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DANIELA MARIA DE SOUSA MOURA
ALTERAÇÕES NA LINHAGEM CELULAR E ORGANIZAÇÃO NEURONAL DO GIRO
DENTEADO EM DOIS MODELOS ANIMAIS DE EPILEPSIA
Natal-RN
2017
1
Instituto do Cérebro
Universidade Federal do Rio Grande do Norte Programa de Pós-Graduação em Neurociências
Alterações na linhagem celular e organização neuronal do giro denteado em dois modelos
animais de epilepsia
Daniela Maria de Sousa Moura
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Neurociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor em
Neurociências.
Orientador: Marcos R. Costa
Co-orientador: Claudio M.T. Queiroz
Natal-RN, Brasil
Agosto de 2017
2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro - ICE
Moura, Daniela Maria de Sousa.
Alterações na linhagem celular e organização neuronal do giro denteado em dois modelos animais de epilepsia / Daniela Maria de
Sousa Moura. - Natal, 2017.
127f.: il.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Instituto do
Cérebro, Programa de Pós-graduação em Neurociências. Orientador: Marcos R. Costa.
Coorientador: Claudio M. Queiroz.
1. Neurogênese. 2. Epilepsia. 3. Hipocampo adulto. I. Costa,
Marcos R. II. Queiroz, Claudio M. III. Título.
RN/UF/Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do
Cérebro CDU 616.853
Agradecimentos
À minha querida família,
Aos grandes e bons amigos Arthur, Bryan, Carol, Daiane, Dudu, Fernanda, Fernanda, Geissy,
Júlia, Juliana, Kelly, Laila, Sérgio;
Aos amigos biólogos da UFPE espalhados pelo mundo, mas sempre presentes;
A todos os membros que passaram e estão no NeuroCell;
Às companheiras do Meninas@Neuro;
Ao corpo docente e discente e indecente do Corujinha University;
A todos que colaboraram direta e indiretamente com este projeto;
Ao Instituto do Cérebro e seus funcionários;
Em especial, a Marcos e a Claudio.
2
Resumo
As células granulares do hipocampo são um dos poucos tipos de neurônios gerados no
sistema nervoso central de mamíferos adultos. O modelo atual de neurogênese no hipocampo
adulto assume que células tronco neurais (CTN) geram progenitores com potencial restrito à
geração de neurônios ou astrócitos. Estímulos ambientais e condições patológicas podem
alterar a progressão da linhagem, modulando a proliferação, diferenciação, sobrevivência e
integração sináptica dos neurônios gerados. Por exemplo, a Epilepsia do Lobo Temporal mesial
(ELT), a forma mais comum de epilepsia em adultos, está associada a alterações na taxa de
neurogênese hipocampal adulta. Neste trabalho, nós utilizamos dois modelos experimentais de
ELT para avaliar os efeitos de um insulto epileptogênico (i.e., status epilepticus, SE) sobre a
linhagem e amadurecimento celular no giro denteado adulto. Através da técnica de fate-
mapping utilizando animais Dcx-CreERT2/CAG-CAT-GFP, nós acompanhamos o destino de
células que apresentavam o promotor do gene doublecortin (DCX) ativado antes ou depois da
injeção intrahipocampal dos agentes convulsivantes ácido caínico ou pilocarpina. Desta forma,
pudemos avaliar o efeito destas drogas sobre progenitores e neurônios imaturos DCX+ gerados
antes ou após o tratamento. Em ambos os modelos, foram observados um aumento de
neurogênese e alterações no posicionamento e morfologia de células granulares, conforme
descrições prévias na literatura. Alterações neuronais, tais como localização ectópica e
presença de dendritos basais, foram observadas tanto em células geradas antes quanto após a
indução do SE, embora com frequências distintas. No entanto, apenas no hipocampo ipsilateral
à injeção de ácido caínico nós observamos dispersão da camada granular e morte neuronal em
CA1 e CA3, apesar da atividade paroxística epiléptica ocorrer em ambos os hipocampos.
Surpreendentemente, o aumento da neurogênese em animais que receberam ácido caínico foi
restrito ao hipocampo contralateral, enquanto no lado ipsilateral foi observado um significativo
aumento na geração de astrócitos a partir dos progenitores DCX+. Além disso, também
observamos neste modelo a presença de células com morfologia e marcadores de CTNs,
sugerindo que progenitores DCX+ poderiam regredir para estados mais primitivos na linhagem
celular do hipocampo adulto. O aumento da astrogliogênese no lado ipsilateral à injeção de
3
ácido caínico foi associado a uma degeneração de interneurônios parvalbumina (PV)+ no
hipocampo, sugerindo que a atividade gabaérgica poderia estar contribuindo para o
redirecionamento da linhagem celular. Em conjunto, nossos dados indicam que a linhagem
celular no giro denteado não é unidirecional e irreversível, e que o aumento da atividade
elétrica neuronal induzida por ácido caínico e pilocarpina têm efeitos diferentes sobre a
diferenciação celular e destino fenotípico dos progenitores e neurônios nessa região. Esses
resultados impõem a necessidade de revermos o modelo atual de neurogênese hipocampal
adulta e também indicam que diferentes modelos animais de epilepsia produzem alterações
celulares distintas no hipocampo adulto e, portanto, poderiam representar diferentes
graus/estágios da patologia.
Palavras Chaves
Hipocampo adulto, neurogênese, astrogliogênese, epilepsia, ácido caínico, pilocarpina,
interneurônios gabaérgicos, dirpersão das células granulares, neurônios ectópicos, dendritos
basais hilares, camundongo.
4
Abstract
The granular cells of the hippocampus are one of the few types of neurons generated in
the central nervous system of adult mammals. The current model of neurogenesis in the adult
hippocampus assumes that neural stem cells (NSCs) give rise to progenitors restricted to the
generation of neurons or astrocytes. Environmental stimuli and pathological conditions can
alter the lineage progression, modulating cell proliferation, differentiation, survival and synaptic
integration of newly generated neurons. For example, mesial Temporal Lobe Epilepsy (TLE), the
most common form of epilepsy in adults, is associated with changes in the rate of adult
hippocampal neurogenesis. In this work, we used two experimental TLE models to evaluate the
effects of an epileptogenic insult (i.e., status epilepticus, SE) on the cell lineage and neuronal
maturation in the adult dentate gyrus. Using Dcx-CreERT2 / CAG-CAT-GFP animals, we fate
mapped the fate of cells expressing the doublecortin gene (DCX) either before or after
intrahippocampal injection of the convulsive agents kainic acid or pilocarpine. In this way, we
could evaluate the effect of these drugs on DCX+ progenitors and immature neurons generated
before or after treatment. In both models, we observed an increase in neurogenesis and
changes in the positioning and morphology of granular cells, according to previous descriptions
in the literature. Neuronal aberrations, such as ectopic localization and presence of basal
dendrites, were observed both in cells generated before and after induction of SE, albeit at
different frequencies. However, only in the hippocampus ipsilateral to the injection of kainic
acid we observed granule cell dispersion and neuronal death in CA1 and CA3, although the
paroxysmal epileptic activity occurred in both hippocampi. Surprisingly, the increase in
neurogenesis in animals that received kainic acid was restricted to the contralateral
hippocampus, whereas on the ipsilateral side a significant increase in astrocyte generation was
observed within the DCX+ progenitor lineage. In addition, we also observed the presence of
cells with NSC hallmarks, suggesting that DCX+ progenitors could regress to more primitive
states in the adult hippocampal cell lineage. The increased astrogliogenesis on the ipsilateral
side to the injection of kainic acid was associated with a degeneration of parvalbumin (PV)+
interneurons in the hippocampus, suggesting that GABAergic activity could be contributing to
5
the rerouting of the DCX+ progenitor cell lineage. Taken together, our data indicates that the
cell lineage in the dentate gyrus is neither unidirectional nor irreversible, and that the increased
neuronal electrical activity induced by kainic acid and pilocarpine have different effects on cell
differentiation, as well as on the fate of progenitors and neurons in that region. These results
highlight the need to review the current model of adult hippocampal neurogenesis and also
indicate that different animal models of epilepsy produce distinct cellular alterations in the
adult hippocampus and could therefore represent different degrees / stages of the pathology.
Keywords
Adult hippocampus; neurogenesis; astrogliogenesis; epilepsy; fate-specification; kainic
acid; pilocarpine; GABAergic interneurons; granule cell dispersion; ectopic neurons; hilar basal
dendrites, mouse.
6
Sumário
Resumo ......................................................................................................................................................... 2
Abstract ......................................................................................................................................................... 4
Sumário ......................................................................................................................................................... 6
Lista de Abreviações ..................................................................................................................................... 8
Capítulo 1 ...................................................................................................................................................... 9
Considerações iniciais ............................................................................................................................. 10
1.1 Hipocampo ........................................................................................................................................ 11
Circuito neuronal do hipocampo ........................................................................................................ 13
1.2 Neurogênese adulta .......................................................................................................................... 16
Diferenciação dos novos neurônios .................................................................................................... 22
Relevância funcional dos novos neurônios ......................................................................................... 27
Regulação da neurogênese ................................................................................................................. 30
1.3 Epilepsia ............................................................................................................................................ 35
Epileptogênese .................................................................................................................................... 36
Modelos animais de ELT ..................................................................................................................... 39
Neurogênese e epilepsia ..................................................................................................................... 40
Objetivos ................................................................................................................................................. 43
Objetivos específicos .............................................................................................................................. 43
Resultados ............................................................................................................................................... 44
Capítulo 2 .................................................................................................................................................... 45
Abstract ................................................................................................................................................... 46
Introduction ............................................................................................................................................ 47
Results ..................................................................................................................................................... 48
Dcx-lineage in the adult hippocampus encompasses astrocytes ....................................................... 48
Kainic acid enhances astrogliogenesis in the DCX-lineage ................................................................. 52
Progenitors within the Dcx-lineage are still active one month after recombination ......................... 55
Dcx-expressing progenitors can reverse to multipotent stages ......................................................... 57
Increased electrical activity is not sufficient to induce astrogliogenesis from Dcx-expressing
progenitors .......................................................................................................................................... 59
Loss of parvalbumin-expressing interneurons correlates with increased astrogliogenesis ............... 61
Discussion................................................................................................................................................ 63
7
Supplementary Material ......................................................................................................................... 68
Methods .................................................................................................................................................. 73
Capítulo 3 .................................................................................................................................................... 76
Abstract ................................................................................................................................................... 77
Introduction ............................................................................................................................................ 78
Results ..................................................................................................................................................... 79
Intrahippocampal administration of both kainic acid and pilocarpine lead to bilateral epileptiform
activity, status epilepticus and spontaneous seizures ........................................................................ 79
Mature granule cells exhibit abnormalities in ipsilateral and contralateral hippocampi ................... 81
Neurogenesis is selectively suppressed in the kainic acid-injected hippocampus ............................. 83
Electric activity is not sufficient to promote GCD and newborn cell abnormalities. .......................... 85
Discussion................................................................................................................................................ 87
Methods .................................................................................................................................................. 89
Capítulo 4 .................................................................................................................................................... 92
Discussão Geral ....................................................................................................................................... 92
Alterações na linhagem celular ............................................................................................................... 93
Alterações neuronais nos dois modelos de epilepsia ........................................................................... 101
Conclusões ............................................................................................................................................ 105
Anexo ........................................................................................................................................................ 106
Referências ................................................................................................................................................ 107
8
Lista de Abreviações
AC Ácido Caínico
ADN Ácido desoxirribonucleico
BrdU Bromo-deoxiuridina
CA Cornu Ammonis
CREB cAMP response element-binding protein
CTN Células-Tronco Neurais
DCX Doublecortin
DG Dentate gyrus
EC Entorhinal cortex
ELT Epilepsia do Lobo Temporal
FT Fatores de Transcrição
GCL Granule Cell Layer
GD Giro Denteado
GFAP Glial Fibrilary Acidic Protein
GFP Green Fluorescent Protein
KA Kainic Acid
ML Molecular Layer
PV Parvalbumina
SGZ Subgranular Zone
TLE Temporal Lobe Epilepsy
Tbr2 T-box brain protein 2
ZSG Zona Subgranular
ZSV Zona Subventricular
9
Capítulo 1
Introdução
10
Considerações iniciais
Um dos dogmas centrais da neurociência no século XX foi que a geração de neurônios em
mamíferos seria restrita ao desenvolvimento do sistema nervoso, como indicado na célebre
frase do neurocientista espanhol Ramón y Cajal (1913):
"Once the development was ended, the founts of growth
and regeneration of the axons and dendrites dried up
irrevocably. In the adult centers, the nerve paths are
something fixed, ended, and immutable. Everything may
die, nothing may be regenerated. It is for the science of
the future to change, if possible, this harsh decree."
A capacidade do sistema nervoso de mudar e se adaptar em fases posteriores, portanto,
dependeria exclusivamente de alterações ao nível sináptico, modificando a comunicação entre
dois neurônios pré-existentes. No entanto, com o avanço das técnicas experimentais em
neurobiologia celular na segunda metade do século XX, os pesquisadores encontraram
evidências de geração de novos neurônios, denominada neurogênese, na vida adulta de
mamíferos (Altman e Das, 1965; Alvarez-Buylla e Lois, 1995; Cameron et al., 1993),
revolucionando a ideia de plasticidade celular nessa fase do organismo. A partir de então,
diversos estudos buscaram desvendar os mecanismos que permitiriam à algumas células no
sistema nervoso adulto manter a capacidade de produção de neurônios, assim como o processo
de inserção dessas novas células em circuitos neurais pré-existentes e sua consequência
funcional.
Apesar de ser uma característica natural presente no encéfalo maduro, algumas
patologias, como a epilepsia, podem causar disfunções da neurogênese adulta. Tem-se
especulado que as alterações na neurogênese hipocampal, como observadas na epilepsia pode
contribuir para o desenvolvimento da doença (Jessberger e Parent, 2015). Portanto, é
importante compreender os mecanismos celulares e moleculares que controlam a geração e
INTRODUÇÃO
11
integração de células recém geradas e, dessa forma, identificar maneiras de corrigir as
disfunções da neurogênese adulta encontradas em processos patológicos.
Para melhor contextualizar o processo de neurogênese no encéfalo adulto e o seu
possível envolvimento na gênese e desenvolvimento das epilepsias, faremos a seguir uma breve
revisão das bases conceituais sobre o hipocampo, estrutura envolvida na epilepsia do lobo
temporal e que abriga uma das regiões com ocorrência de neurogênese na vida adulta – o giro
denteado (GD). Posteriormente, descreveremos os aspectos gerais das etapas do
desenvolvimento celular, e por fim focaremos em uma visão geral da patologia e nas alterações
hipocampais que são observadas nessa doença.
1.1 Hipocampo
A formação hipocampal é uma das áreas mais estudadas do encéfalo de mamíferos
(Strien, van, Cappaert e Witter, 2009). Desde 1950, suas estruturas vêm sendo implicadas em
diversos processos cognitivos, tais como memória e aprendizado (Shepherd, 2004). Seu
formato peculiar é associado ao cavalo marinho, o que levou à nomenclatura utilizada. A
formação hipocampal localiza-se na porção medial do lobo temporal de seres humanos, e é
formada pelo hipocampo propriamente dito (também conhecido por Cornu Ammonis, ou CA), o
giro denteado (GD) e o subiculum (Amaral e Witter, 1989). Mais recentemente, evidências
funcionais sugerem que a formação hipocampal deva ser expandida permitindo a inclusão do
presubiculum, parassubiculum e córtex entorrinal (Amaral, 2006).
Em termos anatômicos, a camada de células piramidais do CA é subdividida, latero-
medialmente, em CA1, CA2 e CA3, definidas pelo tamanho e morfologia dos neurônios
piramidais (Amaral, 2006). Os corpos celulares ocupam a camada das células piramidais e as
árvores dendríticas desses neurônios são elaboradas e ramificadas e se estendem
perpendicularmente em ambas as direções, apical e basal, para fora da camada, classificando
esses neurônios como bipolares. Lorente de Nó (1934) classificou ainda uma quarta região, a
camada de células polimórficas próxima do GD, como sendo a região de CA4. Atualmente, essa
INTRODUÇÃO
12
nomenclatura não é mais utilizada, sendo essa região conhecida como o hilo do GD. Além da
diferença entre o tamanho do corpo celular, as regiões têm diferenças quanto a suas conexões.
CA3 recebe as fibras musgosas do GD, enquanto CA2 e CA1 não recebem. CA2 sempre foi
motivo de controvérsias nas classificações por terem morfologia semelhante a CA3, mas não
recebem conexões do GD e parecem ser mais resistentes à morte celular na epilepsia (Figura
1.1) (Grooms et al., 2000).
Figura 1.1
Arquitetura da formação hipocampal. No lado esquerdo, encontra-se um esquema de um encéfalo de
camundongo, evidenciando algumas regiões, com ampliação do hipocampo. À direita, observa-se o
circuito trissináptico da formação hipocampal, detalhando os principais tipos celulares e suas projeções.
CA – Cornus Ammonis; GD – Giro Denteado (Modificado de Christian et al. 2014).
Outra região importante da formação hipocampal (e que também é a mais relevante para
o presente trabalho) é o giro denteado (GD). Esta estrutura é formada por três camadas: a
camada granular, a camada molecular, que circunda o GD, e o hilo (ou camada polimórfica). Os
principais neurônios da camada granular são as células granulares, que possuem corpo celular
com morfologia esférica, compactadas em 4 a 6 níveis de células. Em roedores, a camada
granular dá a impressão de formar, em cortes sagitais, horizontais ou coronais, um V ou U
dependendo da altura septo-temporal observada. Os dendritos das células granulares surgem
na parte apical do corpo celular e se estendem perpendicularmente pela camada granular em
direção a camada molecular, onde recebem conexões sinápticas majoritariamente do córtex
INTRODUÇÃO
13
entorrinal (Amaral e Witter, 1989; Patton e McNaughton, 1995). Devido a essa morfologia, as
células granulares são consideradas neurônios monopolares. Os axônios dessas células,
também chamados de fibras musgosas (devido à aparência dos terminais sinápticos), se
originam na região basal do corpo celular, na posição oposta aos dendritos e se estendem em
direção ao hilo, onde estabelecem conexões com interneurônios e seguem direção à CA3,
formando terminais sinápticos en passage na porção proximal dos dendritos das células
piramidais (Okazaki, Evenson e Nadler, 1995). No hilo são encontradas as células polimórficas,
que são de vários tipos e formas e mantêm apenas conexões locais no GD.
Os outros neurônios do GD e hipocampo, em sua maioria, realizam apenas conexões
sinápticas locais, não possuem espinhas dendríticas e liberam o neurotransmissor ácido amino-
butírico (GABA) (Freund e Buzsáki, 1996). O principal tipo de interneurônio, são as células
piramidais em cesto (em inglês, pyramidal basket cells), presentes principalmente no hilo, mas
também na camada molecular. Os axônios dessas células inervam o corpo celular das células
granulares. Outro tipo interessante de interneurônios compreende as células musgosas
(Amaral, 1978), que são excitatórias e projetam para a camada molecular do GD de ambos
hemisférios, ipsi e contralateral, além de também projetarem ao longo do eixo septo-temporal.
Circuito neuronal do hipocampo
Assim como a anatomia, a circuitaria hipocampal é bem definida funcionalmente de
acordo com sua organização celular. A formação hipocampal é considerado um circuito
trissináptico (Amaral e Witter, 1989), pois a progressão unidirecional de vias excitatórias
conecta as regiões em três checkpoints principais (Figura 1.2)(para uma discussão sobre a
abrangência dessa afirmação canônica, ver Szabo et al., 2017). De forma simples, o córtex
entorrinal é o primeiro ponto de passagem da informação sensorial que chega ao hipocampo. A
informação chega principalmente de duas regiões corticais: o córtex perirrinal e pósrinal.
Anatomicamente, o córtex entorrinal é dividido em duas partes, a porção lateral e a porção
medial. A primeira porção projeta majoritariamente para a camada molecular externa do GD,
enquanto que a segunda, estabelece contatos sinápticos na camada molecular média do GD
ipsilateral. Em ambos os casos, os axônios se originam na camada II do córtex entorrinal.
INTRODUÇÃO
14
Neurônios da camada III projetam bilateralmente para os strata lacunosum-moleculare de CA3
e CA1, além do subículo. Finalmente, as aferências hipocampais das porções dorsal (polo
septal) e ventral (polo temporal) originam-se das partes lateral e medial do córtex entorrinal,
respectivamente (van Groen, Miettinen e Kadish, 2003). Coletivamente, os axônios dos
neurônios cortico-hipocampais recebem o nome de via perforante (Shepherd, 2004).
O GD é considerado o segundo estágio sináptico do loop hipocampo-cortical. Células
granulares projetam, por meio das fibras musgosas, para CA3, estabelecendo contatos
sinápticos com as porções proximais dos dendritos de células piramidais, os boutons en
passage. Essas sinapses são poderosas em produzir alterações na condutância da membrana
celular, podendo produzir excitação em CA3, dependendo da frequência de potenciais de ação
e do tônus de neuromoduladores (Jaffe e Gutiérrez, 2007). As células granulares também
estabelecem sinapses com as células musgosas no hilo, que promove conexões locais,
contralaterais e sinais retroativos em outros níveis no GD. Modelos computacionais e
evidências experimentais sugerem que o GD atua como um separador de padrões, sendo
responsável por segregar novas e velhas memórias (Danielson et al., 2016; Rennó-Costa e Tort,
2017; Sahay et al., 2011; Treves et al., 2008).
As células piramidais em CA3 são o terceiro e último estágio sináptico dentro do
hipocampo, e projetam em vários níveis para CA3 e CA1. Os axônios dos neurônios piramidais
de CA3 são chamados de colaterais de Schaffer (Szirmai, Buzsáki e Kamondi, 2012). Das células
de CA1, a informação neural "sai" do hipocampo através de projeções para o subiculum e para
camadas mais profundas (especialmente a V) do córtex entorrinal e retornam para as mesmas
regiões do neocórtex que projetaram para o córtex entorrinal inicialmente.
INTRODUÇÃO
15
Figura 1.2
Circuitaria hipocampal. Esquema mostrando uma visão transversal do hipocampo onde se encontram as
principais células do GD, CA1 e CA3 que compõem o circuito trisináptico. O cortéx entorrinal é
considerado o ponto inicial do circuito por onde chega a informação sensorial através dos axônios que
compõem a via perfurante e entram em contato com a camada molecular. As células granulares
projetam fibras musgosas para os neurônios piramidais em CA3, que por sua vez projetam através da via
colateral de Schaffer para os neurônios piramidais em CA1. Interneurônios no hilo e camada molecular
participam modulando a atividade das células granulares (modificado de Toni e Schinder, 2015).
Portanto, a informação que entra na formação hipocampal, atravessa regiões por um
sistema de vias excitatórias e retorna para as mesmas áreas que a originaram. Esse fenômeno e
as transformações que ocorrem no processo parecem ser essenciais para a formação de
memórias de longo prazo. No entanto, se olharmos o circuito de forma mais detalhada,
encontraremos muito mais complexidade, onde ocorrem vários níveis de regulação dessa via
principal. Como por exemplo, o papel de feedback e controle da excitação desse sistema
INTRODUÇÃO
16
exercido pelos interneurônios gabaérgicos hilares, outro componente que gera oscilações do
potencial de campo característico do GD.
Diferentes tipos de interneurônios gabaérgicos realizam sinapses somáticas, em
dendritos proximais ou distais e nos segmentos axonais das células principais (Freund e Buzsáki,
1996; Houser, 2007). Esses interneurônios são classificados como interneurônios da via
perfurante na camada molecular (MOPP), hilares relacionados com a via comissural-associativa
(HICAP), hilares associados a via perforante (HIPP), stratum lacunosum-moleculare (LM) e
células em cesto (BC do inglês basket cells) (Freund e Buzsáki, 1996; Houser, 2007). São
classificados de acordo com a localização, morfologia, e expressão de proteínas ligantes de
cálcio.
Além da inibição sináptica que compõe a sinalização e controle da passagem da
informação no GD, o GABA tem ação sobre os progenitores neurais e neurônios pós mitóticos
imaturos promovendo maturação, diferenciação, integração sináptica e sobrevivência,
regulando a neurogênese em vários estágios (Ge et al., 2006; Jagasia et al., 2009; Tozuka et al.,
2005). Essa influência será discutida de maneira detalhada abaixo.
1.2 Neurogênese adulta
O termo neurogênese designa o fenômeno no qual uma célula progenitora origina células
filhas que se diferenciam em neurônios. Células-tronco neurais (CTNs) possuem capacidade de
proliferar e são multipotentes, ou seja, podem dar origem a progenitores de neurônios ou
células macrogliais, incluindo astrócitos e oligodendrócitos (Reynolds e Weiss, 1996). Portanto,
a neurogênese também pode ser entendida como um processo paulatino de restrição do
potencial celular, onde uma CTN origina células progenitoras comprometidas com a geração de
um único tipo celular e estas, por sua vez, originam neurônios pós-mitóticos.
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso central, CTNs ao longo do tubo neural se
organizam de forma espacial e temporalmente precisa, adquirindo padrões distintos de
expressão gênica, e gerando os diferentes tipos neuronais encontrados no sistema nervoso
INTRODUÇÃO
17
central adulto e, em seguida, as células macrogliais (Kriegstein e Alvarez-Buylla, 2009; Miller e
Gauthier, 2007). O fenômeno de neurogênese, na maior parte do sistema nervoso central,
começa em estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e está concluído no início do
período de vida pós natal (Kriegstein e Alvarez-Buylla, 2009). Contudo algumas CTNs
permanecem após este período e retém potencial neurogênico no sistema nervoso central de
mamíferos adultos. De fato, a formação de novos neurônios no cérebro adulto pode ser
encontrada em duas regiões: a zona subventricular (ZSV), ao redor dos ventrículos laterais, e a
zona subgranular (ZSG) do giro denteado no hipocampo (Doetsch et al., 1999; Praag, van et al.,
2002; Song, Stevens e Gage, 2002). A existência de neurogênese em outras regiões está sendo
discutida, mas se acredita que possa ocorrer de forma limitada em condições fisiológicas no
neocórtex, estriado, amídala e substância negra (Gould, 2007). Já o fenômeno de gliogênese no
sistema nervoso central ocorre durante o estágio embrionário e pós natal, permanecendo ativa,
embora em níveis mais reduzidos, durante toda a vida adulta dos mamíferos (Kriegstein e
Alvarez-Buylla, 2009).
No indivíduo adulto, as CTNs da ZSV e ZSG podem permanecer quiescentes (estado de
inatividade proliferativa), renovarem-se, através de divisões simétricas (gerando duas novas
CTNs) ou entrarem em um processo de diferenciação produzindo progenitores comprometidos
com a geração de astrócitos ou neurônios (Bonaguidi et al., 2011; Costa et al., 2011; Pastrana,
Cheng e Doetsch, 2009). É interessante ressaltar que esses processos ocorrem em um tecido já
maduro e com conexões sinápticas estabelecidas, diferentemente do período inicial de
desenvolvimento. Dessa forma, novas células adicionadas ao tecido (astrócitos ou neurônios)
são geradas em um ambiente rico em “eventos” fisiológicos, farmacológicos e ambientais,
diferenciando a neurogênese adulta daquela observada na vida embrionária (Praag, van et al.,
1999).
A neurogênese adulta parece estar bem-conservada nos mamíferos, sendo também
descrita em outras classes, como pássaros, répteis e peixes (Nottebohm 2002; Zupanc 2002).
Entretanto, sua confirmação em humanos dependeu da superação de dificuldades técnicas, tais
como o desenvolvimento de métodos eficazes para coleta e análise de tecido post mortem. De
fato, apenas recentemente, coletou-se evidências suficientes da ocorrência de neurogênese
INTRODUÇÃO
18
adulta no hipocampo de seres humanos (para uma revisão ver Bergmann, Spalding, e Frisén
2015). No entanto, a ocorrência de neurogênese no bulbo olfatório humano adulto ainda é
controversa (Bergmann et al., 2012; Curtis et al., 2007). A seguir, discutiremos em detalhe a
neurogênese no hipocampo, que é o objeto de estudo utilizado no presente trabalho.
A forma mais comum de marcar e identificar células que estão sendo geradas num
organismo é através da administração de análogos da timidina (como o Bromo-deoxiuridina
[BrdU] e a timidina triciada [3H]). Estas moléculas são incorporadas ao material genético de
células proliferativas durante a fase S do ciclo celular, quando ocorre a duplicação do ácido
desoxirribonucleico (ADN). Portanto, a administração de BrdU, por exemplo, a um animal
adulto permite a posterior identificação, através de métodos imunohistoquímicos e
microscópicos post mortem, das células que estavam em fase S no momento do tratamento e
sua progênie. Desta forma, foi possível demonstrar de maneira inequívoca que novos neurônios
eram adicionados ao giro denteado de mamíferos adultos (Kuhn, Dickinson-Anson e Gage,
1996), embora estudos anteriores com timidina triciada já sugerissem a ocorrência de
neurogênese no hipocampo adulto (Altman e Das, 1965; Cameron et al., 1993; Kaplan e Hinds,
1977).
Nos últimos 20 anos, o uso de vetores retrovirais para transfectar especificamente células
proliferativas e acompanhar sua progênie permitiu um avanço significativo no estudo da
neurogênese adulta, uma vez que a introdução de genes codificando proteínas fluorescentes,
como GFP (do inglês, green fluorescent protein), nas células progenitoras da ZSG permitiu a
análise morfológica das células fluorescentes em diferentes estágios de desenvolvimento (Zhao
et al., 2006), assim como o estudo das suas propriedades eletrofisiológicas em fatias (Laplagne
et al., 2006). Por fim, o uso do sistema cre-lox em estudos de mapeamento genético de
linhagens celulares, permitiu avaliar a progressão da linhagem de uma CTN adulta até a geração
de células granulares (Andersen et al., 2014; Imayoshi et al., 2008; Ninkovic, Mori e Götz, 2007;
Suh et al., 2007).
Utilizando estas técnicas, foi possível caracterizar o padrão de expressão gênico das CTNs
e progenitores, assim como os estágios de diferenciação dos novos neurônios gerados no giro
INTRODUÇÃO
19
denteado (Figura 1.3). Utilizando BrdU ou retrovírus, foi demonstrado que o processo de
neurogênese hipocampal se inicia na zona subgranular, onde células do tipo glia-radial (Tipo 1),
consideradas CTNs, e progenitores não-radiais (Tipo 2a) funcionam como progenitores
multipotentes (Filippov et al., 2003). Essas células produzem os progenitores intermediários
que, por sua vez, geram os neuroblastos. Esses neuroblastos migram pela camada granular
interna e se diferenciam em células granulares (Ming e Song, 2005). Os novos neurônios se
tornam estrutural e funcionalmente maduros com 6 a 8 semanas (Espósito et al., 2005; Praag,
van et al., 2002; Zhao et al., 2006).
As células tipo 1 possuem um ciclo celular longo e são estruturalmente caracterizadas
pela presença de um prolongamento radial que se estende pela camada granular e a expressão
das proteínas GFAP (do inglês, glial fibrillary acidic protein) e nestina (Kempermann et al., 2004;
Seri et al., 2001). O traçamento de linhagem celular mostrou que esse tipo celular, semelhante
à glia radial do telencéfalo em desenvolvimento (Kriegstein e Alvarez-Buylla, 2009), é uma
célula-tronco capaz de sofrer divisão simétrica e assimétrica e dessa forma se replicar e
produzir progenitores de neurônios ou astrócitos, mas não oligodendrócitos (Bonaguidi et al.,
2011; Kang et al., 2010). A sinalização mediada por Notch parece ser essencial para
manutenção das células no estágio Tipo 1 (Imayoshi et al., 2010). Esse tipo celular também
apresenta propriedades de contato com os vasos sanguíneos e perfil eletrofisiológico similar à
astroglia (Filippov et al., 2003; Steiner et al., 2006).
As células progenitoras do tipo 1 têm, inicialmente, um formato que se assemelha a glia
radial no início do desenvolvimento: um corpo celular triangular com uma longa projeção apical
ramificada. Outro tipo de célula tipo 1 foi identificada por Lugert et al. (2010), com a
característica de ter processos curtos horizontais. Aparentemente se dividem mais
rapidamente. Quando se torna ativada, perde as projeções e assume um corpo celular
arredondado ou alongado, característico de células tipo 2, e migram para a camada granular
(Kempermann et al., 2004).
Uma vez que as células progenitoras entram em divisão, elas passam por um estágio
temporário de progenitores amplificadores, ou células tipo 2 (Kempermann et al., 2004;
INTRODUÇÃO
20
Kronenberg et al., 2003). As células tipo 2 são altamente proliferativas e são o estágio de
definição entre o potencial de gerar astrócitos ou neurônios (Steiner et al., 2006). Na linhagem
que vai assumir o fenótipo neuronal, a célula regula negativamente a expressão de nestina e
aumenta a expressão da proteína neuronal DCX (doublecortin) e do fator de transcrição TBR2
(T-box brain protein 2) (Kronenberg et al., 2003; Steiner et al., 2006) e se comprometem com
esta linhagem gerando o progenitor tipo 3 (Hodge et al., 2008). A fase de progenitor tipo 2,
portanto, pode ser subdividida em dois estágios: tipo 2a e tipo 2b. O tipo 2a pode expressar a
proteína GFAP de forma residual como as células tipo 1, e o tipo 2b que não apresenta nestina
ou GFAP e começa a expressar o DCX (Steiner et al., 2006). É possível que o progenitor tipo 2b e
tipo 3 representem o mesmo tipo celular, uma vez que ambos são caracterizados pela
capacidade proliferativa, expressão de DCX, TBR2 e PROX1, e comprometimento com a geração
de neurônios.
A proteína estrutural DCX está presente de forma transiente em neurônios imaturos e em
processo de migração. O aumento da assimilação de BrdU em resposta à atividades que
aumentam proliferação celular é acompanhado pela comarcação com a proteína DCX, e por
isso tem sido utilizada como marcador de taxas de neurogênese adulta (Brown et al., 2003;
Couillard-Despres et al., 2005; Rao e Shetty, 2004). É uma proteína encontrada no citoesqueleto
celular associada à regulação e estabilidade de microtúbulos e é encontrado especificamente
em neurônios (Gleeson et al., 1999). Neste trabalho, utilizaremos o DCX como marcador da
linhagem neuronal e trataremos os dois tipos de progenitores, 2b e 3, de forma conjunto, mas
assumindo a sequência apresentada na Figura 1.3.
Finalmente, os progenitores tipo 3 geram neurônios, que são inicialmente células
arredondadas e passam por um período de migração para a camada granular, extensão de
dendritos em direção a camada molecular e axônio em direção ao hilo e CA3, completando o
processo de diferenciação morfológica (Zhao et al., 2006).
Apesar de células nos diferentes estágios da progressão da linhagem entre uma CTN e um
neurônio estarem presentes no hipocampo simultaneamente, ainda é desconhecido se todas as
etapas são necessárias para a neurogênese ou se, por exemplo, células tipo 1 poderiam,
INTRODUÇÃO
21
eventualmente, gerar neurônios diretamente. A resolução temporal é imprecisa, por limitações
das técnicas disponíveis, e é também imprecisa a determinação de onde as regulações ocorrem
e em que momento é definido o fenótipo neuronal. Por fim, ainda é questionável se esse
processo é estritamente unidirecional ou se o progenitores mais tardios na linhagem
neurogênica podem regredir para estágios mais primitivos da linhagem celular (Kim et al., 2007;
Urban et al., 2016).
Figura 1.3
Linhagem celular envolvida na neurogênese hipocampal, modificado de Encinas e colaboradores
(2013). Classificação dos tipos de progenitores obedece às características de morfologia, proliferação e
expressão de proteínas.
Curiosamente, a linhagem das CTNs no giro denteado comporta uma taxa residual de
geração de astrócitos (Bonaguidi et al., 2011; Encinas et al., 2011). Astrócitos maduros e CTN
apresentam características similares, como a expressão de GFAP, mas podem ser distinguidas
pela morfologia, expressão de nestina e capacidade de proliferar e gerar neurônios. O número
de astrócitos gerados no GD aumenta com a idade do indivíduo, enquanto o número de
INTRODUÇÃO
22
neurônios diminui, sugerindo que as CTNs poderiam estar se transformando em astrócitos após
a fase de geração de neurônios (Encinas et al., 2011) ou que as CTNs mudariam seu potencial
ao longo da vida adulta, adquirindo capacidade gliogênica em detrimento à neurogênica
(Bonaguidi et al., 2011).
Ainda não são conhecidos os mecanismos moleculares que controlam a aquisição do
fenótipo neuronal ou astroglial quando uma CTN do hipocampo adulto se torna ativada. No
entanto, um importante candidato é o neurotransmissor GABA através da subunidade y2 nos
canais GABAA presente nessas células, independente da ativação sináptica. A atividade de
interneurônios em contato com esses progenitores pode definir a escolha da permanência na
quiescência ou ativação para entrar em divisão celular (Song, Zhong, et al., 2012). É possível
modular essa resposta através do DBI (do inglês diazepam binding inhibitor) que se liga no sítio
receptor de benzodiazepínicos do receptor GABAA induzindo o aumento da proliferação de
CTNs e diferenciação em astrócitos, enquanto a redução de DBI e o aumento da sinalização de
GABA promove a a quiescência das CTNs, proliferação de progenitores neuronais pré-existentes
e a diferenciação de neurônios imaturos (Dumitru et al., 2017). Portanto, podemos concluir que
uma maior atividade gabaérgica favorece a neurogênese, enquanto uma redução da atividade
gabaérgica favorece a astrogliogênese.
Diferenciação dos novos neurônios
Os neurônios recém-gerados no giro denteado adulto passam por uma intensa fase de
alterações morfológicas nos primeiros dias de vida. Durante a primeira semana de
diferenciação, os neurônios localizados na camada subgranular apresentam projeções paralelas
à camada granular. Em seguida, estas células desenvolvem dendritos sem espinhas que
alcançam a camada molecular entre a segunda e terceira semanas de diferenciação e, na quarta
semana, já estão posicionados na camada granular e passam a apresentar dendritos com
espinhas na camada molecular externa (Figura 1.4) (Espósito et al., 2005).
INTRODUÇÃO
23
Durante este período de alterações morfológicas, também são observadas mudanças
importantes na expressão de diversos genes tipicamente neuronais (Dhaliwal e Lagace, 2011).
Por exemplo, as proteínas DCX e NeuroD, que começam a ser expressas em progenitores 2b/3,
são encontradas em neurônios pós-mitóticos somente durante as primeiras 2 a 3 semanas,
enquanto a expressão de calbindina e NeuN se inicia após este período e permanece em células
granulares maduras (Jagasia et al., 2009). Além disso, a expressão de transportadores e canais
iônicos é profundamente alterada nas primeiras semanas de diferenciação neuronal, com
importantes consequências sobre as propriedades elétricas destas células (Lledo, Alonso e
Grubb, 2006).
O período completo de amadurecimento elétrico de um neurônio pode levar 1 a 2 meses,
no qual neurônios jovens apresentam características de alta resistência de input elétrico, sendo
mais excitáveis que neurônios maduros. Quando caracterizados funcionalmente, os novos
neurônios mostram um processo de desenvolvimento estereotipado no qual GABA precede a
formação de sinapses glutamatérgicas (Espósito et al., 2005; Overstreet-Wadiche, 2006). Esse
processo é um pouco mais lento em neurônios gerados na vida adulta do que naqueles gerados
em estágios iniciais de desenvolvimento do giro denteado, ainda no período neonatal (Espósito
et al., 2005). No entanto, uma vez que os neurônios granulares gerados na vida adulta atingem
seu estágio final de maturação, não são identificadas características morfológicas ou
eletrofisiológicas que os diferenciem daqueles gerados no período de vida neonatal (Laplagne
et al., 2006).
Apesar dos precursores do tipo glia radial apresentarem receptores funcionais para GABA
(Song, Zhong, et al., 2012), a primeira sinapse funcional parece surgir somente nos
neuroblastos nos primeiros 4 dias a partir da divisão (células tipo2b/3) (Song et al., 2013;
Tozuka et al., 2005). No entanto, neurônios imaturos exibem apenas respostas despolarizantes
lentas ao GABA, enquanto células granulares mais maduras passam a apresentar respostas
hiperpolarizantes rápidas ao mesmo neurotransmissor (Espósito et al., 2005; Ge et al., 2006). Já
foi observado que vários subtipos de interneurônios inervam os novos neurônios nas primeiras
semanas e parecem ter um papel no controle da integração celular (Deshpande et al., 2013;
Markwardt et al., 2012; Song et al., 2013).
INTRODUÇÃO
24
A mudança das respostas iniciais despolarizantes nos novos neurônios para respostas
hiperpolarizantes ocorre em cerca de duas ou três semanas (Figura 1.4) (Espósito et al., 2005;
Ge et al., 2006; Overstreet-wadiche et al., 2006). A fase inicial da sinalização gabaérgica
induzindo a despolarização neuronal é crítica para os estágios precoces de diferenciação,
controlando importantes apectos metabólicos envolvidos em sobrevivência, maturação,
formação e ativação de sinapses nos neurônios (Chancey et al., 2013; Ge et al., 2006; Song et
al., 2013; Tozuka et al., 2005). Por exemplo, a fosforilação do fator transcricional CREB (do
inglês, cAMP response elemento-binding protein) nas primeiras semanas de diferenciação
neuronal depende da ação despolarizante de GABA e é necessária à sobrevivência celular
(Jagasia et al., 2009).
Análises eletrofisiológicas também demostram que as primeiras respostas
glutamatérgicas acontecem apenas entre 11 e 14 dias, e seguem amadurecendo nas semanas
seguintes, acompanhando o aumento de espinhas dendríticas (Figura 1.4) (Espósito et al., 2005;
Ge et al., 2006). O aumento gradual da inibição - em conjunto com a formação de sinapses
glutamatérgicas e mudanças fisiológicas intrínsicas do neurônio - proporcionam características
únicas em um período crítico de plasticidade durante a maturação. Esse período crítico é
particularmente importante para a integração desses neurônios e participação na formação de
memórias (Deng, Aimone e Gage, 2010). De forma geral no animal adulto, os neurônios ainda
imaturos apresentam propriedades celulares distintas dos neurônios maduros já integrados,
logo, é de se esperar que essas diferenças tenham um papel no mecanismo que permite
plasticidade dependente da experiência (Alvarez et al., 2016); e, de forma indireta, levanta
questionamentos sobre a susceptibilidade dessas células a eventos patológicos.
INTRODUÇÃO
25
Figura 1.4
Esquema do desenvolvimento neuronal, incluindo as propriedades neuronais e integração sináptica em
uma linha temporal. (Adaptado de Christian et al. 2014)
Inicialmente os novos neurônios interagem com interneurônios na zona subgranular e
hilo através de pequenos eventos não-sinápticos de despolarização da membrana plasmática,
uma vez que ainda não apresentam contatos sinápticos. Em uma semana, realizam os primeiros
contatos sinápticos com interneurônios na camada molecular interna e em seguida recebem
sinapses de células musgosas no hilo como primeiro estímulo glutamatérgico. Conexões com
interneurônios da camada molecular (MOPP) ocorrem apenas mais tardiamente, coincidindo
com o crescimento dos dendritos na camada molecular (Deshpande et al., 2013; Espósito et al.,
2005). Entre a primeira e segunda semana de idade dos novos neurônios, os contatos sinápticos
INTRODUÇÃO
26
praticamente triplicam, com o surgimento de conexões com neurônios colinérgicos do septo
medial e núcleo diagonal de Broca (Deshpande et al., 2013). Durante esse período, ocorre a
troca do efeito de GABA com a reversão do potencial dos receptores GABAA, que deixam de ser
excitatórios em resposta ao GABA e passam a hiperpolarizar a célula (Ge et al., 2006). Após 3
semanas, completa-se a integração das novas células granulares com o córtex entorrinal e são
observadas conexões com o subiculum (Deshpande et al., 2013). O aumento das conexões
glutamatérgicas ocorre na quarta semana e a célula passa a exibir potenciais excitatórios pós-
sinápticos de alta frequência. O amadurecimento se torna completo com o desenvolvimento
das conexões perissomáticas gabaérgicas (Espósito et al., 2005).
Por outro lado, contatos sinápticos entre as células granulares e interneurônios hilares e
neurônios em CA3 começam a ser observados em cerca de 17 dias, enquanto os botões en
passant das fibras musgosas atingem maturação com 8 semanas (Toni et al., 2008). A
integração definitiva das células granulares ao circuito hipocampal também apresentará
contatos sinápticos “de retorno” vindo de células piramidais de CA3 e outras células granulares
no giro denteado (Vivar et al., 2012), embora a escala temporal do desenvolvimento destas
conexões em novos neurônios permaneça desconhecida.
O desenvolvimento das conexões em etapas temporais garante que a incorporação dos
novos neurônios granulares no circuito trissináptico clássico ocorra de forma gradual,
integrando essas células quando tenham alcançado maturidade celular e já participem do
circuito local. No entanto, o papel dos novos neurônios para o funcionamento da circuitaria
hipocampal, especialmente pelas suas propriedades elétricas iniciais, parece ser maior que a
simples substituição de células. De fato, experimentos recentes sugerem que células granulares
recém-geradas são mais responsivas à estimulação fraca dos aferentes da via perfurante
quando comparadas ás células granulares maduras (Marín-Burgin et al., 2012). Desta forma, a
neurogênese adulta permite que o giro denteado possua constantemente uma população
heterogênea de neurônios capazes de responder diferentemente aos estímulos, o que poderia
explicar a importância dos novos neurônios hipocampais para o aprendizado (Kropff, Yang e
Schinder, 2016).
INTRODUÇÃO
27
Figura 1.5
Circuitaria do GD em detalhe. Em verde células granulares geradas na fase adulta apresentam mesmo
perfil eletrofisiológico que células presentes desde o embrião (em vermelho) uma vez que estejam
integradas no circuito. O GD possui uma circuitaria complexa, com interneurônios que projetam
localmente ou entre hemisférios (Adaptado de Aimone et al., 2014).
Relevância funcional dos novos neurônios
O número significativo de novos neurônios, juntamente com a regulação dinâmica da
neurogênese por diversos fatores ambientais, fisiológicos e patológicos sugere que a
neurogênese seja importante para determinadas funções hipocampais (James B. Aimone, Wei
Deng, 2011). O mecanismo de adicionar novas unidades individuais em um sistema já
estabelecido induz elevada plasticidade estrutural no circuito neuronal pré-existente. As
implicações desse processo parecem ir muito além de uma simples reposição de neurônios
INTRODUÇÃO
28
perdidos. Acredita-se que os neurônios recém-gerados no GD adulto sejam importantes para
adaptar o indivíduo a eventos novos, gerando novas memórias, aprendizado espacial e
separação de padrões (Aimone, Deng e Gage, 2010).
A principal função atribuída ao GD é a separação de padrões, um conceito dentro do
processamento de informação que seria a habilidade de distinguir contextos e estímulos
similares e gerar atividades neuronais distintas (Leutgeb et al., 2007). Notoriamente, a ablação
da neurogênese adulta no giro denteado compromete o desempenho de roedores em testes
comportamentais que envolvem a separação de padrões (Clelland et al., 2009; Danielson et al.,
2016), indicando que a adição de novos neurônios na circuitaria hipocampal contribui para a
função da estrutura.
O hipocampo também faz parte do sistema límbico e está relacionado com a regulação
do humor. Existem inúmeras evidências que demonstram uma regulação da proliferação de
progenitores e/ou sobrevivência reduzindo o número de neurônios gerados no giro denteado
adulto em situações de estresse e depressão (Gould et al., 1992; Sahay e Hen, 2007; Warner-
Schmidt e Duman, 2006). Camundongos que passaram por processo de ablação da
neurogênese, além de exposição a situações estressantes, apresentam um maior nível de
hormônios de estresse e maior resposta comportamental em testes específicos, o que sugere
um envolvimento com o eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) (Schloesser, Manji e
Martinowich, 2009; Snyder et al., 2011). Contudo, não está claro de que maneira a adição de
novos neurônios na circuitaria hipocampal poderia regular a atividade do eixo HPA.
Muitos outros fatores externos estão diretamente relacionados com as taxas de
neurogênese e destino dos progenitores. Alguns têm efeito de promover proliferação e
sobrevivência, como exercício físico voluntário e exposição à ambiente enriquecido (Gage,
Praag, van e Kempermann, 1999; Praag, van et al., 2002). Parece haver uma interconexão entre
neurogênese hipocampal e os sistemas de neurotransmissão relacionados à estresse e
exercício, como adrenérgico, dopaminérgico, colinérgico, mas ainda faltam evidências
indicativas de quais seriam os mecanismos precisos deste controle (Veena, Rao e Srikumar,
2011).
INTRODUÇÃO
29
A importância da neurogênese parece ser mais clara em estudos comportamentais que
promoveram situações de aumento da proliferação e ganho de função (Sahay et al., 2011), em
comparação com os experimentos que utilizam ablação e perda de função (Singer et al., 2011).
Essa informação não é surpreendente se pensarmos que a remoção de uma população celular
pode desencadear mecanismos compensatórios, enquanto conexões aberrantes podem ser
mais prejudiciais.
Em um nível de observação mais amplo, a neurogênese também apresenta regulação da
sobrevivência em resposta à experiência e desafios ambientais. Esses estímulos também
podem atuar positivamente ou negativamente nos níveis de proliferação. O enriquecimento
ambiental e exercício voluntário promovem um aumento proeminente na neurogênese
hipocampal. O ambiente enriquecido apresenta diferentes estímulos sociais, sensoriais e
motores. E em particular, experimentos realizados com exercícios na presença de running
wheels permitiram isolar a atividade voluntária como um dos fatores mais importantes para a
proliferação celular, enquanto estímulos do enriquecimento sensorial afetavam mais a
sobrevivência e diferenciação. (Gage, Praag, van e Kempermann, 1999), possivelmente agindo
sinergicamente por diferentes mecanismos. Além disso, a atividade física leva a alterações nos
vasos e permeabilidade da barreira hemato-encefálica, o que correlaciona indiretamente com a
circulação de hormônios e fatores de crescimento (Fabel et al., 2009).
Enquanto isso, o aumento da idade e estresse têm um efeito dramaticamente redutor
nos níveis de neurogênese. O estresse está associado com a liberação de glicocorticoides na via
sanguínea, e consequentemente relaciona as alterações de humor à efeitos sobre as funções da
neurogênese (Lehmann et al., 2013). O envelhecimento está diretamente relacionado com à
redução da proliferação celular, sobrevivência e diferenciação celular. Com o tempo, a
diferenciação neuronal vai invertendo proporções de produção com a diferenciação astroglial.
A redução da neurogênese parece ser resultado de uma redução na atividade e quantidade da
população de progenitores (Star W. Lee, Gregory D. Clemenson Jr., 2012).
INTRODUÇÃO
30
Regulação da neurogênese
A neurogênese adulta está sujeita à modulação nas taxas de produção dependendo da
atividade do indivíduo. O controle pode acontecer em diferentes estágios da progressão da
linhagem entre uma CTN e um neurônio pós-mitótico, envolvendo controle da proliferação,
tipo de divisão celular, especificação fenotípica, diferenciação e sobrevivência celular. A seguir,
discutiremos o papel de fatores intrínsecos e extrínsecos sobre o controle destas diferentes
etapas da linhagem neurogênica do hipocampo adulto.
Os fatores de transcrição (FT) são proteínas capazes de controlar a transcrição gênica e,
portanto, são um importante grupo de elementos intrínsecos da célula orquestrando os
processos de diferenciação celular. As funções específicas podem variar dependendo do tipo
celular (Lledo, Alonso e Grubb, 2006), mas a ação de alguns FTs no controle da neurogênese
hipocampal é bem conhecida.
O Ascl1, por exemplo, é importante para controlar o destino celular, e, em condições
normais, Ascl1 induz a produção apenas de neurônios granulares (Kim et al., 2007, 2011).
Porém, sob o efeito de super expressão, Ascl1 gera oligodendrócitos (Jessberger et al., 2008).
As CTN expressam Ascl1, e sua expressão é mantida nos progenitores intermediários ativos,
enquanto sua inibição impede a proliferação. Como forma de induzir ativação, o ácido caínico
parece ser um meio capaz de promover a ativação de Ascl1 em células quiescentes e induzir a
entrada no ciclo celular proliferativo (Andersen et al., 2014).
NeuroD e Prox1 são regulados pela b-catenina e implicam o envolvimento com a via wnt
na regulação de células granulares (Gao et al., 2009; Liu et al., 2000). Contudo, os mecanismos
específicos do controle de diferenciação de cada fase ainda não estão completamente
esclarecidos. Prox1 é amplamente utilizado como marcador de células granulares e é
importante para a sobrevivência e maturação de neurônios (Karalay et al., 2011; Lavado et al.,
2010). A deleção condicional de Prox1 leva a redução de número de células DCX+ e calretinina+
(Lavado et al., 2010).
INTRODUÇÃO
31
É importante observar que a expressão de diferentes fatores de transcrição também
serve como marcadores para identificar em que estágio a célula se encontra, mesmo que sua
função não seja plenamente conhecida. Além disso, a expressão de FTs como PROX1 e NEUROD
são considerados como pontos críticos na determinação da linhagem neuronal (Karalay et al.,
2011).
Além dos fatores intrínsecos, fatores externos do microambiente são extremamente
importantes na sinalização e destino celular. Por exemplo, células progenitoras transplantadas
em regiões neurogênicas ou não-neurogênicas apresentam respostas diferentes, preferindo um
destino gliogênico ou neurogênico (Seidenfaden et al., 2006; Shihabuddin et al., 2000). Nos
nichos neurogênicos, tanto os fatores secretados quanto o contato celular são cruciais na
promoção da neurogênese. Nesse mesmo contexto a presença de sinais pró-inflamatórios e
anti-inflamatórios também têm papel crítico nas taxas de neurogênese (Carpentier e Palmer,
2009).
O aminoácido GABA é o principal neurotransmissor inibitório e atua em diversos estágios
da progressão da linhagem das CTNs adultas, controlando aspectos tão diversos quanto
proliferação, diferenciação e sobrevivência celular (Aimone et al., 2014). As células tipo 1 são
sensíveis à ação local de GABA pois nessa fase os receptores respondem de forma tônica, por
ativação não sináptica dos neurônios parvalbumina (PV)+ presentes. O GABA age suprimindo a
proliferação simétrica dos progenitores, favorecendo a quiescência ou a diferenciação (Song,
M. Christian, et al., 2012). Portanto aumentando a atividade do GD e, por consequência,
ativando os neurônios PV+, ocorre a inibição da ativação de células tronco quiescentes
enquanto a sobrevivência e proliferação de progenitores neuronais já diferenciados é
favorecida. Em contrapartida quando o GD e neurônios PV+ têm atividade reduzida, ocorre a
ativação da expansão das células tronco quiescentes através de divisões simétricas e
simultaneamente a proliferação e sobrevivência dos progenitores diferenciados é reduzida
(Song, Zhong, et al., 2012).
Além desse efeito não-sináptico do GABA sobre as CTNs, uma resposta funcional
sináptica ao neurotransmissor já pode ser observada em progenitores tipo 2, influenciando a
INTRODUÇÃO
32
proliferação e sobrevivência celular (Tozuka et al., 2005) . Posteriormente, a sinalização por
GABA tem um papel fundamental na sobrevivência e maturação dos neurônios pós-mitóticos,
especialmente nas duas primeiras semanas de diferenciação neuronal, quando o GABA tem
efeito despolarizante, ativando cascatas de sinalização celular capazes de fosforilar CREB
(Jagasia et al., 2009).
Células com 3 dias começam a expressar canais de resposta ao glutamato, mas os inputs
glutamatérgicos são encontrados em células a partir de 3 semanas de idade que corresponde
quando a célula passa a apresentar espinhas nos terminais dendríticos. Os canais NMDA têm
um papel importante na formação das primeiras sinapses excitatórias e inicialmente as células
apresentam um menor limiar para indução de potenciais de ação facilitando a potenciação de
longo prazo (LTP) (Ge et al., 2007; Tashiro et al., 2006) O glutamato atua facilitando a
sobrevivência e integração de neurônios imaturos (Tashiro et al., 2006).
Outros sistemas modulatórios agem na circuitaria local e também têm funções na
neurogênese (Figura 1.6). A serotonina, que está relacionada com depressão e estresse,
também favorece a proliferação (Mahar et al., 2014). Alguns sistemas são menos conhecidos
como a norepinefrina, que é necessária para proliferação, acetilcolina age em favor da
maturação e sobrevivência, assim como o glutamato, e a dopamina atua na maturação através
da sua ação sobre a LTP dos neurônios que estão se integrando (Mu, Zhao e Gage, 2011; Veena,
Rao e Srikumar, 2011).
INTRODUÇÃO
33
Figura 1.6
Circuitos influenciam a neurogênese em diferentes estágios do desenvolvimento celular. O sistema
gabaérgico mantém progenitores Tipo 1 quiescentes enquanto promove proliferação e sobrevivência de
estágios mais avançados. Glutamato, o principal neurotransmissor excitatório promove sobrevivência e
integração de neurônios imaturos. Outros sistemas de neurotransmissores conhecidos pelo
envolvimento com patologias regulam diferentes partes do processo (Aimone et al. 2014).
INTRODUÇÃO
34
Além disso, a regulação também pode ser feita localmente por ação de outras células. A
microglia regula a neurogênese através da fagocitose dos neurônios que não se integrarão no
hipocampo. O processo de morte celular programada depende dessa interação com a
microglia, que engloba as células apoptóticas com seus processos (Sierra et al., 2010).
Além das alterações sobre as taxas de proliferação, a formação de novos neurônios pode
ser controlada pela morte programada de células já geradas. Os mecanismos de morte celular
podem ser classificados como apoptose, necrose, e autofagia celular, sendo apoptose a mais
importante no hipocampo adulto, e funcionam como uma forma de controlar a população
celular e remoção de erros indesejados. Cerca de 30 a 70% dos neuroblastos gerados podem
sobreviver dependendo das condições fisiológicas ou patológicas e contextos comportamentais
que o animal é exposto, enquanto os restantes morrem nas duas primeiras semanas após sua
geração (Dayer et al., 2003; Gu et al., 2012). A maioria dessas células em processo de morte
expressam marcadores como DCX e PSA-NCAM, e estão formando contatos sinápticos
provisórios, indicando que a morte celular programada ocorre principalmente no período de
maturação dos novos neurônios (Brandt et al., 2003; Nacher et al., 2001). Esse período crítico
tem o papel de selecionar o número ótimo de neurônios finais, de forma dependente de sinais
tróficos liberados segundo a necessidade do contexto. A competição entre neurônios por esses
sinais eventualmente determina quantas células permanecerão e se integram no circuito
hipocampal (Leuner, 2004).
Os astrócitos não são apenas um dos produtos alternativos das células progenitoras, mas
também são importantes para indução neuronal (Barkho et al., 2006). Eles liberam fatores
como citocinas pro-inflamatórias e moléculas de adesão vascular que atuam como sinais
indutores da diferenciação neuronal, podendo contribuir para o aumento desse processo. Além
disso, os astrócitos estão intimamente ligados fisicamente com os vasos sanguíneos e são
pontes comunicantes de vários fatores extrínsecos que chegam por essa via.
INTRODUÇÃO
35
1.3 Epilepsia
Teoricamente, epilepsia pode ser definida como um distúrbio do sistema nervoso central
caracterizado por uma maior predisposição do organismo em gerar crises convulsivas (Fisher et
al., 2005). Operacionalmente, atribui-se o diagnóstico de epilepsia para pacientes que
apresentem pelo menos duas crises não provocadas em um intervalo maior que 24 h, ou que
apresentem sinais e sintomas associadas a alguma síndrome epiléptica (Fisher et al., 2014). Por
sua vez, crises convulsivas epilépticas são definidas como sinais e/ou sintomas transientes
causados por uma atividade neuronal anormal excessiva ou hipersincrônica (Fisher et al., 2005).
A classificação das crises é fundamental para a determinação do tipo de epilepsia e
consequentemente, do tratamento farmacológico mais apropriado. De maneira geral, as crises
podem ser classificadas como tendo um início focal (restrito a uma rede neural específica),
generalizada (envolvendo o encéfalo inteiro) ou de natureza não determinada (Fisher et al.,
2017). A expressão comportamental da crise depende da área recrutada pela atividade
epileptiforme inicial e de sua propagação, podendo comprometer a consciência ou não.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, as epilepsias afetam 50 milhões de
pessoas no mundo, comprometendo a qualidade de vida dos pacientes, que devido à
imprevisibilidade quanto as crises tornam atividades cotidianas, tais como dirigir ou nadar,
perigosas. Além disso, geram um grande custo para saúde pública com tratamentos paliativos
(WHO 2004). Apesar de sua alta incidência, estigmas e crenças equivocadas sobre sua
existência resulta em importantes implicações sociais e psicológicas para os pacientes. Devido
às difíceis situações do sistema de saúde, principalmente em países em desenvolvimento como
falta de infraestrutura adequada e drogas disponíveis, a baixos níveis de conhecimento sobre a
doença pela população em geral, acredita-se que 80% desses pacientes não recebem
tratamento ou este é inadequado (Dua et al., 2006).
Ainda não se conhece o mecanismo pelo qual crises epilépticas surgem, se propagam e,
até mesmo, porque cessam espontaneamente. Em 70% dos casos, o tratamento farmacológico,
com uma ou mais drogas antiepilépticas, permite o controle sintomático das crises. Porém, em
torno de 30% dos pacientes, as crises não são controladas mesmo após um regime de
INTRODUÇÃO
36
politerapia (i.e., múltiplas drogas), o que é conhecido como epilepsia refratária (Choy, Duffy e
Lee, 2016). Nesses casos, os pacientes são encaminhados para centros especializados para
serem avaliados quanto a possibilidade e ressecção do foco epiléptico por um neurocirurgião,
um procedimento invasivo, extremamente oneroso para o sistema de saúde, com grandes
possibilidades de sequelas para o paciente, e sem necessariamente garantia de cura.
Algumas epilepsias têm origem genética provenientes de mutações e são chamadas de
epilepsias primárias. As epilepsias secundárias se desenvolvem como consequência de um
evento inicial como tumor, trauma, acidente vascular cerebral, infecções e malformações
congênitas. A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) pertence ao grupo de epilepsias secundárias ou
adquiridas, e corresponde à 30% dos casos de epilepsia, sendo frequentemente refratárias ao
tratamento medicamentoso (Fisher et al. 1998).
Na ELT, as crises se iniciam no lobo temporal, especificamente no hipocampo ou em
outras estruturas mesiais (e.g., amígdala), sendo bastante comum encontrar alterações
substanciais na estrutura hipocampal. As alterações mais comuns são morte celular no hilo e
nas camadas piramidais de CA1 e CA3 (Babb et al., 1984), astrogliose, reorganização axonal nas
células granulares (Sutula et al., 1989). Também foi observado nos pacientes um aumento do
tamanho da camada granular, o que é conhecido como dispersão das células granulares (Haas
et al., 2002; Houser, 1990). Como o GD é a via de entrada da informação no hipocampo, ele é
uma estrutura com papel importante na patogênese da ELT, pois se encontra hiperexcitável
(Masukawa et al. 1996; Gabriel et al. 2004) e com as células granulares alteradas (Houser 1992).
Epileptogênese
A epileptogênese é o processo pelo qual um encéfalo normal torna-se epiléptico.
Diversos mecanismos biológicos podem ser responsáveis pela formação de um circuito neural
capaz de produzir crises epilépticas espontâneas e recorrentes (McNamara, Huang e Leonard,
2006). Na maioria dos casos, insultos de natureza química, traumática, infecciosa e/ou de causa
desconhecida (e.g., capaz de produzir uma crise convulsiva) podem ser classificados como
epileptogênicos. Como resultado, as células sobreviventes se reorganizam, anatômica e
INTRODUÇÃO
37
funcionalmente, gerando descargas anormais, sincronizadas e reincidentes que levam a crises
focais ou generalizadas. (Lothman, Bertram e Stringer, 1991).
Uma das dificuldades de compreender as causas que levam ao surgimento da epilepsia é
que os sintomas podem aparecer em qualquer momento do rearranjo neuronal após o insulto
inicial. Podem levar meses ou anos de um trauma ou evento que desencadeiam os processos
como inflamação, neurogênese, morte celular e gliose, e culminam em um grau de atividade
neuronal patológico (Mathern et al. 1995; Lukasiuk et al. 2003; Duffy et al. 2012; Choy et al.
2014).
As epilepsias são comumente compreendidas como um desbalanço entre a inibição e
excitação da atividade neuronal levando a uma hipersincronização de populações de uma
região, mas não se conhece os motivos e o mecanismo que levam à sobreposição da rede
excitatória sobre a inibitória. Ainda é necessário compreender melhor as circunstâncias de
reorganização desse circuito, que é crucial para direcionar as pesquisas sobre epilepsia
(Buckmaster e Dudek 1997; Kelley et al. 2009).
Observando em um nível molecular é possível que os mecanismos envolvidos na
epileptogênese incluem processos inflamatórios e neurodegenerativos, além de mudanças na
sinalização celular. Tanto o estágio de desenvolvimento celular como a consequente
susceptibilidade elétrica podem ter um papel importante em como as células se integram e
como mantém o circuito em homeostase. Essas características podem influenciar as
subsequentes expressões convulsivas. E mesmo no circuito na fase crônica, que já se estabilizou
após o insulto inicial, é difícil reconhecer que elementos influenciam no aumento da
excitabilidade que podem levar às crises, quais são mecanismos compensatórios para restaurar
a homeostase, e quais são somente epifenômenos.
Em modelos animais, a indução química de status epilepticus (SE) promove uma série de
mudanças no microambiente do GD. Essas alterações afetam diretamente a neurogênese e são
candidatas a serem mecanismos epileptogênicos. A esclerose hipocampal, ou morte seletiva de
neurônios piramidais em CA1 e CA3 é uma das características mais comuns encontradas em
pacientes com TLE e melhor replicada em modelos animais. A perda dessas populações gera
INTRODUÇÃO
38
uma demanda de reconformação sináptica no hipocampo e pode ser uma das fontes de
conexões aberrantes (Thom, 2014). A morte de interneurônios gabaérgicos pode levar a perda
de inibição das células granulares e estar diretamente responsável pelo aumento da
excitabilidade do GD, e influenciar o destino dos progenitores (Ratzliff et al., 2002; Sloviter et
al., 2003).
O surgimento de novos astrócitos (astrogliose) pode estar ligado a epileptogênese devido
a múltiplos mecanismos. Astrócitos estão envolvidos na transmissão sináptica e liberação de
glutamato (Clasadonte et al., 2013) resultando em excitabilidade alterada e sincronização
neuronal, além da perda da homeostase de adenosina que tem um papel inibitório e
propriedade anticonvulsionante (Boison, 2016). Processos inflamatórios deflagram respostas
dos astrócitos que se ativam transformando sua morfologia aumentando a sua área, que
parece estar relacionado com a indução da formação de dendritos basais (Foresti et al., 2009) e
liberam proteínas inflamatórias que podem aumentar a excitabilidade e favorecer a
epileptogênese (Maroso et al., 2010).
Nas células granulares do GD também são encontradas alterações morfológicas e
funcionais. Os axônios das fibras musgosas que realizaram novos contatos, brotamento de
dendritos basais hilares e aparecimento de células ectópicas no hilo e camada molecular
(Parent et al., 1997). Essas células que tipicamente têm dendritos polarizados na parte apical do
corpo celular, apresentam ramificações dendríticas na região basal em direção ao hilo com a
presença de espinhas (Shapiro, Ribak e Jessberger, 2008; Walter et al., 2007) indicando
integração e atividade conectiva. Em conjunto com os dendritos basais, o brotamento anormal
de fibras musgosas é um forte candidato epileptogênico por aumentar o loop de excitação
recorrente (Tauck e Nadler 1985), e por diminuir a inibição indiretamente (Buhl, Otis e Mody
1996).
As células ectópicas são capazes de sobreviver e integrar no circuito hipocampal apesar
de estarem fora do nicho natural (Scharfman, Goodman e McCloskey, 2007). O padrão
eletrofisiológico dessas células é similar ao das células granulares normais, entretanto, elas
podem ser fontes de super-conexão que desencadeiam disparos em salva em sincronia com
INTRODUÇÃO
39
neurônios piramidais de CA3 indicando que podem estar envolvidas na geração de crises
(Cameron, Zhan e Nadler, 2011; Scharfman e Pierce, 2012). O motivo e os mecanimos que
levam essas células à migrarem anormalmente ainda não são conhecidos.
É mais provável que uma combinação de vários mecanismos seja responsável pela
instalação da condição epiléptica; entretanto ainda é preciso definir precisamente o impacto de
cada um, o que é um processo desafiador e longo.
Modelos animais de ELT
Como existem limitações para estudar a patologia em humanos, foi necessário o
desenvolvimento de modelos animais que permitissem o acesso à fisiopatologia mais detalhada
da epilepsia. Os modelos atuais buscam reproduzir características semelhantes à doença e
causar uma injúria restrita, menor variabilidade possível, e crises espontâneas que se
desenvolvam em um local observável conhecido e possam ser monitorados após a injúria.
Foram então gerados modelos animais que buscam assemelhar determinadas
características dos tipos de epilepsia. Os modelos mais conhecidos e utilizados são a injeção de
toxinas convulsivantes como ácido caínico (AC) e pilocarpina (Sperk, 1994; Turski et al., 1983), a
indução de um trauma no córtex cerebral (Pitkanen e McIntosh 2006), ou a indução de crises
febris em roedores infantis (Toth et al., 1998).
Mas apesar de evidências de envolvimento do hipocampo como foco primário da ELT
(Spencer, 2002), não existe um modelo animal que abranja todos os padrões encontrados na
doença em humanos. Uma característica que é compartilhada entre os modelos é buscar
induzir uma crise inicial sustentada e prolongada chamada de status epilepticus (SE). Essa crise
prolongada leva à injúria inicial, seguida de um período latente de dias ou semanas no qual
ocorre a cadeia de eventos e modificações estruturais que levam às crises espontâneas e
recorrentes. Esses modelos recapitulam muitas características da fisiopatologia em humanos
(Buckmaster, 2004; Norwood et al., 2010). No presente trabalho utilizaremos os modelos de
injeção intrahipocampal do ácido caínico e da pilocarpina, com o objetivo de reduzir a área
afetada pelo dano neuronal e alta taxa de mortalidade ocasionada pelos modelos sistêmicos.
INTRODUÇÃO
40
No modelo de injeção da pilocarpina, o principal mecanismo de ação é através dos
receptores muscarínicos do subtipo M1, que são metabotrópicos. Além dessa via, ocorre
ativação secundária do sistema glutamatérgico por meio dos receptores NMDA (Freitas et al.,
2006). Essa ativação leva a excitotoxicidade no hipocampo e consequentemente à morte celular
em CA1 e CA3 (Furtado et al., 2011; Lasoń et al., 1997) e interneurônios hilares (Furtado et al.,
2011), além da ativação de mecanismos de reorganização sináptica, neurogênese e mudanças
nas propriedades eletrofisiológicas neuronais e em circuitos inibitórios (Freitas et al., 2006).
Todas essas alterações são compatíveis com a esclerose mesial hipocampal, encontrada em
pacientes com epilepsia.
O AC é análogo ao ácido glutâmico isolado da alga Digenea simplex. Tem afinidade com
os receptores ionotrópicos de glutamato e é um agente citotóxico que causa excitação
exacerbada nos neurônios do sistema nervoso central. A ação do AC leva à despolarização
repetitiva e disparo contínuo dos neurônios, eventualmente levando à morte celular. A
toxicidade é decorrente da disfunção mitocondrial e produção de espécies de oxigênio reativo
que levam a apoptose celular. Entretanto, sua ação parece ser limitada à população local,
poupando os terminais que projetam de longas distâncias para o local da injeção, assim como
as fibras de passagem. No local da injeção ocorre gliose pronunciada e respostas inflamatórias
tipicamente encontradas em doenças neurodegenarativas (Sperk et al., 1983). Alguns grupos de
células são mais vulneráveis ao AC e essa relação parece ser decorrente da distribuição e
presença de receptors AMPA/Cainato no cérebro (Wang et al., 2005).
Neurogênese e epilepsia
A partir da relação da neurogênese com as crises epilépticas, surgiu um grande interesse
do ponto de vista clínico, como por exemplo, se os novos neurônios seriam capazes de reverter
o efeito da perda neuronal devido à morte celular ocasionada pelas crises através de novas
conexões, ou se eles estariam envolvidos com o estabelecimento das crises recorrentes por
formação de conexões aberrantes, e sua interrupção impediria a progressão da doença.
INTRODUÇÃO
41
Entretanto esse entendimento é bem mais complicado do que pode parecer inicialmente
(Scharfman 2004; Shapiro e Ribak 2005).
Os estudos são inconclusivos quanto a essa questão. Por um lado é sugerido que a
alteração na taxa da neurogênese pode ser indiferente para a instalação da epilepsia. Usando
radiação para inibir divisão celular após a indução do SE no modelo da pilocarpina em ratos,
Parent e colaboradores (1999), não observaram necessariamente uma interrupção do
desenvolvimento das crises. Já outras evidências mostram que através da infusão no inibidor
mitótico arabinoside-C, também no modelo de pilocarpina em ratos, a menor quantidade de
novos neurônios estava associada a redução da frequência de crises (Jung et al. 2004). Por
outro lado, irradiação focal no GD ou morte celular de progenitores por indução genética no
modelo de injeção intrahipocampal do ácido caínico em camundongos, apresentou um SE mais
forte e maior número de crises espontâneas (Iyengar et al., 2015).
As alterações sobre as células granulares no giro denteado também são extensivamente
estudadas devido à sua variedade. A taxa de neurogênese é significativamente aumentada, e os
neurônios recém-gerados podem migrar de forma atípica e desenvolverem conexões
aberrantes (Bengzon et al., 1997). Ocorre um aumento substancial na ativação e proliferação de
progenitores neuronais (Jessberger et al., 2005; Parent et al., 1997) e aumento da quantidade
de células que expressam DCX (tipo 2b e 3) (Hüttmann et al., 2003). A proliferação retorna aos
níveis basais em aproximadamente 3 ou 4 semanas mas, na fase crônica, ocorre uma redução
da neurogênese, possivelmente devido a um esgotamento da população de progenitores ou
alterações no microambiente neurogênico (Kralic, Ledergerber e Fritschy, 2005).
A susceptibilidade dos novos neurônios à alterações morfológicas foi abordada em alguns
trabalhos. Por serem mais excitáveis que as células vizinhas maduras, a possibilidade de que
estejam mais envolvidas no desenvolvimento de características aberrantes foi observada em
camundongos no modelo de injeção intraperitoneal de pilocarpina, e 50% das células imaturas
no período de indução apresentaram dendritos basais em contraste com os 9% de células
maduras, e células geradas após o insulto apresentaram dendritos basais e migração aberrante.
(Walter et al., 2007). Dentro do grupo de células recém geradas, foram observadas
características heterogêneas com grupos de células mostrando redução do número de espinhas
INTRODUÇÃO
42
dendríticas e outros com aumento do número de espinhas, além de dendritos basais e corpo
celular aumentado. (Murphy et al., 2011). Em ratos, utilizando o mesmo modelo, resultados
foram semelhantes. Foi mostrado que células geradas antes não apresentaram ectopia, mas
apresentaram dendritos basais e brotamento de fibras musgosas, células geradas após o insulto
apresentam ectopia, dendritos basais e fibras musgosas aberrantes (Kron, Zhang e Parent,
2010). No modelo de injeção intrahipocampal do ácido caínico em camundongos as células
foram encontradas dendritos basais com características diferentes dos modelos anteriores,
com complexos “tufos” de dendritos curtos e com espinhas, além de aparência invertida sem
dendritos apicais (Murphy et al., 2012).
Esses resultados indicam que células em desenvolvimento no GD apresentam
vulnerabilidade dependente do estágio que se encontram, e que participam do processo
epileptogênico de forma complexa, e também conflitante entre diferentes modelos e espécies.
Na maioria dos casos não se compreende ainda se as mudanças na neurogênese são respostas
adaptativas às várias condições ou se contribuem para que a condição se acentue, e se são
efeitos diretos ou indiretos.
No presente trabalho, nós utilizamos os dois modelos animais de epilepsia apresentados
para avaliar as alterações na linhagem celular das CTNs do hipocampo adulto, assim como as
alterações em neurônios gerados antes ou após o insulto epileptogênico.
INTRODUÇÃO
43
Objetivos
Investigar os efeitos de duas drogas indutoras de epilepsia sobre a linhagem neuronal do
hipocampo adulto de camundongos
Objetivos específicos
- Descrever os estágios da linhagem celular no hipocampo adulto a partir de células
progenitoras intermediárias expressando o gene da proteína DCX;
- Avaliar o efeito do ácido caínico e da pilocarpina sobre a progressão da linhagem celular
no hipocampo adulto;
- Descrever as alterações morfológicas de neurônios granulares e hilares do giro
denteado gerados antes e após a indução do estado de mal epiléptico nos dois modelos
farmacológicos;
- Identificar possíveis mecanismos envolvidos na geração de alterações observadas nos
modelos animais de epilepsia.
INTRODUÇÃO
44
Resultados
Os principais resultados da tese de doutorado serão apresentados na forma de dois
artigos científicos que estão em fase final de preparação.
O primeiro, desenvolveu-se a partir de um achado inesperado que obtivemos ao analisar
a progênie de células DCX+ em animais tratados com ácido caínico. Encontramos que muitas
células se diferenciavam em astrócitos, o que não seria esperado para progenitores DCX+,
considerados comprometidos com a geração de neurônios. Ao aprofundar as análises,
encontramos evidências de que a progressão de linhagem celular a partir de células-tronco no
hipocampo não é linear e irreversível. Além disso, dados iniciais sugerem que o controle da
progressão de linhagem é mediado por atividade elétrica da rede e sinalização gabaérgica de
neurônios PV+.
O segundo artigo versa sobre as alterações sofridas por neurônios gerados antes ou após
a injeção dos agentes epileptogênicos ácido caínico ou pilocarpina. Nossos resultados revelam
que tanto neurônios gerados previamente como após o tratamento com ácido caínico podem
apresentar alterações morfológicas, mas os neurônios gerados após o SE parecem ser mais
suscetíveis a estas alterações. Além disso, a ocorrência de dispersão das células granulares e a
taxa de ectopias neuronais é diferente entre os lados ipsi e contralateral da injeção de kainato,
enquanto ambas alterações são residuais no modelo de pilocarpina. Em conjunto, nossos
resultados indicam que os dois modelos animais de epilepsia estudados são bastante distintos
em termos de alterações celulares hipocampais.
45
Capítulo 2
Cell lineage progression in the adult hippocampus revisited:
evidence of progenitor transdifferentiation
CAPÍTULO 2
46
Abstract
Cell lineage in the adult hippocampus comprises multipotent and neuron-determined
progenitors. In the present work, we fate-mapped neuron-determined progenitors using Dcx-
CreERT2 and CAG-CAT-EGFP double-transgenic mice (cDCX/EGFP). We show that three days
after tamoxifen-mediated recombination in cDCX/EGFP adult mice, virtually all GFP+ cells in the
dentate gyrus co-expresses DCX. However, within 30 days, about 15% of GFP+ cells become
GFAP+ astrocytes. Administration of epileptogenic drugs kainic acid (KA) or pilocarpine led to a
significant increase in the number of GFP+ cells in both ipsi and contralateral dentate gyrus.
However, while pilocarpine injection boosted neurogenesis in both ipsi- and contralateral sides,
KA stimulated neurogenesis only in the contralateral side. In the ipsilateral side, KA injection led
to an unexpected increase of astrogliogenesis in the Dcx-lineage. Intriguingly, we also observed
a small number of GFP+ cells displaying radial-glia morphology, a hallmark of multipotent
progenitors. Altogether, our data indicate that cell lineage in the adult hippocampus is not
unidirectional and can be modulated by environmental signals.
Keywords
Adult hippocampus; neurogenesis; astrogliogenesis; epilepsy; fate-specification; kainic
acid; pilocarpine; GABAergic interneurons
CAPÍTULO 2
47
Introduction
Generation and functional integration of new neurons occurs at discrete sites of the adult
central nervous system (for review see Pierre-Marie Lledo 2006). In the adult rodent
hippocampus, new granule cells (GCs) are constantly added to the dentate gyrus (DG)
throughout life (Praag, van et al., 1999), though at significantly lower levels in aging brains
(Encinas et al., 2011). Adult hippocampal neurogenesis contributes to learning and memory (for
review see Aimone et al. 2014), due to the unique responses of immature GCs to activity
patterns entering the DG (Marín-Burgin et al., 2012). It also provides a powerful model to study
the integration of newly generated neurons into host circuits (Sailor, Schinder e Lledo, 2017).
Generation of new GCs in the adult hippocampus follows a stereotyped cell-lineage
progression, with multipotent radial-glia like cells (RGCs, Type 1) progenitors generating glia-
like non-radial (Type 2a), which in turn generate neuronal-committed progenitors (Type 2b and
3), directly responsible for the generation of post mitotic neurons (Steiner et al., 2006). RGCs
can transit from a quiescent to an activated state, controlled by environmental signals (Dumitru
et al., 2017; Song, M. Christian, et al., 2012) and retain the ability to generate astrocytes
(Bonaguidi et al., 2011; Encinas et al., 2011). However, it is largely believed that RGCs either
follows an astroglial-lineage generating new RGCs and post mitotic astrocytes or follows a
neuronal-lineage, comprising Type 2b and 3 progenitors, which terminates with the generation
of new granule neurons (Bonaguidi et al., 2011; Dumitru et al., 2017; Encinas et al., 2011; Suh
et al., 2007).
Network activity affects cell proliferation and differentiation in the adult DGs and can be
modulated by exposure to enriched environments (EE), running wheels, learning paradigms,
stress and pathological conditions, such as epilepsy (Aimone et al., 2014). These modulations in
cell lineage progression are likely mediated through different gamma-aminobutyric acid (GABA)
levels in the DG acting on the gamma2 subunit of the GABA type A receptor expressed in RGCs
(Song, M. Christian, et al., 2012). GABA activity promotes neuronal differentiation and stem cell
quiescence, whereas reduced GABA activity favors RGCs self-renewal and differentiation to
astrocytes (Dumitru et al., 2017; Song, M. Christian, et al., 2012). Interestingly, the effect of
GABA in RGCs is likely due to diffusion from nearby synapses (Song, M. Christian, et al., 2012).
CAPÍTULO 2
48
However, activation of hilar interneurons elicits a GABAA receptor-sensitive response in type 2
progenitors, causing depolarization and opening of voltage-dependent calcium channels
(Tozuka et al., 2005). Calcium influx promotes NeuroD expression and leads to neuronal
differentiation (Deisseroth et al., 2004).
Intrahippocampal injection of kainic acid (KA) in rodents is used to model mesial
temporal lobe epilepsy (TLE) and is associated with a transient increase in cell proliferation,
depletion of RGCs and astrogliogenesis in the DGs (Sierra et al., 2015). Fate mapping of Nestin-
expressing cells shows that KA-induced seizures leads to activation of RGCs and their
conversion into reactive astrocytes, which exhausts adult hippocampal neurogenesis in the
long-term (Sierra et al., 2015). However, Nestin is also expressed in Type 2 progenitors and
there is the possibility that KA could be inducing a lineage shift in these cells.
To address this possibility, we used a DCX-CreERT2 transgenic mouse line to fate map
cells in the lineage of DCX-expressing cells. We show that DCX-expressing cells contribute a
small proportion of astrocytes in the DG even in physiological conditions. Increased network
activity induced by KA or pilocarpine has different effects on DCX-progenitors. While KA shifts
the lineage towards an astrogliogenic fate within the injection side, pilocarpine enhances
neurogenesis. Increased neuronal activity in the DG contralateral to the injection site of both
pilocarpine and KA leads to augmented neurogenesis. Preliminary results indicate that these
different effects of increased network activity might be modulated by differential GABAergic
signaling.
Results
Dcx-lineage in the adult hippocampus encompasses astrocytes
Cell lineage in the adult hippocampus comprises multipotent (Type 1 and 2a) progenitors
and neuron-determined (Type 2b and 3) progenitors (Steiner et al., 2004). To label and follow
the latter, we generated double-transgenic mice crossing Dcx-CreERT2 (Zhang et al., 2010) and
CAG-CAT-EGFP mice (Nakamura, Colbert e Robbins, 2006), hereafter referred to as cDCX/EGFP.
Animals received tamoxifen and were killed 3, 7 or 30 days after (Figure 2.1). We observed that
CAPÍTULO 2
49
recombination is restricted to small and round DCX-expressing cells in the subgranular zone at
day 3, suggesting that tamoxifen-mediated Cre-recombination is occurring exclusively in
Type2b/3 progenitors (Figure 2.1A). After 7 days, most GFP+ cells display immature granule
neuron Type2b/3 progenitors morphologies and expressed DCX, whereas a small fraction of
GFP+ maintained Type2b/3 cell morphologies (B). Interestingly, after 30 days we observed that
about 11% of GFP+ cells were GFAP+ astrocytes (Figure 2.1C), 15% of GFP+ cells still expressed
DCX and the vast majority of the remaining recombined cells displayed typical morphology of
mature granule neurons and expressed NeuN, as previously described (Jagasia et al., 2009). A
small number of GFP+ cells showed morphologies reminiscent of intermediate progenitors, but
did not express DCX, suggesting that these cells could be Type2a progenitors. Altogether, these
data indicate that DCX-expressing Type2b/3 progenitors retain the ability to generate
astrocytes and regress to a more primitive stage in the lineage (Type 2a).
CAPÍTULO 2
50
Figure 2.1
Tamoxifen-mediated recombination in naïve cDCX/EFGP animals. (A-C) Coronal sections of the
hippocampus of cDCX/EGFP animals immunolabeled for GFP (green) and DCX (red) after tamoxifen
treatment. Nuclei are stained with DAPI (blue). Observe that GFP expression (arrowheads) is restricted
to small DCX+ cells in the SGZ 3 days after tamoxifen injection (A). A second population of GFP+/DCX+
cells (arrowheads) showing morphologies of immature neurons is noticed 7 days after tamoxifen
administration (B). After 30 days cells present mature granule cell morphology (arrows), express
neuronal marker NeuN (inset) and do not label to DCX protein (C). (D) Graphic showing the
quantification of GFP cells expressing makers of different cell populations within the subgranular zone
and granule cell layer (n=3 animals per timepoint). (E) After 30 days GFP+/GFAP+ cells (arrow) could be
observed in the SGZ. Scale bar: 20um.
To further confirm that newly generated astrocytes were derived from DCX-expressing
Type 2b/3 progenitors, we treated cDCX/EGFP adult animals with tamoxifen followed by 3 days
continuous administration of BrdU (Figure 2.2). A subset of animals was killed immediately after
BrdU administration (3 days after tamoxifen) and the remaining animals were allowed to
survive for additional 27 days (30 days after tamoxifen). We found that the vast majority of
GFP+/BrdU+ cells in the dentate gyrus at 3 days co-expressed DCX. We failed to observe any
GFP+/BrdU+/GFAP+ cell, ruling out a possible inespecific expression of the dcx promoter in
proliferative astrocytes. Even considering the total population of BrdU+ cells, independent of
GFP expression, only 4% of cells co-expressed GFAP, what is in accordance with the low number
of type 1 cells and the long cell cycle of these cells (Encinas et al., 2011). Notably, however, 30
days after dcx-mediated recombination, about 12% of GFP+/BrdU+ cells were GFAP+, whereas
most remaining GFP+/BrdU+ cells differentiated into mature granule neurons and expressed
NeuN (Figure 2.2).
CAPÍTULO 2
51
Figure 2.2
Kainic acid injection enhances astrogliogenesis from previously recombined DCX-cells. (A) Timeline
representing experimental procedures. TAM - Tamoxifen treatment; SE - Status epilepticus induction
with intrahippocampal injection of kainic acid. (B) Coronal section of the contralateral dentate gyrus
cells 3 days after SE showing that most GFP+ cells are immature neurons (arrows), but GFP+/BrdU+ cells
with astrocytic morpphology (arrowhead) are also present. (C) Coronal section of the ipsilateral
hippocampus 30 days after SE showing GFP+/BrdU+ cells with reactive glia morphology and expressing
GFAP. Scale bar: 20um. (D) Quantification of recombined cells that incorporated BrdU and expressed
GFAP at days 3 and 30. Observe that GFP+/GFAP+/BrdU+ cells are absent in the control group and
contralateral side of KA-injected animals after 3 days, but are observed after 30 days. (n=3 animals per
treatment and timepoint).
CAPÍTULO 2
52
Kainic acid enhances astrogliogenesis in the DCX-lineage
Intrahippocampal injection of kainic acid (KA) in adult mice induces Status epilepticus (SE)
and increases astrogliogenesis from Nestin-expressing progenitors (Sierra et al., 2015). To
evaluate whether DCX-expressing progenitors could also contribute to astrogliogenesis in this
model, we performed intrahippocampal injection of KA in 2 months-old cDCX/EGFP animals
(Figure S 1) and tamoxifen was administered one week later to induce Cre-mediated
recombination (Figure 2.3). As previously described (Kralic, Ledergerber e Fritschy, 2005), we
observed an increased number of newly generated cells in both ipsi and contralateral sides
(Figure S 2) and accentuated granule cell dispersion in the KA-ipsilateral side (Figure 2.3C and
Figure S 1). We also found that, similar to the Nestin-lineage (Sierra et al., 2015), the vast
majority of DCX-derived GFP+ cells in the DCX-lineage within the ipsilateral injection side
displayed astrocyte morphology and expressed GFAP (Figure 2.3C, E and G), with a very small
fraction of cells differentiating into neurons (Figure 2.3F). Interestingly, despite the fact that
increased electrical activity could also be recorded in the contralateral injection side, we found
that the vast majority of GFP+ cells in this side display typical granule neuron morphology
(Figure 2.3B) and expressed CTIP2 (Figure 2.3D), similar to saline-injected control animals
(Figure 2.3F). These data suggest that KA injection could reprogram DCX-expressing progenitors
to generate astrocytes either directly, or indirectly through a regression in the lineage to a
multipotent state.
CAPÍTULO 2
53
Figure 2.3
Kainic acid injection induced the generation of reactive astrocytes from DCX-expressing cells. (A)
Timeline presenting experimental protocol from group receiving two TAM injections 7 days after SE.
CAPÍTULO 2
54
Animals were perfused 35 days later. (B) Mosaic composition from contralateral hippocampus showing
GFP+ granule cells with typical morphology, although some ectopic cells are observed. (C) Ipsilateral DG
shows severe GCD and most GFP+ cells display morphologies of reactive astrocytes. (D) Confocal image
of contralateral DG showing the expression of CTIP2 in GFP+ granule cells (arrows). (E) Confocal image of
ipsilateral DG showing the expression of GFAP in GFP+ cells. (F,G) Quantification of GFP+ cells
differentiating into granule neurons (F) or astrocytes (G) in the contralateral and ipsilateral sides of KA-
injected animals. ML - Molecular layer; GCL - Granular Cell layer.(n control = 3; n kainate = 5; Statistics:
(G) ANOVA F(15,1)= 149.74; p< 0.001; (H) ANOVA F(15,1)= 89.41; p< 0.001) Each value represents the
mean ± SEM. 50um (B-C) and 20um (D-E).
To rule out the possibility that KA injection could induce ectopic DCX expression in
astrocytes, we injected KA in the striatum of cDCX/EGFP adult mice, followed by a single TAM
injection 7 days later, and analyzed the expression of GFP in reactive astrocytes after 35 days. In
contrast to the hippocampus, no GFP+/GFAP+ cells were observed in the striatum (Figure S 4),
supporting the notion that KA does not activate the dcx promoter in astrocytes of cDCX/EGFP
double-transgenic animals.
Next, to unambiguously exclude possible influences of KA on the activity of the dcx
promoter, we recombined DCX-expressing cells before SE induction. To that, cDCX/EGFP mice
received tamoxifen 1 day before intrahippocampal injection of KA or saline (Figure 2.2). Animals
also received BrdU for three consecutive days and were killed immediately after this period or
30 days after KA. Consistent with our data in naïve animals, we observed that all GFP+/BrdU+
cell in the SGZ co-expressed DCX 4 days after tamoxifen-mediated recombination and 3 days
after saline injection (data not shown). The same pattern was observed in the contralateral side
of KA-treated animals, although GFP+/BrdU+/DCX+ cells looked more differentiated in these
animals, as compared to controls. Interestingly, however, we observed that a small group of
GFP+/BrdU+ cells expressed GFAP in the ipsilateral side of KA-injected mice only 3 days after
treatment (Figure 2.2C). This fraction of GFP/GFAP/BrdU cells in the KA-ipsilateral side further
increased to about 45% after 30 days (Figure 2.2D). Notably, despite the complete absence of
GFP+/GFAP+/BrdU+ at day 3 in control animals and in the KA-contralateral side, these cells
could be observed at small but consistent frequencies 30 days after recombination (Figure
CAPÍTULO 2
55
2.2D). Altogether, these observations confirm that astrocytes are encompassed within the
lineage of DCX-expressing type 2b/3 cells and that generation of new astrocytes from type 2b/3
cells depends on cell proliferation.
Progenitors within the Dcx-lineage are still active one month after recombination
The interesting observation that DCX-expressing progenitors generate astrocytes after KA
injection prompted the question as to which extent this potential could be observed in
progenitors recombined at earlier time-points before KA injection. To address this question, we
injected tamoxifen in cDCX/EGFP adult mice 35 days before intrahippocampal KA injection
(Figure 2.4A). Fifteen days after KA treatment, we observed a significant increase in the
proportion of astrocytes among GFP+ cells in the KA-ipsilateral side as compared to the
contralateral-KA side and controls (Figure 2.4C, D and F). Yet, and consistent with our previous
findings, a small population of GFP+/GFAP+ cells could be observed in controls and in the
contralateral-KA side. These observations suggest that DCX-expressing progenitors recombined
5 weeks before KA injection retain their ability to proliferate and generate astrocytes. In fact,
when the same experiment was performed with the additional treatment of animals with BrdU
for the whole period after KA-injection, we observed that most GFP+ astrocytes in the KA-
ipsilateral side incorporated BrdU (Figure 2.4G), indicating that progenitor cells within the DCX-
lineage are still active 35 days after recombination and retain the potential to generate
astrocytes.
CAPÍTULO 2
56
CAPÍTULO 2
57
Figure 2.4
DCX-cells retain the capacity to proliferate and generate astrocytes after 1 month. (A) Timeline
representing experimental protocol where two tamoxifen injections were administered 35 days before
SE induction with KA. Animals received BRDU during the whole period after KA and were perfused two
weeks later. (B) Image of the contralateral dentate gyrus shows the majority of GFP+ cells with typical
neuronal morphologies. (C) Image of the ipsilateral dentate gyrus shows GCD and many GFP+ cells with
morphologies of reactive astrocytes. (D) Examples of GFP+/GFAP+ astrocytes (arrowheads) and ectopic
neurons (arrows) in the ipsilateral DG. (E-F) Quantification of GFP+ cells differentiating into neurons (E)
and astrocytes (F) in the ipsi and contralateral sides of controls and KA-treated animals. ML - Molecular
layer; GL - Granular Cell layer. Scale bars: 50um (B-C) and 20um (D). .(n control = 4; n kainate = 4;
Statistics: (E) ANOVA F(15,1)= 4.01; p=0.0682; (F) ANOVA F(15,1)= 3.91; p=0.0715)
Dcx-expressing progenitors can reverse to multipotent stages
The generation of astrocytes from Dcx-expressing progenitors (Type 2b and 3) may
suggest that those cells are bipotent or may reverse to a more primitive stage in the lineage
when cells are multipotent (Type 1 or 2a). To directly address this second possibility, we set out
to investigate whether cells within the Dcx-lineage display hallmarks of Type 1 (radial glia-like)
and Type 2a (glia-like, non-radial) progenitors. We first observed that a small but consistent
population of GFP+/DCX- cells in the SGZ of naïve animals recombined 30 days earlier (Figure
2.5A). Considering that virtually all GFP+ cells in the SGZ 3 and 7 days after recombination are
DCX+, the most parsimonious explanation is that some of these type regress a to type 2a (DCX-)
stage. Even more intriguing, we found a significant fraction of RGC-like GFP+ cells in animals
treated with KA (Figure 2.5B and C), indicating that type 2b DCX-expressing progenitors could
revert to a multipotent, Type 1 stage. Altogether, these observations suggest that type2b/DCX+
cells are not fully committed to further differentiate into neurons, but may rather return to
more primitive stages in the lineage and resume multipotency.
CAPÍTULO 2
58
Figure 2.5
DCX+ type 2b cells regress to earlier stages in the progenitor cell lineage. (A) Example of GFP+/DCX- cell
(type 2a) in the SGZ of naïve cDCX/EGFP animals 30 days after recombination. (B-C) Examples of RGC-
like cells in the DG of cDCX/EGFP that received tamoxifen 1 day before KA injection. Note the typical
radial morphology and expression of GFAP (arrowheads in B and C), hallmarks of type 1 progenitors.
Note also the presence of non-radial GFP+/GFAP- cells 3 days after KA injection. Scale bars: 20um
CAPÍTULO 2
59
Increased electrical activity is not sufficient to induce astrogliogenesis from Dcx-
expressing progenitors
The previous observations that GCD and cell-fate switch is restricted to the KA-injection
side, suggest that altered electrical activity per se is not sufficient to cause these changes. To
confirm this hypothesis, we took advantage of another epilepsy model using the muscarinic
agonist pilocarpine (Lima et al., 2016). Similar to KA, intrahippocampal injection of pilocarpine
induces SE and lead to increased cell proliferation (data not shown). However, in contrast to
our previous observations using KA, neither GCD nor switch in the fate of GFP+ cells was
observed in pilocarpine-injected animals (Figure 2.6). Actually, we observed a slight increase in
the proportion of neurons within the DCX-lineage as compared to controls, albeit below
statistical significance (Figure 2.6B and C). Thus, increased network activity alone is not
sufficient to re-route DCX-expressing progenitors towards the generation of astrocytes.
CAPÍTULO 2
60
Figure 2.6
Pilocarpine injection does not induce generation of reactive astrocytes. (A) Timeline of the experiment.
Two tamoxifen injections were administered 7 days after SE. Animals were perfused five weeks later. (B)
Mosaic composition image of the ipsilateral DG showing GFP+ with typical granule cell morphology. (C-
D) Quantification of GFP+ cells differentiating into neurons (C) and astrocytes (D) in the ipsilateral or
contralateral side of pilocarpine-injected hippocampi. (n control = 3; n pilocarpine= 3)
CAPÍTULO 2
61
Loss of parvalbumin-expressing interneurons correlates with increased astrogliogenesis
GABA activity mediated by parvalbumin (PV)+ interneurons promotes stem cell
quiescence and neuronal differentiation in the adult hippocampus (Dumitru et al., 2017; Song,
M. Christian, et al., 2012). We hypothesized that altered GABA signaling from PV+ interneurons
to progenitor cells could explain the divergent effects on cell lineage progression in the dentate
gyrus of mice treated with KA or pilocarpine. To test this possibility, we analyzed the
hippocampus of adult mice 3 days after saline, KA or pilocarpine injection (Figure 2.7).
According to previous data in the literature (Song, Zhong, et al., 2012), we observed a complex
parvalbuminergic plexus within the subgranular zone, originating from PV+ cells in the hilus
(Figure 2.7A). Interestingly, the number of PV+ cells in the ipsilateral hippocampus of KA-
injected animals was dramatically reduced, whereas the number of PV+ cell in the contralateral
KA-side and in both hippocampi of pilocarpine-injected animals was similar to controls (Figure
2.7B). Together, these data indicate that enhanced astrogliogenesis is accompanied by overall
reduction in the number of PV+ interneurons in the dentate gyrus.
CAPÍTULO 2
62
Figure 2.7
Parvalbuminergic plexus degenerate in the ipsilateral side of KA injection. (A) Coronal sections of the
hippocampus 3 days post injection (dpi) of pilocarpine. Note the presence of PV+ interneurons and the
complex parvalbuminergic plexus in the subgranular zone (SGZ). (B) Quantification of average PV+
interneurons per section in the dentate gyrus 3 days after injection of saline, KA or pilocarpine (n
control= 3; n KA= 3; n Pilo= 3).
CAPÍTULO 2
63
Discussion
A comprehensive knowledge about the intermediate steps enacted in the transition from
an adult neural stem cell to neuronal state is critical to understand how neurons can be
generated in the adult central nervous system. Here, we provide evidence that neurogenic cell
lineage progression in the adult hippocampus is not a one-way process towards granule cell
differentiation. Rather, intermediate progenitors retain the potential to regress to more
primitive stages and regain astrogliogenic potential. Increased electrical activity induced by KA
injection affects cell lineage progression in opposite directions depending on the concurring
GABAergic activity. While increased electrical activity in the ipsilateral side, where GABAergic
PV+ interneurons degenerate, leads to an increase in astrogliogenesis, in the contralateral side,
where hilar GABAergic PV+ interneurons are preserved, augmented electrical activity further
enhances neurogenesis. Altogether, our data indicate that intermediate progenitors are
responsive to environmental signals controlling adult neurogenesis in the hippocampus. We
suggest that these cells function as sensors of network activity and, therefore, are a checkpoint
for lineage progression in the adult hippocampus (Figure 2.8).
Lineage progression in the adult hippocampus has been extensively studied in the last
two decades using viral-mediated and cre-lox fate mapping (Aimone et al., 2014 and references
therein). These studies have shown that RGCs (Type 1 cells) express GFAP, BLBP, NESTIN, SOX2
and MASH1, are slow-dividing cells and can also be found in a quiescent state (Song, Zhong, et
al., 2012). RGCs function as the founders of the neuronal lineage, generating intermediate
progenitors (Type 2 cells), which in turn generate Type 3 cells, constrained to a future neuronal
fate and expressing TBR2, DCX and NEUROD1 (Bonaguidi et al., 2011; Suh et al., 2007). Some
authors also divide type 2 cells into two subtypes - 2a and 2b, where type 2a cells still express
several markers of RGCs (BLBP, SOX2, NESTIN) but do not show radial morphologies (Steiner et
al., 2006). In contrast, type 2b express a similar set of proteins to type 3 cells and are
considered neuronal-committed progenitors. According to this expression pattern, we show
that virtually all recombined GFP+ cells express DCX 3 days after tamoxifen administration in
the cDCX/EGFP mice. These observations are also in accordance to previous data in the
CAPÍTULO 2
64
literature using cDCX mice (Zhang et al., 2010) and indicate that recombination is restricted to
type 2a/3 cells and early neuroblasts.
Interestingly, however, about 11% of cells generated from DCX-expressing cells become
astrocytes after 1 month, indicating that Type2a/b progenitors are either bi-potent or could
regress to a more primitive stage in the lineage (Type 1/2a), when astrogliogenic potential is
recognized (Bonaguidi et al., 2011; Encinas et al., 2011). According to this latter possibility, we
show that a few GFP+ cells in the SGZ maintain morphologies similar to intermediate
progenitors and lack the expression of DCX or GFAP 30 days after recombination. These cells
are likely type2a cells derived from earlier recombined DCX-expressing type2b cells. Thus, our
fate mapping experiments indicate that at least some type2b/3 cells do not follow a neurogenic
fate, but rather return to stages in the lineage retaining astrogliogenic potential (Figure 2.8A).
Neuronal activity in the hippocampus modulates progenitor cell proliferation, neuronal
differentiation and survival of newly generated granule cells (Aimone et al., 2014). We took
advantage of two different models of mesial temporal lobe epilepsy (TLE) to study how network
activity could affect the cell lineage progression of DCX-expressing cells. Unilateral
intrahippocampal injections of KA or pilocarpine elicit status epilepticus and spontaneous
seizures in adult mice (Sperk et al., 1983; Turski et al., 1983). However, we show that these two
drugs have very different effects on DCX-expressing cell lineage progression.
CAPÍTULO 2
65
CAPÍTULO 2
66
Figure 2.8
Cell lineage progression model in the adult hippocampus. (A) Grey arrows indicate previously described
transitions during cell lineage progression from RGC to neurons and from RGC to astrocytes in the adult
hippocampus. Red arrows indicate the novel transitions described in our work. (B) Enhanced electrical activity
accompanied by loss of GABAergic interneurons inhibits the progression of intermediate progenitors towards
neurogenesis and stimulate proliferation, generation of RGCs and astrogliogenesis. (C) Enhanced electrical activity
and sustained GABAergic activity stimulate proliferation of intermediate progenitors and neuronal
differentiation/survival
While pilocarpine injection boosted neurogenesis in both ipsi and contralateral sides, KA
injection provoked a dramatic shift in the lineage of DCX-cells towards the generation of
astrocytes, especially in the ipsilateral side. Interestingly, despite the fact that neuronal activity
is severely increased in the contralateral side of KA injection, DCX-cells not only normally
progressed to a neuronal fate in this side, but also generate a larger number of neurons. These
observations suggest that increased network activity can modulate DCX-cell lineage in both
directions – neurogenesis or astrogliogenesis, depending on other concomitant signals (see
below). Previous work in the literature fate mapped NESTIN-expressing cells and described a
similar shift in the lineage of adult hippocampal progenitors towards an astroglial fate (Sierra et
al., 2015). We believe that DCX-expressing type2b progenitors fate mapped in our study are
reversing to a NESTIN+ type 2a and even to a type 1/RGC state in KA-injected animals and this
regress in the lineage supports the enhanced astrogliogenesis in the ipsilateral side and
neurogenesis in the contralateral side. According to this interpretation, we observe that many
cells in the DCX-lineage show RGC-like morphologies in KA treated animals 3 days after
injection.
The contradictory effects of increased network activity on DCX-cell lineage progression in
the ipsi and contralateral hippocampi of KA injected animals are likely explained by the
different levels of GABA activity in these regions. While the GABAergic PV+ plexus is mostly
preserved in the contralateral side, the vast majority of GABAergic PV+ neurons degenerate in
the ipsilateral side. GABA activity promotes RGC quiescence and enhances neuronal
differentiation and survival, whereas reduced GABA activity favors progenitor self-renewal and
CAPÍTULO 2
67
astrogliogenesis (Dumitru et al., 2017; Song, Zhong, et al., 2012). Thus, the increased network
activity in the ipsilateral side is accompanied by a decreased GABA activity, leading to an
increase in the astrogliogenesis. In contrast, increased network activity in the contralateral side
is coupled to an enhanced GABA activity, favoring neuronal differentiation and survival. We
suggest that the latter also stimulate the return of DCX-expressing cells to a RGC state, since
these cells are augmented in the contralateral KA-injection side.
The increased neurogenesis observed in pilocarpine-injected animals could also be
explained by the increased GABAergic activity in the dentate gyrus. In fact, GABA signaling is
involved in granule cell survival and differentiation even before NMDA-glutamate pathways are
activated (Jagasia et al., 2009). Yet, we cannot rule out the possibility that pilocarpine
stimulates neurogenesis, at least partially, through the direct activation of muscarinic receptors
Freitas et al., 2007). In fact, depletion of acetylcholine leads to a reduction in neurogenesis
(Cooper-Kuhn, Winkler e Kuhn, 2004; Kaneko, Okano e Sawamoto, 2006), whereas increased
cholinergic neurotransmission induced by galantamine, an acetylcholinesterase inhibitor,
promotes increased neurogenesis (Kita et al., 2014). The latter effect can be partially blocked by
scopolamine and the preferential M1 muscarinic receptor antagonist telenzepine (Kita et al.,
2014), suggesting that progenitor cells in the hippocampus express muscarinic receptors and
are affected by cholinergic activity.
Collectively, our results convey a new view on the lineage progression of adult neural
stem cells, indicating that intermediate progenitors can regress to more primitive states and
switch potential to generate neurons or glial cells. The control of lineage progression is
dependent on neuronal network activity, with GABA playing a key role in the control of
neurogenesis and astrogliogenesis. Last, but not least, our conflicting observations for cell
lineage progression in two different models of MTLE stresses the need of more studies
disentangling the precise mechanisms leading to cellular alterations in the hippocampus of
epilepsy patients.
CAPÍTULO 2
68
Supplementary Material
CAPÍTULO 2
69
Figure S 1
Experimental model for lineage tracing following intrahippocampal kainic acid injection. (A) Mosaic
composition image of the DG in control animal showing the pattern of GFP transgene expression 35 days
after tamoxifen administration. Note the predominance of GFP+ cells with typical granule cell
morphologies. Scale bar: 50um. (B) Schematic representation of the intrahippocampal administration of
kainic acid (50 nL, 20 mM) in the right hippocampus. (C) Electrophysiological recording during the
surgery shows self-sustained Status Epilepticus (SE) in both (ipsi and contra) hippocampi. Hilbert
transformation (red trace) shows the progressive and sustained increase in the LFP power after the
discontinuation of the isoflurane anesthesia (isoflurane OFF) leading to a behavioral seizure (Racine class
V). Administration of diazepam (5 mg/kg, i.p.) attenuates the epileptiform discharges in the contralateral
hippocampus, although they resumed after 2 h. (D) Low power image of a coronal section of the mouse
brain 30 days after KA injection. Observe the severe GCD and CA1 degeneration in the ipsilateral side,
whereas the contralateral side histology is mostly preserved. GCL - Granular Cell layer; CA1 – Cornus
Ammonis.
CAPÍTULO 2
70
Figure S 2
Cell proliferation in KA injected animals (A) Venn diagram showing each animal proliferation rate
through BrdU labeling after KA injection. Each circle represent total number of cells observed for each
marker. Observe that in both control and KA animals, the population of GFP+/BrdU+ cells is extremely
small, suggesting that most GFP+ cells do not divide. Note also that in KA injected animals the number of
BrdU cells raises accompanying the pattern of GFP cells, and intersection area reduces proportionally
when compared to control. (B) Quantification of intersection areas of BrdU and granule cell marker
CAPÍTULO 2
71
Ctip2 in each group. (C) Quantification of intersection areas of GFP and Ctip2 in each group. (B) ANOVA
F(12,1)= 13.07; p< 0.01; (H) ANOVA F(12,1)= 129.85; p< 0.001) Each value represents the mean ± SEM.
Figure S 3
GFP expression in control animals 30 days after tamoxifen administration. (A) Mosaic composition
image of coronal section of contralateral hippocampus in control group. (B) Ipsilateral general view of
DG in control group. Scale bar: 50um. (C) Confirmation of granule cell phenotype with CTiP2 marker in
contralateral side. (D) Confirmation of granule cell phenotype with CTiP2 marker in ipsilateral side. Scale
bar: 20um
CAPÍTULO 2
72
Figure S 4
CAPÍTULO 2
73
Lack of GFP expression in striatal astrocytes following KA injection. (A) Protocol of experiment to label
progenitors after injection of KA in the striatum.(B) Schematic view of the KA injection site in the
striatum (red dot). (C) Representative serial slices showing the absence of GFP+ astrocytes in the
striatum 35 days after tamoxifen. (D’) Confirmation of injection coordinates with DAPI staining (D’’)
Enlarged view of merged image. (D’’’) Random GFP+ cells can be observed in the striatum confirming the
immunohistochemistry. (D’’’) GFAP labeling showing astrocytes close to the injection site.
Methods
EXPERIMENTAL MODEL AND SUBJECT DETAILS
Animals
All experiments performed involving animals were approved by the ethics committee for animals
in the Federal University of Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN) with protocol number 012/2016
conform guidelines from the regional council. For the present study, a total of 36 double-transgenic
mice, with age between 8 - 12 weeks, were randomly assigned to the control or treatment (Status
epilepticus (SE) induced by kainic acid or pilocarpine) group. Mice from the lineage DCX (DCX-CRE-ERT2
- Stem Cell Research, Helmholtz Center Munich) were crossed to mice from the reporter lineage GFP
(CAG-CAT-GFP) to generate double-transgenic DCX-CreERT2::CAG-CAT-GFP. The genotypes of the
mutants were confirmed by PCR analysis of genomic DNA. Animals had a mixed background from
C57BL/6, Swiss and Agouti. Tamoxifen (TAM) treatment of these mice restricts CreERT2 expression to
DCX-expressing progenitors and neuroblasts in the hippocampal subgranular zone and causes random
excision between multiple pairs of lox sites, leading to the expression of the reporter sequence. To
achieve sparse labeling, mice were given two injections of TAM (100ug/g) (Zhang et al., 2010), in
consecutive days. The animals were held under standard laboratory housing conditions with a light/dark
cycle of 12h each and free access to food and water. All efforts were made to minimize animal suffering.
METHOD DETAILS
Intrahippocampal Kainic Acid and Pilocarpine Injections
For unilateral intrahippocampal injections, mice were anesthetized (inhaled anesthesia mixture
containing isoflurane 1.5%; 1L/min) and positioned in the stereotaxic. We injected 50nl of kainic acid
CAPÍTULO 2
74
(20mM in PBS) or vehicle solution (sterile PBS) using a glass micropipette attached to nanoinjector, and
set to a flux of 0.5μL/min. The pipette was positioned into the dentate gyrus of the right dorsal
hippocampus (coordinates AP: 2.1mm; ML: 1.7; DV: 1.6mm) and left still for 5 minutes before removing
to avoid liquid reflux. After KA injection, SE was characterized by clonic movements of the forelimbs,
rotations or immobility. These behaviors were described before in previous studies (Häussler et al.,
2012) and confirmed by us through recording field potential activity in 2 animals. Animals were
monitored behaviorally for seizures and the onset of SE. Following 90 minutes of SE mice were given
injection of diazepam (5mg/kg, i.p.) to alleviate seizure activity. Mice were returned to their cage where
they were provided free access to food and water, and monitored for weight loss and recovering in the
subsequent days. Only animals that had experienced SE after KA injection, and confirmation in
histological observation of granular cell dispersion were kept for further analysis.
A similar protocol was applied for Pilocarpine injection with small adaptations. Before
anesthetizing the animal, methyl-scopolamine was injected (1mg/kg, i.p.) to block peripheral reactions.
Coordinates and method of drug delivery were the same as KA and solution concentration and volume
were 700 µg/µL and 570 nL respectively.
Experimental Protocols
The same protocol of injections was applied for the different experimental groups with small
differences in the order and timing depending on the purpose of the experiment. Each timeline is
graphically presented in the results session. Tamoxifen (TAM, T-5648, Sigma Aldrich) diluted in corn oil
(10mg/ml, Sigma) was administered intraperitoneally (100ug/g) twice in consecutive days a week after
the SE (SE group: n=5; control group: n=3), a day before (SE group: n=3; control group: n=3), and 5
weeks before SE group: n=4; control group: n=4). In the experiments with BrdU administration, it was
given either by intra-peritoneal injections (50mg/kg), or diluted in the drinking water (1mg/ml).
Immunohistochemistry and Microscopy
At the end of the experiments, animals were killed by intraperitoneal injection of tiopental,
transcardially perfused with saline 0,9% and immediately followed by a 4% paraformadehyde solution.
Brains were removed and post-fixed overnight in the same solution at 4C. They were then cryoprotected
in 30% sucrose solution for 24h, and then frozen in isopentane with dry ice and stored at -80C. Brains
were sectioned coronally on a cryostat at 40um and mounted to ionized slides.
CAPÍTULO 2
75
Sections were incubated in the primary antibodies: rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP;
1:1000; DAKO), chicken anti-green fluorescent protein (GFP; 1:500; Aves Labs), rabbit anti-CTiP2 (1:500;
ABcam), rat anti-BrdU (1:500, Serotec). The following secondary antibodies were used: Alexa 488 goat
anti-chicken, Alexa 594 goat anti-rabbit, Alexa 633 goat anti-rat.
To allow BrdU detection the sections were pre-treated with sodium citrate solution at 97C for 15
min (Tang et al., 2007). Immunofluorescence triple-labeling was carried out for GFP and other primary
(overnight) and secondary antibodies (4 hours) incubation in permeabilization solution (PBS-TritonX
0,5%) and blocker Normal Goat Serum (NGS; 5%), slices were incubated with PFA for 10 minutes and
then carrying on with BrdU pre-treatment and immunostaining as described before.
The stained samples were analyzed under a fluorescence microscope. For quantitative analysis
we used Stereo investigator software to count cells and to measure the Granular Cell Dispersion (GCD).
The entire DG+hilus+molecular layers was identified as the region of interest, and the total number of
GFP cells was counted in each section. To measure the GCD, we drew a line around the GCL in DAPI
staining and the program calculates the area limited by the line. To confirm colocalization, images were
captured using a confocal laser-scanning microscope (Carls Zeiss, Jena, Germany).
Quantification and statistical analysis
All numerical analysis were performed using MATLAB software. The proportion of GFP-positive
cell population in each side was normalized for total number of GFP cells to control for differential gene
expression in each animal. Values are expressed as mean +-standard error of mean (SEM). For all
comparisons ANOVA was performed with treatment group and hemisphere as factors, followed by post-
hoc test, if appropriate. Differences were considered statistically significant at p < 0.05.
76
Capítulo 3
Disentangling topic and electric effects of status epilepticus-
induced dentate gyrus abnormality
CAPÍTULO 3
77
Abstract
Experimental animal models of epilepsy have significantly contributed to the current knowledge
of the mechanisms associated with the human epileptic condition, although translational approaches
towards improving human disorder are still lacking. In rodents, systemic administration of kainic acid
(KA) or pilocarpine (Pilo) induces status epilepticus (SE), long-lasting epileptiform activity, including
spontaneous and recurrent seizures, and generalized cell death. Surprisingly, despite the neurotoxin
used to trigger the epileptic condition, it has been suggested granule cells in the dentate gyrus are
spared, and reorganization of their synaptic projections are responsible for generating a recurrent
excitatory network at the gate of the hippocampus. To identify how SE affects the reorganization of
mature and immature granule cells, we analyzed their morphology and localization after
intrahippocampal administration of KA or Pilo in mice. Granule cells were labeled using conditioned
doublecortin-dependent expression of green fluorescent protein (GFP), and anatomical alterations were
quantified in the chronic phase (after 15-30 days). Local administration of both neurotoxins induced SE,
bilateral epileptiform activity and hilar and CA1 cell death. However, while severe granule cell dispersion
occurred in the ipsilateral side of KA injection, in the contralateral KA-side and in both hippocampi of
Pilo-injected mice the granule layer morphology was unaffected. We also observed a higher ratio of
ectopic neurons amongst immature as compared to mature neurons in the KA model, despite the
significant reduction in neurogenesis in the KA ipsilateral side. In Pilo animals, we observed increased
neurogenesis in both hippocampi and low frequency of ectopic neurons. Neurons with hilar basal
dendrites were observed in both KA and Pilo animals, but only in the KA model we observed neurons
with enlarged cell bodies. Collectively, our results show that KA and Pilo models of TLE lead to different
cellular alterations in the hippocampus and need to be interpreted as complimentary approaches to the
study of epilepsy.
Adult hippocampus; epilepsy; animal models, kainic acid; pilocarpine; granular cell
dispersion, hilar basal dendrites.
CAPÍTULO 3
78
Introduction
Structural alterations of the hippocampal formation are a hallmark of temporal lobe
epilepsies (TLE) (Babb et al., 1991; Pitkanen and Sutula, 2002; Blumcke et al., 2013). Cell death,
astrogliosis and synaptic reorganization of the hilar region of the dentate gyrus, CA subfields,
subiculum and related cortices have long been extensively associated with its pathophysiology
(Armstrong, 1993;Mathern et al., 1997). Although initial accounts have suggested that granule
cell layer could be exempt from morphological transformations (Babb et al., 1989; Sloviter,
1994), compelling evidence including neuronal ectopia, granule cell dispersion, misplaced and
swelled granule cell bodies and, presence of basal dendrites may all contribute to the epileptic
condition (Blumcke et al., 2002; Thom et al., 2002; da Silva et al., 2006; Sastri et al., 2014;
Thom, 2014).
Granule cells in TLE are considered less vulnerable to cell death (Grooms et al., 2000), and
they are frequently described as an important group of cells that reinforces the excitatory loop
after the initial insult. Aberrant connections include abnormal mossy fibers sprouting -
recurrent axonal projection to the molecular layers - and basal dendrites with spines towards
the hilus (Bonaguidi et al., 2011; Shapiro, Ribak e Jessberger, 2008). Also, the ectopic granule
cells in the hilus are related to the abnormal synchronized bursts with CA3 (Scharfman,
Goodman e McCloskey, 2007). The loss of mossy cells and GABAergic hilar interneurons that
used to connect with dentate granule cells might play a part in the reorganization to form a
positive-feedback circuit, inducing the aberrant excitatory synaptogenesis, generating seizures.
Overall, granule cells are strong candidates for therapeutic approaches, once its role in the
epileptogenesis is better understood.
In animal models of TLE, administration route and neurotoxin used to generate the
epileptic condition may yield different pathophysiological findings and therefore, conclusions
for the human condition. These differences might bring evidence to help identify the causes of
TLE. Pilocarpine and kainic acid are the most common drugs used to initiate status epilepticus.
Local administrations of these drugs reduce the mortality rate and unspecific damages in the
brain are avoided, focusing in one initial epileptic focus and trying to reduce variability in the
CAPÍTULO 3
79
model.
Here, we addressed whether granule cell associated abnormalities (i.e., ectopic neurons,
astrogliosis and increased neurogenesis) are also present in the dorsal hippocampus locally
treated with intrahippocampal administration of pilocarpine in mice. In rats, pilocarpine has
been shown to produce sustained status epilepticus, hippocampal cell death and spontaneous
seizures (Furtado Mde et al., 2002; Castro et al., 2011; Furtado et al., 2011). Recently,
hippocampal cell death has been reported after intrahippocampal administration of pilocarpine
in mice, but no further details were given regarding dentate structural alterations (Lima et al.,
2016). Specifically, we used conditioned transgenic mice expressing green fluorescent protein
(GFP) under the doublecortin promoter to label mature and immature neurons in relation to
the moment of the initial insult. We discuss the results in light of current literature regarding
animal models of temporal lobe epilepsy.
Results
Intrahippocampal administration of both kainic acid and pilocarpine lead to bilateral
epileptiform activity, status epilepticus and spontaneous seizures
Intrahippocampal administration of both KA (n=9) and pilocarpine (n=5) during isoflurane
anesthesia induced status epilepticus in all animals, irrespective of their genetic background.
Interruption of isoflurane anesthesia occurred after drug application and the animals displayed
epileptic behavior as the anesthesia washed out. Behaviorally, these acute seizures evolved
from facial automatisms to unilateral forelimb myoclonia and, eventually, to one generalized
full blown seizures. We administered diazepam to interrupt seizures after 90 minutes from the
onset of SE, and 24 hours later we could still observe bilateral epileptiform discharges and
seizures (Figure 3.1A). Interictal spikes recorded in the molecular and granule cell layers
showed phase reversal suggesting local generation of these epileptiform events (Figure 3.1A).
The chronic epileptic condition in KA group was confirmed by recording spontaneous seizures
(Figure 3.1B), although no quantification of seizure frequency was made.
CAPÍTULO 3
80
Figure 3.1
Kainic acid intrahippocampal injection produced bilateral epileptiform activity in the acute and
chronic phases and morphological alterations. (A) KA-induced SE recruits both hippocampi one day
after spontaneously. Interictal spikes (a1) and high-voltage, fast-frequency oscillations (a2, a3) were
recorded in the ipsi and contralateral hippocampi in synchrony, or separately. (B) Spontaneous seizure
(1 day after ihpc KA injection). (C,D) Mosaic reconstruction of control (C) and KA-injected animals with
DAPI staining showing granule cell dispersion in the granule cell layer and cell death in CA1 and CA3 in
ipsilateral hippocampus (D). (E, F) Granule cell dispersion in the control and experimental group 15 (E, n
control= 4; n KA= 4) and 30 (F, n control=3; n KA= 5) days after KA injection.
CAPÍTULO 3
81
Mature granule cells exhibit abnormalities in ipsilateral and contralateral hippocampi
Histological analysis after KA injection revealed extensive hippocampal sclerosis, as
previously shown (Bouilleret et al., 1999). We confirmed that granule cell dispersion was
restricted to the ipsilateral side of KA injection (Figure 3.1C, D). Granule cell layer area was
enlarged when compared to the contralateral side, and the phenomenon was progressive with
time, i.e., the area was larger 35 days in comparison with 15 days after injection (Figure 3.1E,F).
In the contralateral hippocampus, subtle granule cell dispersion could only be observed 35 days
after kainic acid injection, mainly towards the temporal pole of the hippocampus (Figure 3.1F).
Through tamoxifen-mediated recombination, we could evaluate granule cells position
and morphology after KA injection. For that, we labeled neuronal progenitors 35 days before KA
injection (Figure 3.2A), in that way cells that are immature at the time of tamoxifen injection
would have had time to mature and integrate into the circuit. In vehicle-treated animals, these
cells showed round cell bodies and a cone-shaped tree of apical dendrites (Figure 3.2B).
Branching of the dendritic tree most likely started in the transition zone between the granule
cell and inner molecular layer and extended up to the hippocampal fissure. In KA-treated
animals, ectopic neurons and basal dendrites were observed in both hemispheres. In the
contralateral hippocampus, ectopic neurons were found in hilus (Figure 3.2C, arrow) and
molecular layer (not shown). However, abnormalities in the ipsilateral hippocampus were more
drastic. Granule cells developed prominent basal dendrites and enlarged cell bodies (Figure
3.2D). The total number of cells in each hemisphere was influenced by neither the
recombination rate nor possible cell death effect, regarding control or experimental group
(Figure 3.2E). Two-way analysis of variance (ANOVA, factors: condition and hemisphere)
revealed an increase in the number of ectopic neurons in KA-treated animals (F[1,15] = 4,97;
p<0.05; Figure 3.2F) irrespective of the hemisphere analyzed. Finally, the ectopic neurons
showed no preference for positioning in the hilus or the molecular layer of the dentate gyrus.
Their distribution was also not different between the ipsi and contralateral hippocampus (Figure
3.2G).
CAPÍTULO 3
82
CAPÍTULO 3
83
Figure 3.2
Morphological alterations in pre-established neurons in both hippocampi after iHPC administration of
KA. (A) Timeline depicting experimental procedure. (B-D) coronal section of Tamoxifen injected adult
mice labeling granule cells in GFP. (B) Granule cells labeled with tamoxifen mediated recombination in
control animals shows typical morphology and are restricted to the granule cell layer. (B) granule cell
displacing ectopic positioning in hilus in the contralateral hemisphere. (C) Neurons presenting abnormal
basal dendrites were found in both hermispheres, but in ipsilateral side they had an enlarged cell body.
(E) Quantification of labeled neurons in 4 sections per animal in each group. (F) Quantification of ectopic
neurons in relation to the total of neurons observed. (G) Graphic showing the distribution of GFP+
ectopic neurons in the molecular layer and hilus. Note that ectopic granule cells show no preference for
either region. .(n control = 4; n kainate = 4; Statistics: (F) ANOVA F(1,15)= 4.97; p<0.05)
Neurogenesis is selectively suppressed in the kainic acid-injected hippocampus
Young neurons have different electrical properties as compared to fully mature ones
(Espósito et al., 2005). To evaluate the effects of status epilepticus in this cell population, we
induced the tamoxifen-mediated recombination 7 days after the KA administration (Figure
3.3A). Within 35 days, granule cells are expected to develop and integrate into the dentate
gyrus circuitry as seen in the control group (Figure 3.3B). Conversely, immature granule cells in
KA-treated animals had its development disrupted. In the contralateral hemisphere, the effects
were mild, neurogenesis was significantly increased (F[1,15] = 6,17; p<0.05, ANOVA) and
ectopic cells were found abundantly in the hilus (Figure 3.3C, E and G). As before, the soma of
granule cells resembles those from the control group (Figure 3.3C). In the ipsilateral
hippocampus, GFP+ cells assumed aberrant morphologies with severely increased cell bodies
and disorganized dendrites (Figure 3.3D). The proportional number of neurons decreased
among labeled cells and the few remaining neurons in the ipsilateral hemisphere were
misplaced (Figure 3.3F).
CAPÍTULO 3
84
Figure 3.3
Morphological alterations in newly generated neurons in both hippocampi after iHPC administration
of KA. (A) Timeline depicting experimental procedure. (B) Granule cells in control group show typical
morphology. (C) In the contralateral side of KA injection, GFP+ granule cells show slightly altered
morphologies and ectopic neurons can be observed (arrow). (D) GFP+ granule cells in the ipsilateral side
of KA injection show dramatically altered morphology, with many processes and enlarged cell bodies
(arrowheads). (E) Quantification of GFP+ neurons in the ipsi and contralateral hippocampi of control and
KA injected animals. Observe the severe impairment of neurogenesis in the KA-ipsilateral hippocampus,
in contrast to the enhancement of neurogenesis in the KA-contralateral side. (F) Quantification of GFP+
CAPÍTULO 3
85
ectopic neurons. Note that misplaced neurons are observed in both contra and ipsilateral hippocampi
following KA injection, though their frequency is higher in the ipsilateral side (F[1,15] = 6,17; p<0.05,
ANOVA). (G) Graphic showing the distribution of GFP+ ectopic neurons in the molecular layer and hilus.
Electric activity is not sufficient to promote GCD and newborn cell abnormalities.
Through a different pathway of electrical activation, we wanted to test for the difference of
electrical and chemical activities. Using another model of chemical-induced SE - the injection of
pilocarpine - we could compare the differential effects between the two models following
similar protocal (Figure 3.4A). Although we could record sustained electrical activities and
observe hippocampal sclerosis in CA1 (Figure 3.4B), the newborn cells labeled through
tamoxifen recombination did not present massive morphological transformation, as seen in KA
group. The granule cells maintained their round shaped cell body and apical dendrites (Figure
3.4C) although we could also observe basal dendrites. Also differently from KA group, there was
no granule cell dispersion in the injected hippocampus (Figure 3.4B,D), but neurogenesis was
stimulated in both hemispheres (Figure 3.4E; F[1,11] = 67,35; p<0.001, ANOVA). A common
feature between models was the presence of granule cells misplaced from the dentate gyrus
(Figure 3.4F; F[1,11] = 10,3; p<0.01, ANOVA).
CAPÍTULO 3
86
CAPÍTULO 3
87
Figure 3.4
Morphological alterations in newly generated neurons after pilocarpine ihpc injection. (A) Protocol
applied intended to label cells through tamoxifen injection 7 days after SE induction. Cells were
observed 35 days later. (B) Coronal section showing both hippocampi with DAPI staining. Cell death was
observed in ipsilateral CA1, but no Granule Cell Dispersion. (C) Granule cells acquire typical morphology
and ectopic positioning (arrow) after iHPC Pilocarpine SE. (D) DG area in sections relating to site of
injection. DG area in injected animals were not different from control group. (E) Total number of
neurons in Pilocarpine treated animals were higher than vehicle treated group (F[1,11] = 67,35; p<0.001,
ANOVA). (F) Ectopic cells were observed in both hemispheres (F[1,11] = 10,3; p<0.01, ANOVA).
Discussion
Granule cell abnormalities are found in many models of temporal lobe epilepsy, but their
participation in the disease is still a matter of discussion. In our work, we made use of two
common chemical models for inducing a sustained status epilepticus, Pilocarpine and KA
injected in the hippocampus. The alterations shared between models might be important to
understand which the most critical elements are and which features are more susceptible to
induce an epileptic condition. We analyzed granule cell morphology after inducing the
expression of a reporter conditioned to a neuronal promoter regulation. In the KA group,
depending on the stage of cell development in the ipsilateral side, we observed enlarged cell
bodies and the development of basal dendrites when the granule cells are mature. On the
other hand, there is a disruption of neurogenesis in progenitors affected with KA. In Pilocarpine,
these observations were not found; instead, cells maintained their typical morphology and
neurogenesis was enhanced. Ectopic cells were a common feature between all experimental
groups. In sum, we believe that the different characteristics between models must be taken
into account in the moment of discussing the pathology in humans and searching for treatment.
Among the alterations we observed, it was striking the presence of granular cell
dispersion (GCD). The GCD is a phenomenon where granule cells lose their expression of reelin
CAPÍTULO 3
88
(Heinrich et al., 2006) and acquire a less compact conformation in the DG, expanding its area in
time. We showed that GCD is restricted to the hippocampus receiving KA, but not Pilo, in spite
of sustained bilateral paroxysmal activity. It seems that only intrahippocampal administration of
KA can provoke this phenomenon, which is also found in humans with TLE. Other models using
intraperitoneal administration failed to replicate it (Mello et al., 1993; Schwob et al., 1980), and
now we showed that also the intrahippocampal injection of Pilo does not have this local effect.
GCD and KA injection seem to be intimately related, and its molecular mechanisms have been
studied (Orcinha et al., 2016), although, so far, no correlation has been found between the
granular cell density and seizure activity (Mathern et al., 1997; Blumcke et al., 2002). In this
respect, other effects than the reduction of GCD such as decreased signaling of pro-
inflammatory cytokine and mTORC1 activation could explain the decreased seizure
susceptibility after SE-induced epileptogenesis (Park et al., 2016). Once only one model elicits
this response, it could be that GCD is not a critical effect to define an epileptogenic
environment.
Apparently, the granule cells are more resistant to cell death than pyramidal neurons in
CA1 and CA3 (Grooms et al., 2000), as we did not observe a significant reduction in the total
number of cells (Fig 2E) within the DG when compared to control group, although they seem
susceptible to morphological alterations and dislocation in the granular layer. The ectopic cells
are important to understand the rewiring that occurs in the DG after the insult, since they may
multiply the excitation loop in the DG (Scharfman e Pierce, 2012). It is interesting to note that
they occur in both hippocampi, and it’s not necessarily related to the GCD in the ipsilateral side,
and also they are consistent between many models of TLE (Jessberger et al., 2005; Jung et al.,
2004; Parent et al., 1997; Scharfman, Goodman e McCloskey, 2007).
It has been reported that systemic (Ben-Ari, 1985) and intrahippocampal (Bouilleret et
al., 1999; Heinrich et al., 2006) administration of KA increases proliferation in the subgranular
zone (SGZ) of the dentate gyrus (Kajitani et al., 2009; Kralic, Ledergerber e Fritschy, 2005;
Lugert et al., 2010). However, neurogenesis is reduced in the ipsilateral SGZ when KA is locally
administered (Ledergerber, Fritschy e Kralic, 2006; Murphy et al., 2012). Our results indicate
that both neuronal differentiation and survival are severely hampered in the KA-ipsilateral side,
CAPÍTULO 3
89
what could help to explain the decreased neurogenesis in this hippocampus. Moreover, the few
neurons added to the DG of these animals display a high degree of morphological
malformations and mispositioning.
One other characteristic present only in KA-injected animals is the enlarged cell body of
neurons, with aberrant basal dendrites. This morphology is also found in models knocking out
PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog on Chromosome Ten); (Williams et al., 2015). This
molecule is involved in regulating neuronal biology, and its mutation is present in patients with
epilepsy and autism disorders (Marchese et al., 2014). Loss of PTEN increased excitatory
afferent input in the granule cells and provided morphological changes, as seen in our KA
injected animals, suggesting this pathway might be affected and could increase the propensity
of the hippocampal network to seize. Although a more detailed analysis is necessary to confirm
this hypothesis.
Our results suggest that KA-induced drastic morphological alterations in old and new
neurons in the DG and both young and old neurons were susceptible to form basal dendrites
and assume ectopic positions on the contralateral side, suggesting the electrical effect upon
this side, as a control from the ipsilateral counterpart, which received the drug directly. Also,
pilocarpine injection, although showing less remarkable changes in the ipsilateral side,
presented ectopic cells and basal dendrites. We could suggest that the most common effects to
induce an epileptogenic environment are the ectopic cells and basal dendrites, based on the
electrical effects shared between models, but more analysis with more models are necessary to
confirm that.
Methods
Animals
All experiments were performed in accordance with international guidelines of animal
experimentation and were previously approved by local ethic committee (#012/2016; CEUA-UFRN).
Mice with age between 8 - 12 weeks, were arbitrary assigned to the control or experimental groups (KA-
or pilocarpine-induced status epilepticus). Animals were double-transgenic, resulting from crossing DCX
lineage (DCX-CRE-ERT2 - Stem Cell Research, Helmholtz Center Munich) to mice from the reporter lineage
CAPÍTULO 3
90
GFP (CAG-CAT-GFP). Only animals confirmed by PCR analysis of genomic DNA were used. Tamoxifen
(TAM) treatment induces CreERT2 expressed in type2b, type3 and neuroblasts cells in the hippocampal
subgranular zone to cause random excision between multiple pairs of lox sites, leading to the expression
of the reporter sequence. Two injections of TMX (100 µg/kg) (Zhang et al 2010) were given in
consecutive days to achieve sparse labeling. Animals were held under standard laboratory housing
conditions with a light/dark cycle of 12h each (lights on at 6am), with free access to food and water.
Efforts were made to reduce the number of animals used in the experiments.
Intrahippocampal kainic acid and pilocarpine injections
Animals were anesthetized with isoflurane (inhaled anesthesia mixture containing isoflurane 1.5
%; 1 L/min) and placed in the stereotaxic. Using a glass pipette attached to nanoinjector, we injected
kainic acid (50 nL, 20 mM solution in PBS;Cayman Chemical), pilocarpine (Sigma-Aldrich, 570 nL of a 700
µg/µL solution) or vehicle solution (sterile PBS) at a flux of 0.5 μL/min in the dentate gyrus of the right
dorsal hippocampus (coordinates in mm: AP: 2.1; ML: 1.7; DV: 1.6) and waited 5 minutes before
removing the pipette to avoid liquid reflux. In the pilocarpine group, methyl-scopolamine was injected (1
mg/kg, i.p.) before anesthetizing the animal to block peripheral reactions. SE was characterized by clonic
movements of the forelimbs, rotations or immobility. These behaviors were described before in
previous studies (Haussler et al., 2012) and confirmed by us through recording field potential activity in
3 animals. We monitored SE for 90 minutes and then injected diazepam (5mg/kg, i.p.) to alleviate
seizure activity. Mice were then returned to their cage with free access to food and water. Only animals
that experienced SE were kept for further analysis.
Experimental design
Each group received tamoxifen (TAM, T-5648, Sigma Aldrich) in order to label neurons and
associate them to effects of SE upon different stages of cell development. Recombination occurred a
week after the SE (SE group: n=5; control group: n=3), a day before (SE group: n=3; control group: n=3),
and 5 weeks before SE group: n=4; control group: n=4). The difference between timelines in each group
is graphically represented in the results sessions. Each injection of TAM was diluted in corn oil (10
mg/mL, Sigma Aldrich) and administered intraperitoneally (100 µg/g) in consecutive days.
CAPÍTULO 3
91
Immunohistochemistry and Microscopy
At the end of the experiments, animals were killed by intraperitoneal injection of tiopental (100
mg/kg; i.p.), transcardially perfused with saline 0.9 % and immediately followed by a 4 %
paraformadehyde solution. Brains were removed and post-fixed overnight in the same solution at 4 Cº.
They were then cryoprotected in 30 % sucrose solution for 24 h, and then frozen in isopentane with dry
ice and stored at - 80 Cº. Brains were sectioned coronally on a cryostat at 40 µm and mounted to ionized
slides.
Sections were incubated in the primary antibodies: rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP;
1:1000; DAKO), chicken anti-green fluorescent protein (GFP; 1:500; Aves Labs). The following secondary
antibodies were used: Alexa 488 goat anti-chicken, Alexa 594 goat anti-rabbit.
Immunofluorescence double-labeling was carried out for GFP and other primary (overnight) and
secondary antibodies (4 hours) incubation in permeabilization solution (PBS-TritonX 0.5%) and blocker
Normal Goat Serum (NGS; 5%). The stained samples were analyzed under a fluorescence microscope
(Zeiss). For quantitative analysis we used Stereo investigator software to count cells and to measure the
Granular Cell Dispersion (GCD). The entire DG+hilus+molecular layers was identified as the region of
interest, and the total number of GFP cells was counted in each section. To measure the GCD, we drew a
line around the GCL in DAPI staining and the program calculates the area limited by the line. To confirm
colocalization, images were captured using a confocal laser scanning microscope (Carls Zeiss, Jena,
Germany).
Statistical analysis
Statistical analysis were performed using MATLAB. Data are expressed as the mean ± standard
error of the mean (SEM). Statistically significant differences were assessed by 2-way analysis of variance
(ANOVA), comparing two or more groups with treatment group and hemisphere as factors, followed by
post-hoc test, if appropriate. P-value < 0.05 was considered a significant difference (*).
92
Capítulo 4
Discussão Geral
DISCUSSÃO GERAL
93
No presente trabalho, nós avaliamos os efeitos da injeção do ácido caínico e da
pilocarpina sobre a progressão da linhagem de progenitores do tipo 2b/3 no hipocampo adulto,
assim como os efeitos dessas drogas sobre a organização celular do giro denteado e a
morfologia de neurônios granulares em camundongos adultos. Nossos resultados trazem
importantes contribuições para os campos de estudo da neurogênese adulta e da epilepsia.
Para o primeiro, indicando que a progressão da linhagem celular de uma CTN adulta até a
geração de neurônios não é irreversível, mas comporta processos de transdiferenciação e
alteração do potencial para gerar diferentes tipos celulares. E para o campo de estudo da
epilepsia, demonstrando que a injeção intrahipocampal de ácido caínico e pilocarpina
provocam diferentes efeitos na organização celular do giro denteado adulto e, portanto, podem
estar modelando diferentes graus ou estágios da patologia em humanos. A seguir, discutiremos
estes dois grupos de resultados de forma separada, para facilitar a compreensão dos leitores.
Alterações na linhagem celular
Para estudarmos o processo de neurogênese no giro denteado de camundongos
submetidos à injeção de ácido caínico ou pilocarpina, nós utilizamos animais duplo-
transgênicos, nos quais o gene codificando a proteína repórter (GFP) é expresso de maneira
controlada tanto no tempo quanto no tipo celular. O controle temporal é possível pela
dependência do tratamento com o tamoxifeno para a translocação da enzima CreERT para o
núcleo (Hayashi e McMahon, 2002; Imayoshi et al., 2006), onde a recombinação gênica no locus
do gene GFP irá acontecer. Já a especificidade do tipo celular recombinado é dada pelo
promotor do gene Dcx controlando a expressão de CreERT (Zhang et al., 2010). Desta forma,
apenas células com o promotor do gene Dcx ativo durante a administração do tamoxifeno
serão recombinadas e passarão a expressar GFP
O gene DCX codifica uma proteína associada a microtúbulo que começa a ser expressado
na linhagem celular do giro denteado adulto em progenitores do tipo 2b, uma célula localizada
na zona subgranular (ZSG), com corpo celular arredondado e sem prolongamentos, considerada
como um progenitor comprometido com a geração de neurônios (Steiner et al., 2006). A
expressão da proteína DCX permanece em células progenitoras do tipo 3 e em neurônios pós-
DISCUSSÃO GERAL
94
mitóticos imaturos, sendo perdida quando a célula adquire características de neurônio maduro
e se integra na camada granular (Francis et al., 1999; Jagasia et al., 2009).
De acordo com este padrão de expressão proteica, nós observamos que a expressão de
GFP em animais Dcx-CreERT/CAG-CAT-GFP naïve, 3 dias após a injeção de tamoxifeno, está
restrita às células DCX+ na ZSG, sendo que a maior parte destas células apresenta morfologias
indicativas de progenitores 2b/3 ou de neurônios recém-gerados. Aproximadamente 5% das
células GFP+/DCX+ na ZSG incorporaram BrdU nos primeiros 3 dias após a administração de
tamoxifeno, sugerindo que a recombinação ocorre predominantemente em células pós-
mitóticas. De acordo com esta interpretação, 7 dias após a administração de tamoxifeno,
observamos que todas as células GFP+ na ZSG e na camada granular do giro denteado
expressam DCX e apresentam pequenos processos apicais, típicos de neurônios granulares com
1 semana de diferenciação (Zhao et al., 2006). Trinta dias após a recombinação,
aproximadamente 90% das células GFP+ apresentam morfologias típicas de neurônios
granulares e não expressam mais a proteína DCX, conforme descrito na literatura (Jagasia et al.,
2009). Reforçam essa conclusão o fato destas células expressarem CTIP2, um marcador de
neurônios granulares (Simon et al., 2012) (Figure S 3).
O padrão descrito acima é coerente com a maturação neuronal descrita na literatura
(Zhao et al., 2006) e também está de acordo com a proposição de que progenitores do tipo
2b/3 são restritos à geração de neurônios. No entanto, nós também observamos um resultado
surpreendente que não corrobora esta última possibilidade. Aproximadamente 10% das células
GFP+ no giro denteado apresentam morfologia astroglial e expressam GFAP 30 dias após a
administração de tamoxifeno, sugerindo que parte das células GFP+/DCX+ observadas nos
estágios iniciais (3 ou 7 dias) seriam capazes de gerar astrócitos.
De acordo com esta possibilidade, quando acompanhamos a população de progenitores
GFP+ através da incorporação de BrdU nos primeiros 4 dias após a administração de
tamoxifeno, observamos que todas as células GFP+/BrdU+ em animais controles expressam
DCX. No entanto, quando os animais foram submetidos ao mesmo protocolo de tratamento
com tamoxifeno e BrdU, mas tiveram uma sobrevida de 30 dias, observamos que cerca de 10-
DISCUSSÃO GERAL
95
12% das células GFP+/BrdU+ expressam GFAP. A explicação mais parcimoniosa para esta
observação é que alguns dos progenitores GFP+/DCX+/BrdU+ observados quatro dias após a
administração de tamoxifeno geram os astrócitos GFP+/GFAP+/BrdU+ observados no dia 30.
Estes resultados, por si, já indicam a necessidade de uma revisão do modelo atual de
progressão da linhagem celular de uma CTN no hipocampo adulto, que propõe que as células
do tipo 1 (CTN) originam progenitores do tipo 2a e que apenas estes dois tipos celulares teriam
a capacidade de gerar astrócitos e neurônios (Encinas et al., 2011). O progenitor do tipo 2a por
sua vez, originaria os progenitores do tipo 2b, que conforme descrição anterior, marcaria a
transição definitiva para a linhagem neuronal (Steiner et al., 2006). Contrariamente a este
modelo, nossos dados indicam que os progenitores 2b ainda apresentam a capacidade de gerar
astrócitos e, portanto, não podem ser considerados restritos à geração de neurônios.
A determinação do potencial neurogênico ou gliogênico dos progenitores do tipo 2b/3
(DCX+) pode estar sendo controlada por fatores extrínsecos, como neurotransmissores
(Bonaguidi et al., 2011; Encinas et al., 2011). Para avaliar esta possibilidade, utilizamos um
modelo animal de ELT, na qual um desbalanço entre excitação e inibição é produzido por meio
da administração de uma neurotoxina. De fato, dados da literatura monstram que a
administração intrahipocampal de ácido caínico leva a uma maior geração de astrócitos (Nitta
et al., 2008; Sierra et al., 2015). Nós observamos que uma única injeção intrahipocampal de
ácido caínico induz um aumento sustentado da atividade elétrica no hipocampo ipsi e
contralateral (Figure S 1). No entanto, apenas no hipocampo ipsilateral nós observamos um
aumento da astrogliogênese na linhagem de células DCX+, enquanto no hipocampo
contralateral, a linhagem de células DCX+ manteve o padrão predominantemente neurogênico
observado em animais controle. Esses resultados sugerem que apesar da atividade elétrica
aumentar a proliferação de CTN (Nakagawa et al., 2000; Parent et al., 1997), a presença de
ácido caínico é condição necessária na modificação da via de diferenciação celular no
hipocampo adulto.
Nessa mesma direção, Sierra e colaboradores (2015) descreveram um fenômeno similar
de direcionamento para linhagem glial com uma população celular expressando o marcador
DISCUSSÃO GERAL
96
nestina após injeção de ácido caínico. Esse marcador está presente em progenitores mais
primitivos (tipo 1 e 2a) na linhagem celular do giro denteado adulto, e apresentam reconhecido
potencial astrogliogênico (Bonaguidi et al., 2011; Encinas et al., 2011). Considerando estas
observações, uma possível explicação para o aumento da astrogliogênese observada em nosso
modelo após a injeção de ácido caínico é que progenitores DCX+ (tipo 2b/3) poderiam regredir
para estágios mais primitivos da linhagem (tipo 1/2a) e readquirir potencial astrogliogênico. De
acordo com esta interpretação, 30 dias após a administração de tamoxifeno, nós identificamos
progenitores GFP+/DCX- (tipo 2a) em animais controle, assim como células GFP+/GFAP+ com
morfologia de células de glia radial (tipo 1) em animais que receberam ácido caínico (Figure
2.5).
Essa regressão na linhagem celular de progenitor tipo 2b para 2a e 1 pode explicar o
aumento do número de astrócitos gerados em animais que receberam ácido caínico 30 dias
após a administração de tamoxifeno (Figure 2.2). De fato, a maioria dos astrócitos GFP+
observados nestes animais é gerada após a indução do SE, indicando que progenitores
derivados da linhagem DCX+ ainda estão presentes um mês após a recombinação e apresentam
potencial astrogliogênico. Corroborando estas observações, evidências na literatura também
indicam que progenitores em estado ativo de proliferação poderiam regressar ao estado de
quiescência (Urban et al., 2016). Nesse trabalho, os autores mostram que o aumento da
degradação proteossômica do fator de transcrição Ascl1, mediada pelo complexo E3-ubiquitin
ligase Huwe, estimula o retorno dos progenitores para o estado de quiescência, permitindo a
manutenção da neurogênese a longo prazo (Urban et al., 2016). No entanto, Ascl1 também é
expresso em progenitores tipo 2b Tbr2+ (Andersen et al., 2014), de modo que parte dos efeitos
observados por Urban e colaboradores poderia ser interpretada como um retorno de células
tipo 2 para estágios mais precoces. De acordo com esta interpretação, os autores também
descrevem que a deleção de Huwe1 reduz a neurogênese no giro denteado (Urban et al.,
2016).
Nossos resultados indicam que esta possibilidade é concreta. De fato, nós observamos
células com características de progenitores tipo 2a em animais naïve 30 dias após
recombinação, e de progenitores tipo 1 em animais tratados com ácido caínico em períodos de
DISCUSSÃO GERAL
97
tempo bastante curtos após a administração de tamoxifeno e ácido caínico (3, 7 e 30 dias),
sugerindo que a regressão na linhagem acontece em células do tipo 2b de forma esporádica em
condições fisiológicas, mas pode ser intensificada após estímulos. Será interessante avaliarmos
em nosso modelo se a injeção de ácido caínico reduz a expressão de Ascl1 em progenitores do
tipo 2b.
A fim de avaliar se o aumento da atividade elétrica neuronal induzida por ácido caínico
poderia ser a causa das alterações observadas na neurogênese e astrogliogênese hipocampal,
nós utilizamos um segundo modelo de ELT - a injeção intrahipocampal de pilocarpina (Furtado
et al., 2011; Furtado et al., 2002; Lima et al., 2016). Neste modelo, observamos que tanto no
hipocampo ipsi quanto contralateral à injeção, houve um aumento no número de neurônios
GFP+. Contrariamente aos animais tratados com ácido caínico, a proporção de astrócitos na
linhagem de células DCX+ em animais que receberam pilocarpina permaneceu similar aos
controles. Portanto, a alteração na linhagem celular de neurogênica para astrogliogênica não
pode ser explicada apenas pelo aumento generalizado da atividade elétrica, uma vez que ela foi
restrita ao lado ipsilateral da injeção de ácido caínico.
Com o intuito de averiguar o que poderia explicar estas diferenças de desenvolvimento
das células GFP+ nos hipocampos ipsi e contralateral de animais tratados com ácido caínico e
entre estes e os animais tratados com pilocarpina, nós investigamos a degeneração do plexo
parvalbuminérgico no giro denteado destes animais. O controle da proliferação das CTN (tipo 1)
está intrinsecamente relacionada com a atividade de interneurônios gabaérgicos, que modulam
a atividade dos progenitores, proporcionando uma diminuição da divisão celular simétrica em
resposta à ativação do receptor gabaérgico (Song, Zhong, et al., 2012). Através da deleção
condicional da subunidade γ2 do receptor de GABAA em progenitores nestin+ (tipo 1/2a), os
autores observaram um aumento no número de células de glia radial em estado proliferativo.
Além disso, a administração de diazepam nesses animais, ao contrário do observado em
animais controle, não afeta a proliferação de células de glia radial (Song, Zhong, et al., 2012),
sugerindo que o neurotransmissor GABA teria um papel fundamental na manutenção de um
estado de quiescência à nível populacional no giro denteado adulto. Os autores ainda sugerem
que o tônus gabaérgico responsável por esse fenômeno dependeria da ativação seletiva de
DISCUSSÃO GERAL
98
interneurônios parvalbumina+ (PV+) no giro denteado, mas não de neurônios gabaérgicos
positivos para somatostatina (SST+) ou peptídeo intestinal vasoativo (VIP+).
Baseados nestes achados, nós decidimos avaliar o efeito das injeções de ácido caínico e
pilocarpina sobre a população de interneurônios gabaérgicos PV+. Nós observamos, 3 dias após
a indução do SE, uma marcante degeneração do plexo parvalbuminérgico no giro denteado
ipsilateral à injeção de ácido caínico. Em contraste, observamos que a população de
interneurônios PV+ está conservada no lado contralateral à injeção de ácido caínico e em
ambos os hipocampos de animais tratados com pilocarpina. Esses resultados estão de acordo
com dados prévios da literatura mostrando que, após injeção de pilocarpina intraperitoneal,
ocorre uma redução de interneurônios gabaérgicos, mas a população PV+ se encontra
praticamente preservada (Buckmaster, Abrams e Wen, 2017). Já no modelo de ácido caínico,
Marx e colaboradores demonstraram a redução de células PV+ 2 ou 21 dias após a injeção no
lado ipsilateral, enquanto o número de células PV+ no lado contralateral permaneceu similar
aos controles (Marx, Haas e Häussler, 2013)
Dessa forma podemos especular que, no lado ipsilateral dos animais que receberam
ácido caínico, a perda de neurônios parvalbumina positivos, em conjunto com o aumento da
atividade elétrica, estaria contribuindo para o redirecionamento da linhagem dos progenitores
DCX+ para estágios mais primitivos da linhagem e astrogliogênese. No lado contralateral destes
animais e em ambos hipocampos de animais que receberam pilocarpina, nos quais a população
de interneurônios gabaérgicos PV+ permanece relativamente preservada, o aumento da
atividade elétrica coincide com um aumento do tônus gabaérgico, o que estimularia a
quiescência dos progenitores e possivelmente sua diferenciação e sobrevivência como
neuroblastos.
Em conjunto, nossos resultados sobre a análise da linhagem de progenitores DCX+ no
hipocampo adulto indicam que estas células não podem ser consideradas como restritas à
geração de neurônios e que a progressão da linhagem celular neurogênica seria regulada pela
atividade gabaérgica também no estágio de progenitor tipo 2b/3. Nós propomos um novo
modelo para a progressão da linhagem celular das CTNs do hipocampo (Figura 4.1).
Progenitores tipo 1, cuja quiescência é sabidamente estimulada por GABA (Song, Zhong, et al.,
DISCUSSÃO GERAL
99
2012), quando ativados originam progenitores tipo 2a. Possivelmente, estes dois tipos celulares
podem originar astrócitos (Encinas et al., 2011). Células tipo 2a originam progenitores tipo 2b,
que começam a expressar DCX+ e, em condições fisiológicas, geram predominantemente
neurônios. No entanto, uma pequena fração destas células pode retornar para o estágio 2a e
gerar astrócitos diretamente (Figura 4.1A). Nossos resultados atuais não permitem confirmar
ou excluir esta última possibilidade.
O aumento da atividade elétrica neuronal no giro denteado ocasiona um aumento da
liberação de glutamato e GABA, que são os principais neurotransmissores produzidos por
neurônios locais, bem como dopamina, liberada por projeções de longa distância (Smolders et
al., 1997). Desta forma, a resultante do aumento da atividade neuronal no giro denteado
ipsilateral à injeção de ácido caínico é um aumento da liberação de glutamato e diminuição de
GABA. O aumento de glutamato estimularia o aumento da diferenciação neuronal observada
neste modelo nos primeiros momentos após o SE, embora a maior parte destes neurônios
degenere em estádios mais tardios (Mohapel, Ekdahl e Lindvall, 2004). Já a redução do GABA
explicaria a maior taxa de regressão de células 2b/3 para os estágios 1/2a e a mudança de seu
potencial para a geração de astrócitos (Figura 4.1B).
Por outro lado, o aumento da atividade elétrica em ambos hipocampos após injeção de
pilocarpina e no hipocampo contralateral à injeção de ácido caínico ocasionaria um aumento
nas liberação de glutamato e GABA, aumentando a taxa total de neurogênese (Figura 4.1C). De
fato, a sinalização por glutamato estimula a sobrevivência de neurônios pós-mitóticos (Tashiro
et al., 2006). Já o aumento dos níveis de GABA, também contribuiria para a diferenciação e
sobrevivência de novos neurônios (Tozuka et al., 2005), além de exercer uma inibição sobre a
proliferação das CTNs (Song, Zhong, et al., 2012), já discutida anteriormente.
Em experimentos futuros, avaliaremos a validade desse modelo utilizando métodos
genéticos para eliminar seletivamente neurônios PV+ no giro denteado de animais tratados
com pilocarpina e/ou no hipocampo contralateral à injeção de ácido caínico. Nossa predição é
que a eliminação daquelas células, em conjunto com o SE, produzirá um aumento da
astrogliogênese hipocampal.
DISCUSSÃO GERAL
100
DISCUSSÃO GERAL
101
Figura 4.1
Modelo proposto de progressão da linhagem celular no hipcampo adulto (A) Setas cinzas indicam o
modelo descrito classicamente na literatura, apresentando as transições entre estágios durante a
progressão de células de glia radial até neurônios ou astrócitos no hipocampo adulto. As setas
vermelhas sugerem as transições descritas no nosso trabalho. (B) O aumento da atividade elétrica
acompanhado da perda de interneurônios gabaérgicos inibe a progressão dos progenitores à neurônios
e estimula a proliferação e geração de CTN e astrócitos. (C) Atividade elétrica aumentada na presença de
atividade gabaérgica estimula a proliferação de progenitores intermediários e diferenciação e
sobrevivência neuronal
Alterações neuronais nos dois modelos de epilepsia
Além dos efeitos sobre a diferenciação dos progenitores, neste trabalho também
descrevemos alterações na organização do giro denteado e na morfologia dos neurônios
granulares maduros e em processo de amadurecimento, tais como a presença de dendritos
basais e localização ectópica desencadeadas pela injeção intrahipocampal de ácido caínico ou
pilocarpina. Embora estas alterações tenham sido descritas em camundongos tratados com
ácido caínico intrahipocampal (Häussler et al., 2012; Murphy et al., 2012) ou em animais
tratados com pilocarpina sistêmica (Walter et al., 2007), nós aqui demonstramos que elas
ocorrem em diferentes proporções e intensidades, dependendo do momento de administração
do tamoxifeno e da droga utilizada para a indução do SE, sugerindo que tanto o estágio de
maturação dos neurônios quanto o fármaco utilizado para a indução do SE influenciam os
fenótipos neuronais observados no giro denteado de animais epilépticos.
O giro denteado é organizado em camadas compactas do corpo celular das células granulares.
No modelo de injeção intrahipocampal do ácido caínico observamos uma severa dispersão das
células da camada granular no lado ipsilateral (Figure 3.1), enquanto a organização neuronal na
camada granular foi praticamente inalterada no lado contralateral à injeção de ácido caínico e
em ambos hemisférios em animais que receberam pilocarpina (Figure 3.4). A dispersão da
camada granular é caracterizada pelo aumento da área do GD e perda de proximidade e
compactação do corpo celular dos neurônios granulares decorrente da inibição da produção de
DISCUSSÃO GERAL
102
Relina (Heinrich et al., 2006; Müller et al., 2009). Esse fenômeno parece estar ligado à
receptores de NMDA, uma vez que administrando antagonistas, e aumentando a inibição por
ativação gabaérgica, a dispersão pode ser impedida (Suzuki et al., 2005). O envolvimento das
sinalizações glutamatérgica e gabaérgica local poderia explicar porque apenas no hipocampo
ipsilateral do modelo de injeção do ácido caínico observamos a dispersão, uma vez que apenas
neste hipocampo foi observado um aumento da atividade neuronal e concomitante
degeneração de neurônios gabaérgicos.
Curiosamente, as células granulares sofreram alterações morfológicas apenas no lado
ipsilateral, e as características dessas alterações ocorreram de forma dependente do período
que a recombinação foi induzida. Quando injetamos tamoxifeno 35 dias antes da indução do SE
as células granulares apresentaram aumento da área do corpo celular e formação de dendritos
basais hilares ramificados e com espinhas (Figure 3.2). Já a população neuronal recombinada 7
dias após a injeção de ácido caínico é bastante reduzida devido a perda da capacidade
neurogênica descrita após a injeção de ácido caínico (Kralic, Ledergerber e Fritschy, 2005) e os
poucos neurônios restantes apresentam morfologia bastante alterada, perdendo a
característica de corpo celular arredondado e apresentando várias projeções. Danzer e
colaboradores descreveram alterações similares para os neurônios gerados antes do insulto.
Utilizando outro animal transgênico, que expressa a proteina reporter YFP sob o controle do
promotor Thy1, as células geradas até 5 semanas antes do insulto apresentaram hipertrofia do
corpo celular e dendritos basais em tufo (Murphy et al., 2012). Esse promotor só é ativo em
neurônios com 5 semanas de idade, e em conjunto com marcadores de proliferação (Ki67) e
células imaturas (utilizando como marcador calretinina) eles aproximaram a idade e efeitos das
células. Através do nosso modelo temos uma melhor aproximação temporal da idade e estágio
da célula e confirmamos os resultados que eles descreveram.
Uma via possível para ocorrência das alterações encontradas nos neurônios maduros no
lado ipsilateral, é a alteração de PTEN (Phosphatase and Tensin homolog on chromosome Ten).
A mutação nessa fosfatase é encontrada em pacientes com macrocefalia, autismo e epilepsia
(Marchese et al., 2014). É sugerido que a perda de função de PTEN é suficiente para aumentar a
atividade neuronal e em neurônios em desenvolvimento aumentar o input do aferente
DISCUSSÃO GERAL
103
excitatório e levar à convulsões (Luikart et al., 2011; Pun et al., 2012). As alterações
morfológicas encontradas nos trabalhos com deleção de PTEN (Williams et al., 2015) são
semelhantes com as encontradas no nosso modelo de ácido caínico e, poderia ser uma forma
de explicar uma via de interação entre a estimulação com o ácido caínico e a indução do estado
epiléptico nesse modelo. Neurônios com deleção do PTEN são considerados menos excitáveis
por suas propriedades de membrana e aumento da área celular, contudo in vivo, realizam mais
conexões a partir de seus dendritos ramificados e com mais espinhas, resultando em um
aumento de corrente glutamatérgica, maior amplitude de potencial de ação e maiores taxas de
disparo. Essas mudanças intrínsecas aumentam o drive excitatório que supera o aumento de
corrente necessário para despolarizar esses neurônios de maior volume. Além disso, PTEN tem
uma participação na ativação de astrócitos em modelos de injeção do ácido caínico (Cho et al.,
2002), reforçando que existe uma interação entre a via de PTEN e ácido caínico para gerar as
alterações encontradas especificamente nesse modelo.
A alterações ocasionadas pela administração intrahipocampal de pilocarpina foram bem
menos drásticas do que aquelas encontradas no modelo de ácido caínico, porém acompanha a
tendência do modelo de administração da droga por via intraperitoneal. Nos nossos resultados,
as células marcadas 7 dias após a injeção da pilocarpina mantiveram formato e tamanho típicos
da célula granular, mas foi possível observar dendritos basais e células ectópicas em ambos os
hemisférios (Figure 3.4). Células geradas após o SE, com alterações nos dendritos basais e
ectopia, foram observadas no modelo de injeção intraperitoneal em camundongos (Murphy et
al., 2011; Walter et al., 2007) e em ratos (Kron, Zhang e Parent, 2010). Nesses modelos, células
geradas após a injeção de pilocarpina parecem ser mais suscetíveis à ectopia que células
geradas previamente ao insulto, enquanto que outras características, tais como dendritos
basais, são mais prevalentes em células maduras, já existentes no circuito hipocampal no
momento do insulto epileptogênico. Em nossos animais a presença de dendritos basais foi um
evento raro e as taxas de ectopia foram menores que os resultados no experimento
equivalente de ácido caínico. Consideramos portanto que cada modelo promove efeitos
diferentes que podem ser relevantes para a compreensão da doença em humanos. A atividade
DISCUSSÃO GERAL
104
epileptiforme no momento da indução do SE e presença química direta na ativação celular
produzem cascatas de respostas diferentes nos hemisférios afetados.
A geração de um modelo animal de epilesia depende de uma conjunção de múltiplos
fatores. Mas podemos discutir que as características em comum que encontramos entre os
nossos modelos de epilepsia e os descritos na literatura podem ser consideradas elementos
“básicos” para caracterizar a condição. Morte e degeneração neuronal, presença de neurônios
ectópicos, dendritos basais e brotamento de fibras musgosas (não analisadas no presente
trabalho), são as características mais prevalentes entre os modelos e com maior potencial de se
tornarem alvos de terapias. Devido a variedade de tipos da doença em seres humanos, cada
modelo tem uma importância em se aproximar à explicação de fatores paralelos na doença
real, e essas diferenças podem trazer respostas importantes, como por exemplo a sugestão da
alteração de PTEN encontrada em alguns casos de autismo e epilepsia, e dispersão das células
granulares, que nem sempre está presente na ELT.
Em conjunto, nossos resultados sugerem que o balanço entre excitabilidade e inibição
neuronal alterados pelos ácido caínico e pilocarpina têm efeitos diferentes sobre a
diferenciação celular e destino fenotípico dos neurônios pré-existentes e recém-gerados no
hipocampo.
105
Conclusões
Diante dos resultados obtidos e informações presentes na literatura, como discutido no
presente trabalho podemos chegar às seguintes conclusões gerais:
A progressão da linhagem das CTNs do hipocampo adulto não é um evento
unidirecional no qual progenitores intermediários se tornam irreversivelmente comprometidos
com a linhagem neuronal. Progenitores do tipo 2b/3, ao contrário do que é descrito na
literatura, podem retornar aos estágios 2a e 1, readquirindo potencial astrogliogênico;
Ácido caínico e pilocarpina induzem aumento da atividade elétrica neuronal tanto no
ipsilateral quanto no contralateral à injeção das neurotoxinas. No entanto, as alterações da
linhagem celular e neurônios granulares observadas dependem do lado e da droga utilizada;
O aumento da atividade elétrica de neurônios locais do hipocampo após a injeção de
ácido caínico provoca, apenas no lado ipsilateral, um aumento massivo da astrogliogênese na
linhagem de células DCX+, assim como uma dramática dispersão da camada de células
granulares;
Estas alterações no lado ipsilateral à injeção de ácido caínico estão associadas a uma
redução dos interneurônios PV+, que possivelmente reduz a sinalização gabaérgica para os
progenitores e neurônios imaturos;
Os modelos animais de epilepsia utilizados neste trabalho possivelmente representam
diferentes graus/estágios da doença em humanos e, portanto, podem contribuir para o avanço
do entendimento dos mecanismos patofisiológicos da doença.
106
Anexo
REFERÊNCIAS
107
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