anatomia patológica - técnicas histológicas (iff-fiocruz)

Anatomia patológica:Anatomia patológica:

Técnicas histológicas

•Antonio Carlo Fonseca Vanzillotta•Yasmim Franceschi

IntroduçãoDados Históricos:

• O homem com sua curiosidade incessante, buscar decifrar o mundo a sua volta. Com o passar do tempo e com os seguidos avanços tecnológicos como a invenção do microscópio, em 1560 pode-se observar um outro “mundo” que estava bem embaixo dos nossos pés. O Mundo microscópico.

• Com essa descoberta, os Cientístas/Pensadores da época começaram a associar esses mundo e seus “habitantes” como os causadores de certas doenças que acometiam a população da época. Dando causas naturais, e não divinas as doenças.

Microscópio antigo.

Modelo mais Recente.

• Em 1761, Giovanni Battista Morgagni publica “ Sobre os lugares e as Causas das Doenças Anatomicamente Verificadas”, obra que descreve, em âmbito macroscópico, conclusões provenientes da observação atenta de seus pacientes. Morgagni considerado mais tarde como o pai da anatomia patológica moderna.

• Outro cientista que podemos ressaltar é Rudolf Virchow, que direcionou a Anatomia Patológica às aplicações próximas das atuais. Virchow construiu bases para a teoria celular com sua frase: “Todas as células provém de células”.

Giovanni Batista Morgagni

Dr. Rudolf Virchow

O Que é a Anatomia Patológica?A Anatomia Patológica é um ramo da Patologia/

Medicina que lida com doenças diagnósticáveis por meio de exames Macro e Microscópicos.

Importância da Anatomia Patológica

• A Anatomia Patológica é um serviço de apoio ao atendimento médico, pois é fonte de diagnósticos em diversas ocasiões. Possibilitando também, a compreensão das causas e efeitos de cada enfermidade a nível macroscópico, tecidual e celular gerando maior entendimento sobre os mecanismos de desenvolvimento, observando também suas alterações teciduais e explicando suas consequências nos seres como doenças.

Atuação da Anatomia patológica

A Participação do setor de Anatomia Patológica dentro de um Centro Hospitalar é sem dúvida ampla. Sendo primordial para a qualidade desse serviço a confiabilidade dos diagnósticos fornecidos..

● O patologista pode atuar na observação de material macro e microscópico tanto para o desenvolvimento de pesquisa quanto para o apoio ao fornecimento de diagnósticos à comunidade hospitalar. Podendo dedicar-se a Citopatologia, baseando suas análises na Imuno-histoquímica.

Etapas

No setor de Anatomia Patológica, o laboratório técnico tem como função condicionar o material coletado à posterior análise microscópica. Desta forma, cada etapa do procedimento técnico tem seu próprio objetivo em termos de qualificar química e fisicamente o material à observação.

Coleta do MaterialClivagemFixaçãoDescalcificação, em materiais calcificados.MicrotomiaCloração

• Podemos ressaltar que esses processos sofrem alterações, quanto a ordem de acordo com a necessidade de cada departamento. No caso do IFF, podemos ver que ocorre Coleta, Clivagem, Fixação, Microtomia e coloração ( Claro havendo necessidade haverá a Descalcificação). Constatando que a troca dessa ordem não altera os produto resultante no material finalizado

Etapas Coleta do material

A coleta do material consiste na remoção de uma parte ou do todo tecido de um organismo que será analisado. A Coleta pode ser feita por meio de uma Biopsia, com o organismo ainda vivo; ou Pós-morte, por meio de uma Necropsia.

Os Materiais retirados por esses processos deverão ser analisados de primeiro momento por um patologista, que dará seu parecer de forma Macroscópica.

Observando os seguintes aspectos:Cor do materialCheiroAparênciaTamanho

Logo após esse processo deve-se Registrar em um livro especifico o Material, identificando–o com um número que o acompanhara toda sua passagem pelos demais processos.

• Nota de Biossegurança: Deve-se nesse procedimento utiliza-se de Equipamentos de EPI`S proposto pelo departamento. Lembrando–se de quanto maior o uso de proteção do meio externo do meio interno melhor. Evitando assim, o contato direto com o materiais, pois todo o material orgânico retirado e potencialmente infectante

EtapasClivagem

Esta etapa consiste em Reduzir as dimensões do material. Para facilitar a penetração dos fixadores e a difusão dos reagentes durante as demais etapas do processamento dos tecidos.

Observação sobre a Clivagem:O ideal em uma clivagem é que a espessura dos fragmentos atinjam 3mm de espessura.É importante que os órgãos conhecidos como auto- metabolizantes os sejam retirados primeiro, pois são primeiros a entrar em autólise.Não comprimir o material com pinças ou outros instrumentos, pois a estrutura tecidual pode ser distorcida.

EtapasClivagem

EtapasClivagem

Nota de biossegurança: Durante o procedimento de clivagem do material, tome muito cuidado com as navalhas e giletes utilizadas. O material perfuro cortante, bem como os restos de material biológico, devem ser descartados em lixo próprio.

EtapasFixação

A fixação é um processo muito importante nas Técnicas histológica, pois evita que o material entre em decomposição. Por meio de um acúmulo de dióxido de Carbono, culminado Autólise, que é a liberação de lisossomos dentro da Célula causando sua morte. A Fixação interrompe o Metabolismo Celular, estabilizando as estruturas do tecido permitindo a invasão de outras substâncias.Podemos observar que apesar de prolongar a “vida” do material os fixadores não se mostram 100% eficazes. Alguns fixadores são excelentes para certas estruturas teciduais, outros para uso em células ou mesmo para estudo da Bioquímica. Porém, nenhum fixador é adequado para todas as situações. Uma possível solução é o uso de um Mistura de Fixadores que visa suprir a carência de um pela vantagem de outra.

Principais FixadoresFormolÁlcool

Biossegurança do processo:Biossegurança do processo:

EtapasDescalcificação

Em alguns tipos de tecido como o Ósseo, nota-se a presença de Cálcio, Fosfato, entre outros sais minerais. Para a leitura em microscópio deve-se seguir um desses procedimentos:A Descalcificação, que remove a porção mineral do material. Evidenciando sua estrutura Orgânica.Desgaste: Que permite O Patologista analisar os componentes inorgânicos.

O não seguimento desses processos acomete na ação dos Cristais de Cálcio que danificam o material de trabalho na Microtomia como as navalhas que ficam com “ dentes”, impedindo a feitura de bons cortes

Nota de biossegurança:Deve-se presar pelo uso de luvas específicas na

manipulação química na hora de mexer em soluções ácidas e quelantes, máscaras com filtro próprio para vapores ácidos e orgânicos e deve-se fazê-lo em local arejado.

O preparo dessas soluções deve ser feito em uma capela de exaustão.

Não deve-se descartar soluções ácidas em esgoto sanitário convencional.

EtapasProcessamento

Etapa que consiste na difusão de reagentes para o interior dos tecidos e na remoção do líquido tecidual, assim como o Fixador que ainda está no tecido. Também condiciona os fragmentos para serem fatiados de forma fina e delicada pela próxima etapa.

O processamento é constituído de três etapas:

Desidratação: que consiste na remoção de água do tecido.Clarificação: etapa que retira todo o álcool do tecido. A retirado do

álcool é primordial, pois a parafina que será usada na etapa de Inclusão não se mistura homogeneamente com o álcool.

Infiltração em parafina: etapa que coloca a parafina em 56°C a 60° C em contato direto com os tecidos.

Nota de biossegurança: •Os materiais usados na etapa de processamento são altamente inflamáveis. Deve-se usar luvas, jaleco e máscara com filtro de vapores. •O Xilol é altamente cancerígeno se prolongado o contato direto, podendo levar a morte.•Deve-se instalar um exaustor inferior, pois o Xilol é mais denso que o ar.

EtapasInclusão

A inclusão é um processo em que coloca, com uma pinça aquecida, os tecidos que foram infiltrados com parafina no interior de um cassete que contem parafina líquida, com a parte clivada para baixo.Os fragmentos devem ser colocados na parafina aquecidos evitando que se forme bolhas de ar em seu entorno.

Nota de Biossegurança: •A parafina é altamente inflamável. A inclusão deve ser feita em local arejado com exaustor.•A parafina libera vapores tóxicos, quando aquecida, Logo deve-se usar máscara de vapores.

EtapasMicrotomia

Micrótomo rotatório manualMicrótomo rotatório automático

EtapasMicrotomia

Para se obter cortes do material incluído em parafina ou congelado, é necessário o uso do micrótomo. As funções dos micrótomos variam de acordo com o fabricante, mas o equipamento tem como fundamento duas peças principais: o suporte ou mandril (onde é fixada a peça a cortar) e a navalha, que realiza os cortes. O suporte é encaixado a um parafuso micrométrico ou a uma espiral metálica que o faz adiantar segundo seu eixo, em medida conhecida e que pode ser regulada. Esta medida tem como unidade o micrômetro (µm), que corresponde à milésima parte do milímetroNormalmente um micrótomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50 micrômetros, mas a espessura mais utilizada em microscopia óptica é de 1 (para cortes sequenciais) a 5 micrômetros (quando não há necessidade de se aproveitar todos os cortes).

EtapasColoração

Processo primordial para que se diferencie cada estrutura tecidual, afim de que se possa ver ao Microscópio de luz os diferentes componentes relacionados ao diagnóstico. Os corantes são compostos orgânicos, aromáticos e ionizáveis baseados em estruturas de Benzeno. Os corantes se dividem de forma geral em:Naturais: Hematoxilina, Índigo, Orceína, Brasilina, entre outros.Artificiais: Derivados de Benzeno.

EtapasColoração

Nota-se que o uso das colorações é feita após um analise de que material estamos trabalhando. Atento a isso temos o seguinte quadro com suas colorações e seus respectivos resultados.

EtapasColoração

EtapasColoração

EtapasColoração

Existem, como vimos, diferentes tipos de colorações com diferentes aplicações teciduais. Podemos então Destacar algumas colorações.Hematoxilina FosfotúngicaHematoxilina de Harris+EosinaMétodo de GrocoottMétodo de Ziehl-Neelsen e FiteAzul de AlcianMétodo de Weigert-Van GiensonVerde Metil PironinaEntre outras

EtapasColoração

Assim com a ordem das etapas sofre alterações quanto a demanda ou o produto final, com a colaração não é diferente. É possivel selecionar um número de colorações usadas no IFF com seus resultados:He ( Hematoxilina+eosina): serve para ver a Morfologia dos tecidos.Núcleos----------------------Roxo

Etapas

EtapasColoração

Masson: resultadosNúcleos------PretoMúsculo, citoplasma. Queratina---- VermelhoColágeno-----Azul

PAS e PASD( Sendo que o PASD contém um enzima que digere o glicogênio) Resultados:Glicogênio, mucina, membrana basal, fungos--------- VermelhoNúcleos--------Azul

Etapas

Coloração• Per´s: Resultados Pigimento férrico-----Azul Fundo------Laranja

Etapas

Coloração• Wayson: Resultados: Citoplasma------- Rosa Núcleos------------Azul Hemácias----------Vermelho Grânulos de Mastócitos---Púrpura Bactérias-----------Azul Parasitas da malária---Azul

• Nota de biossegurança: O uso do xilol em certos preparos exige o uso de máscaras de vapores e capela de exaustão. Deve-se presar pelo uso dos EPI`S propostos pelo departamento.

• Antonio Carlo F. Vanzillotta• Yasmin Franceschi