biologia molecular seminário - plantas transgênicas

PLANTAS PLANTAS TRANSGÊNICTRANSGÊNIC

ASAS

PLANTAS PLANTAS TRANSGÊNICTRANSGÊNIC

ASASPatrícia Gomes

João EvangelistaLaiane Fernanda

Patrícia GomesJoão EvangelistaLaiane Fernanda

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO Nos organismos ocorrem mutações gênicas que

sofrem a ação da seleção natural; Há cerca de 10.000 anos o homem iniciou a

agricultura; Domesticação de algumas plantas:

Cevada, trigo, ervilha e lentilhas data de 7.000 anos a.C;

Banana, maçã, batata, milho e outros vegetais datam de 5.000 anos a.C;

Abacaxi, certas hortaliças, morango, seringueira e dendê foram melhorados já na era cristã;

Redescoberta das leis de Mendel no início do século XX;

Melhoramento convencional; Hibridação introgressiva; Indução de mutações por agentes mutagênicos

químicos ou por radiações; Muitas metodologias de transformação genética

vegetal foram desenvolvidas nas últimas décadas.

Mas a maioria das plantas transgênicas até agora obtidas foi produzida por: Transformação mediada por agrobactéria; Transferência direta de DNA para protoplastos; Aceleração de partículas.

Melhoramento tradicional de plantas

Biotecnologia de plantas

TRANSFERÊNCIA DE GENES TRANSFERÊNCIA DE GENES MEDIADA POR MEDIADA POR

AGROBACTÉRIASAGROBACTÉRIAS Primeiro método utilizado para gerar plantas

trans-gênicas; Agrobacterium tumefaciens e a A. rhizogenes; A Agrobacterium tumefaciens é o agente

causador da galha-da-coroa, doença caracterizada pelo crescimen-to de tumores na junção entre o caule e a raiz;

O T-DNA; A preparação de uma linhagem de

Agrobacterium para ser utilizada como vetor no processo de transfor-mação de plantas inclui duas etapas;

Na primeira, os oncogenes são deletados, obtendo-se uma linhagem desarmada;

Na segunda, os vetores são preparados de modo que eles irão apresentar apenas as extremidades direita e esquerda e os genes de interesse;

Esse método é utilizado para transformar dicotile-dôneas (tabaco, batata, soja etc.).

Transformação genética mediada por agrobactérias

TRANSFERÊNCIA DIRETA DE TRANSFERÊNCIA DIRETA DE DNA PARA PROTOPLASTOSDNA PARA PROTOPLASTOS

Protoplastos são células que tiveram suas paredes celulares removidas, permanecendo a membrana plasmática;

Os protoplastos são submetidos a tratamentos químicos ou elétricos para absorver DNA ou outras moléculas desejáveis;

Incorporação de DNA mediada por polietilenoglicol

Cátions carregados positivamente: Unem as moléculas de PEG e DNA aos protoplastos;

Ligação do DNA à superfície da célula;A primeira espécie transformada foi o tabaco;Outras dicotiledôneas e monocotiledôneas transfor-madas através desse método atualmente:

Azevém Trigo

Incorporação De DNA Promovida Por Eletroporação

Os protoplastos são expostos a pulsos elétricos curtos e de alta voltagem, na presença de DNA exógeno;Esse método tem sido utilizado para um número limitado de espécies vegetais;Primeiro cereal transgênico fértil gerado por eletroporação:

Arroz

Transferência direta de DNA para protoplastos por eletroporação

TRANSFORMAÇÃO TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA POR GENÉTICA POR

ACELERAÇÃO DE ACELERAÇÃO DE PARTÍCULASPARTÍCULAS

É a introdução de moléculas de DNA em células vegetais intactas, através da utilização de micro-projéteis acelerados a alta velocidade;

Qualquer tecido com potencial de regeneração é adequado para a transformação genética através desta técnica;

Os aparelhos para acelerar as micropartículas podem ter propulsão a ar comprimido, a vapor d’água, a pólvora, a gás hélio ou a eletricidade.

Praticamente todos os vegetais de importância agronômica já foram transformados por esse método;

Adequado tanto para dicotiledôneas como para mo-nocotiledôneas.

Células-alvo

Tubode aceleração de

gás

Micropartículas contendo DNA

Transformação genética mediada por biobalística

IMPORTÂNCIA DA IMPORTÂNCIA DA CULTURA DE TECIDOSCULTURA DE TECIDOS

Não é um pré-requisito; Arabidopsis thaliana mediada por Agrobacterium:

Pode ser obtido pela inoculação direta de plântulas; Replantio das mesmas no solo; Seleção sobre plântulas germinadas a partir de semen-

tes geradas de plantas transformadas. Método empregado na maioria dos procedimentos; Eficiência na transferência do gene, na seleção e na

regeneração dos transformantes; Os MC são preparados a partir de soluções

concentradas de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, ferro, e outros aditivos;

Podem também ser preparados a partir de preparados liofilizados;

Existem vários tipos de meios de cultura: MS, B5 e NN;

O período de cultura in vitro deve ser minimizado.

Preparação do meio de cultura

GENES MARCADORES E GENES MARCADORES E GENES REPÓRTERESGENES REPÓRTERES

Uma pequena % de células será estavelmente trans-formada com qualquer das técnicas;

Genes marcadores e genes repórteres são incluídos na maioria dos procedimentos;

Genes marcadores → conferem resistência ou tole-rância a determinados agentes seletivos;

Apenas células que contenham e expressem o gene crescerão normalmente;

Gene aphA2: Mais usado; Isolado do transposon Tn5 de E. coli;

Codifica a enzima aminoglicosídeo 3-fosfotransferase II [APH(3)II];

A APH(3)II inibe antibióticos aminoglicosídicos. Gene hpt:

Isolado de E. coli; Codifica a enzima higromicina fosfotransferase

(HPT); Usado em plantas sem resistência a antibióticos

amino-glicosídicos, como cevada, aveia e soja. Genes que conferem resistência a herbicidas:

csr1, aroA e bar; Gene crs1:

Isolado de mutantes de A. thaliana; Codifica uma forma alterada da enzima ácido hidro-

xiacético sintetase (AHAS); AHAS é essencial a biossíntese de aminoacidos

(valina, leucina, isoleucina).

Herbicidas derivados de sulfoniluréias e de imidazolino-nas inibem a AHAS.

Gene aroA: Isolado de Salmonella typhimurium resistente a

glifosato; Enzima 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato sintetase

(EPSPS): Rota Biosintética de aminoácidos aromáticos

(tripto-fano e fenilalanina). O gene codifica uma proteína com menor afinidade

ao glifosato. Gene bar:

Isolado de Streptomyces hygroscopicus; Codifica a enzima fosfinotricina-N-acetiltransferase

(PAT); PAT inativa o herbicida fosfinotricina.

Genes repórteres → Permitem monitorar a transfor-mação

Deve codificar uma enzima não presente na célula e de fácil evidencia;

Gene gusA: Mais utilizado; Isolado de E. coli; Codifica a β-glicuronidase (GUS); Detecção da enzima histoquimicamente –

precipitado azul.

Embrião imaturo de Apricot expres-sando gene repórter GUS (biolística)

Material de controlo, não co-cultivado

Material co-cultivado com A. tumefaciens: a marcação a azul evidencia a transferência do gene repórter

Desvantagem do gene gusA: Morte das células no momento da análise.

Genes luc e gfp: Gene luc codifica a enzima luciferase de Photinus

pyralis Luciferase + ATP → luz verde-amarelada.

Gene gfp codifica a proteína de fluorescência verde (GFP) GFP absorve luz azul ou UV emitindo luz verde.

Planta expressando a luciferase

Microscopia de grãos de pólen fluorescentes (GFP) na antera de uma planta transgênica de Arabidopsis.

INTEGRAÇÃO DO DNAINTEGRAÇÃO DO DNA Espera-se que o DNA exógeno seja integrado no

genoma receptor por recombinação ilegítima; Pareamento homólogo entre seqüências curtas,

por pequenas deleções no local da inserção; Ocorrência de síntese de DNA (reparo) em

trechos curtos entre a seqüência transferida e a seqüência-alvo;

DNA de fita simples → transformação por agrobac-térias;

DNA de fita dupla → aceleração de partículas e outros;

Controle do local de integração no genoma e do número de cópias; Inclusão de segmentos de homologia com regiões

cromos-sômicas; Espera-se recombinação homóloga → DNA exógeno e

região genômica correspondente Regiões escolhidas → transcrição ativa;

Número de cópias do T-DNA: Usualmente baixo; Raramente 12 cópias.

MÉTODOS ALTERNATIVOS MÉTODOS ALTERNATIVOS DE TRANSFORMAÇÃO DE TRANSFORMAÇÃO

GENÉTICAGENÉTICA

Eletroporação de tecido intactos: Mesmos princípios usados na eletroporação de

proto-plastos; Tecidos intactos são usados como alvo; A parede celular é levemente modificada; Enzimas (celulases, ligninases e pectinases); Lipídios polares (lipofectina ou lipofectamina); Alvos mais adequados:

Embriões zigóticos imaturos; Culturas embriogênicas.

Microinjeção de DNA: Agulhas microcapilares e microscópios são

usados; Deposição de DNA diretamente nos núcleos de

cé-lulas definidas; Óvulos fecundados; Método pouco utilizado → parede celular

espessa; Uma célula por vez; Freqüência de transformação alta (51%); Tabaco e canola.

TRANSFORMAÇÃO TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE PLASTÍDEOS E GENÉTICA DE PLASTÍDEOS E

MITOCÔNDRIASMITOCÔNDRIAS Platídeos e mitocôndrias podem ser alvos; Biobalística é o método preferencial; Cada célula de folha:

100 cloroplastos em média; 100 plastomas em média;

10.000 plastomas além dos genomas mitocondriais.

Vantagens: Herança materna permite o maior controle da

dispersão do gene; Transcrição e síntese protéica maior; Controle do local de integração e do número de

copias.

Plantas transplastômicas: Dicotiledôneas:

Tabaco; Batata; Tomate; Arabidopsis.

Monocotiledôneas: Arroz.

O QUE É ENGENHARIA O QUE É ENGENHARIA GENÉTICA?GENÉTICA?

Compreende um conjunto de instrumentos não convencionais com vistas à transferência de infor-mação genética de um organismo, seja ele um microrganismo, um vegetal ou um animal, para o outro.

SISTEMAS PARA A SISTEMAS PARA A REMOÇÃO DE GENES DE REMOÇÃO DE GENES DE

SELEÇÃOSELEÇÃO Plantas com características transgênicas

múltiplas poderão ser obtidas pelo processo de retransformação de uma planta já transformada ou pelo cruzamento sexual de diferentes plantas transgênicas que com-tenham, cada uma, um gene exógeno.

Tipos de sistema de remoção: Co-transformação pelo co-cultivo de A. tumefaciens. Sistema de recombinação sítio-específica,

denominado Cre/lox

Geração de plantas transgênicas livres de genes marcadores por métodos de co-transformação

Remoção do transgene marcador pelos sistemas Cre/lox

EMPREGO COMERCIAL DE EMPREGO COMERCIAL DE PLANTAS TRANSGÊNICASPLANTAS TRANSGÊNICAS

Adoção comercial mais rápida; Durante um período de 7 anos:

A área global das culturas transgênicas aumentou mais de 35 vezes;

1,7 milhões de hectares em 1996 58,7 milhões de hectares em 2002.

Países que cultivaram plantas transgênicas em ordem decrescente de área foram:

Principais culturas transgênicas: soja, milho, algodão e canola.

CONSIDERAÇÕES SOBRE RISCOS E CONSIDERAÇÕES SOBRE RISCOS E BENEFÍCIOS DOS VEGETAIS BENEFÍCIOS DOS VEGETAIS

TRANSGÊNICOSTRANSGÊNICOS

Vantagens: Fornece uma melhor qualidade de alimentos; Melhor teor protéico e proteínas mais completas; Óleos mais saudáveis; Arroz com mais carotenos; Cenouras com mais vitamina C etc. Plantas mais resistentes a insetos, pragas,

herbicidas, metais tóxicos do solo, fungos e amadurecimento precoce;

Aumento da produtividade Efetiva redução no uso de agrotóxicos; Redução nos custos de produção, tornando-se assim

adequadas para evitar a degradação ambiental.

Tomate transformado com gene da toxina Bt (direita); a esquerda (controle)

Desvantagens: Poucos laboratórios têm os equipamentos; Reagentes dispendiosos; Poucos pesquisadores capazes de obter organismos

transgênicos com toda segurança requerida pela Lei de Biossegurança, fiscalizada pela CTNBio.

Críticas de OGN’s leigas; Introdução de alergenos em alimentos; Culturas transgênicas carrearem genes de resistência

a antibióticos para o homem ou bactérias do trato intestinal;

Pragas desenvolverem resistência a toxinas produzidas por culturas de GM;

Risco destas toxinas afetarem outros organismos.

O QUE HÁ DE TRANSGÊNICO O QUE HÁ DE TRANSGÊNICO PLANTADO NOPLANTADO NO

BRASIL?BRASIL?

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abas-tecimento aprovou as zonas de exclusão para o plantio de algodão transgênico em 21/10/2005;

Até então, somente a soja transgênica era liberada no Brasil;

As suas primeiras variedades de milho GM rece-beram liberação inicial e aguardam aprovação final para plantio em 2008/09.

ROTULAGEM DE ROTULAGEM DE TRANSGÊNICOSTRANSGÊNICOS

DECRETO Nº 4.680, DE 24 DE ABRIL DE 2003: Revoga o DECRETO Nº 3.871, de 18 de Julho de

2001. Art. 2o : Na comercialização de alimentos e

ingredientes alimentares destinados ao consumo que contenham ou sejam produzidos a partir de OGMs, com presença acima do limite de 1% do produto, o consumidor deverá ser informado.

§ 2o. O consumidor deverá ser informado sobre a espécie doadora do gene no local reservado para a identificação dos ingredientes.

CONCLUSÕESCONCLUSÕES A tecnologia dos transgênicos não é isenta de

riscos, a exemplo de outras tecnologias atuais na agricultura;

Os transgênicos liberados são tão seguros quanto os alimentos convencionais (ou mais);

Há benefícios decorrentes da adoção dos transgê-nicos;

A sociedade deve estar bem informada.

Ontem, hoje e Ontem, hoje e sempre!!!sempre!!!