aulas eng-enzima - actividade e estabilidade de enzimas - c · deqb lição de biocatálise...

DEQB

Lição de Biocatálise

Hidrólise da ureia pela urease

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimática

Para cada case do utilização de um enzima para catálise de uma dada reacção é necessário conhecer a estequiometria da reacção

aA + bB → cC

e da sua dependência com:

- Concentração enzima- Concentração do(s) substrato(s)- Presença de inibidores e sua concentração- Presença de activadores e sua concentração- Força iónica do meio reaccional- pH (actividade enzimática e estabilidade)- Temperatura (actividade enzimática e estabilidade)- Indirectamente do tempo de reacção, isto é, acumulação e concentração do(s) produto(s) da reacção.

[ ] [ ] [ ]dt

Bd

bdt

Ad

adt

Cd

cv

111−=−==

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimática

Função da concentração de substrato

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimática

Função da concentração de substrato

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimática

Função da concentração do enzima

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimática

Função do pH

v

pH óptimo

pH

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimática

Função do pH

v

pH óptimo

pH

O pH óptimo da actividade de um enzima está próximo do pH do ambiente em que o enzima é normalmente encontrado, por exemplo:

(a)Pepsina que hidrolisa certas ligações peptídicas de proteínas durante a sua digestão no estômago tem um pHóptimo de 1,6.

(b) Glucose 6-fosfatase de células do fígado (hapatócitos) com um pHóptimo de ~ 7,8 é responsável pela libertação de glucose na corrente sanguínea. O pH normal no citosol de células de hepatócitos é ~7,2.

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Lição de Biocatálise

Noções Gerais sobre Cinética

v, exprime-se como a velocidade de alteração da quantidade de uma substância interveniente na reacção, presente na mistura reaccional.

De um modo geral, para, aA + bB → cC tem-se;

Com a lei cinética obtêm-se uma expressão matemática que mostre como é que a velocidade medida depende das concentrações dos reagentes (e produtos, se a reacção inversa ocorrer com velocidade apreciável).

[ ] [ ] [ ]dt

Bd

bdt

Ad

adt

Cd

cv

111−=−==

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Lição de Biocatálise

Noções Gerais sobre Cinética

Por exemplo, se a velocidade da reacção

A + B → C variar linearmente com as concentrações de A e B, tem-se:

em que k é a constante cinética para a reacção indicada. De uma forma geral pode escrever-se

em que α e β definem a chamada ordem da reacção em relação a A e B, respectivamente.

[ ] [ ][ ]BAkdt

Cdv ==

[ ] [ ] [ ]βαBAk

dt

Cdv ==

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Lição de Biocatálise

Noções Gerais sobre Cinética

À soma θ = α + β chama-se ordem global da reacção. Para uma reacção de ordem global θ, as unidades da constante cinética são [concentração1-θ x tempo-1].

Tabela– Expressões cinéticas para reacções de ordem global entre zero e dois

Reacção Ordem Lei Cinética tsemi-tranformação

A → B

A → B

A + A → B

0

1ª

2ª

[ ]

− =d A

dtk [ ] [ ]A A kt= −0

[ ][ ]− =

d A

dtk A [ ] [ ]A A e

kt= −0

[ ] [ ]2Ak

dt

Ad

2

1=−

[ ] [ ]1 1

20A A

kt= +

[ ]t =

A1/2

0

2k

tk1 2

2/

ln=

[ ]0

2/1Ak2

1t =

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Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura

Equação de Arrhenius

- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.

A → B[ ]

[ ]− =d A

dtk A

DEQB

Lição de Biocatálise

Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura

Equação de Arrhenius

- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.

A → B[ ]

[ ]− =d A

dtk A

Actividade Enzimática: Equação de Base Experimental

PE

k

k

ES

k

k

SE +↔↔+

−− 2

2

1

1

Figura 2-1 – Curva de progressão de uma reacção enzimática

V E2

Vmáx

E1

reacção de ordem zero

1/2 Vmáx

reacção de 1ª ordem

KM

[ S]

[ ][ ]

v k CS

K Scat E

M

=+

Para [S]<< KM

, [ ]SCk

kv E

M

cat=

Para [S]>> KM, máxEcat VCkv ==

DEQB

Lição de Biocatálise

PE

k

ES

k

k

SE +→↔+

−

2

1

1

Cinética de Michaelis-Menten

[ ][ ]

d P

dtv k ES= = 2

• Reacção inicial, a concentração de produto édesprezável e, por isso, pode ignorar-se a reacção inversa de formação de ES a partir de E+P

[ ] [ ]ESCE E −=

[ ][ ][ ]ES

ES

k

kK

1

1-

S ==

[ ][ ]

[ ]ES

C S

K S

E

S

=+

[ ][ ]SK

SCkv

S

E2+

=

• A combinação do enzima com o substrato éinstantânea para dar um complexo enzima-substrato, ES. Este passo é considerado, neste esquema, rápido e reversível (equilíbrio)

• A conversão do complexo ES em E+P é muito lenta, não alterando o equilíbrio anterior (k2 << k-1).

Vmáx

= E2Ck

KM = KS,

[ ][ ]SK

SVV

M += máx

DEQB

Lição de Biocatálise

[ ] [ ]ESECE +=• Balanço ao enzimas

?

Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten

[ ] máxmáx

M

V

1

S

1

V

K

v

1+=

Pela equação de Lineweaver-Burk

resultante da inversão da Michaelis-Menten

Pela equação de Eadie-Hofstee

multiplicar anterior por Vmax

[ ]v

S

vKV Mmáx +=

[ ]S

vKVv Mmáx −=

coeficiente angular =KM

/Vmáx

abcissa = -1/KM [ ]1/ S

1/Vmáx

1/V

v

ordenada=Vmáxcoeficiente angular = - KM

Vmáx /K M v/[S]

DEQB

Lição de Biocatálise

[ ][ ]SK

SVV

M += máx

Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten

DEQB

Lição de Biocatálise

KM = 0,161 mM (o-NPG)Vmax = 178 µµµµmole o-NPG/L.min

Cinética de Briggs – Haldane

[ ] [ ]ESkvdt

Pd2==

• Briggs e Haldane examinaram o caso em que, no esquema de Michaelis-Menten, k2 era comparável a k-1,, logo a hipótese da existência de equilíbrio rápido não é válida.

Vmáx

= E2Ck

[ ][ ]SK

SVV

M += máx

DEQB

Lição de Biocatálise

• Do balanço ao enzimas

PE

k

ES

k

k

SE +→↔+

−

2

1

1

[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdt

ESd1210 −−−== [ ] [ ][ ] )/( 211 kkSEkES += −

KM =

1

21

k

kk +−

[ ] [ ]ESCE E −= .

• Mas, aplicando a aproximação do estado estacionário à concentração de ES:

[ ] [ ]ESECE +=

• A velocidade de formação do produto.

?

[ ] [ ][ ]Skkk

SCkES E

121

1

)( ++=

−

[ ]

[ ]Sk

kk

SCkv E

++

=−

1

21

2

Actividade Enzimática

sendo n o número de centros activos por molécula de enzima. Como regra, pode-se considerar que kcat é uma constante cinética de 1ª ordem que se refere às propriedades e reacções dos complexos enzima-substrato, enzima-composto intermediário e enzima-produto.

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Lição de Biocatálise

Significado da constante catalítica (k2 = kcat)

No mecanismo de Michaelis Menten kcat = k2 é a constante cinética de 1ªordem para a conversão química de ES em EP. Para casos mais complexos, éuma função de todas as constantes cinéticas de 1ª ordem costume relacionar kcat com o “turnover number”, que representa o número máximo de moléculas de substrato que se podem converter em produtos por centro activo do enzima e por unidade de tempo, e é expresso em s-1.

“turnover number”nC

V

n

k

E

cat máx==

Actividade Enzimática

DEQB

Lição de Biocatálise

“turnover number”nC

v

n

k

E

cat ==

onde

aparece como uma constante cinética aparente de segunda ordem. Este quociente relaciona a velocidade da reacção com a concentração do enzima livre. Por exemplo, para baixas concentrações de substrato, o enzima está em grande parte livre e CE ≅ [E]. A constante designa-se por constante de especificidade uma vez que este quociente traduz a especificidade para substratos que estejam em competição para se ligarem ao enzima.

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Lição de Biocatálise

Significado da constante (kcat/KM)

No mecanismo de Michaelis Menten para baixas concentrações de substrato ([S]<<KM):

[ ]SCK

kv E

M

cat=M

cat

K

k

De facto, se tivermos dois substratos A e B competindo para o centro activo do enzima:

[ ]

[ ]BK

k

AK

k

v

v

BM

cat

AM

cat

B

A

=

o poder discriminatório do enzima em relação a dois substratos, é determinadopor kcat/KM.

DEQB

Lição de Biocatálise

Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK

kv E

M

cat=

DEQB

Lição de Biocatálise

Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK

kv E

M

cat=

DEQB

Lição de Biocatálise

Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK

kv E

M

cat=

Há uma dependência da reacção catalisada pela quimotripsina com o pH e neste caso manifesta-se ao nível dos valores de kcat e KM:

- A velocidade da reacção aumenta para pH > 7,0 devido ao aumento do kcat.

- A velocidade da reacção diminui parapH > 8,5 devido à diminuição do 1/KM.

- Esta dependência é devida à intima relação entre cinética e estrutura do centro activo, em particular ao estado de ionização da His57

envolvida na ligação do substrato.

- No pH óptimo da reacção (pH = 8,0) a His57

deve estar desprotonada (pka ~ 6,0).

Interacções do enzima com activadores e inibidores

DEQB

Lição de Biocatálise

Interacções do enzima com activadores e inibidores

DEQB

Lição de Biocatálise

ActivadoresEm enzimas alostéricos o sítio de ligação do substrato (subunidadecatalítica C) e do activador (subunidadereguladora R) são diferentes:

- A ligação do activador (M) ao seu sitio específico na subunidade reguladora écomunicada à subunidade catalítica por uma alteração da sua conformação espacial.

- E é esta alteração conformação espacial que permite à sub-unidadecatalítica reconhecer o substrato com elevada afinidade.

- A dissociação do activador ao sub-unidade reguladora converte o enzima numa forma conformacional não activa ou menos activa.

Interacções do enzima com activadores e inibidores

DEQB

Lição de Biocatálise

Inibidores Irreversíveis

Reacção da quimotripsina com di-isopropil fluoro fosfato (DIFP) inibe irreversivelmente a actividade do enzima e levou àconclusão de que a Ser195 é um resíduo de amino ácido chave no processo catalítico.

Inibição da Actividade Enzimática (Inibidores reversíveis)DEQB

Lição de Biocatálise

Interacções do enzima com activadores e inibidores

Inibição da Actividade Enzimática na cinética Briggs-Haldane

Inibição competitiva

EI

K

I

PE

k

ES

k

k

SE

I b

+

+→↔+

−

2

1

1

[ ][ ][ ]EI

IEKI =

CE=[E]+[ES]+[EI]

[ ][ ]

11

1

1

1

21

2

+

+

+=

−

SK

I

k

kkCkv

I

E

[ ]

+=

I

M´M

K

I1KK

1/ v S + I

S

1/ [S]-1/K`M

DEQB

Lição de Biocatálise

[ ]

[ ]Sk

kk

SCkv E

++

=−

1

21

2[ ]

[ ][ ]

1

2

1

21

2

+

=

++

=−

S

k

Ck

Sk

kk

SCkv

M

EE

Inibição da Actividade Enzimática

Inibição não competitiva

ESI

k

k

SEI

KK

II

PE

k

ES

k

k

SE

II

1

1

´

2

1

1

−

−

↔+

++

+→↔+

bb

CE=[E]+[ES]+[EI] + [ESI]

[ ][ ]SK

SCkv

M

E

+= 2

1/ vS+I

S

1/ [S ]

1/Vmáx´

DEQB

Lição de Biocatálise

[ ][ ]

[ ]SK

S

K

I1

Ckv

M

I

E2

++

=

[ ]

I

máxmáx

K

I1

V´V

+

=

Inibição anticompetitiva

ESI

K

I

PE

k

ES

k

k

SE

I b

+

+→↔+

−

2

1

1

CE=[E]+[ES]+[ESI],

[ ][ ]

[ ][ ]S

K

I1

K

S

K

I1

Ckv

I

M

I

E2

+

+

+

=

1/ v

S+I

S

1/ [S ]-1/K`M

1/Vmáx´

DEQB

Lição de Biocatálise

[ ][ ]SK

SCkv

M

E+

= 2

Inibição da Actividade Enzimática

Inibição pelo Substrato

PE

k

ESS

KS

ES

k

k

SE

I

+→+

↔+

−

2

1

1

b [ ][ ][ ]ESS

SESK I =

[ ]

[ ] [ ]2

I

'M

E2

K

SSK

SCkv

++

=

Para baixas concentrações de S

([S]<<KM) a equação é de 1ª

ordem em [S]:

[ ]SK

EC

2k

v'M

=

Para elevadas concentrações

de S ([S]>> KM):

[ ]

[ ] [ ] [ ]

I

E2

I

E2

K

S1

1Ck

K

S1S

SCkv

+

=

+

=

v [ ]

I'M KKS =

k2CE

ESS ES + P

ESS inactivo

[S]

DEQB

A equação de Lineweaver-Burk teria o seguinte aspecto:

Inibição pelo Substrato

declive =

máx

'

M

V

K

-1/'

MK

1/[S]

1/v

1/Vmáx

DEQB

Lição de Biocatálise