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Biotecnologia Animal

Luiz Lehmann Coutinho

Laboratório de Biotecnologia

ESALQ - USP

Introdução

• Qual é o objetivo da produção animal?

• Melhorar a eficiência e a qualidade dos produtos.

O que precisa ser melhorado?

• Conversão alimentar

• Eficiência do crescimento

• Eficiência reprodutiva

• Sanidade

• Qualidade da carne

O que poderia ser feito ?

• Seleção

• Seleção assistida por marcadores

• Animais transgênicos

• Novas vacinas

• Novos promotores de crescimento

Seleção assistida por marcadores

• Princípios

– Variação genética

– Identificação de alelos favoráveis

• Exemplos

– Gene do halotano

– Musculatura dupla

Princípios

Expressão Gênica

Variação genética

Polimorfismo:

Cromossomo 5

ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

PCR

Polimorfismo:Cromossomo 5

ATAACGCGCAATCTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGACTGACTATACAT

Marcadores Moleculares

• Determinação direta do genótipo

• Características de baixa herdabilidade

• Características não determináveis nos dois

sexos

• Características difíceis ou caras para serem

determinadas

Identificar genes responsáveis pela

prolificidade em suínos.

• Estratégia: Genes Candidatos

– Análise de genes conhecidos com base em

informações de fisiologia (hormônio ou

receptores ligados a reprodução).

– Mutações observadas em outras espécies.

– Resultados observados em animais

transgênicos.

Prolificidade em suínos

• Animais da raça Meishan chinesa tem um

maior número de leitões por leitegada.

• Investigação de genes ligados ao sistema

reprodutivo, por exemplo: ESR1

• Detecção do polimorfismo por PCR e digestão

com enzima de restrição.

1) Identificação da sequencia do gene.

2) Desenho de primers e amplificação do gene.

3) Sequenciamento em diversos indivíduos para detecção de

polimorfimsos.

4. Detecção de SNP

5. Estudo do efeito do polimorfismo na prolificidade.

Marcadores Genéticos em Uso

MARCADOR / TESTE OBSERVAÇÃO

Paternidade Uso não exclusivo

HAL Qualidade da carne – uso não exclusivo

ESR Tamanho de leitegada – uso exclusivo (PIC)

PRLR Tamanho de leitegada – uso exclusivo (PIC)

KIT Cor branca – uso exclusivo (PIC)

MC1R Cor vermelha / preta – uso exclusivo (PIC)

Fonte: PLASTOW (2000), citado por Freitas

Marcadores Genéticos em Uso

MARCADOR / TESTE OBSERVAÇÃO

MC4R Crescimento e deposição de gordura – uso

exclusivo (PIC)

FUT1 Resistência à E. Coli F18 – uso exclusivo

(PIC / ITH suiça)

RN Qualidade da carne – teste exclusivo e não

exclusivo (breve)

AFABP, HFABP Gordura intramuscular – uso não exclusivo

IGF2 Composição da carcaça – uso exclusivo

(Seghers)

"Trade secret tests" Várias características

Fonte: PLASTOW (2000), citado por Freitas

Bovinos

Bovino com fenótipo de musculatura dupla

Castelhano, E. C., 2000

McPherron et al., Nature e PNAS 1997

Musculatura dupla em bovinos

Testes de DNA para bovinos

•Tenderness

•Marbling

•Quality grade

•Yield grade

•Fat thickness

•Ribeye area

•Heifer pregnancy rate

•Stayability (longevity)

•Calving ease

•Docility

•Myostatin

•Arthrogryposis

Multiplex

•Coat color

•Breed-specific

horned/polled

•Multisire parentage

•BVD-PI diagnostic test

Clop, A., Marcq, F., Takeda, H., Pirottin, D., Tordoir, X., Bibe, B., Bouix, J., Caiment, F., Elsen,

JM., Eychenne, F., Larzul, C., Laville, E., Meish, F., Milenkovic, D., Tobin, J., Charlier, C.,

Georges, M.: A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the

myostatin gene affects muscularity in sheep., Nat Genet 38:813-818, 2006.

Pubmed reference: 16751773.

1) Identificação de um QTL no cromossomo 2

Georges, 2007

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

4/20/2010 Zootecnia I 57

Efeito de GH no crescimento

• Falta de HC

– Redução no crescimento

– Redução no crescimento do osso

– Redução na massa muscular

– Aumento na deposição de gordura

• Terapia com HC

– Aumento no crescimento de osso, músculo

– Aumento na síntese de RNA, proteína e entrada de a.a. nas células

– Diminuição de gordura

4/20/2010 Zootecnia I 59

Resultados de HC em bovinos

Observação Controle 33 ug rbST/kg PV/dia

GPD 1.14 1.23

Cons. 6.9 6.5

C/G 6.05 5.32

Rend. carcaça 62.7% 61.3%

Área long. 52.7cm2

56.6 cm2

Espes. gord 1.94cm 1.76cm

% gord. 41.9 36.3

% prot. 13.2 14.6

Moseley et al., 1992

Microinjeção em Pronúcleo

Microinjeção em Pronúcleo

Microinjeção em Pronúcleos

Vantagemlinhas transgênicas com

expressão correta.

Desvantagens

limitado à embriões

de 1 célula,

difícil visualização do

pronúcleo,

introdução de várias

cópias do transgene.

Microinjeção de ovos (Auburn Univ.)

Bagre do canal transgênico

Salmonídeo transgênico

Instalação para peixes transgênicos

Genes sendo transferidos

• Hormônio de Crescimento

• Proteína Anti-congelante

• Hormônio Liberador do Hormônio de

crescimento

• IGF-I

Salmonideo transgênico

Promotor AFP + gene HC

Salmonideo Transgênico

Progresso do melhoramento

Marcadores Moleculares

• Determinação direta do genótipo

• Características de baixa herdabilidade

• Características não determináveis nos dois

sexos

• Características difíceis ou caras para serem

determinadas

Fator limitante

• Quais são os genes que controlam

as características de interesse?

Princípios

Polimorfismo:

Cromossomo 5

ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Sequência do gene MyoD

MyoD : 881 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 940

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pMyoD: 241 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 300

MyoD : 941 ggaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttccc 1000

| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

pMyoD: 301 gcaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttncc 360

Como encontrar os polimorfismos

associados com a característica de

interesse ?

Estratégias:

• Procura em todo o genoma

• Genes candidatos

Bases Genéticas de Mapeamento:

• Segregação

• Recombinação

• Polimorfismo

Crossing-over e recombinação durante a meiose

Gametas

Bases Genéticas do Mapeamento

Mapeamento:

A

M

B

A

M

B

a

m

b

A

M

B

A

M

B

A

M

B

a

m

b

A

M

B

a

m

b

A

M

b

A

M

B

A

M

B

a

m

B

a

m

b

Polimorfismo:

Cromossomo 5

ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Microssatélites

• Sequência de bases (2-6 nucleotídeos)

repetidas várias vezes

• Alto grau de polimorfismo

• Distribuído ao acaso no genoma

Microssatélite

Profiles of a run by automatic DNA- Sequencer (ALF-

Pharmacia ) for two microsatelites - BM1224 e TEXAN15

BM1224

TEXAN 15

Sample sizer

150pb

50-500bp

sizer 150pb 200pb

Amplificação por PCR:

Cromossomo 5

ATAAC GCGCAATCACACACACTGACTGATATGTATATTGCGCGTTAGTGTGTGTGACTGACTATACATCromossomo 5’ATAAC GTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTATATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Exemplo de mapeamento em

aves

Identificação de regiões do

genoma: Mapeamento de QTLs

• Não necessita de informação prévia da localização do loco ou gene de interesse.

• A busca é feita em todo o genoma com marcadores microssatélite.

• Necessita de uma estrutura de família

– Cruzamento entre linhagens ou raças contrastantes

– Dentro de uma raça (desenho de netas)

• Bastante trabalhosa

• Pode resultar na localização do loco de interesse, mas podem existir muitos genes na região.

Projetos de mapeamento no

Brasil• Mapeamento de genes de resistência a ecto e

endoparasitas em bovinos (Embrapa)

• Mapeamento de genes de crescimento e qualidade

de carne em suínos (UFV)

• Mapeamento de genes de crescimento e qualidade

de carne em aves (Embrapa –ESALQ)

Mapeamento de genes de crescimento e

qualidade de carne em aves

(Embrapa –ESALQ)

• Cruzamento entre uma linhagen de corte (TT) e uma de postura (CC).

• Características fenotípicas (F2).

– Ganho de peso, consumo, conversão alimentar.

– Composição de carcaça

– Rendimento de partes

• Genotipagem (F2):

– Microssatélite

– SNP

Linhagem de corte (TT)

Linhagem de Postura (CC)

Caracterização dos Parentais e F1

Grupos

Genét.Peso

41d

Carc. Peito Gord. Pulmão Coração Hemat.

CC 514a 330a 73a 0,8a 4,4a 4,7a 32,2a

TT 2395b 1776d 486d 57,2b 17,1d 13,3d 34,6c

LLc 1689c 1185b 284b 37,8c 11,9b 9,8b 30,4b

CT 1573d 1129b 292b 30,8d 11,4b 8,9b 31,7ab

TC 1193e 832c 206c 18,1e 9,9c 7,0c 32,6a

Família de referência

• Seis machos TT X seis fêmeas CC para gerar a

população F1. Cruzamentos recíprocos.

• Seis famílias de F1 foram selecionados. Cada uma

com um macho e 3 fêmeas.

• Cada macho foi cruzado com 3 fêmeas para gerar

a população F2

• Cada família de F2 tem 100 indivíduos

• Total de 3600 indivíduos F2

Indivíduos F2

Mapeamento de QTL com

Microssatélites

Posição no cromossomo (cM) Marcador Nº do Kit

Resultado do 2

12 Mcw 248 3 Não associado

24 Mcw 168 7 Não associado

52 Lei 209 4 Não Otimizado

66 Gct 06 7 Não associado

71 Mcw 101 7 Não Otimizado

94 Mcw 106 7 Não associado

122 Adl 19 7 Não associado

151 Adl 234 7 Não Otimizado

162 Mcw 297 3 Associado (P<0,05)

169 Lei 146 3 Associado (P<0,01)

175 Lei 174 3 Associado (P<0,10)

211 Lei 71 3 Associado (P<0,01)

235 cM QTL identificado por van Kaam, et al. (1999)

259 Lei 101 3 Não associado

267 Adl 251 7 Não Otimizado

288 Mcw 218 3 Não associado

300 Lei 108 3 Não associado

309 Lei 160 3 Não associado

316 Lei 88 3 Não associado

330 Mcw 200 3 Não associado

366 Lei 91 3 Não associado

381 Lei 139 3 Não associado

400 Lei 169 3 Associado (P<0,10)

414 Mcw 283 3 Não associado

417 Lei 106 3 Associado (P<0,01)

424 Lei 107 3 Não associado

434 Lei 79 3 Associado (P<0,01)

455 Mcw 145 7 Associado (P<0,01)

466 cM QTL encontrado por van Kaam, et al. (1999)

475 Abr 328 7 Não associado

500 Adl 101 7 Não associado

520 Adl 238 7 Não associado

527 Lei 134 3 Não associado

565 Mcw 107 7 Não associado

Genotipagem Seletiva

Mapeamento de QTL no Cromossomo 1

0

2

4

6

8

10

12

14

0 100 200 300 400 500

Distâcia em cM

F

PN P42

P35 P41

Ligação significativa a 5%

Estratégia:

• Identificação de Genes Candidatos:

– Análise de genes conhecidos (hormônio de

crescimento, miostatina, fatores miogênicos,

...)

– Análise de sequencias expressas, EST

– Estudo de expressão gênica.

Exemplos

• Musculatura dupla

• Gene do halotano

• Receptor de estrogênio

Gene Halotano: receptor de

ryanodina.

• Mutação associada com aumento na % de

músculo na carcaça.

• Maior susceptibilidade ao estresse.

• Associado com pior qualidade de carne.

Polimorfismo:

Cromossomo 5

ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

RFLP

Digestão com enzima que reconhece a seqüência GCGC:

Cromossomo 5

GCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA

CGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

ATAACGC

TATTGCG

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Cromossomo 5

ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Receptor de estrogênio

• Animais da raça meishan chinesa tem um

maior número de leitões por leitegada.

• Associação entre polimorfismo do gene do

receptor de estrogênio e tamanho da leitegada.

• Detecção do polimorfismo por PCR e digestão

com enzima de restrição.

Deficiência na adesão de

leucócitos em bovinos (BLAD)

• Mutação na proteína CD18.

• Animais homozigotos para a doença

raramente sobrevivem.

• Freqüência gênica de 15% nos touros e 6%

nas fêmeas.

Bovino de musculatura dupla

Efeito da ausência de expressão do gene da miostatina em camundongos (McPherron et al.,

1997)

Castelhano, E. C., 2000

McPherron et al., Nature e PNAS 1997

Musculatura dupla em bovinos

Bovino com fenótipo de musculatura dupla

Castelhano, E. C., 2000

Exon 1 Exon 2 Exon 3Intron 1 Intron 2 DNA extra gênico

Síntese de RNA

RNA primário

RNAm

Processamento

Transcriptoma: Estudo de

seqüências expressas (EST)

Construção da biblioteca de cDNA

RNA total mRNA

AAAA

AAAA

AAAA

AAAA

Síntese do cDNA

RNA m

AAAAAA

TTTTTTNot I

Síntese da Primeira fita

AAAAAA

TTTTTTNot I

Síntese da Segunda fita

AAAAAA

TTTTTTNot I

Adição do Adaptador SalI

AAAAAA

TTTTTTNot I

AAAAAA

TTTTTTNot I

Digestão com NotI

AAAAAA

TTTTTTNot I

Ligação no Plasmídio

Sal I Sal I

Sal I

Sal I

Sequenciamento das EST

cDNA

ACGTACGTACGTAC

TGCATGCATGCATGPrimer

3’ 5’

5’

Plasmídio

Cromatograma

Análise de polimorfismo

SOMITOS

CÉLULAS

PLURIPOTENTES

FIBRA

MUSCULAR

MIOBLASTOS

PROLIFERAÇÃO

DETERMINAÇÃO

DIFERENCIAÇÃO

MATURAÇÃO

FGF / HGF / Prohibitin / Laminin B / Ciclinas / EBP1 / CDC45 /

BRCA1 / MCT1 / p10 binding ptn / peroxiredoxin 1 / RAB1 /

BTG1 / MN1 / Translationally controlled Tumor ptn / cell division

control ptn 4

Paired mesoderm homeobox ptn 1 / homeobox ptn

Hox-d12/ BMP1 / Transcriptor Factor 4 / Hoxa 7 /

Early development regulator 2 / Slug ptn /

Nucleoredoxin / RRM containg ptn SEB4 / COP9 /

TATA binding ptn associated factor / Mo25

Notch / ATF4 / PCAF associated factor / LIM /

Motch / retinoblastoma tumor supressor / SRF

/ Muscle specific gene M9 / Limb deformity ptn

/ pleiotrophin

Caldesmon / Transgelin / Destrin / Myosin

binding ptn / Collagen / Diaphanous ptn /

Catenin / Actina / Tubulinas / Calpactina /

Miosina / Dynactin / Dysbinding / SW1 / SNF

/ Keratin 17 / Troponina / Tropomiosinas

Macroarray

Microarray

Estudos de expressão gênica

Genes diferencialmente expressos entre linhagens de corte e postura

Metabolism

Cell growth and

maintenance

Unknown

Li...

Selected Gene Tree: Linhagens (Default Inter...

Selected Condition Tree: Linhagens (Default Inter...

Colored by: Linhagens (Default Interpretation)

Gene List: metabolism (155)

Linhagen... Li...

Selected Gene Tree: Linhagens (Default In...

Selected Condition Tree: Linhagens (Default In...

Colored by: Linhagens (Default Interpretation)

Gene List: cell growth and-or maintenance (2...

Linhagen... Li...

Selected Gene Tree: Linhagens (Def...

Selected Condition Tree: Linhagens (Def...

Colored by: Linhagens (Default Interpreta...

Gene List: molecular_function unknown...

Linhage...

Metabolism Cell growth and

maintenance

Unknown

•101 genes diferencialmente expressos entre as linhagens (P<0.05).

•Na linhagem de corte, 62 induzidos e na linhagem de postura 39 estavam induzidos.

•Entre os genes com maior expressão na linhagem de corte 1 esta envolvido com contração muscular, 3 com sinalização celular, 1 com proliferação celular, 2 com desenvolvimento de músculo e 2 com síntese de proteína.

• Entre os genes com maior expressão na linhagem de postura, 3 estavam envolvidos com sinalização celular e 2 com síntese de proteína.

Up-regulated Broiler

Up-regulated Layer

Mapeamento dos genes diferencialmente expressos em regiões de QTL

29,9 Mb

32,7 Mb

40,8 Mb

68,2 Mb

71 Mb

96,4 Mb

150,6 Mb

161,4Mb

21 Mb

41,9 Mb

QTL Carcass yield

59,6 Mb

71 MbQTL Breast weight**

147,5 Mb

154 Mb

176Mb

177,5 Mb

QTL Intestinal length * * and body weight

36,3 Mb

80,8 Mb

23 Mb

38,5 Mb

QTL Egg weight

73 Mb

90,5 Mb

QTL Carcass and breast weight and feed conversion **

GGA1: 11 transcripts DE

8 in QTLGGA2: 5 transcripts DE

2 in QTL

SOMITO MIOBLASTO MIOTUBO MIOFIBRA

MyoD ou Myf-5 Miogenina MRF4

Determinação Diferenciação Maturação

bFGF, TGF-, miostatina

oncogenes

Similaridade entre os perfis de expressão de MyoD/miogenina

Similaridade entre os perfis de expressão de MRF4/Myf5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728

Estádios de desenvolvimento

mR

NA

mio

sta

tin

a (

10

-3 f

mo

l/fm

ol b

-actin

a)

Valores observados

Valores estimados

MIOSTATINA

MIOSTATINA

Precursoras

Myo D

Myf 5

Mioblastos

Proliferação

Miogenina

Mioblastos

determinados

Miotubos

Diferenciação

Rb

Cdk2p21MIOSTATINA

Thomas et al. 2000, JBC, v.275, n.51, p.40235-43

McPherron et al, 1997

RESULTADOS DA

HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

Embrião HH20 Embrião HH24 Embrião HH24

RESULTADOS DOS CORTES

HISTOLÓGICOS

TN

NC

STST

NC

TN

Grupos

Genét.Peso

41d

Carc. Peito Gord. Pulmão Coração Hemat.

CC 514a 330a 73a 0,8a 4,4a 4,7a 32,2a

TT 2395b 1776d 486d 57,2b 17,1d 13,3d 34,6c

LLc 1689c 1185b 284b 37,8c 11,9b 9,8b 30,4b

CT 1573 1129 292 30,8 11,4 8,9 31,7

Expressão MyoD

0

10

20

30

40

50

60

70

E12 E15 E18 E24 E26

10

-4 fm

ole

s/f

mol b

actin

a

CC

LLC

TT

Atraso transiente na determinação - Expressão de MyoD

Expressão miogenina

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

E12 E15 E18 E24 E26

10

-4 f

mole

s/f

mol b

actin

a

CC

LLC

TT

Atraso transiente da diferenciação – Expressão de Miogenina

Expressão miostatina

0

5

10

15

20

25

E12 E15 E18 E24 E26

Estádios desenvolvimento

10

-4 f

mole

s/f

mol b

actin

a

CC

LLC

TT

Menor expressão do inibidor da proliferação de mioblastos –

Expressão de Miostatina

Strategy:

Gene candidato

Expressão diferencial de genes

MyoD : 881 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 940

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pMyoD: 241 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 300

MyoD : 941 ggaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttccc 1000

| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

pMyoD: 301 gcaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttncc 360

Polimorfismo

12

6

Mapa comparativo

(Humano)

EST