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“Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos
de antígeno (CAR) ativadores e inibitórios”
Leonardo Chicaybam Peixoto
Rio de Janeiro
Julho 2010
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSO
EM ONCOLOGIA
ii
“Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos
de antígeno (CAR) ativadores e inibitórios”
Leonardo Chicaybam Peixoto
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Senso do Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Oncologia.
Orientador: Martin Hernán Bonamino
Divisão de Medicina Experimental – Centro de Pesquisa – Instituto Nacional de Câncer
Rio de Janeiro
Julho 2010
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Chicaybam, Leonardo Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos de antígeno (CAR) ativadores e inibitórios Orientadora: Martin Hernán Bonamino Dissertação: Mestre em Oncologia Programa de Pós-Graduação em Oncologia 85 páginas 1 - Linfócito T 2 - Leucemia Linfóide Aguda 3 - Receptor Quimérico de Antígeno 4 - Terapia Gênica
iv
Este trabalho foi realizado na Divisão de Medicina Experimental do Centro de Pesquisa - Instituto Nacional de Câncer, sob orientação de Martin Hernán Bonamino. Contou com o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), Fundação do Câncer e Ministério da Saúde/INCA, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
v
FOLHA DE APROVAÇÃO
Leonardo Chicaybam Peixoto
“Construção e validação de um sistema de receptores quiméricos de antígeno
(CAR) ativadores e inibitórios”
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Oncologia do
Instituto Nacional de Câncer (INCa), visando à obtenção do título de Mestre em Oncologia
___________________________________________________________________________ Dr. José Andrés Yunes, Centro Infantil de Investigações Hematológicas Dr. Domingos A. Boldrini (Membro Titular da Banca) ___________________________________________________________________________ Dra. Hilda Petrs Silva, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ (Membro Titular da Banca) ___________________________________________________________________________ Dr. Claudio Gustavo Stefanoff, Serviço de Pesquisa Clínica, INCa (Membro Titular da Banca) __________________________________________________________________________________ Dr. João P. B.Viola, Divisão de Biologia Celular, INCa (Suplente) ___________________________________________________________________________ Dra. Cinthya Sternberg, Serviço de Pesquisa Clínica, INCa (Suplente)
vi
AGRADECIMENTOS
- Aos meus pais, Vicente e Maria Emília, por todo o apoio e incentivo que me deram desde o
início. Graças à grande educação que eles me deram, consegui chegar até aqui. Obrigado
também pelo carinho e amor que recebo diariamente.
- Aos meus irmãos, Gustavo e Mariana, que apesar de todos os desentendimentos, são muito
importantes na minha vida.
- À todos os integrantes da família Chicaybam e da família Peixoto, pelas festas animadas e
cheias de comida, pelas viagens ao Sítio, pelas reuniões de domingo, pelas conversas cheias
de besteiras. Em especial, ao meu avô Nacyr Chicaybam, que sempre me incentivou a fazer
medicina, e à Tia Olívia, que sempre me incentivou a fazer biologia. Apesar de não ter feito
nenhum destes cursos, o apoio deles foi essencial para eu achar o meu caminho.
- Ao Martin, meu orientador, por estar sempre presente no laboratório e pronto a nos ajudar.
Obrigado pela enorme paciência, pela dedicação, pelos ensinamentos, pelas piadas engraçadas
e pelas piadas sem graça.
- À Carol, minha companheira de grupo, que após 5 anos de convivência diária, virou
praticamente minha irmã. Agradeço por sua enorme paciência, por aturar minhas manias e
meu jeito implicante, por estar (quase) sempre de bom humor, pelas discussões sobre
experimentos, pelas discussões sobre a vida, por me abrigar em sua casa quando preciso, pelas
festas, pelos bares. Obrigado por tudo.
- Ao MartinLab: Andressa, Bianca, Carol, Luiza, Ana Emília, Jackline e Tonho. Obrigado
pela companhia no laboratório e pela ajuda com experimentos.
vii
- Ao Gui, Rafaela Samico (Samicão), Thaís, Carol, Rômulo Galvani, Haynna e Gabi, grandes
amigos que fiz durante a faculdade. Obrigado pelas viagens, bares, festas, vôlei, conversas
jogadas fora, enfim, por estarem presentes em minha vida.
- Aos amigos de Niterói Leo Jorge, Mateus, Giulia, Leo Navarro, Leo Marafoni, Aline, Gabi,
Diogo, Nino, Tainá, Taiana, pelo companheirismo e apoio de sempre.
- Ao pessoal da MEDEX: Rômulo “Paca” Areal, João Luiz, Ana Paula, Poliana, Rômulo
Galvani, Heitor, Ana Merc, Suelen, Tatiana, Luciana, Aline. Obrigado por tornar o laboratório
um bom lugar de se trabalhar, pela ajuda em experimentos e pelas dúvidas tiradas.
- Ao pessoal da BIOCEL: Bruno Robbs, Flávia, Patrícia, Douglas, André, Giuliana, Renata.
Agradeço pela paciência, pela discussão de experimentos e por toda a ajuda que vocês me
deram.
- À Sueli, Thaís, Andréia e a todos os funcionários do INCa que sempre ajudaram com muita
boa vontade.
- Ao suporte financeiro: FAF/ INCa - Ministério da Saúde, CNPq e FAPERJ que colaboraram
para a execução do trabalho.
viii
RESUMO
O uso da transferência adotiva de linfócitos T para o tratamento do câncer tem sido dificultado
pela baixa persistência e avidez das células infundidas e pela dificuldade de isolar e expandir
linfócitos reativos contra o tumor. Além disso, as células tumorais apresentam diversos
mecanismos de escape, como a diminuição da expressão de MHC de classe I, levando a um
menor reconhecimento do tumor pelos linfócitos. A utilização de receptores quiméricos de
antígeno (CARs) permite evitar alguns desses problemas. Os CARs redirecionam a
especificidade dos linfócitos, reconhecendo o antígeno alvo com alta afinidade e de modo
MHC-independente. Esses receptores são capazes de ativar as células através de domínios
citoplasmáticos de ativação derivados de moléculas como CD3ζ ou 4-1BB, por exemplo. No
contexto da leucemia linfóide aguda de precursores B (BCP-ALL), linfócitos redirecionados
contra a proteína CD19 poderiam ser usados clinicamente, visto que os blastos leucêmicos
expressam este antígeno. No entanto, como o CD19 é expresso por toda a linhagem B, isto
poderia acarretar efeitos colaterais como a depleção de células B maduras. Como as células B
maduras expressam CD19 e CD20, nós propomos a criação de um CAR inibitório que
reconheça o antígeno CD20, permitindo que o sistema discrimine entre os blastos leucêmicos
e as células B maduras, resultando na eliminação apenas da neoplasia. Como um sistema
repórter de ativação para testar nossa hipótese, células da linhagem Jurkat expressando o
plasmídeo pGL4.30 – que expressa a proteína luciferase sobre o controle de um promotor
responsivo a NFAT – foram geradas. Como células alvo nós utilizamos a linhagem K562
modificada para expressar CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) ou CD19 e CD20 (K5-DUPLA).
Três diferentes CARs inibitórios anti-CD20 foram construídos por SOE-PCR, contendo
domínios de sinalização dos receptores inibitórios CTLA-4, PD-1 ou BTLA. Células Jurkat
ix
expressando o CAR de ativação 19BBz apresentaram alta atividade de luciferase quando co-
cultivadas com K5-19 ou K5-DUPLA. No entanto, células Jurkat expressando o CAR de
ativação 19BBz e um CAR de inibição apresentaram uma grande redução na atividade de
luciferase quando foram co-cultivadas com a K5-DUPLA, enquanto mantiveram alta atividade
quando co-cultivada com a linhagem K5-19. Além disso, os receptores contendo o domínio de
sinalização de CTLA4, PD-1 ou BTLA induzem também uma diminuição significativa do
marcador de ativação CD69 em células ativadas após interação com as linhagens alvo. Para
validar estes resultados in vivo nós estabelecemos um modelo de melanoma utilizando a
linhagem B16F10 expressando os antígenos alvo CD19 e/ou CD20. Para aumentar a
persistência e função das células infundidas tratamos os camundongos com tumores
estabelecidos com 100mg/kg de ciclofosfamida. Este tratamento resultou em uma profunda
linfopenia e depleção de células T reguladoras, podendo ser usado em conjunto com a
transferência de linfócitos T. Com isso, podemos concluir que o sistema repórter de ativação
utilizando a linhagem Jurkat foi estabelecido e foi capaz de mostrar a funcionalidade dos
CARs de ativação e inibição. A diminuição da molécula CD69 em células Jurkat ativadas
sugere que os CARs inibitórios são funcionais. Como perspectivas, iremos transduzir células
T primárias murinas, permitindo a validação dos CARs ativadores/inibitórios in vitro
(secreção de citocinas, atividade citotóxica) e in vivo (modelo B16F10).
x
ABSTRACT
Use of adoptive transfer of T lymphocytes for cancer treatment has been hampered by low
avidity and persistence of the infused cells and the difficulty of isolating and expanding
reactive lymphocytes against the tumor. Moreover, tumor cells have several escape
mechanisms, such as decreased expression of MHC class I, leading to diminished tumor
recognition by lymphocytes. The use of chimeric antigen receptors (CARs) avoids some of
these problems. The CARs redirect the specificity of lymphocytes, recognizing the target
antigen with high affinity and in a MHC-independent fashion. These receptors are capable of
activating cells through cytoplasmatic domains derived from molecules such as CD3zeta or 4-
1BB, for example. In the context of B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-
ALL), lymphocytes redirected against the CD19 protein could be used clinically, as the
leukemic blasts express this antigen. However, as CD19 is expressed throughout the B
lineage, this could induce side effects such as depletion of mature B cells. Because mature B
cells express CD19 and CD20, we propose the creation of an inhibitory CAR that recognizes
the CD20 antigen, allowing the system to discriminate between leukemic blasts and mature B
cells, resulting in the elimination of only the tumor cells. As an activation reporter system to
test our hypothesis, Jurkat cell line expressing plasmid pGL4.30 - which expresses the
luciferase protein under the control of a NFAT responsive promoter - were generated. As
target cells we used the K562 cells modified to express CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) or
CD19 and CD20 (K5-DUPLA). Three different inhibitory CARs anti-CD20 were constructed
by SOE-PCR, containing the signaling domains of the inhibitory receptors CTLA-4, PD-1 or
BTLA. Jurkat cells expressing activating CAR 19BBz showed high luciferase activity when
co-cultured with K5-19 or K5-DUPLA. However, Jurkat cells expressing 19BBz CAR and
xi
one of the inhibitory CARs showed a large reduction in luciferase activity when they were co-
cultured with the K5-DUPLA, while maintaining high activity when co-cultured with the K5-
19 target. Furthermore, receptors containing the signaling domain of CTLA4, PD-1 or BTLA
also induced a significant decrease in the activation marker CD69 on activated cells after
interaction with the target cell lines. To validate these findings in vivo we established a model
using the melanoma cell line B16F10 expressing the target antigens CD19 and / or CD20. To
increase the persistence and function of the infused cells mice with established tumors were
treated with 100mg/kg of cyclophosphamide. This treatment resulted in a profound
lymphopenia and depletion of regulatory T cells, which can be used in conjunction with the
transfer of T lymphocytes. We can conclude that the activation reporter system using Jurkat
was established and was able to show the functionality of activating and inhibitory CARs. The
decrease of CD69 molecule on activated Jurkat cells suggests that the inhibitory CARs are
functional. As perspective, we will transduce primary murine T cells, allowing the validation
of activating / inhibitory CARs in vitro (cytokine secretion, cytotoxic activity) and in vivo
(B16F10 model).
xii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (antibody-dependent
cellular citotoxicity)
AICD Morte celular induzida por ativação (activation induced cell death)
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida (acquired immunodeficiency
syndrome)
APC Célula apresentadora de antígeno (antigen presenting cell)
BCR Receptor de célula B (B cell receptor)
CAR Receptor quimérico de antígeno (chimeric antigen receptor)
CD Cluster designation
CDC Citotoxicidade dependente de complemento (complement-dependent
cytotoxicity)
CDR Região determinante de complementariedade (complementarity
determining regions)
CLP Progenitor linfóide comum (common lymphoid progenitor)
CMP Progenitor mielóide comum (common myeloid progenitor)
CsA Ciclosporina A
DC Célula dendrítica (dendritic cell)
DECH Doença enxerto contra hospedeiro
DLI Infusão de linfócitos do doador (donor lymphocyte infusion)
DNA Ácido desoxirribonucléico
EAE Encefalomielite autoimune experimental
xiii
EBV Vírus Epstein-Barr
ECL Enxerto contra a leucemia
GFP Proteína verde fluorescente (green fluorescent protein)
HIV Vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency virus)
HLA Antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen)
HPV Vírus do papiloma humano (human papilloma virus)
HSC Célula tronco hematopoiética (hematopoietic stem cell)
IFN Interferon
IRES Sítio interno de entrada do ribossomo (internal ribosome entry site)
ITAM Motivos ativadores baseados em tirosina dos imunoreceptores
(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)
ITIM Motivos inibitórios baseados em tirosina dos imunoreceptores
(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)
ITSM Motivos de troca baseados em tirosina dos imunoreceptores
(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)
LLA Leucemia linfóide aguda
LMC Leucemia mielóide crônica
mHAgs Antígenos de histocompatibilidade menor (minor histocompatibility
antigens)
MHC Complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility
complex)
MLV Vírus da leucemia murina Moloney (Moloney murine leukemia virus)
MOI Multiplicity of infection
xiv
NK Assassino natural (natural killer)
PBMC Célula mononuclear de sangue periférico (peripheral blood mononuclear
cell)
PBS Salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline)
PCR Reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)
PMA Forbol miristato acetato (phorbol miristate acetate)
RNA Ácido ribonucléico
RT Transcrição reversa (reverse transcription)
scFv Fragmento variável de cadeia única (single chain variable fragment)
SOE Splicing by overlapping extension
TAA Antígeno associado ao tumor (tumor-associated antigen)
TCR Receptor de célula T (T cell receptor)
TIL Linfócito infiltrante do tumor (tumor-infiltranting lymphocyte)
TNF Fator de necrose tumoral (tumor necrosis factor)
TPH Transplante de precursores hematopoiéticos
TSA Antígeno específico do tumor (tumor-specific antigen)
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Taxas de recaída após TMO alogênico e singênico.
4
Figura 2 – Anticorpos.
6
Figura 3 – Gráfico ilustrando a evolução das taxas de respostas objetivas em pacientes
com melanoma metastático após tratamento com imunoterapias.
15
Figura 4 – Desenho esquemático representando a estrutura padrão do receptor
quimérico.
19
Figura 5 – Esquema simplificado da sinalização iniciada pelo complexo TCR-CD3.
21
Figura 6 – Esquema mostrando os receptores da família CD28 e TNF.
24
Figura 7 – Esquema ilustrando as principais vias ativadas por CD28.
25
Figura 8 – Esquema apresentando os principais efeitos da estimulação via 4-1BB.
27
Figura 9 – Esquema da ontogenia da linhagem B, apresentando os principais
marcadores.
30
Figura 10 – Representação esquemática dos mecanismos de ação dos receptores
inibitórios da família CD28.
34
xvi
Figura 11 – Esquema demonstrando o princípio da eventual terapia utilizando o
sistema de CARs ativadores / inibitórios.
37
Figura 12 – Ensaio de luciferase, comprovando a funcionalidade do sistema repórter de
ativação e do receptor quimérico.
38
Figura 13 – Esquema mostrando os CARs inibitórios previamente construídos e
clonados no vetor pCR2.1.
39
Figura 14 – Clonagem dos CARs inibitórios.
48
Figura 15 - Avaliação da expressão dos CARs inibitórios após transdução com vetor
retroviral e duas semanas de seleção com G418/puromicina.
50
Figura 16 - Avaliação da expressão dos CARs inibitórios na Jurkat por western blot
utilizando o anticorpo ααααFab-biotina/estreptavidina-HRP.
51
Figura 17 – Resultado do ensaio de luciferase, demonstrando a capacidade dos CARs
inibitórios de inibir a translocação de NFAT para o núcleo.
53
Figura 18 – Avaliação da expressão do marcador de ativação CD69 após 24 horas de
incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina (P+I).
54
Figura 19 – Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A, como
esquematizado no painel A.
57
xvii
Figura 20 – Análise de citometria de fluxo das células Jurkat transduzidas com os
vetores lentivirais EF1αααα-19BBz-2A-20PD1 PURO (A) ou EF1αααα-20z-2A-1941BB GFP
(B).
58
Figura 21 – Ensaio de luciferase para validação do sistema de expressão baseado no
peptídeo 2A.
59
Figura 22 – Análise da expressão de CD19 e CD20 na linhagem B16F10 após
transdução e purificação por sorting.
60
Figura 23 - Cinética de crescimento tumoral das linhagens B16 CD20 (A) e B16 CD19
(B) injetadas por via subcutânea.
61
Figura 24 - Marcação das linhagens B16-CD19 (A) e B16-CD20 (B) após passagem in
vivo.
61
Figura 25 - Avaliação da linfopenia (A) e percentual de células T reguladoras (Treg) (B)
após administração de ciclofosfamida a animais com tumores estabelecidos.
63
Figura 26 - Efeito da ciclofosfamida sobre o crescimento do tumor. 63
xviii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1
1.1 Tratamento atual de Câncer 1
1.2 Imunoterapia 2
1.3 Transplante de precursores hematopoiéticos 3
1.4 Anticorpos Monoclonais 5
1.5 Transferência adotiva de células T 6
1.5.1 Importância das subpopulações infundidas 8
1.5.2 Indução de linfopenia 10
1.5.3 Abordagens para a geração de linfócitos anti-tumorais 11
1.6 Padrão de expressão de antígenos tumorais 15
1.7 Receptor de antígeno quimérico (CAR) 17
1.7.1 Domínio Extracelular 19
1.7.2 Domínio Intracelular 20
1.7.3 Testes Clínicos 28
1.8 Leucemia Linfóide Aguda – B (LLA-B) 30
1.9 Importância da resposta condicional 32
2. OBJETIVOS 40
2.1 Objetivo geral 40
2.2 Objetivos específicos 40
3. MATERIAIS E MÉTODOS 41
3.1 Plasmídeos 41
xix
3.2 Cultura de células 42
3.3 Produção de vetores virais 42
3.4 Citometria de Fluxo 43
3.5 Titulação dos vetores virais 43
3.6 Transdução e purificação das linhagens 44
3.7 Ensaio de luciferase 44
3.8 Avaliação do marcador de ativação CD69 45
3.9 Western blot 45
3.10 Modelo in vivo de melanoma 45
4. RESULTADOS 47
4.1 Clonagem dos CARs nos vetores retrovirais 47
4.2 Transdução e seleção da linhagem Jurkat 4.30 com os CARs
ativadores e inibitórios
48
4.3 Validação funcional dos CARs - ensaio de luciferase 51
4.4 Validação funcional dos CARs - marcador de ativação linfocitário
CD69
53
4.5 Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A 54
4.6 Validação do vetor lentiviral EF1αααα-19BBz-2A-20PD1 57
4.7 Transdução da linhagem B16F10 59
4.8 Estabelecimento do modelo in vivo 60
5. DISCUSSÃO 64
6. CONCLUSÕES 69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Tratamento atual de Câncer:
Segundo as estimativas do Instituto Nacional de Câncer (INCa), em 2011
ocorrerão mais de 400.000 novos casos de câncer no Brasil. Esta doença é decorrente de
um processo de transformação, ou tumorigênese, das células normais de um indivíduo.
Estas células transformadas adquirem vantagens seletivas sobre as células normais
através de uma série de eventos genéticos e epigenéticos que incluem mutações no
DNA, mudanças na expressão de genes e, em muitos casos, perda de quantidade
significativa de material genético. De modo geral, as células cancerosas possuem
capacidade de proliferação ilimitada e de evadir os mecanismos de apoptose, além de
serem insensíveis aos sinais anti-proliferativos fisiológicos (Hanahan, 2000).
Os tratamentos atuais para os diversos tipos de câncer baseiam-se
principalmente em cirurgia, radioterapia e quimioterapia, terapias pouco específicas e
que acarretam efeitos colaterais graves para o paciente. Além disso, as taxas de cura
alcançadas com estes tratamentos são muito variáveis. Mais recentemente, o
desenvolvimento de áreas como biologia molecular e bioquímica estrutural permitiu a
elucidação de diversas vias importantes para o processo oncogênico. Isto possibilitou o
desenvolvimento racional de drogas, como os inibidores de tirosina cinases, desenhadas
para se ligarem especificamente em determinada molécula e inibir a sua atividade. Essas
drogas são capazes de induzir regressões tumorais significativas em pacientes com
leucemia mielóide crônica (LMC) e câncer de pulmão, por exemplo. No entanto, a
maioria dos pacientes eventualmente desenvolve resistência, causada pela amplificação
do gene da proteína cinase ou pela seleção de um clone que possui mutações
secundárias na proteína alvo, sendo uma terapia incapaz de curar a doença.
2
Nos últimos anos o grande avanço na compreensão da biologia do câncer
permitiu o desenvolvimento de novas drogas e novos regimes de tratamento, além de
proporcionar melhorias no diagnóstico. Ainda assim, com as terapias atuais empregadas
na clínica, 30% a 40% dos pacientes morrem da doença. Com isso torna-se evidente a
necessidade do desenvolvimento de novas terapias, de preferência direcionadas
especificamente contra o tumor, visando a diminuição dos efeitos colaterais e o aumento
da taxa de sobrevivência e da qualidade de vida do paciente.
1.2 Imunoterapia:
Recentemente, muitos trabalhos experimentais e clínicos vêm explorando o
potencial da imunoterapia para o tratamento de diversos tipos de câncer. Esta
modalidade se baseia na utilização de componentes do sistema imune para atacar o
tumor e assim controlar a doença. A maior incidência de leucemias, linfomas e
sarcomas em pacientes com imunodeficiências (AIDS, por exemplo) demonstra a
capacidade do sistema imune de retardar ou até mesmo evitar o surgimento de
neoplasias (Goedert, 2000), propriedade conhecida como imunovigilância. De fato, os
tumores induzem uma resposta imunológica, que pode ser atestada pela presença no
plasma de anticorpos contra antígenos associados ao tumor e pela presença de linfócitos
T direcionados contra células tumorais. Essas e outras evidências impulsionaram o
desenvolvimento de várias abordagens em imunoterapia utilizando-se citocinas,
anticorpos monoclonais e componentes celulares como linfócitos T, NK e células
dendríticas.
3
1.3 Transplante de precursores hematopoiéticos:
O transplante de precursores hematopoiéticos (TPH) alogênico foi desenvolvido
há mais de 35 anos com o objetivo de impedir a falência da medula óssea causada pela
quimioterapia e radioterapia. Este procedimento é amplamente utilizado no tratamento
de malignidades hematológicas, sendo atualmente a única terapia curativa para doenças
como a leucemia mielóide crônica (LMC). Inicialmente acreditava-se que o regime de
condicionamento mieloablativo era o principal responsável pela eliminação dos clones
leucêmicos e que o transplante de células tronco hematopoiéticas do doador apenas
recuperava a função da medula óssea (Appelbaum, 2001). No entanto, ainda em 1956,
foi observado por Barnes e cols. que as células leucêmicas de camundongos irradiados
eram eliminadas quando estes recebiam transplantes alogênicos, mas não singênicos. O
mesmo foi comprovado anos mais tarde em humanos, onde pacientes que recebiam
transplante alogênico (porém HLA-compatível) tinham uma menor probabilidade de
recidivas do que pacientes que receberam a medula de um irmão gêmeo. Essa
conseqüência do transplante alogênico foi chamada de efeito enxerto contra a leucemia
(ECL). No contexto do TPH alogênico HLA-compatível, as proteínas das células do
paciente e do doador apresentam diferenças devido a polimorfismos genéticos. Essas
proteínas polimórficas também são processadas e apresentadas como antígenos
(chamados antígenos minoritários de histocompatibilidade – mHAgs). Sendo assim as
células T presentes no enxerto, que não são tolerizadas contra esses peptídeos,
reconhecem esse complexo peptídeo-HLA diferente e se tornam ativadas, exercendo sua
atividade efetora. Quando esses antígenos são expressos pelos clones leucêmicos, são
alvos do reconhecimento que resulta no efeito ECL (Bleakley, 2004). No entanto, outros
tecidos do paciente também podem expressar os mesmos antígenos minoritários, ou
4
ainda um conjunto diferente de mHAgs, como a pele, trato gastrointestinal e o fígado,
sendo este alo-reconhecimento fundamental para o estabelecimento da doença enxerto
contra o hospedeiro (DECH). Estudos posteriores demonstraram que pacientes que
desenvolvem DECH tem uma menor chance de recidiva da doença, o que evidencia o
compartilhamento da expressão dos mHAgs entre o tecido normal e a leucemia
(Horowitz, 1990) (Figura 1).
Figura 1: Taxas de recaída após TMO alogênico e singênico. As menores taxas são encontradas em pacientes que desenvolveram DECH aguda e crônica e as maiores em pacientes que receberam medula depletada de linfócitos T ou de irmãos gêmeos. Adaptado de Appelbaum, 2001.
Outra evidência do importante papel que o efeito ECL tem na eliminação da
leucemia é a utilização de infusões de linfócitos do doador (DLI) para o tratamento de
pacientes que sofreram recidivas da LMC após o TPH alogênico. Este tratamento é
capaz de induzir uma nova remissão completa em aproximadamente 70% dos pacientes,
sendo menor que 20% a probabilidade de uma nova recidiva em 3 anos (Kolb, 1995)
quando a nova remissão é alcançada.
5
1.4 Anticorpos Monoclonais:
Em 1975, Kohler e Milstein desenvolveram a tecnologia do hibridoma, tornando
possível a produção de anticorpos com especificidade conhecida em larga escala. Com
isso, foi proposta a utilização de anticorpos no tratamento de câncer, direcionados
contra proteínas-chave na progressão tumoral e geralmente superexpressas pelo tumor.
No entanto, em testes clínicos iniciais os pacientes desenvolveram uma resposta
humoral contra os anticorpos infundidos, apesar da resposta antitumoral que foi
observada (Miller, 1982). Este fato ocorreu devido à origem murina destes anticorpos, o
que limitou o número de doses tolerado pelos pacientes.
Esses obstáculos foram superados com a geração de anticorpos monoclonais
quiméricos (estrutura da IgG humana com as regiões variáveis derivadas de
camundongo) e humanizados (estrutura da IgG humana com as regiões determinantes
de complementariedade – CDRs – de camundongo) (Figura 2). Os mecanismos de ação
destas moléculas estão relacionados com o isotipo de IgG. Anticorpos com a estrutura
de IgG1 são capazes de induzir citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) e
citotoxicidade dependente de complemento (CDC), induzindo diretamente a morte das
células tumorais. Outros isotipos, como IgG2, são utilizados quando o anticorpo atua
através de suas propriedades de ligação ao antígeno. Como muitos alvos são receptores
de fatores de crescimento, essas moléculas agem bloqueando fisicamente a interação
entre o ligante e o receptor ou impedindo a mudança de conformação necessária para a
dimerização e sinalização (Adams, 2005).
6
Figura 2: Anticorpos. Esquema comparando a estrutura dos anticorpos utilizados na clínica (quiméricos e humanizados) com os murinos e humanos.
Diversos anticorpos já estão sendo regularmente utilizados em clínica, alguns
com resultados promissores. O primeiro a ter seu uso aprovado foi o Rituximab,
anticorpo anti-CD20 utilizado no tratamento de linfomas não Hodgkin de células B,
onde cerca de 50% dos pacientes apresentam resposta significativa (McLaughlin, 1998).
Os efeitos adversos desta terapia estão associados à ligação do anticorpo na molécula
alvo. O tratamento com Rituximab pode causar toxicidade relacionada à rápida lise de
células CD20+ normais e tumorais, especialmente na primeira dose.
1.5 Transferência adotiva de células T:
Os linfócitos T são pertencentes ao sistema imune adaptativo, sendo os efetores
da imunidade celular. A geração destas células tem início na medula óssea, através do
processo de hematopoiese. Durante este processo, a célula tronco hematopoiética gera
7
dois precursores que vão dar origem à linhagem mielóide ou linfóide: o progenitor
mielóide comum (CMP) e o progenitor linfóide comum (CLP). O CLP por sua vez gera
precursores comprometidos com a diferenciação de linfócitos T, que migram para o
timo, gerando as células T maduras. Durante a passagem pelo timo o receptor da célula
T (TCR) sofre rearranjos, gerando a diversidade necessária para o reconhecimento de
praticamente qualquer antígeno. Além disso, este repertório recém formado é moldado
pelos mecanismos de seleção positiva e negativa, que vão eliminar as células com alta
capacidade de reconhecer o antígeno e também as incapazes de reconhecê-lo.
As células T maduras se dividem em duas grandes subpopulações: os linfócitos
CD8+ e CD4+. Os linfócitos CD8+ são células com função citotóxica, sendo
diretamente responsáveis pela eliminação da célula alvo através da liberação de
perforinas e granzimas. Estes linfócitos, após encontro com o antígeno, podem gerar
duas populações de células de memória capazes de responder rapidamente ao re-
estímulo. Os linfócitos de memória central são definidos pela presença na membrana
das moléculas CD45RO, CD62L e CCR7 e, apesar de possuírem uma grande
capacidade de proliferação e migração para o linfonodo, não possuem capacidade
efetora imediata. Os linfócitos de memória efetora são CD45RO+ e negativos para
CD62L e CCR7. Apresentam atividade efetora imediata, mas pouca capacidade de
proliferação.
Os linfócitos CD4+, após reconhecimento do antígeno e ativação, produzem
citocinas que são capazes de modular atividade de outras células, como linfócitos
CD8+, macrófagos e células B. Estas células podem se diferenciar em quatro
populações com funções diferentes. A população Th1 produz citocinas como IFN-γ, IL-
2 e TNF-α, tendo um papel crucial na resposta contra vírus e patógenos intracelulares,
além de aumentar a função das células CD8+. A população Th2 está envolvida em
8
processos de alergia, ativação de eosinófilos e células B através da produção de
citocinas como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. A população Th17 é caracterizada pela
produção de altos níveis de IL17A e IL17F, além de IL-9 e IL-21. Esta população está
envolvida na defesa contra organismos extracelulares, respostas autoimunes e
recrutamento de neutrófilos para os sítios de inflamação. Já as células T reguladoras
(Treg) estão envolvidas na regulação e supressão de linfócitos através da produção de
ctiocinas como IL-10 e TGF-β.
A transferência adotiva de células T consiste na infusão de vários subtipos de
linfócitos T maduros com o objetivo de eliminar o tumor e impedir recidivas da doença.
Clones de linfócitos T CD4+ e CD8+ específicos contra o tumor podem ser gerados ou
expandidos in vitro ou isolados do paciente e, após expansão para atingir o número de
células necessário para a terapia, são re-infundidos. Os estudos pré-clínicos e clínicos
definiram diversos parâmetros importantes para a eficácia deste tipo de terapia, assim
como diferentes abordagens de tratamento.
1.5.1 Importância das subpopulações infundidas:
Linfócitos T CD8+ citotóxicos têm um importante papel na defesa do
organismo, atuando contra patógenos como vírus, bactérias e parasitas. Estudos
realizados na década de 90 demonstraram que estas células também possuem a
capacidade de induzir regressão de tumores em modelos animais, sendo que o número
de células infundidas está diretamente correlacionado com o sucesso do tratamento
(Melief, 1995; Dudley, 2003). Outro parâmetro importante é o grau de diferenciação das
células infundidas. Células que apresentam um perfil menos diferenciado, com
9
marcadores de membrana da subpopulação de linfócitos T CD8+ de memória central,
são muito mais eficazes na eliminação do tumor (Gattinoni, 2005; Klebanoff, 2005).
Essa subpopulação possui uma capacidade proliferativa mais alta e é menos propensa à
apoptose devido à menor expressão de moléculas pró-apoptóticas como BID e BAD.
Além disso, as células desta sub-população expressam a molécula CD62L, importante
na migração para o linfonodo, e são capazes de responder melhor a citocinas como IL-7,
devido à alta expressão da cadeia alfa do receptor desta citocina (IL7Rα). No entanto,
estudos recentes conseguiram gerar in vitro, através da manipulação farmacológica da
via de sinalização de Wnt, células T CD8+ de memória com características de células
tronco. Para isso os autores inibiram a cinase Gsk-3β, levando a um acúmulo de β-
catenina no núcleo e conseqüentemente ativação da via. Estas células, quando
transferidas para outro animal, apresentaram capacidade de gerar todas as
subpopulações de linfócitos CD8+, além de expressarem marcadores característicos de
célula tronco como Sca1 e Bcl2. Também apresentaram um efeito antitumoral muito
maior, sendo necessária a infusão de apenas 5x104 células para induzir regressão
tumoral em todos os animais analisados (Gattinoni, 2009).
Apesar dos linfócitos CD8+ formarem a base do tratamento de transferência
adotiva, muitos estudos indicam que os problemas associados a esta terapia (baixa
persistência das células infundidas, baixo efeito antitumoral) podem ser contornados
através da co-infusão de células CD4+. As células CD4+ são essenciais para a geração
de células CD8+ de memória (Shedlock, 2003; Sun, 2003) e para sua correta função
(Bourgeois, 2002). Também são capazes de inibir a exaustão funcional dos linfócitos
citotóxicos e aumentar a infiltração nos tumores (Hunziker, 2002; Giuntoli, 2002). A
diversidade genética do HLA de classe II em qualquer população de pacientes é bem
maior quando comparada ao HLA de classe I, tornando a identificação de epítopos e
10
TCRs para a sub-população CD4+ mais complexa. Além disso, a expansão destas
células em cultura é mais difícil e existem poucos modelos animais que mimetizem o
uso destas células (Muranski, 2009). No entanto, um estudo recente comparou as
diferentes subpopulações (Th0, Th1 e Th17) de células T CD4+ TCR-transgênicas
reconhecendo o antígeno TRP-1 expresso por células próprias e tumorais em um
modelo de melanoma subcutâneo (B16F10). Neste modelo, as células Th17
apresentaram um efeito antitumoral superior às células Th1, sendo este efeito altamente
dependente de IFN-γ (Muranski, 2008). No único caso reportado na literatura, a
transferência para um paciente de melanoma de um clone de linfócitos CD4
reconhecendo o antígeno NY-ESO-1, sem regime de condicionamento para indução de
linfopenia ou administração de IL-2 exógena, induziu a regressão completa do tumor,
com o paciente permanecendo livre de doença por dois anos (Hunder, 2008).
1.5.2 Indução de linfopenia:
Estudos demonstraram que o uso de radioterapia ou quimiterapia antes da
transferência dos linfócitos T pode aumentar a persistência e a atividade antitumoral
destas células (North, 1982). As doses utilizadas para esta finalidade constituem um
regime não mieloablativo, induzindo uma severa, mas transiente, leucopenia sem dano
permanente às células tronco hematopoiéticas, permitindo assim uma recuperação
espontânea da hematopoiese do hospedeiro. Este efeito benéfico é, ao menos em parte,
dependente da depleção de células com características inibidoras, como linfócitos T
reguladores e células mielóides supressoras, além de propiciar uma menor competição
por citocinas como IL-7 e IL-15 (Gattinoni, 2005) e infiltração do tumor (Bracci, 2007).
11
Os quimioterápicos e a radiação também induzem efeitos específicos sobre os tumores,
modulando o repertório de antígenos expressos, a expressão de HLA de classe I e o tipo
de morte celular induzida, conseqüentemente aumentando o reconhecimento pelos
linfócitos infundidos (Reits, 2006; Gasser, 2005).
1.5.3 Abordagens para a geração de linfócitos anti-tumorais:
Os resultados positivos obtidos nos modelos pré-clínicos impulsionaram a
realização de diversos testes envolvendo humanos. A aplicação clínica que obteve mais
sucesso foi o tratamento de pacientes infectados pelo vírus Epstein-Barr (EBV). A
maioria dos adultos saudáveis possui uma infecção persistente, mas assintomática, de
EBV, mantida sobre controle pelo sistema imunológico. No entanto, pacientes
imunosuprimidos após o TPH têm um risco maior de desenvolver doença
linfoproliferativa ou linfoma associado ao EBV. Como esses tumores expressam
constantemente antígenos virais, são altamente suscetíveis ao reconhecimento pelos
linfócitos T. Com isso, protocolos foram desenvolvidos nos quais os linfócitos do
sangue periférico do doador são repetidamente estimulados in vitro com células B
infectadas por EBV, gerando uma população enriquecida em células anti-EBV que,
após sua expansão, é infundida no paciente. Em um estudo piloto, nenhum paciente que
foi tratado com estas células desenvolveu linfoma relacionado ao EBV, quando a taxa
de doenças esperada era de 25%, demonstrando ser um tratamento profilático efetivo e
com potente atividade antiviral (Rooney, 1998).
Diversas abordagens para aperfeiçoar a geração e seleção de células antígeno-
específicas foram testadas em modelos experimentais e em pacientes. A identificação de
antígenos associados ao tumor (Novellino, 2005), principalmente ao melanoma,
12
possibilitou o desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro utilizando células
dendríticas (DCs), APCs profissionais que expressam altos níveis de moléculas
coestimulatórias e que são capazes de induzir ativação e proliferação de linfócitos T
CD4 e CD8. Nestes sistemas as DCs são co-incubadas com o peptídeo derivado do
antígeno tumoral ou com lisados de células tumorais e depois são utilizadas para
estimular linfócitos do sangue periférico dos pacientes. Os linfócitos específicos contra
os antígenos apresentados são preferencialmente ativados e expandidos, e depois
infundidos no paciente.
Em um estudo de fase 1 para tratamento de melanoma metastático avançado,
DCs pulsadas com um peptídeo derivado do antígeno Melan-A foram utilizadas para a
geração dos linfócitos CD8 (Mackensen, 2006). Onze pacientes foram tratados com
múltiplas infusões, com três apresentando resposta antitumoral (uma regressão
completa, uma regressão parcial e uma resposta mista). O tratamento demonstrou-se
seguro e foi bem tolerado, com migração dos linfócitos infundidos para os sítios
tumorais e alta freqüência de células CD8 Melan-A específicas no sangue dos pacientes
após dois dias da infusão (média de 0,67% do total de linfócitos CD8). No entanto, após
duas semanas da infusão a freqüência destas células se mostrou muito baixa e, em dois
pacientes avaliados, uma perda seletiva do antígeno alvo nas metástases do linfonodo
foi observada. Este protocolo apresentou também dificuldade de produzir o grande
número de DCs necessário para a expansão dos linfócitos.
Outra abordagem para gerar linfócitos específicos contra o tumor envolve a
seleção de clones diretamente dos pacientes. Linfócitos do sangue periférico de
pacientes previamente imunizados com o peptídeo alvo são isolados e passam por um
primeiro ciclo de expansão. Após este ciclo, por meio de diluição limitante, os linfócitos
13
são clonados e expandidos através de estimulação com células mononucleares de
sangue periférico (PBMCs) e IL-2. Alternativamente, os clones são gerados a partir de
linfócitos infiltrantes do tumor (TILs) isolados de biopsia. Nos testes clínicos
utilizando-se esta abordagem para o tratamento de melanoma metastático, cada paciente
foi infundido com apenas um clone, que foi selecionado com base nos níveis de IFN-γ e
IL-2 liberados após estimulação in vitro com o peptídeo ou linhagens celulares de
melanoma. Respostas objetivas não foram observadas em pacientes imunocompetentes
e imunossuprimidos, mesmo quando os clones foram transferidos para pacientes
tratados com IL-2, e, na maioria dos pacientes, as células transferidas não persistiram
por mais de uma semana (Dudley, 2001; Dudley, 2002; Yee, 2002). Diversos fatores
podem explicar a falta de persistência e a relativa ineficácia da terapia utilizando-se
linfócitos clonados ou gerados com o auxílio de DCs, incluindo a necessidade de
linfócitos CD4 antígeno-específicos na infusão, exaustão proliferativa e/ou
diferenciação terminal durante o processo de expansão ou seleção in vivo de variantes
negativas para o antígeno alvo.
Um método muito eficiente para a geração de linfócitos específicos contra o
tumor foi desenvolvido utilizando-se um modelo murino de sarcoma. Linfócitos
infiltrantes do tumor (TILs) foram isolados e cultivados em altas doses de IL-2 e
apresentaram atividade lítica específica contra células tumorais murinas in vitro. Além
disso, essas células também foram capazes de mediar regressão do tumor quando
transferidas para camundongos com sarcoma (Rosenberg, 1986). Testes com células
humanas foram então realizados e culturas de TILs puderam ser geradas de pacientes
com melanoma, carcinoma renal, carcinoma de cólon, glioma e câncer de mama. O uso
de TILs se mostrou mais eficaz para o tratamento de melanoma, provavelmente porque
14
as culturas de TIL de outros tipos de neoplasia raramente produzem linfócitos capazes
de reconhecer e lisar o tumor (Joncker, 2006).
As culturas de TIL geradas a partir das biopsias de pacientes com melanoma
apresentaram alta atividade lítica, padrão oligoclonal e geralmente continham células
CD4 e CD8. O protocolo de expansão consiste em estimulação com anti-CD3, IL-2 e
PBMCs HLA-compatíveis, onde melhorias recentes nos métodos de cultura resultaram
na geração de TILs em 78% dos pacientes com melanoma. Em um teste clínico, 34%
dos pacientes imunocompetentes tratados com TIL e altas doses de IL-2 apresentaram
respostas clínicas objetivas. No entanto, a maioria das respostas observadas foi
transiente, tendo sido observada uma persistência limitada das células transferidas
(Rosenberg, 1994).
Testes clínicos recentes, impulsionados pela evidência em modelos pré-clínicos,
utilizaram a infusão de culturas de TIL e o tratamento com altas doses de IL-2 após um
regime de condicionamento (quimioterapia) não mieloablativo, mas que induz
linfodepleção. Outra modificação do protocolo foi a seleção dos TILs infundidos, onde
a liberação de IFN-γ após estímulo com o tumor autólogo atuou como parâmetro de
seleção de culturas responsivas. Este tratamento foi capaz de induzir uma resposta
clínica em 18 de 35 pacientes tratados (51%), sendo 3 respostas completas e 15
respostas parciais, com duração média de 11 meses (Dudley, 2005). As células
infundidas foram capazes de enxertar e proliferar, e 4 de 5 pacientes analisados
apresentaram alta persistência dos TILs meses após a transferência. Estudos do mesmo
grupo demonstraram que a persistência das células é crucial para o sucesso da terapia
(Robbins, 2004), e que esta característica está associada ao comprimento dos telômeros
(Zhou, 2005) e à expressão de altos níveis de CD28 (Huang, 2005). No entanto, 17
pacientes apresentaram reação autoimune contra os melanócitos (vitiligo, uveíte),
15
demonstrando que o melanoma compartilha diversos antígenos reconhecidos pelos TILs
com as células normais. Em outro teste clínico do mesmo grupo, um regime de
condicionamento mais intenso foi testado, combinando quimioterapia e radioterapia.
Com isso, a taxa de respostas objetivas chegou a 72%, constituindo atualmente o melhor
tratamento para pacientes com melanoma (Dudley, 2008) (figura 3).
Figura 3: Gráfico ilustrando a evolução das taxas de respostas objetivas em pacientes com melanoma metastático após tratamento com imunoterapias. ACT = transferência adotiva de linfócitos; NMA = regime não mieloablativo; TBI= irradiação de corpo total. Adaptado de Rosenberg, 2009.
1.6 Padrão de expressão de antígenos tumorais:
O sistema imune mantém um diverso repertório de células T com alta avidez
para um antígeno externo, enquanto limita a atividade de células que reconhecem
antígenos próprios. Sendo assim, os antígenos tumorais podem ser divididos em duas
categorias básicas, antígenos específicos do tumor (TSA) e antígenos associados ao
tumor (TAA). TSAs são geralmente imunogênicos visto que são derivados de vírus
associados a tumores humanos, como o EBV e o HPV. A ocorrência aumentada de
16
tumores induzidos por vírus em pacientes imunocomprometidos sugere que a expressão
destes antígenos pelas células transformadas promove uma resposta antitumoral,
atuando como alvos em terapias profiláticas para EBV já aplicadas em clínica.
Outra classe de TSAs são os antígenos únicos, resultado de mutações somáticas
ocorridas durante o processo de tumorigênese (Parmiani, 2007). Muitas destas mutações
ocorrem em genes cruciais para o fenótipo maligno, como RAS ou CDK4, sendo alvos
atrativos para a imunoterapia, pois seriam resistentes à seleção de variantes. No entanto,
enquanto algumas mutações são encontradas em vários tumores, freqüentemente elas
são unicamente encontradas nos tumores na qual elas foram identificadas, e novas
mutações podem ser geradas durante a progressão da doença. Com isso, a aplicação
clínica destes antígenos tem sido limitada pela falta de métodos rápidos de identificação
e caracterização molecular no nível individual.
TAAs são antígenos próprios, não mutados, derivados de proteínas expressas
pelos tumores e pelo tecido normal. TAAs podem ser caracterizados pelo seu padrão de
expressão como antígenos tecido-específicos ou antígenos ubiquamente expressos
(Kessler, 2007). Os antígenos de câncer/testículo (MAGE, BAGE, NY-ESO-1) são
importantes exemplos de antígenos tecido-específicos. Esses antígenos são
normalmente expressos nos testículos e placenta, mas são reativados em células
tumorais. O baixo nível de expressão de MHC nestes tecidos impede o reconhecimento
destes antígenos pelo sistema imune, tornando-os alvos atrativos para a imunoterapia.
Outro exemplo são os antígenos de diferenciação, presentes tanto no tecido tumoral
quanto no tecido normal do qual o tumor se originou, mas não em outros tecidos. Os
antígenos deste tipo mais estudados são os relacionados ao melanoma, como o gp100,
Mart-1/Melan-A, pMel-17. Já os antígenos ubiquamente expressos são encontrados na
maioria dos tecidos normais, mas estão freqüentemente superexpressos nas células
17
transformadas, como hTERT, survivina e PRAME. A superexpressão destes antígenos
aumenta a quantidade de peptídeos apresentados pelas moléculas de MHC na superfície
celular, aumentando também o reconhecimento da célula tumoral pela célula T.
No entanto, devido à expressão em tecidos normais, imunoterapias direcionadas
contra estes antígenos podem induzir uma resposta autoimune, como vista no teste
clínico para tratamento de melanoma já mencionado. Além disso, como os TAAs são
antígenos próprios, os clones de linfócitos reativos presentes nos pacientes são de baixa
avidez (resultado dos mecanismos de tolerância central) e estão submetidos aos
mecanismos de controle da tolerância periférica (células T reguladoras, indução de
anergia), o que muitas vezes afeta a qualidade da resposta antitumoral obtida.
1.7 Receptor de antígeno quimérico (CAR):
Como mencionado, com exceção do melanoma, as estratégias imunoterapêuticas
para geração e utilização de linfócitos antitumorais tem falhado em induzir respostas
clínicas nos pacientes. Células específicas contra o tumor geralmente não estão
presentes nos pacientes ou estão em baixa freqüência, resultado da baixa
imunogenicidade da neoplasia e dos mecanismos de tolerância. Além disso, diversos
mecanismos de evasão tumoral dificultam a atividade das células infundidas. As células
tumorais comumente apresentam defeitos na maquinaria de processamento de
antígenos, como diminuição da expressão de TAP e β-2-microglobulina, e diminuição
da expressão do MHC de classe I, resultando em uma menor quantidade de antígenos
apresentados. Moléculas com função imunossupressora secretadas pelo tumor, como IL-
10, induzem a diminuição da expressão de moléculas coestimulatórias em DCs, de
modo que a apresentação de antígenos por estas células pode levar à anergia das células
18
T. Além destes mecanismos de evasão, complexos sistemas de cultura são necessários
para a expansão e seleção dos clones reativos. As doses terapêuticas podem ultrapassar
109 células T/Kg, necessitando assim de diversos ciclos de estimulação (Dudley, 2002).
Esta cultura prolongada das células T, no entanto, apresenta o risco de perda dos clones
reativos e diminuição da funcionalidade das células. (Yee, 2002)
Com o objetivo de superar algumas destas limitações, Eshhar e colaboradores
desenvolveram, em 1993, o conceito de receptor de antígeno quimérico (CAR) (Eshhar,
1993). Este receptor é composto de um domínio extracelular de reconhecimento de
antígeno, um espaçador, uma região transmembrana e um domínio intracelular de
sinalização (Figura 4). Geralmente a porção extracelular é derivada de um anticorpo
monoclonal murino, mas receptores ou ligantes (CD4, CD8, heregulina) também podem
ser utilizados. As células T que expressam estes receptores tornam-se ativadas após o
reconhecimento do antígeno na célula alvo, sendo então capazes de produzir citocinas e
exibir atividade citotóxica independente da ligação do receptor de célula T (TCR)
endógeno com o complexo MHC/peptídeo. Sendo assim, a expressão desta molécula na
membrana dos linfócitos permite o redirecionamento da especificidade da célula,
constituindo um novo método de geração de linfócitos antitumorais. Além disso, como
o reconhecimento do antígeno não é restrito ao MHC, um importante mecanismo de
evasão tumoral é evitado e permite que esta molécula seja utilizada em pacientes com
qualquer haplótipo de HLA. Com o advento de métodos efetivos de transferência gênica
para linfócitos, baseados principalmente em retrovírus e lentivirus, tornou-se possível a
modificação genética de um grande número de células, o que diminui a necessidade de
longos protocolos de expansão e seleção (Sadelain, 2003).
19
Figura 4: Desenho esquemático representando a estrutura padrão do receptor quimérico. VH: cadeia pesada variável; VL: cadeia leve variável; scFv: fragmento variável de cadeia única. Adaptado de Pule, 2003.
1.7.1 Domínio Extracelular:
O CAR conecta a especificidade dos anticorpos à maquinaria celular do sistema
imune adaptativo. O fragmento Fab de um anticorpo é uma unidade estruturalmente
independente que contém o sítio de ligação ao antígeno, composto de 4 domínios:
cadeia pesada variável (VH), cadeia pesada constante (CH), cadeia leve variável (VL) e
cadeia leve constante (CL). A especificidade da ligação é dada pelas duas regiões
variáveis. Com isso, a porção de reconhecimento de antígeno do CAR consiste na
expressão dos domínios VH e VL separados por um conector flexível em uma única
cadeia polipeptídica, chamada também de scFv (fragmento variável de cadeia única). O
conector aproxima os dois domínios e forças não covalentes proporcionam a correta
orientação, preservando o sítio de ligação (Pule, 2003). Essas regiões podem facilmente
ser amplificadas a partir do cDNA de hibridomas por RT-PCR, tornando possível o
redirecionamento dos linfócitos contra qualquer molécula da superfície celular para a
20
qual haja um anticorpo monoclonal identificado. Com isso, diferentemente do TCR,
CARs podem reconhecer não somente antígenos protéicos como antígenos derivados de
carboidratos e glicolipídeos, ampliando o conjunto de moléculas que podem ser
utilizadas como alvo. Além disso, esses receptores apresentam alta avidez pelo
antígeno, uma vez que não foram modelados pelos mecanismos de tolerância central do
sistema imune, como ocorre com o TCR.
Entre a região de reconhecimento de antígeno e a região transmembrana existe
um espaçador, que parece ser necessário para a função ótima de algumas construções.
De fato, um estudo demonstrou que espaçadores são necessários para CARs anti-5T4 e
anti-NCAM, mas não anti-CD19 (Guest, 2005). Acredita-se que a presença do
espaçador forneça mais flexibilidade à porção de reconhecimento para se ligar a
epítopos perto da membrana plasmática. A região espaçadora hinge-CH2-CH3, derivada
de IgG, é a mais comumente utilizada, e parece ser superior em termos de expressão,
estabilidade, ativação da célula T e função efetora. A região transmembrana conecta a
parte extracelular à parte intracelular, sendo importante para a dimerização dos
receptores e conseqüente amplificação do sinal de ativação, além de contribuir para a
co-localização do receptor com a sinapse imunológica.
1.7.2 Domínio Intracelular:
A parte intracitoplasmática do CAR é responsável pela sinalização do receptor e,
quando ativada, deve ser capaz de induzir as funções efetoras do linfócito. Estudos
iniciais desenvolveram CARs que possuíam apenas um domínio de sinalização, sendo
chamados de CARs de primeira geração. Nestes receptores, os domínios derivados da
cadeia ζ do complexo CD3 (parte sinalizadora do TCR) e da cadeia γ do FcεRI (receptor
21
de alta afinidade para IgE) são os mais utilizados. No entanto, estudos comparativos
demonstraram a superioridade do receptor com a cadeia ζ, tanto in vitro (Heuser, 2003;
Roberts, 1998) como in vivo (Haynes, 2001). Acredita-se que esta característica possa
ser explicada pela presença de 3 motivos ativadores baseados em tirosina dos
imunoreceptores (ITAMs) na cadeia ζ do complexo CD3, contra apenas 1 ITAM na
cadeia γ do FcεRI, gerando um sinal de ativação mais forte (Figura 5).
Figura 5: Esquema simplificado da sinalização iniciada pelo complexo TCR-CD3. Após a ligação do antígeno, os motivos ITAM são fosforilados e passam a recrutar a proteína cinase ZAP-70. A tirosina cinase Lck fosforila e conseqüentemente ativa a ZAP-70, que fosforila uma série de alvos incluindo LAT e SLP-76. Essas duas proteínas ativam duas vias de sinalização importantes, a via da PLC-γ e a via da Ras. A ativação destas vias culmina na ativação dos fatores de transcrição NFAT, AP-1 e NFkB, resultando em diferenciação, proliferação e ações efetoras das células T. Adaptado de Razzaq, 2004.
22
Diversos estudos desenvolveram receptores direcionados contra importantes
antígenos tumorais, como PSMA (câncer de próstata), GD3 (melanoma), CD20
(linfoma de célula B) e CAIX (carcinoma renal). As células T transduzidas com estes
receptores foram capazes de secretar IL-2 e lisar as células tumorais in vitro. Além
disso, a eficácia in vivo das células T murinas CAR+ foi demonstrada para os antígenos
Erbb2, FBP (câncer de ovário) e CEA (câncer de cólon), onde regressões tumorais
significativas foram observadas (Sadelain, 2003). No entanto, evidências recentes
mostram que as células T naive precisam de mais de um estímulo para uma eficiente
ativação. A estimulação apenas através da via do TCR não induz proliferação da
maioria das células T primárias, além de tornar estas células insensíveis a um
reestímulo, característica conhecida como anergia. A coestimulação da célula T é um
importante aspecto da transferência adotiva de células antígeno-específicas, visto que os
sinais fornecidos são cruciais na determinação do limiar de ativação, do tipo da resposta
e na sobrevivência das células. Como as células tumorais geralmente não expressam
moléculas coestimulatórias, o desenvolvimento de uma resposta antitumoral pode ser
comprometido. De fato, em um estudo utilizando um camundongo transgênico
expressando o CAR em todas as suas células, os receptores de primeira geração não
foram capazes de induzir proliferação em células naive (Brocker, 1995).
As funções efetoras demonstradas nos trabalhos publicados se devem ao
fenótipo pré-ativado dos linfócitos, resultado do processo de transdução retroviral que
requer a proliferação das células alvo. A importância da coestimulação para a expansão
das células T CAR+ foi demonstrada em um estudo in vitro de Gong e cols (Gong,
1999). Apenas os linfócitos que foram co-cultivados com células que expressavam o
antígeno alvo (PSMA) e CD80 proliferaram. As células que expressavam apenas PSMA
não foram capazes de induzir a secreção de altos níveis de IL-2 e de sustentar a
23
expansão dos linfócitos, mas foram capazes de induzir atividade citotóxica. Resultados
semelhantes foram obtidos em modelos in vivo, onde a expressão de CD80 pelo tumor
foi necessária para a completa erradicação do tumor pelos linfócitos T modificados
(Brentjens, 2003).
Esses fatores levaram ao desenvolvimento de CARs com capacidade
coestimulatória, chamados de segunda geração, através da fusão do domínio
citoplasmático de moléculas da família CD28 e TNF com o domínio de sinalização da
cadeia ζ. Uma grande variedade de moléculas coestimulatórias modula a resposta
imune, exercendo seu papel sobre uma subpopulação específica ou em determinado
momento do programa de diferenciação do linfócito. Conseqüentemente, os sinais
transmitidos podem diferir, resultando na indução de diferentes fenótipos que podem ser
utilizados de acordo com o tipo de resposta desejada e assim aumentar a eficácia da
terapia. Além de moléculas coestimulatórias, o fenótipo do linfócito pode ser controlado
por moléculas inibitórias expressas após a ativação, limitando e controlando a resposta
imune (Figura 6).
24
Figura 6: Esquema mostrando os receptores da família CD28 e TNF. Enquanto a família TNF (B) apresenta apenas receptores coestimulatórios, a família CD28 (A) possui receptores coestimulatórios e inibitórios. A: adaptado de Parry, 2007; B: adaptado de Watts, 2005.
A molécula CD28 apresenta um papel crucial na ativação de células naive
através da interação com membros da família B7 (CD80, CD86) nas APCs, sendo o
principal receptor coestimulador expresso pelos linfócitos T (Figura 7). Os estudos in
vitro utilizando células primárias murinas e humanas transduzidas com o scFv-CD28-ζ
25
mostraram uma liberação de IL-2 e proliferação significativamente maior quando
comparada ao receptor scFv-ζ (Hombach, 2001; Finney, 1998). Os estudos in vivo
também demonstraram uma atividade antitumoral superior deste receptor de segunda
geração (Kowolik, 2006; Haynes, 2002), com uma maior persistência das células
infundidas.
Figura 7: Esquema ilustrando as principais vias ativadas por CD28. O domínio citoplasmático desta molécula apresenta um motivo YMNM capaz de ser fosforilado, provavelmente pelas cinases Lck ou Fyn. Este motivo fosforilado é capaz de recrutar proteínas que contenham o domínio SH2, como a PI3K e o adaptador GRB2. A via de PI3K produz mediadores lipídicos como PIP3, que induz a co-localização na face interna da membrana plasmática das cinases PDK-1 e PKB-Akt através da interação com os domínios de homologia a pleckstrina (PH) presentes nestas proteínas. PDK-1 fosforila e ativa PKB-Akt, que possui um papel crucial na produção de IL-2 e IFN-γ. Essa via também apresenta um importante efeito antiapoptótico, induzindo a expressão de Bcl-xL (não mostrado). Adaptado de Rudd, 2003.
O sucesso obtido com a incorporação do domínio intracitoplasmático de CD28
levou diferentes grupos a testar outros domínios de ativação. Um dos domínios de
sinalização testados deriva da molécula 4-1BB (CD137), membro da família TNF de
receptores. Esta molécula tem a sua expressão induzida pela ativação do TCR e produz
respostas como proliferação, secreção de citocinas do tipo Th1, aumento da
citotoxicidade e maior sobrevivência, tanto em células CD4 como CD8 (Watts, 2005)
26
(Figura 8). A estimulação através deste receptor pode substituir os sinais de CD28 na
expansão in vivo de células T CD8, apesar de induzir menores níveis de IL-2. Estudos
demonstraram que este receptor apresenta um efeito preferencial sobre células CD8 e
tem a capacidade de inibir a morte celular induzida por ativação (AICD). Em um
trabalho recente, utilizando uma população de linfócitos CD8 de sangue periférico
previamente estimulado com um antígeno, foi demonstrado que 4-1BB induz uma
expansão preferencial das células de memória, resultando em um enriquecimento das
células antígeno-específicas (Zhang, 2007). Estas propriedades levaram os
pesquisadores a incorporar o domínio de sinalização desta molécula no CAR. Estudos in
vitro com células T CD8 e células NK demonstraram maior proliferação e atividade
efetora das células transduzidas com o scFv-4-1BB-ζ quando comparado com scFv-ζ
(Imai, 2004). No entanto, este receptor apresentou uma menor eficácia quando
comparado com scFv-CD28-ζ em um modelo de leucemia linfóide aguda (LLA) in vivo
(Brentjens, 2007).
27
Figura 8: Esquema apresentando os principais efeitos da estimulação via 4-1BB. Estes efeitos são decorrentes da sinalização via TRAF2, que em última análise ativa AKT, NFκB e AP-1. Adaptado de Croft, 2003.
Outros domínios de sinalização, como os derivados das moléculas ICOS e OX40
(CD134), foram testados in vitro (Finney, 2004) e in vivo (Brentjens, 2007), mas não
foram eficazes. Esses CARs apresentaram taxas de proliferação e liberação de citocinas
menores do que os receptores com CD28 e 4-1BB. Recentemente, na tentativa de
melhorar ainda mais a ativação dos linfócitos T, pesquisadores desenvolveram CARs
com três domínios intracelulares, scFv-CD28-41BB-ζ (Wang, 2007; Carpenito, 2009) e
scFv-CD28-OX40-ζ (Pule, 2005). Nos testes in vitro estes receptores induziram uma
maior proliferação dos linfócitos e maior secreção de citocinas como IL-2 e IFN-γ, além
de aumento da citotoxicidade. Esses resultados podem se traduzir em uma maior
atividade antitumoral in vivo e em um menor tempo de expansão ex vivo dos linfócitos.
28
Acredita-se que este efeito possa ser explicado pelas diferentes vias de sinalização
ativadas por estes domínios, visto que CD28 atua principalmente via PI3K e OX40/4-
1BB via TRAF2.
1.7.3 Testes Clínicos:
O primeiro teste clínico utilizando a abordagem do CAR foi para tratamento de
pacientes infectados com HIV (Mitsuyasu, 2000). Neste estudo, 24 pacientes receberam
uma única infusão de linfócitos CD4 e CD8 modificados para expressar o CAR CD4-ζ.
Com isso, as células infectadas pelo HIV seriam eliminadas devido à expressão de
proteínas do envelope viral, que se ligam na molécula CD4. Apesar das células
infundidas terem persistido por até um ano e terem migrado para os tecidos que atuam
como reservatórios de células infectadas, não houve diminuição nos níveis plasmáticos
de RNA e DNA viral. Alguns pacientes apresentaram diminuição do RNA viral no
tecido retal por até 14 dias, sugerindo uma atividade antiviral compartimentalizada.
Em outro estudo, 14 pacientes com câncer de ovário foram tratados com IL-2 e
células T anti-FBP, proteína expressa por este tipo de câncer, acoplado à cadeia γ
(Kershaw, 2006). Desses, 6 pacientes receberam células com dupla especificidade,
reagindo também contra células alogênicas, seguido de imunização com PBMCs
alogênicas. Nenhum paciente apresentou regressão do tumor e não houve evidências de
migração das células para os sítios da doença. Além disso, após 2 semanas as células já
não foram mais detectadas no sangue periférico e alguns pacientes desenvolveram
anticorpos contra o scFv, que é de origem murina. Estes anticorpos presentes no plasma
dos pacientes inibiram a liberação de IFN-γ em um ensaio in vitro, provavelmente
impedindo a interação do CAR com o ligante na célula tumoral. Em teste clínico para
29
tratamento de pacientes com neuroblastoma, resultados semelhantes foram obtidos
(Park, 2007). Os linfócitos com o CAR anti-CD171-ζ apresentaram baixa persistência
quando infundidos e não secretaram IL-2 após estimulação in vitro, apesar da alta
citotoxicidade contra a linhagem Be-2. Os clones infundidos apresentavam fenótipo de
células diferenciadas (CD62L-, CD27-, CD28-), mas baixos níveis de PD-1, molécula
associada à exaustão funcional do linfócito. Nenhum paciente tratado apresentou
resposta clínica significativa.
Em um teste clínico para tratamento de pacientes com neuroblastoma, a
utilização de uma nova abordagem melhorou significativamente a resposta observada.
Neste estudo, linfócitos específicos contra antígenos do EBV ou linfócitos do sangue
periférico foram modificados para expressar um CAR anti-GD2 contendo a cadeia
CD3ζ. Os linfócitos anti-EBV persistiram in vivo por muito mais tempo, provavelmente
devido à constante coestimulação recebida através do TCR endógeno. Esta maior
persistência se traduziu em melhores resultados, com 3/6 pacientes apresentando
regressão tumoral (Pule, 2008).
Os resultados obtidos com estes estudos iniciais apontam as características
cruciais para o sucesso deste tipo de terapia e sugerem abordagens para a sua
otimização. A utilização de CARs de segunda (ou terceira) geração aliada ao regime de
condicionamento não-mieloablativo pode resultar em uma maior persistência das
células e um maior efeito antitumoral. A humanização dos scFvs ou a geração de scFvs
a partir de anticorpos humanos pode eliminar as respostas humorais contra o CAR
observadas em alguns pacientes. Por último, a utilização de linfócitos com o fenótipo de
memória pode melhorar a proliferação in vivo destas células e suas funções efetoras.
30
1.8 Leucemia Linfóide Aguda – B (LLA-B):
A hematopoiese é um processo guiado por mudanças seqüenciais na expressão
gênica de progenitores multipotentes induzidas por microambientes como o fígado fetal,
medula óssea e timo. A manutenção deste sistema requer células tronco hematopoiéticas
(HSC), que continuamente geram na medula óssea os progenitores mielóides comuns
(CMP) e os progenitores linfóides comuns (CLP), através de divisão assimétrica. O
CLP dá origem aos precursores de células NK, T, e B. O desenvolvimento dos linfócitos
B acontece na medula óssea e no baço, e cada estágio pode ser identificado através de
uma combinação de marcadores de membrana e rearranjos dos segmentos gênicos que
codificam a parte variável do receptor da célula B (BCR) (Pui, 2006) (Figura 9).
Figura 9: Esquema da ontogenia da linhagem B, apresentando os principais marcadores. Adaptado de Pui, 2006.
Apesar de sujeito a inúmeros mecanismos de controle, translocações e mutações
podem ocorrer nas diferentes etapas do desenvolvimento da linhagem B, resultando na
indução do fenótipo maligno característico da LLA-B. Aproximadamente 70% das
LLAs pediátricas e 50% das LLAs adultas envolvem o compartimento de precursores B
iniciais, que pode ser definido através da expressão dos marcadores CD10, CD19,
CD24, CD34 e TdT. A proliferação e o acúmulo de células leucêmicas resultam na
31
supressão da hematopoiese normal e envolve vários sítios extramedulares, como o
fígado, baço e linfonodo. As mudanças na regulação gênica, induzidas por translocações
como TEL-AML1, alteram a capacidade de auto-renovação e diferenciação das HSC,
levando ao desenvolvimento do quadro leucêmico.
Os tratamentos atuais baseados em quimioterápicos atingem uma taxa de cura de
mais de 80% em crianças (Pui, 2006). Os pacientes de alto risco (BCR-ABL+, por
exemplo) são submetidos ao TPH. No entanto, muitos pacientes desenvolvem sérias
complicações devido aos efeitos adversos do tratamento, especialmente os que são
submetidos ao transplante. Além disso, as taxas de sobrevivência de adultos com LLA-
B são muito baixas (~40%) e os pacientes que sofrem recidivas não respondem bem aos
tratamentos disponíveis, como a DLI. Em um estudo retrospectivo multicêntrico, 75%
(n=44) dos pacientes tratados com DLI não alcançaram remissão completa (Collins,
2000). Acredita-se que características associadas aos blastos leucêmicos, como
apresentação de antígeno defeituosa e baixa expressão de moléculas coestimulatórias e
de adesão, sejam responsáveis por tal resultado (Cardoso, 1996; D´Amico, 2004). Com
isso, torna-se necessário o desenvolvimento de novas terapias com o objetivo de
aumentar as taxas de cura e melhorar a qualidade de vida dos pacientes.
Neste contexto, o uso de CARs direcionados contra antígenos expressos pelos
blastos leucêmicos é uma alternativa promissora. A molécula CD19 representa um bom
alvo, visto que é expressa por todos os subtipos de LLA e apenas pela linhagem B,
poupando os outros tecidos em uma eventual terapia. Além disso, a subpopulação de
LLA-B com potencial clonogênico, ou seja, que sustenta o crescimento do tumor,
expressa este antígeno. Testes clínicos utilizando anticorpos monoclonais contra CD19
não revelaram uma alta incidência de variantes de escape negativas para este antígeno
(Ma, 2002). Com isso diversos estudos in vitro e in vivo foram realizados, apresentando
32
resultados promissores e demonstrando o potencial da terapia (Cooper, 2003; Cooper,
2005). No entanto, um efeito adverso desta terapia seria a eliminação de todos os
progenitores e células B maduras, poupando apenas os plasmócitos.
1.9 Importância da resposta condicional:
Com a escassez de TSAs caracterizados, os protocolos de imunoterapia têm
utilizado como alvo TAAs. Apesar de serem expressos nos tumores, a expressão destes
antígenos nos tecidos normais pode induzir respostas autoimunes, diminuindo a eficácia
da terapia e podendo provocar sérios efeitos colaterais nos pacientes. De fato, em testes
clínicos para tratamento de pacientes com melanoma utilizando infusão de TIL foi
observada a destruição de melanócitos normais, com desenvolvimento de vitiligo e
uveíte. Resultados semelhantes foram reportados em um teste clínico utilizando CARs
anti-CAIX para o tratamento de carcinoma renal (Lamers, 2006). Neste estudo foi
observada uma grave toxicidade hepática decorrente da expressão inesperada do
antígeno alvo nos ductos biliares. Estes efeitos exigiram medidas como suspensão da
terapia, redução da dose de células T ou administração de corticosteróide, limitando o
sucesso da terapia.
Mais recentemente foi reportado na literatura um estudo que apresentou um
grave efeito adverso. Neste teste clínico, um paciente com câncer de cólon metastático
foi tratado com um regime de condicionamento não mieloablativo e com infusão de 1010
linfócitos expressando um CAR anti-Erbb2 de terceira geração contendo os domínios de
sinalização de CD28, 4-1BB e CD3ζ. No entanto, apenas 15 minutos após a infusão a
paciente apresentou edema e infiltrado pulmonar, e cinco dias depois a paciente veio a
óbito. A análise do soro da paciente demonstrou altos níveis de citocinas inflamatórias
33
(IL-6, TNF-α, IFN-γ) 4 horas após a infusão, consistente com o processo de intensa
liberação de citocinas. Os autores postularam que a morte desta paciente foi devido ao
reconhecimento do antígeno alvo expresso em baixos níveis pelas células epiteliais do
pulmão, e à migração inicial das células infundidas pelo pulmão, levando à liberação de
altas quantidades de citocinas e conseqüentemente falha de múltiplos órgãos (Morgan,
2010). Este estudo deixa clara a limitação dos protocolos atuais de transferência adotiva,
sendo necessário o desenvolvimento de mecanismos capazes de direcionar a resposta
especificamente contra células tumorais.
Fisiologicamente, a resposta imune mediada pelos linfócitos T é regulada por
um balanço entre os receptores coestimulatórios e inibitórios. Os receptores inibitórios
possuem um importante papel na homeostasia do sistema imune, sendo que alterações
nestas vias de regulação podem estar relacionados à progressão do câncer e a doenças
autoimunes (Chen, 2004). A utilização dos domínios de sinalização destas moléculas
inibitórias nos CARs poderia proporcionar um importante mecanismo de controle,
direcionando a resposta efetora apenas contra as células do tumor e poupando os tecidos
normais. Uma maneira de obter estes resultados seria a utilização de um sistema com
dois CARs, onde o receptor de ativação seria específico contra um TAA compartilhado
pelo tumor e pelo tecido alvo e o receptor inibitório específico para um antígeno
expresso somente pelo tecido normal. Dentre os receptores inibitórios descritos, os mais
estudados são os da família CD28, como o CTLA-4, PD-1 e BTLA (Figura 10).
34
Figura 10: Representação esquemática dos mecanismos de ação dos receptores inibitórios da família CD28. Esses receptores são capazes de suprimir a proliferação e secreção de citocinas por meio do recrutamento de fosfatases como SHP-1 e SHP-2, que inibem a ativação de proteínas-chave (por exemplo, PI3K) da via de sinalização do TCR. Adaptado de Murphy, 2006.
A molécula CTLA-4 tem a sua expressão induzida logo após a ativação da célula
T. Este receptor interage com os mesmos ligantes da molécula CD28, porém apresenta
uma maior afinidade por eles. A função inibitória desta molécula é crucial para a
manutenção da homeostase do sistema imune, como comprovado nos experimentos
utilizando camundongos CTLA4-knockout (Tivol, 1995). Esses animais, apesar de
nascerem sadios, desenvolvem um fenótipo linfoproliferativo após 5-6 dias,
caracterizado pela ativação de um grande percentual de células T e pela maciça
infiltração destas em órgãos não linfóides, resultando em morte após 3-4 semanas.
Como esta proteína não apresenta atividade enzimática, sua função é exercida através
do recrutamento de moléculas de sinalização pelos domínios de tirosina fosforilados
presentes no domínio citoplasmático. Moléculas como SHP-2, PP2A e PI3K já foram
35
descritas como sendo recrutadas por CTLA-4, mas o papel destas proteínas na inibição
dos linfócitos é controverso (Teft, 2006). Recentemente, um novo modelo de ação foi
proposto, onde a ligação de CTLA-4 induziria um aumento na mobilidade da célula T.
Esse aumento de mobilidade impediria o estabelecimento de interações estáveis entre o
linfócito e a APC, conseqüentemente inibindo a sua ativação (Rudd, 2008).
A molécula PD-1, originalmente descrita como um transcrito preferencialmente
expresso em células apoptóticas, possui um importante papel na manutenção da
tolerância periférica. Todos os estudos realizados até o momento demonstraram que a
ligação de PD-1 bloqueia a ativação da célula T. Camundongos knockout para PD-1
desenvolvem glomerulonefrite e artrite (linhagem C57BL/6) e cardiomiopatia
autoimune (linhagem BALB/c), sustentando ainda mais o papel desta molécula como
um regulador negativo da ativação do linfócito T (Chen, 2004). A cadeia citoplasmática
deste receptor possui duas tirosinas, que estão localizadas em motivos conservados
chamados ITIM (motivos inibitórios baseados em tirosina dos imunoreceptores) e ITSM
(motivos de troca baseados em tirosina dos imunoreceptores). Esses motivos, quando
fosforilados, são capazes de recrutar proteínas fosfatases e assim inibir a ativação do
linfócito. No entanto, um estudo utilizando linfócitos T CD4 humanos demonstrou que
apenas o motivo ITSM é crucial para a função do receptor, mediando o recrutamento
das fosfatases SHP-1 e SHP-2 e inibindo a proliferação e produção de citocinas
induzidas pela coestimulação por CD28 (Chemnitz, 2004).
O receptor BTLA é o mais recente membro da família CD28 descrito, sendo
expresso por células T ativadas, mas não por células naive. Experimentos in vitro e in
vivo confirmaram a sua função inibitória, sendo capaz de inibir a proliferação e secreção
de IL-2 em células murinas e humanas. Além disso, camundongos deficientes em
BTLA apresentam uma maior suscetibilidade de desenvolver encefalomielite autoimune
36
experimental (EAE) (Tao, 2005). A região citoplasmática de BTLA apresenta
similaridade com PD-1, também possuindo os dois motivos baseados em tirosina ITIM
e ITSM. Além disso, possui dois sítios (YXN) de ligação de proteínas adaptadoras
como Grb2/Grap. Apesar disso, mutações direcionadas nestes motivos não tiveram
efeito na habilidade do BTLA de inibir a ativação de linfócitos. A molécula perdeu sua
função inibitória apenas quando as quatro tirosinas da porção citoplasmática foram
mutadas. Apenas a fosfatase SHP-1 foi recrutada após ligação deste receptor, e
mutações que impediram esta interação não comprometeram a função inibitória
(Chemnitz, 2006).
No contexto da LLA de precursores B iniciais, os receptores quiméricos
inibitórios poderiam ser usados para direcionar a resposta especificamente contra os
blastos leucêmicos, poupando as células B maduras. Para isso, um receptor de ativação
seria direcionado contra o antígeno CD19, expresso nos blastos leucêmicos e nas B
maduras, e o receptor inibitório seria direcionado contra o antígeno CD20, expresso
apenas nas B maduras (Figura 11). Este tipo de abordagem pode possibilitar uma
diminuição dos efeitos colaterais de uma eventual terapia com CARs anti-CD19.
37
Figura 11: Esquema demonstrando o princípio da eventual terapia utilizando o sistema de CARs ativadores / inibitórios. As células T são modificadas ex vivo, expandidas e infundidas. Estas células migram para o sítio da doença, onde encontram células B normais e malignas. As células T reconhecem as células B normais, mas não se tornam ativadas devido à expressão de CD20 pela célula alvo, que interage com o CAR inibitório. Já a célula B maligna não expressa CD20, tornando-se alvo da célula T infundida pois apenas o receptor de ativação (anti-CD19) é ligado. Adaptado de Sadelain, 2003.
Para verificar se tal resposta condicional pode ser alcançada, utilizamos um
sistema de co-cultura in vitro entre a linhagem de linfócito T CD4+ humano Jurkat e a
linhagem mielóide K562. A linhagem Jurkat foi modificada para expressar um
plasmídeo que codifica a proteína luciferase sob o controle de um promotor responsivo
a NFAT, atuando como repórter da ativação da célula quando o NFAT é translocado
para o núcleo. Com isso, podemos avaliar o nível de ativação ou inibição induzido pela
ligação dos CARs expressos pela Jurkat. Neste modelo, a linhagem K562 atua como
38
alvo, expressando os antígenos CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) ou CD19 e CD20 (K5-
19/20). Estas proteínas não são expressas pela linhagem selvagem, tornando esta célula
o alvo ideal neste tipo de experimento. Resultados anteriores do nosso grupo
demonstraram a capacidade deste sistema de avaliar a translocação do fator de
transcrição NFAT para o núcleo após estímulo da linhagem Jurkat 4.30 20BBz com as
linhagens derivadas da K562 (Figura 12) e a construção dos CARs inibitórios por meio
da técnica de SOE-PCR (Figura 13).
Figura 12: Ensaio de luciferase, comprovando a funcionalidade do sistema repórter de ativação e do receptor quimérico. A linhagem Jurkat 4.30 transduzida ou não com o receptor ativador anti CD20 (20BBz) foi estimulada com PMA e Ionomicina ou co-cultivada com a linhagem K562 e suas derivadas expressando os antígenos alvo(K5-19, K5-20 ou K5-DUPLA) por 8 horas. Após este período, as células foram lisadas, o substrato foi adicionado e a atividade de luciferase foi medida no luminômetro. Os valores foram normalizados de acordo com o controle J 20BBz. J = Jurkat4.30; P+I = PMA + Ionomicina; CsA = ciclosporina A.
39
Figura 13: Esquema mostrando os CARs inibitórios previamente construídos e clonados no vetor pCR2.1. Estes receptores foram completamente seqüenciados, não apresentando alterações nas seqüências previstas.
40
2. OBJETIVOS:
2.1 Objetivo Geral:
Construção e validação funcional de um sistema de CARs de ativação e
inibição capazes de induzir uma resposta celular funcional contra uma célula que
expresse uma combinação específica de antígenos.
2.2 Objetivos Específicos:
• Clonagem dos CARs inibitórios anti-CD20 em vetores retrovirais e lentivirais.
• Transdução da linhagem Jurkat 4.30 com os CARs ativadores e inibitórios.
• Validação funcional dos CARs inibitórios através do ensaio repórter de ativação
baseado em luciferase e de marcadores de ativação (CD69).
• Transdução de linfócitos primários murinos e validação funcional dos CARs
através de ensaio de citotoxicidade.
• Estabelecimento de um modelo in vivo de tumor utilizando a linhagem de
melanoma murino B16F10 modificada para expressar os antígenos alvo CD19,
CD20 ou ambos.
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS:
3.1 Plasmídeos:
Os plasmídeos 19BBz e 20BBz foram cedidos pelo Dr. D. Campana (St. Jude
Children´s Research Hospital, Tennessee, EUA). Ambos codificam receptores
quiméricos de ativação que reconhecem respectivamente as proteínas CD19 e CD20
(que utilizaremos como protótipo de antígenos de membrana no nosso sistema) e
contém o domínio intracelular do receptor 4-1BB e do CD3ζ. Além disso, estas
construções possuem uma seqüência chamada IRES que possibilita o início da tradução
de uma segunda proteína a partir do mesmo RNA, neste caso a proteína verde
fluorescente GFP. Os plasmídeos pQCXIN e pQCXIP (Clontech) foram utilizados pra
clonar os CARs ativadores e inibitórios, respectivamente. Estes plasmídeos possuem a
seqüência IRES seguida de um gene que confere resistência ao antibiótico G418
(pQCXIN) ou puromicina (pQCXIP). Todos estes plasmídeos são desenhados para o
sistema de vetores virais derivados do MLV (Moloney Leukemia Vírus). O plasmídeo
pGL4.30 (Promega) codifica a proteína luciferase sobre o controle de um promotor
responsivo ao fator de transcrição NFAT, expresso por linfócitos ativados. Além disso,
codifica uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina B. O plasmídeo
EF1α-CD20, para o sistema lentiviral, codifica a proteína CD20 humana sobre o
controle do promotor EF1α e já está disponível no nosso laboratório (Serafini, 2004). O
plasmídeo EF1α-CD19-IRES-GFP codifica a proteina CD19 humana e o reporter GFP,
encontrando-se disponível em nosso laboratório. Os plasmídeos pEF-ENTRB (vetor de
entrada), pLenti CMV GFP DEST e pLenti CMV PURO DEST (vetores lentivirais de
destino) foram obtidos da empresa AddGene. Neste plasmídeos, o inserto é clonado no
42
vetor de entrada e, após uma reação de recombinação mediada pela enzima LR Clonase
(Invitrogen), é inserido nos vetores de destino.
3.2 Cultura de células:
A linhagem mielóide humana K562 e suas derivadas K5-19 (CD19+), K5-20
(CD20+) e K5-19/20 (CD19+, CD20+) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco)
suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado, L-glutamina (2mM) e
antibióticos (penicilina e estreptomicina). As linhagens humanas Jurkat e suas derivadas
(linfócito T CD4+), 293T e a linhagem murina B16F10 e suas derivadas foram
cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB inativado, L- glutamina
(2mM) e antibióticos (penicilina e estreptomicina). Todas as linhagens foram mantidas
em uma atmosfera contendo 5% de CO2 a 37°C e com saturação de umidade.
3.3 Produção de vetores virais:
Para a produção de vetores virais derivados do MLV, 3x106 células
empacotadoras 293T foram transfectadas pelo método de precipitação por fosfato de
cálcio com os plasmídeos GAGPOL (proteínas estruturais - 10µg) e VSV (envelope -
6µg), além do plasmídeo contendo o gene de interesse (20µg). Para a produção de
vetores virais derivados do HIV (lentivirus), 3x106 293T foram transfectadas pelo
mesmo método com os plasmídeos RRE, REV (proteínas estruturais - 10µg e 5µg),
VSV (6µg) e o plasmídeo contendo o gene de interesse (20µg). Em ambos os casos o
meio de cultura das células empacotadoras foi trocado no dia seguinte (d+1) e os
sobrenadantes contendo o vírus foram recolhidos nos d+2 e d+3 após a transfecção.
Estes sobrenadantes foram filtrados em filtros de 0,22µm (Millipore) e armazenados em
alíquotas de 1 ml a -70ºC.
43
3.4 Citometria de Fluxo:
O citômetro de fluxo FacsCalibur (BD Biosciences) foi utilizado para a titulação
dos vetores virais, avaliação da transdução das linhagens Jurkat4.30 e B16F10 e
avaliação do marcador de ativação na Jurkat. Os anticorpos contra proteínas humanas
utilizados foram: αCD19-FITC (eBiosciences), αCD19-PECy5 (eBiosciences), αCD20-
FITC (BD Biosciences), αCD20-APC (BD Biosciences), αCD69-PE (eBiosciences),
αFab-Biotina (Jackson Laboratories). Os anticorpos contra proteínas murinas utilizados
foram: αCD4-FITC (eBiosciences), αFoxp3-APC (eBiosciences). As células foram
lavadas duas vezes com PBS+1% soro humano e depois incubadas com o anticorpo na
devida diluição por 20 minutos no gelo. Após a incubação, as células foram lavadas
duas vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% e analisadas no citômetro.
3.5 Titulação dos vetores virais:
O título dos vetores foi determinado através da transdução das células 293T e
análise da expressão do transgene por citometria de fluxo. Em cada poço de placas de 6
poços foram plaqueadas 5x105 células 293T, que foram incubadas com o vetor viral no
dia seguinte. Para cada vetor, dois volumes diferentes de sobrenadante foram utilizados.
A transdução foi realizada na presença do policátion Polibrene (8µg/ml). Além disso,
duas centrifugações de 1800rpm durante 45 minutos foram efetuadas, com intervalo de
3 horas entre as duas. Dois dias após a infecção as células 293T foram tripsinisadas e
analisadas por citometria de fluxo para avaliar o nível de expressão dos transgenes. O
título foi calculado utilizando-se a fórmula: título = (F x N)/V; onde F é a freqüência de
células positivas, N é o número de células 293T no dia da transdução, e V é o volume
(em mL) de sobrenadante utilizado.
44
3.6 Transdução e purificação das linhagens:
A razão do número de partículas virais para cada célula alvo (MOI) variou
conforme o título obtido para cada vetor. A linhagem B16F10 (3x104) foi transduzida
com o vetor lentiviral EF1α-CD20 (MOI=50) e/ou com o vetor EF1α-CD19-IRES-GFP
(MOI=30). A linhagem Jurkat 4.30 (2x105) foi transduzida com o vetor pQCXIN-
19BBz ou pQCXIP-CAR Inibitório (MOI=5). Para potencializar as transduções, duas
centrifugações de 450g por 45 minutos foram realizadas, com intervalo de 3 horas entre
uma e outra. Além disso, Polibrene foi utilizado na concentração de 8µg/ml. As
linhagens resultantes B16-CD19, B16-CD20 e B16-CD19/CD20 foram expandidas e
depois purificadas por sorting utilizando o citômetro de fluxo MoFlo (Dako
Citomation). Já as linhagens Jurkat19BBz/20CTLA4, Jurkat 19BBz/20PD1 e Jurkat
19BBz/20BTLA foram selecionadas in vitro por meio da adição dos antibióticos G418
(1mg/mL) e Puromicina (1ug/mL) ao meio de cultura.
3.7 Ensaio de luciferase:
As células Jurkat 4.30 19BBz e suas derivadas expressando um dos CARs
inibitórios (1x105) foram ativadas com PMA 20µM + Ionomicina 1µM (controle
positivo) ou co-incubadas na proporção de 1:1 com as linhagens K562, K5-19, K5-20
ou K5-19/20. Como controle de ativação da via do TCR, utilizamos a droga
Ciclosporina A (CsA) na concentração de 1µM, 15 minutos antes da ativação. Após 8
horas de incubação, as células foram lavadas com PBS e o pellet foi ressuspendido em
PBL (tampão de lise). Ao lisado de cada condição experimental foi adicionado o
substrato luciferina e os resultados foram obtidos utilizando-se um luminômetro
Veritas® (Turner Biosystems).
45
3.8 Avaliação do marcador de ativação CD69:
As células Jurkat 4.30 19BBz e suas derivadas expressando um dos CARs
inibitórios (2,5x105) foram ativadas com PMA 20µM + Ionomicina 1µM (controle
positivo) ou co-incubadas na proporção de 1:1 com as linhagens K562, K5-19, K5-20
ou K5-19/20. Após 24 horas de incubação as células foram marcadas com o anticorpo
αCD69-PE e analisadas por citometria de fluxo.
3.9 Western blot:
A extração de proteína total das células Jurkat 4.30 19BBz e suas derivadas
expressando um dos CARs inibitórios foi realizada com tampão de lise RIPA, na
presença de coquetel de inibidores de protease (Sigma). A dosagem protéica foi obtida
utilizando-se do método de Lowry. A separação protéica foi feita em gel de
bisacrilamida 12% contendo Tris 1M (pH 8,8), H2O destilada, perssulfato de amônio
10% e Temed. Utilizou-se o método de transferência semi-seca do gel para membrana
de nitrocelulose, e bloqueio inespecífico com leite 5% e PBS-T 0,1%. O anticorpo goat
anti-mouse IgG 1:1000 conjugado a peroxidase (KPL) foi incubado overnight à 4ºC.
Para a revelação foi utilizado o kit ECL (GE Healthcare).
3.10 Modelo in vivo de melanoma:
Células da linhagem B16F10 (5x105) modificada para expressar os antígenos
alvo foram injetadas por via subcutânea no flanco direito de animais C57BL/6. A cada
dois dias as dimensões do tumor eram obtidas utilizando-se um paquímetro e o volume
do tumor foi calculado segundo a fórmula V = A2 x B / 2, onde A é o menor diâmetro
do tumor, B é o maior diâmetro do tumor e V é o volume. Os animais foram
46
sacrificados quando o tumor atingiu entre 1500-2000mm3 ou quando o tumor
apresentou sinais de ulceração.
47
4. RESULTADOS:
4.1 Clonagem dos CARs nos vetores retrovirais:
A construção dos CARs inibitórios 20CTLA4, 20PD1 e 20BTLA já havia sido
realizada por nosso grupo utilizando a técnica de SOE-PCR. Estes seqüências foram
clonadas no vetor pCR2.1 e completamente seqüenciadas, não apresentando erros. Para
permitir a validação destes receptores em linfócitos o CAR ativador e os CARs
inibitórios foram clonadas nos vetores retrovirais pQCXIN e pQCXIP, respectivamente.
Estes vetores possuem um gene de resistência aos antibióticos G418 e puromicina,
permitindo a seleção em cultura de células que expressem os dois receptores. As
seqüências correspondendo aos receptores foram retiradas do vetor pCR2.1 com a
enzima EcoRI e clonados no vetor pQCXIN ou pQCXIP abertos com a mesma enzima.
Como pode ser visto na figura 14, após digestão controle com a enzima de restrição, as
colônias mostradas apresentaram o inserto na orientação certa.
48
Figura 14: Clonagem dos CARs inibitórios. Em A e B estão mostrados os esquemas dos plasmídeos retrovirais utilizados, com as enzimas usadas para clonagem (EcoRI) e controle (BmgBI ou BamHI) destacadas. Em C, o gel mostrando a digestão controle com BamHI dos CARs inibitórios 20CTLA4 (1), 20PD1(2) e 20BTLA (3) apresentando a banda de 200pb e com BmgBI do CAR ativador 19BBz (4) com a banda de 900pb. As setas indicam as bandas do marcador molecular. MM = marcador molecular de 1kb (Invitrogen).
4.2 Transdução e seleção da linhagem Jurkat 4.30 com os CARs ativadores
e inibitórios:
Como já foi mostrado, a linhagem Jurkat 4.30 é capaz de indicar o nível de
translocação de NFAT pro núcleo após um estímulo, sendo então uma medida de
ativação da célula. Sendo assim, com o objetivo de validar a funcionalmente os CARs
inibitórios esta linhagem foi transduzida com o vetor retroviral pQCXIN-19BBz e com
um dos receptores inibitórios. Dois dias após transdução foram adicionados os
antibióticos G418 (1mg/mL) e puromicina (1ug/mL) ao meio de cultura para a seleção
49
de células duplo-positivas. Duas semanas após o início da seleção a expressão dos
CARs inibitórios foi avaliada por citometria de fluxo utilizando-se o anticorpo αFab-
biotina e estreptavidina-PE. Este anticorpo reconhece a porção extracelular apenas do
CAR anti-CD20 (Altvater, 2009), não reconhecendo o CAR anti CD19. A figura 15
mostra que 98% das células Jurkat 4.30 expressam o CAR 20PD1 (figura 15C) e que
93% expressam o 20BTLA (figura 15D), demonstrando uma eficiente transdução e
seleção in vitro. No entanto apenas 8% das células expressavam 20CTLA4 (figura
15B), mesmo estas permanecendo vivas após o tratamento com as drogas.
50
Figura 15: Avaliação da expressão dos CARs inibitórios após transdução com vetor retroviral e duas semanas de seleção com G418/puromicina. O controle negativo corresponde a Jurkat 4.30 não transduzida marcada com αFab-biotina/estreptavidina-PE.
51
A expressão dos CARs inibitórios também foi avaliada por western blot,
especialmente para determinar se o receptor 20CTLA4 estava sendo expresso. Como
pode ser visto na figura 16 os receptores apresentam peso molecular condizente com o
previsto (38KDa para 20CTLA4, 45KDa para 20PD1 e 46KDa para 20BTLA). Isto
demonstra que os três receptores construídos são eficientemente expressos na linhagem
Jurkat.
Figura 16: Avaliação da expressão dos CARs inibitórios na Jurkat por western blot utilizando o anticorpo ααααFab-biotina/estreptavidina-HRP. Como controle positivo foi utilizado um extrato protéico de baço de camundongo, contendo a cadeia leve (25KDa) e pesada (52KDa) da IgG. Como controle negativo foi utilizado um extrato de Jurkat não transduzida.
4.3 Validação funcional dos CARs - ensaio de luciferase:
Como mostrado na introdução, para a detecção do NFAT nuclear como
indicativo da ativação celular utilizamos como sistema repórter o plasmídeo pGL4.30,
que codifica a proteína luciferase sobre o controle de um promotor responsivo a NFAT.
52
Desta forma podemos utilizar as células Jurkat expressando as diferentes combinações
de CARs ativador/inibitório para quantificar o nível de ativação/inibição mediado por
estes após a interação com os ligantes. A linhagem Jurkat e suas derivadas foram
ativadas mediante adição de PMA/Ionomicina (controle positivo) ou co-incubação com
as linhagens K562 expressando os antígenos alvo e, após 8 horas, foram lisadas e a
atividade de luciferase medida com o auxílio de um luminômetro. Como pode ser visto
na figura 17, quando as células Jurkat são co-incubadas com a linhagem K5-19 uma alta
atividade de luciferase é observada, correspondendo à atividade do receptor 19BBz. No
entanto, quando as células contendo os dois CARs (19BBz e um CAR inibitório) são
co-incubadas com a K5-DUPLA, ocorreu uma grande diminuição da atividade de
luciferase, sendo este um forte indício de que estes receptores são capazes de inibir a
ativação induzida pelo CAR 19BBz. É importante ressaltar que a incubação das células
Jurkat com a K5-20 não alterou a atividade de luciferase, permanecendo similar ao sinal
obtido com a co-incubação com a K562 selvagem.
53
Figura 17: Resultado do ensaio de luciferase, demonstrando a capacidade dos CARs inibitórios de inibir a translocação de NFAT para o núcleo. O sinal foi avaliado após 8 horas de incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina e foi normalizado em relação à condição K562.
4.4 Validação funcional dos CARs - marcador de ativação linfocitário
CD69:
A molécula CD69 é considerada um marcador inicial de ativação de linfócitos T,
não sendo expressa por linfócitos não ativados. Diversos trabalhos na literatura apontam
uma regulação similar desta molécula na linhagem Jurkat (Aussel, 1996; Fernández-
Riejos, 2008). Sendo assim, para verificar se os CARs inibitórios são capazes de
modular a expressão deste marcador, as linhagens Jurkat foram co-cultivadas com as
linhagens alvo K562 e suas derivadas por 24 horas. Após este período a presença desse
marcador foi avaliada por citometria de fluxo. A figura 18 mostra que a expressão de
CD69 aumenta quando os linfócitos são ativados por PMA/Ionomicina ou K5-19, mas
esta molécula se mantém em níveis basais quando os linfócitos são co-cultivados com a
54
K562 WT (selvagem) ou K5-20. No entanto, quando as Jurkat são co-cultivadas com a
K5-DUPLA o percentual de células expressando CD69 permanece parecido com o
controle (K562 selvagem), o que constitui um forte indício da capacidade inibitória dos
CARs 20CTLA4, 20PD1 e 20BTLA sobre a atividade do CAR 19BBz e,
conseqüentemente, sobre a ativação dos linfócitos.
Figura 18: Avaliação da expressão do marcador de ativação CD69 após 24 horas de incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina (P+I). As células foram marcadas com o anticorpo anti-CD69PE e analisadas por citometria de fluxo. As células K562 não expressam esta molécula (dados não mostrados). CsA = ciclosporina A.
4.5 Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A:
A linhagem Jurkat foi escolhida para estes ensaios iniciais pois, além de ser um
linfócito CD4+, é imortalizada e possui alta capacidade de proliferação, características
que favorecem a transdução com vetores retrovirais e a posterior seleção com
antibióticos. No entanto, a transdução de linfócitos primários se mostra mais difícil,
55
uma vez que estas células são mais sensíveis à apoptose. Além disso, a transdução com
retrovírus requer constante ativação via TCR e proliferação dos linfócitos, o que pode
prejudicar a sobrevivência e induzir a exaustão funcional dos linfócitos, inversão da
razão CD4/CD8, perda da subpopulação de linfócitos naive e diminuição do repertório
de TCRs (Sauce, 2002). Com isso, protocolos recentes vêm empregando vetores
lentivirais para a transdução deste tipo celular. Esses vetores requerem apenas que o
linfócito esteja na fase G1b do ciclo celular, condição alcançada mediante estímulo com
baixas doses de citocinas como IL-2 e IL-7 (Cavalieri, 2003), levando à preservação da
capacidade funcional destas células. Esses vetores também parecem ter um perfil de
sítios de integração mais seguro, diminuindo as chances de tumorigênese. (Montini,
2006).
O sistema de CARs proposto implica na expressão de dois receptores diferentes
na mesma célula, sendo tecnicamente preferível a utilização de apenas um vetor viral.
Classicamente o elemento viral IRES (internal ribosomal entry site) é utilizado para
obter a expressão de duas proteínas a partir do mesmo transcrito e sobre o controle do
mesmo promotor. Este elemento é posicionado entre os insertos e assume uma estrutura
secundária que mimetiza o 5’cap, permitindo o acoplamento do ribossomo e a tradução
da segunda proteína. No entanto, este mecanismo não apresenta uma alta eficácia,
fazendo com que a proteína situada após o IRES tenha uma expressão
consideravelmente mais baixa (Mizuguchi, 2000).
Trabalhos recentes vêm utilizando a seqüência 2A (derivada de um picornavirus)
para a expressão de duas proteínas no mesmo vetor. Este pequeno peptídeo (18
aminoácidos), durante a sua tradução, interage com o túnel de saída do ribossomo,
impedindo a formação da última ligação peptídica no C-terminal do 2A. O mesmo
ribossomo continua a tradução da segunda proteína e a primeira proteína é liberada com
56
o 2A fusionado no C-terminal. A segunda proteína permanece apenas com o último
aminoácido (prolina) do 2A fusionado ao seu N-terminal. A grande vantagem deste
sistema é a expressão das duas proteínas de forma equimolar, permitindo um maior
controle da estequiometria dos transgenes (Szymczak, 2004).
Resolvemos utilizar este sistema para expressar o receptor 19BBz juntamente
com um CAR inibitório em linfócitos T primários. A figura 19A mostra o esquema da
construção, desenhada seguindo os parâmetros definidos por Yang e colaboradores
(Yang, 2008). As seqüências V5 e SGSG servem como espaçadores, aumentando a
eficiência do processo. O sítio para a protease furina (expressa no complexo de Golgi)
permite a eliminação dos peptídeos residuais do 2A no primeiro receptor quimérico. O
cassete de expressão contendo os dois receptores foi clonado no vetor de entrada pEF-
ENTRB, que possui o promotor EF1α e os sítios de recombinação attL1 e attL2. Estes
sítios permitem a recombinação com os respectivos sítios attR1 e attR2 presentes nos
vetores lentivirais pLenti CMV GFP DEST e pLenti CMV PURO DEST através da
utilização da enzima LR Clonase (figura 19B). O gel da figura 19C representa os clones
obtidos após o processo de recombinação da seqüência EF1α-19BBz-2A-20PD1,
demonstrando que as clonagens foram realizadas com sucesso.
57
Figura 19: Construção do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A, como esquematizado no painel A. Os elementos estão descritos no texto. Em B estão representados os mapas dos plasmídeos lentivirais de destino, que possuem os sítios de recombinação attR1 e attR2. O gel no painel C representa a clonagem do cassete EF1α-19BBz-2A-20PD1 no vetor pLenti CMV GFP DEST (1) ou pLenti CMVPURO DEST (2) após controle com a enzima de restrição EcoRV (bandas de aproximadamente 8500, 2500, 1600 e 430 pb). M = marcador molecular de 1kb (Invitrogen).
4.6 Validação do vetor lentiviral EF1αααα-19BBz-2A-20PD1:
Com o objetivo de verificar a funcionalidade desta nova construção, a linhagem
Jurkat 4.30 foi transduzida com o vetor lentiviral EF1α-19BBz-2A-20PD1 PURO e
selecionada com puromicina durante uma semana. No entanto, como podemos ver na
figura 20A, as células não apresentavam marcação para o receptor 20PD1, mesmo após
extensa morte celular observada durante o período de seleção com antibiótico. Apesar
58
deste resultado, células Jurkat que foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo
uma configuração de receptores invertida (EF1α-20z-2A-1941BB GFP) apresentaram
marcação de cerca de 20% (Figura 20B).
Figura 20: Análise de citometria de fluxo das células Jurkat transduzidas com os vetores lentivirais EF1αααα-19BBz-2A-20PD1 PURO (A) ou EF1αααα-20z-2A-1941BB GFP (B). As células foram marcadas com o anticorpo primário αFab-biotina e com estreptavidina-PECy5. O controle negativo utilizado foi a Jurkat negativa marcada com o anticorpo/estreptavidina (coluna da esquerda).
O ensaio repórter de ativação baseado em luciferase também foi realizado com
as células Jurkat 4.30 19BBz-2A-20PD1. Como podemos ver na figura 21, a co-cultura
com a linhagem K5-19 resultou em uma pequena atividade de luciferase, enquanto que
o controle positivo PMA/Ionomicina apresentou uma atividade 200 vezes superior à
condição K562 (atividade basal). Além disso, quando co-incubada com a K5-DUPLA, o
receptor 20PD1 não foi capaz de inibir a baixa atividade do 19BBz.
59
Figura 21: Ensaio de luciferase para validação do sistema de expressão baseado no peptídeo 2A. O sinal foi avaliado após 8 horas de incubação com as linhagens alvo ou PMA/Ionomicina e foi normalizado em relação à condição NEG (não estimulada).
4.7 Transdução da linhagem B16F10:
Os dados obtidos até o momento sugerem que os CARs inibitórios são
funcionais e que a utilização destes receptores juntamente com o 19BBz pode ser útil na
eliminação preferencial das células tumorais. Com o objetivo de validar este sistema in
vivo utilizaremos a linhagem murina B16F10. Esta linhagem apresenta baixa
imunogenicidade e baixa expressão de MHC de classe I, além de um grande potencial
de invasão de tecidos normais quando implantada de forma subcutânea, tornando-se um
atrativo modelo para o teste de terapias baseadas em transferência de células T. Sendo
assim, esta linhagem foi transduzida com vetores lentivirais EF1α-CD20 e/ou EF1α-
CD19-IRES-GFP codificando as proteínas alvo CD20 ou CD19 e as células positivas
foram purificadas por sorting. A figura 22 mostra que, após a purificação, foram obtidas
células com alto nível de expressão destas proteínas, todas cima de 80%.
60
Figura 22: Análise da expressão de CD19 e CD20 na linhagem B16F10 após transdução e purificação por sorting. Em A está mostrado a B16 selvagem marcada com o anticorpo αCD20-APC como controle negativo. Em B a linhagem B16 CD19, com 91% de positividade avaliada através do marcador GFP. Em C a linhagem B16 CD20, apresentando 99% de marcação utilizando o anticorpo αCD20-FITC. Em D a linhagem B16-Dupla apresentando 82% de positividade para CD19 (avaliado através de GFP) e CD20 (através de marcação com o anticorpo αCD20-APC).
4.8 Estabelecimento do modelo in vivo:
As linhagens B16 geradas através de transdução lentiviral foram injetadas por
via subcutânea em animas C57BL/6, configurando um modelo singeneico.
Primeiramente foram injetadas 3 doses diferentes de células, sendo 105, 5x105 e 106,
buscando uma maior uniformidade em relação ao aparecimento e crescimento do tumor.
A dose escolhida foi de 5x105 células para as três linhagens. A figura 23 mostra a
cinética de crescimento tumoral para as linhagens B16 CD20 (Figura 23A) e B16 CD19
(Figura 23B). Não foi possível estabelecer uma cinética para a linhagem B16 duplo-
61
positiva devido ao padrão heterogêneo de surgimento dos tumores. É importante
ressaltar que as células tumorais retêm a expressão dos antígenos alvo após passagem in
vivo (figura 24).
Figura 23: Cinética de crescimento tumoral das linhagens B16 CD20 (A) e B16 CD19 (B) injetadas por via subcutânea. Cada linha do gráfico representa um animal.
Figura 24: Marcação das linhagens B16-CD19 (A) e B16-CD20 (B) após passagem in vivo. Os tumores foram retirados, macerados e colocados em cultura. Após cinco dias as células aderentes foram marcadas com os respectivos anticorpos e analisados por citometria de fluxo.
62
A indução de um estado linfopênico no hospedeiro antes da infusão de linfócitos
T cria um ambiente proprício para a proliferação e função efetora dos mesmos, sendo
esta uma abordagem já incorporada a diversos protocolos clínicos. Este efeito está
basicamente ligado à depleção de células com atividade supressora (linfócitos T
reguladores e células mielóides supressoras) e uma menor competição por citocinas
como IL-15 e IL-7. Uma das drogas que vem sendo utilizada com este objetivo é a
ciclofosfamida, um agente alquilante que, quando usado em baixas doses, induz a
depleção de linfócitos. Para testar este regime de condicionamento no nosso modelo,
camundongos com tumores estabelecidos (entre 150-200mm3) foram tratados com
100mg/kg ou 200mg/kg de ciclofosfamida. Dois, três ou quatro dias após a
administração da droga foi avaliada a contagem de células no sangue periférico e o
percentual de células CD4+Foxp3+ (linfócitos T reguladores) no tumor, baço, linfonodo
drenante (linfonodo inguinal direito) e não drenante (linfonodo inguinal esquerdo).
Como pode ser observado na figura 25A, tanto a dose de 100mg/kg quanto a dose de
200mg/kg induziram uma profunda linfopenia, com a maior queda sendo observada
quatro dias após a administração da droga. O percentual de linfócitos T reguladores
(células FoxP3+) no compartimento de células CD4+ , que antes do tratamento os
chegam a ser mais de 20% das células CD4+ infiltradas no tumor, também apresentou
uma grande queda em todos os locais avaliados, sendo que a dose de 200mg/kg mostrou
os resultados mais expressivos (figura 25B).
Em outro experimento, realizado da mesma forma, o volume do tumor ao longo
do tempo foi medido, para assegurar que a ciclofosfamida não estava tendo um efeito
inibitório sobre o crescimento tumoral. A figura 26 mostra que as duas doses de
ciclofosfamida não são capazes de afetar o crescimento do tumor de forma significativa,
permitindo assim que o efeito dos linfócitos transferidos seja avaliado de forma precisa.
63
Figura 25: Avaliação da linfopenia (A) e percentual de células T reguladoras (Treg) (B) após administração de ciclofosfamida a animais com tumores estabelecidos. A linfopenia foi determinada através da contagem das células do sangue periférico após lise de hemácias. Em B, os órgãos foram retirados, macerados e as células marcadas com os respectivos anticorpos. Os percentuais apresentados são dentro da sub-população CD4+. Ciclo = ciclofosfamida; LN dren = linfonodo drenante; LN n-dren = linfonodo não drenante.
Figura 26: Efeito da ciclofosfamida sobre o crescimento do tumor. Animais com tumores estabelecidos (150-200mm3) foram tratados ou não (ctrl) com as doses indicadas de ciclofosfamida e o tamanho do tumor foi avaliado a cada 2-3 dias. Ciclo = ciclofosfamida.
64
5. DISCUSSÃO:
A criação de um sistema de receptores quiméricos ativadores e inibitórios capaz
de direcionar a resposta de células T especificamente contra o tumor pode encontrar
grande utilidade no campo da imunoterapia. Uma vez que a grande maioria dos
antígenos-alvo é compartilhada pelo tumor e por tecidos normais, esta abordagem
permitiria uma diminuição dos possíveis efeitos colaterais oriundos do ataque a células
não transformadas, proporcionando um aumento na eficácia do tratamento.
Os dados apresentados constituem um importante passo na validação deste
sistema. Os vetores retrovirais construídos se mostraram eficientes na transdução da
célula Jurkat, sendo possível a derivação de linhagens expressando estavelmente o CAR
19BBz e um dos CARs inibitórios. Apesar de apenas 8% das células apresentarem
marcação para o receptor 20CTLA4 através de citometria de fluxo (figura 15B), o
western blot demonstrou que este CAR está presente em altos níveis nas células (figura
16). De fato, estudos anteriores demonstraram que em linfócitos não ativados a proteína
AP-2 interage com as tirosinas não fosforiladas da cauda citoplasmática de CTLA-4 e
promove o seu redirecionamento para endossomos e lisossomos. Após ativação das
células as tirosinas são fosforiladas por proteínas como Lck e Zap-70, impedindo a
interação com AP-2 e mantendo a molécula na membrana plasmática (Shiratori, 1997).
Este fenômeno pode explicar a baixa detecção da molécula de CTLA4 nas células não
estimuladas, como observamos neste trabalho. Pretendemos analisar a expressão do
CAR de inibição baseado em CTLA4 logo após o estímulo pelo CAR de ativação para
verificar se há um aumento na expressão desta molécula na membrana.
O sistema repórter de ativação da célula T baseado na atividade de luciferase já é
bem descrito na literatura, inclusive como ferramenta para a caracterização de
65
receptores quiméricos (Schaft, 2003). Este método se mostrou rápido e eficaz, podendo
ser utilizado juntamente com outros testes in vitro capazes de atestar a ativação
antígeno-específica do linfócito, como liberação de citocinas e ensaio de citotoxicidade.
Como mostrado na figura 17, os três CARs inibitórios construídos são capazes de
impedir a translocação de NFAT para o núcleo, sugerindo que estes CARs possuem a
capacidade de inibir a ativação de linfócitos T. Além disso, esses CARs inibem o
aumento de expressão do marcador de ativação CD69 (figura 18), outra forte evidência
da funcionalidade destes receptores. Evidências na literatura apontam que as funções
inibitórias de CTLA-4, PD-1 e BTLA podem ser mediadas por fosfatases que inibiriam
eventos inicias da via de sinalização do TCR. Estudos relatados na literatura de
imunoprecipitação destas moléculas inibitórias demonstraram interação da fosfatase
SHP-1 com PD-1 e BTLA, e da fosfatase SHP-2 com CTLA-4 e PD-1 (Chemnitz,
2006). De fato, um estudo recente demonstrou que a ausência de atividade citotóxica
dos TILs em um modelo murino de adenocarcinoma é devida à superexpressão de SHP-
1 (Monu, 2007), mostrando que esta fosfatase pode ter um papel importante na
regulação da ativação de linfócitos T. No entanto, a fosfatase SHP-2 parece não ter um
efeito crucial, uma vez que células T superexpressando uma forma inativa desta
proteína apresentavam receptores CTLA4 e PD-1 funcionais (Salmond, 2005). Outra
proteína que pode estar envolvida com a atividade inibitória de receptores com motivo
ITIM (PD-1, BTLA) é o adaptador Crk. Foi demonstrado que a fosforilação deste
adaptador é crucial para a função inibitória de KIR2DL1, um receptor de células NK
com motivo ITIM (Peterson, 2008).
Uma das preocupações durante o desenho da abordagem proposta com CARs
inibitórios é o balanço entre o nível de expressão do CAR de ativação e o de inibição.
No contexto do sistema de CARs proposto, a utilização de um método de expressão
66
baseado no peptídeo 2A consiste na melhor opção. Os dados obtidos em relação à
sinalização de células NK sugerem que o balanço de sinais provenientes de diferentes
receptores define a ativação da célula (Lou, 2000). Evidências de estudos realizados in
vitro sugerem que o mesmo acontece em linfócitos T (Nurieva, 2006). Sendo assim, a
expressão dos CARs ativadores e inibitórios em níveis semelhantes pode ser crucial
para a correta função do sistema. O dado mostrado na figura 20 sugere que o peptídeo
2A não está funcional, uma vez que as células apresentam marcação para o CAR anti-
CD20 apenas quando este está posicionado antes da seqüência do 2A. O resultado do
ensaio de luciferase (figura 21) mostra uma baixa capacidade do receptor 19BBz de
induzir a translocação de NFAT para o núcleo quando comparado ao controle positivo
PMA/Ionomicina, o que pode sugerir uma baixa expressão do receptor na membrana ou
inabilidade de recrutamento das proteínas que medeiam a sinalização, sendo que estas
duas hipóteses podem ser explicadas por uma falha do sistema contendo o peptídeo 2A
em expressar corretamente os dois CARs. Além disso, após co-cultura com a K5-
DUPLA, o CAR 20PD1 não foi capaz de inibir a baixa atividade do receptor 19BBz. De
fato, um artigo publicado recentemente mostrou que seqüências que apresentam um
peptídeo sinal no N-terminal, como no caso dos CARs, podem inibir a função do 2A (de
Felipe, 2010), o que poderia explicar nossos resultados.
Um ponto importante do sistema de CARs proposto é o fenótipo induzido nos
linfócitos T após interação com os receptores. O modelo apresentado de terapia (figura
11) implica a constante estimulação do linfócito pelo receptor inibitório. Neste contexto,
diversos trabalhos vêm demonstrando o papel de moléculas inibitórias, como PD-1, na
indução de anergia (Tsushima, 2007) e exaustão funcional do linfócito (Barber, 2006), o
que poderia impossibilitar o uso destes receptores. No entanto, evidências na literatura
sugerem que estes efeitos são reversíveis. Em um modelo in vivo de indução de anergia
67
por administração de antígenos solúveis, a infusão de anticorpos agonistas α4-1BB foi
capaz de impedir e reverter o estabelecimento de anergia (Wilcox, 2004). Em outro
trabalho, o bloqueio da interação entre PD-1 e o ligante PD-L1 recuperou a função
efetora dos linfócitos previamente não responsivos (Barber, 2006). Estes dados sugerem
que o CAR 19BBz seria capaz de reverter este fenótipo e conseqüentemente ativar o
linfócito T mesmo que esta célula tenha sido previamente estimulada pelo CAR
inibitório.
Outro fenótipo que pode ser induzido é o de linfócito Treg. Em linfócitos T
reguladores humanos, a expressão de CTLA-4 foi associada a uma maior atividade
supressora e maior expressão de Foxp3 quando comparada com Tregs CD4+ CD25+
CTLA-4neg. Além disso, o bloqueio de CTLA-4 resultou em uma perda significativa da
atividade supressora, mostrando que este receptor está envolvido na função desta célula
(Birebent, 2004). Avaliaremos, portanto a presença de células CD4+/FoxP3+ na
população estimulada com ligantes dos CARs inibitórios, especialmente quando estes
ensaios forem realizados com linfócitos T primários.
Além da aplicação no tratamento de LLA, este sistema de receptores
ativadores/inibitórios poderia ser utilizado para o tratamento de diversos tipos de câncer.
Freqüentemente, ao longo do processo de transformação e aquisição de um fenótipo
indiferenciado, os tumores perdem a expressão de inúmeras proteínas, muitas delas
moléculas de membrana, enquanto o tecido normal mantém estes marcadores. Sendo
assim, a utilização de um receptor inibitório direcionado contra um antígeno não mais
expresso pelo tumor, combinado com um receptor de ativação direcionado contra um
antígeno compartilhado entre o tecido normal e o tumoral permitiria a eliminação
seletiva das células neoplásicas pelos linfócitos T. Além do teste clínico citado na
introdução, em que um paciente morreu devido o reconhecimento do antígeno no tecido
68
normal (Morgan, 2010), recentemente foi publicado um editorial reiterando a
necessidade de CARs mais seguros (Heslop, 2010). O sistema proposto neste trabalho
consiste em uma potencial solução para estes problemas. Devido à estrutura do CAR,
praticamente qualquer antígeno de membrana pode ser utilizado como alvo, bastando a
amplificação da região VH e VL de um hibridoma que produza anticorpos específicos
contra o antígeno e sua subseqüente clonagem no receptor quimérico. Esta abordagem
seletiva possibilitaria a diminuição dos efeitos nocivos decorrentes da destruição de
células normais, característica ausente na maioria dos tratamentos atuais.
Como perspectivas, iremos transduzir células primárias murinas com vetores
codificando os CARs ativadores e inibitórios e avaliar a atividade efetora destas células
após interação com as linhagens expressando os antígenos alvo. Estes linfócitos
transduzidos serão também utilizados em ensaios in vivo, onde verificaremos a
capacidade destas células de eliminar tumores estabelecidos utilizando o modelo animal
de melanoma B16F10. Além disso, iremos transduzir linfócitos humanos anti-EBV e
avaliar a função destas células in vitro através de ELISA e ensaios de citotoxicidade e in
vivo em um modelo que utiliza as células leucêmicas humanas NALM-6 em
camundongos SCID imunodeficientes.
69
6. CONCLUSÕES:
• Os CARs inibitórios 20CTLA4, 20PD1 e 20BTLA são eficientemente expressos
pela linhagem Jurkat.
• Os CARs inibitórios, após interação com antígeno alvo, são capazes de inibir a
translocação de NFAT para o núcleo induzida pelo CAR de ativação 19BBz em
células Jurkat.
• A expressão do marcador de ativação CD69, induzida pelo receptor 19BBz, é
diminuída após interação dos CARs inibitórios com a proteína CD20 em células
Jurkat.
• O modelo in vivo de melanoma foi estabelecido utilizando a linhagem murina
B16F10 expressando os antígenos-alvo humanos CD19 e CD20. O tratamento
dos animais possuindo tumores estabelecidos com ciclofosfamida permitiu a
indução de linfopenia e depleção de linfócitos T reguladores CD4+ Foxp3+.
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