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CULTURA DE TECIDOS: HISTÓRICO, CONCEITOS, APLICAÇÕES E ORGANIZAÇÃO

DO LABORATÓRIO

Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi

AF073 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL

CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS

1.HISTÓRICO

2.CONCEITOS

3.APLICAÇÕES

4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO

1.HISTÓRICO

-Haberlandt (1902) - 1º cultivo de células em soluçãonutritiva.

Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien., Math. – Naturwiss. K., Abt. (1):111, 69-92. 1902.

“Experiments on the culture of isolated plant cells”. The BotanicalReview, Berlin, 35(1):68-88, 1969. (Tradução para inglês).

-Hannig (1904) - 1º cultivo de embriões imaturos-Knudson (1922) - 1º cultivo de embriões de orquídeas-White (1934) - Cultivo de ápices radiculares de tomate em meio líquido-Kogh et al. (1934) - Descoberta do AIA

Gottlieb Haberlandt

-Miller et al. (1955) - Descoberta da cinetina

-Skoog e Miller (1957) - Experimento clássico com calo de fumo – Balanço auxina/citocinina

-Skoog e Tsui (1948) - Formação de partes aéreas e raízes em calos de fumo

Folke Skoog

-Morel e Martin (1952) - Obtenção de dália livre de vírus.

Carlos Miller

Skoog, F. and Miller, C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental

Biology, 11, 118-131. 1957.

Morel, G. and Martin, C. Guerison de dahlias atteints d’ une maladie a virus. Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences, 235:1324-1325, 1952.

-Steward et al. (1958) e Reinert (1959) - Obtenção de embriões somáticos em calos de cenoura-Morel (1960) - Obtenção de orquídeas livre de vírus-Cocking (1960) - Obtenção de protoplastos

-Murashige e Skoog (1962) - Meio de cultura MS-Takebe et al. (1971) - Obtenção de plantas a partir de protoplastos-Murashige et al. (1972) - Microenxertia em Citrus

Toshio Murashige

-Carlson et al. (1973) - Primeira hibridação somática em fumo.-Larkin e Scowcroft (1981) – Variação somaclonal

Biologia molecularTransformação genética de plantas

DESENVOLVIMENTO

Alterações que ocorrem no organismo ao longo do seu ciclo de vida nos níveis morfológico, fisiológico e bioquímico.

Ex: evolução da fase embrionária para planta.Ex: mudança da fase vegetativa para reprodutiva.

CRESCIMENTO

Mudanças quantitativas irreversíveis.Ex: aumento de biomassa.Ex: aumento de comprimento.

DIFERENCIAÇÃO

Processo pelo qual as células, os tecidos ou órgãos durante odesenvolvimento, adquirem propriedades metabólicas, estruturais efuncionais distintas daquelas iniciais.

DIFERENCIAÇÃO OCORRE PELA REGULAÇÃO NA ESPRESSÃO GÊNICA

2.CONCEITOS

DESDIFERENCIAÇÃO CELULAR

Retorno de células diferenciadas ao estado meristemático não diferenciado.

INDUÇÃO

É o desencadeamento de um processo morfogenético pela exposiçãodo explante a um estímulo físico, químico ou biológico. A indução envolve ocontrole da expressão gênica, embora não seja um fenômeno genético, pois nãoocorre ganho ou perda genética (modificação alélica ou genotípica). Refere-sesomente a expressão dos genes pré existentes. Em cultura de tecidos, é asinalização por um fitormônio a uma resposta específica a nível celular.

EPIGÊNESE

Ativação seletiva e diferencial de genes, envolvendo células receptivasou tecidos responsivos.

TOTIPOTÊNCIA

HABERLANDT (1902)

●“As plantas são agregados de seresindividuais e independentes, denominadosde células”●“Células dão origem aos tecidos”

●“As células são as unidades funcionais detodos os seres viventes”

●“Toda a célula nasce de outra célula”

Rudolf Virchow (1858)

Schleiden (1838) & Schwann (1839)

“Toda célula vegetal íntegra possuicapacidade para reproduzir um organismointeiro”.

“TEORIA CELULAR”

(Ideias ainda incompletas)

DETERMINAÇÃO

Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célulatorna-se limitado a uma rota específica de morfogênese. A determinaçãocelular diz respeito a uma canalização progressiva no desenvolvimento.

COMPETÊNCIA

Capacidade das células reagiram a sinais específicos dedesenvolvimento. Capacidade das células de expressar um potencial inerente.

MORFOGÊNESEIntegração entre crescimento (mudanças quantitativas) e

diferenciação (alterações qualitativas), mediada por divisão e especialização celular. A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, através da regulação e expressão de sistemas gênicos múltiplos.

CÉLULAS INDIFERENCIADAS

São células que mantém ascaracterísticas embrionárias. Sãoisodiamétricas, pouco ou nenhum vacúoloe núcleo grande. Encontram-se nasregiões meristemáticas e embriões.Possuem grande capacidade de divisãocelular.

CLONES

Conjunto geneticamente uniforme de indivíduos, derivados de umúnico indivíduo por propagação assexuada.

CALOS

Agregados celulares desorganizados que se originam pelaproliferação desordenada de células a partir de tecidos cultivados in vitro.

ÁPICE CAULINAR

Porção apical do caule, composto pelomeristema apical mais alguns primórdios foliares.

MERISTEMA

Conjunto de células indiferenciadas e decaracterísticas embrionárias, de reduzido tamanho,localizado na porção mais apical das gemas e raízes.

EXPLANTE

Segmento de tecido ou órgão vegetal que éintroduzido in vitro ou subcultivado durante osprocessos de cultura de tecidos.

MeristemaPrimórdios foliares

•Produção de mudas em larga escalaMicropropagação (organogênese e embriogênese)

•Produção de material de propagação sadio (livre de virus)Cultura de meristemas + TermoterapiaMicroenxertiaCrioterapia (técnica nova)

•Resgate de embriões de cruzamentos difíceisCultivo de embriões zigóticos

•Conservação de germoplasmaConservação in vitro

Criopreservação

•Obtenção de duplo haploides Cultura de anteras + duplicação cromossômica

•Obtenção de híbridos somáticosFusão de protoplastos

3.APLICAÇÕES

•Produção de material de propagação sadio (livre de virus)

Cultura de meristemaMicroenxertia

•Produção de mudas em larga escala

CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p. 112-118, 2009.

Embriogênese somática e produção de sementes sintéticas

•Resgate de embriões de cruzamentos difíceis

Resgate de embriões de videira

Ohnishi et al. (Plant and Cell Physiology 52(7):1249-57. 2011).

Resgate de embriões de arroz

Buttibwa et al. African Journal of Biotechnology. 14(27):2191-2201. 2015

Resgate de embriões de mandioca

•Conservação de germoplasma

Embrapa Clima Temperado

Rayssa Natasha Barros Mafra & Victor Spieshttp://www.ebah.com.br/content/ABAAAfW-EAF/criopreservacao

Conservação in vitro

Fayos et al. Frontiers in Plant Science. 6:384. 2015.

Produção de duplo-haplóide de alho

•Obtenção de duplo haploides

Fig. 1 Plant regeneration from protoplast fusion experiment of a grass cultivar with a wild species. http://en.phytowelt.com/phytodiversity.html

• Obtenção de híbridos somáticos

Cultura e fusão de protoplastos

Fig. 2 Tubers of different somatic hybrids in comparison to the fusion partners (cultivar: upper lines, wild species: lower lines, hybrids: in-between).

ESTRUTURA BÁSICA DE UM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS

1.Sala de preparo de meio de cultura2.Sala para manipulações assépticas3.Sala de crescimento climatizada4.Sala de lavagem de vidraria5.Escritório6.Banheiro

AMBIENTES ADICIONAIS

1.Antecâmara2.Almoxarifado3.Sala de microscopia4.Sala de biologia molecular

ESTRUTURAS EXTERNAS

1.Ambiente para transferência ex vitro2.Casa-de-vegetação3.Telados4.Depósitos

4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO

Planta de uma biofábrica

Fonte: Rocha (2009)

EQUIPAMENTOS BÁSICOS

1.Sala de preparo de meio de cultura*Balança*pHmetro*Agitador magnético*Microondas*Destilador ou Deionizador*Refrigerador*Freezer

2.Sala para manipulações assépticas*Câmara de Fluxo Laminar*Microscópio Estereoscópico

3.Sala de crescimento climatizada*Ar condicionado*Timer para controle de fotoperíodo

4.Sala de lavagem de vidraria*Autoclave

1. SALA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA

2. SALA DE MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA

3. SALA DE CRESCIMENTO CLIMATIZADA

*CONTROLE DE LUZ:- Fotoperíodo: 16 horas- Intensidade luminosa: 20 a 50 µmol.m-2.s-1

- Tipos de lâmpadas: -Fluorescentes-LED

*CONTROLE DE TEMPERATURA:- Geralmente 25° C- Ar condicionado

*EQUIPAMENTOS:-BOD-Agitadores

NOVAS ALTERNATIVAS: Uso da luz naturalSistemas autotróficos

-Aumento do CO2-Aumento da Intensidade luminosa-Redução da sacarose

4. SALA DE LAVAGEM DE VIDRARIA

AMBIENTE PARA TRANSFERÊNCIA EX VITRO

CASA-DE-VEGETAÇÃO PARA ACLIMATIZAÇÃO