definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana ( lipopolissacáride )

Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana

- Definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana (lipopolissacáride)

- Aplicação e abrangência

- Ações biológicas da endotoxina bacteriana

- Métodos de despirogenização e sua aplicação em produtos estéreis

- Produtos Apirogênicos

- Teste de pirogênio: método de detecção in vivo

- Teste de endotoxina : método de detecção in vitro – Kit LAL

- Vantagem e desvantagens dos métodos in vivo e in vitro

Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana

Pirogênio: Substância que induz a febre, proveniente de um produto injetável.

São divididos em 2 classes:

a) Pirogênios exógenos

b) Pirogênios endógenos

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Pirogênios exógenos: São substâncias originárias fora do corpo e induzem a elevações térmicas quando injetados em humanos e animais.

Ex.: Endotoxina bacteriana (lipopolissacarídeo)

Mais importante pirogênio exógeno.

Outros Pirogênios exógenos: bactéria, fungo, vírus e outros não microbianos, como por exemplo fármacos, esteróides, frações do plasma, e adjuvante sintético muramil dipeptídeo.Produtos estéreis = ausência de microrganismos viáveis e apirogênicos

Endotoxinas bacterianas: - São complexos de alto peso molecular associados a

membrana externa de bactérias Gram negativas, sejam elas patogênicas ou não.

- São altamente resistentes ao calor, dessecação, tratamentos químicos e pH extremos.

- São liberadas durante o processo de multiplicação bacteriana ou quando morrem.

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Cont. Endotoxinas bacterianas:

- Constituem maior fonte de pirôgenio para a Indústria Farmacêutica

* Diferença entre endotoxina e lipolissacarídeo (LPS)

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A atividade biológica da endotoxina está associada ao LPS da membrana externa de bactéria Gram negativa

Pirogênios endógenos: É produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênio exógeno.

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Produtos estéreis: ausência de m.o viáveis e apirogênicos

Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacterianaAplicação:

- Produtos farmacêuticos injetáveis , como fármacos, soluções de injetáveis de pequeno e grande volume.

- Produtos correlatos ligados a injetáveis ( seringas, agulhas, catéteres)

- Embalagens de acondicionamento de produtos injetáveis

- Próteses

- Fluidos para infusão

Ações Biológicas da Endotoxina Bacteriana

- São tóxicas para a maioria dos mamíferos- Quando injetadas - injeção de células vivas, mortas ou

purificadas (LPS), podem causar várias reações fisiológicas, tais como:

a) Febreb) Alteração na contagem de leucócitosc) Coagulação intravasculard) Hipotensãoe) Apatiaf) Dores de cabeçag) Convulsãoh) Até mesmo a morte

Devido a estes fatores, é de grande importância a detecção e eliminação das endotoxinas bacterianas de produtos

farmacêuticos injetáveis

Processos de Despirogenização

Existem 2 grandes classes de Processos de Despirogenização:

a) Processo de Inativação

b) Processo de Remoção

Processos de Despirogenização

Processo de Inativação da Endotoxina

1) Hidrólise ácido – básica ou alcalina- Reduz ou elimina a atividade do LPS, pela desativação do

lipídeo A ( considerado responsável pela ação biológica) HCl 0,05N por 30 min a 100ºC ouÁcido acético glacial 1% por 2 – 3 h a 100ºC

Aplicação: Despirogenização de materiais

Processos de Despirogenização

Processo de Inativação da Endotoxina

2) Oxidação

- Inativação oxidativa da endotoxina bacteriana com peróxido de Hidrogênio (H2O2). É dependente do tempo, pH e concentração.

Aplicação: Eliminação de pirogênio da água estéril para injeção USP, solução salina normal, salina dextrose, lavagem de componentes plásticos na fabricação de correlatos.

Vantagem : ausência de peróxido no final do processo

Outros produtos, porém com limitações: ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido nítrico, dióxido de selênio,entre outros.

Processo de Inativação da Endotoxina

3) Alquilação Um agente alquilante é o gás óxido de etileno, que, segundo

alguns estudos, pode promover a redução da atividade de endotoxinas bacterianas, além de promover a esterilização de produtos.

Aplicação: produtos médicos - hospitalares Outros agentes alquilantes: tratamento com anidridos acéticos e

succínico

Processos de Despirogenização

Processos de Despirogenização

Processo de Inativação da Endotoxina

4) Processo térmico – Calor seco

- Estufas- Túneis por convecção, condução ou irradiação

(Infravermelho)

Aplicação: Método de escolha para materiais temoresistentes, como frascos de vidro e instrumentos metálicos

Processo de despirogenização: Exposição do material a 250ºC , no mínimo por 30 min. Ocorre incineração.

Autoclavação não é efetiva para inativação de endotoxinas

Processo de Inativação da Endotoxina

5) Radiação Ionizante Cobalto ( Co60)

- Reduz a toxicidade de endotoxinas, porém, são dose dependentes.

- Pode aumentar alterações químicas desconhecidas em fármacos e soluções parenterais.

- Seu uso na despirogenização de materiais não tem sido considerado.

Seus riscos podem superar suas propriedades benéficas

Processos de Despirogenização

Processos de Despirogenização

Processo de Inativação da Endotoxina

6) Polimixina B

- Antibiótico pode anular a atividade do LPS.

- Mais estudos devem ser feitos, pois a Polimixina pode interferir no teste LAL ( para determinação de endotoxina bacteriana in vitro)

Processos de Despirogenização

Processo por Remoção de Endotoxina

1) Lavagem

- Método mais simples e um dos mais antigos para remoção de endotoxinas.

- Efetivo- Lavagem com solvente apirogênico : Água estéril para

injetáveis USP.

Aplicação: Vidrarias, dispositivos médicos, tampas e superfícies de materiais.

Processos de Despirogenização

Processo por Remoção de Endotoxina

2) Destilação

- Método mais antido para remoção de endotoxinas.

Mecanismo: Alteração de fase:

a) L para V – Água ( vapor) e LPS ( Líquido) LPS ( Alto peso molecular) : tende a cair, devido a gravidade.b) V para L – Água Condensa, sem as endotoxinas.

Aplicação: Remoção de pirogênio da água

Processo por Remoção de Endotoxina

3) Ultrafiltração- Utilização de membranas ultrafiltrantes

Tamanho da subunidade básica do LPS: 10.000 a 20.000 daltons.

Mecanismo: Filtros despirogenantes – exclusão por peso molecular / tamanho da partícula.

Aplicação: Fármacos (ex. antibióticos) e soluções de baixo a médio peso molecular.

Processos de Despirogenização

Processo por Remoção de Endotoxina

4) Osmose reversa

- Filtração sobre pressão .- Membranas constituída de acetato de celulose ou poliamida,

com pequenos poros para exclusão de partículas.

Mecanismo: Exclusão por tamanho - poros pequenos impedem a passagem de pirogênios.

Aplicação: Produção de água estéril para injeção. Método reconhecido pela USP, assim como o processo de Destilação.

- Consegue remover de 99,5 a 99,9 % da carga pirogênica do sistema.

Processos de Despirogenização

Processo por Remoção de Endotoxina

5) Carvão Ativado- Adição de carvão a solução- Pode ser aplicado em ampla faixa de pH

Mecanismo: Adsorção de partículas pirogênicas (endotoxina) , agitação e remoção do carvão por filtração.

Aplicação: Soluções de eletrólitos.

Limitações: - Pode ocorrer a adsorção de ingredientes ativos, devido sua

afinidade por subst. não ionizáveis de elevado peso molecular.

Processos de Despirogenização

Processos de Despirogenização

Processo por Remoção de Endotoxina

6) Atração por membrana hidrófoba

- Polímeros de polipropileno, polietileno, polifluoreto de vinilideno e politetrafluoretileno apresentam afinidade para ligação a endotoxina.

Mecanismo: Processo de microfiltração com estes materiais são empregados permitem efetiva eliminação de endotoxinas por ADSORÇÃO

Aplicação:Subst. instáveis hormônios, antibióticos e substâncias difíceis de despirogenizar pelos métodos tradicionais.

Produtos Apirogênicos:

È importante ressaltar que:

1) Apesar dos métodos de despirogenização, existem limitações ( natureza do produto, riscos envolvidos ou aspectos econômicos)

2) Deve – se avaliar a natureza do produto ara escolha do processo de despirogenização adequado.

3) É importante seguir a BPF, para que se possa obter um produto apirogênico e não haver necessidade de tratamentos adicionais

Teste de Pirogênio

1) Teste in vivo

2) Teste in vitro

Teste de Pirogênio : Método in vivo

- Também conhecido como Método biológico ou Método in vivo

- Teste de hipertermia realizado em coelhos.

- Consiste em injetar uma solução nas veias periféricas das orelhas de coelhos.

- Após a injeção, verifica-se se ocorre uma reação pirética, ou

seja, um aumento da temperatura do corpo do animal (febre).

- A elevação da temperatura indicará a presença de pirogênios na solução.

Teste de Pirogênio : Método in vitro

- Também conhecido como Teste LAL ou Método in vitro

- Teste LAL (Limulus Amebocyte Lysate): proteína de caranguejo

- Caranguejos de espécie Limulus polyphemus - Ocorre uma reação entre o componente proteico do LAL e a endotoxina bacteriana.

- Consiste em adicionar o reagente LAL , que é uma proteína que coagula ou gelifica na presença de endotoxinas bacterianas.

Teste de Pirogênio : Método in vitro

Métodos analíticos

1)Ponto Final de Gelificação

- Mais simples e amplamente utilizado- Consiste em adicionar solução e reagente em quantidades iguais

em tubo de ensaio despirogenizado.- Mistura-se LAL com a solução a ser analisada e incuba-se por

1h a 37ºC.- Inversão dos tubos a 180º

- Positivo: formação de gel- Negativo : não formação de gel

Métodos analíticos

2) Ensaio Turbidimétrico

- Permite medida quantitativa da endotoxina em diferentes faixas de concentração

- O método é baseado no fato em que: Aumento da concentração de toxina é proporcional ao aumento da turbidez da solução, devido a ppt de proteína coagulável.

- Mistura se a solução com o reagente e incuba-se para reação da endotoxina.

- Realiza-se a leitura em espectrofotometria de absorção, calculando-se a concentração (compara-se com padrão).

Teste de Pirogênio : Método in vitro

Questão Provão / ENADE – 2001

As diálises peritoneais, administradas em pacientes em hospitais, têm sido causa de infecções. As análises das soluções determinaram a presença de pirogênio.

a) Quais as consequências para um paciente que recebe formulações medicamentosas injetáveis contaminadas com pirogênio?

b) Como é realizada a pesquisa do pirogênio em medicamentos?