abordagem química e atividade citotóxica frente à artemia...

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Abordagem Química e Atividade Citotóxica frente à Artemia

salina de um Espécime de Guapira pernambucensis

Jéssica da Silva Xarifa

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

Centro de Ciências e Tecnologias

Campos dos Goytacazes – RJ

Março de 2015

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Orientadora: Profª. Drª Leda Mathias

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

Centro de Ciência e Tecnologia

Campos dos Goytacazes – RJ

Março de 2015

Monografia apresentada ao Centro

de Ciência e Tecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense, como parte das

exigências para obtenção do titulo de

Licenciado em Química.

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COMISSÃO EXAMINADORA:

Profª. Drª Leda Mthias (Doutora em Química de Produtos Naturais) – UENF

(Orientadora)

Profª. Drª Lara Fonseca Barbosa (Doutora em Ciêcias Nturais) – IFF

Prof. Dr. Carlos Roberto Ribeiro Matos (Doutor em Química dos Produtos

Nturais) - UENF

Monografia apresentada ao Centro

de Ciência e Tecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense, como parte das

exigências para obtenção do titulo de

Licenciado em Química.

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Consagre ao Senhor tudo o que você faz, e os seus planos serão bem

sucedidos. (Provérbios 16:3)

Eis que Deus é o meu ajudador, o Senhor é quem sustenta a minha vida.

(Salmos 54.4)

Aos meus pais, Antônio e Eliane.

A minha irmã Jaqueline.

Ao meu marido Carlos Augusto.

http://www.bibliaon.com/versiculo/proverbios_16_3/

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AGRADECIMENTOS

Ao fim desta jornada que marca o fim de uma grande e importante fase da minha

vida tenho muito a agradecer.

Agradeço aos meus pais, Antônio e Eliane, que me deixaram chegar a

esse mundo, que me mostraram o poder e a importância do estudo, pelo amor,

paciência e sacrifícios. A minha irmã Jaqueline e ao meu esposo Carlos

Augusto, pela paciência, carinho, amizade e palavras de apoio e otimismo.

Amo vocês.

Aos professores Leda e Carlos Roberto pela paciência, orientação,

disponibilidade, apoio e por todos os ensinamentos.

Aos professores do curso de Licenciatura em Química pelos

ensinamentos adquiridos.

Aos técnicos do LCQUI pelos espectros de massas, RMN, IV e UV.

Aos colegas de laboratório Laís, Laysa, Anaína, Lucas, Pollyana,

Sthefanie, Fernanda e Tayná por toda ajuda, torcida, amizade e risadas. E de

maneira geral, a todos os colegas do curso de Licenciatura em Química.

Aos meus irmãos em Cristo que me sustentaram em orações

principalmente nos momentos mais difíceis.

Tudo isso não teria sido possível sem a ajuda do ser maior, Deus, ao

qual sou grata pela vida, bênçãos, proteção e força que sempre me

proporcionou.

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SUMÁRIO

pág.

1. Introdução.....................................................................................................18

1.1. Aspectos gerais.................................................................................19

1.2. A Família Nyctaginaceae...................................................................21

1.3. O Gênero Guapira ............................................................................21

1.4. A espécie Guapira pernambucensis.................................................22

1.5.Local de coleta da planta...................................................................23

1.6. Testes Biológicos..............................................................................24

1.6.1. Artemia salina........................................................................24

1.7. Atividade Antioxidante.......................................................................25

2. Objetivos.......................................................................................................27

2.1. Objetivo geral....................................................................................28

2.2. Objetivos específicos........................................................................28

3. Materiais e Métodos ....................................................................................29

3.1. Equipamentos...................................................................................30

3.1.1. Concentração dos extratos brutos e frações.........................30

3.1.2. Espectroscopia no Infravermelho..........................................30

3.1.3. Espectroscopia na Região do Ultravioleta.............................31

3.1.4. Cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas............................................................................................31

3.1.5. Ressonância Magnética Nuclear...........................................31

3.2. Material vegetal.................................................................................31

3.3. Preparação dos Extratos brutos........................................................31

3.4. Teste químico para identificação de Metabólitos secundários........33

3.4.1. Testes Genéricos para Identificação de Triterpenos e

esteróides........................................................................................33

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3.4.2. Teste químico para Fenólicos em Geral................................34

3.4.3.Teste para Alcalóides.............................................................34

3.5. Determinação de Atividade Antioxidante pelo método do sequestro do radical livre 2,2’-difenil-1-picrihidrazil (DPPH)..........................................35

3.6. Flavonóides totais.............................................................................36

3.7. Determinação do teor de Protocianidinas por análise colorimétrica pelo método da Butanólise........................................36

3.8. Ensaios Biológicos............................................................................37

3.8.1. Letalidade frente às larvas do microcrustáceo Artemia salina

leach................................................................................................37

3.9. Fracionamento dos extratos brutos..................................................38

3.9.1. Fracionamento da fração HDCM do extrato bruto em hexano do caule de G. Pernambucensis.....................................................38

3.9.2. Fracionamento do extrato metanólico das folhas de G. pernambucensis..............................................................................39

4. Resultados e Discussão...............................................................................41

4.1. Testes químicos para identificação de metabólitos secundários nos

extratos brutos de G. pernambucensis...................................................42

4.1.1. Triterpenos e Esteróides.......................................................42

4.1.2. Fenólicos em geral e Flavonóides........................................44

4.1.3. Teste para Alcalóides............................................................45

4.2. Avaliação da Atividade Antioxidante (AA) pelo método do

DPPH.......................................................................................................46

4.3. Avaliação do teor de Flavonoides totais – Método do Cloreto de

Alumínio...................................................................................................48

4.4. Análise de Protocianidinas pelo método da

solvólise...................................................................................................49

4.5. Ensaios Biológicos............................................................................53

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4.5.1. Citotoxidade frente às larvas de Artemia salina....................53

4.6. Avaliação do perfil químico dos extratos brutos de G.

pernambucensis......................................................................................53

4.6.1.Identificação do perfil químico do extrato hexânico do caule de

G. pernambucensis.........................................................................53

4.6.1.1. Identificação da mistura GP-01..................................54

4.6.1.2. Identificação da mistura GP-02. ................................66

4.6.2. Identificação do perfil químico do extrato metanólico das folhas

de G. pernambucensis....................................................................74

4.6.2.1. Identificação da mistura GP-03..................................74

5. Conclusões...................................................................................................77

6. Sugestões para futuras pesquisas...............................................................79

7. Bibliografia....................................................................................................81

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LISTA DE TABELAS

pág.

Tabela 1. Resultados do teste químico para identificação de triterpenos e esteróides.........................................................................................................43

Tabela 2. Resultados do teste químico para identificação de flavonoides e fenólicos em geral............................................................................................45

Tabela 3. Absorbâncias obtidas para o padrão Rutina no teste do Teor de

Flavonóides Totais...........................................................................................47

Tabela 4. Resultado das absorbâncias encontradas para o extrato metanólico no teste do Teor de Flavonóides Totais...........................................................49

Tabela 5. Citotoxidade do extrato em MeOH de G. pernambucensis frente as

larvas de A. salina............................................................................................53

Tabela 6. Tempos de retenção (tR) e área(%) dos componentes de GP-01..56

Tabela 7. Dados espectrais de RMN13C-APT (125 MHz, CDCl3) das

substâncias majoritárias (estigmasterol e sitosterol) da mistura GP-01 e valores da literatura......................................................................................................65

Tabela 8. Tempos de retenção (tR) e área(%) dos componentes de GP-02.67

Tabela 9. Dados espectrais de RMN13C-APT (125 MHz, CDCl3) das substâncias majoritárias (β- e α-amirina) da mistura GP-02 e valores da literatura...........................................................................................................73

Tabela 10. Substâncias identificadas na mistura GP-03 através de CG/EM..74

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LISTA DE ESQUEMAS

pág.

Esquema 1. Fluxograma resumido da preparação dos extratos brutos do caule

de G. pernambucensis......................................................................................32

Esquema 2. Fluxograma resumido da preparação dos extratos brutos das folhas de G. pernambucensis...........................................................................33

Esquema 3. Fluxograma resumido do fracionamento do extrato bruto em

hexano do caule de G. pernambucensis..........................................................39

Esquema 4. Fluxograma resumido do fracionamento do extrato bruto em

metanol das folhas de G. pernambucensis.......................................................40

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LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1: Estrutura do flavonóide rutina............................................................20

Figura 2. Fotografia das folhas e frutos de Guapira pernambucensis..............22

Figura 3. Fotografias do complexo lagunar Grussaí/Iquipari em São João da

Barra/RJ.............................................................................................................23

Figura 4. Estrutura da DPPH antes e após reação com o antioxidante (A-H).26

Figura 5. Metodologia resumida do teste de determinação da atividade antioxidante.......................................................................................................36

Figura 6. Metodologia resumida da solvólise (butanólise) de proantocianidinas no extrato em MeOH de G. pernambucensis....................................................37

Figura 7. Metodologia resumida do teste de determinação do teor de toxidade

frente a larvas de A. salina................................................................................38

Figura 8. Mecanismo proposto para a reação de Liebermann-Buchard.........43

Figura 9. 1-reação de Liebermann-Burchard e 2-Reação de Salkowiski........44

Figura 10. Complexo formado entre flavonóide e AlCl3....................................44

Figura 11. Foto ilustrativa da reação com FeCl3 (1) e da reação com NaOH (2)......................................................................................................................45

Figura 12. Solução da amostra antes da reação (1) e após reagir com o

reagente de Dragendorf (2)...............................................................................46

Figura 13. Decomposição de uma proantocianidina catalisada por ácido.......50

Figura 14. Estrutura da pelargonidina,cianidina e delfinidina..........................51

Figura 15. Espectro na região do ultravioleta do extrato em MeOH de G.

pernambucensis diluído em MeOH antes da reação com BuOH/HCl/..52


pernambucensis depois da degradação com BuOH/HCl/52

Figura 17. Perfil químico dos componentes da mistura GP-01.........................54

Figura 18. Espectro no infravermelho da mistura de substancias GP-01.......55

Figura 19. Cromatograma da mistura de substância GP-01.............................56

Figura 20. Fragmentograma do pico no. 1 (Campesterol)................................57

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Figura 21. Fragmentograma do pico no. 2 (Ergosterol)....................................57

Figura 22. Fragmentograma do pico no. 3 (Estigmasterol)...............................57

Figura 23. Fragmentograma do pico no. 4 (Não identificado)...........................58

Figura 24. Fragmentograma do pico no. 5 (-Sitosterol)...................................58

Figura 25. Fragmentograma do pico no. 6 (Estigmastenol)..............................58

Figura 26. Fragmentograma do pico no. 7 (Estimast-8[14]-em-3--ol).............59

Figura 27. Fragmentograma do pico no. 8 (Espinasterona).............................59

Figura 28. Fragmentograma do pico no. 9 (Estimast-4-em-3-ona)..................59

Figura 29. Proposta de fragmentação dos componentes majoritários de GP-

01.......................................................................................................................60

Figura 30. Deslocamentos químicos.................................................................61

Figura 31. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-01.................62

Figura 32. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-01(ampliação)....................................................................................................62

Figura 33. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-

01(ampliação)....................................................................................................62

Figura 34. Espectro de RMN-13C da mistura de substâncias GP-01................63

Figura 35. Espectro de RMN-13C da mistura de substâncias GP-01

(ampliação)........................................................................................................63

Figura 36. Espectro de RMN-13C da mistura de substâncias GP-01 (ampliação)........................................................................................................64

Figura 37. Estruturas dos componentes da mistura GP-02..............................66

Figura 38. Espectro na região do infravermelho de GP-02...............................66

Figura 39. Cromatograma da mistura de substância GP-02.............................67

Figura 40. Fragmentograma do pico no. 1 (-Amirina).....................................68

Figura 41. Fragmentograma do pico no. 2 (-Amirina).....................................68

Figura 42. Fragmentograma de massas da - e -amirina...............................68

Figura 43. Fragmentograma do pico no. 3 (Ciclolaudenol)...............................69

Figura 44. Deslocamento químico.................................................................. 69

Figura 45. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-02.................70

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Figura 46. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-02

(Ampliação)........................................................................................................70

Figura 47. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-02 (Ampliação)........................................................................................................71

Figura 48. Espectro de RMN-13C-APT da mistura de substâncias GP-02.......71

Figura 49. Espectro de RMN-13C-APT da mistura de substâncias GP-02 (Ampliação)........................................................................................................72

Figura 50. Espectro de massas da mistura de substâncias GP-03..................74

Figura 51. Fragmentograma de massas do estigmasterol 1.............................75

Figura 51. Fragmentograma de massas do -sitosterol 2.................................75

Figura 52. Fragmentograma de massas do estigmastanol 3............................75

Figura 52. Fragmentograma de massas da -amirina 4...................................75

Figura 53. Fragmentograma de massas pico 5 (não identificado)....................76

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LISTA DE GRÁFICOS

pág.

Gráfico 1. Curva de calibração do DPPH.........................................................47

Gráfico 2. Atividade antioxidante obtida para o flavonoide Rutina..................47

Gráfico 3. Atividade antioxidante obtida para o extrato metanólico das folhas de G. pernambucensis......................................................................................47

Gráfico 4. Curva de calibração para o padrão de rutina no teste de teor de Flavonóides Totais............................................................................................48

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS

AA% Porcentagem de Atividade Antioxidante

Abs Absorbância

AcOH Ácido acético

AcOEt Acetato de etila

APT Attached Proton Test

Ax Axial

CC Cromatografia em coluna

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

cm-1 Centímetro recíproco (unidade de número de onda)

DL50 Dose letal suficiente para matar 50% da população testada

d Dubleto

dd Duplo dubleto

EC50 Concentração efetiva máxima obtida em 50% do padrão

eV Eletrovolt

Hz Hertz

HDCM Fração diclorometano

HMEOH Fração metanólica

IV Infravermelho

J Constante de aclopamento (medida em Hertz)

m Multipleto

MHz Megahertz

m/z Relação massa/carga

Ppm Parte por milhão

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RDA Rearranjo do tipo Diels-Alder

Rf Fator de retenção

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

s Singleto

sl Singleto largo

t Tripleto

UV Ultravioleta

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RESUMO

XARIFA, Jéssica da Silva; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro; Março, 2015; Abordagem Química e Atividade Citotóxica frente à

Artemia salina de um Espécime de Guapira pernambucensis; Orientadora:

Leda Mathias.

A presente monografia teve por objetivo principal a abordagem química

e avaliação da atividade citotóxica frente às larvas de Artemia salina das folhas

e caule de um espécime de Guapira pernambucensis.

Os testes químicos realizados com os extratos brutos indicaram

principalmente a presença de triterpenos, esteróides, flavonóides, fenólicos

gerais, catequinas e alcalóides.

A avaliação da toxidade dos extratos brutos foi realizada utilizando-se o

método proposto por Mac Laughlin para larvas de A. salina.

A avaliação da capacidade antioxidante foi realizada através do método

que utiliza o 2,2-Difenil-1-picril-hidrazil como radical livre

A avaliação de flavonóides totais foi feita utilizando o método do cloreto

de alumínio.

O fracionamento do extrato bruto hexânico do caule e metanólico das

folhas e isolamento dos metabólitos secundários foi feito utilizando métodos

cromatográficos adequados.

Os metabólitos secundários isolados foram identificados através da

interpretação de espectros de Ressonância Magnética Nuclear, bem como

através de informações obtidas no Cromatógrafo de gás acoplado ao

Espectrômetro de Massa e comparação com a literatura, resultando na

identificação de triterpenos e esteróides.

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ABSTRACT

XARIFA, Jessica da Silva; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro; March, 2015; Approach Chemistry and Cytotoxic Activity through brine

shrimp test of a specimen of Guapira pernambucensis; Supervisor: Leda

Mathias.

This monograph presents the chemistry approach and evaluation of the

cytotoxic activity against Artemia salina larvae of the leaves and stem of a

specimen of Guapira pernambucensis.

The tests chemical performed with crude extracts indicated mainly the

presence of triterpenes, sterols, flavonoids, general phenolic, catechins and

alkaloids.

Evaluation of the antioxidant capacity was performed by the method

which uses 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl as free radical.

Evaluation of total flavonoids was performed using the method of

aluminum chloride.

The evaluation of the toxicity of the crude extracts was performed using

the method proposed by Mac Laughlin to A. salina larvae.

The fractionation of the crude hexane extract of the stem and

methanolic of the leaves and isolation of secondary metabolites were made

using appropriate chromatographic methods.

The secondary metabolites were identified by interpreting of Nuclear

Magnetic Resonance spectra as well as through information obtained in the

Gas Chromatography coupled with to Mass Spectrometer and comparison with

literature, resulted in the identification of triterpenes and steroids

P á g i n a | 18

1. INTRODUÇÃO

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1.1. ASPECTOS GERAIS

A utilização de ervas como base para remédios remonta às tribos

primitivas onde as mulheres eram encarregadas de extrair das plantas os

princípios ativos responsáveis pela cura de doenças. Com o passar do tempo

os povos dessa época se tornaram mais habilitados em suprir as necessidades

de sobrevivência, estabelecendo papeis sociais específicos como, por

exemplo, o curandeiro.No século XIX o empirismo foi substituído pela química

experimental que permitiu a síntese de novas substâncias orgânicas

contribuindo para o aumento da sobrevida humana(França, 2008).

Atualmente os estudos sobre a medicina popular vêm merecendo

atenção cada vez maior devido ao contingente de informações e

esclarecimentos que vem sendo oferecido à ciência. Na maioria dos países

ocidentais, o uso de medicamentos de origem vegetal esta sendo retomado de

maneira sistemática e crescente na profilaxia e tratamento de doenças, ao lado

da terapêutica convencional (França, 2008).

A utilização das plantas medicinais vem atingindo um público cada vez

maior, recebendo incentivo da própria Organização Mundial de Saúde. A

avaliação do potencial terapêutico das plantas medicinais e de seus

constituintes tem sido objeto de vários estudos, em que já foram comprovadas

as ações farmacológicas e a eficácia terapêutica por meio de testes clínicos.

Entre os medicamentos comercializados com princípios ativos de origem

vegetal temos VickVaporub, Floratil, Buscopan, Tamarine e Morfina (França,

2008).

O Brasil, com sua grandeza de litoral, de sua flora e possuindo a maior

floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua

vocação para os produtos naturais. A química dos Produtos Naturais é, dentro

da Química brasileira, a área mais antiga.Em 1976, realizou-se a semana de

estudos sobre “Produtos Naturais e a Proteção de Plantas”. O foco das

discussões nesta reunião era o papel de determinados metabolitos secundários

na defesa de plantas contra organismos predadores e situações diversas.

Essas defesas são de natureza química e, normalmente, envolvem substancias

P á g i n a | 20

do metabolismo secundário, as quais podem ser chamadas de fitotoxinas ou

aleloquímicos. Esse fenômeno é conhecido como alelopatia (Pinto, 2002).

A característica mais importante da maioria dos metabolitos secundários

é sua distribuição restrita na natureza, que se limita a uma espécie ou a

espécies relacionadas, permitindo a ela se adequar às condições impostas pelo

ambiente. Outro papel importante é a proteção do metabolismo vegetal contra

a ação oxidante (Castro, 2001).

Muitas plantas possuem uso na medicina popular com fins terapêuticos

pela ação de flavonóides e terpenóides que são importantes na obtenção de

novos fármacos (Montanari, 2001; Braz-Filho, 1994).

Os flavonóides estão presentes em grande parte das plantas, incluindo

folhas, raízes, cascas, pólen e sementes e por isso representam um dos

grupos fenólicos mais importantes e diversificados dentre os produtos de

origem natural. O emprego terapêutico de plantas contendo flavonóides é

reconhecidamente importante. Muitas atividades biológicas são atribuídas a

eles, como: antiviral, antiinflamatória, dentre outras (Severi, 2010).

Dentre os flavonóides isolados em espécies da família

Nyctaginaceaetemos a rutina, isolada de G. opposita (Figura 1)a qual se atribui

a propriedade de inibição da formação de radicais livres (Severi, 2010;

Rodrigues, 2003).

OHO

OH O

O

O

OH

OH OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

Figura 1: Estrutura do flavonóide rutina.

P á g i n a | 21

1.2. A FAMÍLIA NYCTAGINACEAE

A família Nyctaginaceae esta representada no Brasil por 11gêneros e 48

espécies, sendo os gêneros Andradea, Bolemia, Bouganvillea, Guapira,

Leucaster, Mirabilis, Neea, Pisonia, Ramísia e Reichenbachia nativos e o

Boerhaviaintroduzido (Marchiorettoet al., 2011; Souza eLorenzi, 2008).

Seus representantes apresentam-se na forma de arvores, arbustos,

ervas ou lianas. Folhas alternas ou opostas, simples, sem estipulas.

Inflorescências cimosas em geral; flores vistosas ou não, bissexuadas ou

unissexuadas, monociamideas, geralmente actinomorfas, às vezes envolvidas

por um conjunto de brácteas vistosas (Bouganvillea) ou semelhantes a um

cálice (Mirabillis) (Souza e Lorenzi, 2008; Furlan et al., 2008).

Algumas espécies são consideradas, economicamente, importantes tais

como Mirabilis L. e BougainvilleaChoisy, cujas espécies são utilizadas como

plantas ornamentais. A espécie Boerhavia L, vulgarmente conhecida como

“erva-tostão”, é utilizada na medicina popular na cura de diversos males (Souza

et al., 2010).

Entre os gêneros nativos destaca-se a Guapira, em especial

Guapiraopposita, muito comum em diversas formações florestais. As espécies

arbóreas de Nyctaginaceae recebem o nome vulgar de “Maria-mole”, referencia

a baixa qualidade de sua madeira.Estudos da morfologia floral comparada feito

em 1996 possibilitou o reconhecimento de trinta espécies na família, dentre

elas G. opposita, G. pernambucensis, G. noxia, Neeaduekei e Pisoniaaculeata

(Furlan, 1996).

A família também apresenta vários gêneros com atividades biológicas

importantes e dentre estas podemos destacar as atividades, antiúlcera,

antimicrobiana, imunomodulatória e antioxidante, algumas vezes atribuída à

presença de flavonóides (Mazzolinet al., 2007).

1.3. O GÊNERO GUAPIRA

Guapira é um gênero neotropical com aproximadamente 70 espécies,

ocorrendo do sul dos Estados Unidos ao norte da Argentina. No Brasil ocorre

P á g i n a | 22

em todas as regiões, porem apresenta baixa frequência na região amazônica

(Souza e Lorenzi, 2008).

No gênero são conhecidas as seguintes espécies: G. areolata, G.

discolor, G. fragans, G. globosa, G. graciliflora, G. hirsuta, G.nítida, G. noxia, G.

opposita e G. pernambucensis(Bernacci, 2014).

1.4. A ESPÉCIE Guapira pernambucensis

A espécie G. pernambucensis (casar.) Lundell (Figura 2) é uma das

muitas espécies do gênero Guapira que habitam principalmente as restingas,

regiões arbustivas e campos. Esta espécie apresenta o basônimo de Pisonia

pernambucensis Casar e sinonímia Torrubia pernambucensisStandl(Furlan,

1996; Schmidt, 1872).

G. pernambucensis, conhecida popularmente como “mangue-branco”,

“pau-mole”, “ramalhete-do-mato” e “João mole”, apresenta habito arbustivo

(cresce em moitas), é nativa das restingas do Brasil (RJ até PE), apresenta

folhas opostas, flores paniculadas e frutos aquênicos (Bernacci, 2014). A

espécie apresenta a seguinte linhagem filogenética:ReinoPlantae,

FiloMagnoliophyta, ClasseMagnoliopsida, OrdemCaryophyllales,

FamíliaNyctaginaceae, GêneroGuapira, EspécieG. pernambucensis.

Figura 2. Fotografia das folhas e frutos de Guapira pernambucensis*

*Fontes: (Popovikin, 2013)

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1.5. LOCAL DE COLETA DA PLANTA

A espécie G. pernambucensis foi coletada na região de restinga no complexo

lagunar Grussaí-Iquipari no Município de São João da Barra – RJ (Figura 3). O solo

da região foi identificado como areias quartzosas marinhas associadas

aopodozolhidromórfico têm origem flúvio-marinha, formada sobre cordões litorâneos

paralelos, com estratificação plano-paralela com 1 a 3 m de altura. Segundo

Radambrasil o clima da região está caracterizado como tropical sub-úmido a

semiárido, com precipitação pluviométrica média anual variando de 800 – 1200 mm.

O vento predominante tem direção nordeste atingindo maiores velocidades nos

meses de agosto a dezembro (Assunção, 2000).

No Brasil as restingas são encontradas ao longo do litoral desde a costa leste

do Pará até a costa do Rio Grande do Sul, perfazendo um total de aproximadamente

9.000 Km de extensão (Silva, 2014).

Figura 3. Fotografias do complexo lagunar Grussaí/Iquipari em São João da

Barra/RJ*

*Fontes: (UENF, 2013)

O conceito geográfico de restinga refere-se aos cordões arenosos que

depositados pelas correntes marinhas, fecham ou tendem a fechar uma reentrância

http://www.guiaguaruja.com.br/meioambiente/restinga.html

P á g i n a | 24

na linha da costa, onde se estabelece comunidades vegetais e animais com

características marcantes em função das condições físicas do meio (Silva, 2014).

As formas de vida diversificadas (arbusto, ervas, trepadeiras e epífitas) dão

ao conjunto uma estrutura de mata baixa, rica e complexa. A região de restinga

apresenta grande importância econômica, onde podemos destacar: ornamental e

paisagística, industrial e alimentícia, arqueológica, ecológica e medicinal (Maraschin-

Silva, 2004).

Na região de restinga o solo não é a principal fonte de nutrientes, mas é,

sobretudo, a vegetação o suporte vital do ecossistema, onde os solos arenosos

extremamente permeáveis e pobres em nutrientes, a constante ação do vento e a

salinidade exigem uma especificação de certos órgãos das plantas para que possam

sobreviver em um ambiente inóspito. Encontra-se um sistema radical profundo e

ramificado, que garante a fixação da planta, além de fornecer mais água e

nutrientes, pela maior área do solo que pode ser explorada. As folhas são em geral

pequenas e coriáceas para diminuir a perda de água e como proteção contra

dilaceração pelo vento. Existem caules rastejantes, flutuando sobre a areia e

acompanhando as modificações da superfície. Existem também caules subterrâneos

(rizomas) e folhas carnosas com a finalidade de retenção de água (Joly, 1998).

1.6. TESTES BIOLÓGICOS

1.6.1. Artemia salina

A. salina (larva de camarão de água salgada) é utilizado como alimento para

peixes, sendo seus ovos facilmente encontrados em lojas de piscicultura. O teste de

toxicidade contra a Artemia salina é um ensaio biológico considerado como uma das

ferramentas mais utilizadas para a avaliação preliminar de toxicidade (Amarante et.

al., 2011). O bioensaio foi proposto por McLaughlinet al. (1995) e caracteriza-se

como um ensaio simples para determinar a DL50 (µg/mL) para substâncias puras e

extratos. São considerados ativos valores de DL50≤1000 µg/mL para extratos brutos

e ˂ 30 µg/mL para substâncias puras.

A praticidade e simplicidade que envolve o bioensaio favorecem sua utilização

sistemática em laboratórios de pesquisa. A técnica tem a vantagem de apresentar

baixo custo, rapidez e não exigir técnicas assépticas (Meyer etal., 1982).

P á g i n a | 25

O único parâmetro envolvido no bioensaio é a morte ou vida dos

microcrustáceos em contato com o material analisado e os dados obtidos são

facilmente tratados estatisticamente (Calvacanteet al., 2000).

Diversos trabalhos tentam correlacionar à toxidade frente a A. salina com

atividades antifúngica, viruscida, antimicrobiana, parasiticida e tripanossomicida

(Siqueira et al., 1998).

1.7. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

O conhecimento sobre propriedades antioxidantes é relativamente recente,

especialmente nas duas ultimas décadas observou-se um enorme crescimento da

investigação cientifica envolvendo o efeito de extratos brutos, frações e substâncias

puras e/ou modificadas quimicamente (Yunes & Calixto, 2001).

Antioxidantes naturais constituem uma larga gama de substâncias incluindo

as nitrogenadas, fenóis, carotenóides, terpenóides e saponinas, dentre outras.

Dentre os antioxidantes naturais podemos destacar os flavonóides, pois possuem a

capacidade de proteger os constituintes alimentares contra o dano oxidativo, o que

contribui para prevenção de diversas patologias, como doenças cardiovasculares,

envelhecimento precoce e câncer (Yunes & Calixto, 2001).

Existem vários métodos para determinação de atividade antioxidante em

extratos e substâncias isoladas, um dos mais utilizados consiste em avaliar a

atividade sequestradora do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil). O DPPH

em solução apresenta coloração violeta e absorve em 515 nm. Quando reage com

um antioxidante ou uma espécie radicalar, o DPPH é reduzido formando difenil-picril-

hidrazina, de coloração amarela, com consequente desaparecimento da absorção.

Quanto maior o potencial oxidante da amostra testada, mais rápida será a

descoloração do DPPH. Como a mudança de coloração é um aspecto facilmente

visualizado, o método é bastante simples e prático (Figura 4, p.26) (Roginsky e Lissi,

2005).

P á g i n a | 26

Para a obtenção de dados com maior precisão utilizamos um

espectrofotômetro ou um colorímetro, devido à forte absorção 517 nm, à medida que

o DPPH é consumido pela ação do oxidante permite traçar-se um gráfico de

absorbância versus concentração do soluto (Mensor, 1999; 2001).

A partir dos valores de absorbância obtidos, determina-se a porcentagem de

atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres. A porcentagem de

atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH consumida pelo

antioxidante e a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a

concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50)

(Mensor, 1999; 2001).

+ A

N

N

NO2 NO2

NO2

DPPH(violeta, 517 nm)

N

NH

NO2 NO2

NO2

+AAntioxidante (A-H)

Extrato bruto de planta

DPPH-H(reduzido)

Figura 4. Estrutura da DPPH antes e após reação com o antioxidante (A-H)

P á g i n a | 27

2. OBJETIVOS

P á g i n a | 28

2.1. OBJETIVO GERAL

O principal objetivo desta monografia é a prospecção fitoquímica/biológica de

extratos vegetais do caule e folhas de um espécime de Guapirapernambucensis.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Aprendizado de pesquisa bibliográfica, técnicas e uso de equipamentos

básicos de laboratório de química orgânica;

Realizar testes químicos para identificação dos metabólitos secundários:

triterpenos, esteroides, alcaloides, fenólicos, flavonoides e antocianidinas;

Avaliar a atividade antioxidante dos extratos brutos;

Avaliação do teor de fenólicos e flavonóides totais;

Avaliar o perfil químico dos extratos através de testes químicos específicos

para identificação de metabolitos secundários e métodos espectrométricos

(IV, CG/EM e RMN);

Avaliar a atividade citotóxica dos extratos brutos frente às larvas do

microcrustáceo Artemia salina Leach.

P á g i n a | 29

3. MATERIAIS E METODOS

P á g i n a | 30

Os solventes empregados no desenvolvimento desse trabalho foram de grau

p.a. e procedência Merck, Sigma-Aldrich, Synth e Vetec. Nas análises por RMN

utilizou-se solventes deuterados de procedência Cil (Cambridge Isotope

Laboratories, Inc).

Nas separações cromatográficas em coluna, foram utilizadas, sílica gel 60

(0,063-0,200 mm) e sílica gel 60 (0,040-0,063 mm)ambas de procedência Merck e

Vetec e Sephadex LH-20 procedência Pharmacia.

Nas análises comparativas através de cromatograma em camada delgada

analítica (CCDA) utilizou-se cromatofolhas de sílica gel 60 F254 e RP-18 F254ambas

de procedência Merck.

A revelação das cromatoplacas foram efetuadas através de irradiação com luz

na região do ultravioleta em comprimento de onda 254 e 366 nm e/ou com

reveladores cromogênicos (vanilina sulfúrica, sulfato cérico, solução alcoólica de

cloreto férrico, orcinol sulfúrico).

Os critérios de pureza adotados foram a observação de uma única mancha

em cromatografia de camada delgada analítica (CCDA), variando-se a fase móvel e

reveladores.

3.1. EQUIPAMENTOS

3.1.1. CONCENTRAÇÃO DOS EXTRATOS EFRAÇÕES

A concentração dos extratos e frações foi efetuada sob pressão reduzida em

evaporador rotativo, Fisatom 802. As soluções aquosas foram liofilizadas em

liofilizador Thermo Savant.

3.1.2. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO

Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em pastilhas de KBr

grau espectroscópico, com leituras na região de 4000 a 400 cm-1 em um

espectrômetro IRAffinity-1 Shimadzu.

P á g i n a | 31

3.1.3. ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA

Utilizou-se espectrofotômetro Bel Photonics 1105 com faixa espectral de 320 -

1000 nm e espectrofotômetro UV-1800Shimadzu, com varredura entre 200 e 1000

nm com amostras dissolvidas em MeOH ou BuOH ou EtOH em cubetas de 1,0 cm.

3.1.4. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA AO ESPECTRÔMETRO DE

MASSAS

Os espectros de gás acoplados ao massas (CG-EM), foram obtidos em

aparelhos GC-MS QP 5050 Shimadzu e CG-MS 5975C Inert XL EI/CI/MS Agilent

Technologies.

3.1.5. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono-

13 para as substâncias foram realizados em temperatura ambiente dissolvidas em

metanol ou clorofórmio ou dimetil sufóxido deuterados, empregando-se

tetrametilsilano (TMS) como referência. Utilizou-se espectrômetro Brucker ascend

500 MHz em campo de 500 MHz(RMN 1H) e 125 MHz (RMN 13C). Os

deslocamentos químicos (δ) foram indicados em ppm e as constantes de

acoplamento (J) em Hertz (Hz).

3.2. MATERIAL VEGETAL

A espécie G. pernambucensis foi coletada na região de restinga no Complexo

Lagunar Grussaí - Iquipari no Município de São João da Barra – RJ. Inicialmente

foi realizada a triagem do material coletado, quando foi separados folhas e caule. O

material vegetal (caule e folhas) foi diretamente submetidos à secagem a

temperatura ambiente durante 7 dias. Em seguida procedeu-se a moagem do

material vegetal em moinho de facas tipo Willey. O material pulverizado foi pesado e

submetido à extração com solventes.

3.3. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS

Folhas e caules de G. pernambucensis após secos, moídos e pesados foram

submetido à extração a frio. Para as folhas as extrações foram feitas utilizando

P á g i n a | 32

CH2Cl2, MeOH e MeOH/H2O (9:1). Para o caule foram utilizados Hexano, CH2Cl2,

AcOEt, MeOH, e MeOH/H2O (9:1).

Os extratos brutos foram concentrados em evaporador rotatório, sob pressão

reduzida, até obtenção de um resíduo. Os extratos brutos obtidos foram transferidos

para frasco previamente tarados e mantido em capela de exaustão. Esse

procedimento forneceu para o caule 0,79 g de extrato em hexano, 0,59 g em CH2Cl2,

0,76 g em AcOEt, 6,16 g de extrato em MeOH e 0,66 g de extrato hidroalcoólico.

Para as folhas obteve-se 0,33 g de extrato em CH2Cl2, 35,12 g de extrato em MeOH

e 6,69 g de extrato hidroalcoólico (Esquema 1 e 2, p. 32 e 33).

G. pernambucensis (caule = 10,75 g)

10% H2O e 90%MeOH

0,66gMeOHAcOEtDCMHexano

0,79 g

Filtração com celite + carvão ativo

DMeOH

Filtração com celite + carvão ativo

0,59 g

DDCM

0,76 g 6,16 g

HMeOH42,8 mg

HDCM64,1 mg

Esquema 1. Fluxograma resumido da preparação dos extratos brutos do caule de

G. pernambucensis.

P á g i n a | 33

MeOH35,12 g

Extração liquido/liquidocom solventes

organicos11,2 g

Acetato

Filtração com XAD-02

2,0 g

DCM

AcOEt

Guapira pernambucensis (folhas)803,70 g

DCM MeOH/H2O (9:1)6,69 g

BuOH

Resíduoaquoso

H2O

MeOH

0,33 g

Esquema 2. Fluxograma resumido da preparação dos extratos brutos das folhas de

G. pernambucensis

3.5. TESTE QUÍMICO PARA IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS

SECUNDÁRIOS

3.5.1. TESTES GENÉRICOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE TRITERPENOS E

ESTERÓIDES

O teste para identificar a presença de triterpenos e esteroides foi iniciado com

a preparação de uma solução contendo 11,2 mg do extrato bruto em hexano do

caule de G.pernambucensis diluído em 4,0 mL de MeOH. A uma alíquota de 2,0 mL

da solução foram adicionados 10,0 mL de clorofórmio. Filtrou-se com papel de filtro e

dividiram-se o extrato em duas porções iguais utilizando-se dois tubos de ensaio. No

tubo 1 realizou-se a reação de Liebermann-Burchard e no tubo 2 a reação de

Salkowski.

P á g i n a | 34

REAÇÃO DE LIEBERMANN-BURCHARD(Costa, 1994)

Misturou-se 10,0 mL de anidrido acético e 2,0 gotas de Ácido sulfúrico

concentrado, em seguida, adicionou-se ao tubo de ensaio1.

REAÇÃO DE SALKOWSKI (Joly, 1998)

Ao tubo de ensaio2 adicionou-se algumas gotas de ácido sulfúrico concentrado.

3.5.2. TESTE QUÍMICO PARA FENÓLICOS EM GERAL

Em todos os testes realizados para identificação de fenólicos, foi utilizado o

extrato metanólico bruto das folhas de G. pernambucensis.

REAÇÃO COM CLORETO DE ALUMÍNIO (Mouco &Cornélio, 2003)

Em um papel de filtro foram demarcadas duas áreas A e B, onde foram

depositadas algumas gotas do extrato bruto metanóico (5 mg/mL). Em seguida foi

adicionada a área A uma gota de solução de AlCl3 5% em etanol. As duas áreas

foram analisadas.

REAÇÃO COM CLORETO FÉRRICO (Shriner&Fuson, 1983)

Em um tubo de ensaio contendo 10,1 mg/mL do extrato bruto, foram

adicionados 3,0 gotas de cloreto férrico 2% em etanol. Analisaram-se os resultados.

REAÇÃO COM HIDRÓXIDO DE SÓDIO (Mouco &Cornelio, 2003)

A um tubo de ensaio foram adicionados 5,2 mg do extrato bruto diluído

em 5,0 mL de água destilada, e a este foram adicionadas duas gotas de hidróxido de

sódio 5%. Os resultados foram analisados.

3.4.3. TESTE PARA ALCALÓIDES(Mouco &Cornélio, 2003)

Dissolveu-se, aproximadamente, 20,0 mg do extrato metanólico bruto das

folhas de G. pernambucensis em 5,0mL de uma solução de MeOH/H2O (7:3, v/v)

com 1,0 gota de acido acético, em seguida foi realizada a adição do reagente

Dragendorff gota a gota.

P á g i n a | 35

3.5. DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DO

SEQUESTRO DO RADICAL LIVRE 2,2’-DIFENIL-1-PICRIHIDRAZIL (DPPH)

Neste ensaio foi analisado o extrato metanólico das folhas de G.

pernambucensis, utilizando como controle positivo o flavonóide rutina e como

controle negativo a solução de DPPH. O procedimento resumido esta ilustrado na

Figura 6 (p.37).

Metodologia: Primeiramente foram preparados 50,0 mL de solução estoque

de DPPH em metanol na concentração de 40,0 µg/mL. Em seguida foram feitas

diluições de 35,0; 30,0; 20,0; 15,0; 10,0; 5,0 e 1,0 µg/mL a partir da solução estoque.

A curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância, medidos em

triplicatas, a 515 nm e tendo como branco o metanol.

Soluções com concentração de 500,0 µg/mL do extrato e do controle positivo

em metanol foram diluídas nas concentrações de 250,0; 200,0; 150,0; 100,0; 50,0 e

25,0 µg/mL. Os valores das medidas de absorbâncias das misturas reacionais (0,3

mL da solução da amostra ou do controle positivo e 2,7 mL da solução estoque de

DPPH na concentração de 40,0 µg/mL) em todas as concentrações testadas, após

30 minutos reagindo, foram convertidos em porcentagem de atividade antioxidante

(AA), através da equação:

%AA={[Abscontrole–(Absamostra–Absbranco)]x100}/Abscontrole

Todas as análises foram realizadas em triplicata e a AA% foi calculada

através de média aritmética. O valor da EC50 foi calculado através da equação da

reta do gráfico plotado, onde a abscissa representa às concentrações da amostra

testada e a ordenada a %AA.

P á g i n a | 36

Figura 5. Metodologia resumida do teste de determinação da atividade antioxidante.

3.6.FLAVONÓIDES TOTAIS (Rio, 1996)

Inicialmente preparou-se uma curva de calibração com o padrão de rutina

com um faixa de concentração de 6,8 a 17,0 µg/mL. A cada concentração

acrescentou-se 1,0 mL de solução de cloreto de alumínio (5,0 g de cloreto de

alumínio em 100,0 mL de metanol). Completou-seo volume para 50,0 mL e após

repouso de 30 minutos realizou-se a leitura em 425 nm no espectrofotômetro de

UV/Visível.

O preparo do branco foi feito adicionando-se 1,0 mL da solução de cloreto de

alumínio 5% a 50,0 mL de metanol.

A uma solução de 15,0 mL da solução do extrato (1,0mg/mL) adicionou-se 1,0

mL da solução de AlCl3. Completou-se o volume com metanol até 50,0 mL em balão

volumétrico. Após repouso por meia hora, fez-se a leitura em espectrofotômetro.

3.7. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROANTOCIANIDINAS POR ANÁLISE

COLORIMÉTRICA PELO MÉTODO DA BUTANÓLISE

5,0mg do extrato em MeOH das folhas de G. pernambucensis foi solubilizado

em 10,0 mL de MeOH (solução 0,5 mg/mL) em balão volumétrico. Com auxílio de

P á g i n a | 37

uma pipeta volumétrica 1,0 mL dessa solução foi colocado em um tubo de hidrólise

contendo 4,0 mL de solução 5% de HCl em BuOH. O tubo foi fechado e a mistura

reacional foi aquecida em banho Maria a 95oC por cerca de 2 h. Após esse período a

mistura reacional foi resfriada e submetida à leitura em espectrofotômetro de

ultravioleta a 540 nm, comparando-se os valores obtidos com os valores da solução

inicial, isto é, o extrato metanólico bruto (Figura 5).

Figura 6. Metodologia resumida da solvólise (butanólise) de proantocianidinas no

extrato em MeOH de G. pernambucensis.

3.8. ENSAIOS BIOLÓGICOS

3.8.1. LETALIDADE FRENTE ÀS LARVAS DO MICROCRUSTÁCEO Artemia salina

LEACH.

O ensaio da letalidade frente às larvas de A. salina foi feito segundo

metodologia proposta por McLaughlin (McLaughlinetal., 1982).

No bioensaio utilizou-se uma solução estoque (2,22 mg/mL) do extrato

metanólico das folhas da G. pernambucensis solubilizado na mistura de água do

mar/ DMSO 1% na proporção de 3:2 (v/v).a partir da solução estoque foram

preparadas diluições nas concentrações 1,33; 0,89; 0,44; e 0,22 mg/mL. Os ensaios

foram realizados em triplicatas e estão ilustrados na Figura 7 (p. 38).

P á g i n a | 38

Figura 7. Metodologia resumida do teste de determinação do teor de toxidade frente

a larvas de A. salina.

3.9. FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS

Todos os fracionamentos cromatográficos foram monitorados por

cromatografia em camada delgada analítica de sílica gel (CCDA), utilizando-se

diversos eluentes. Os cromatogramas foram observados sob luz visível e ultravioleta

(254 e 365 nm) e então revelados com as soluções reveladoras citadas no item 3

(pág. 30).

3.9.1. FRACIONAMENTO DA FRAÇÃO HDCM DO EXTRATO BRUTO EM HEXANO

DO CAULE DEG. pernambucensis.

O extrato em Hexano (0,794g) do caule de G. pernambucensis foi submetido

a filtração a vácuo utilizando uma mistura de celite e carvão ativo. Os solventes

utilizados foram o diclorometano e o metanol. Esse procedimento resultou em 323,9

mg HDCM (fração diclorometano) e 311,2 mg de HMeOH (fração metanólica).

Cerca de 100,0 mg da fração HDCM foi submetida a fracionamento em coluna

aberta de sílica tipo flash utilizando como eluente CH2Cl2/MeOH (99,5: 0,5). Esse

procedimento resultou em 67 frações. As frações foram reunidas de acordo com a

semelhança de comportamento em CCDA originando 15 subfrações. As frações de

números 15 - 18 foram reunidas e codificadas como GP-02 e as de números 30-

43como G.P-01 e posteriormente submetidas à análise através de cromatografia

P á g i n a | 39

gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG/EM). O fracionamento encontra-se

resumido no esquema 3.

Coluna de silica flash100 mg

64 frações

GP- 016,3 mg

GP- 024,0 mg

HDCM

Esquema 3. Fluxograma resumido do fracionamento do extrato bruto em hexano do

caule de G. pernambucensis

3.9.2. FRACIONAMENTO DO EXTRATO METANÓLICO DAS FOLHAS de G.

pernambucensis.

Aproximadamente 11,0 g do extrato em MeOH das folhas de G.

pernambucensis foram submetidos a partição líquido/líquido entre os solventes

orgânicos acetato de etila, n-butanol e H2O. As frações orgânicas foram

adicionadas de sulfato de sódio e filtradas em papel de filtro. O filtrado foi

concentrado em evaporador rotatório e o resíduo foi deixado em capela de exaustão

para eliminação do solvente remanescente. O resíduo de solvente orgânico da

fração aquosa foi evaporado em evaporador rotatório e a água remanescente foi

eliminada através de liofilização. Esse procedimento resultou em fração AcOEt

(0,787g), fração em n-BuOH (4,03 g) e fração aquosa (5,81 g).

A fração em AcOEt, foi submetida a cromatografia de exclusão com Sephadex-

LH-20, utilizando-se como eluente MeOH. Esse procedimento resultou em 72

frações que foram reunidas de acordo com a semelhança em CCDA. As frações de

números 37 a 46 foram reunidas e submetidas ao mesmo procedimento citado

anteriormente até o isolamento da mistura de substâncias codificada de GP-03 (9,2

mg).O Esquema2 (p. 33) resume o fracionamento do extrato em MeOH das folhas

de G. pernambucensis.

P á g i n a | 40

Extrato MeOH folhas35,1238 g

Acetato0,7868 g

Butanol4,0281 g

Partição hidroalcoolica

Extração líquido/líquido com solventes

orgânicos11,1659 g

72 frações

Sephadex LH-200,7868 g

Sephadex LH-20 frações 37- 46

47,7 mg

44 frações

Fração 13GP-039,2 mg

Esquema 4. Fluxograma resumido do fracionamento do extrato bruto em metanol

das folhas de G. pernambucensis

P á g i n a | 41

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

P á g i n a | 42

4.1. TESTES QUÍMICOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS

SECUNDÁRIOS NOS EXTRATOS BRUTOS DE G. pernambucensis

4.1.1. TRITERPENOS E ESTERÓIDES

Os isoprenóides são característicos por sua acessibilidade, abundancia

facilidade com que são isolados e composição relativamente simples motivando

pesquisas desde o final do século XIX.

São classificados de acordo com o numero de unidades de isopreno (u.i.) que

os constitui. Os esteróides são uma subclasse dos triterpenoides (C30, seis u.i.). Os

triterpenoides são os constituintes mais importantes dos óleos essenciais e também

possuem atividades biológicas como: fortalecimento do sistema imunológico e

reparação de tecidos (Castro etal. 2001).

Os testes químicos mais comuns para a identificação de triterpenos e

esteróides são as reações de Libermann-Buchard e de Salkowiski.

A reação de Liebermann-Buchard, ilustrada na figura 8, permite a

identificação do esqueleto esteroidal, através do mecanismo proposto na reação

mostrada na Figura 8 (p.43). Quando os reagentes são adicionados à amostra

contendo esteróides ocorre uma mudança de coloração do meio reacional. O

desenvolvimento de coloração esverdeada se dá devido à formação de um derivado

sulfônico que absorve em torno de 416 nm.

P á g i n a | 43

Figura 8. Mecanismo proposto para a reação de Liebermann-Buchard

Os testes químicos para identificação de triterpenóides e esteróides feito com

o extrato em hexano do caule de G. pernambucensismostrou resultado positivo para

a duasreações (ocorreu intensificação da cor da mistura reacional). Os resultados

estão apresentados na Tabela 1 e Figura 9 (p.44).

Tabela 1.Resultados do teste químico para identificação de triterpenos e esteroides

Testes Químicos Resultados Observações Reação de Liebermann-Burchard + Intensificação da cor Reação de Salkowski + Intensificação da cor

P á g i n a | 44

Figura 9. 1-reação de Liebermann-Burchard e 2-Reação deSalkowiski.

4.1.2. FENÓLICOS EM GERAL E FLAVONÓIDES

Naidentificação da presença de flavonoides em um extrato, sem que ocorra a

interferência de outras substâncias fenólicas, comumente emprega-se o método

colorimétrico com AlCl3 ondeo cátion Al3+forma complexos estáveis com os

flavonóides, ocorrendo na análise espectrofotométrica um desvio para maiores

comprimentos de onda (desvio batocrômico)e uma intensificação da cor (efeito

hipercrômico) (Marcucci,1998; Marques, 2012)(Figura 10).

O

OO

HO

O

O

Al2+

Al

O

OOH

HO

OH

OH

AlCl3

Figura10. Complexo formado entre flavonóide e AlCl3

Nareação com AlCl3, feita com extrato metanólico das folhas de G.

pernambucensis,a área com reagente apresentou intensificação da cor (amarelo

claroamarelo escuro) quando visualizado na luz UV/VIS,caracterizando resultado

positivo. Nas reações com FeCl3 e NaOH as soluções quando em contato com o

reagente, sofreram mudança de coloração (amarelo claroverde escuro; amarelo

P á g i n a | 45

claroamarelo escuro respectivamente) (Figura 11). Os resultados obtidos estão

resumidos na Tabela2.

Tabela 2.Resultados do teste químico para identificação de flavonoides e fenólicos em geral.

Teste Metabólito Resultado

Reação com Cloreto de Alumínio Flavonóides +

Reação com Cloreto Férrico Fenólicos em geral +

Reação com Hidróxido de Sódio Flavonóides +

Figura 11. Foto ilustrativa da reação com FeCl3 (1) e da reação com NaOH (2).

4.1.3. TESTE PARA ALCALÓIDES

Alcalóides são bases orgânicas nitrogenadas encontradas principalmente em

plantas e com menos freqüência, em micro-organismos e animais (Barbosa et al.

2003).

Exemplos de alcalóides muito conhecidos incluem a nicotina, presente em

variedades de fumo (Nicotianatabacum); a cocaína, presente em folhas de

Erythroxylon coca; e a cafeína, de sementes de café e folhas de chá. Estudos

revelam atividades biológicas como: atividade antitumoral (vincristina e vimblastina),

tratamento da malaria (quinina), regulação das funções do miocárdio (quinidina),

dentre outras (Castro et al. 2001).

P á g i n a | 46

A presença de um ou mais átomos de nitrogênio na molécula confere a maioria

dos alcaloides um caráter básico, possibilitando a formação de sais quando

presentes em meio ácido (Gama, 2012).

No teste realizado com extrato metanólico das folhas de G. pernambucensis

observou-se a formação de um precipitado indicando a presença de alcalóides no

extrato.O resultado obtido esta ilustrado na Figura 12.

Figura12. Solução da amostra antes da reação (1) e após reagir com o reagente de

Dragendorf (2)

4.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (AA) PELO MÉTODO DO DPPH

Após o trabalho de Pincemail & Deby (1986) que relata a utilização do extrato

padronizado da espécie Ginkgobiloba na terapêutica antioxidante, a procura de

novas substâncias ou extratos brutos com atividade antioxidade (AA) vem

aumentando consideravelmente. Dentre as metodologias utilizadas podemos

destacar o método do DPPH (2,2-difenil-1- picril-hidrazila), um radical livre estável à

temperatura ambiente, com coloração violeta característica em solução etanólica

(Mensor, 1999; 2001).

Para medida da AA do extrato metanólico das folhas de G. pernambucensis,

inicialmente construiu-se uma curva de calibração de diferentes concentrações do

padrão de DPPH versus absorbância e em seguida calculou-se a equação da reta (y

= 0,027x - 0,005; R = 0,998). Em seguida foram preparadas conhecidas do padrão

rutina e fez-se reagir com DPPH. Mediram-se as absorbâncias e calculou-se a

equação da reta (y = 0,117x + 15,46; R = 0,997). O mesmo procedimento descrito

P á g i n a | 47

anteriormente foi realizado com a amostra. A partir daí calculou-se a EC50 para a

rutina (EC50 = 292,9 µg/mL) e para a amostra (EC50 = 287,9 µg/mL). Os resultados

obtidos estão apresentados nos Gráfico 1 a 3 apresentados abaixo.

Gráfico 1. Curva de calibração do DPPH.

Gráfico 2. Atividade antioxidante obtida para o flavonoide Rutina

Gráfico 3. Atividade antioxidante obtida para o extrato metanólico das folhas de G.

pernambucensis.

y = 0,0272x - 0,0054 R² = 0,9981

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50

Ab

s

concentração (µg/mL)

y = 0,1179x + 15,463 R² = 0,9975

0

10

20

30

40

50

0 100 200 300

%A

A

Concentração (µg/mL)

y = 0,1207x + 15,247 R² = 0,9968

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 50 100 150 200 250

concentração (µg/mL)

%A

A

EC50 = 292,9 µg/mL

EC50 = 287,9 µg/mL

P á g i n a | 48

4.3. AVALIAÇÃO DO TEOR DE FLAVONOIDES TOTAIS – MÉTODO DO CLORETO

DE ALUMÍNIO

Inicialmente prepararam-se diferentes concentrações do padrão rutina e

mediu-se a absorbância a 425 nm conforme mostrado na Tabela3. Com os

resultados obtidos construiu-se uma curva de calibração de concentração versus

absorbância. Através do gráfico foi possível obter a equação da reta (Gráfico4).

Tabela 3. Absorbâncias obtidas para o padrão Rutina no teste do Teor de

Flavonóides Totais

Gráfico 4. Curva de calibração para o padrão de rutina no teste de teor de

Flavonóides Totais.

Após obtenção da equação da reta, realizou-se a medida da absorbância da

amostra em triplicata (Tabela 4, pag. 49) e a partir daí com base na equação da reta

foi possível determinar um teorde 6,13 µg de flavonóides totais presentes em 1 mL

de extrato bruto.

y = 0,0053x - 0,0175 R² = 0,9755

00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

0 5 10 15 20

Curva de calibração

abs.

Concentração µg/mL

Rutina

Concentração Absorbância

6,8 g/mL 0,020

8,5 g/mL 0,029

10,2 g/mL 0,038

11,9 g/mL 0,044

13,6 g/mL 0,050

15,3g/mL 0,063

17,0g/mL 0,078

P á g i n a | 49

Tabela 4. Resultado das absorbâncias encontradas para o extrato metanólico no

teste do Teor de Flavonóides Totais.

Extrato em MeOH Absorbância

Frasco 1 0,013

Frasco 2 0,014

Frasco 3 0,018

Média 0,015

4.4. ANÁLISE DE PROANTOCIANIDINAS PELO MÉTODO DA SOLVÓLISE

O método fundamenta-se na reação colorimétrica com intensa absorção na

região de 550 nm, após tratamento com ácido. A clivagem oxidativa dos taninos

condensados formam antocianidinas evidenciando a labilidade da ligação C4-C8

(Figura 13, p. 50).

Na reação é possível verificar que a decomposição da proantocianidinas

catalisada por ácido produz cianidinas da parte superior do dímero e um flavan-3-ol

da unidade terminal ocasionada pela protonação do anel D da unidade terminal do

dímero. A ressonância estabiliza o cátion formado.

Em seguida ocorre a quebra da ligação entre o anel C e D para estabilizar o

íon. O dímero fragmentado dá origem a um monômero (unidade terminal) e a

cianidina (unidade superior). A unidade superior em forma de carbocátion perde

próton gerando flavan-3-eno, que por sua vez sofre oxidação fornecendo

antocianidina de coloração vermelha.

Em meio ácido, alcoólico e a quente, as proantocianidinas caracterizam-se

pela liberação de antocianidinas, devido à quebra das ligações estabelecidas entre

as unidades monoméricas. As antocianidinas liberadas para o meio, conforme for o

grau de hidroxilação do anel B, podem ser a pelargonidina, a cianidina ou a

delfinidina (Figura 14, p. 51).

P á g i n a | 50

OHO

OH

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

OH

H

A

B

C

D

E

F

Proantocianidina B2

H

OHO

OH

OH

OH

OH

A

B

C

Epicatequina

O

OH

HO

OH

OHD

E

F

OHO

OH

OH

OH

OH

A

B

C

Flavan-3-eno

OHO

OH

OH

OH

OH

A

B

C

Antocianidina

Oxidação

1

2

3

45

6

7

8

9

10

3

45

6

7

89

10

1

2

1'

2'

3'

4'

5'

6'

1'

2'

3'

4'

5'

6'

OH

Figura 13. Decomposição de uma proantocianidina catalisada por ácido

O

OH

OHOH

HO

OH

Pelargonidina

O

OH

OHOH

HO

OH

Cianidina

OHO

OH

OHOH

HO

OH

Delfinidina

OH

OH

Figura 14. Estrutura da pelargonidina, cianidina e delfinidina

O produto da reação é a formação quantitativa de antocianidinas, resultado da

quebra das ligações entre as flavonas pelo ácido [ligações C-C ( 4 6) e (8),

sendo a primeira mais resistente. Essas substâncias possuem coloração vermelha

P á g i n a | 51

cuja densidade ótica é proporcional a quantidade de proantocianidinas nas

amostras, obedecendo a Lei de Lambert-Beer.

A leitura das absorbâncias do extrato do extrato em MeOH das folhas de G.

pernambucensis antes e após a butanólise é mostrada nas Figuras15 e 16 (p. 52),

onde podemos notar que após a reação apareceu uma absorção 548 nm

característico da presença decatequinas.


pernambucensis diluído em MeOH antes da reação com BuOH/HCl/


pernambucensis depois da degradação com BuOH/HCl/

Pico nm Absorbância

1 958,5 0,034

2 902,0 0,037

3 334,5 0,481

4 271,0 0,946

Pico nm Absorbância

1 548,0 0,205

2 270,5 2,503

3 227,0 4,000

P á g i n a | 52

4.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS

4.5.1. CITOTOXICIDADE FRENTE ÀS LARVAS DE Artemia salina

Os resultados apresentados pelo extrato bruto metanólico das folhas de

G.pernambucensis no ensaio da letalidade frente a larvas de Artemia salina estão

ilustrado na Tabela 5. Os dados obtidos foram tratados estatisticamente pelo método

log-Probit determinando os valores de DL50.

O extrato metanólico apresentou uma DL50 = 171 µg/mL. Segundo

McLaughlin, os valores de DL50 ≤ 103 µg/mL são considerados ativos para extratos

brutos.

Tabela 5. Citotoxidade do extrato em MeOH de G. pernambucensis frente as larvas de A. salina.

Porcentagem de NaúpliosMortos após 24 h Concentração (mg/mL) % de naúplios mortos

2,22 62 1,33 57,8 0,89 55,6 0,44 51,1 0,22 51,1

Branco 0 DL50 171 µg/Ml

4.6. AVALIAÇÃO DO PERFIL QUÍMICO DOS EXTRATOS BRUTOS DE G.

pernambucensis

4.6.1.IDENTIFICAÇÃO DO PERFIL QUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO DO

CAULE DE G. pernambucensis

O extrato hexânico do caule de G. pernambucensisdepois de submetido à

filtração (Item 3.7.1., p. 38) forneceu duas frações. A fração em diclorometano

forneceu as subfrações GP-01 e GP-02 que após revelação com vanilina sulfúrica

sugeriu tratar-se de esteróides.

P á g i n a | 53

4.6.1.1. IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA GP-01

HO

Campesterol

HO

Ergosterol

HO

Estigmasterol

HO

HO

OO

Estimast-4-en-3-onaEspinasterona

Estimast-8[14]-en-3- -olEstigmastenol -Sitosterol

HO

1

2

3

45

67

8910

11

12

13

14

15

16

17

18

19

2021

22

2324 25

26

27

28

29

1

1

2

3

45

6

7

89

10

1911

12

13

14

15

16

17

1820

21

22

2324

28

26

2527

29

Figura 17. Perfil químico dos componentes da mistura GP-01

A mistura de substancias GP-01 mostrou-se como sólido branco amorfo e

apresentou os seguintes dados espectroscópios: o espectro na região do

infravermelho, obtido em KBr, revelou a presença de bandas de absorção

condizentes com a presença de grupo hidroxila em 3441,16 cm-1 e de grupos

metílicos, metilênicos e metínicos respectivamente em 2933,85; 2866,34 e 2850,91

cm-1 conforme mostra a Figura 18 (p.55).

P á g i n a | 54

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

0

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

96%

Tra

nsm

itta

nce

3441.1

63423.8

0

3051.5

23030.3

02955.0

72933.8

52866.3

42850.9

1

2650.3

1

1724.4

4 1647.2

8

1462.1

1

1379.1

61334.8

0

1049.3

21022.3

2966.3

8800.4

9592.1

7522.7

3513.0

9503.4

4455.2

2

418.5

7

Figura 18. Espectro no infravermelho da mistura de substancias GP-01.

A análise da amostra GP-01 através de cromatografia gasosa acoplada ao

espectrômetro de massas mostrou-se como uma mistura de nove substâncias,

sendo os componentes majoritários o estigmasterol e o -sitosterol (Figuras 19 a 28,

p. 56 a 59) cujas proporções encontram-se indicadas na Tabela 6 (p. 56). Os

componentes majoritários da mistura foram identificados especialmente pela análise

dos espectros de CG/EM.

P á g i n a | 55

Tabela 6.Tempos de retenção (tR) e área (%) dos componentes de GP-01.

Pico Substância tR %

1 Campesterol 20.6 6,2

2 Ergosterol 20.9 0,8

3 Estigmasterol 21.6 38,2

4 Não identificado 21.7 2,5

5 -Sitosterol 23.2 40,2

6 Estigmastenol 23.4 8,8

7 Estigmast-8[14]-en-3--ol 24.7 1,3

8 Espinasterona 25.3 0,8

9 Estimast-4-en-3-ona 27.4 1,2

Figura 19. Cromatograma da mistura de substância GP-01

P á g i n a | 56

Figura 20.Fragmentograma do pico no. 1 (Campesterol)

Figura 21. Fragmentograma do pico no. 2 (Ergosterol)

Figura 22. Fragmentograma do pico no. 3 (Estigmasterol)

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

55

41283133 255

159 300213 351

433 896844741 803563 653594491

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

43

215

107402

109

165

369315276876476 812535 571 702 741637

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

43

414107

119 329213

381159 255

475 503 830553 626596 887

HO

HO

HO

P á g i n a | 57

Figura 23. Fragmentograma do pico no. 4

Figura 24. Fragmentograma do pico no. 5 (-Sitosterol)

Figura 25. Fragmentograma do pico no. 6 (Estigmastenol)

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

55

69

109414

273 302353163 215

466 856 890596 833565 670 756623

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

43

107 414

105 329213

255163

354549467 847 890

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

43

215

107

416121

165290

381 456 886841

Estrutura não identificada

HO

HO

P á g i n a | 58

Figura 26. Fragmentograma do pico no. 7 (Estimast-8[14]-en-3--ol)

Figura 27. Fragmentograma do pico no. 8 (Espinasterona)

Figura 28. Fragmentograma do pico no. 9 (Estimast-4-en-3-ona)

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

43 414

255107

105

213

161381

327 430 535 869503 823714598 654

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

55

83 410269121 367298

229173

503 860529457 681570 719658 898758 821

100 200 300 400 500 600 700 800 9000.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

124

43

229412

95289

370187 327

477 898860525 825645573 674

HO

O

O

O

P á g i n a | 59

R

m/z = 412; R = Et, 22 (estigmasterol)

m/z = 414; R = Et (sitosterol)

HO

HO

HO

HO

R

R

RDA*

m/z 138

R

m/z 163R

CH3

R

R

H2

m/z 232

m/z 121

m/z 262

m/z 133

m/z 247

m/z 135

RDA*

Figura 29. Proposta de fragmentação dos componentes majoritários de GP-01

Os espectros de RMN 1H (500 MHz) de GP-01 (Figuras 30 a 32, p. 61 e 62)

apresentou-se dois sinais largos a 3,53 ppm, atribuído ao hidrogênio do carbono

carbinólico e 5,37 ppm referente ao hidrogênio olefínico H-6. Foram observados

também um grande numero de sinais na região entre 0,6 e 1,3 ppm relativos aos

hidrogênios dos grupos metílicos do esqueleto estereoidal.

P á g i n a | 60

Os espectros de RMN 1H apresentou ainda sinais referentes aos hidrogênios

vinílicos (H-22 e H-23) que aparecem como dois duplos dupletos entre 5,00 e 5,18

ppm.

Os espectros de RMN 13C-APT da mistura GP-01 (Figuras 33 a 35, p. 63 e

64) apresentou sinais atribuídos aos carbonos C-5 (140,7 ppm) e C-6 (121,7 ppm)

do sitosterol e do estigmasterol e também sinais atribuídos ao CH-23 (129,3 ppm) e

CH-22 (138,3 ppm) do estigmasterol (SEO et al., 1988).

HO HO

140,7 140,7

121,7 121,7

138,3

129,371,871,8

Figura 30. Deslocamentos químicos.

As substancias minoritárias da mistura foram identificadas especialmente pela

análise dos espectros de CG/EM.

GP 04.001.001.1r.esp

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Chemical Shift (ppm)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

Norm

alized Inte

nsity

TMS

CHLOROFORM-d

5.3

653

5.3

622

5.3

592

5.3

549

5.3

079

5.1

673

5.1

542

5.1

371

5.0

184

3.5

637

3.5

548

3.5

417

3.5

326

3.5

231

3.5

097

3.4

984

3.4

950

2.2

981

2.2

939

2.0

062

1.8

637

1.8

432

1.6

028

1.5

156

1.2

614

1.0

231

1.0

177

0.8

541

0.8

508

0.8

370

0.8

288

0.8

154

0.8

135

0.7

068

0.6

885

0.5

445

0.0

770


P á g i n a | 61

GP 04.001.001.1r.esp

1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5


0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

Norm

alized Inte

nsity

1.3

044

1.3

014

1.2

922

1.2

892

1.2

819

1.2

739

1.2

614

1.2

425

1.1

879

1.1

842

1.1

696

1.1

653

1.1

455

1.0

909

1.0

842

1.0

631

1.0

363

1.0

231

1.0

177

1.0

064

0.9

417

0.9

365

0.9

289

0.9

234

0.8

660

0.8

541

0.8

508

0.8

480

0.8

392

0.8

370

0.8

288

0.8

154

0.8

135

0.8

108

0.7

876

0.7

739

0.7

373

0.7

187

0.7

068

0.6

885

0.6

750

0.6

570

0.5

591

0.5

445

Figura 32. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-01(ampliação)

Figura 33. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-01(ampliação)

P á g i n a | 62

GP 04.002.001.1r.esp

140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10


0

0.5

1.0

Norm

alized Inte

nsity

CHLOROFORM-d

140.7

441

138.3

102

129.2

606

121.7

133

77.2

528

77.0

000

76.7

472

71.8

072

56.8

570

56.7

559

56.0

409

55.9

398

51.2

236

50.1

186

45.8

213

42.2

896

40.4

840

39.7

618

37.2

412

36.1

362

33.9

334

31.8

678

31.6

511

29.1

378

28.9

067

28.2

350

26.0

538

25.3

966

24.2

916

23.0

566

21.2

005

21.0

632

19.8

066

19.3

877

19.0

193

18.7

665

12.2

376

12.0

354

11.9

704

11.8

476

Figura 34. Espectro de RMN-13C da mistura de substâncias GP-01

GP 04.002.001.1r.esp

70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10


-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Norm

alized Inte

nsity

71.8

072

56.8

570

56.7

559

56.0

409

55.9

398

51.2

236

50.1

186

45.8

213

42.2

896

42.2

029

40.4

840

39.7

618

39.6

679

37.2

412

36.4

973

36.1

362

33.9

334

31.9

039

31.8

678

31.6

511

29.6

867

29.1

378

28.9

067

28.2

350

26.0

538

25.3

966

24.2

916

23.0

566

21.2

005

21.0

632

19.8

066 19.3

877

19.0

193

18.7

665

12.2

376

12.0

354

11.9

704

11.8

476

Figura 35. Espectro de RMN-13C da mistura de substâncias GP-01(ampliação)

P á g i n a | 63

GP 04.002.001.1r.esp

55 50 45 40 35 30 25 20 15


-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6N

orm

alized Inte

nsity

56.8

570

56.7

559

56.0

409

55.9

398

51.2

236 50.1

186

45.8

213

42.2

896

42.2

029

40.4

840

39.7

618

39.6

679

37.2

412

36.4

973

36.1

362

33.9

334

31.9

039

31.8

678

31.6

511

29.6

867

29.1

378

28.9

067

28.2

350

26.0

538

25.3

966

24.2

916

23.0

566

21.2

005

21.0

632

19.8

066

19.3

877

19.0

193

18.7

665

12.2

376

12.0

354

11.9

704

11.8

476

Figura 36. Espectro de RMN-13C da mistura de substâncias GP-01 (ampliação)

P á g i n a | 64

Tabela 7. Dados espectrais de RMN13C-APT (125 MHz, CDCl3) das substâncias

majoritárias (estigmasterol e sitosterol) da mistura GP-01 e valores da literatura.

Estigmasterol (GP-01)

*Ref. Sitosterol (GP-01)

*Ref.

Carbono C C

1 37,2 37,3 37,2 37,3

2 31,9 31,9 31,6 31,7

3 71,8 71,8 71,8 71,9

4 42,2 42,2 42,3 42,4

5 140,7 140,7 140,7 140,8

6 121,7 121,7 121,7 121,8

7 33,9 33,9 33,9 34,0

8 31,9 31,9 31,9 31,9

9 50,1 50,1 50,1 50,1

10 36,5 36,1 36,5 36,1

11 21,1 21,1 21,1 21,1

12 39,8 39,8 39,7 39,8

13 42,3 42,3 42,3 42,3

14 56,8 56,8 56,7 56,8

15 24,3 24,3 24,2 24,3

16 28,9 28,9 28,9 28,9

17 56,0 56,0 56,0 56,0

18 12,2 12,3 12,2 12,3

19 19,4 19,4 19,3 19,4

20 40,5 39,8 40,4 39,8

21 21,2 20,5 18,7 18,8

22 138,3 138,3 31,9 32,0

23 129,3 129,3 26,0 26,0

24 51,2 51,2 45,8 45,8

25 31,9 31,9 29,1 29,0

26 21,2 21,2 19,8 19,8

27 19,8 19,8 19,8 19,8

28 25,4 25,4 23,1 23,0

29 11,9 11,9 11,8 11,8

*Seoet al., 1988

P á g i n a | 65

4.6.1.2. IDENTIFICAÇÃO DA MISTURA GP-02.

HO

R R1

HOH

H

R = R2 = CH3, R1 = H, -amirina

R = R1 = CH3, R2 = H, amirinaCiclolaudenol

R2

1

2

34

56

7

89

10

11

1213

14

15

16

17

18

19 2021

22

2324

25 26

27

28

29

30

Figura 37.Estruturas dos componentes da mistura GP-02

O espectro na região do infravermelho de GP-02 apresentou banda de

absorção em 3300 cm-1 referente ao estiramento da ligação OH; 2918 e 2848 cm-1

referente à deformação da ligação CH; 1462 e 1379 cm-1 referente à deformação

angular de grupos metilenos (Paiva et al., 2001; Silverstein et al., 2005).

Figura38. Espectro na região do infravermelho de GP-02.

P á g i n a | 66

Quando analisada através de cromatografia gasosa acoplada ao

espectrômetro de massas GP-02 mostrou-se como uma mistura de três substâncias,

sendo o componente majoritário a -amirina (Figuras 38). As cujas proporções de

cada componente encontram-se indicadas na Tabela 8.

Tabela 8.Tempos de retenção (tR) e área (%) dos componentes de GP-02.


1 -Amirina 24,1 19,6

2 -Amirina 25,6 74,6

3 Ciclolaudenol 27,4 5,8

Figura 39. Cromatograma da mistura de substância GP-02.

Os fragmentogramas da - e -amirina apresentaram o pico do íon molecular

em m/z 426 e mais três picos em m/z 218, 203 e 189 (Figura 39 e 42, p. 68-69)

característicos de fragmentação tipo retro Diels-Alder de triterpenos com esqueleto

ursano ou oleano com insaturação no carbono 12 (Ogunkoya, 1981).

P á g i n a | 67

Figura 40. Fragmentograma do pico no. 1 (-Amirina).

Figura 41. Fragmentograma do pico no. 2 (-Amirina).

HO

R R1

R = R2 = CH3, R1 = H, -amirina

R = R1 = CH3, R2 = H, amirina

R2

RDA

R R1R2

CH3

m/z = 426

m/z = 218 m/z = 203

R1

R2

m/z = 189

R

Figura 42. Fragmentograma de massas da - e -amirina.

25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

218

203

43

107 18911969

147 426257 271 411297 366341 489441

25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

218

43

95 20318911969

147 426

411257 272 315 365 383342 489446

HO

HO

P á g i n a | 68

Figura 43. Fragmentograma do pico no. 3 (Ciclolaudenol)

O espectro de RMN- 1H apresentou entre outros, oito sinais entre 0,7 e 1,1

ppm referente a oito grupo metilas; um duplo sinal duplo centrado em 3,2 ppm (J =

4,8 e 11,4 Hz) característico de hidrogênio H-3 em triterpenóides do tipo 3-OH; dois

sinais triplos centrados em 5,0 e 5,2 ppm (J = 3,6 e 7,2 Hz), característicos de

hidrogênio olefínico de triterpenos da série ursano e oleano com insaturação no

carbono C-12.

O espectro de RMN-13C da mistura apresentou, entre outros, sinais entre 14,1

e 39,6 ppm relativo aos grupos metilas; sinal em 79,0 ppm atribuído ao

deslocamento químico do carbono carbinólico C-3; dois sinais em 121,0 e 124,0 ppm

relativos aos carbonos metínicos C-12 de triterpenos das séries oleano e ursano. Os

carbonos sinais dos carbonos não hidrogenados C-13 de ambas as substâncias não

foram observados. Os dados obtidos comparados com os deslocamentos químicos

registrados na literatura (Mahato&Kundu, 1994) permitiu identificar esses triterpenos

como sendo o urs-12-eno (-amirina) e olean-12-eno (-amirina). A distinção entre

- e -amirina foi feito através do deslocamento do 13C do carbono C-20 da -

amirina que aparece em 39,6 ppm (carbono metínico) e o da -amirina (carbono não

hidrogenado) aparece em freqüência mais alta (32,9 ppm). Os deslocamentos

químicos de 13C encontram-se resumidos na Tabela 9 (p. 73).

HO HO

39,632,9

79,0 79,0

124,4121,7

Figura 44. Deslocamento químico

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%43

55

124

95107

229175 203149412

300288380 440353253 327 476

500

HOH

H

P á g i n a | 69

O ciclolaudenol foi identificado somente através da comparação com o banco

de dados da biblioteca NIST do cromatógrafo de gás acoplado ao massas.

GP 05._1Hr.esp

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0


0.05

0.10

0.15

Nor

mal

ized

Inte

nsity

TMS7.

3989

7.21

467.

2073

7.19

237.

1829

6.98

06

5.23

125.

0591

5.05

094.

6472

4.62

014.

5960

3.59

533.

5855

3.57

183.

5586

3.42

263.

4177

3.40

40

2.21

812.

1030

1.92

731.

8553

1.54

291.

5002

1.22

891.

2152

1.20

481.

1844

0.94

090.

9296

0.89

880.

8109

0.80

270.

7319

0.72

55

0.00

00


GP 05.012.001.1r.esp

2.0 1.5 1.0


0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0.11

0.12

Norm

alized Inte

nsity

2.2

92.2

82.2

72.2

22.1

82.1

0

1.9

81.9

61.9

41.9

31.8

61.8

51.8

51.8

41.8

31.7

01.6

71.6

11.6

11.6

11.5

71.5

61.5

51.5

41.5

01.3

21.2

91.2

61.2

51.2

41.2

31.2

21.2

01.1

81.1

81.0

01.0

00.9

40.9

30.9

00.8

90.8

90.8

70.8

40.8

10.8

00.8

00.7

60.7

30.7

30.6

9

Figura 46. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-02 (Ampliação)

P á g i n a | 70

GP 05.012.001.1r.esp

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0


0

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

Norm

alized Inte

nsity

5.2

3

5.1

15.0

75.0

65.0

5

4.6

54.6

24.6

24.6

04.5

04.5

04.5

0

4.0

64.0

53.9

8

3.6

63.6

53.6

03.6

03.5

93.5

73.5

63.4

33.4

23.4

23.4

03.3

93.1

73.1

63.1

53.1

4

Figura 47. Espectro de RMN-1H da mistura de substâncias GP-02 (Ampliação)

GP 05.022.001.1r.esp

160 140 120 100 80 60 40 20 0


0

0.05

0.10

Norm

alized Inte

nsity

124.4

3121.7

4 79.0

878.8

6

77.2

777.0

276.7

7

64.4

5

59.0

9

55.1

9

48.0

047.7

347.2

5

41.5

440.0

2

39.6

8

38.8

0

32.9

531.9

429.7

129.3

7

28.7

627.9

9

27.4

327.2

923.3

822.7

0

21.4

1

18.3

7

17.4

816.8

715.6

314.1

3

Figura 48. Espectro de RMN-13C-APT da mistura de substâncias GP-02

P á g i n a | 71

GP 05.022.001.1r.esp

70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15


0

0.05

0.10

Norm

alized Inte

nsity

64.4

5

63.1

4

59.0

9

55.6

3

55.1

9

48.0

047.7

347.2

5

46.8

4 41.5

4

40.0

2

39.6

8

38.8

0

37.1

6

34.7

5 32.9

531.9

431.2

729.7

129.3

7

28.7

627.9

9

27.4

327.2

926.6

326.1

7 23.3

822.7

0

21.4

1

18.3

7

17.4

816.8

715.6

3

14.1

3

Figura 49. Espectro de RMN-13C-APT da mistura de substâncias GP-02 (Ampliação)

P á g i n a | 72

Tabela 9. Dados espectrais de RMN13C-APT (125 MHz, CDCl3) das substâncias majoritárias

(β- e α-amirina) da mistura GP-02 e valores da literatura.

-amirina *Ref. -amirina *Ref.

Carbono C C C C

1 38,8 38,7 38,8 38,7

2 27,3 27,3 27,3 27,2

3 79,1 79,0 78,3 78,3

4 38,8 38,8 38,8 38,7

5 55,2 55,3 55,2 55,2

6 18,4 18,5 18,4 18,3

7 32,9 32,8 32,9 32,9

8 38,8 38,8 40,0 40,0

9 47,73 47,7 47,7 47,7

10 - 37,6 - 36,9

11 23,4 23,6 23,4 23,3

12 121,7 121,8 124,4 124,3

13 - 145,1 - 139,3

14 41,5 41,8 41,5 42,0

15 26,2 26,2 29,4 28,7

16 27,3 27,0 26,6 26,6

17 32,9 32,5 - 33,7

18 47,3 47,4 59,1 58,9

19 47,2 46,9 39,7 39,6

20 31,3 31,1 39,6 39,6

21 34,8 34,8 31,3 31,2

22 37,2 37,2 41,5 41,5

23 28,8 28,2 28,8 28,1

24 15,6 15,5 15,6 15,6

25 15,6 15,6 15,6 15,6

26 16,9 16,9 16,9 16,8

27 27,9 26,0 21,4 23,3

28 28,8 28,4 28,8 28,1

29 32,9 33,1 17,5 17,4

30 - 23,6 21,4 21,3

*Mendes, 1999

P á g i n a | 73

4.6.2.IDENTIFICAÇÃO DO PERFIL QUÍMICO DO EXTRATO METANOLICO DAS

FOLHAS DE G. pernambucensis

O extrato metanólico das folhas de G. pernambucensisdepois de submetido

àextração líquido/líquido (Item 3.7.2., p. 39) forneceu três frações. A fração em

AcOEt forneceu a mistura GP-03.

4.6.2.1. IDENTIFICAÇÃO DA MISTURA GP-03

A análise através de cromatografia de gás acoplada ao espectrômetro de

massas da fração correspondente a partição em acetato de etila do extrato em

metanol permitiu identificar uma mistura de substâncias codificada de GP-03. A

análise do fragmentograma seguido da comparação com a biblioteca NIST permitiu

identificar como componentes principais: estigmasterol1, -sitosterol2,

estigmastanol3 e -amirina4 (Tabela 10 e Figuras 49 – 53, p.75 e 76).

Figura 50. Espectro de massas da mistura de substâncias GP-03

Tabela 10. Substâncias identificadas na mistura GP-03através de CG/EM


1 3,6,11-trimetildodecano 4,7 0,2

2 heneicosano 6,1 0,9

3 3β-ergost-5-en-3-ol 20,1 1,4

4 estigmasterol 20,8 35,2

5 - sitosterol 22,2 55,1

6 estigmastanol 22,5 5,7

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Figura 51. Fragmentograma de massas do estigmasterol1

Figura 52. Fragmentograma de massas do -sitosterol 2

Figura 53. Fragmentograma de massas do estigmastanol3

Figura 54. Fragmentograma de massas da -amirina 4

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

55

83

69

107

255145 159 412119

271300

351213229187 285 369 394327

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

95

10755

414145119

69

159 396329213 303

255

273178 231

355288370

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

55

93

10781

233

416

165

133401

173381290257203

331303280 455355

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%218

9555

105 189

13516153 281

254 426327230 356 412382298

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Figura 55. Fragmentograma de massas pico 5 (não identificado)

Os espectros de RMN 1H e 13C dos componentes majoritários da mistura já

foram discutidos nas seções 4.6.1.1.e 4.6.1.2 (p. 53 a 72).

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00.0

25.0

50.0

75.0

100.0

%

218

95

55107

18969

135161

175

427257 272 411231 365 393317299 342

P á g i n a | 76

5.CONCLUSÕES

P á g i n a | 77

A avaliação preliminar do perfil químico realizada com as casca da espécie

Guapira pernambucensis indicou a presença dos seguintes grupos fitoquímicos:

esteróides e triterpenos no extrato hexânico, flavonóides, fenólicos em geral e

alcalóides no extrato metanólico.

Do fracionamento preliminar do extrato hexânico do caule e metanólico das

folhas, utilizando-se de técnicas espectrométricas (IV, CG/EM e RMN 1H e 13C)

foram identificados principalmente triterpenos e esteróides: campesterol,

estigmasterol, - e -sitosterol, estigmastenol, - e -amirina, cicloclaudenol, 3-

acetato olean-12-eno, estigmast-4-en-3-ona e 3-ergost-5-em-3-ol..

Para o ensaio de toxicidade sobre as larvas de Artemia salina, a espécie

apresentou DL50 = 171,0 µg/mL, sendo considerada, portanto bioativa de acordo com

McLaughlinet al., (1995).

Foi observada atividade antioxidante no extrato bruto metanólico, EC50 = 287,9

µg/mL superior ao padrão rutina, EC50 = 292,9 µg/mL, podendo ser considerada a

planta com alto potencial antioxidante.

A avaliação do teor de flavonóides totais mostrou um resultado bastante

significativo igual a 6,13 µg/mL de extrato metanólico bruto.

A análise de proantocianidinas pelo método da butanólise apresentou resultado

positivo indicando a presença de catequinas.

Os resultados obtidos com a espécie mostraram-se promissores estimulando

a continuidade do estudo fitoquímico da espécie G. pernambucensis.

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6. SUGESTÕES PARA FUTURAS PESQUISAS

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Do ponto de vista químico, apenas o estudo preliminar do extrato em hexano do

caule e metanólico das folhasfoi feito nesta monografia, sendo interessante a

continuidade do estudo químico mais específico, uma vez que foi constatada em

estudos preliminares a presença de outros grupos de substâncias não isoladas

nesta monografia, principalmente do extrato em metanol, o qual apresentou alta

atividade antioxidante, teor de flavonóides totais considerável e bioatividade frente

às larvas de A. salina. Também será interessante a realização de estudos

farmacológicos com a espécie, visto que a mesma apresenta uso popular e poucos

estudos realizados.

P á g i n a | 80

7. BIBLIOGRAFIA

P á g i n a | 81

Amarante, C. B. do; Müller, A. H.; Póvoa, M. M.; Dolabela, M. F. Estudo fitoquímico biomonitorado pelos ensaios de toxicidade frente à Artemia salina e de atividade antiplasmódica do caule de aninga (Montrichardialinifera). Acta Amaz.

[online], vol. 41, 2011.

Assunção, J.; Nascimento, M. T. Estrutura e composição florística de Quatro formações vegetais de restinga no complexo lagunar Grussai/Iquipari, São João da Barra, RJ, Brasil. Acta bot. vol. 14, 2000.

Bernacci, L. C. Guapira. Disponível em:<www.herbario.iac.sp.gov.br/Relatorios /listagens/genero.asp?Tarefa=Guapira>. Acesso em 21 de janeiro de 2014.

Braz-Filho, R. 1. Química de Produtos Naturais: Importância, Interdisciplinaridade, Dificuldades e Perspectivas. 2. A Peregrinação de um Pacatubano. Química Nova. vol. 17,1994.

Castro, H. G. de;FERREIRA, F.A.; SILVA, D.J.H. &. MOSQUIM, P.R. Contribuição ao estudo das plantas medicinais – Metabólitos secundários. Viçoza-MG, 2001.

Cavalcante, M.F. Síntese de 1,3,5-triazinas substituídas e avaliação da toxidade frente a Artemia salina leach. Química Nova. vol. 23, 2000.

Costa, A. F. Farmacognosia. Lisboa: Fundação CalousteGulbenkian, 1994.

França, I. S. X. de; Souza, J. A. de;Baptista, R. S.; Britto, V. R. de S. Medicina popular: benefícios e malefícios das plantas medicinais. Revista Brasileira de Enfermagem. vol. 61, 2008.

Furlan, A. A tribo pisonieae Meisner (Nyctaginaceae) no Brasil. Tese de

Doutorado - Universidade de São Paulo, São Paulo. 1996.

Furlan, A.; Udulutsch, R. G.; Dias, P. Boletim de Botânica da Universidade de São Paulo. vol. 26, 2008.

Gama, A. P. Alcaloides. Disponível em <http://adamogama.blogspot.com.br/ 2012/01/alcaloides.html > Acesso em 04 de março de 2015.

mailto:%[email protected]

P á g i n a | 82

Joly, A. B. Botânica: Introdução a taxonomia vegetal. São Paulo: Nacional, 1998.

Lopes, W. A.; Fascio, M. Esquema para interpretação de espectros de substâncias orgânicas na Região do Infravermelho. Química Nova. vol. 27, 2004.

Maraschin-Silva, E. A. Extração aquosa de aleloquímicos e bioensaios laboratoriais de alelopatia. Dissertação de Mestrado - Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Rio Grande do Sul. 2004.

Marchioretto, M. S.; Lippert, A. P. U.; Silva, V. L. da. Pesquisas Botânicas do Instituto Anchietano de Pesquisas. Nº 62, 2011.

Marcucci, M. C. Mensagem Doce 1998. Disponível em <http://www.apacame.org.br/mensagemdoce/46/artigo.htm > Acesso em 04 de março de 2015.

Marques, G. S.;Monteiro, R. P. M.; Leão, W. F.; Lyra, M. A. M.; Peixoto, M. S.; Rolim-Neto,

P. J.; Xavier, H. S. Avaliação de procedimentos para quantificação espectrofotométrica de flavonoides totais em folhas de Bauhinia forficata. Quím. Nova. vol. 35, 2012.

Mazzolin, L. P.; Severi, J. A.; Vilegas.W.; Hiruma-Lima, C. Avaliação da atividade secretória gástrica sistemática e local e da atividade antioxidante do extrato metanólico de Guapira noxia (Nyctaginaceae). XVI Congresso Ítalo-latino americano de Etnomedicina – SILAE. 2007.

McLaughlin, J.L. Colman-Saizarbitoria, T.; Anderso J.E. Tres bioensayos Simples para Químicos de Productos Naturales. Revista de la Sociedad Venezoelana de

Química, 1995.

Mendes, Carla C. Triterpenos esterificados com ácidos graxos e ácidos triterpênicos isolados de Byrosonima microphylla. Quím. Nova. vol.22, 1999.

Mensor, L L. Atividade antioxidante de plantas brasileiras. Tese de Mestrado - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.1999.

P á g i n a | 83

Mensor, L. L.; Menezes, F. S.; Leitão, G. G.; Reis, A. S.;dos Santos, T. C.;Coube, C. S.;Leitão, S. G. Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Química Nova. vol.15, 2001.

Meyer, B.N., Ferrigni, N. R.;Putnam, J. E.;Jacobsen, L. B.;Nichols, D. E.;McLaughlin, J. L. Brine Shrimp a Convenient Genera Bioassay for Active Plant Constituents.

Planta Medica.vol. 45, 1982.

Montanari, C. A.; Bolzani, V. S. Planejamento Racional de Fármacos Baseado em Produtos Naturais. Química Nova. vol. 24, 2001.

Moreira, D. de L. Antioxidantand Antiviral properties of Pseudopiptadenia contorta (leguminosae) and of quebracho (Schinopsissp.) extracts. Química

Nova, Vol. 28, 2005.

Mouco, G.; Bernardino, M. J.; Cornélio, M. L. Controle de Qualidade de Ervas Medicinais. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.vol.31, 2003.

Ogunkoya, L. Application of mass spectrmetry in structural problems in triterpenes. Phytochemistry.vol. 20, 1981.

Pincemail J, Deby C. Propriétésantiradicalares de l'extrait de Ginkgo biloba. Presse Méd. vol. 15, 1986.

Pinto, A. C.; Silva, D. H. S.;Bolzani, V. da S.; Lopes, N. P.; Epifanio, R. de A. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas.

Química Nova. vol. 25, 2002.

Popovkin, A. V. Guapira pernambucensis (Casar.) Lundell. Disponível em:<

www.flickr.com/photos/plants_of_russian_in_brazil/5436105921/> Acesso em 10 de Agosto de 2013.

Rio, R. G. W. Métodos de controle químico de amostras de própolis. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo, São Paulo. 1996

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Menezes%20FS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Leit%C3%A3o%20GG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Reis%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=dos%20Santos%20TC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coube%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coube%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Leit%C3%A3o%20SG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11268111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ferrigni%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17396775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Putnam%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17396775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jacobsen%20LB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17396775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nichols%20DE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17396775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McLaughlin%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17396775

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McLaughlin%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17396775

P á g i n a | 84

Rodrigues, H. G.; DINIZ,Y. S.; FAINE, L. A.; ALMEIDA, J. A.; FERNANDES, A. A. H.; NOVELLI, E. L. B. Suplementação nutricional com antioxidantes naturais: efeito da rutina na concentração de colesterol-HDL. Revista de Nutrição. vol. 16, 2003.

Schmidt, J. A. Nyctaginaceae. In Martius, C. F. P. Flora Brasileira. vol. 14, 1872.

Seo, S. Biosynteses of sitosterol, cycloartenol, na 24-methylenecycloartenol in tissue cultures of higher and of ergesterol in yeast from [1,2-13CH2] and [2-13CH3]acetate and [5-13CH2]. Jornal Chemistry Society. Perkin. Trans. 1988.

Severi, J. A. Prospecção Químico-Farmacológica em plantas superiores: Guapira spp. Tese de Doutorado - Universidade Estadual Paulista. São Paulo. 2010.

Severi, J. A. Uso sustentável da biodiversidade brasileira – Prospecção químico-farmacologico de plantas superiores: Guapiranoxia (Nyctaginaceae).

Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual Paulista. São Paulo. 2007.

Shriner, R.L.; FUSON, R.C.; CURTIN, D. Y.; MORRILL, T. C. Identificação sistemática dos compostos orgânicos. Rio de Janeiro.1983.

Silva, S. M. Diagnóstico das restingas no Brasil. Disponível em:

<http://www.anp.gov.br/brasilrounds/round7/round7/guias_r7/PERFURACAO_R7/refere/Restingas.pdf>. Acesso em 03 de Dez. de 2014.

Siqueira, M.J. Boaventura,D.A.M. Estudo fitoquímico de Unonopsislindmanii-Annonaceae, biomonitorado pelo ensaio de toxidade sobre a Artemia salina Leach. Química Nova. Vol. 21, 1998.

Souza, M. A. de; Mendonça, C. B. F.; Esteves, V. G. Palinologia de espécies de NyctaginaceaeJuss. Ocorrentes nas restingas do estado do Rio de Janeiro, Brasil. Acta bot. bras. vol. 24, 2010.

Souza, V. C.; Lorenzi, H. Botânica sistemática. Guia ilustrado para identificação das famílias de fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum. 2008.

P á g i n a | 85

UENF-Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Restinga Iquipari. Disponível em: <www.uenf.br/Uenf/Pages/CBB/Herbario/?& modelo=1&cod_pag= 3365&tabela=&np=Restinga&nc=Ecossistemas&buscaEdicao=&grupo=herbario&p=1004>. Acesso em 10 de Agosto de 2013.

Yunes, R. S., Calixto, J.B. Plantas Medicinais sob a ótica da Química Medicinal Moderna. UNOESC, SC.chapecó. 2001.

abordagem química e atividade citotóxica frente à artemia...

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