biologia molecular básica e aplicada primeira oficina de trabalho das redes nacionais de...

Biologia Molecular

Básica e AplicadaPrimeira Oficina de Trabalho das Redes Nacionais de Laboratórios

Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini

Pesquisadora do Depto. de Clínica Médica da FMB

Responsável pelo Lab. de Biologia Molecular do Hemocentro-Botucatu

Biologia Molecular

Básica e AplicadaPrimeira Oficina de Trabalho das Redes Nacionais de Laboratórios

Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini

Pesquisadora do Depto. de Clínica Médica da FMB

Responsável pelo Lab. de Biologia Molecular do Hemocentro-Botucatu

H

A* A* T* T* C*C* G*G*

CTGACTTCGACAAGACTAAA

CTGACTTCGACAAGACTAAA

CTGACTTCGACAAGACTAAA

CTGACTTCGACAAGACTAAA

CTGACTTCGACAAGACTAAA

GAC

GAC

GAC

GAC

GACTGAAGC*

TGAAGCTGTTCTG*

TGA*

TGAAGCTGTTCTGATTT*

T*

TGAAGCTGTTCTG*CTGACTTCGACAAGACTAAAGAC

GACTGAAGC*

GACTGAAGCTGTTCTG*

GACTGA*

GACTGAAGCTGTTCTGATTT*

GACT*

TGAAGCTGTTATG*GAC

TGAAGCTGTTA*GAC

GACTGAAGC*GACT*

GACT*

GACTGAAGC*GACT*

GAC TGAAGCT*

GAC TGAAGCT*

GACTGAAGCTGTTCTGATTT*

GACTGAAGCTGTTCTGATTT*

GACTGAAGC*

DNA Fita Simples

5’

3’

3’

5’

Fragmentosmaiores

Fragmentosmenores

3’ 5’

3’ 5’

Eletroforese

Complementaridade

de

Cadeias

A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES NO

GENÓTIPO VIRAL

GENOTIPAGEM

A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES NO

GENÓTIPO VIRAL

GENOTIPAGEM

Genes Estruturais

Genes Regulatórios

Genes Estruturais

Genes Regulatórios

HETERODÍMERO

P51

450 aa

P66

560 aa

RNA

cDNA

cDNA

DNA

Asp – Thr - Gly

TRATAMENTO

INIBIDORES DA TRANSCRIPTASE

REVERSA

FASES PRECOCES

INIBIDORES DA PROTEASE

FASESTARDIAS

INIBIDORES DA PROTEASE

VÍRUS SELVAGEM (WILD TYPE)

VÍRUS MUTANTE

MUTAÇÕESSILENCIOSAS ALTERAÇÕES DE AA

RESISTÊNCIARESISTÊNCIA

FENOTIPAGEM

GENOTIPAGEM

INTPR TR

Extração de RNAExtração de RNA

RT- PCRRT- PCR

Extração de DNAExtração de DNA

PCR PCR

DNA genômicoTaq polimerasePrimers Tampão

dCTPdATPdGTPdTTP

94ºC 72ºC57ºC

PRODUTO DA PCRPRODUTO DA PCR

NESTED PCRPR

NESTED PCRTR

Descrita por Sanger et al em 1977

nucleotídeo análogoPCR

Dideoxinucleotídeo

4,66

2,76

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120 140

Tempo (semanas)

Ca

rga

Vir

al

(lo

g)

Transcriptase Reversa Protease

Mutações ausentes L10V

Resistência ausentesTerapia InstituídaCategoria

AZT-ddI-IDVVirgem de terapia

SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO

Estudos de comparação da expressão em diferentesEstudos de comparação da expressão em diferentestecidos tecidos ou diferentes condições em ou diferentes condições em que umaque umapopulação de células possa estar submetida.população de células possa estar submetida.

MICROARRAYSMICROARRAYS ((biochipsbiochips, chips de DNA), chips de DNA)..

Princípio: Complementaridade entre as duas fitas.Princípio: Complementaridade entre as duas fitas.

MICROARRAYSMICROARRAYS

Lâmina de vidroFita SimplesDNA, cDNA

MICROARRAYSMICROARRAYS

Robô de alta precisãoRobô de alta precisãoCoordenadas XYZCoordenadas XYZ

SpotsSpots criados por agulhas criados por agulhas 8080--150 150 uum m

Até 80.000 Até 80.000 spotsspots

10.00010.000--20.000 20.000 spotsspotsmais comunsmais comuns

MICROARRAYSMICROARRAYS

mRNA - cDNA tecido normal mRNA - cDNA tecido tumoral

Marcadores

Fluorescentes

Mistura em concentrações iguais.

Desnaturação

MICROARRAYSMICROARRAYS

Verde Verde –– tecido normaltecido normal

Vermelho Vermelho –– tecido tecido tumoraltumoral

AmareloAmareloTecido normal + tecido Tecido normal + tecido tumoraltumoral

Preto - não houve hibridização

As cores do microarray

Diferentes AplicaçõesDiferentes Aplicações

Monitorar as condutas clínicasMonitorar as condutas clínicas

e os procedimentos cirúrgicos.e os procedimentos cirúrgicos.

Arte gráfica: Adriana, Rejane, minhas alunas.

www.hemocentro@fmb.unesp.br

pardini@laser.com.br