apresentação1 dot blot 2

CAPTURA HIBRIDA IICAMILA LIMA DIOGO

ANANERE

Prevalência de HPV de baixo e alto risco pela técnica de biologia molecular (Captura Hibrida II®) em Santa Catarina

HPV –Papilomavirus

Humano

Grande Ocorrência na

PopulaçãoMundial

Da Intima Relação com a Carcinogenese

Cervical

HPV

• A Prevalência

• E a Incidência de HPV

OBJETIVO• De Baixo• E Alto Risco

Oncogênico • Faixa Etária

Mais Acometida

Técnica de Biologia

Molecular

(Captura Hibrida IIR)

12.211 exames

Estado de Santa

Catarina

Banco de Dados do Setor de Doenças

Infecciosas- DNAnálise.

2001 – 2005,

coletados

Resultado Positivo para HPV

OS DOIS GRUPOS

De Baixo Alto Risco

De Ambos

Os Sexos

Independente da Faixa

Etária

MATERIAL E MÉTODO

18 tipos de HPV

O Grupo A

O Grupo B

• Divididos em Dois Grupos • Grupos conforme o Risco

Oncogênico

• Possui Sondas para os HPV de Baixo Risco.

• (6, 11, 42, 43, e 44)

• Sondas para os HPV de Intermediário/Alto Risco.

• (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68)

As sondas consistem de moléculas de RNA complementares ao DNA dos tipos acima especificados.

As moléculas são conjugados com anticorpos monoclonais que contem um fosfato alcalino

Esse material é lavado e depois, só permanecendo os anticorpos ligados ao RNA / DNA.

Técnica molecular de Captura Hibrida II (Digene R)

Um substrato quimioluminescente, que se liga ao fosfato alcalino e misturado ao material

E a leitura e feita em um luminometro, sendo a luz emitida em unidades relativas de luz que e comparada com o controle (RLU/PC).unidade de luz relativa (RLU)

A sensibilidade do método e de 1 pg/ml de DNA-HPV, equivalente a 0,1 copia de vírus/célula

Por esta sensibilidade, o teste de Captura Hibrida e ao mesmo tempo qualitativo e quantitativo.

O Teste de Captura Hibrida

Sensibilidade

Quantitativo

Qualitativo

Foram considerados

positivos os resultados iguais ou

superiores a 1 pg/ml. Equivalente

a 0,1 copias virais/célula.

Negativos

Até 24 anos

25 a 35

anos

36 a 45

anos

E acima de 45 anos

A Prevalência do HPV de Baixo e Alto Risco

E a Incidênciapor Faixa Etária

De acordo com as idades, agruparam-se casos, nos seguintes grupos

Foi feito um levantamento dos resultados positivos.

EXAME POSITIVOS

53,8%

EXAME NEGATIVOS 46,2%

FIGURA 1. Distribuição percentual do número de exames positivos e negativos para HPV no período de 2001-2005.

Dentro dos 12.211 exames

Resultado positivo para HPV de baixo

e/ou alto risco, o total de

6.120

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No presente estudo foi encontrada alta porcentagem de HPV de alto risco, o que indica a importância da realização de um exame especifico para detectar o vírus do HPV, podendo assim diminuir a morbidade do câncer de colo de útero.

RESULTADO E DISCUSSÃO

43,35%

< 25 anos

30,33%

25 aos 35

anos

18,99%

36 aos 45

anos

7,34%

> 45 anos

Incidência de HPV positivos de alto e baixo risco por faixa etária no período de 2001-2005. Conforme exposto no gráfico 1

Esses dados demonstram que indivíduos com menos de 25 anos, tiveram maior prevalência para HPV positivo, e essa prevalência foi diminuindo com o avanço da idade.

Os resultados obtidos nesta pesquisa apresentam-se coerentes com os dados encontrados na literatura em relação a distribuição dos resultados positivos para HPV de baixo e/ou alto risco nas diferentes faixas etárias.

As vitimas “preferenciais” desse vírus são as que estão entre 15 e 25 anos.

A infecção por HPV e mais comum em pessoas sexualmente ativas entre 20 e 24 anos, independente do tipo viral.

Apos esta idade, a incidência declina gradativamente; como ilustra o gráfico 1.

Verificando que abaixo dos 35 anos houve uma maior prevalência do HPV de baixo risco.

Este fato pode ser explicado, em partes, pelo aumento da freqüência sexual nesta idade.

O que acarreta em uma maior periodicidade na pratica de exames de prevenção, diminuído a incidência de câncer de colo uterino.

Já na faixa etária acima de 35 anos, ha uma maior incidência de HPV de alto risco, comparado com a de baixo risco.

O gráfico 2 ilustra a prevalência de HPV de baixo e alto risco por faixa etária

Abaixo 25 anos (48%)

< 35 anos (33%)

36 a 45 anos (22%)

acima de 45 (8%)

No entanto, quando comparada a prevalência do HPV de baixo e alto risco em relação a faixa etária, o HPV de baixo risco teve uma maior incidência na população.

o HPV de alto risco foi mais prevalente.

53,8% de positividad

e66,4% foi

HPV de alto risco

Verificou-se com o desenvolvimento deste trabalho, a grande incidência do HPV na população estudada.

Com isso, destaca-se a importância da detecção do HPV através de metodologias mais sensíveis, como testes de biologia molecular (Captura Hibrida IIR), para garantir o diagnostico precoce deste que vem sendo considerado o maior agente causador de câncer de colo de uterino.

Conclusão

Papilomavirus humano associado a lesões de cérvice

uterinaTécnica de dot blot

O método mais simples de detecção do HPV é a observação das verrugas genitais a olho nu. Entretanto, estima-se que apenas 1% dos pacientes com infecções pelo HPV apresentam condilomas típicos (verrugas visíveis) e que a grande maioria dos casos são subclínicos, portanto, assintomático, o que muitas vezes dificulta um diagnóstico .O diagnóstico das infecções subclínicas baseia-se principalmente no exame de Papanicolau ou citopatológico e na Genistoscopia, que se utilizam de reagentes e lentes de aumento.Outros métodos, como biópsia dirigida e biologia molecular, são utilizados na identificação da infecção, sendo que o PCR ou a  captura híbrida utilizados principalmente nos casos de infecções recorrentes e persistentes para identificação do DNA HPV, proporcionando um melhor direcionamento na conduta a ser adotada com este paciente, tratamento ou apenas controle.

Objetivo

Determinar a prevalência e identificar os tipos de HPV mais frequentes em mulheres com lesões de cérvice uterina, agrupadas segundo diagnóstico histopatológico, em Belém, Pará.

228 amostras de cérvice uterina

A (155/2

28)

• adenocarcinoma (5/155)• carcinomaepidermóide invasor

(150/155).

B (54/22

8)

• Neoplasia intra-epitelial grau II (1/54)• Grau III (53/54) (NIC II ou NIC III)

C

(19/ 228)

• cervicite crônica (19/228).

Materiais e métodos

PCR

Baseou-se nadescrição de Manos et al

Primers genéricos MY09 e MY11, que detectam ampla faixa dos diferentes tipos de HPV em uma área bem delimitada de seus genomas região L1).

Como controle de qualidade utilizaram-se primers capazes de amplificar um fragmento do gene de globina humana.

Controlespositivos (células He-La ou células Caski)

Controle negativo (água).

1μl de cada amostra do DNA a ser testado

49μlde uma mistura (MIX)

5,00μl de cada um dos 4 trifosfatos dedesoxinucleotídeo

1,00μl de cada primer paraHPV (MY09 e MY11),

0,50μl de cada primer deglobina G73 e G74,

0,25μl de Taq DNApolimerase,

5,00μl de solução tampão [100mMTris-Hcl (pH:9),

500mM KCl, 30mM MgCl2]

35,75μl de água bidestilada,

94oC por 1 min

55oC por 1 min,

72oC por 2 min,

10 min a 72oC

33 ciclos de amplificação em aparelho ciclador de temperatura

Após eletroforese em gel de agarose a 2%, os produtos da PCR foram corados em solução de brometo de etídio e visualizados à luz ultravioleta.

Técnica de hibridização por

DOT BLOT

Baseou-se na descrição de Manos et al17, com modificações.

Utilizaram-se oligonucleotídeos específicos tornados radioativos pela incorporação de P32, em uma reação que envolveu a T4 polinucleotídeoquinase

Sondas específicas para os seguintes tipos de HPV: 5, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 66, 68, 70, 72, 73, Pap.155, Pap.291, W13B (os três últimos são tipos ainda não classificados) e sonda genérica.

A décima parte do volume da reação de PCR foi desnaturada em placa de ELISA com hidróxido de sódio.

A mistura foi pipetada sobre uma membrana de náilon ajustada a uma placa de acrílico (d o t - m a c h i n e), ligada constantemente ao vácuo.

A membrana foi removida e colocada sobre um papel de filtro para marcar as posições das amostras.

Fixou-se o DNA expondo a membrana à luz ultravioleta por 5 minutos.

6x soluçãocitrato salina padrão

(SSC), (NaCl ® 900mM,Na citrato ® 90mM)

10 x Denhardt's: (0,2% de soro de albumina,

0,2% de polyvinylpirrolidona,

0,2% ficoll)

0,5% de SDS, 100μg/ml de

esperma de salmão desnaturado

incubou-sepor 3h a 56oC

a sonda radioativa foi acondicionada no interior do saco

plástico junto com a solução de hibridização e incubada por 12-18

horas a 56oC

após o que as membranas foram removidas do saco plástico e lavadas a

temperatura ambiente por duas vezes, por 15

minutos cada

seguindo-se duas vezes a 56oC

por 20 minutos, com uma solução de 2 x SSC

e0,1 SDS.

No final as membranas foram expostas

a filmes de raio X por períodos de 12 a 24h.

A tipagem dos HPV foi realizada nas amostras

que amplificaram ou não 450 pares de

bases da região L1 dos HPV.

A tipagem dos HPV foi realizada nas amostras que amplificaram ou não 450 pares de bases da região L1 dos HPV.

Resultados

Todas as amostras foram testadas por PCR, enquanto que pela hibridização por dot-blot analisaram-se 147 (de um total de 150) nogrupo A, 49 (das 54) no grupo B e 17 (das 19) no grupo C.

AB

C

0102030405060708090

100

Positivas por dot blot e PCRPositivas por dot blot e negativas por PCRPositivas por Dot blot e PCR não realizado

Tabela 1 - Presença de papilomavirus humano em lesões de cérvice uterina, pelas técnicas de PCR e hibridização por dot- blot, segundo os grupos estudados*, Belém, Pará (1992-1996).

Figura 1

Tipo 16GenéricoTipo 31,33,45,52,58,59,73Tipo 18

9,40%

18,90%

11,30%

Tipos prevalentes de HPV em 106 amostras decérvice uterina, de pacientes do grupo A (Ambulatóriodo IOL), pela técnica de hibridização por d o t - b l o t,Belém, Pará (1992-1996).

60,40%

0

40

80

120

160

N°Presença de HPVAusensia de HPV

Prevalência de papilomavirus humano em lesões de cérvice uterina pelas técnicas de PCR e hibridizaçãopor dot-blot, segundo os grupos estudados*, Belém, Pará (1992-1996).

Figura 2

Tipo 16genéricoTipo 31, 33, 58Tipo 18

21,21%

21,30%

3%

Tipos prevalentes de HPV em 33 amostras decérvice uterina, de pacientes do grupo B (Ambulatóriodo IOL), pela técnica de hibridização por d o t - b l o t,Belém, Pará, (1992-1996).

54,55%

TESTE SENSIBILIDADEESPECIFICIDAD

E

FACILIDADE PARA O TESTE

COMENTÁRIOS

Southern Blot

Alta Alta Fraca

Excelente para pesquisa e controle de qualidade, porém

muito demorado  e de difícil uso na clínica diária

Dot Blot Moderada Alta Boa Rápido e relativamente barato

Hibridização in situ

Moderada Alta BoaLocaliza DNA do HPV em

tecidosHibridizaç

ão in

situ com filtro

Fraca Fraca BoaSimples execução, porém pouco

preciso

PCR Muito alta Alta Boa

Altíssima  sensibilidade, porém alto risco de falso-positivo

exceto nos quando for realizado PCR "REAL TIME" com proteção

bioquímica UDL (Uracil DNA glicosilase) pois zera a

contaminação do  TIPO "CARRY-OVER"

Captura híbrida

Alta Alta BoaRápido e pode ser usado na

clínica diária

QUADRO III –  CARACTERÍSTICAS DOS TESTES DE DNA PARA DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR HPV

Conclusão

Os resultados aqui discutidos reforçam a correlação entre certos tipos de HPV, especialmente o 16, no desenvolvimentode lesão maligna de cérvice uterina.

http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/dot-blot.jpg http://www.virushpv.com.br/novo/diagnostico.php www.dspace.espol.edu.ec/.../9029/.../D-39716.p... www.dms.ufsc.br/.../9560_AULA_BIO_MOL_Agosto_2009.ppt

Referências