Aires

Universidad de San Carlos de Guatemala

CEREMIC, Farmacognosia y Biología Vegetal de Universidad Nac de Rosario

ISBN 978-950-9030-40-4

Mayo 2007

• Agencia de Promoción Científica y Tecnológica de la Argentina (ANPCyT)

• Organización de Estados Americanos (OAS)  

• Programa Iberoamericano (CYTED)

• Internation al Foundation for Sciences (IFS)

• Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de Argentina (CONICET)

Agradecimientos

BoliviaDr A. GiménezBrasilDr V. Cechinel Filho (Itajaí) Dr R. YunesDr. M. FurlánDra S. Kuze RatesDra G. von PoserChile:Dr G. Schmeda Hirschmann Colombia:Dr. J. Quiroga Dr. V. Kouznetsov Costa RicaDra A. Pérez

MéxicoDr. R. Pereda Miranda (UNAM)Dr. L Peña Rodríguez, (Mérida)Dra R. EncarnaciónEspañaDr. A.San FelicianoDra. E. del OlmoDr.S. Cañigueral,Dra R. VilaDr A. DuránDr. J.C. RibasDra P. PérezParaguay: Dr E. FerroPanamá:Dr M. GuptaVenezuelaDr. G. VisbalDra G. San Blas Dr. J. Domínguez

Colaboraciones