avaliação de dsa (anticorpo doador...
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Avaliação de DSA (anticorpo doador específico)
Igen - Instituto de ImunogenéticaAssociação Fundo de Incentivo à Pesquisa
São Paulo, SP, Brasil
Renato de Marco17.04.18
Estrutura do HLA
KLEIN J, SATO A:. The HLA system. First of two parts. N Eng J Med 2000; 343;10: 702-9.
HLA - Nomenclatura
HLA A* 01:01:01:01Locus
Nível sorológico –Grupo de alelos
Alelo
AleloSubstituição silenciosa
Variantes intron
Polimorfismo HLANumbers of HLA Alleles
HLA Class I Alleles 12,893
HLA Class II Alleles 4,802
HLA Alleles 17,695
HLA Class I
Gene A B C E F G
Alleles 4,081 4,950 3,685 27 30 58Proteins 2,853 3,582 2,550 8 5 18
Nulls 191 148 137 1 0 3HLA Class II
Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB
Alleles 7 2,440 94 1,178 64 5 963 6 7 13Proteins 2 1,751 35 779 26 0 655 0 4 7
Nulls 0 66 3 31 0 0 22 0 0 0HLA Class II - DRB Alleles
Gene DRB1 DRB2 DRB3 DRB4 DRB5 DRB6 DRB7 DRB8 DRB9
Alleles 2,146 1 152 74 55 3 2 1 6Proteins 1,548 0 125 57 49 0 0 0 0Nulls 52 0 5 9 3 0 0 0 0
IMGT/HLA Database (04/2018)
Grupo de Alelos (nível sorológico)
HLA A: 21
HLA B: 43
HLA C: 15
HLA DR: 17
HLA DQ: 7 DQB1 e 6 DQA1
HLA DP: 18 DPB1 e 4 DPA1
Correspondente Sorológico
B*14 B64, B65
B*15 B62; B63; B70 (B71; B72); B75; B76; B77
B*40 B60, B61
B*50:02 B45
DRB1*01 DR1, DR103
DRB1*03 DR17, D18
C*03 Cw9, Cw10
DQB1*03 DQ7, DQ8, DQ9
Como um indivíduo forma anticorpos anti-HLA?
Gestação
Transfusão
Transplante
Hipersensibilizados (PRA >80%)
Não Hipersensibilizados (PRA < 80%)
Teste Exato de Fisher
N 493 3.737
TX prévio 199 (40,4%) 266 (7,1%)P<0.0001OR:8,9IC 95%:7,1 – 11,1
Mulheres com gestação prévia
1 a 2 gestações 107( 21,7%)
≥ 3 gestações: 169 (34,3%)
Gestação ≥ 1: 492 (13,2%)
Gestação ≥ 3; 502 (13,4%)
P<0.0001OR:1,8IC 95%:1,4 – 2,3P<0.0001OR:3,4IC 95%:2,7 – 4,2
TransfusõesSanguíneas
N: 1 a 4 = 274 (55,6%)
N ≥ 5=136 (27,6%)
N: 1 a 4 = 1521 (40.7%)
N ≥ 5= 560 (15,0%)
P<0.0001OR: 1,8IC 95%:1,5 - 2,2
P<0.0001OR:2,16IC 95%:1,7 – 2,7
FATORES ASSOCIADOS À CONDIÇÃO DE HIPERSENSIBILIZADOS
Metodologias de Uso Corrente para Detecção de Anticorpos Anti-HLA
ALTA SENSIBILIDADE
BAIXA SENSIBILIDADE
LUMINEX SA-IgBeads recobertas por antígenos HLA purificados
Definição da especificidade dos anticorpos
CDC
CDC-AGH
CITOMETRIA DE FLUXO
Crossmatch (XM) contra o doador
HLA doador +
Crossmatch Virtual
Diferença entre os kits
Mixed PRA Fenótipo Single Antigen
FI=1x FI=4x
FI=1x
FI=2x
MFI=4/3=1,33x
FI=5x
FI=6x
MFI=15/3=5x• MFI= Valor médio da leitura, pelo luminex, da fluorescência emitida pelo conjugado.
5
5
5
6
6
6
Leitura no Luminex
LUMINEX SINGLE ANTIGEN
Exemplo de Single I
- Paciente não forma anticorpos contra HLA próprio
- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs A, B, C
- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população
Exemplo de Single II
- Paciente não forma antircorpos contra HLA próprio
- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs DRB1, DRB3/45, DQB1, DQA1, DPB1 e DPA1
- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população
Problemas no Luminex
• Reações Falso-Negativas
– Interferência do complemento presente no soro do receptor nadetecção dos anticorpos anti-HLA
– Pré-tratamento do soro com: Aquecimento, DTT ou EDTA
Anti-A2Média de MFIA2=1.170
AQUECIMENTO DO SORO
Anti-A2 Aq 1 min.
Média de MFIA2=15.010
INIBIÇÃO DE REATIVIDADE PELO COMPLEMENTO
Problemas no Luminex• Reações Falso-Positivas
– Presença de antígenos HLA desnaturados aderidos à bead
– Experiência do analista para identificar
– Não correlacionam com prova cruzada real positiva
– Diferença de resultados entre diferentes fabricantes
• Desnaturar antígeno HLA do kit – experimental
• Absorção / Eluição - experimental
Presença de anticorpos contra antígeno HLA desnaturado
Doador: HLA-A*02,31; B*14(B65),49; DRB1*01,13
LINFÓCITOS T LINFÓCITOS BControle Negativo Cut-off MCF = 212 Cut-off MCF = 238
Soro da Paciente MCF = 174 (Neg) MCF = 208 (Neg)
Single Antigen Padrão
Single Antigen Antígeno HLA Desnaturado
Reação falso-Positiva
Variação entre laboratórios nos Estados Unidos
A adoção de um procedimento operacional padrão, reduziu o coeficiente de variação entre os laboratório de ~62% para ~25%
0%
25%
50%
75%
100%
lotes 08 e 09 Lote 8 Lote 9 lote 10
% C
V
LSA-Ig Classe I LSA-Ig Classe II
Variação entre laboratórios no BrasilAmostras nº 64, 65, 66 do controle de qualidade da ABH - 2015
14 laboratórios enviaram os dados de MFI de LSA classe I:8 Laboratórios utilizaram lote 086 Laboratórios utilizaram lote 09
13 laboratórios enviaram os dados de MFI de LSA classe II: Todos utilizaram lote 010Só foram incluídas na análise beads com média de MFI > 500
33,3% 32,7% 34,0%
20,7%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
LSA-Ig I lote7 LSA-Ig II lote 9
% C
V
Variação intra-laboratório dos resultados de LSA-Ig
3 diferentes soros testados 5 vezes, em diferentes dias e por diferentes técnicos, com o mesmo lote de beads e o mesmo conjugado. Das beads com média MFI > 500, calculamos:
Avaliação no IGEN
9,0%5,4%
NEG POSPresença de Anticorpos Anti-HLA – relação com Soro negativo
nMFI: cut-off # para # objetivos
NEG POSPresença de Anticorpos Anti-HLA – relação entre fabricantes
Cutoff = 300 MFI (variação encontrada no soro controle negativo) – dados do Igen
Cutoff = 1000 a 1500 MFICutoff = 1400 MFI – acurácia de 90% para anticorpos contra HLA classe I e II
nMFI: cut-off # para # objetivos
Crossmatch Virtual Positivo por CDCPOSNEG
Crossmatch Virtual Positivo por CFPOSNEG
Qual a relação MFI x CDC ?
MFI = 11.761 (Sensibilidade de 89,9% e especificidade de 94,7%)
Qual a relação MFI x Citometria de Fluxo ?
-5000
0
5000
10000
15000
20000
-200 -100 0 100 200 300 400 500 600>
MFI
DSA
HLA
-A,
B
MCF - Cutoff
Citometria de Fluxo - Linfócitos TMFI do DSA AB mais alto x Delta (MCF - cutoff)
Correlação: 0,93
1500 MFI
Cutoff MFI ≥ 1500VPN: 98,7%VPP: 92,0%Acurácia: 97,5%
nMFI: cut-off # para # objetivos
Anticorpos Clinicamente Relevantes
POSNEG ? ? ? ? ?
Trabalho de Mestrado Igen-HRim – DSA A,B,DR (XM CDC Neg)
Impacto desta política sobre a sobrevida do rim de doador falecido
Em pacientes sensibilizados (PRA ≥ 10%)
AntesDepois
anos
P<0.001
01/08/2009 a 31/12/2016, N=81001/01/2002 a 31/12/2007, N= 92Data da revisão: 15/02/2017
Em pacientes não sensibilizados (PRA < 10%)
AntesDepois
anos
01/08/2009 a 31/12/2016, N=306201/01/2002 a 31/12/2007, N= 723Data da revisão: 15/02/2017
Equipe e Transplante: Hospital do Rim & Hosp. São PauloLaboratório de Histocompatilidade: IGEN – AFIP, SP
Em 01/08/2009 foi implantada a política de contra-indicar o transplante em receptores com anticorpos contra antígenos HLA-A, B ou DR do doador falecido com MFI > 1500 no teste Luminex-Single Antigen, mesmo que o crossmatch por CDC seja negativo. Este corte foi baseado em estudo retrospectivo em transplantes do Hosp. Rim anteriores a 2008.
DSA (MFI=1,140)
Eplet 76ESN/TerEp #216 (Bw6)
Foi realizada prova cruzada por citometria de fluxo (Flow XM) com células B39 do doador
Gebel HM, Bray RA. Am J Transplant. 2014 Sep;14(9):1964-75
Flow T-Cell XM: 205 MCF (Cut Off - 180 MCF)Flow B-Cell XM : 312 MCF (Cut Off - 271 MCF)
POSITIVO FRACO
Epítopos compartilhados levam a “diluição” do anticorpo nas beads e consequentemente uma diminuição nos valores do MFI
SATURAÇÃO DO TESTE
PRA LUMINEX (IgG) Single AntigenSORO DE 24.11.15
CLASSE ISORO PURO
CLASSE IISORO PURO
CLASSE IISORO DILUÍDO 1:1024
VALORES DE MFI DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA O DOADOR
HLA A*23 – MFI = 587HLA B*08 – MFI = 962HLA B*18 – MFI = 858
HLA DQB1*02 – MFI = 8872
HLA DQB1*06 – MFI = 18277HLA DQB1*06 – MFI = 3102
PRA LUMINEX (IgG) Single AntigenSORO DE 04.01.16
CLASSE ISORO PURO
CLASSE IISORO PURO
CLASSE IISORO DILUÍDO 1:1024
VALORES DE MFI DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA O DOADOR
HLA A*23 – MFI = 443HLA B*08 – MFI = 645HLA B*18 – MFI = 459
HLA DQB1*02 – MFI = 3529
HLA DQB1*06 – MFI = 19565HLA DQB1*06 – MFI = 332
PRA LUMINEX (IgG) Single AntigenSORO DE 01.04.16
CLASSE ISORO PURO
CLASSE IISORO PURO
CLASSE IISORO DILUÍDO 1:1024
VALORES DE MFI DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA O DOADOR HLA B*08 – MFI = 324
HLA DQB1*02 – MFI = 985
HLA DQB1*06 – MFI = 12801NEGATIVO
RESULTADO DOS EXAMES PRÉ-TRANSPLANTE:
RESULTADO DOS EXAMES PÓS-TRANSPLANTE:
XAnticorpos do Receptor
HLA A,B,DR: cutoff = 1.500 MFI
HLA C,DQ,DP: cutoff = 5.000 MFI
Antígeno HLA (MM) do doador
Tipificação HLA
HLA-A,B,C,DRB1*,DRB3/4/5, DQ, DP
Prova Cruzada VirtualPredição de Prova Cruzada Real Negativa
Definição das especificidades dos anticorpos: Luminex-SA
HLA-A,B,C,DRB1,DRB3/4/5,DQ
HLA-A,B,DRB1,DRB3/4/5
PROVA CRUZADA VIRTUAL X PROVA CRUZADA REAL
Virtual XM
XM CDC T ou BTotal
Negativo Positivo
Negativo 284 (95,3%) 14 298Positivo 141 154 295
- XM virtual considerando HLA-A,B,DR
- Soro mais recente: Nem sempre com PRA
Lista Rim
Virtual XM
RetrospectivoXM CDC T or B
TotalNegativo Positivo
Negativo 654 (100%) 0 654Positivo 300 83 383
Lista Pâncreas/Rim
- XM virtual considerando HLA-A,B,C,DR,DQ,DP
- Soro mais recente: Sempre com resultado de PRA
Ausência de DSA contra HLA desse loco!
A falta da tipificação HLA de um loci do doador ≠
RECOMENDAÇÕES GERAIS DA ASHI E EFI SOBRE XM VIRTUAL
Paciente tenha pelo menos 2 painéis pré-TxSoro deve ser testado, no PRA, com uma técnica no mínimo com a
mesma sensibilidade da prova cruzada.Soro testado nos últimos 3 meses antes do TxE também 14 dias após eventos de sensibilização
XM real seja realizado retrospectivamenteTodo o processo seja documentadoEquipe de Tx esteja de acordo com o protocolo do XM virtualEquipe tenha ciência de possíveis erros de tipificação HLA
ESTRATIFICANDO RISCO DO TX
Um resultado negativo de C1q não indica ausência de subclasse de IgG fortemente fixadora de complemento
C1qScreen
Transplantation. 2014
Single classe: LSA-C1q (pos, neg) vs MFI LSA-Ig
Resultados – Igen (ABTO 2015)
LSA-IgLSA-C1q
NEG POS
MFI < 10.900 297 (99,7%) 1 298
MFI ≥ 10.900 4 86 (95,6%) 90
Sensibilidade 98,8%Especificidade 98,7%Acurácia 98,7%
Sensibilidade 97,8%Especificidade 97,3%Acurácia 97,4%
LSA-IgLSA-C1q
NEG POS
MFI < 14.613 325 (99,7%) 1 326
MFI ≥ 14.613 9 45 (83,3%) 54
LSA-C1q vs XM T CDC-AGH
Resultados – Igen (ABTO 2015)
Sensibilidade 85,3%Especificidade 69,1%
Acurácia 79,1%
p<0,0001
LSA-C1qclasse I
XM CDC - T
NEG POS
NEG 29 (74,4%) 10 39
POS 13 58 (81,7%) 71
DIAGNOSTIVO DE RMA Critérios de banff 2017
Fenótipo 1
Fenótipo 2
1 – anticorpos classe I e II presentes no pre-tx2 – acontece nos primeiro meses pos-tx3 – em geral, boa resposta ao tratamento
1 – Ocorre após o primeiro ano2 – dnDSA3 – associados a anticorpos HLA classe II4 – frequentemente com componente de TCMR5 – Histórico de não aderência
DEFINIÇÃO DE NDDSA Anticorpo detectado somente após o transplante.
Cuidado na avaliação! Uso de um alto valor de cutoff (MFI) Efeito “dilucional” dos anticorpos que reconhecem o
mesmo epítopo pode levar a uma falsa interpretação que o anticorpo não
estava presente no pre-tx.
Células B de memória se tornam ativadas após o transplante, o DSA ressurgente pode ser interpretado erroneamente como dnDSA.
DNDSA dnDSA, um importante fator de risco perda de enxerto e ocorre em
15-25% dos receptores de transplante renal em 5 anos após o transplante1
A não-adesão à medicação imunossupressora emergiu como a causa primária da formação de dnDSA,
dnDSA pode ser uma conseqüência de imunossupressão insuficiente, seja iniciado pelo paciente (não-adesão à medicação) ou iniciado pelo médico (protocolos de minimização)
Imunossupressão prescrita está em regime sub-ótimo para o perfil de risco imunológico do paciente.
1 Wiebe C, Pochinco D, Blydt-Hansen TD, et al. Class II HLA epitope matching-a strategy to minimize de novo donor-specificantibody development and improve outcomes. Am J Transplant. 2013;13:3114–3122
J Am Soc Nephrol 28, 2017
MONITORAMENTO PÓS-TX
O monitoramento rotineiro de DSA pós-transplante ainda não é amplamente adotado
O curso natural do dnDSA e sua correlação com a função do enxerto e a histopatologia ainda não foram totalmente elucidados em grandes estudos clínicos.
Existem diferenças de opinião em relação à utilidade clínica da rotina de monitoramento e manejo de DSA pós-transplante de pacientes com dnDSA, especialmente na ausência de disfunção do enxerto
Realização de biópsia na descoberta do dnDSA.
Se não houver rejeição concomitante na biópsia no início do dnDSA: aumento do nível de imunossupressão
Em que caso seria fortemente recomendada:
Suspeita de rejeição humoral (para diagnóstico de AMR)
Em que casos seria interessante:
Pacientes com DSA pré-tx
Suspeita de não aderência a medicação
Mudança de esquema de imunossupressão, ou minimização da imunossupressão.
Após episódios de TCMR
AVALIAÇÃO DE DSA PÓS-TX
Agradecimento
Instituto de Imunogenética – Igen/AFIPDiretora: Maria Gerbase de Lima
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