alterações morfológicas e estruturais induzidas por um...
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Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Área de concentração: Biologia Celular e Molecular
Alterações morfológicas e estruturais induzidas por um
componente do açafrão (Curcuma longa L.) em células de
melanoma humano em cultura
Marcella Lemos Brettas Carneiro
Goiânia
2007
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E ESTRUTURAIS INDUZIDAS POR UM
COMPONENTE DO AÇAFRÃO (CURCUMA LONGA L.) EM CÉLULAS DE
MELANOMA HUMANO EM CULTURA
Dissertação a ser defendida como
requisito para obtenção do título de
Mestre em Biologia.
MARCELLA LEMOS BRETTAS CARNEIRO
ORIENTADORA: PROFa: DRa: LIDIA ANDREU GUILLO
CO-ORIENTADORA: PROFa: DRa SÔNIA NAIR BÁO
Goiânia, 2007.
iii
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Marcella Lemos Brettas Carneiro
Alterações morfológicas e estruturais induzidas por um componente do
açafrão (Curcuma longa L.) em células de melanoma humano em cultura
Comissão Examinadora:
----------------------------------------------------------------------
Profa: Dra. Lidia Andreu GuilloOrientadora/Presidente
UFG
-----------------------------------------------------------------------Prof: Dr. Cirano José Ulhoa
Membro TitularUFG
------------------------------------------------------------------Dr. José Realino de Paula
Membro TitularUFG
Goiânia, fevereiro de 2007.
iv
Dedicatória
À Deus por ter me concedido a graça de concluir mais uma etapa de minha caminhada com sucesso.
Ao Walfredo, meu marido, grandioso incentivador do meu trabalho, minha fonte perene de inspiração e motivação.
À minha mãe e a minha avó, tenras fonte de carinho e amor, que muito contribuíram na minha formação.
À minha orientadora Professora Dra. Lidia Andreu Guillo e à minha co-orientadora Professora Sônia Nair Báo, pela dedicação e doação concedidas para a elaboração dessa dissertação.
v
Agradecimentos
À Deus Jeová, por ter me concedido magníficas oportunidades que tornaram possíveis todo o percurso da minha formação acadêmica e científica.
À Profª Dra. Lidia Andreu Guillo, pelas boas sugestões, empenho e orientação durante a execução deste trabalho e, sobretudo, por ter participado, ativamente, da minha formação acadêmica, inclusive durante a iniciação científica.
À Profª Dra. Sônia Nair Báo, pelo seu pleno apoio, carinho e interesse que tornaram possíveis muitas análises, essenciais ao trabalho; pela oportunidade de trabalhar no seu laboratório e pela sua competente participação como co-orientadora.
À Universidade Federal de Goiás (UFG), por ter proporcionado a minha formação acadêmica desde a graduação e pelas boas oportunidades que obtive durante os 6 anos em que pertenci ao seu corpo discente.
A todos os colegas do Laboratório de Microscopia Eletrônica que me ofereceram suporte e auxílio durante a execução deste trabalho, e, principalmente, à aluna Elaine Porfírio, pela sua influente colaboração nas análises de microscopia eletrônica de transmissão.
Aos pesquisadores Dra. Andréia H. Otake e ao Dr. Roger Chammas, do Laboratório de Oncologia Experimental, da Universidade de São Paulo, pelas excepcionais contribuições e parceria neste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal (CAPES) pela bolsa concedida durante os 24 meses do mestrado.
À minha avó pelo seu intenso apoio e carinho que me acolheram durante toda a minha formação acadêmica.
E, a todos os outros colegas, amigos e professores que, de uma forma ou de outra, contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
Sucesso
Rir muito e com freqüência;
ganhar o respeito de pessoas inteligentes
e o afeto das crianças;
merecer a consideração de críticos honestos e
suportar a traição dos falsos amigos;
apreciar a beleza, encontrar o melhor nos outros;
deixar o mundo um pouco melhor,
seja por uma saudável criança,
um canteiro de jardim ou
uma redimida condição social;
saber que ao menos uma vida
respirou mais fácil porque você viveu.
Isto é ter sucesso!!!
vii
Ralph Waldo Emerso
viii
SUMÁRIO
RESUMO...........................................................................................................xiiiSUMMARY........................................................................................................xiv
1-INTRODUÇÃO....................................................................................................1
1.1-Origem, progressão e incidência do melanoma cutâneo.................................11.2-Alterações moleculares em tumores................................................................41.2.1-Vias de proliferação celular: implicações do ciclo celular no câncer.....................................................................................................................41.2.2-Vias de morte celular: implicações no câncer ............................................. 71.3-Abordagens terapêuticas empregadas no melanoma e suas limitações.............................................................................................................111.4-Mecanismos de resistência do melanoma.....................................................121.5-Efeitos biológicos de um composto do açafrão (Curcuma longa L.).........................................................................................................................141.5.1-Origem, descrição e constituição de Curcuma longa L...........................................................................................................................141.5.2-Atividades biológicas da curcumina e sua potencial aplicação terapêutica............................................................................................................16
2-REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................18
JUSTIFICATIVA...................................................................................................22
3-OBJETIVOS......................................................................................................23
Objetivo geral.......................................................................................................23Objetivos específicos...........................................................................................23
4-MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................24
4.1-Preparação de soluções................................................................................244.2-Cultura e manutenção das linhagens celulares.............................................244.3-Tratamento das células com curcumina (diferuloilmetano)............................264.4-Ensaios de avaliação de morte celular: análise por citometria de fluxo.........264.4.1-Avaliação de morte e ciclo celular por incorporação de iodeto de propídio................................................................................................................264.4.2--Avaliação da dissipação do potencial transmembranar mitocondrial por JC1.......................................................................................................................274.5 -Análise morfológica e estrutural das células.................................................284.5.1-Análise por Microscopia de Fluorescência..................................................284.5.2-Análise ultra-estrutural por Microscopia Eletrônica de Transmissão (M.E.T).................................................................................................................294.5.3-Análise por Microscopia Eletrônica de Varredura (M.E.V)..........................304.5.4 Análise estatística.......................................................................................31
5-RESULTADOS .................................................................................................32
vii
5.1-Curcumina induz fragmentação do DNA........................................................325.2-Curcumina induz acúmulo de células em G0G1 na concentração de 5 µM em SKMEL.................................................................................................................355.3-Curcumina não altera o potencial transmembranar da mitocôndria em SKMEL 37............................................................................................................385.4-Curcumina induz alterações morfológicas e estruturais em SKMEL 37........405.5-Curcumina induz alterações ultra-estruturais em SKMEL 37........................425.6-Curcumina induz alterações estruturais na superfície da membrana plasmática em SKMEL 37....................................................................................45
6-DISCUSSÕES...................................................................................................47
CONCLUSÕES....................................................................................................53
PERSPECTIVAS..................................................................................................54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................55
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AKT – quinases da proteína B
COX - ciclooxigenases
COX 2 - Ciclooxigenase 2
DMSO - Dimetil Sulfóxido
DAPI - diacetato de 4,6 diamino 2-fenilindol
DNA - Ácido desoxirribonucléico
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
EGFR - Receptor do Fator de Crescimento Epitelial
Faa-1 - Fator de ativação de apoptose-1
GSH - L-γ glutamil-L-cisteinil-glicina
ICAM1 - Molécula 1 de Adesão Intercelular
IL-1 - interleucina 1
IL-6 - interleucina 6
IL-8 - interleucina 8
IL-12 - interleucina 12
iNOS - Óxido Nítrico Sintase
JC1 - iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina
MAPK - proteína quinase ativada por mitógeno
MEM – Meio de Eagle modificado
MDR – multi-resistencia a drogas
NFkB - Fator Nuclear Kappa B
PBS - Tampão fosfato-salina
PI- iodeto de propídio
ix
PKA - proteína quinase A
PKB - proteína quinase B
PKC - proteína quinase C
RNA - ácido ribonucléico
SFB – Soro fetal bovino
TNFα - Fator de Necrose Tumoral α
TGF-beta 1 - Fator de Crescimento-Beta-1
VCAM1 - Molécula-1 de Adesão de Célula Vascular
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Melanoma maligno na fase "in situ"...................................................................1
Figura 2: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 mulheres,
estimadas no ano 2006, segundo a Unidade da Federação (melanoma maligno da pele).
...........................................................................................................................................2
Figura 3: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 mulheres,
estimadas no ano 2006, segundo a Unidade da Federação (melanoma maligno da
pele)...................................................................................................................................2
Figura 4: Pontos de controle do ciclo celular....................................................................6
Figura 5: Vias da ativação de caspases na indução da apoptose pela via de receptores
da morte (via extrínseca) e pela via mitocondrial (via intrínseca)...................................10
Figura 6: Rizoma de Curcuma longa Lin.........................................................................14
Figura 7: Curcuma longa Lin...........................................................................................15
Figura 8: Estrutura química de Curcuminóides extraídos de Curcuma longa.................16
Figura 9: Morfologia da linhagem de melanoma humano SKMEL 37.............................25
Figura 10: Modelos de gráficos e tabela, adquiridos em citômetro de fluxo, após
avaliação de morte e ciclo celular por incorporação de iodeto de propídio.....................32
Figura 11: Curcumina induz aumento de fragmentação do DNA após 24 horas de
tratamento........................................................................................................................33
Figura 12: Curcumina induz aumento de células hipodiploides após 24 horas de
tratamento.
Figura 13: Curcumina induz acúmulo de células no ciclo na subfase G0G1 na
concentração de 5 µM após 24 horas de tratamento.......................................................36
xi
Figura 14: Comparação do percentual de hipodiploidia, de células em G0G1 e de
células em SG2M, entre células tratadas na ausência e na presença de 5 µM de
curcumina.........................................................................................................................36
Figura 15: O aumento de populações de células na subfase G0G1 na dose de 5 µM foi
acompanhado por redução em populações de células na subfase SG2M após 24 horas
de incubação com a curcumina.......................................................................................37
Figura 16: O tratamento de SKMEL 37 com curcumina não induz a dissipação do
potencial transmembranar mitocondrial após 24 horas de tratamento............................39
Figura 17: Curcumina induz alterações morfológicas em SKMEL 37.............................41
Figura 18: Curcumina induz fragmentação do núcleo em células da linhagem SKMEL
37.....................................................................................................................................41
Figura 19: Micrografia eletrônica de transmissão de células da linhagem SKMEL 37 na
ausência de tratamento com curcumina..........................................................................43
Figura 20: Micrografia eletrônica de transmissão de células da linhagem SKMEL 37
após tratamento com curcumina......................................................................................44
Figura 21: Micrografia eletrônica de varredura de células da linhagem SKMEL37 em cultura..............................................................................................................................46
xii
RESUMO
O melanoma humano é uma forma de câncer muito agressiva, que frequentemente adquire resistência a agentes quimioterápicos. Em virtude da baixa eficácia de agentes quimioterápicos empregados até o momento, torna-se primordial o desenvolvimento de novos agentes que sejam menos tóxicos e que não desencadeiem quimiorresistência. A curcumina é um fitoquímico derivado do rizoma do açafrão (Curcuma longa Linn) e é responsável por uma ampla variedade de propriedades farmacológicas incluindo antiinflamatória, antioxidante, antiproliferativa e antitumoral. Este fitoquímico é considerado um agente quimiopreventivo e é farmacologicamente seguro, representando, dessa forma, uma nova perspectiva terapêutica para o melanoma. Neste estudo, avaliamos o efeito da curcumina sobre a proliferação, perfil do ciclo celular, indução de apoptose e dissipação do potencial transmitocondrial em células de melanoma humano, da linhagem SKMEL 37. As células foram tratadas com 5, 10, 15 e 20 µM de curcumina por 24 horas. Análises da indução de fragmentação do DNA, das alterações do perfil das fases do ciclo celular e a avaliação da dissipação do potencial transmitocondrial foram realizadas por citometria de fluxo. As alterações morfológicas e ultra-estruturais foram examinadas por microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Observou-se que a indução de fragmentação do DNA foi proporcional ao aumento da concentração de curcumina. Nossos resultados indicaram que a população de células com DNA fragmentado aumentou de 2.36% (± 0.76), no controle, para 3.53% (±1.61), 7.52% (± 5.05), 11.1% (± 5.43) e 18,43% (± 7.02) em células tratadas com 5, 10, 15 e 20 µM, respectivamente (p<0.001). Células tratadas com 5 µM de curcumina apresentaram acúmulo significativo na subfase G0G1 do ciclo celular, em relação aos demais tratamentos (p<0.001). Ademais, alterações morfológicas e estruturais como blebbing de membrana e fragmentação nuclear, em células tratadas com concentrações acima de 10 µM de curcumina, foram observadas em microscópio de fluorescência. Outros aspectos morfológicos e ultra-estruturais, peculiares à apoptose, tais como compactação e segregação da cromatina, formação de blebs de membrana, de corpos apoptóticos e de vacúolos citoplasmáticos também foram observados em células tratadas com estas concentrações de curcumina. Paralelamente, a análise das células em microscopia eletrônica de varredura corroborou os resultados obtidos em microscopia de transmissão e microscopia de fluorescência, visto que também foram observadas blebbings de membrana, característica esta que evidencia o processo de morte celular por apoptose em SKMEL 37. Além disso, a curcumina não induz alteração do potencial transmembranar da mitocôndria, sugerindo que a via de sinalização de apoptose, induzida por curcumina, não é mediada por esta organela. Nossos dados sugerem, portanto, que a curcumina induz alteração no perfil do ciclo celular e morte por apoptose, por uma via de sinalização que não é mediada pela mitocôndria, em SKMEL 37. Assim, a curcumina representa uma valiosa ferramenta para o desenvolvimento de terapias em tumores como o melanoma humano. Estudos mais aprofundados sobre seus possíveis alvos moleculares, no mecanismo de indução de apoptose, somados à estudos pré-clínicos em pacientes com melanoma, poderão tornar possível o uso clínico da curcumina como um agente quimioterápico.
Palavras-chave: curcumina, melanoma, apoptose, ciclo celular.
xiii
SUMMARY
The human melanoma is a very aggressive form of cancer, tha frequently becomes resistant to chemotherapeutic agents. Due to the low effectiveness of chemotherapeutic agents employed currently, the development of new agents that are less toxic and do not unchain chemoresistance becomes primordial. The curcumin is a phytochemistry derived from rhizomes of the turmeric (Curcuma longa Linn) and is responsible for a large variety of pharmacological properties including antiinflammatory, antioxidant, antiproliferative and anticancer. This phytochemistry is considered a chemopreventive agent and is pharmacology safe, representing a new therapeutical perspective for the melanoma. In this study, we evaluate in a human melanoma cell line (SKMEL 37), the effect of the curcumin on the proliferation, profile of the cell cycle, induction of apoptosis and dissipation of the transmitochondrial potential. Cells were treated with 5, 10, 15 and 20 µM curcumin for 24 hours. Induction of DNA fragmentation, alterations on cell cycle and evaluation of transmitochondrial potential dissipation was assessed by flow cytometry. Morphologic and ultra-structural alterations were examined by fluorescence microscopy and transmission and scanning electron microscopy. It was observed that the induction of DNA fragmentation was proportional to the increase of the curcumin concentration. Our results has indicated that the population of cells with DNA fragmentation increased of 2.36 (± 0,76), in the control, for 3.53% (±1.61), 7,52% (± 5,05), 11,1% (± 5,43) and 18.43% (± 7,02) in cells treated with 5, 10, 15 µM and 20 µM, respectively (p < 0.001). Cells treated with curcumin 5 µM has presented significant accumulation in G0G1 phase, in relation to others treatments (p<0.001). Moreover, morphologic and structural alterations, such as membrane blebbing and nucleus fragmentation, in cells treated with concentrations above to 10 µM of curcumin, has been observed by fluorescence microscopy. Other morphologic and ultra-structural alterations, peculiar to apoptosis, such as compacting and segregation of the chromatin, formation of membrane blebs, apoptotic bodies and cytoplasmic vacuoles has been also observed in cells treated with these concentrations of curcumin. Parallel, the analysis of the cells by electronic scanning microscopy corroborated the results gotten in transmission electron microscopy and fluorescence microscopy since they has been also showed membrane blebbings, characteristic that evidences the process of cellular death by apoptosis. Moreover, curcumin does not induce transmitochondrial potential alterations, suggesting that events in the apoptosis signalling, are not mediated by mitochondria. All together, our data suggest, therefore, that curcumin induces alteration on cell cycle profile and death by apoptosis, in a signalling pathway that isn’t mediated by the mitochondria, in SKMEL 37. Thus, the curcumin represents a valuable tool for the development of therapies in tumors as the human melanoma. Deepened studies on its possible molecular targets, on the mechanism of induction of apoptosis, and more clinical selections, in patients with melanoma, will be able to become possible the clinical use of curcumin as a chemotherapeutic agent.
xiv
Word-key: curcumin, melanoma, apoptosis, cell cycle.
xv
1-INTRODUÇÃO
1.1-ORIGEM, PROGRESSÃO E INCIDÊNCIA DO MELANOMA CUTÂNEO
O melanoma humano (Figura 1) é um tipo de tumor maligno que tem origem
no crescimento desordenado de melanócitos, células localizadas entre a epiderme
e a derme da pele humana. A função destas células está associada à produção de
um pigmento denominado melanina. Este pigmento dá cor à pele e a protege
contra os efeitos nocivos dos raios ultravioletas do tipo A e B, produzidos pelo sol.
A progressão de melanócitos normais para melanócitos névicos pode ser
iniciada pela perda de contato entre os melanócitos e os queratinócitos (Li &
Herlyn, 2000). Queratinócitos são células que se localizam na camada basal da
epiderme, formando interações com os melanócitos para formação da
pigmentação da pele. Uma lesão névica surge devido a uma hiperplasia de
melanócitos, podendo ser classificada em benigna ou maligna. A formação do
melanoma está associada à manutenção de células névicas malignas em estado
proliferativo, ou alternativamente mais resistente à morte celular (Chammas et al.,
2003).
Figura 1: Melanoma maligno na fase "in situ". Características oriundas de melanoma cutâneo, tais como, assimetria, bordas irregulares, coloração variada e diâmetro maior que 6 milímetros são observadas nesta lesão melanocítica. Fonte: http://www.dermatologia.net.
1
As causas do melanoma são variadas, podendo ser externas ou internas ao
organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se
a exposição à luz ultravioleta (UV), intensa e prolongada, que provoca mutações
diretamente no DNA, formando dímeros de bases, isto é, nas regiões do DNA
onde existem duas timinas (T) sucessivas na mesma fita, essas perdem a
capacidade de parear com as adeninas de outra fita, estabelecendo pareamento
T-T. Esses dímeros não se desfazem naturalmente e precisam ser removidos por
um complexo sistema de reparo das células. Na maioria das vezes, as mutações
são corrigidas, porém, em células neoplásicas, elas podem ser reparadas
erroneamente, por substituições de bases diferentes na molécula de DNA
(Camargo & Costa, 2003). As causas internas são geneticamente pré-
determinadas (Perlis & Herlyn, 2004; Inca, 2007).
As etapas da progressão do melanoma estão associadas à capacidade
proliferativa da lesão névica. Na fase inicial, por exemplo, o melanoma está restrito
à camada mais superficial da pele correspondendo, nesse caso, ao melanoma "in
situ" (Figura 1). Neste estádio, o melanoma é caracterizado por um crescimento
horizontal (fase de crescimento radial), onde não houve disseminação de células
tumorais à distância (metástase), sendo, portanto o momento ideal para realização
do diagnóstico e tratamento. Quando o melanoma deixa de ser plano, formando
lesão elevada na pele, é sinal de que também está progredindo em profundidade,
sendo caracterizado por um crescimento vertical. A profundidade atingida e a
espessura da lesão são os parâmetros que definem a gravidade da lesão, pois
aumentam os riscos de metástases para outros órgãos. Esta fase está associada
à invasão dos vasos sanguíneos e linfáticos da pele e, consequentemente,
formação de metástases (Otake, 2005).
A incidência de melanoma é mais expressiva em populações de cor de
pele branca. De acordo com as estimativas, realizadas pelo INCA (Instituto
Nacional do Cancer), em 2006, a incidência do câncer de pele melanoma foi de
2.710 casos novos em homens e 3.050 casos novos em mulheres. As maiores
taxas de incidência, tanto em homens como em mulheres, ocorreram na região
Sul do Brasil, como pode ser observado nas figuras 2 e 3 (Inca, 2007).
2
Figura 2: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 homens, estimadas no ano 2006, segundo a Unidade da Federação (melanoma maligno da pele). Fonte: www.inca.gov.br
Figura 3: Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 mulheres, estimadas no ano 2006, segundo a Unidade da Federação (melanoma maligno da pele). Fonte: www.inca.gov.br
Embora o melanoma de pele represente apenas 4% dos tipos de câncer de
pele, esse tipo de tumor é a forma mais agressiva e severa de câncer de pele. Sua
taxa de letalidade é elevada devido à alta probabilidade da lesão melanocítica
disseminar metástases para outros órgãos. Contudo, o prognóstico do melanoma
pode ser considerado bom, se detectado nos estádios iniciais. Nos últimos anos,
houve uma grande melhora na sobrevida dos pacientes com esse tipo de câncer,
3
principalmente devido à detecção precoce do mesmo. A média mundial de
sobrevida estimada para este tipo de tumor, atualmente, é de 69%, em média
(Inca, 2007).
1.2-ALTERAÇÕES MOLECULARES EM TUMORES
1.2.1-Vias de proliferação celular: implicações do ciclo celular no câncer
Melanomas, como todos os cânceres, surgem devido ao acúmulo de
mutações que levam ao descontrole da transcrição de produtos gênicos críticos
para a proliferação, diferenciação e morte celular. O controle da proliferação celular,
por exemplo, requer a expressão coordenada e interdependente de vários genes,
tais como, o p53, Bcl2, Bax, p21, dentre outros. Mutações gênicas podem levar à
superexpressão e/ou hiperatividade de seus produtos e resultar em proliferação
celular não controlada. Assim, alterações genéticas que acarretam a ativação de
oncogenes ou levam à perda da função de genes supressores de tumor, são
responsáveis pela formação de neoplasias (Miracco et al., 1998; Otake, 2005).
A progressão das células no ciclo celular ocorre em quatro fases
seqüenciais: G1, S, G2 e M. Células na fase G0 (gap0) são diferenciadas e estão
no estado quiescente. Em resposta a estímulos externos específicos, as células
iniciam o ciclo de divisão celular passando da fase G0 (células quiescentes) ou G1
(gap1) para as fases S, G2 (gap2) e finalmente M (mitose), quando se completa a
divisão celular. Na fase G1, ocorre a síntese das proteínas envolvidas com a
maquinaria de duplicação do DNA, tais, como proteínas, enzimas e RNA. Na fase S
ocorre replicação das moléculas de DNA, na fase G2 ocorre a síntese das proteínas
relacionadas com o processo de divisão celular e na fase M (mitose), ocorre a
divisão celular, propriamente dita (Alberts et al., 2004).
Para que o conteúdo genético da célula replique corretamente, é fundamental
a existência de um balanço entre estímulos positivos e negativos que coordenam a
progressão dentro do ciclo celular. Três eventos diferentes podem ocorrer diante de
mutações gênicas, envolvidas no controle do ciclo celular: (1) mecanismos de
reparo destas mutações podem ser acionados; (2) mecanismos de indução de
morte celular programada podem ser ativados e, (3) a alteração gênica pode ser
4
transmitida para células-filhas, considerando que os mecanismos de controle da
proliferação não funcionaram adequadamente (Golsteyn, 2005).
No ciclo celular normal, a divisão da célula, pode ser interrompida em pontos
de restrição (R), conhecido também como check points, que ocorrem durante a
transição das fases G1/S e G2/M, onde eventuais erros genéticos são identificados
e reparados. A existência de R serve como um marca-passo que evita que a célula
progrida no ciclo até que o restante da maquinaria celular necessária esteja pronto.
Quando ocorre a interrupção do ciclo, inicia-se o processo de morte celular por
apoptose. Este processo funciona como um controle negativo do ciclo celular, a fim
de que falhas como mutações, possam ser excluídas, evitando a formação de um
futuro tumor (Alberts et al., 2004).
Durante a fase G0, a célula é sensível às condições do ambiente celular. Se
estas não forem favoráveis, a divisão celular pára em G1. No entanto, se há
estímulos para ocorrência da mitose (M), a célula ultrapassa o primeiro ponto de
restrição (R), e a divisão celular ocorre independentemente de condições
ambientais. Este evento ocorre frequentemente em células neoplásicas, onde os
mecanismos de controle e proliferação celular encontram-se desregulados. Outros
pontos de restrição no início de G2 e na fase mitótica são responsáveis por verificar
a qualidade do DNA celular replicado e a correta distribuição dos cromossomas nas
células-filhas, respectivamente (Figura 4).
A progressão da célula no ciclo, de G0 para G1, é decorrente de um estímulo
mitogênico de fatores de crescimento, como o EGF (fator de crescimento
epidérmico). O estímulo é, em geral, iniciado quando receptores celulares
específicos ligam esses fatores de crescimento, desencadeando uma complexa
cascata de fosforilação e de desfosforilação de enzimas denominadas quinases e
fosfatases, respectivamente, responsáveis pela progressão das células nos pontos
de restrição do ciclo celular (Mangoni & Federico, 2003; Alberts et al., 2004;
Golsteyn, 2005).
5
Figura 4: Pontos de controle do ciclo celular. A progressão das células no ciclo celular ocorre em quatro fases seqüenciais: G1, S, G2 e M. Caso a célula tenha estímulos para proliferar, elas progridem de G0 para G1. Nesta fase, a célula é sensível às condições ambientais. Se estas não forem favoráveis, a divisão celular pára em G1. No entanto, havendo estímulos proliferativos, a célula ultrapassa o ponto R, progredindo para a etapa subseqüente (S). Outros pontos de controle, no início de G2 e de M, são responsáveis pela checagem de outros fatores importantes para a correta progressão das células no ciclo celular. Fonte: Ward, L. S. Arq Bras Endocrinol Metab, v. 46, n. 4, agosto, 2002.
As quinases formam complexos com outras proteínas denominadas ciclinas.
Estas são proteínas fase-específicas do ciclo celular que controlam a ativação e
desativação de complexos, formados por ciclinas e quinases dependentes de
ciclinas (complexos ciclina-Cdk). Os complexos de ciclina-Cdks são responsáveis
pela progressão das células, de forma controlada, em cada fase do ciclo (Mangoni
& Federico, 2003). Já o controle negativo do ciclo celular é exercido, principalmente,
por inibidores de quinase-dependente de ciclina, que inibem a transição entre as
fases G1 e S, do ciclo celular. Em tumores, essas moléculas encontram-se em
níveis reduzidos (Golsteyn, 2005).
São descritas várias ciclinas e Cdks na literatura, sendo que as mais bem
caracterizadas são as ciclinas A, B, C, D, E e cdk1, cdk2, cdk4 e cdk6,
respectivamente. Sabe-se que membros da ciclina D e ciclina E são importantes na
transição da fase G1/S do ciclo celular, enquanto membros da família de ciclina A
são requeridos tanto na fase S como na fase M. Cdk1 é especialmente requerida
para a M, enquanto Cdk2 e Cdk4 são requeridas durante a fase G1/S. Células
6
tumorais apresentam perda da regulação de ciclinas e Cdks, não apresentando,
portanto, uma regulação apropriada dos mecanismos de controle da progressão das
células em pontos de restrição no ciclo celular (Mangoni & Federico, 2003;
Golsteyn, 2005).
1.2.2-Vias de morte celular: implicações no câncer
O processo de morte celular pode ocorrer por três mecanismos distintos:
necrose, autofagia e apoptose. A necrose, também chamada de morte celular
patológica ou acidental, ocorre quando as células são expostas a uma variação
extrema de suas condições fisiológicas, tais como hipertermia, hipoxia, isquemia,
metabólitos tóxicos e irradiação. Estas condições fisiológicas culminam com a perda
abrupta da integridade da membrana plasmática (citólise) e alteração de seus
gradientes eletroquímicos. Ademais, a liberação dos seus constituintes
intracelulares para o meio extracelular estimula a resposta inflamatória e ampliam a
lesão tecidual (Parolin & Reason, 2001; Edinger & Thompson, 2004).
Células necróticas apresentam características bastante diferentes de células
em apoptose. Essas características incluem expansão das células e dos seus
fluidos, dilatação das cisternas de retículos endoplasmáticos, contração seguida de
expansão dos compartimentos internos de mitocôndrias, dispersão de ribossomos e
suave acúmulo de cromatina nuclear (Edinger & Thompson, 2004).
Autofagia e apoptose são consideradas mortes programadas, podendo ser
comparadas, metaforicamente, a um “suicídio celular”. Morte celular por autofagia é
um mecanismo que caracteriza uma espécie de “reciclagem” dos constituintes
celulares. Este tipo de morte celular é estimulado em células que estão passando
por stress bioenergético e parece estar relacionada a uma forma de morte celular
programada. Nesse processo, observa-se formação de vesículas que culminam
com a degradação dos seus constituintes celulares, por ação de enzimas
hidrolíticas (Edinger & Thompson, 2004).
A apoptose é um mecanismo importante para a ativação de um programa de
autodestruição celular intrínseco e controlado. Quando a célula sofre uma injúria,
que não é reparada, ocorre ativação de vias de sinalização, que podem culminar
com a apoptose (Otake, 2005). Esta pode ser induzida por uma variedade de
7
estímulos, como inanição, fatores de crescimento, DNA danificado, infecção viral,
linfócitos citotóxicos, ação citotóxica de drogas antineoplásicas, irradiação
ultravioleta, ativação de citocinas, privação de fatores de sobrevivência e ligações
de indutores químicos a determinados receptores de morte presentes na superfície
celular.
O processo de morte celular por apoptose é fundamental em processos
fisiopatológicos. Disfunções nos mecanismos de controle do sistema, como
apoptose deficiente ou excessiva resultam em uma variedade de condições
patológicas, tais como imunodeficiência, doença auto-imune, doença degenerativa
(Parkinson e Alzheimer) e câncer (Edinger & Thompson, 2004).
Em decorrência de alguns agentes quimioterapêuticos atuarem em
populações de células malignas, induzindo apoptose, nosso foco, neste trabalho,
será dado a este processo de morte celular, visto que a indução de apoptose pode
oferecer grandes perspectivas no tratamento de doenças proliferativas, tais como o
melanoma.
A morte celular programada, por apoptose, desencadeia uma série de
alterações morfológicas e estruturais nas células, dentre elas, podem-se citar
alterações no citoesqueleto celular, contração do volume citoplasmático, formação
de bolhas na membrana citoplasmática, exposição de um lipídio de membrana
(fosfatidilserina) na porção externa da membrana plasmática e condensação da
cromatina nuclear, seguida de fragmentação do DNA, em segmentos de tamanho
proporcional (aproximadamente em 200 pares de bases nitrogenadas).
A exposição de fosfatidilserina na porção externa da membrana celular indica
sinais para o recrutamento de células fagocitárias, como linfócitos T. Estas células
englobam seus fragmentos e completam o processo de degradação das células que
sofreram apoptose (Edinger & Thompson, 2004). Assim, este processo não
desencadeia resposta inflamatória em tecidos adjacentes, já que a autodigestão dos
fragmentos remanescentes das células é controlada por linfócitos, em consonância
com a remoção de células lesadas, sem alteração do microambiente celular (Kerr et
al., 1995; Parolin & Reason, 2001).
Vários genes estão envolvidos no processo de apoptose celular, tais como
p53, Bcl-2, Bax, p16, p15, p19, p21, p27 e p57, desempenhando papéis críticos na
regulação desse tipo de morte celular programada. Algumas proteínas, produtos
destes genes, que regulam a proliferação celular encontram-se ora em níveis
8
aumentados, ou constitutivamente ativadas, ora em níveis reduzidos, no caso de
moléculas inibitórias do ciclo celular. Sabe-se que células tumorais escapam à
apoptose, devido às alterações que ocorrem na regulação de proteínas transcritas
por esses genes (Ward, 2002).
A atividade de uma proteína kinase B (PKB), também está envolvida nos
mecanismos de sinalização que medeiam a regulação da proliferação e
sobrevivência celular. Em células de melanoma, a sobrevivência celular depende
frequentemente da ativação de PKB (Cho & Choi, 2002; Friedlander, 2004; Testa &
Tsichilis, 2005).
Diversas moléculas são reguladas por uma ampla variedade de mecanismos
de sinalização celular durante a apoptose. Este processo pode ser iniciado por
estímulos externos, através de receptores específicos na superfície celular,
chamados receptores da morte, ou por estímulos internos, associados ao estresse
intracelular, tais como lesão do DNA ou perturbações no ciclo celular. Essas
diferentes vias culminam com a ativação de uma cascata de caspases, família de
proteases cisteínas que desempenham papel fundamental no processo de morte
celular (Kumar, 2007; Lamkanfi et al., 2007).
A cascata de caspases é ativada por duas rotas: uma que inicia o estímulo
na superfície celular (via extrínseca) e outra na mitocôndria (via intrínseca).
A ativação de caspases através da rota da superfície celular requer componentes
celulares como receptores de membrana, proteínas adaptadoras e caspase-8. Já a
ativação da mitocôndria requer um fator de ativação de apoptose, o Faa-1, caspase-
9 e citocromo c citosólico.
A via extrínseca, via mediada pela membrana celular, ocorre através da
ativação de receptores de membrana (Figura 5 A), entre eles, será destacado o
receptor Fas. Linfócitos são células que apresentam uma relevante importância na
resposta imune antitumoral. Estas células, agregadas com ligante Fas, se ligam à
célula através do receptor Fas, ativando proteínas específicas (Fas) na superfície
da célula alvo. Logo, proteínas adaptadoras ligam-se na região intracelular das
proteínas Fas agregadas, promovendo agregação de moléculas de procaspase-8,
seguida por ativação de caspases iniciadoras, até então presentes no citoplasma,
na forma de pró-enzimas inativas. Estas, uma vez ativadas, ativam outras caspases
efetoras que atuarão no núcleo celular, desencadeando a apoptose. O receptor Fas
9
funciona, portanto, como um supressor do tumor (Kaji et al., 1994, Parolin &
Reason, 2001; Alberts et al., 2004).
A via intrínseca (Figura 5 B) é sinalizada pela liberação de citocromo c para o
citoplasma. A seguir, o citocromo c se liga a uma proteína adaptadora formando um
complexo (apoptossomo), que ativa caspase-9, que por sua vez, ativa uma cascata
de caspases executoras e, posteriormente, DNAses (enzimas que induzem
fragmentação do DNA) culminando com a morte celular por apoptose (Parolin &
Reason, 2001; Friedlander, 2004; Alberts et al., 2004; Otake, 2005).
Ainda na presença de sinais de estresse intracelular, proteínas pró-
apoptóticas, tais como Bax e Bid, são translocadas do citoplasma para a
mitocôndria, resultando na liberação do citocromo c da mitocôndria para o citosol.
A seguir, o citocromo c forma um complexo como o fator ativador da apoptose 1
(Faa-1), levando à ativação de caspase-9, que ativa caspases efetoras (Parolin &
Reason, 2001)
Figura 5: Vias da ativação de caspases na indução da apoptose pela via de receptores da morte (via extrínseca) e pela via mitocondrial (via intrínseca). (A) A ativação extrínseca é mediada pela membrana plasmática e ocorre quando um ligante, tal como o Fas, se liga e ao seu respectivo receptor na superfície da célula-alvo, ocasionando a ativação de caspase-8. Esta protease induz a ativação de caspases executoras, tais como caspases 3, 6 e 7, que por sua vez, induzem morte celular por apoptose. (B) Já a ativação intrínseca resulta de sinais de estresse intracelular que induzem a liberação de citocromo c e ativação de caspase-9, que por sua vez, induz a ativação das caspases executoras induzindo à apoptose. Ainda, na presença de sinais estresse intracelular pode ocorrer a translocação de Bid, do citosol para a mitocôndria, levando à ativação de caspase-9 e,
A B
10
subsequentemente, à ativação de caspases efetoras, induzindo apoptose. Fonte: Parolin, M. B & Reason, I. J. M. Arq Gastroenterol, v. 38, n. 2, abr./jun., 2001.
1.3-ABORDAGENS TERAPÊUTICAS EMPREGADAS NO MELANOMA E SUAS
LIMITAÇÕES
Atualmente, as modalidades terapêuticas convencionalmente empregadas
para o melanoma abrangem a cirurgia, radioterapia e quimioterapia. A cirurgia é a
mais utilizada e pode ser definitiva quando utilizada em pacientes com tumores
localizados em regiões acessíveis e com lesões pequenas e não metastásicas.
Algumas desvantagens deste método são as complicações pós-operatórias, que
podem gerar seqüelas físicas e funcionais e, em casos extremos, a morte (Lacava &
Morais, 2004).
Já a radioterapia é o tratamento mais utilizado quando a neoplasia está
localizada em áreas que impossibilitam sua remoção parcial ou total através de
intervenção cirúrgica, ou em casos de reincidência após cirurgia. Por acometer
tanto os tecidos tumorais quanto os normais, a radioterapia pode provocar muitos
efeitos colaterais e aumentar a probabilidade de desenvolvimento de cânceres
secundários (Marks et al., 1991).
A quimioterapia, por sua vez, é utilizada no caso de doença sistêmica.
A maioria dos quimioterápicos afeta, direta ou indiretamente, moléculas de DNA de
células em divisão. Os efeitos colaterais advindos do uso de agentes
quimioterapêuticos ocorrem em função do efeito tóxico exercido também sobre
células normais do organismo. Os principais problemas associados com a
administração dos quimioterápicos incluem falta de especificidade da droga ao sítio
patológico e a necessidade de alta dose para atingir alta concentração no local
desejado. Devido à toxicidade das drogas empregadas, diarréia, vômito, náuseas e
perda de cabelo são sintomas observados durante a quimioterapia (Torchilin, 2000).
Dessa forma, o tratamento quimioterápico apresenta ainda muitas limitações para a
curabilidade das neoplasias.
No entanto, existem perspectivas para melhorar a eficácia da quimioterapia
empregando produtos naturais de plantas, os denominados fitoquímicos.
Fitoquímicos, derivados de componentes da dieta alimentar, têm despertado
considerável interesse científico para o combate de doenças humanas,
11
especialmente para doenças cardiovasculares e câncer. A curcumina, um
componente ativo do açafrão (Curcuma longa L.), é um exemplo de fitoquímico
usado na dieta alimentar que apresenta diversas propriedades biológicas, que têm
recebido considerável atenção na comunidade científica (Sharma et al., 2005).
Pesquisas realizadas com compostos de Curcuma longa L. serão descritas na
seção “Revisão da Literatura” e seu mecanismo de ação será abordado no item 1.5
desta introdução (página 14).
Outras formas de tratamento alternativas para o melanoma referem-se a
imunoterapia e terapia gênica. A eficácia destas está ainda em investigação. Uma
da formas de imunoterapia utiliza uma vacina antitumoral, denominada
CâncerVax™, que poderia ser usada como adjuvante no tratamento do melanoma
(www.gbm.org.br). O emprego desta vacina tem como finalidade reduzir o risco das
células tumorais escaparem do reconhecimento imune, o que é bastante comum
ocorrer em células de melanoma. Outra abordagem refere-se à imunoterapia
adoptiva, que consiste na infusão endovenosa de linfócitos imunes específicos, que
reconhecem células tumorais. Embora a taxa de resposta seja promissora, a sua
duração é muito curta. Ainda como terapia experimental, cientistas têm tentado
alterar geneticamente os glóbulos brancos do sangue de pacientes, induzindo essas
células a atacar os tumores. Embora a pesquisa até o momento tenha obtido
sucesso, as perspectivas em longo prazo são imprevisíveis (Romero et. al., 2006).
As inúmeras desvantagens apresentadas, atualmente, pelas terapias
empregadas no tratamento do melanoma e o crescente número de falecimentos em
função desta doença suscita a busca de novas alternativas terapêuticas, que sejam
mais eficientes e menos tóxicas.
1.4-MECANISMOS DE RESISTÊNCIA DO MELANOMA
Um fator crítico no sucesso de agentes quimioterapêuticos está na sua
habilidade em induzir apoptose em populações de células malignas. Alguns estudos
demonstram que a apoptose é um mecanismo comum pelos quais agentes
quimioterápicos exercem sua citotoxicidade (Bush et. al, 2001).
Atualmente, células de melanoma são resistentes à indução de apoptose por
drogas anticancerígenas, tais como cisplatina, vimblastina, tamoxifen e ácido
12
betulínico, não havendo assim um tratamento eficiente para o melanoma
metastático. O índice de resposta dos pacientes a esses tratamentos é baixo,
correspondendo a uma faixa de apenas 30%. Vários mecanismos de aquisição de
resistência do melanoma à quimioterapia têm sido descritos. Um deles é a
capacidade das células de manter baixas concentrações intracelulares das drogas,
devido à extrusão destas drogas por membros da família da glicoproteína P (Pgp) e
MDR (multidrug resistence). Em geral, melanomas acumulam altos níveis destas
proteínas na sua membrana plasmática, atuando como bombas reversas de drogas
para o meio extracelular (Otake, 2005).
A regulação alterada dos mecanismos moleculares envolvidos com a
apoptose celular pode ser outro fator que explica a resistência do melanoma a
vários agentes quimioterapêuticos (Karin & Lin, 2002).
Vários mecanismos estão associados à perda da susceptibilidade da
ativação da apoptose em células tumorais, frente à esses agentes
quimioterapêuticos. Estes mecanismos incluem baixa regulação ou mutação de
alguns genes, como o p53, aumento da expressão de c-myc e de genes
antiapoptóticos como o Bcl2 e mutação de oncogenes como N-ras (Salvucci et al.,
2001).
A resistência à droga e a regulação alterada dos mecanismos moleculares
envolvidos com a apoptose celular são aspectos muito importantes na biologia
tumoral. Em virtude de estes aspectos influenciarem na eficácia terapêutica, é
necessário elucidar novos mecanismos moleculares que tornem tumores
quimiorresistentes, como o melanoma, mais susceptíveis à ativação da morte
celular programada (Zheng et al., 2004).
13
1.5-EFEITOS BIOLÓGICOS DE UM COMPONENTE DO AÇAFRÃO (Curcuma
longa L)
1.5.1-Origem, descrição e constituição de Curcuma longa L
Por toda a história da medicina, produtos de plantas têm demonstrado ser
valiosas fontes para drogas antitumorais, por produzirem uma ampla variedade de
substâncias fornecedoras de um amplo espectro de propriedades biológicas.
Curcuma longa L é considerada uma planta mágica, dada às suas propriedades
terapêuticas e protetoras a nível hepático e cutâneo. A curcumina, extraída do
rizoma de Curcuma longa L. (Figura 6), é um exemplo de substância com
propriedades biológicas associadas a aplicações terapêuticas. Este fitoquímico é
largamente usado, na medicina tradicional indiana para cura de várias doenças, tais
como reumatismo, sinusite, desordens hepáticas e cardiovasculares, câncer, entre
outras. (Mans et al., 2000; Araújo & Leon, 2001; Sharma et al., 2005; Shishodia et
al., 2005).
Curcuma longa L. (Figura 7) é uma planta herbácea, perene, com
aproximadamente 1 metro de altura. Esta planta, de origem asiática, pertence à
família das Zingiberáceas e é amplamente cultivada em regiões tropicais e
subtropicais da Ásia, Índia, China e América Latina. No Brasil, essa planta é
conhecida como açafrão e é comumente usada na culinária como condimento no
preparo de alimentos (Ramsewak et al., 2000; Araújo & Leon, 2001).
Figura 6: Rizoma de Curcuma longa Lin. Fonte: www.jardin-mundani.info
14
Figura 7: Curcuma longa Lin. Fonte: www.pacificbulbsociety.org
Curcuma longa , apresenta na sua composição, turmerina, uma proteína
solúvel em água, óleos essenciais e curcuminóides (Sharma et al., 2005). Existem
três tipos de curcuminóides: curcumina, demetoxicurcumina e
bisdemetoxicurcumina (Figura 8), extraídos de seu rizoma. Neste trabalho foi
utilizado a curcumina, também conhecida como curcumina I (Figura 8A, página 16).
Esta apresenta cor amarela e corresponde de 2-5% do peso bruto do rizoma dessa
planta e é o componente mais abundante e ativo do rizoma de Curcuma longa L.,
seguido de curcumina II (demetóxicurcumina) e curcumina III
(bisdemetóxicurcumina). Estes curcuminóides são compostos fenólicos insolúveis
em água e éter, porém solúveis em etanol, dimetil sulfoxido (DMSO) e outros
solventes orgânicos (Ruby et al., 1995; Ramsewak et al., 2000; Shrishodia et al.,
2005; Maheshwari et al., 2006).
15
Figura 8: Estrutura química de Curcuminóides extraídos de Curcuma longa. (A) Curcumina (B) Demetoxicurmina. (C) Bisdemetoxicurcumina. Fonte: Maheshwari, R. K., Singh, A. K., Gaddipati, J., Srimal, R, C. Life Sciences, v. 78, p.2081–2087, 2006.
1.5.2-Atividades biológicas da curcumina e sua potencial aplicação terapêutica
As propriedades antiinflamatórias da curcumina são conhecidas há bastante
tempo na Índia e na Indonésia (Sambaiah et al., 1982). A curcumina I foi isolada,
pela primeira vez, em 1.842 e sua estrutura (C21H20O6) foi quimicamente
caracterizada em 1.910. Desde então, diversos estudos vêm sendo realizados a fim
de investigar suas atividades biológicas, tais como, sua ação antimicrobiana,
antiinflamatória, imunomoduladora, hipolipodérmica, antioxidante, antitumoral,
anticarcinogênica, dentre outras (Mesa et al., 2000; Araújo & Leon, 2001). Suas
distintas atividades biológicas têm despertado investigações para associar os seus
diversos efeitos biológicos aos seus respectivos mecanismos de ação. A principal
linha de investigação dos efeitos biológicos da curcumina, nos últimos anos, têm
sido conhecer sua atividade antiproliferativa, antitumoral e anticarcinogênica (Bush
et al., 2001).
A atividade antiproliferativa, antitumoral e anticarcinogênica da curcumina
parece associada à sua capacidade de regular alguns alvos moleculares em células
A
B
C
16
neoplásicas, tais como, fatores de transcrição, citocinas, enzimas e genes que
regulam a apoptose celular. No entanto, o mecanismo pelo qual a curcumina exerce
sua atividade antitumoral ainda não é totalmente compreendido. Esta pesquisa foi
idealizada em virtude de observações anteriores realizadas em nosso laboratório
mostrando a alta atividade antiproliferativa in vitro sobre células de melanoma
humano, motivando-nos a compreender o mecanismo de ação da curcumina para
futuros estudos envolvendo animais.
A curcumina representa um enorme potencial terapêutico para o melanoma,
uma vez que apresenta atividade antitumoral e é farmacologicamente segura (Mesa
et al., 2000). Além disso, esse fitoquímico pode reduzir a resistência do tumor à
droga, visto que promove a redução da expressão de proteínas, associadas à
resistência de drogas em tumores, como a MDR (multi-resistência a drogas)
(Shishodia et al., 2005). O uso clínico da curcumina poderia, dessa forma, aumentar
a eficácia da quimioterapia, revelando uma nova esperança para o tratamento de
tumores quimiorresistentes como o melanoma humano.
17
2-REVISÃO DA LITERATURA
As propriedades medicinais da planta Curcuma longa são documentadas há
séculos na medicina chinesa e indiana (revisado por Maheshwari et al., 2006).
Várias propriedades biológicas são atribuídas aos extratos desta planta.
Componentes bioativos extraídos do seu rizoma, conhecidos como fitoquímicos,
tem sido amplamente empregados para cura de diversas afecções cutâneas,
hepáticas, digestivas, entre outras. Na medicina chinesa, por exemplo, os extratos
de Curcuma longa são aplicados a nível tópico, sobre a pele, para a cicatrização de
feridas (revisado por Mesa et al., 2000; Thangapazham, et al., 2006).
As propriedades medicinais de Curcuma longa têm sido atribuídas à
fitoquímicos denominados curcuminóides. A curcumina é o principal curcuminóide
presente no rizoma de Curcuma longa L. Esse curcuminóide foi identificado há
quase dois séculos, mas pesquisas sobre suas propriedades biológicas começaram
a intensificar-se há três décadas. Suas propriedades famacocinéticas têm sido
estudadas desde 1991 e publicações sobre os estudos clínicos realizados com
curcumina datam três anos (revisado por Shishodia et al., 2005; Sharma et al.,
2005; Maheshwari et al., 2006).
A curcumina é um composto polifenólico. Estudos demonstrando a relação
existente entre a estrutura química e as atividades biológicas da curcumina
indicaram que os fenóis e grupos metóxi, existentes na sua composição química, é
que são responsáveis pelas propriedades biológicas que este fitoquímico exerce em
diversas linhagens celulares (Ahsan, et al., 1999; Ramsewak, et al., 2000; Joe et al.,
2004).
As diversas atividades farmacológicas da curcumina, tais como,
antiinflamatória, antioxidante, antibiótica, antiprotozoária, imunomoduladora,
hipolipodérmica, antiproliferativa, antitumoral e anticarcinogênica têm despertado
interesses em muitos pesquisadores para investigação do seu mecanismo de ação
(revisado por Mesa et al., 2000; Ramsewak et al., 2000; Araújo & Leon, 2001; Joe
et al., 2004; Odot et al., 2004; Sharma et al., 2005; Shishodia, et al., 2005;
Maheshwari et al., 2006; Thangapazham, et al., 2006). Existem ainda relatos na
literatura indicando efeitos terapêuticos da curcumina em doenças como diabetes,
AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida), artrite reumatóide, esclerose
18
múltipla, doença de Alzheimer e fibrose cística (revisado por Shishodia, et al.,
2005).
Diversos relatos, descritos na literatura, têm revelado que a curcumina
desencadeia várias atividades farmacológicas, por modular distintos alvos
moleculares, incluindo, fatores de transcrição, enzimas, proteínas do ciclo celular,
citocinas, receptores e moléculas de adesão celular (revisado por Shishodia et al.,
2005).
A curcumina pode inibir a ativação do fator transcrição NFkB (fator nuclear
kappa B) e da enzima iNOS (óxido nítrico sintase). Níveis reduzidos de iNOS e de
seu produto, o óxido nítrico, estão correlacionados com funções antiapoptóticas nas
células. NFkB é constitutivamente ativado em células de melanoma humano e é
responsável por modular a expressão de uma variedade de fatores que interferem
na sinalização da apoptose celular, da inflamação, da angiogênese, do ciclo celular
e da diferenciação. Este fator de transcrição também modula a expressão de
moléculas de adesão, de migração e de sobrevivência celular (Zheng et al., 2004).
Alvos moleculares como o receptor EGFR (receptor do fator de crescimento
epitelial) e proteínas quinases, como MAPK (proteína quinase ativada por
mitógeno), PKA (proteína quinase A), PKC (proteína quinase C) também são
inibidos por curcumina. Estes alvos moleculares estão envolvidos em várias vias de
sinalização relacionada aos estímulos mitogênicos para proliferação celular (Testa
et al., 2005).
Além disso, a curcumina pode inibir moléculas de adesão, como a ICAM-1
(molécula 1 de adesão intercelular) e a VCAM-1 (molécula-1 de adesão de célula
vascular) e ainda de enzimas como a COX-2 (ciclooxigenase 2) . Moléculas como
VCAM-1 e ICAM-1 modulam mecanismos de evasão da resposta imune de células
tumorais, sendo que seus níveis aumentados estão correlacionados com a
progressão do câncer no organismo. COX-2 é uma forma induzida de COX
(ciclooxigenase) que catalisa metabólitos para síntese de prostaglandinas
(moléculas pró-inflamatórias). A expressão aumentada dessa enzima está
associada aos estímulos proliferativos em células malignas e à progressão do tumor
(revisado por Shishodia, et al., 2005).
É descrito também na literatura que a curcumina aumenta a regulação de
proteínas supressoras de tumor como a p53 e p21 e suprime a atividade de
proteínas chaves para a progressão de células no ciclo celular, como as ciclinas D1
19
e B1. Esse fitoquímico também é responsável por reduzir a regulação de proteínas
antiapoptóticas como a Bcl-2 e de proteínas de multi-resistência à droga como a
MDR, que atuam como bombas reversoras de drogas, mantendo baixos os níveis
intracelulares de drogas (revisado por Shishodia et al., 2005).
A principal linha de investigação sobre o potencial terapêutico da curcumina,
nos últimos anos, têm sido conhecer suas atividades antioxidante, antiinflamatória,
anticarcinogênica e principalmente, sua atividade antitumoral. O mecanismo de
ação da curcumina para cada uma destas atividades será descrito a seguir.
Sua atividade antioxidante está associada à sua habilidade em reduzir os
níveis intracelulares de glutationa reduzida (GSH, L-γ glutamil-L-cisteinil-glicina),
enzima envolvida no sistema de defesa ao stress oxidativo nas células (revisado por
Shishodia, et al., 2005).
Outra atividade da curcumina, bastante interessante, está na sua potente
ação antiinflamatória. Este efeito está associado à influência que esse fitoquímico
exerce sob citocinas, eicosanóides (moléculas pró-inflamatórias) e enzimas
proteolíticas, moléculas envolvidas no processo de inflamação celular. Revisões
sobre a atuação da curcumina, na mediação da resposta inflamatória, indicam que
esse curcuminóide pode inibir a produção de TNFα (Fator de Necrose Tumoral α),
IL-1 (interleucina 1), IL-6 (interleucina 6), IL-8 (interleucina 8) e IL-12 (interleucina
12). Já os efeitos da curcumina sobre os eicosanóides podem estar associados à
inibição da formação de ácido araquidônico, importante substrato de eicosanóides.
A curcumina também pode inibir a atividade de enzimas como as COX
(ciclooxigenases) e lipooxigenases e também a produção de mediadores da
resposta inflamatória, como as prostaglandinas (revisado por Joe et al., 2004).
O grande potencial terapêutico da curcumina, como agente quimioterápico e
quimiopreventivo, estão também relacionados ao seu efeito na modulação da
expressão de diversos alvos moleculares. A base molecular do efeito
anticarcinogênico da curcumina é atribuída ao seu efeito sobre fatores de
transcrição, moléculas de adesão, reguladores da angiogênese e moléculas de
sinalização celular, como PKB (proteína quinase B), NFkB e MAPK. Estas
moléculas apresentam regulações alteradas quando são induzidas por agentes
carcinogênicos em mecanismos de transdução de sinais (revisado por Aggarwal et
al., 2003; Thangapazham, et al., 2006).
20
É conhecido também que esse agente suprime a proliferação e progressão
do tumor, por modular a expressão gênica de protooncogenes e por suprimir vários
genes de sobrevivência e de proliferação celular, incluindo Bcl-2, ciclina D1 e IL-6
(revisado por Thangapazham, et al., 2006). Existem evidências sugerindo que a
curcumina também interfere na migração celular. Foi observado que este
fitoquímico bloqueia o fator de crescimento-beta-1 (TGF-β 1), molécula que estimula
a migração e invasão de células (revisado por Joe et al., 2004).
Ainda, estudos pré-clínicos têm revelado o potencial quimiopreventivo da
curcumina em vários tipos de tumor incluindo cólon, duodeno, estômago, próstata e
na carcinogênese de mama (Thangapazham, et al., 2006).
A atividade antitumoral da curcumina provém da sua capacidade em induzir
apoptose em uma variedade de células tumorais. Este fitoquímico inibe a
proliferação celular por induzir apoptose em várias linhagens celulares de tumores,
incluindo melanoma (linhagens A375, B16R, B15F10 e MeWo), linfoma, câncer de
ovário e câncer de mama, o que demonstra seu grande potencial como agente
quimioterapêutico (revisado por Mesa, et al., 2000; Araújo, et al., 2001; Bush, et al.,
2001; Joe, et al., 2004; Odot, et al., 2004; Zheng, et al., 2004; Uddin et al., 2005;
Maheshwari et al., 2006; Shi, et al., 2006; Thangapazham, et al., 2006).
Numerosos estudos realizados com curcumina indicam que esta é
toxicologicamente inerte nas células, não demonstrando ser tóxica em animais ou
humanos, mesmo sob administração de até 8 gramas por dia. Assim, a vantagem
do seu uso está associada ao fato de apresentar baixa toxicidade, no organismo,
em relação a outros quimioterápicos (Ahsan, et al., 1999; Aggarwal, et al., 2002; Joe
et al., 2004; Sharma et al., 2005; Maheshwari et al., 2006).
Todavia, considerando que o desenvolvimento de novas drogas requer
estudos de toxicidade e farmacocinética das mesmas, em conjunto com avaliações
da sua atividade, tanto em modelos in vitro como in vivo, mais estudos devem ser
realizados a fim de elucidar os mecanismos de ação da curcumina, em um número
maior de linhagens celulares e de animais de experimentação, para tornar possível
sua futura aplicação clínica em regimes quimioterápicos (revisado por Sharma et al.,
2005).
21
JUSTIFICATIVA
As elevadas taxas de letalidade do melanoma humano, a crescente
incidência deste câncer e a falta de métodos terapêuticos amplamente eficientes
suscitam a busca de novas alternativas terapêuticas. A curcumina poderia
representar uma nova alternativa terapêutica para tumores quimiorresistentes
como o melanoma. A compreensão do mecanismo de ação deste fitoquímico
poderá contribuir para sua futura aplicação terapêutica em regimes
quimioterápicos.
22
2-OBJETIVOS
Tendo em vista o enorme potencial terapêutico da curcumina para o
melanoma, visamos avaliar o efeito desta substância em cultura de células de
melanoma humano, da linhagem SKMEL 37, esperando contribuir para seu
posterior uso clínico.
Objetivos específicos:
1. Avaliar o efeito da curcumina sob a proliferação e progressão do ciclo
celular em SKMEL 37.
2. Avaliar o envolvimento da mitocôndria na sinalização do processo de
morte celular mediado por curcumina em SKMEL 37.
3. Comparar características morfológicas e ultra-estruturais de células
tratadas com distintas concentrações de curcumina, relacionando-as ao tipo de
morte celular induzido por curcumina em SKMEL 37.
23
4-MATERIAIS E MÉTODOS
4.1-Preparação de soluções
As soluções de PBS (solução tampão de fosfato salina) e EDTA (ácido
etilenodiaminotetracético) foram preparadas por pesagem e dissolução em
quantidade adequada de água deionizada e esterilizadas em unidades filtrantes
Milipore com poros de 0,22 µm.
A solução estoque de curcumina (Fluka, USA) foi preparada por
dissolução de massa adequada em etanol (Merck, USA) e esterilizado por
filtração. A concentração foi calculada através de pesagem de massa adequada
da curcumina e as diluições foram preparadas a partir de uma solução de 10 mM
de curcumina utilizando volume adequado de etanol como solvente. Para o
tratamento das células com diferentes concentrações de curcumina, foi utilizada
a solução estoque 10 mM, variando-se apenas o volume desta solução para
cada tratamento. A solução de curcumina foi mantida a 4ºC protegida da luz.
4.2-Cultura e manutenção das linhagens celulares
A linhagem de células de melanoma SKMEL 37 (Figura 9) empregadas
neste estudo foi obtida por doação do Instituto Sloan-Kettering, NY. As células
estocadas em nitrogênio líquido foram descongeladas e transferidas para
frascos de cultura de 80 cm2 (Nunc Brand Products, USA) e mantidas em meio
de cultura MEM (Sigma, St. Louis, MO), suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, Brasil) e 100 U/µL de penicilina (Gibco BRL,
Argentina) e fungizona (Gibco BRL, Argentina). A linhagem SKMEL 37 foi
mantida rotineiramente em incubadora úmida com 5% de CO2 a 37ºC.
Os repiques eram feitos quando as células atingiam confluência no frasco
de cultura. As células eram então semeadas em densidade inicial de cerca de
30% da confluência e repicadas a cada três dias e mantidas em incubadora
úmida até atingirem um número suficiente para os experimentos. Os repiques
eram realizados da seguinte maneira: as células eram lavadas duas vezes com
solução de PBS-EDTA (137 mM NaCl, 2,7mM KCl, 1 mM Na2HPO4, 2 mM
24
KH2PO4, 1mM EDTA, pH 7,2) e desprendidas da garrafa por ação proteolítica
de solução 0,25% de tripsina-EDTA (Cultilab, Campinas, Brasil) por 2 minutos a
37ºC. A seguir, a ação proteolítica era neutralizada pela ressuspensão das
células em meio MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (v:v).
O número de células para os experimentos era estimado através de contagem
direta em câmara de Neubauer e a avaliação da viabilidade celular era feita pelo
método de exclusão por azul de Tripan.
Quando as células não eram utilizadas para experimentos, o meio de
cultura era trocado três vezes por semana. Os procedimentos de repique,
substituição de meio e tratamentos das células eram realizados em fluxo laminar
para evitar contaminação das células por microorganismos. As ponteiras e
outros materiais utilizados durante as técnicas de cultivo celular eram
rigorosamente esterilizados para este fim. A morfologia da linhagem de
melanoma SKMEL 37 está representada abaixo:
Figura 9: Morfologia da linhagem de melanoma humano SKMEL 37. As células
foram fixadas com metanol 10%, coradas com Giemsa e observadas por microscopia de
campo claro (Leite, 2003). Ampliação: 40X.
Nos períodos em que não eram realizados os experimentos, as células
eram congeladas. O congelamento era feito por ressuspensão das células em
solução de congelamento (meio MEM suplementado com 10% de soro fetal
bovino) e 5% de dimetilsulfoxido (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO) e estocadas em
ampolas de congelamento a 70ºC por 24 horas e transferidas para nitrogênio
líquido.
25
4.3-Tratamento das células com curcumina (diferuloilmetano)
As células (3 X 105) foram semeadas em placas de poliestireno
(Nunc Brand Products, USA) de 9,6 cm2 (~3,1 X 104/ cm2) e mantidas sob
condições de cultura, descritas anteriormente. Transcorridas 24 horas, elas
foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina (5, 10, 15 e 20 µM) e
mantidas em incubadora úmida por 24 horas. Células sem adição de curcumina
e células com adição de 0,5% de etanol filtrado estéril (diluente da curcumina)
foram utilizados como controle do ensaio.
Para realizar os tratamentos das células, utilizamos uma solução estoque
10 mM de curcumina, variando apenas o volume para cada tratamento, ou seja,
foi adicionado 1, 2, 3 e 4 µL, o que correspondia a uma concentração final no
meio de cultura de 5, 10, 15 e 20 µM, respectivamente. A concentração de etanol
em todas as amostras foi de 0,5%, percentual usado na concentração mais
elevada de curcumina.
Após o período de 24 horas de incubação das células com a curcumina,
foram recolhidos os sobrenadantes e as células, aderidas na placa, foram
removidas por ação proteolítica de tripsina.
4.4-Ensaios de avaliação de morte celular: análise por citometria de fluxo
4.4.1-Avaliação de morte celular e das fases do ciclo celular por
incorporação de iodeto de propídio
A análise de morte celular por incorporação de iodeto de propídio (PI)
(Invitrogen), realizada em citômetro de fluxo, permitiu-nos avaliar possíveis
alterações no ciclo celular e, ao mesmo tempo, quantificar a fragmentação de
DNA de células tratadas com curcumina. De acordo com a quantidade de DNA
celular, avaliamos a distribuição das células nas diferentes fases do ciclo celular.
Utilizamos o fluorocromo iodeto de propídio, que intercala nos pares de
bases nitrogenadas do DNA, e, quando excitado por um feixe de luz de
26
comprimento de onda adequado é capaz de emitir fluorescência, cuja
intensidade é proporcional à quantidade de DNA na célula. A morte celular foi
então avaliada através da incorporação deste fluorocromo no DNA das células
após os tratamentos indicados no item 4.3 (página 26).
Para a análise por citometria de fluxo, após coleta por centrifugação, as
células foram suspensas em 1 mL de etanol 70 % (Merck) para permeabilização
por 2 horas ou por até 20 dias a -20ºC. A seguir, foram lavadas com 1 mL de
PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7,2) por
duas vezes, centrifugadas e ressuspensas em 200 µL de solução de PI contendo
200 µg/mL de RNAse (Sigma), 20 µg/mL de PI e 0,1% v:v de Triton X-100
(Sigma) em PBS. Logo, as células foram mantidas em temperatura ambiente por
30 minutos, protegidas de luz, e as amostras foram adquiridas e analisadas em
citômetro de fluxo (FACScan Becton & Dickinson, WinMDI 2.8)
Após a calibração do aparelho, foram analisadas 10.000 partículas por
amostra, em fluxo de cerca de 300 eventos/segundo. O conteúdo de DNA foi
avaliado pela fluorescência vermelha, captada no canal de fluorescência
2 (FL2-H) e analisado em histograma representativo.
O percentual de células analisadas nas diferentes fases do ciclo foi
mensurado utilizando-se o programa Cell QuestTM e os dados foram analisados
estatisticamente por análise de variância (ANOVA) não paramétrica, conforme
descrito no item 4.5.4 (página 31). Os experimentos foram repetidos quatro
vezes e foram realizados em triplicatas.
4.4.2-Avaliação da dissipação do potencial transmembranar mitocondrial por JC1
JC1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine
iodide) (Molecular Probes) é um fluorocromo catiônico que se acumula na
mitocôndria sob a forma de agregados, e este evento é indicado pela mudança
de emissão de fluorescência verde para fluorescência laranja/vermelho.
Enquanto em sua forma monomérica JC1 emite fluorescência na faixa do verde
(530 nm), em sua forma agregada ele fluoresce na faixa do laranja/vermelho
(>590 nm).
27
Esse fluorocromo se difunde livremente para o interior da célula quando o
potencial transmembranar da mitocôndria não está alterado. Quando há
alteração deste potencial, JC1, que se agrega dentro da mitocôndria, flui para o
citoplasma. Isto resulta numa redução da intensidade de fluorescência na faixa
do vermelho/laranja.
Um dos eventos iniciais da apoptose é a despolarização da mitocôndria e
esta é indicada, neste tipo de análise, pela redução da razão da intensidade da
fluorescência vermelha/verde após aquisição das amostras em citômetro de
fluxo.
Esse ensaio nos permitiu avaliar a dissipação do potencial de membrana
da mitocôndria a fim de determinar se o processo de morte celular,
desencadeado por curcumina, em SKMEL 37, é mediado pela mitocôndria. Para
esta análise, o sobrenadante e as células aderidas foram ressuspendidas em
meio de cultura suplementado com 10% de SFB, após o período de incubação
das células com curcumina (descrito no item 4.3, página 26) por 24 horas. A
seguir, foi adicionado às células 0,2 μM de JC1, seguindo por agitação intensa
em vórtex por 20 segundos, para que o JC1 entrasse nas membranas celulares.
Logo, as células foram centrifugadas e lavadas, por duas vezes, em PBS e
incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente e no escuro.
As amostras foram então adquiridas em citômetro de fluxo e a análise foi
feita usando o programa “Cell QuestTM”. Os experimentos foram repetidos duas
vezes e foram realizados em triplicatas.
4.5-Análise morfológica e estrutural das células
4.5.1-Análise por Microscopia de Fluorescência
Utilizamos dois fluorocromos para esta análise: JC1 e DAPI
(4’,6-diamidino-2-phenylindole, dilactate) (Sigma). O primeiro já descrito
anteriormente, é um fluorocromo que se difunde livremente na membrana
citoplasmática e na membrana mitocondrial, sendo visualizado no citoplasma e
mitocôndria. Já o fluorocromo DAPI se difunde para o núcleo celular, corando
preferencialmente o DNA.
28
As células (1 X 105) foram semeadas em lamínulas de vidro, previamente
montadas, em placas de poliestireno (Nunc Brand Products, USA) de 9,6 cm2
(~3,1 X 104 cm2) e mantidas sob condições de cultura. Após o período de
incubação das células com curcumina (descrito no item 4.3, página 26), as
células foram incubadas com 20 μM de JC1, diluído em MEM com 10% de SFB
na proporção 1:200, durante 15 minutos a 37ºC. A seguir, as células foram
lavadas duas vezes em PBS adicionando-se 1 μM de DAPI e incubando-se por
30 minutos, no escuro. Logo, as células foram lavadas duas vezes com PBS,
sendo que na última lavagem, a solução de PBS foi mantida na placa
protegendo-se da luz. Em seguida, as lamínulas foram montadas em lâminas
com glicerol e mantidas no escuro. As células foram finalmente examinadas e
fotografadas em microscópio de fluorescência Nikon Eclipse E6000. Carl
4.5.2-Análise ultra-estrutural por Microscopia Eletrônica de Transmissão (M.E.T)
A análise das células, realizada em microscópio eletrônico de
transmissão, permitiu-nos avaliar as alterações ultra-estruturais induzidas por
curcumina em SKMEL 37. Após os períodos de 6 e 24 horas de incubação com
0, 5, 10 e 15 µM de curcumina, as células foram fixadas com 1 mL de
glutaraldeído 2% e paraformaldeído 2% e 3% de sacarose em tampão cacodilato
de sódio 0,1 M pH 7,2 por 30 minutos. A seguir foram efetuadas três lavagens,
de 15 minutos cada, em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2. A pós-fixação
foi realizada em solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de
sódio (0,1 M, pH 7,2), e solução de ferrocianeto de potássio a 0,8% em tampão
cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,2) por 1 hora. Posteriormente, foram efetuadas
três lavagens, de 5 minutos cada, em água destilada. As células foram
desidratadas em uma série de concentrações crescente de acetona, incluindo
banhos de 30% a 90% por 10 minutos, e a 100%, foram efetuados três banhos
de 5 minutos cada. A seguir, as células foram imersas em mistura de acetona
100% e resina Spurr’s na proporção de 2:1 por 12 horas. Posteriormente, as
células foram novamente imersas na mesma mistura em proporção 1:1 por 6
horas e, em seguida, por mais 6 horas em mistura 1:2. Após este período, as
células foram então colocadas em resina pura onde permaneceram por 6 horas.
29
A inclusão das células na resina pura foi feita nos tubos ependorf mantidos em
estufa, a 60ºC, por três dias, para polimerizar. Após a polimerização, os blocos
foram aparados e seccionados em cortes ultrafinos em ultramicrótomo Reichert,
modelo Supernova. A seguir, os cortes foram coletados em telas de 200 malhas,
contrastados com acetato de uranila a 5% durante 30 minutos, e com citrato de
chumbo por 10 minutos. Os cortes foram examinados em microscópio eletrônico
de transmissão Jeol JEM, modelo 1011, operado a 80 KV e fotografados com
câmera Gatan Ultrascan.
4.5.3-Análise por Microscopia Eletrônica de Varredura (M.E.V)
Através da análise por M.E.V., avaliamos as alterações morfológicas na
superfície das células induzidas por curcumina. Após o período de 24 horas de
incubação com 0, 10, 15 e 20 µM de curcumina, as células foram fixadas com 1
mL de glutaraldeído 2% e paraformaldeído 2% e 3% de sacarose em tampão
cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2 por 30 minutos. A seguir foram efetuadas três
lavagens, de 15 minutos cada, em cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,2). Na
terceira lavagem, as células foram ressuspendidas em 0,5 mL de tampão e
aplicadas em lamínulas, previamente tratadas com poli-L-lisina.
A fixação primária foi seguida de uma pós-fixação em solução de tetróxido de
ósmio (1%) em tampão de cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,2) e solução de
ferrocianeto de potássio a 0,8% em tampão de cacodilato de sódio (0,1 M, pH
7,2) por 1 hora. Posteriormente, foram efetuadas duas lavagens, de 5 minutos
cada, em água destilada. As células foram desidratadas em uma série de
concentrações crescentes de acetona, seguindo o mesmo padrão adotado em
M.E.T. Após a desidratação, procedeu-se a secagem ao ponto crítico de CO2, no
aparelho de Critical Point Dryer CPP030 (Balzers). Logo, as amostras foram
cobertas com uma fina camada de ouro no aparelho de Sputter Coater SCD050
(Balzers), observadas e fotografadas em microscópio eletrônico de varredura
JEOL JSM 840, operado a 10 KV.
30
4.5.4 – Análise estatística
Os dados experimentais, obtidos em citômetro de fluxo, correspondentes
ao item 4.4.1 (página 26), foram analisados estatisticamente por análise de
variância (ANOVA) não paramétrica. Em seguida, foi feito o teste de comparação
múltipla de Bonferroni. O intervalo de confiança adotado foi de 95% e as
diferenças entre os tratamentos foram consideradas estatisticamente
significantes quando o valor de “p” era menor do que 0,05 (p<0,05).
31
5-RESULTADOS
5.1-Curcumina induz fragmentação do DNA
A análise da fragmentação do DNA e do ciclo celular, avaliada através de
incorporação de iodeto de propídio, em citômetro de fluxo, foi baseada na
quantidade de DNA para cada fase do ciclo celular, conforme descrito por
Rabinovitch (1995). Após a aquisição das amostras, o citômetro de fluxo fornece
um gráfico de dispersão (Figura 10 A) e um histograma (Figura 10 B). Este é
demarcado em 4 marcadores: M1, M2, M3 e M4, de acordo com a quantidade de
DNA (unidade arbitrária), observada no eixo x (FL2-H). Os valores percentuais
relacionados a cada marcador também são fornecidos pelo aparelho, após a
análise das amostras (Figura 10 C).
O marcador M1 corresponde às populações de células que apresentaram
fragmentação do DNA (hipodiplóides), o que corresponde às células em
processo de morte celular. Os demais marcadores (M2, M3 e M4) correspondem
às populações de células em GOG1, SG2M e debris, respectivamente.
Figura 10: Modelos de gráficos e tabela, adquiridos em citômetro de fluxo, após avaliação de morte e ciclo celular por incorporação de iodeto de propídio. Os
gráficos e valores são referentes a células após incubação por 24 horas, apenas na
presença de meio de cultura e 10 % de SFB (controle).
A B
C
32
Após 24 horas de tratamento, observamos um aumento na fragmentação
do DNA, em concentrações acima de 10 µM, mostrado com o alargamento da
base correspondente ao marcador M1 (Figura 11).
Figura 11: Curcumina induz aumento de fragmentação do DNA após 24 horas de tratamento. As células SKMEL 37 foram incubadas na ausência, na presença de 0.5% de etanol e na presença de 5, 10, 15 e 20 µM de curcumina, por 24 horas. A avaliação de morte celular foi feita com iodeto de propídio e a porcentagem de células hipodiploides (M1) foi analisada. Em concentrações acima de 15 µM de curcumina, observamos um aumento significativo em relação ao controle (p<0.001) na porcentagem de células hipodiploides.
FL2-H
N.ºde eventos
Controle Etanol (0.5%)
Curcumina 5 M Curcumina 10 µM
Curcumina 15 µM Curcumina 20 µM
33
O percentual de células hipodiploides (M1) foi colocado em um gráfico em
barras (Figura 12) para melhor visualização dos resultados encontrados.
05u
M10
uM
15 uM
20 uM
0.02.55.07.5
10.012.515.017.520.022.5
05uM10uM15 uM20 uM
Concentração de curcumina
% d
e hi
podi
ploi
dia
Figura 12: Curcumina induz aumento de células hipodiploides após 24 horas de tratamento. As células SKMEL 37 foram incubadas na presença de diferentes concentrações de curcumina. Cada ponto representa média±erro padrão de ensaio de quatro experimentos independentes realizados em triplicatas. Os asteriscos são referentes às diferenças estatisticamente significantes entre células tratadas (asteriscos) em relação ao controle (ausência de curcumina). Os dados foram analisados por ANOVA não paramétrica e pelo teste de Bonferroni.
Observou-se que células sem adição de curcumina apresentaram um
baixo percentual de hipodiploidia 2.36% (± 0.76) em relação às células tratadas
(Figura 12). Células incubadas na presença de etanol (diluente da curcumina)
também não demonstraram efeito citotóxico (Figura 11).
Nossos resultados indicam que não há diferença significativa no número
de células hipodiplóides entre o controle e concentrações de 5 µM de
curcumina. Porém, observamos um aumento na proporção de células
hipodiploides à medida que aumentamos a concentração de curcumina. A
população de células com DNA fragmentado aumentou de 2.36%
(± 0.76), no controle, para 7.52 % (± 5.05), 11.1 % (± 5.43) e 18,43% (± 7.02)
em células tratadas com 10, 15 e 20 µM, respectivamente. Em células tratadas
com 10 (p<0,01), 15 e 20 µM (p<0,001) de curcumina, o percentual de células
hipodiplóides, aumentou significativamente em relação ao controle (Figura 12).
***
***
*
34
Este resultado sugere que o número de células hipodiploides é dependente da
concentração de curcumina.
5.2-Curcumina induz acúmulo em G0G1
Na figura 13 observamos que células tratadas com 5 µM de curcumina
por 24 horas, apresentaram acúmulo, estatisticamente significante, na subfase
G0G1 do ciclo celular, em relação aos demais tratamentos. Observou-se,
claramente, que há acúmulo em G0G1 e redução em SG2M, para esta
concentração, embora o percentual de hipodiploidia seja insignificante (Figura
14).
Células tratadas com 5 µM de curcumina talvez não entrem em fase
proliferativa (G1), permanecendo em estado quiescente (G0). No entanto, caso
as células entrem em fase proliferativa (G1), o acúmulo em G0G1 poderia indicar
que a transição G1/S foi bloqueada, sem, contudo, provocar morte celular.
Para concentrações mais elevadas de curcumina (10, 15 e 20 μM),
verificamos um decréscimo na proporção de células em G0G1 (Figura 13). Isto
poderia ser atribuído ao fato de que células submetidas a concentrações mais
elevadas de curcumina, escapam dos pontos de checagem do ciclo celular, o
que explicaria sua progressão por G0G1 e posterior morte, indicada pelo
respectivo aumento de hipodiploidia.
35
05 u
M10
uM15
uM20
uM0
25
50
7505 uM10 uM15 uM20 uM
Concentração
% d
e G
OG
1
Figura 13: Curcumina induz acúmulo na subfase G0G1 do ciclo celular após 24 horas de tratamento. As células SKMEL 37 foram incubadas por 24 horas na presença de diferentes concentrações de curcumina, conforme indicado no gráfico. Cada ponto representa a média±erro padrão de ensaio de quatro experimentos independentes realizados em triplicatas. A diferença entre o percentual de células, tratadas com 5 µM é estatisticamente significante (asteriscos) em relação ao controle (p<0,001) e em entre os tratamentos com 10 µM (p<0.01), 15 µM (p<0.001) e 20 µM (p<0.001). Os dados foram analisados por ANOVA não paramétrica e pelo teste de Bonferroni.
Figura 14: Comparação do percentual de hipodiploidia, de células em G0G1 e de células em SG2M, entre células tratadas na ausência e na presença de 5 µM de curcumina. Cada ponto representa a média±erro padrão de ensaio de quatro experimentos independentes realizados em triplicatas. A diferença entre o percentual de células tratadas com 5 µM é estatisticamente significante (asteriscos) em relação ao controle (p<0,001) para GOG1 e SG2M.
***
***
***
36
O aumento percentual de populações de células na subfase G0G1, na
concentração de 5 μM de curcumina, foi acompanhado por redução do
percentual de populações de células em SG2M. Células tratadas com 20 μM de
curcumina também apresentaram uma redução significativa no percentual de
população de células em SG2M (Figura 15).
05 u
M10
uM15
uM20
uM0
10
20
30
4005 uM10 uM15 uM20 uM
Concentração de curcumina
% d
e SG
2M
Figura 15: O aumento de populações de células na subfase G0G1 na concentração de 5 µM foi acompanhado por redução em populações de células na subfase SG2M após 24 horas de incubação com a curcumina. Cada ponto representa a média±erro padrão de ensaio de quatro experimentos independentes realizados em triplicatas. A diferença entre o percentual de células, tratadas com 5 µM é estatisticamente significante (asteriscos) em relação ao controle (p<0,001). Foi constatada diferença significativa entre o tratamento com 20 µM de curcumina e na ausência de curcumina (p<0,01).
*** ***
37
5.3-Curcumina não altera o potencial transmembranar da mitocôndria
As concentrações de curcumina empregadas no ensaio de JC1 foram
estabelecidas com o ensaio de morte celular por incorporação de iodeto de
propídio, através da análise de fragmentação do DNA (fração de células
hipodiploides), como indicado na figura 12 (página 34).
A despolarização da membrana da mitocôndria foi avaliada usando o
fluorocromo JC1. Os gráficos de dispersão de pontos (Figura 16) representam
dois parâmetros: intensidade de fluorescência verde (FL1) e intensidade de
fluorescência vermelha (FL2). A freqüência de células com dissipação do
potencial transmembranar mitocondrial é estimada através da análise destes
parâmetros, e, é demonstrada pela redução da intensidade da fluorescência
vermelha de JC1 (leitura em FL2).
A fim de facilitar a análise dos resultados, os gráficos de dispersão,
obtidos nesta análise, foram demarcados em quatro quadrantes: superiores
direito (SD) e esquerdo (SE) e inferiores direito (ID) e esquerdo (IE). Antes da
análise das amostras, no citômetro de fluxo, os controles de viabilidade máxima
foram mantidos no quadrante superior da direita (SD), o que corresponde às
células onde não houve alteração do potencial transmitocondrial.
Assim, as alterações no potencial transmembranar da mitocôndria
correspondem à redução da intensidade de fluorescência de FL2, que pode ser
verificada com o deslocamento de células do quadrante superior direito (SD)
para o quadrante inferior direito (ID).
Nossos resultados não indicaram deslocamento de população de células
do quadrante SD para o ID em células tratadas com 0.5% de etanol (controle)
(Figura 16 a). Esta mesma observação foi verificada em células tratadas com
curcumina (Figura 16 b, c, d).
Observou-se que a intensidade da fluorescência vermelha não reduziu
nas populações de células analisadas, demonstrando que a curcumina não
altera o potencial transmembranar mitocôndria, no período de 16 horas e nas
concentrações de 5 a 20 μM. Este efeito sugere, portanto, que o processo de
morte celular, desencadeado por esta droga, não é mediado por esta organela. m
38
Figura 16: O tratamento de SKMEL 37 com curcumina não induz a dissipação do potencial transmembranar mitocondrial após 24 horas de tratamento. As células
SKMEL 37 foram incubadas por 24 horas na ausência e na presença de curcumina.
(a) Controle. (b) 10 μM de curcumina. (c) 15 μM de curcumina. (d) 20 μM de curcumina.
A população de células no quadrante superior direito corresponde às células em que
não houve dissipação do potencial transmembranar mitocondrial. O ensaio foi realizado
em triplicatas e repetido duas vezes. Os resultados de ambos os ensaios foram
semelhantes.
A
FL1-H
FL2-HF
Etanol 0.5% Curcumina 10 μMb
FL1-H
FL2-HF
Curcumina 15 μM Curcumina 20 μMc d
a
IE ID
SE
IE
SDSE
IE
SD
ID
SE
IE
SD
ID
SDSE
ID
39
5.4-Curcumina induz alterações morfológicas e estruturais em SKMEL 37
Células incubadas por 16 horas em meio de cultura com 10% de SFB e
0,5% de etanol, sem adição de curcumina, não apresentaram alterações
morfológicas (Figura 17 a). O tratamento com curcumina tornou as células mais
arredondadas, isto poderia estar associado às alterações estruturais decorrentes
de morte celular e possivelmente às alterações no citoesqueleto (Figura 17 b, c e
d). Foi observada formação de blebs de membrana em células tratadas com
15 µM de curcumina (setas) (Figura 17 d). Além destas alterações morfológicas,
observamos a fragmentação do núcleo em células tratadas com as
concentrações de 10 e 15 μM de curcumina (Figuras 18 a e b). Os resultados
obtidos indicam, provavelmente, que a curcumina induz morte celular por
apoptose, já que alterações como formação de blebs de membrana e
fragmentação do DNA são características peculiares de eventos apoptóticos.
40
A: Etanol 0,5 % B: Curcumina 5 µM
Curcumina 10 µM Curcumina 15 µM
Figura 17: Curcumina induz alterações morfológicas nas células e formação de ‘blebs’ de membrana em SKMEL 37. As células SKMEL 37 foram tratadas com diferentes doses de curcumina por 16 horas, incubadas com JC1 e visualizadas em microscópio de fluorescência. (a) Controle; (b) 5 μM de curcumina. (c) 10 μM de curcumina; (d) 15 μM de curcumina. As setas indicam as alterações morfológicas nessas células.
Curcumina 10 µM Curcumina 15 µMFigura 18: Curcumina induz fragmentação do núcleo em células da linhagem SKMEL 37. As células foram tratadas com 10 e 15 µM de curcumina por 16 horas, incubadas com DAPI e visualizadas em microscópio de fluorescência. (a) 10 μM de curcumina; (b) 15 μM de curcumina. As setas indicam a fragmentação nuclear.
5.5 - Curcumina induz alterações ultraestruturais em SKMEL 37
a
dc
b
ba
10 µm10 µm
10 µm 10 µm
25 µm25 µm
41
Métodos que avaliam a apoptose são claramente necessários para
aplicação de agentes indutores de apoptose, visto o papel central que esse
mecanismo exerce na quimioterapia (Fraker et al., 1995). Assim, a análise
ultraestrutural, foi essencial para avaliar alterações celulares decorrentes da
morte induzida por curcumina.
Observações ao microscópio eletrônico de transmissão mostraram
detalhes ultra-estruturais de mudanças morfológicas decorrentes do processo de
morte celular induzidas por curcumina em SKMEL 37. Células desta linhagem
são geralmente células ricas em projeções de superfície de membrana (Figuras
19 a, b). O núcleo, a membrana plasmática e as organelas citoplasmáticas das
células, na ausência do tratamento com curcumina, permaneceram íntegros
(setas), após a incubação em meio de cultura com 10% de SFB, por 6 e
24 horas (Figura 19 a, b).
Não foram observadas alterações morfológicas em células tratadas com
5 µM de curcumina por um período de 6 horas (Figura 20 a). Porém, células
tratadas incubadas por 24 horas, nesta mesma concentração, apresentaram
uma discreta segregação da cromatina para a periferia do núcleo (Figura 20 b).
Em concentrações acima de 10 µM de curcumina, observou-se características
decorrentes de processos de morte celular, tais como segregação de porções de
heterocromatina para a periferia do núcleo e formação intensa de vacúolos
(Figura 20 c-e). Observou-se também formação de fragmentos celulares,
eliminados na superfície das células (corpos apoptóticos) em células tratadas
com 10 e 15 µM de curcumina por 24 horas (Figura 20 d, f). Essas mudanças
morfológicas, induzidas por curcumina, possivelmente, indicam que o processo
de morte celular, verificado anteriormente no item. 4.4.1 (página 26), é mediado
por apoptose.
Durante o processo de morte celular mediado por necrose há alterações
nas organelas citoplasmáticas. Não observamos quaisquer alterações nas
organelas celulares nos distintos tratamentos (Figura 20 a-f). Todavia,
observamos um intenso acúmulo de vacúolos em células tratadas com
curcumina (Figura 20 c-e), que, possivelmente, fazem parte do sistema
autofágico, decorrente de eventos de apoptose celular, ainda não muito bem
esclarecidos.
42
Figura 19: Micrografia eletrônica de transmissão de células da linhagem SKMEL 37 na ausência de tratamento com curcumina. Secção transversal mostrando a integridade do núcleo, das membranas e organelas celulares na ausência de tratamento com curcumina. (a) As células foram mantidas por 6 e (b) 24 horas em incubadora úmida em meio de cultura com 10% de SFB sem adição de curcumina. Abreviações: (n) núcleo, (cr) cromatina, (mt) mitocôndria, (ct) citoplasma, (mp) membrana plasmática.
ba
nn
cr
mt
mp
mpct
2 µm
43
Figura 20: Micrografia eletrônica de transmissão de células da linhagem SKMEL 37 após tratamento com curcumina. Secção transversal mostrando as mudanças morfológicas induzidas por curcumina, tais como, segregação da cromatina para a periferia do núcleo (setas), formação de vacúolos (setas tracejadas) e corpo apoptótico (asterisco). As células foram tratadas com 5 μM de curcumina por 6 (a) e 24 horas (b); 10 μM de curcumina por 6 (c) e 24 horas (d); e 15 μM por 24 horas (e, f). Abreviações: (n) núcleo, (cr) cromatina, (mt) mitocôndria.
5.6-Curcumina induz alterações estruturais na superfície da membrana plasmática em SKMEL 37
a b
c d
ef
nn
n
n
mt
*
*
cr
cr
*
*
2 µm
cr
cr2 µm
1 µm
44
A análise das células em microscopia eletrônica de varredura nos permitiu
visualizar as mudanças na superfície das células, induzidas por curcumina,
complementando, dessa forma, os resultados, obtidos anteriormente, através da
análise em M.E.T.
Células que não receberam tratamento com curcumina possuem muitas
projeções citoplasmáticas (Figura 21 a), característica já observada na análise
em M.E.T. (Figura 19). Todavia, células tratadas com 10, 15 e 20 µM de
curcumina, por um período de 24 horas, apresentaram redução destas projeções
e formação de blebs na superfície da membrana plasmática (setas),
característica decorrente do processo de morte celular por apoptose (Figura 21
b-d).
Dessa forma, nossos resultados, obtidos através da análise de M.E.T. e
M. E. V., indicam que a curcumina, possivelmente, induz morte celular por
apoptose.
45
Figura 21: Micrografia eletrônica de varredura de células da linhagem SKMEL37 em cultura. Curcumina induz formação de blebs de membrana (setas) em SKMEL 37, característica decorrente de eventos de morte celular por apoptose. As células foram incubadas por 24 horas na presença e ausência de curcumina. (a) SKMEL 37 na ausência de curcumina (controle); (b) na presença de 10 μM; (c) na presença de 15 μM e (d) na presença de 20 μM de curcumina. (a-c) barra=2 µm; (d) barra=3µm. As setas indicam os blebs na superfície da membrana plasmática.
6- DISCUSSÃO
cccSD
dSDF
aSDF
bSDF
cSDF
46
O melanoma humano é uma forma de câncer muito agressiva, que
frequentemente torna-se resistente a agentes quimioterápicos. Em virtude da baixa
eficácia de agentes quimioterápicos empregados atualmente, torna-se necessário o
desenvolvimento de novos agentes que sejam menos tóxicos e que não
desencadeiem quimiorresistência nessas células.
A cada dia, novos compostos naturais ou sintéticos farmacologicamente ativos
contra os diversos tipos de tumores são descritos. Polifenóis, por exemplo, têm sido
extensivamente estudados, e estes estudos têm sugerido sua propriedade tanto de
prevenir como de tratar o câncer. A curcumina, agente utilizado na nossa pesquisa, é
um composto polifenólico. Estudos relatam que seus grupos fenólicos e metóxis e, a
presença de dois grupos cetona, na sua estrutura química, são aspectos muito
importantes para suas atividades biológicas (revisado por Joe et al., 2004).
O potencial terapêutico da curcumina, como um agente antitumoral, tem sido
amplamente discutido na literatura (revisado por Shi et al., 2006). Diversos estudos
têm demonstrado o efeito inibitório da curcumina na tumorigênese e no crescimento
do tumor em células in vitro e in vivo, através da indução de apoptose celular em
várias linhagens de células tumorais, indicando seu grande potencial terapêutico para
o câncer (revisado por Shi et al., 1999; Mesa, et al., 2000; Araújo, et al., 2001; Bush,
et al., 2001; Aggarwal et al., 2003; Odot, et al., 2004; Zheng, et al., 2004; Joe, et al.,
2004; Uddin et al., 2005; Maheshwari et al., 2006; Shi, et al., 2006; Thangapazham,
et al., 2006). Recentemente, vários trabalhos têm mostrado que a curcumina
apresenta perfis de citotoxicidade distintos, conforme o tecido celular e a
concentração deste fitoquímico (revisado por Sharma, et al., 2005).
No presente estudo, constatou-se o efeito inibitório da curcumina sob a
proliferação de células de melanoma humano, da linhagem SKMEL 37. Vários
estudos têm relatado o efeito inibitório da curcumina na proliferação de várias
linhagens celulares, incluindo, câncer de ovário, câncer de mama, linfoma e
melanoma (Simon et al., 1998; Zheng et al., 2004; Odot, et al., 2004; Uddin et al.,
2005; Shi et al., 2006).
Observamos que a curcumina induziu baixo percentual de fragmentação do
DNA em células tratadas com 5 µM de curcumina, mas o contrário foi notado em
células tratadas com 10, 15 e 20 µM. Nossos resultados indicam, portanto, que o
47
percentual de hipodiploidia, associado ao seu efeito antiproliferativo, é proporcional à
concentração de curcumina. Esta observação está de acordo com vários relatos
descritos na literatura (Simon, et al., 1998; Zheng, et al., 2004; Uddin, et al., 2005;
Shi et al., 2006).
Atualmente, sabe-se que a compreensão dos mecanismos de regulação do
ciclo celular é essencial para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos, que
visem tornar às células susceptíveis à apoptose, como ocorre em regimes
quimioterápicos (Zheng, et al., 2004).
Neste estudo, observou-se que a curcumina altera o perfil do ciclo celular,
bloqueando a progressão das células no ciclo celular na fase do ciclo GOG1. Este
efeito é, contudo, dependente da concentração de curcumina. Enquanto foi verificado
acúmulo na fase G0G1 no ciclo celular, na concentração de 5 µM de curcumina, por
outro lado, foi notado um decréscimo na proporção de células, nesta mesma fase,
para concentrações acima de 10 µM.
Possivelmente, na concentração de 5 µM de curcumina, os mecanismos de
reparo celular devem ser acionados, como se estivesse ocorrendo, por exemplo, uma
deprivação de nutrientes para as células. Este mecanismo evitaria a progressão
destas células no ciclo e, sua posterior morte. Assim, nesta concentração de
curcumina, as células não morrem, mas ocorre uma contenção destas no ciclo
celular. Por outro lado, células submetidas a concentrações mais elevadas (acima de
10 µM) de curcumina escapariam de pontos de checagem, no ciclo celular, devido à
sua citotoxicidade mais intensa. Isto, provavelmente, explicaria a progressão de
células tratadas com 10, 15 e 20 µM de curcumina em G0G1 e posterior morte,
indicada pelo respectivo aumento da hipodiploidia nestes tratamentos.
Vários trabalhos têm demonstrado o efeito da curcumina no ciclo celular, tanto em
células em cultura como em modelos animais (Chen & Huang et al., 1998; Zheng, et
al., 2004; Uddin, et al., 2005). Observações descritas na literatura indicam que a
curcumina induz apoptose por bloquear a progressão das células, em várias fases do
ciclo celular, de maneira dependente da concentração, do tempo e também do tecido
celular (Karunagaran, et al., 2005; Su et al., 2006).
Chen & Huang demonstraram que para baixas concentrações (10-6 M), a
curcumina induz acúmulo nas fases GO-G1/G2/S e para altas concentrações (10-4 M),
ocorre indução de apoptose, em células musculares de vasos sanguíneos, o que
poderia fornecer suporte aos nossos resultados (revisado por Joe et al., 2005).
48
Entretanto, encontramos relatos de que a curcumina induz acúmulo, na fase G2/M
do ciclo celular, em células de câncer de mama da linhagem MCF-7 bem como em
linhagens de células de melanoma humano A375 e MeWo (Simon et al., 1998, Zheng
et. al. 2004). Ainda, recentes estudos demonstraram que a curcumina também induz
acúmulo em G2/M e apoptose em células de câncer de ovário humano, resistentes à
cisplatina (Weir, et al., 2007).
Um estudo realizado por Quin & Ng, (2002) demonstrou que a cisplatina, um
agente amplamente empregado na quimioterapia, também interfere na progressão
das células no ciclo celular, em células de hepatoma. Este estudo indicou que em
altas concentrações, a cisplatina induz um acúmulo de células em G1(transitório) em
períodos de tratamento abaixo de 24 horas e, após este período, o estudo indicou
que as células entram em apoptose.
O mecanismo pelo qual a curcumina bloqueia as células, na concentração de
5 µM, em G0G1, ainda não foi esclarecido por nosso grupo. Possivelmente, este
efeito da curcumina, estaria relacionado à inibição de quinases e cdks (Golsteyn,
2005). Alguns estudos têm relatado que a curcumina inibe o tumor e induz apoptose
por suprimir genes de sobrevivência e de proliferação celular, tais como Bcl-2 e
ciclina D1 e c-myc. A redução de c-myc, por exemplo, pode resultar em contenção na
subfase G1 no ciclo celular, impedindo a progressão para fase S e, eventualmente,
levando à morte celular por apoptose (revisado por Thangapazham, et al., 2006).
Dessa forma, novos estudos devem ser realizados a fim de elucidar o mecanismo
molecular, no qual a curcumina induz apoptose e contenção em G0G1.
São descritos na literatura vários eventos associados à indução de apoptose, por
curcumina, incluindo inibição de mecanismos de sinalização, envolvendo Akt e NFkB.
Tais moléculas estão relacionadas à contenção de células no ciclo celular (revisado
por Sharma et al., 2005). Um alvo molecular importante envolvido na proliferação,
sobrevivência celular, invasão, angiogênese e metástase é o NFkB Recentemente,
vários estudos têm demonstrado que a curcumina inibe a ativação de NFkB
(Aggarwal, et al., 2003; Joe, et al., 2004; Zheng, et al., 2004; Sharma et al., 2005;
Shishodia, et al., 2005; Singh & Khar, 2006; Thangapazham, et al., 2006).
Ainda, nossos resultados demonstraram que a curcumina induz alterações
morfológicas e estruturais, tais como formação de blebbings de membrana e
fragmentação do DNA, em células tratadas com concentrações de curcumina acima
de 10 µM. Além disso, outros aspectos morfológicos ultra-estruturais, peculiares à
49
apoptose, como condensação e segregação da cromatina para a periferia do núcleo,
formação de corpos apoptóticos e ausência de mudanças ultraestruturais nas
organelas citoplasmáticas, também foram observados com estas concentrações de
curcumina. Paralelamente, a análise das células em microscopia eletrônica de
varredura corroborou os resultados obtidos em microscopia de transmissão e
microscopia de fluorescência, visto que também foram observadas blebbings de
membrana, característica que evidencia o processo de morte celular por apoptose em
SKMEL 37.
Também observamos um intenso acúmulo de vacúolos citoplasmáticos em células
tratadas com concentrações de curcumina acima de 10 µM. Esta observação é
descrita, por alguns autores, como decorrente de uma vacuolização autofágica (Boya
et al., 2005; Pólo et al., 2005). Recentemente, os processos de morte celular por
autofagia têm despertado as atenções de muitos pesquisadores, visto que diferentes
tipos de células tumorais sofrem autofagia após várias terapias antitumorais (Kondo &
Kondo, 2006).
Contudo, os vacúolos observados, em células tratadas com concentrações de
curcumina acima de 10 µM, certamente são precedentes à apoptose, já que a
literatura também têm descrito que a formação de vacúolos autofágicos, é uma das
características que pode ocorrer no processo de apoptose. Além disso, estudos têm
indicado que a autofagia e a apoptose fazem parte de processo de morte celular
programada e ambos podem estar intrinsecamente interligados (Cho & Choi, 2002;
Edinger & Thompson, 2004; Boya et al., 2005; Pierron et al., 2005, Pólo et al., 2005).
Sabe-se que a morte celular por apoptose é um processo ativo mediado por vários
mecanismos de sinalização, cuja ativação pode ser iniciada por uma variedade de
estímulos intracelulares e extracelulares. Numerosos fatores associados com esses
mecanismos de sinalização incluem caspases, dentre diversos outros fatores (Cho &
Choi, 2002).
As caspases são enzimas fundamentais para o processo de indução de apoptose.
Uma rota de ativação de caspases pode ser iniciada na superfície celular por
estímulos apoptóticos (via extrínseca). Fas-L têm demonstrado induzir a cascata de
caspase por se ligar e ativar seu receptor de membrana (Fas). Esta ligação permite a
associação desse complexo com caspase-8 e, subsequentemente, sua ativação, que
leva à ativação de caspases executoras, tais como a caspase-3 (Cho & Choi, 2002).
50
A mitocôndria pode ser um outro sítio onde estímulos para apoptose podem
ocorrer por sinalização que também medeia a ativação de caspases (via intrínseca).
Esta organela desempenha um papel central no mecanismo de apoptose, em
decorrência desta liberar citocromo c para o citosol, o que culmina com a ativação de
caspase-9 e, subsequentemente da cascata de caspases executoras (Cho & Choi,
2002). As caspases executoras são responsáveis pela ativação de DNAses e,
consequentemente, à apoptose.
Sobretudo, os dois mecanismos de sinalização (intrínseca e extrínseca) para
ativação de caspases podem, algumas vezes, estar interconectados. A caspase-8,
por exemplo, pode não só clivar uma cascata de caspases, como também outros
substratos de proteínas, como a proteína Bid. Esta molécula se move para a
mitocôndria e estimula a liberação de citocromo c no citoplasma, ativando a
caspase-9 (Cho & Choi, 2002).
Nossos resultados não demonstraram alteração do potencial transmembranar
mitocondrial, sugerindo que o processo de apoptose, induzido por curcumina, não é
mediado pela mitocôndria. Em virtude do processo de morte celular, induzido por
curcumina, ser decorrente de apoptose e, considerando que este processo não é
mediado pela via intrínseca, aventa-se a hipótese de que a sinalização, envolvida
neste processo de morte celular, em SKMEL 37, deve estar associada à via
extrínseca. Contudo, futuros ensaios, a fim de esclarecer esta hipótese, poderão
determinar a atividade enzimática de caspases 8, em SKMEL 37, após o tratamento
com curcumina.
Estudos realizados por Bush et al. (2001) e Anto et al. (2002) demonstraram que a
curcumina induz apoptose, através do receptor Fas e ativação de caspase 8. Por
outro lado, outros estudos têm demonstrado que a curcumina induz alterações no
potencial de membrana da mitocôndria, processo que culmina com a liberação de
citocromo c e ativação de caspase 3 (revisado por Sharma et al., 2005; Su et al.,
2006; Tan, et al., 2006).
No presente estudo, a curcumina mostrou interferir na progressão das células no
ciclo celular e induzir apoptose. Sabe-se que o sucesso de agentes
quimioterapêuticos estaria vinculado à potencialidade em induzir apoptose em células
malignas (Syng-ai et al., 2004). Assim, compostos que previnem a progressão das
células no ciclo celular, e induzem apoptose, como a curcumina, podem ser usados
51
como reguladores negativos da proliferação celular no tratamento do câncer, inclusive
do melanoma (Chen & Huang, 1998).
As plantas continuam sendo importantes para o desenvolvimento de novas
drogas, por possuírem uma larga variedade de substâncias químicas, com ações
farmacológicas. Considerando o fato de a curcumina ser um constituinte da dieta
natural e ser farmacologicamente segura, sua aplicação torna-se cada vez mais
promissora. Destacamos, portanto, a emergente importância de pesquisas nesta
área, a fim de promover o desenvolvimento de terapias que envolvam a curcumina no
tratamento do câncer, incluindo do melanoma.
52
CONCLUSÕES
O melanoma humano é uma forma de câncer muito agressiva, que
frequentemente torna-se resistente a agentes quimioterápicos. Em virtude da baixa
eficácia dos agentes quimioterápicos empregados torna-se primordial o
desenvolvimento de novos agentes que sejam menos tóxicos e que não
desencadeiem quimiorresistência.
Nossos resultados indicaram que a curcumina interfere na progressão das
células no ciclo celular, induzindo acúmulo na subfase G0G1 em SKMEL 37, na
concentração de 5 µM. Além disso, este agente induziu morte celular por apoptose,
em concentrações acima de 10 µM, por mecanismos que não são mediados pela
mitocôndria. A curcumina representa um enorme potencial terapêutico para o
melanoma, visto que atua como um agente indutor de apoptose e interfere na
progressão de células no ciclo celular. Estes aspectos são importantes para a eficácia
de agentes quimioterapêuticos.
53
PERSPECTIVAS
As plantas continuam sendo importantes no descobrimento de novas drogas.
A curcumina, isolado do rizoma da planta Curcuma longa L., representa um enorme
potencial terapêutico para o melanoma, visto que é considerada farmacologicamente
segura e um agente quimiopreventivo. Porém, estudos rigorosos do seu efeito
antitumoral em modelos de experimentação animal e linhagens celulares in vitro
devem ser realizados a fim de elucidar seu mecanismo de ação. Isso implica,
intrinsecamente, esclarecer alguns dos seus alvos moleculares nas vias de
sinalização de apoptose, como o receptor EGFR, o fator de transcrição NFkB,
proteínas como a Bcl-2, p53, Bax, PKB, MAPK e enzimas como ciclinas, iNOS e
caspases 3 e 8. Estas análises somadas à estudos pré-clinicos em pacientes com
melanoma, poderão tornar possível o uso clínico da curcumina como um agente
quimioterápico.
Nesse sentido, um estudo piloto em pacientes com melanoma está sendo
delineado em colaboração com o Ambulatório de Cabeça e Tórax do Hospital Araújo
Jorge de Goiânia.
54
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