AGENTES OXIDANTES E ANTIOXIDANTES

Introduo As molculas de oxignio diatmico na atmosfera terrestre so as maiores promotoras

de reaes nas clulas vivas. Exceto aqueles organismos que so especialmente adaptados para

viver sob condies anaerbicas, todos os animais e plantas requerem oxignio para uma

eficiente produo de energia (Halliwell & Gutteridge, 1989).

O surgimento do oxignio deve ter sido acompanhado pelo aparecimento da camada de

oznio (O3) na alta atmosfera, e a absoro dos efeitos danosos da radiao ultravioleta pela

camada de oznio provavelmente permitiu a evoluo dos mais complexos organismos

terrestres (Halliwell & Gutteridge, 1989). O oxignio o elemento que, na classificao

peridica dos elementos qumicos, pertence famlia 6A, cujo nmero atmico e massa atmica

so 8 e 16, respectivamente, e que possui 8 eltrons distribudos nas suas camadas orbitrias.

Metabolismo do oxignio Normalmente, em torno de 95 a 98% do oxignio absorvido pelos organismos aerbicos

reduzido, formando-se gua na cadeia respiratria atravs do transporte de eltrons na

mitocndria, bem como no retculo endoplasmtico, onde o sistema enzimtico citocromo, no

processo de fosforilao oxidativa, procede a reduo tetravalente do O2 pelo sistema citocromo

oxidase, fornecendo simultaneamente 4 eltrons para o oxignio, que se reduz diretamente

gua:

O2 + 4H+ 4e- 2H2O

As fontes que cedem os ctions de hidrognio e os eltrons para a reao so,

basicamente, o NADH, o FADH e a ubiquinona ou coenzima Q (Halliwell & Gutteridge, 1989).

Todavia, como j referido, de 2 a 5% do O2 reduzido univalentemente, processo em que uma

molcula recebe apenas um eltron, o qual vai ocupar um dos orbitais externos, ao mesmo

tempo em que o outro continua no parelhado, produzindo intermedirios altamente reativos,

denominados Espcies Reativas de Oxignio - ERO, que algumas vezes constituem os radicais

livres. Forma-se ento a primeira espcie txica reativa de oxignio, o superxido, conforme

esquema:

Seminrio apresentado pelo aluno FERNANDO KUSS na disciplina BIOQUMICA DO TECIDO ANIMAL, no Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no primeiro semestre de 2005. Professor responsvel pela disciplina: Flix H.D. Gonzlez.

O2 + e- O2-

Radical livre

Um Radical Livre nada mais do que qualquer tomo, molcula ou on que possui um

ou mais que um eltrons livres na sua rbita externa. Essas partculas, formadas por eltrons

livres ou no pareados tem uma instabilidade eltrica muito grande, e por esta razo, mesmo

tendo meia vida muito curta, apresentam grande capacidade reativa, o que pode acontecer com

qualquer composto que esteja prximo, a fim de captar um eltron desse composto para sua

estabilizao, independente de ser uma molcula, uma clula, ou tecido do organismo, a partir

do que, acontecem reaes em cadeia de leso celular. Devido a esta caracterstica,

denominado de substncia oxidante. O oxignio tem a sua atividade fundamental no

metabolismo celular aerbico. Desta forma, a formao de Radicais Livres pelo organismo em

condies normais inevitvel, pois so necessrios no processo de respirao celular que

ocorre nas mitocndrias ("usinas energticas") das clulas, a fim de gerar o ATP (energia).

Tambm os Radicais Livres, produzidos pelos macrfagos e neutrfilos (glbulos brancos de

defesa), so usados contra bactrias e fungos invasores do organismo, produzindo ao lesiva

estes microrganismos.

Um eltron desemparelhado pode se associar com tomos isolados (hidrognio ou ons

metlicos), ou, ainda, com molculas (acares, protenas, lipdeos, DNA), o que resulta em um

processo de relevncia biolgica (Slater, 1984; Halliwell, 1987). Por outro lado, os radicais

livres j foram relacionados a vrias doenas humanas e participam como componentes

fundamentais em muitas, o que mostra quo grande o dano oxidativo causado por eles

(Halliwell & Gutteridge, 1985).

A formao dos ERO se d primeiramente pelo o radical superxido (O2-), que pode ser

dismutado em perxido de hidrognio (H2O2) ou mesmo atravs de ao cataltica, pela atuao

da enzima superxido dismutase (SOD). No organismo existem duas SODs principais, uma

citoplasmtica, que a CuZnSOD e outra, mitocondrial, que a MnSOD, esta contendo

Mangans e aquela contendo Cobre-Zinco na mesma molcula. A importncia da SOD pode ser

demonstrada pelo fato de ser a enzima mais abundante do organismo, ao mesmo tempo em que

tambm a quinta protena mais abundante neste mesmo organismo (Halliwell & Gutteridge,

1989). O grfico seguinte demonstra como ocorre a formao das ERO.

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Figura 1, Formao das EROS

SOD Superxido dismutase, Cat Catalase, O2- Superxido, O2 Oxignio, GSSH Glutationa Oxidada, GSH Glutationa Peroxidase, H2O gua, OH Radical Hidroxila, GSH Glutationa Reduzida, H2O2 Perxido de Hidrognio.

Tabela 1: Espcies reativas de oxignio (ERO).

O2- nion superxido ou radical superxido

HO2 Radical perhidroxil

H2O2 Perxido de hidrognio

OH Radical hidroxila

RO Radical alcoxil

ROO Radical peroxil

ROOH Hidroperxido orgnico (ex.: lipoperxido)

1O2 Oxignio singlet

RO Carbonila excitada Fonte: (Sies, 1991)

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Antioxidantes O organismo possui sistemas naturais de eliminao de Radicais Livres, enzimticos ou

no, que so os chamados "Varredores de Radicais Livres, produzindo a sua eliminao ou

ento impedindo sua transformao em produtos mais txicos para as clulas. O efeito

prejudicial dos Radicais Livres ocorre quando eles esto em quantidade excessiva no

organismo, ultrapassando a capacidade do organismo de neutraliz-los com os seus sistemas

naturais. Esses sistemas enzimticos de defesa so compostos pelas seguintes enzimas:

Glutation-Peroxidase (que necessita do Selnio), Catalase, Metionina-Redutase e Superxido-

Dismutase (h vrios tipos, e os 2 principais necessitam de Zinco e Cobre, e Mangans), os

quais combatem, no organismo os seguintes Radicais Livres: Perxido de Hidrognio,

Superxido, Oxignio Single, on Hidroxila, xido Ntrico e xido Nitroso.

Os Antioxidantes no enzimticos, em sua maioria so exgenos, ou seja, necessitam

ser absorvidos pela alimentao apropriada. Os principais podem ser divididos em: Vitaminas

Lipossulveis (vitamina A, vitamina E, beta-caroteno), Vitaminas Hidrossolveis (vitamina C,

vitaminas do complexo B),e os oligoelementos (Zinco, cobre, selnio, magnsio etc.), os

bioflavonides (derivados de plantas), etc. Segue Tabela 2 das ERO relacionadas aos seus

respectivos antioxidantes.

Tabela 2. ERO e antioxidantes.

Antioxidantes ERO

Endgenos Exgenos

Superxido (O2-) Superxido dismutase (SOD):

a) citoplasmtica: Zinco-Cobre

b) mitocondrial: Mangans

Vitaminas, zinco, cobre, mangans,

picnogenol, EDTA

Perxido de hidrognio

(H2O2)

Catalase Fe2+

Perxido lipdico (COOH-) Glutationa peroxidase, selnio,

cistena

Vitamina E, selnio

Radical hidroxila (HO ) Vitamina C, picnogenol, dimetil sulfxido, EDTA, cido dimercapto

succnico e manitol

Oxignio singlet (1O2) Betacaroteno

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Ao das ERO nos sistemas biolgicos

Peroxidao lipdica A peroxidao lipdica o processo atravs do qual as ERO agridem os cidos graxos

polinsaturados dos fosfolipdeos das membranas das clulas, desintegrando-as e permitindo,

desta feita, a entrada dessas espcies nas estruturas intracelulares. A fosfolipase, ativada pelas

espcies txicas desintegra os fosfolipdeos, liberando os cidos graxos no saturados (Halliwell

& Gutteridge, 1989), resultando nas seguintes aes deletrias dos perxidos lipdicos:

Ruptura das membranas celulares (bombas NA/K e Ca/Mg); Mutaes do DNA - cido desoxiribonuclico; Oxidao dos lipdeos insaturados; Formao de resduos qumicos como o malondialdedo; Comprometimento dos componentes da matriz extracelular, proteoglicanos, colgeno e elastina.

Os perxidos lipdicos possuem poder de ao maior do que as outras espcies txicas

primrias de O2 (O2-, H2O2, OH , O2), atingindo facilmente alvos mais distantes. A lipoperoxidao deve ter tambm, um papel muito importante na proliferao celular,

especialmente em clulas tumorais. H autores que sugerem que os produtos da lipoperoxidao

esto envolvidos no controle da diviso celular, sendo que a peroxidao de lipdeos est

inversamente relacionada com o crescimento tumoral (Gonzalez, 1992).

Defesa antioxidante Os antioxidantes que representam a defesa dos organismos contra as espcies reativas

de oxignio so divididos em dois tipos principais, os no enzimticos e os enzimticos.

Antioxidantes no-enzimticos Alguns nutrientes essenciais podem atacar diretamente os radicais de oxignio. A

vitamina E (alfa-tocoferol) o maior antioxidante lipossolvel presente em todas as membranas

celulares e, portanto, atua na proteo contra a lipoperoxidao (Kay et al., 1986). Ela pode

reagir diretamente com uma variedade de oxiradicais, como o superxido, a hidroxila, etc., e

tambm com o oxignio singlet (Machlin & Bendich, 1987). A vitamina E foi primeiramente

relatada em 1922, nos Estados Unidos, por Evaris e Bishop, que demonstraram ser liposolvel e

tambm fator essencial para reproduo normal em ratos. A purificao deste fator revelou que

ele composto da famlia dos tocoferis. Quatro tocoferis so conhecidos, porm o alfa-

tocoferol o mais importante biologicamente e os termos alfa-tocoferol e vitamina E so quase

intercambiveis na literatura (Halliwell & Gutteridge, 1989).

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Primeiramente, o alfa-tocoferol inativo reage com o oxignio singlet e poderia, portanto,

proteger a membrana contra essa espcie. Durante a sua ao antioxidante (destruindo a cadeia

de lipoperoxidao) nas membranas, o alfa-tocoferol consumido e convertido em forma de

radical.A vitamina E pode tambm proteger contra a peroxidao modificando a estrutura da

membrana (Halliwell & Gutteridge, 1989).

A vitamina E, localizada perto do citocromo P-450 no fosfolipdeo da membrana, varre

os radicais livres formados no citocromo P-450. A seguir, a vitamina C reduz o radical tocoferil.

Os carotenides, principalmente o beta-caroteno, podem funcionar como precursores da

vitamina A. So absorvidos pelos intestinos, e devem tambm atuar como antioxidantes. Tm,

portanto, duplo papel, diminuem a formao do oxignio singlet in vivo, e ajudam a remover

aqueles j formados (Halliwell & Gutteridge, 1989).

A vitamina A tem pouca ao antioxidante e incapaz de agir sobre o oxignio singlet, mas seu

precursor, o beta-caroteno, o mais eficiente ligante desta forma reativa de oxignio encontrada

na natureza e pode agir como antioxidante. O beta-caroteno, um pigmento presente em todas as

plantas, pode ser encontrado em membranas celulares, inclusive nos lipossomos (Machlin &

Bendich, 1987).

A vitamina C (cido ascrbico), hidrossolvel e tambm age contra os radicais livres e

o oxignio singlet. O cido ascrbico participa ainda da regenerao da forma reduzida e

antioxidante da vitamina E (Halliwell & Gutteridge, 1985). O cido ascrbico puro slido,

branco, cristalino e muito solvel em gua. Plantas e animais podem sintetiz-lo, com exceo

de humanos, primatas e cobaias, que no conseguem e necessitam obt-lo na dieta (Halliwell &

Gutteridge, 1989). O cido ascrbico necessrio in vivo como cofator de vrias enzimas,

sendo as mais conhecidas a prolina-hidroxilase e a lisina-hidroxilase, envolvidas na biossntese

do colgeno. A deficincia do ascorbato na dieta humana causa o escorbuto. A mais

impressionante propriedade qumica do ascorbato a sua habilidade para agir como agente

redutor (doador de eltrons).

Existe, ainda, uma srie de outros antioxidantes no enzimticos que participam da

defesa contra as espcies reativas do oxignio nos sistemas biolgicos como, por exemplo, a

ubiquinona, a ceruloplasmina, o cido rico, a taurina, os flavonides e outros compostos

fenlicos de origem vegetal (Halliwell, 1990; Sies, 1991).

A glutationa (GSH) um marcador da sade celular e sua queda indicativa de leso

oxidante. Seu dficit acarreta diminuio da resistncia s drogas e radiaes, da capacidade de

reverso de tumores e da sntese do ascorbato em animais. A glutationa um tripeptdio

composto de aminocidos no essenciais, descrita como um importante agente antioxidante

(Halliwell & Gutteridge, 1985).

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A melatonina um antioxidante conhecido, produzido pela glndula pineal e seu

principal hormnio foi descoberto por Lerner em 1958. Tambm produzido em outros tecidos,

tais como retina e intestino grosso (Guyton, 1973).

Recentemente, a melatonina foi descrita como participante da funo imune dos

organismos e como um potente antioxidante. Exercendo a funo de antioxidante, a melatonina

parece desencadear uma proteo substancial contra os radicais livres que so gerados em uma

variedade de situaes experimentais, incluindo a injria por esquemia/reperfuso. Por essa

razo, ela vem sendo utilizada terapeuticamente em cirurgias e transplantes (Reiter &

Maaestroni, 1999).

Alm destes, h vrios nutrientes essenciais de origem mineral, que participam do

processo antioxidante em associao com enzimas. So eles, zinco, cobre, mangans, selnio e

ferro (Halliwell & Gutteridge, 1985).

Antioxidantes enzimticos Antioxidantes so quaisquer substncias que, quando presentes em pequenas

concentraes, comparadas com aqueles substratos oxidveis, significativamente retardam ou

inibem a oxidao deste substrato e podem agir em diferentes nveis da seqncia oxidativa. Em

1954, Gershman e Gilbert propuseram que a maioria dos efeitos danosos causados pelas

concentraes elevadas de oxignio nos organismos vivos podia ser atribuda formao de

radicais livres. Entretanto, essa idia no despertou interesse de muitos pesquisadores at a

descoberta, em 1968, de uma enzima que especfica para a remoo cataltica de um radical de

oxignio (Mc Cord & Fridovich, 1969). Essa enzima denominada superxido dismutase,

juntamente com outras duas catalase e glutationa peroxidase so as principais defesas

antioxidantes que atuam nos organismos superiores (Halliwell & Gutteridge, 1989).

possvel que a superxido dismutase (SOD) seja substncia com efeitos anti-

envelhecimento reais, podendo atuar positivamente sobre todos os processos degenerativos

(Hendler, 1990). A superxido dismutase (SOD) tem papel fundamental na defesa do organismo

contra as espcies reativas de oxignio, pois atua na remoo do radical superxido. Antes da

sua descoberta, a SOD j havia sido descrita por alguns autores como uma protena que contm

cobre, mas nenhuma atividade cataltica lhe havia sido atribuda (Halliwell & Gutteridge, 1985).

Aps o trabalho de McCord (1969), entretanto, com a determinao de sua funo na

dismutao do radical superxido (O2-), seu papel foi estabelecido, e at hoje, apesar de

inmeras pesquisas realizadas com esta enzima, nenhum outro substrato foi descrito, mostrando

a sua especificidade para o superxido (Halliwell & Gutteridge, 1985). A forma que contm

cobre e zinco, denominada de superxido dismutase cobre-zinco dependente (CuZnSOD),

muito estvel e parece estar presente em praticamente todas as clulas eucariticas (plantas ou

animais). A CuZnSOD tem um peso molecular de 32000 e constituda de duas subunidades

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proticas idnticas, com um tomo de cobre e um de zinco em cada uma delas. O Zn no

funciona no stio cataltico, mas aparece para estabilizar a enzima. Essa concluso foi extrada

de experincias nas quais os metais foram removidos dos stios ativos e recolocados em outros,

sozinhos ou em conjunto (Halliwell & Gutteridge, 1985).

A superxido dismutase dependente do mangans (MnSOD) uma protena de cor rosa,

cujo peso molecular de 40.000 e que contm mangans nos stios ativos. A sua atividade

diminui em pH alcalino. No inibida pelo cianeto, nem pelo di-etil-di-hidrocarbonato.

destruda pelo clorofrmio + etanol (no sobrevive ao mtodos tpicos da purificao para a

CuZnSOD). A atividade da MnSOD em relao a CuZnSOD depende do tecido e das espcies

onde atuam. A remoo do Mn dos stios ativos causa perda da atividade cataltica, no podendo

ser reposto por nenhum on de transio, pois perde a sua atividade funcional. As seqncias de

aminocidos de todas as MnSOD, em todas as espcies, so parecidas e no esto relacionadas

com a CuZnSOD (Halliwell & Gutteridge, 1989). A forma CuZnSOD apresenta-se mais

resistente variaes de temperatura e desnaturao por substncias como cloreto de

guanidina, duodecil sulfato de sdio, ou uria (Halliwell & Gutteridge, 1985).

Quanto a enzima glutationa peroxidase (GPx), esta foi descoberta por Mills em 1959,

em tecidos de mamferos. No se observa sua presena em plantas ou bactrias, embora possa

ser encontrada em algumas algas e fungos (Halliwell & Gutteridge, 1985). As clulas animais

contm dois tipos de glutationa peroxidase, sendo que um deles selnio dependente, enquanto

o outro no.

O primeiro tipo capaz de reduzir qualquer hidroperxido orgnico, alm do H2O2.

Essa forma possui peso molecular de 81.000, uma protena tetramrica e possui um tomo de

selnio em cada subunidade. O segundo tipo, que no depende do selnio, tem peso molecular

de 35.000, dimrico e est apto a reduzir qualquer hidroperxido orgnico, menos o H2O2.

A GPx encontra alta atividade no fgado, moderada atividade no corao, pulmo e

crebro, e baixa atividade nos msculos (Halliwell & Gutteridge, 1989). Na maioria dos

animais, a enzima dependente de selnio responsvel pela maior parte da atividade da GPx,

mas a proporo entre as duas formas varia muito entre as diferentes espcies, bem como de

tecido para tecido em uma mesma espcie. Em ratos, a distribuio da GPx tem sido

extensamente estudada e, em hepatcitos a GPx selnio dependente est localizada

principalmente no citosol e na matriz mitocondrial (Mannervik, 1985). O pH timo para a GPx

prximo de 8,0, mas a enzima continua ativa com valores elevados. Sua atividade mnima

em pH abaixo de 6,0 (Mills, 1959).

A enzima catalase esta presente na maioria das clulas aerbicas, sendo que em animais

se encontra principalmente no fgado, rins e eritrcitos. rgos como crebro, corao e

msculo esqueltico contm, no entanto, pequenas quantidades da enzima (Halliwell &

Gutteridge, 1985). Os nutrientes mais importantes coadjuvantes da catalase so o ferro e os

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tocoferis (vitamina E), que se acham distribuidos na membrana celular, na fase hidrofbica. A

catalase evita o acmulo de metahemoglobina e decompe e perxido de hidrognio, um

produto txico do metabolismo, em gua e oxignio molecular (Gaetani et al., 1989). Alm de

seu papel como espcie reativa de oxignio, e, portanto, causador de estresse oxidativo, o H2O2

em excesso causa oxidao da hemoglobina e, conseqentemente, diminuio das concentraes

de oxignio, o que pode acarretar infeces, formao de lceras e at necrose (Wieacker et al.,

1980).

A enzima catalase tem peso molecular de 240.000 e, quando purificada, apresenta

quatro subunidades, cada uma contendo um grupamento (Fe III protoporfirina), ligado ao seu

stio ativo (Wieacker et al., 1980). Com relao ao pH, pode-se observar uma diminuio da

atividade da enzima abaixo de pH 4,0. Na faixa de 4,0 a 8,5, a atividade da catalase permanece

constante, sendo que acima desse valor volta a decair (Chance, 1952). Experimentos tm sido

realizados para avaliar a competio entre as enzimas catalase e glutationa peroxidase em

eritrcitos. Segundo alguns autores, a catalase a enzima que se encarrega de fazer a converso

de altas concentraes de H2O2 em gua e oxignio. Quando o perxido de hidrognio est

presente em baixas concentraes (condies fisiolgicas normais), entretanto, a glutationa

peroxidase que se encarrega de transform-la em gua (Halliwell & Gutteridge, 1985).

Abreviaturas e smbolos CuZn SOD = Superxido dismutase dependente de cobre e zinco

DNA = cido desoxiribonuclico

ERO = Espcies reativas de oxignio

GPx = Glutationa peroxidase

GSH = Glutationa reduzida

GSSG = Glutationa oxidada

H2O2 = Perxido de hidrognio

HO = Hidroxila Mn SOD = Superxido dimutase dependente de mangans

NADP = Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato, forma reduzida

NADPH = Nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato, forma oxidada

O2 = Dioxignio; oxignio molecular

O2- = Superxido 1 O2 = Oxignio Singlet

RNAm = cido ribonucleico mensageiro

RO = Radical alcoxil ROO = Radical Peroxil ROOH = Hidroperxido Orgnico

SOD = Superxido dismutase

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Literatura citada

GAETANI, G.F.; GALIANO, S.; CANEPA, L.; FERRARIS, A.M.; KIRKMAN, H.N. Catalase and glutathione peroxidase are equally active in detoxification of hydrogen peroxide in human erythrocytes. Blood, v.73, p. 334-339, 1989.

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Antioxidantes