MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO EM PLANTAS

Dra. MARIZA MONTEIRO

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

CONTEÚDO

1- INTRODUÇÃO

2- ISOLAMENTO DO GENE E CONSTRUÇÃO DO CASSETE DE

EXPRESSÃO

3- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

3.1- Agrobacterium3.2- Biobalística

3.3- Eletroporação

4- CULTURA DE TECIDOS COMO PRÉ-REQUISITO PARA

TRANSFORMAÇÃO

5- CULTIVO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS NO MUNDO

6- EXEMPLOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS

7– CONSIDERAÇÕES FINAIS

1- INTRODUÇÃO

MELHORAMENTO DE PLANTAS CULTIVADAS

MÉTODOS MELHORAMENTO CLÁSSICO

TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA

MÉTODOS BIOTECNOLÓGICOS

Plantas Transgênicas

São plantas que tiveram sua constituição genética alterada pela introdução de gene(s) de um outro organismo, em geral de outra espécie.

(Torres et al., 1999)

Importância da técnica de transformação:

Obter plantas com características agronômicasdesejáveis, as quais não são possíveis por polinização.

“Fonte adicional de variabilidade genética para ser incorporada em um programa de melhoramento”.

Utilização - Plantas resistentes a herbicidas e patógenos

- Melhor qualidade do produto

- Produção de proteínas animais

- Fitorremediação - detoxificação de metais pesados

- Alteração das vias metabólicas - produtos mais vantajosos

Limitação:

Número limitado de genes isolados que regulamcaracteres agronômicos relevantes.

TÉCNICAS DE ENGENHARIA GENÉTICA

Genes de interesse isolados e clonados em um vetor

2- ISOLAMENTO DO GENE

Gene:

Sequência de nucleotídeos que compreende um segmento de DNA cujo produto é um polipeptídeo.

Unidade básica da herança.

Estrutura do gene:

Promotor Éxon 2Éxon 1 TerminadorÍntron 1

Processo de transcrição do DNA

5’ 3’

5’3’Transcrição

5’ 3’ hnRNA

Sítio de iniciação da Transcrição

Códon de finalização da tradução UGA, UAA ou UAG

5’3’mRNA

5’ 3’

Filamento não molde

Filamento molde

Splicing ou processamento

AAAAA

AAAAA

Núcleo

Cap

Isolamento do gene de interesse por “Differential display”

Planta inoculada com bacteriose

Ex. Gene de resistência a uma doença (bacteriose)

Plantas resistentes

Planta não inoculada com bacteriose

Extração do mRNA total

Extração do mRNA total da planta inoculada e da planta não inoculada com a bacteriose

mRNA

Planta inoculada com bacteriose

Planta não inoculada com bacteriose

Formação do cDNA5’ 3’mRNAAAAAA

3’AAAAA

Transcriptase reversa

Primer oligo (dT)

TTTTTTAlça

DNA polimerase

Tratamento com alcali

Isolando o gene5’ 3’mRNAAAAAA

Primer oligo (dT)

TTTTTTAlça

DNA polimerase

AAAAA

Transcriptase reversa

Isolando o gene5’ 3’mRNAAAAAA

Primer oligo (dT)

TTTTTTAlça

DNA polimerase

AAAAA

Nuclease S1(específica unifilamentar)

cDNA bifilamentar

Transcriptase reversa

Identificação do cDNA correspondente ao gene de interesse

Planta inoculada com bacteriose

Planta não inoculada com bacteriose

Isolamento do cDNA correspondente ao gene de resistência a bacteriose por “Differential Display”

cDNA cDNA

Extrai o cDNAdo gel

Clonagem do cDNA em um vetor

Plasmídeo

cDNA

Amplificação e identificação do cDNA

VetorBactéria

Introdução do vetor contendo o cDNA em uma bactéria

Construção do Cassete de expressão

Inserção de um promotor e um terminador

Promotor: Região de DNA envolvida na ligação da RNA-polimerase

para iniciar a transcrição

Promotor

Promotores constitutivos:

Dicotiledôneas - 35S – vírus do mosaico da couve-flor

Monocotiledôneas - Adh1 - álcool desidrogenase do milho

- Act1 - actina do arroz

- Ubi1 - ubiquitina do milho

Promotores induzidos - expresso quando submetidos a fatores de indução

ats1A - subunidade menor da ribose 1,6-bifosfato carboxilase oxigenase da Arabidopsis thaliana – induzido pela luz

Terminador: Sequencia de DNA, presente na extremidade do

transcrito, que leva a RNA-polimerase a terminar a transcrição

Promotor Terminador

Clonando o gene em um vetor

Plasmídeo

Promotor Terminador

pCAMBIA1301

11837 bp

lacZ alpha

Gus first exon

Gus second exon

kanamycin (R)

hygromycin (R)

pVS1 sta

Catalase intron

T-Border (right)

Histidine tag

pBR322 bom

T-Border (left)

Nos poly-A

CaMV35S polyA

CaMV 35S promoter

CaMV35S promoter

pBR322 ori

pVS1 rep

BamH I (11046)

Bgl II (8)

Bst EII (2050)

Bst XI (10782)

EcoR I (11025)

Hind III (11076)

Kpn I (11041) Nco I (1)

Pst I (11068)

Sac I (11035)

Sac II (8383)

Sal I (11058)

Sma I (11043)

Xba I (11052)

Nhe I (2014)

Nhe I (5458)

Sph I (2455)

Sph I (11074)

Xho I (8901)

Xho I (9995)

Plasmídeo pCambia 1301

3- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

INDIRETO

Agrobacterium

DIRETOS

Biobalística

Eletroporação - Protoplastos e Tecidos íntegros

3.1- TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium

Agrobacterium - microorganismos tipicamente de solo- induzem doenças em tecidos injuriados de

dicotiledôneas

Agrobacterium tumefaciens - galha-da-coroa

Formação de galha-da-coroa por Agrobacterium tumefaciens (www.biologi.uio.no/plfys/ haa/gen/gmo.html)

Indução do tumor - Plasmídeo Ti

Plasmídeo:

- DNA circular, extracromossômico de replicação

autônoma, presente em bactérias.

- Geralmente ligado a patogenicidade ou virulência

Agrobacterium tumefaciens (www.apsnet.org/.../DNA_easy/Images/agrobacterium.jpg)

plasmideo Ti

Esquema de organização estrutural do plasmídeo Ti (Sluys, 1999)

Processo biológico da infecção

Interação Planta-Agrobacterium (Sheng e Citovsky, 1996).

Processo biológico da infecção

Interação Planta-Agrobacterium (Sheng e Citovsky, 1996).

3.1.1- VETORES UTILIZADOS PARA Agrobacterium

Esquema dos sistemas de vetores de Agrobacterium para transformação de plantas - a) Co-integrados - cis - b) Vetores binários - trans (Brasileiro e Dusi, 1999).

TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens (www.apsnet.org/.../DNA_easy/Images/agrobacterium.jpg)

pCAMBIA1301

11837 bp

lacZ alpha

Gus first exon

Gus second exon

kanamycin (R)

hygromycin (R)

pVS1 sta

Catalase intron

T-Border (right)

Histidine tag

pBR322 bom

T-Border (left)

Nos poly-A

CaMV35S polyA

CaMV 35S promoter

CaMV35S promoter

pBR322 ori

pVS1 rep

BamH I (11046)

Bgl II (8)

Bst EII (2050)

Bst XI (10782)

EcoR I (11025)

Hind III (11076)

Kpn I (11041) Nco I (1)

Pst I (11068)

Sac I (11035)

Sac II (8383)

Sal I (11058)

Sma I (11043)

Xba I (11052)

Nhe I (2014)

Nhe I (5458)

Sph I (2455)

Sph I (11074)

Xho I (8901)

Xho I (9995)

vetor binario

pCAMBIA1301

11837 bp

lacZ alpha

Gus first exon

Gus second exon

kanamycin (R)

hygromycin (R)

pVS1 sta

Catalase intron

T-Border (right)

Histidine tag

pBR322 bom

T-Border (left)

Nos poly-A

CaMV35S polyA

CaMV 35S promoter

CaMV35S promoter

pBR322 ori

pVS1 rep

BamH I (11046)

Bgl II (8)

Bst EII (2050)

Bst XI (10782)

EcoR I (11025)

Hind III (11076)

Kpn I (11041) Nco I (1)

Pst I (11068)

Sac I (11035)

Sac II (8383)

Sal I (11058)

Sma I (11043)

Xba I (11052)

Nhe I (2014)

Nhe I (5458)

Sph I (2455)

Sph I (11074)

Xho I (8901)

Xho I (9995)

Mapa de restrição do plasmídeo pCambia 1301

3.1.2- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO VIA Agrobacterium tumefaciens

Método de co-cultivo (Brasileiro et al., 1998)

Co-cultivo

MÉTODOS DIRETOS

3.2 - TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA

3.2- TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA

- Consiste na aceleração, a velocidade supersônica, de

micropartículas carregando as moléculas de interesse em

direção a um alvo biológico.

Partículas de ouro Partículas de tungstênio

Micropartículas - ouro ou tungstênio - 0,4 a 1,5 µµµµm

Acelerador de partículas com alta pressão de gás hélio (Biorad).

Esquema de funcionamento.

Vetores - não requerem seqüências especiais

Utilização:

- transformar meristemas e tecidos com alto

potencial de regeneração.

- transformação de organelas e pólens

- transformação de cereais, leguminosas e espécies

arbóreas recalcitrantes a outros métodos.

3.3 - TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO

DE PROTOPLASTOS

protoplastos:

- células desprovidas de sua parede vegetal mediante

tratamento enzimático.

enzimas são capazes de degradar:

- Celulose - Pectina - Hemicelulose

- Outros polissacarídeos que compõem a parede

celular.

Choque elétrico:

- formação de poros reversíveis na membrana plasmática

permitindo a entrada do DNA

- Fatores importantes

- Duração do pulso

- Voltagem aplicada

Técnica de eletroporação de protoplastos:

-Consiste em submeter os protoplastos e DNA a um campo

elétrico de intensidade controlada

Esquema de eletroporação

Cubetas para eletroporação

Eletroporador

Vantagem –

Aumento da freqüência de plantas transformadas

Ex. (Quecini, 1999) - 36% - eficiência de transformação por

eletroporação

- 3,47% - de eficiência de transformação por

biobalística

Desvantagem –

- A regeneração a partir de protoplastos é um processo

longo, podendo induzir variação somaclonal.

4- CULTURA DE TECIDOS COMO PRÉ-REQUISITO PARA TRANSFORMAÇÃO

- CULTURA DE TECIDOS: É o processo pelo qual pequenos pedaços de tecido vivo (explantes) são isolados da planta e crescem assepticamente em meio de cultura nutritivo.

- TOTIPOTÊNCIA CELULAR = toda célula tem a capacidade de se dividir e regenerar um novo indivíduo (Schleiden e Schwann, 1938 e 1939), desde que devidamente estimulados.

- Estímulos

- meio nutritivo - sais minerais, vitaminas, fonte de carbono

- condições ambientais - adequadas para o crescimento e

desenvolvimento.

- fitorreguladores

Auxínas AIA - ácido indol-3-acético

AIB - ácido indol-3-butirico

2,4-D - ácido 2,4-Diclorofenóxiacético

ANA - ácido 1-Naftalenoacético

Citocininas K - Cinetina

BAP - 6-Benzilaminopurina

ZEA – Zeatina

* Induzem a desdiferenciação e respostas morfogênicas em tecidos diferenciados

- fitorreguladores

0

0

0,005

0,02

1,0

0,03 0,18 1,08 3,0

CONCENTRAÇÃO DE AIA (mg/L)CO

NCE

NTRA

ÇÃO DE CINET

INA (mg/L)

(Raven, 1998)

Explantes: discos foliares de tabaco

Balanço hormonal

- Protocolos eficientes de regeneração de plantas

Aumenta e eficiência de plantas transformadas

Agrobacterium – Regeneração na extremidade do explante

Biobalística - Regeneração na superfície do explante - Acompanhamento histológico da formação dos meristemóides

Eletroporação de protoplastos

- Protocolo eficiente de isolamento, cultura e regeneração de plantas

5- Cultivo de plantas transgênicas no mundo

Area Global de Plantas Transgênicas Cultivadas em 2008: por Paises (Milhões de Hectares)

6- Exemplos de plantas transgênicas

Tomate Longa Vida

http//www.zoo.utoronto.ca

Flavr savr Tradicional

Etileno

TranscriçãoTranscrição

Tradução

Síntese do gene poligalacturonase (pg)

Síntese do gene e do antisense

Enzima

Enzima não produzida

http//www.zoo.utoronto.ca

Batata resistente a larva de Lacanobia oleracea(mariposa do tomate)

ControleTransgênico

http//www.europe.eu.int

Mamão resistente ao PRSV (Vírus da mancha anelar do mamão)

ControleTransgênico

http//www.apsnet.org

Arroz Dourado apresentando betacaroteno

http//www.news.bbc.uk

Esquema do processo de transformação do Arroz Dourado apresentando betacaroteno

http//www.news.bbc.uk

Soja resistente ao herbicida imazapyr

Detalhe de linhas transgênicas (direita) e não-transgênicas(esquerda) após a aplicação do herdicida

(Abud,S. et al., 2003)

Alimentos Transgênicos

7- CONSIDERAÇÕES FINAIS

-A técnica de transformação nos permite:

- a obtenção de inúmeras espécies vegetais, com diferentes características:

- resistência ou tolerância a estresse biótico e abiótico

- melhor capacidade nutricional ou capaz de produzir fármacos (biorreatores).

- estudos básicos nas áreas de Genética, Fisiologia, Biologia Celular e Biologia Molecular.

-Superar as barreiras reprodutiva

-Transferir apenas genes de interesse

- Adequação dos processos de cultivo in vitro para

várias espécies recalcitrantes.

- Compreensão das funções da grande maioria de genes.

- Manipulação de características complexas que são

governadas por vários genes e que freqüentemente

estão associados a produtividade.

-Desafios a serem superados: