03/06/2015

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Reações Ag-Ac

Testes Sorológicos /

Técnicas de Imunodiagnóstico

Prof. Helio José Montassier

INTERAÇÕES

ANTÍGENO-ANTICORPO

Detecção, quantificação e

caracterização de

anticorpos (Acs) ou de

antígenos (Ags) e seu uso

como ferramenta para

pesquisa e diagnóstico

IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial por

meio de técnicas imunológicas

SERVE PARA PROCURAR (DETECTAR / IDENTIFICAR /

MENSURAR):- Anticorpos ou Antígenos no organismo

vertebrado suspeito de estar infectado com um determinado

agente infeccioso, usando-se técnicas sorológicas de

Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento,

Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags

marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com

conjugados ligantes, como Imunofluorescência,

Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e

Quimioluminiscência .

Interação Ag-Ac: Conceito Inicial

É uma associação bimolecular semelhante à

interação de enzimas com seus substratos ou de

hormônios com seus receptores, com uma

distinção bem evidente o Ac não provoca nenhuma

alteração química irreversível na molécula de Ag,

podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se

dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac

livres /solução/suspensão.

Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)

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INTERAÇÕES Ag-Ac

Reações reversíveis.

Ligações não covalentes:

-Pontes de hidrogênio

-Interações hidrofóbicas

-Interações de Van der Waals

-Ligações iônicas

RESPOSTA DE ANTICORPOS

Especificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.

Quantidade N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.

Isotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).

A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.

Afinidade Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.

Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

Reações Cruzadas: É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais de um Ag

Avidez x Afinidade Reatividade Cruzada entre Ag-Ac

• É a habilidade de um Ac reagir através de seu

parátopo com mais que um determinante antigênico.

• É a habilidade de uma população de moléculas de

Acs reagirem com mais de um Ag

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MÉTODOS SOROLÓGICOS

1) Reagentes não marcados

• Reação de precipitação

• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados

• RIA

• ELISA

• Imunofluorescência

• Western Blotting

• Testes Imunocromatográficos

MÉTODOS

PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla

- Imunodifusão radial

- Imunoeletroforese

AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta

- Inibição da aglutinação

- Teste de Coombs

IMUNOENSAIOS - RIA

- ELISA

- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo

- Western Blotting

- Testes Imunocromatográficos

APLICAÇÕES

- Pesquisa

- Diagnóstico

- Soroepidemiologia

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

Precipitação: Formação de complexos Ag/Ac.

Aglutinação: É o agrupamento de partículas antigênicas após a interação com Acs específicos, usualmente por moléculas de Acs que se ligam a Ags na superfície de partículas adjacentes.

As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúveis ou particulados.

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO

Interação entre Acs [IgG(*) e IgM(-)] e Ags solúveis

Ac precisa ser bivalente ou c/ valência maior

Ag precisa ser bi ou polivalente

A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO

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É importante levar-se em conta como ocorre a

ligação Ag-Ac em diferentes concentrações

dos mesmos. Observe abaixo: TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO

IMUNODIFUSÃO DUPLA

As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:

Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

Radial & Double Immunodiffusion

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Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.

O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

Ag e Ac formam arcos de precipitação.

IMUNOELETROFORESE

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Ac + Ag multivalente particulado

Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo)

Pó-zona: excesso de Ac

Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão)

Agregação visível de

partículas = Eritrócitos,

bactérias, fungos e látex

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

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2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

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3) Controle negativo:

4) Mistura-se:

AGLUTINAÇÃO DIRETA

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5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como

ilustrado acima.

AGLUTINAÇÃO DIRETA

Hemaglutinação

p/ determinação

de grupos

sanguíneos A,

B e O.

TESTE DE COOMBS

Ac antiimunoglobulinas (Robert

Coombs);

DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;

Não aglutinam os eritrócitos;

Direto: Ac ligados aos

eritrócitos fetais;

Indireto: Ac anti-Rh não

aglutinantes no soro materno.

Permite detectar

incompatibilidades Rh, prevenindo

contra DHRN.

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Teste de aglutinação quantitativa

Título: recíproca da > diluição com resultado +

Efeito Prozona

Aglutinação / Hemaglutinação

Definição – teste de aglutinação feito com um antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por ex. Cels./hemácias ou partículas de látex)

Aplicações

– Medida de anticorpos para antígenos solúveis (por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)

Aglutinação Passiva /Hemaglutinação

(+)

(-)

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de

Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação

covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos,

devidamente diluídos, são adicionados aos poços da

referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se

aglutinam e formam uma camada no fundo do poço.

Quando não existe Ac específico, as células formam um

botão no fundo do poço.

Aglutinação Positiva

Negativa

Ag solúveis associados a outras superfícies

(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

Resultado negativo:

(ausência de hCG na

urina).

Ocorre aglutinação,

pois os anticorpos

anti-hCG não são

bloqueados na

incubação inicial,

porque não havia o

hormônio na urina.

Livres, podem

aglutinar as partículas

revestidas de hCG.

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-As infecções bacterianas frequentemente induzem a

produção de Acs séricos específicos para Ags de

superfície das Bactérias.

-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas

reações de aglutinação bacteriana.

-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito

é definido como a recíproca da maior diluição do

soro que produz uma reação positiva de aglutinação.

-O título aglutinante de um soro pode ser usado para

o diagnóstico de infecções bacterianas.

Aglutinação Bacteriana

Aglutinação Bacteriana

Reagentes marcados (enzimas,

fluorocromos, isótopos)

Tipos: - RIA

- ELISA

- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO

- WESTERN BLOTTING

- Testes Imunocromatográficos

IMUNOENSAIOS

Princípio da técnica:

Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente)

a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por

radiações UV, emite luz no espectro visível.

Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo

conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e

vice-versa.

A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas

que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV

(microscópio de fluorescência).

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –

FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).

Tipos: direta, indireta ou saduíche.

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

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REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

IFA direta:

Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,

em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células

tumorais.

IFA indireta:

Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença

de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-

imunes.

É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais

intensa) e especificidade.

APLICAÇÃO DA IMUNOFLUORESCÊNCIA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

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REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível;

simples execução; determinação de classes e subclasses de

anticorpos

Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da

fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura;

ausência de automação

Ferramenta que detecta e quantifica células individuais marcadas

por fluorocromos, passando em uma corrente através de um

feixe de Laser.

Separa as células por fluorescência ativada.

Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.

É um teste qualitativo e quantitativo.

APLICAÇÕES

Tipo de população/subpop. de linfócitos/

leucócitos;

Quantidade, tamanho, granulosidade;

Isolamento de populações celulares;

Monitoramento Cels TCD4 / CD8 - HIV

CITOMETRIA DE FLUXO

Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e

fluorescência sob feixe de laser

Estudo de populações de leucócitos luz dispersa tamanho e

forma da célula

Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B

FACS (fluorescence-activated cell sorter) separação de uma única

célula

Barrientos et al., 2000

CITOMETRIA DE FLUXO / APLICAÇÕES:

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CITOMETRIA DE FLUXO – Esquema de

Funcionamento da Técnica

CITOMETRIA DE FLUXO – PREPARO

DA AMOSTRA

CITOMETRIA DE FLUXO – PREPARO

DA AMOSTRA CITOMETRIA DE FLUXO – RESULTADOS

Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression;

this one-dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called “histogram” in flow

cytometry. (ii) Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the

distribution of CD3 expression than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note

both axes are logarithmic, unlike the linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing

interpretation of quadrant gates of (ii). CD3+CD4+ cells are displayed in the top right quadrant (46.2%

of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.

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IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA

Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais

Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato

incolor em produto colorido (deposição pode ser observada

diretamente ao microscópio óptico)

Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -

Galactosidase e Glicose Oxidase

Método direto Acs primários conjugados (detecção de antígenos)

Método indireto Acs secundários conjugados (detecção de

antígenos ou anticorpos)

Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento

inadequado dos conjugados

TESTE DE IMUNOPEROXIDASE

Como são detectados / mensurados os níveis

de Anticorpos em Fluidos Biológicos?

TÉCNICAS DE ELISA

Ensaio Imunoadsorvente

Ligado à Enzima - ELISA

O teste detecta, identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um

dos dois conjugados com enzimas.

O produto final corado surge por ação da enzima que converte

um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato

alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância

indicadora).

A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através

de leitura em fotocolorímetro.

Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e

captura.

Fosfatase alcalina

Peroxidase

B-galactosidase

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Para que o ELISA é usado:-

-Mensurar os níveis de Acs específicos contra um

determinado Ag e/ou microrganismo.

-Detectar / Identificar vírus (Ags)

-Mensurar hormônios

-Mensurar marcadores de reações inflamatórias

(citocinas, proteínas de fase aguda)

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

PLACA

UTILIZADA

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

?

?

COMPETITIVE ELISA – Ab Detection

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COMPETITIVE ELISA – Ag Detection

( - )

(+)

TESTES DE ELISA

Aplicações do ELISA:

Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e

de Pesquisa

Vantagens:

Teste de alta sensibilidade

Permite quantificar Ag ou Ac das amostras

Seguros e de baixo custo

RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações:

I125: emite raios gama

H3: raios beta

Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)

Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.

Aplicações:

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,

proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

WESTERN BLOTTING

Eletroforese de

proteínas.

Identifica

antígenos ou

anticorpos.

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WESTERN BLOTTING WESTERN BLOTTING

TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

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