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Bastonetes gram-negativos: ecologia,
sistemática e fatores de virulência
Dra. Viviane Nakano
Curso de Pós-Graduação em Microbiologia
BMM 5753 – Bacteriologia de Anaeróbios
Introdução
Bactérias anaeróbias gram-negativas
Gênero Porphyromonas (assacarolíticos)
Gênero Prevotella (sacarolíticos)
Gênero Fusobacterium
Gêneros Bacteroides / Parabacteroides
Gênero Mitsuokella: M. dentalis
Outros gêneros: Selenomonas spp.; Centipeda spp.;Leptotrichia buccalis.
Caracterização dos microrganismos
• Bacilos anaeróbios estritos
• Não esporulados, imóveis
• Produtores de pigmento marrom a negro (alguns)
• Necessitam de hemina e menadiona
• Habitantes da microbiota indígena bucal, intestinal e
trato genito-urinário de humanos e animais.
Evolução taxonômica dos anaeróbios pigmentados
Bacterium melaninogenicus (1921)
não fermentadores (1962)
fracos fermentadores (1962)
fortes fermentadores (1962)
Subespécies assacharolyticus
(1977)
Subespécies intermedius (1977)
Subespécies melaninogenicus
(1977)
B. assacharolyticusB. endodontalis
B. gingivalis (1988)
B. melaninogenicusB. denticola
B. loeschii (1990)
B. intermediusB. corporis
(1990)
Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella
Gêneros
Porphyromonas Prevotella
P. assacharolyticaP. endodontalis P. gingivalis P. salivosa P. circumdentariaP. canorisP. cangingivalisP. cansulciP. crevioricanisP. gingivicanisP. gulae P. macacae P. levii
fracos fermentadores fortes fermentadores
P. corporisP. intermedia (1992)P. nigrescens (1992)P. pallens (1998)
P. melaninogenica P. denticolaP. loescheii P. tannerae
Jousimies-Somer, 1995; Könönen et al., 1998; Fournier et al., 2001
Espécies de Porphyromonas isoladas de humanos e animais
HumanosAnimal
P. asaccharolyticaP. endodontalis P. gingivalis P. catoniae
P. cangingivalisP. canorisP. cansulciP. circumdentariaP. crevioricanisP. gingivicanisP. leviiP. macacae P. gulae P. levii-like organismsP. endodontalis-like organisms
Jousimies-Somer (1997)
Prevotella: Espécies pigmentadas e não pigmentadas
Pigmentados
P. corporisP. denticolaP. intermedia P. melaninogenica P. nigrescensP. tannera
Não Pigmentados
P. bivia P. buccaeP. buccalis P. disiens* P. heparinolytica** P. oralisP. oris P. oulorumP. veroralis P. enoecaP. zoogleoformans**
* UV vermelho-amarelado ** Reagrupados no gênero Bacteroides
Jousimies-Somer (1997).
Prevotella spp. e Porphyromonas spp.
Cultura pura
Porphyromonas spp.
Fluorescência
Prevotella spp. e Porphyromonas spp.
Coloração de Gram
Gênero Fusobacterium spp.
F. alocis
F. necrophorum subsp. funduliforme
F. necrophorum subsp. necrophorum
F. nucleatum subsp. animalis
F. nucleatum subsp. fusiformis
F. nucleatum subsp. nucleatum
F. nucleatum subsp. polymorphum
F. nucleatum subsp. vicentii
F. varium
F. ulcerans Jousimies-Somer (1997).
Fusobacterium spp.
Cultura PuraÁgar Omata-Disraely
Fusobacterium spp.
Coloração de Gram
Família Bacteroidaceae - Gênero Bacteroides
Produtores de pigmento negro
Não produtores de pigmento negro
Assacarolíticos Sacarolíticos Bile-resistentesBile-sensíveis
Gênero Porphyromonas
Gênero Prevotella
B. capillosus Espécies intestinais: Bacteroides fragilis
Sacarolíticos
Shah e Collins (1989)
B. melaninogenicus
Shah (1992); Garrity e Holt (2001)
Porphyromonadaceae
Prevotellaceae
Família Bacteroidaceae - Gênero Bacteroides
Bacteroides fragilis (Grupo?)
Parabacteroides (distasonis e merdae)
Bacteroides gracilis (Campylobacter gracilis)
Bacteroides forsythus (Tannerella forsythia)
Bacteroides ureolyticus
Bacteroides capillosus
Gêneros Bacteroides e Parabacteroides
Bacteroidaceae
Bacteroides
Bacteroides fragilis
B. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. uniformis, B. caccae, B. thetaiotaomicron, B. eggerthii, B. stercoris.
Família
Gênero
Grupo
Espécies
“Grupo” Bacteroides fragilis
Novas espécies do gênero Bacteroides
Song et al. (2004)
Bacteroides nordii
Bacteroides salyersae
Kitahara et al. (2005)
Bacteroides plebeius
Bacteroides coprocola
Fenner et al. (2005)
Bacteroides massiliensis*
Song et al. (2005)
Bacteroides goldsteinii
Bakir et al. (2006)
Bacteroides intestinalis
Bacteroides dorei
Bacteroides finegoldii
* Isolado de sangue de recém-nascido
Song et al. (2004)
Bakir et al. (2006) Sakamoto & Benno (2006)
Novo gênero Parabacteroides
Meio BBE
Bacteroides fragilis Bacteroides fragilis
Cultura pura
Coloração de Gram
Grupo Bacteroides fragilis
Ecologia
Reguladores da Microbiota Intestinal e Bucal Autóctone
Produção de substâncias antagonistas
Bacteriocina
Auto-antagonismo Iso-antagonismo Hetero-antagonismo
Microbiota
Intestinal
Água contaminada (esgoto)
Abscessos
Sangue
Feridas cirúrgicas
HumanosAnimais
Microbiota
Bucal
Prevotella spp.
Porphyromonas spp.
Fusobacterium spp.
Bacteroides spp.
Prevotella spp.
Porphyromonas spp.
Fusobacterium spp.
Fatores de virulência e Patologias associadas
BACTÉRIAS
TRABALHANDO
Fatores de virulência
Adesinas* Cápsula Colagenase Protease
Edema e acúmulo de neutrófilos no sítio da infecção
Prevotella spp. e Porphyromonas spp.
*Fímbrias – fimA I, II, III, IV e V (apenas no gênero Porphyromonas)
Prevotella spp. e Porphyromonas spp.
Patologias associadas
• Abscesso cerebral, infecções de cabeça e pescoço e endocardites
• Infecções bucais
– Gengivite
– Periodontite
– Infecções endodônticas
Periodontite
Prevotella spp. e Porphyromonas spp.
Prevotella spp. e Porphyromonas spp.
Periodontite canina
Porphyromonas spp. - animal
46 com periodontite – 38 isolados + P. gulae
28 saudáveis – 15 isolados + P. gulae
Ativação do Complemento
Fusobacterium spp.
Hidrofobicidade
Estimulação de Linfócitos
Aderência aos tecidos do hospedeiro
(adesinas e fímbrias)
Metabólitos tóxicos(H2S)
Hemolisinas
(alfa e beta)
Fatores de virulência Patologias associadas
Fusobacterium spp.
• Abscesso cerebral, meningites, infecções pélvicas, trato respiratório superior e intra-abdominais.
• Infecções bucais
– Gengivite
– Periodontite
– GUN (gengivite ulcero-necrosante)
Fusobacterium nucleatum
Gengivite ulcero-necrosante (GUN)
Fusobacterium necrophorum
Pododermatite (caprinos e ovinos)
Dichelobacter (Bacteroides) nodosus
Fator de virulênciaEstágio da infecção
Cápsula polissacarídica
Fímbrias
Hemaglutininas
Hemolisinas
Neuraminidase
Fragilisina (Toxina)
Cápsula polissacarídica
Lipopolissacarídeo
Aminas
ADESÃO
ESTABELECIMENTO DA INFECÇÃO/DANO TECIDUAL
ANTIFAGOCITOSE
PRODUTO DO METABOLISMO
Principais fatores de virulência de Bacteroides
Lipopolissacarídeo
Componentes ausentes no LPS• 2-ceto-3-deoxioctanato (CDO) e heptose – polissacarídeo interno
• ácido 3-hidroxi-tetradecanóico – lipídio A
Madigan et al., 2010
Cápsula
(120.000 X) (27.400 X)
Kasper (1976); Nakano (2006)
Cápsula
B. fragilis - três tipos reversíveis de cápsula:
grande, pequena e camada eletrodensa
(52.000 X)
Resistência ao soro
Reid e Patrick (1984)
Antifagocitose
Processo de adesão
Cápsula
Formação de abcessos
Fatores de virulência
Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.
Adesão de Bacteroides às células HEp-2
Nakano et al. (2008)
Adesão localizada
E. coli O127:H6
B. ovatus
B. vulgatus
B. fragilis
Adesão – Caco-2, WiDr (intestinal)
Padrão de adesão não definido
Invasão de Bacteroides e Parabacteroides às células HEp-2
B. fragilis
B. vulgatus
P. distasonis
Microscopia confocal
PI – Iodeto de Propídio (vermelho)
Marcador de DNADiOC – Iodeto diexiloxacarbocianina (verde)
Marcador de membrana celular
Nakano et al. (2008)
Fatores de virulência
Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.
Adesão de B. fragilis em células HT-29
Pumbwe et al. (2007)
BSC: Sais biliares conjugado
BSM: Sais biliares (mistura)
Biofilme de B. fragilisAdesão de B. fragilis em células HT-29
Pumbwe et al. (2007)
Pumbwe et al. (2007)
Tratada com BSM
Tratada com BSC
Não tratada
Fímbrias
Vesículas de membrana externa
Neuraminidase
Neuraminidase (sialidase)
Cliva ácidos siálicos
(ácido N-acetil neuramínico)
células eucarióticas - imunoglobulinas
contribuiçãoNutrição Aderir, invadir e destruir tecidos
Fatores de virulência
Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.
Neuraminidase
Eritrócitos
+
Bactéria (108 cél/ml)
+
PNA* – lectinade amendoim
=
Neuraminidase
Hemaglutinação
*Peanut Arachis hypogaeNakano et al. (2006)
1 2 3 4 5 6 7 8 bp
648
Detecção do gene nanH por Nested-PCR
nanH – apenas a espécie B. fragilis
Nakano et al. (2005)
Produção da neuraminidase e detecção do gene nanHem espécies do grupo B. fragilis isoladas de fezes
diarréicas (51) e não diarréicas (50)
Neuraminidase
Origem das Bactérias Produção Presença do gene
(n) n (%) n (%)
Pacientes (51) 42 (82,3) 29 (56,8)
Sadios (50) 43 (86) 37 (74)
TOTAL (101) 85 (84,1) 66 (65,3)
Nakano et al. (2006)
Enterotoxina
Toxina
Bacteroides fragilis (ETBF)
Animais (Myers et al., 1984)
Humanos (Myers et al., 1987)
Diarréia
Metaloprotease (Moncrief et al., 1995; Obiso et al., 1997)
Familia metzincina: fragilisina
Zinco – estaliza e potencializa
Histidina – essencial para o zinco
Metionina – integridade da ligação
Populações genéticas de Bacteroides fragilis
Padrão I (ETBF)
Padrão II (NTBF)
Padrão III (NTBF)
Região de 6-kb – BfPAI
Região de 12-kb – Região lateral
bft mpII
Região de 18-kb
Sears (2001)
DNA cromossômico
Padrões genéticos B. fragilis não enterotoxigênico (NTBF) de humanos e bezerros
Bactérias Humanos Animais
(n) n (%) n (%)
NTBF padrão II 33 (62,2) 40 (80)
NTBF padrão III 20 (37,7) 10 (20)
TOTAL 53 (100) 50 (100)
Oliveira et al., 2005
Teste citotóxico de ETBF em células HT-29/C1
Controle ETBF
Nakano et al. (2005)Outras linhagens : Caco-2, T84
Mecanismo de ação da toxina
Tight junctionsE-caderina
BFT
Etapa 1
BFTMicrovilosidades
Zônula de oclusão
Zônula de aderênciaEtapa 2
Citocinas (IL-8) – leucócitos – reação inflamatória – efeito secretor
Etapa 3
Secreção de fluídos
Mecanismo in vivo
DIARRÉIA
Sears (2001)
Distribuição mundial de organismos ETBF associados à diarréia infantil
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
EUA It ália Bangladesh Calcut á Japão Brasil (SP) Nicaraguá Vietnam Turquia Brasil (MG) Brasil (SP)
%
Crianças com diarréia
Crianças sem diarréia
(1992) (1994) (1994) (1997) (1999) (2000) (2000) (2005) (2005) (2010) (2011)
294
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
190
bp
bft
bft-1
Detecção do gene bft (PCR) e subtipo bft-1(Multiplex-PCR)
Nakano et al. (2005)Três subtipos: bft-1, bft-2 e bft-3.
Fatores de virulência
Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.
Inoculação intra-gástrica em camundongos isentos de germes
Colonização e patogenicidade de B. fragilis enterotoxigênicos
Nakano et al. (2006)
Alterações histopatológicas do produzidas nos camundongos
SubtiposÓrgãos
Ceco Cólon Fígado
bft-1
Edema moderado e aumento da lâmina
própria. Erosão extensiva e perda da camada superficial epitelial
bft-2Extensiva e proeminente
ulcerações. Erosões superficiais.
Edema e aumento das células da lâmina própria
Edema moderado e aumento da lâmina própria
Estrutura lobular preservada sem alterações degenerativas difusas, mas
com raros focos de células inflamatórias
Congestão difusa com poucas células inflamatórias
Nakano et al. (2006)
Aspectos histopatológicos do intestino grosso de camundongos
bft-1 bft-2
Não ETBFNakano et al. (2006)
Fatores de virulência
Sears, (2009)
Fatores de virulência
Fatores de virulência
Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.
Diversidade genética de ETBF humanos (AP-PCR)
Nakano et al., (2007)ATCC/GAI: bft-2
Importância clínica e patologias associadas
• Gêneros Bacteroides e Parabacteroides - microbiota
intestinal - predominantes: B. vulgatus, P. distasonis e
B. thetaiotaomicron (1010g/fezes).
• Abscessos e infecções extra-intestinais, sendo B.
fragilis a mais frequentemente.
• Infecções intestinais: associação com outros
enteropatógenos – diarréia (ETBF).
Bacteroides fragilis
Fascite Necrosante Peritonite
Abscesso hepático
Conclusões
- Anaeróbios gram-negativos predominantes e
clinicamente mais relevantes - infecções do trato
gastro-intestinal;
- São altamente heterogêneos – reclassificação;
- Apresentam elevada diversidade genética.
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