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DESCOBERTA DE COMPOSTOS ANTIFÚNGICOS DE ORIGEM VEGETAL EM ESPÉCIES UTILIZADAS NA MEDICINA POPULAR
Prof. Susana A. ZacchinoFarmacognosia
Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Os FUNGOS PRODUZEM infecções
denominadas MICOSES
Que tipo de micoses produzem?
Micoses SUPERFICIAIS da pele e mucosas
Dano do tecido epitelial
From
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(HKI).
Micoses SISTÊMICAS
O fungo entra nos tecidos profundos ou nos órgãos internos
Em pacientes hospitalizados
Erna M. Kojic and Rabih O. Darouiche Candida Infections of Medical Devices Clinical Microbiology Reviews, 17 255–267, 2004.
Existem drogas antifúngicas o suficientemente úteis para
combater às infecções fúngicas ?
POLIENOS
AZOLES
ALILAMINAS
CASPOFUNGINA
No entanto, todas possuem MUITOS INCONVENIENTES.TODAS LEVAM AO DESENVOLVIMENTO DE
RESISTÊNCIA.
Como tem que ser o antifúngico ideal ?• Amplo espectro• Fungicida• Não tóxico• Não muito caro• Via oral e intravenosa
As plantas provêem ilimitadas oportunidades para o isolamento de novos compostos
antifúngicos por sua disponibilidade inigualável de diversidade química. Mas,
como selecioná-las para começar seu estudo?
Entonces, dentro de uma região, cómo las escogemos? baseando‐nos em dados etnofarmacológicos ?
A esmo ?
Hay trabajos que se basan em dados etnofarmacológicos
Otros las eligen al azar
Por famílias vegetais?
¿ Por regiões geográficas ?
E encontramos
Nós fizemos um estudo com plantas de sete países de Latinoamerica financiado pela
Organização de Estados AmericanosDirector: Prof. Dr. Mahabir Gupta
Svetaz, et al., J. Ethnopharmacol., enviado Julio 2009
Além da forma de selecionar as plantas, o sucesso depende de muitos outros fatores
por exemplo
MÉTODOS sem alvo específico
PARA BIOGUIAR O ESTUDO
BIOAUTOGRAFIA EM CAPA DE ÁGAR
QUALITATIVO QUANTITATIVO
Método de DILUIÇÃO
ALGUNS RESULTADOS UTILIZANDO MÉTODOS SEM ALVO ESPECÍFICO
Vejamos resultados com diferentesextratos de partes aéreas
Avaliação da atividade antifúngica dos extratos pelo método de microdilución em caldo:
Ca: Candida albicans; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cn: Cryptococcus neoformans; Afum: Aspergillus fumigatus; Afl:Aspergillus flavus; An: Aspergillus niger; Mg: Microsporum gypseum; Tr: Trichophyton rubrum; Tm: Trichophytonmentagrophytes. ≥1000: no activo.
Hex DCM AcOEt MeOH
Poligodial
Isopoligodial
Derita, M., et al., J. Ethnopharmacol. 124, 377‐383, 2009
Detecção de compostos antifúngicos em todos os extratos que apresentaram atividade por
microdiluição em caldo.
No entanto, quando começamos a extração com metanol em lugar de hexano
Sub-extracto hexánico
Marco
Sub-extracto DCM
Marco
Material residualSub-extracto AcOEt
Hexano
DCM
AcOEt
MeOHExtrato MeOH
Avaliação da atividade antifúngica dos extratos pelo método de microdilución em caldo:
Ca: Candida albicans; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cn: Cryptococcus neoformans; Afum: Aspergillus fumigatus; Afl:Aspergillus flavus; An: Aspergillus niger; Mg: Microsporum gypseum; Tr: Trichophyton rubrum; Tm: Trichophytonmentagrophytes. ≥1000: no activo.
INACTIVO
Ying, B et. al. (1995) Phytochemistry 38, 909-15
Que pode ter pasao ?
Se evidenció que la actividad de Polygonum acuminatum se debía a los dialdehidos poligodial e isopoligodial,los cuales se inactivaban en MeOH.
Para comprobar que eran realmente los dialdehidos sesquiterpénicos los responsables de la actividad
Fizemos um estudo da variação doconteúdo de poligodial e relação de esteconteúdo com a atividade antifúngicaVariáveis
Coleta em diferentes estações do ano
Partes da planta
Solvente
Solvente
Se estudou o conteúdo de poligodial nas diferentes partes da planta nos diferentes solventes
folhas
frutos
tallos
raiz
Coleta em diferentes estações do ano
Extrato DCM
Verão
PrimaveraOutono Inverno
FOLHAS: Correlação do conteúdo de poligodial e a atividade antifungica em extratos DCM
Derita, M., et al., J. Ethnopharmacol. 124, 377‐383, 2009Derita M., et al., Biochem. System. Ecol. 36, 55‐58, 2008
Resumo:
A atividade antifúngica de Polygonum acuminatum se deve principalmente a poligodial, mas para mostrar atividade o extrato não deve ser alcoólico.
A atividade é maior em outono e em inverno em que a concentração de poligodial é maior.
O sucesso depende de muitos fatores
Panel de hongosprueba
Método semalvo específico
Extractos a probar
Metodologíaa utilizar
Método con alvoespecífico
Outrasestratégias
Mostras
Fungos
Candida albicans
C. tropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Cryptococcus neoformans
FUNGOS que atacam a humanos
leveduras fungos filamentosos
Microsporum gypseum
M. canis
Trichophyton rubrum
T. mentagrophytes
Epidermophyton floccosum
Aspergillus nIger
A. fumigatus
A. flavus
O ideal é usar um painel amplo
E também podemos usar fungos que atacam aos cultivos ou a animais
Vamos ver os resultados diferentes que se obtêm quando se usam diferentes tipos de fungos con Zuccagnia punctata Cav.
Quando a provamos contra fungos patogénicos oportunistas para o humano com método sem alvo específico
HEXANO
Material Vegetal ResidualAHex, FHex
DCM
ADCM, FDCM Material Vegetal Residual
MeOH
Frutos
AMeOH, FMeOH
BIOEN
SAiOS
Partes Aéreas
CIM de extratos de las partes aéreas
fueron aisladas dos chalconas como los compuestos responsables de la actividad.
No entanto, quando se provou Zuccagnia punctata Cav. Contra fungos que causam infecções em soja
O extrato DCM de partes aéreas
2',4'‐Dihidroxi‐3'‐metoxichalcona (1) 2',4'‐Dihidroxichalcona (2)
7‐Hidroxiflavanona (3) Cafeato de 1‐metil‐3‐(4'‐hidroxifenil)‐propilo (4)
Cafeato de 1‐metil‐3‐(3', 4'‐dihidroxifenil)‐propilo (5)
Comparação da atividade antifúngica (CIM em µg/mL) dos compostos 1-5 isolados de Z. punctata frente a tudo
o painel de fungos patogenicos para soja.
Svetaz L., et al., J. Agric. Food Chem. 52, 3297‐3300, 2004
O sucesso depende de muitos fatores
Panel de hongosprueba
Método semalvo específico
Extractos a probar
Metodologíaa utilizar
Método con alvoespecífico
Outras estratégias
Mostras
Fungos
Quais são os alvos possíveis para um fungo ?
Membrana citoplásmicaMembrana citoplásmica Pared celularPared celular Otras dianasOtras dianasMetabolismointermediarioMetabolismointermediario
A maioria de ANTIFÚNGICOS em uso clínico tem como alvo a membrana fúngica
Membrana
Un mecanismo muy importante es la UNIÓN AL ERGOSTEROL
de la membrana fúngica, que es el mecanismo por el que actúa
Anfotericina B
O
O
OHOH
OHOH
OH
OHOH
H3C
CH3
O
OH NH2OH
CH3
COOHHO
H3C
O
Anfotericina B
Que compostos se liberan ?
Que tienen un máximo de absorción a 260 nm
União ao ergosterol da membrana celular fúngica dos compostos isolados de Zuccagnia punctata
Composto antifungico
Se consideró que el ácido perclórico
produce un leakage celular del 100 %.
Sólo chalcona 2 resultó activa para este ensayo
Svetaz, L., et al., Planta Med. 73, 1074‐1080, 2007
ENSAIO PARA DETERMINAR ROTURA DA MEMBRANA
Panel de hongosprueba
Método semalvo específico
Extractos a probar
Metodologíaa utilizar
Método con alvoespecífico
Outras estratégias
Mostras
Fungos
Cambios en la morfología fúngica
permiten inferir que ese compuesto es antifúngico
y además da idea de su mecanismo de acción.
Seiler et al., MBC, 14, 4352‐4364, 2003Gunji, S. Agric. Biol. Chem. 47, 2061‐2069, 1983
Fitolacósido B
Phytolacca tetramera Hauman
Escalante A, et al. J Ethnopharmacol. 82, 29-34 2002.
(a) Cultivo controle; (b) Micrografías de contraste de fase (400x) deSaccharomyces cerevisiae em presença de Fitolacósido B (37 μM).
Escalante et al, J. Nat. Prod. 2008
Efeito de Fitolacósido B sobre
Saccharomyces cerevisiae
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB)
Crecimiento normalCrecimiento en presencia de Fitolacósido B
Escalante, A., et al., J. Nat. Prod., 71, 1720‐1725, 2008.
Comparação das atividades antifúngicas das chalconas mais ativas
Polygonum ferrugineum Wedd. (Polygonaceae)
pashanonaOOH
OHH3CO
H3CO
cardamoninaOOCH3
OHHO
OH
O
MeO
O
OMe
O
CIM= 5 μg/ml frente a dermatofitos
Configuración relativa ERITRO
Del arilo de Myristica fragrans (macis)
Crescimento normal
Crescimento em presença do neolignano
Crescimento de um fungo filamentoso
Zacchino, S. et al., J. Ethnopharmacol. 62, 35‐41, 1998.
O sucesso depende de muitos fatores
(CH 2)2N
O
O(CH3)2N
(CH 2)2N
O
O(CH3)2N
Filantimida
Phyllanthus sellowianus
Obtener análogos de Productos obtendios de plantas
Sortino, M., et al., Tetrahedron: Asimmetry 20, 1106–1108, 2009Sortino et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 560‐568, 2008López, S. et al. Arzn. Forsch. (Drug. Res.) 55, 123‐132, 2005.Zamora, et al., Intern. J. Quant. Chem. 93, 32‐46, 2003.
Sortino et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 560‐568, 2008Sortino et al., Tetrahedron: Asimmetry, 20 1106–1108, 2009López et al., Arzn. Forsch. (Drug. Res.) 55, 123‐132.Zamora et al., J. Quant. Chem. 93, 32‐46, 2003.
Qual estrategia escolher?
Todas as estratégias são úteis !!
É necessário usar las estratégias que tenemos y encontrar
novas estratégias que permitam aproveitar a grande diversidade química da natureza
Outra estrategia es voltar a testar os extratos inativos com outros bioensaios
Las metodologías se publicaron en un librocon el apoio de CYTED
CIBE, Merck Sharp & Dohme de España, Madrid
Instituto de Microbiología Bioquímica, Salamanca
Instituto de Salud Carlos III, Madrid
Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, IVIC , Caracas
Ciflorpan, Panamá
Instituto Malbrán, Buenos Aires
Universidad de San Carlos de Guatemala
CEREMIC, Farmacognosia y Biología Vegetal de Universidad Nac de Rosario
ISBN 978-950-9030-40-4
Mayo 2007
• Agencia de Promoción Científica y Tecnológica de la Argentina (ANPCyT)
• Organización de Estados Americanos (OAS)
• Programa Iberoamericano (CYTED)
• Internation al Foundation for Sciences (IFS)
• Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de Argentina (CONICET)
Agradecimientos
BoliviaDr A. GiménezBrasilDr V. Cechinel Filho (Itajaí) Dr R. YunesDr. M. FurlánDra S. Kuze RatesDra G. von PoserChile:Dr G. Schmeda Hirschmann Colombia:Dr. J. Quiroga Dr. V. Kouznetsov Costa RicaDra A. Pérez
MéxicoDr. R. Pereda Miranda (UNAM)Dr. L Peña Rodríguez, (Mérida)Dra R. EncarnaciónEspañaDr. A.San FelicianoDra. E. del OlmoDr.S. Cañigueral,Dra R. VilaDr A. DuránDr. J.C. RibasDra P. PérezParaguay: Dr E. FerroPanamá:Dr M. GuptaVenezuelaDr. G. VisbalDra G. San Blas Dr. J. Domínguez
Colaboraciones