5 resultados e discussão – ligante h2 e seus complexos ... · fenol . 1511 1367 (m) ... banda...
TRANSCRIPT
103
5 Resultados e Discussão – Ligante H2L3 e seus complexos binucleares de Cu(II) e Zn(II)
Da mesma forma que nos dois primeiros ligantes, o ligante H2L3 também
foi caracterizado por análise elementar, espectroscopia vibracional (com cálculos
de modelagem molecular e obtenção de espectro de infravermelho teórico) e
ressonância magnética nuclear de 1H e 13C.
Para os complexos 5 e 6, foram feitas espectroscopia vibracional, análise
termogravimétrica e ressonância magnética nuclear (para o complexo de zinco,
6). As análises de espectroscopia eletrônica (UV-vis) e ressonância
paramagnética eletrônica foram feitas apenas para o complexo de cobre, 5.
5.1. Sínteses
Apesar do ligante H2L3 ser simétrico, e ao fato disto ser um aspecto
favorável para a obtenção de estrutura cristalina, a tentativa de obtenção de
cristais, tanto do ligante quanto dos complexos, não foi uma tarefa simples. Em
meio a muitas tentativas, os cristais obtidos, em geral, eram muito pequenos ou
finos, ou quando não, perdiam solvente. Em comparação ao estudo feito por
Louka e colaboradores [36], é presumível que a presença dos metoxilas no ligante
H2L3 seja o fator diferenciador ou então que a questão estérica do grupo dificulte
o empacotamento da estrutura.
Embora o rendimento da reação de obtenção do ligante não seja tão
elevado (28%), os resultados indicam que H2L3 apresenta bom grau de pureza.
5.2. Modelagem Molecular e Espectroscopia Vibracional do Ligante
Similarmente aos ligantes H4L1 e H4L2, na figura 42 é possível observar a
estrutura mais energeticamente favorável para o ligante H2L3 obtida mediante
cálculo teórico.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 104
Figura 42 − Estrutura otimizada para o ligante H2L3 utilizando-se o
conjunto de bases DFT/B3LYP:6-311G(2d,2p), em fase gás.
Na figura 43, é mostrado o espectro experimental e, na tabela 18, as
atribuições mais relevantes comparadas com os valores obtidos teoricamente. O
espectro com a segunda derivada pode ser observado no anexo A.3.2.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 105
Figura 43 – Espectro vibracional do ligante H2L3.
Ligante H2L3: 3427 (m); 3106 (f); 3063 (o); 3047 (m); 2988 (m); 2964 (m);
2935 (m); 2839 (F); 2715 (o); 2629 (o); 2522 (o); 1614 (m); 1590 (F); 1572 (m);
1510 (F); 1486 (F); 1468 (F); 1438 (F); 1413 (F); 1383 (m); 1367 (m); 1314 (f);
1251 (F); 1231 (m); 1213 (F); 1184 (f); 1150 (f); 1115 (m); 1097 (m); 1043 (F);
991 (m); 966 (m); 935 (f); 896 (f); 868 (m); 844 (m); 818 (f); 763 (F); 656 (f); 635
(f); 610 (f); 561 (f); 546 (f); 511 (f); 479 (f); 455 (f).
F: banda forte; m: banda média; f: banda fraca, o: ombro.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
65
70
75
80
85
90
%T
cm-1
H2L3
Capítulo 5. Resultados e Discussão 106
Tabela 18 - Principais bandas observadas no espectro de absorção na
região do infravermelho do ligante H2L3
H2L3
Atribuição B3LYP: 6-311G(2d,2p) Experimental
(2ª derivada)
(O-H) 3417
3818 3432 (m)
(C=N)py;
(C=C)py
1613
1638
1631
1510 (F)
1486 (F)
1467 (F)
(COH)fenol 1511 1367 (m)
s/as(CH)-OCH3 3020
3009
3047 (m)
(3000)
s/as (-O-CH3) 1072 1043 (F)
(C-C-O)fora de fase 769 763 (F)
F: banda forte; m: banda média; f: banda fraca
As absorções referentes ao braço pendente hbpa, obtidas teoricamente,
são similares àquelas obtidas para os dois primeiros ligantes. No caso deste
ligante destacamos, no anel central, a presença das metoxilas (-OCH3). O modo
de estiramento C-O dá origem a bandas de absorção na região entre (1300 e
1000) cm-1. Apesar de sua considerável intensidade, essa banda é difícil de ser
atribuída, pois ocorre em uma região do espectro onde muitas outras bandas,
também intensas, aparecem [84]. Para tal grupo, a atribuição teórica foi de grande
importância. Os modos de estiramento C-H foram observados, teoricamente, em
3020 cm-1 e 3009 cm-1, e associado com as absorções observadas no espectro
experimental em 3048 cm-1 e 3000 cm-1 (2ader.). Da mesma maneira, o modo de
estiramento O-CH3, teoricamente calculado como 1072 cm-1, pode ser associado
à intensa absorção no espectro experimental em 1043 cm-1. Para o modo de
estiramento C-C-O fora de fase, o valor teórico é 769 cm-1, que encontra boa
concordância com a absorção observada em 763 cm-1.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 107
5.3. Caracterização dos Complexos
5.3.1. Estruturas propostas para os complexos
A interpretação dos resultados para os complexos conduz às estruturas
propostas mostradas abaixo (figura44):
5: [Cu2(L3)(OH2)2 (ClO4)2]·H2O = 968,80 g mol-1
OClO3
Cu
O OH2
N
CuH2O
O3ClO
O
N
O
CH3
N
O
N
CH3
H2O.
6: [Zn2(H2L3)(OH2)2(Cl)2]Cl2·3H2O = 953,39 g mol-1
ClZn
OH OH2
N
ZnH2O
Cl
O
N
O
CH3
N
HO
N
CH3
.2Cl- . 3H2O
Figura 44 – Propostas estruturais para os complexos 5 e 6.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 108
A análise elementar confirma a proporção metal-ligante (2:1) utilizada nas
sínteses, e concorda com a fórmula mínima proposta para ambos os compostos.
Essa técnica, juntamente com as análises de TG e espectroscopia vibracional
indicam a presença de moléculas de água, tanto de coordenação quanto de
hidratação, além da complexação dos íons metálicos pelos sítios tetradentados
simétricos coordenantes de H2L3, resultando em complexos binucleares.
Na tabela 19, estão sumarizados os dados referentes à decomposição
térmica dos complexos, muito úteis na avaliação da presença de solvente (tanto
coordenado quanto preso na rede cristalina).
Tabela 19 – Perdas de massas para os complexos 5 e 6
Etapas: ∆T (˚C) % Perda
Complexo 5
1 22,9 – 73,6 2,38 (H2O)
2 220,0 - 295,6 64,75
3 295,6 32,87
4
Complexo 6
1 19,1 – 100,0 4,55 (3H2O)
2 100,0 – 223,4 4,31 (2H2O)
3 223,4 – 442,5 25,87
4 442,5 – 642,5 20,01
5 642,5 45,26
Para o complexo 5, a decomposição térmica acontece em três etapas. A
primeira perda de massa, de 2,38% em relação à massa inicial, ocorre na faixa
de temperatura (28,9 - 73,6) ºC. Isso corresponde à perda de uma molécula de
água de hidratação (%teórica: 1,86 %). Entre (220,0 e 295,6) ºC acontece uma
segunda decomposição, onde há grande perda de massa do complexo: 64,75%.
Essa etapa possivelmente abrange as duas moléculas de água coordenadas, os
contra-íons e parte do ligante. A partir de 295,6 ºC, tem início a última etapa de
decomposição, correspondente a 32,8% da massa total.
Para o complexo 6, a curva TG revela que a decomposição acontece
em cinco etapas. As duas primeiras perdas são sucessivas e, juntas, somam
8,86% de massa, sendo a primeira perda relativa às três moléculas de água de
Capítulo 5. Resultados e Discussão 109
hidratação (teórico: 5,66%) e a segunda, às duas águas coordenadas (teórico:
3,78%). As duas etapas seguintes somam 45,88% de perda de massa e, por fim,
a última etapa, começando em 642,5 ºC, representa uma perda de 45,26%.
Nas figuras 45 e 46, são mostradas as curvas termogravimétricas de
ambos os complexos.
Figura 45 – Curva TG (azul) e DTG (vermelho) do complexo 5.
Figura 46 – Curva TG (azul) e DTG (vermelho) do complexo 6.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 110
5.3.2. Espectroscopia vibracional dos complexos
Os espectros de infravermelho dos complexos foram registrados e podem
ser observados nas figuras 47 e 48. Na tabela 20, estão as principais atribuições.
Figura 47 – Espectro vibracional de 5 na região (4000-450) cm-1.
Complexo 5: 3434 (m); 3117 (f); 3068 (f); 3011 (f); 2938 (f); 2860 (f); 2839
(f); 1612 (m); 1598 (m); 1507 (m); 1481 (F); 1454 (F); 1415 (m); 1392 (f); 1346
(f); 1331 (f); 1289 (m); 1260 (m); 1214 (m); 1145 (m); 1108 (F); 1093 (F); 1035
(m); 995 (o); 972 (f); 939 (f); 886 (f); 871 (f); 848 (f); 765 (m); 743 (f); 694 (f); 657
(f); 626 (f); 593 (f); 565 (f); 497 (f); 480 (f).
F: banda forte; m: banda média; f: banda fraca, o: ombro.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
40
50
60
70
80
%T
cm-1
Capítulo 5. Resultados e Discussão 111
Figura 48 – Espectro vibracional de 6 na região (4000-450) cm-1.
Complexo 6: 3449 (F); 3067 (m); 3017 (m); 2942 (m); 2861 (f); 2839 (f);
2751 (f); 1633 (o); 1609 (F); 1596 (F); 1574 (f); 1509 (m); 1478 (F); 1463 (F);
1453 (F); 1420 (m); 1386 (o); 1360 (o); 1321 (f); 1271 (F); 1220 (F); 1155 (f);
1109 (f); 1091 (f); 1036 (m); 999 (f); 955 (o); 931 (f); 913 (o); 882 (f); 835 (f); 765
(F); 719 (f); 694 (f); 647 (f); 637 (f); 585 (f); 564 (o); 539 (f); 511 (o); 486 (f).
F: banda forte; m: banda média; f: banda fraca, o: ombro.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
30
35
40
45
50
55
60
65
%T
cm-1
Capítulo 5. Resultados e Discussão 112
Tabela 20 – Principais bandas atribuídas utilizando espectroscopia de
infravermelho para os espectros dos complexos do ligante H2L3
Número de ondas (cm-1)
Atribuição Complexo 5 Complexo 6
(O-H) 3434 3449
(C-OH) --- 1360
(C=N)py;
(C=C)py
1507; 1481
1454; 1415
1508; 1478
1463; 1419
s /as (O-CH3) 1034 1036
(C-C-O) fora de fase 765 765
(Cl-O)ClO4-
1145; 1108
1093 (ν3);
940 (ν4);
626
---
De acordo com as propostas estruturais apresentadas, ambos complexos
apresentam algumas similaridades na coordenação ao ligante H2L3; e a análise
dos espectros concorda com as propostas estruturais apresentadas. É o caso do
modo de estiramento O-H (do grupo fenol e / ou das águas de hidratação /
coordenação), cuja absorção pode ser vista em ambos os espectros; e os modos
de estiramento C=N e C=C dos anéis piridínicos, cujas bandas apresentam-se
deslocadas nos espectros dos complexos (em comparação ao do ligante).
Outro aspecto importante desses espectros diz respeito ao modo de
deformação angular C-OH do fenol. No complexo 5 foi proposto a coordenação
do oxigênio fenólico desprotonado, enquanto que, em 6, o próton foi mantido
mesmo após a coordenação. A banda referente a esse modo de coordenação
está ausente no espectro do complexo de cobre(II), o que pode ser observado
na figura 49. Já no complexo de zinco, ela aparece, deslocada, em 1360 cm-1,
quando comparada à do ligante H2L3, em destaque na figura 50.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 113
Figura 49 – Espectros sobrepostos do ligante H2L3 e do complexo 5,
evidenciando o desaparecimento das bandas de deformação angular C-OH
de fenol no complexo de cobre(II).
Figura 50 - Espectros sobrepostos do ligante H2L3 e do complexo 6,
evidenciando o deslocamento das bandas referentes à deformação angular
C-OH de fenol no complexo de zinco.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 114
As bandas alusivas aos modos de estiramento associados às metoxilas,
O-CH3 e C-C-O, aparecem um pouco deslocadas em ambos os espectros.
O ânion perclorato, ClO4- foi proposto na estrutura de 5 coordenado de
forma monodentada ao íon cobre. Além de o espectro apresentar bandas típicas
para este grupo em 1145 cm-1; 1108 cm-1; 1093 (ν3) e 940 (ν4) cm-1, uma
importante absorção, de média intensidade com um máximo 626 cm-1 (não
observada no espectro do ligante), pode ser identificada. Segundo Lewis e
colaboradores [130], a presença de um par de bandas na região entre 700 e 600
cm-1, atribuídas aos modos A1 e E, em perclorato monodentados (simetria C3v),
são indícios do envolvimento deste íon na coordenação.
No espectro da região entre 700 e 30 cm-1 do complexo 6 (figura 51),
uma banda alargada centrada em 295 cm-1 é observada e pode ser atribuída ao
modo de estiramento Zn–Cl, em concordância com a estrutura proposta [118].
Esta absorção não é identificada no espectro do ligante (no anexo A.3).
Figura 51 – Espectro do complexo 6 na região (700-30) cm-1 em
pastilha de polietileno.
700 600 500 400 300 200 100
0
10
20
30
40
50
60
295
%T
cm-1
Capítulo 5. Resultados e Discussão 115
5.3.3. RMN do ligante H2L3 e o seu complexo de zinco(II)
Os espectros de RMN do ligante foram registrados em DMSO-d6 para
comparação com aqueles do complexo (solúvel apenas neste solvente). A figura
52 ilustra a comparação entre os dois espectros de 1H, de ligante e complexo ; e
na figura 53, é mostrado o espectro de 13C de H2L3.
Na tabela 21, estão sumarizadas as atribuições dos espectros de 1H
(para ligante e complexo).
N
N
OCH3
OCH3
N
N
OH
OH
H H
H
H
H
H
H
HH
H 1'
2'
3'
4'
5'
6'
1a
1c
1b1
2
3 4
5
611
1213
14
15 16
Figura 52 – Comparação entre os espectros de 1H do ligante H2L3 e do
complexo 6 na região de aromáticos (6,5-8,6 ppm). Temperatura ambiente.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 116
Figura 53 – Espectro de RMN de 13C do ligante H2L3 em solução de
DMSO-d6, à temperatura ambiente.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 117
Tabela 21 – Sinais, com suas respectivas atribuições, dos espectros de
RMN de 1H (500 MHz) e 13C (100 MHz) para o ligante H2L3 e o seu complexo
de zinco, 6.
H 1H
H2L3
1H
Complexo 6
1a 3,73(s) 3,79 (s)
1b 3,71(s) 3,66 (s)
1c 3,61(s) 3,63 (s)
3 7,36 (s,2H) 7,33 (d, 2H, 3JHH= 5)
4 7,72 (s, 2H) 7,71 (t, 2H, 3JHH= 10 e 5)
5 7,23 (s, 2H) 7,23 (t, 2H, 3JHH= 5 e 10)
6 8,51 (s, 2H) 8,48 (d, 2H, 3JHH= 5)
3’,6’ 7,00 (s,2H) 6,96 (s; 2H)
13 6,72 (s, 4H) 6,70 (m; 4H, 3JHH= 10)
14 7,05 (s, 2H) 7,06 (t, 2H, 3JHH= 10 e 5)
15 6,72 (s, 4H) 6,70 (m, 2H, 3JHH= 10)
16 7,15 (s,2H) 7,13 (d, 2H, 3JHH= 5)
-OCH3 3,63 (s) 3,67 (s)
No espectro de 1H do ligante os sinais aparecem alargados de forma que
não é possível identificar a multiplicidade dos sinais. Os deslocamentos dos
sinais para o braço pendente seguem o mesmo padrão observado nos outros
dois ligantes interpretados no capítulo 4, em que os sinais referentes ao anel
piridínico são os mais desblindados, e aparecem na sequência: H6, H4, H3 e H5
entre 8,51 e 7,23 ppm. E aqueles pertencentes ao anel fenólico estão na
sequência: H16, H14, H13 e H14, entre 7,15 e 6,72. Mas, um singleto em 7,0
ppm também aparece neste intervalo, e pode ser atribuído aos hidrogênios 3’ e
6’. Na região entre 6,73 e 3,61 ppm estão os hidrogênios alifáticos, na
sequência: H1a, H1c, H1b e os hidrogênios da metoxila, -OCH3.
Por outro lado, no espectro de 13C de H2L3 é possível identificar os 18
sinais esperados. Na região entre (160-110) ppm estão 14 sinais referentes aos
carbonos aromáticos, enquanto na região (60-50) ppm há 4 sinais referentes aos
carbonos alifáticos.
O espectro de 1H referente ao complexo 6 também consta na figura 52
para comparação com o espectro do ligante; e na tabela 21 todos os
Capítulo 5. Resultados e Discussão 118
deslocamentos referentes ao complexos podem ser observados. Em 10,20 ppm
é possível identificar um fino singleto que pode ser atribuído ao hidrogênio
hidroxílico do fenol. Todos os hidrogênios referentes aos hidrogênios alifáticos
aparecem mais desblindados após a coordenação, mas os hidrogênios
aromáticos não seguem o mesmo padrão. Alguns estão um pouco mais
blindados, comparados aos sinais pertencentes aos ligantes.
5.3.4. Espectroscopia eletrônica (UV-vis)
De forma similar aos complexos 1 e 3, o complexo 5 também exibe duas
bandas largas em seu espectro na região do visível, com máximos em 430 (ε =
165 mol-1 L cm-1) 557 nm (ε = 114 mol-1 L cm-1) (figura 54), esta última atribuída à
transição d-d dos centros equivalentes de cobre.
Figura 54 - Espectro eletrônico do complexo 5 em solução de DMSO,
[ ] = 1.10-3 Mol L-1.
5.3.5. RPE do complexo de cobre(II)
Os espectros de RPE em banda X foram registrados no estado sólido e
em solução de DMSO (à temperatura ambiente e sob condições de nitrogênio
400 500 600 700 800
0,0
0,5
1,0
557 nm
430 nm
Co
nce
ntr
açã
o (
mo
l.L
-1)
Comprimento de Onda (nm)
Complexo 5
Capítulo 5. Resultados e Discussão 119
líquido). Os parâmetros obtidos por meio de simulação constam na tabela 22, e
os espectros podem ser observados no anexo A.4.
Tabela 22 - Parâmetros g e A (10-4. cm-1) simulados para o complexo 5 no
estado sólido e em solução (temperatura ambiente e nitrogênio líquido)
Complexo 5
Estado
Sólido
Sol. Temp.
Ambiente
Solução
N2 líquido
gx = gy (g┴) 2,068 2,067 2,071
gz (g║) 2,287 2,135 2,28
Ax e Ay (A┴) 10 0 10
Az (A║) 158 93 157
Da mesma forma que os complexos descritos no capítulo 4, os
parâmetros para o complexo 6 apresenta valores de g║ ˃ g┴ ˃ 2, indicando uma
geometria tetragonalmente distorcida.
Um aspecto importante a ser destacado, para os parâmetros em solução
congelada, é o aumento no valor de g║ e diminuição no valor de A║, em
comparação com os complexos dos ligantes H2L1 e H2L2. O que indica que a
força do campo ligante é menor para o complexo em questão. E, uma vez que
em todos os complexos a coordenação de todos os três ligantes é do tipo N2O2,
presume-se que essa diferença na força do campo seja em função do tipo de
oxigênio (fenólico ou metoxílico).
5.4. Testes Farmacológicos in silico para o Ligante H2L3
Com o intuito de se obter, ainda que a priori, um possível perfil
farmacocinético do ligante, foram realizados testes in silico para a predição de
alguns parâmetros, a saber, absorção, metabolismo e toxicidade.
5.4.1. Análise farmacológica in silico
A análise farmacológica in silico é um estudo de fundamental importância
no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, tem como objetivo prever
características farmacocinéticas e farmacodinâmicas de novas moléculas com
possíveis ações farmacológicas. A farmacocinética corresponde ao movimento
Capítulo 5. Resultados e Discussão 120
temporal do fármaco no organismo, é dividida em processos como: absorção,
distribuição, metabolismo, eliminação e toxicidade; ou seja, todos os processos
que o organismo faz com o fármaco. A farmacodinâmica estuda as interações do
fármaco com os diversos alvos biológicos, e seus efeitos decorrentes das ações
agonistas ou antagonistas, ações que alteram funções moleculares e celulares
correspondentes desempenhando a ação terapêutica esperada; em outras
palavras, processos que o fármaco faz com o organismo [131].
5.4.2. Resultados da farmacocinética in silico:
Os estudos de farmacocinética são de extrema importância na
elaboração de novas moléculas. A ação terapêutica, ou eventual toxicidade,
depende da permanência do fármaco no organismo, e por isso, o estudo de sua
cinética representa o conhecimento do perfil farmacológico de atuação nos
fluidos biológicos, e sua adequação terapêutica. A absorção é dependente de
características físico-químicas. Ela consiste na passagem do fármaco pelas
membranas biológicas até alcançar a circulação sistêmica, onde se inicia a fase
de distribuição, ou seja, o inicio da trajetória por todo o organismo alcançando os
tecido e órgãos, locais de ação farmacológica onde a farmacodinâmica, ou
interação fármaco-receptor se inicia desempenhando os processos agonistas ou
antagonistas da fisiologia corporal, ou alterações físico-químicas do meio.
Os demais passos são constituintes da farmacocinética e correspondem
ao armazenamento em tecidos próprios, biotransformação e eliminação [132].
5.4.3. Absorção
A absorção de um fármaco por meio da membrana acontece por
processos passivos, ou por mecanismo facilitados por componentes da
membrana, como os canais proteicos [132]. O processo de absorção foi dividido
em 3 etapas: absorção por via oral, solubilidade e permeabilidade celular, e
permeabilidade pela barreira hematoencefálica.
Para a obtenção desses resultados foi utilizado o método 1D-QSAR em
associação com a regra de Lipinski. A análise de QSAR corresponde a um
estudo que relaciona a estrutura molecular com sua atividade farmacológica. Os
parâmetros mais importantes obtidos são: Log P, Log D, Log S e pKa.
O log P corresponde ao coeficiente de partição, ou equilíbrio hidrófilo-
lipofílico; e a razão da concentração de uma substância na fase orgânica e na
Capítulo 5. Resultados e Discussão 121
fase aquosa, o objetivo é predizer a solubilidade entre ambos os meios a uma
temperatura de 25 a 37°C. O log D é o coeficiente de partição calculado com
base no pH sanguíneo, que é de 7,4. Para um fármaco atravessar a membrana
celular, este deve apresentar uma característica lipofílica, uma vez que a
membrana é formada por uma bicamada lipídica com os elementos apolares no
interior. O log S refere-se a solubilidade do fármaco nos líquidos corporais,
preferencialmente estômago e intestino. Para ser absorvido, o fármaco deve ser
solúvel nesses líquidos, no entanto, deve apresentar lipofilicidade adequada para
ser permeável à membrana da célula. O pKa nos processos farmacocinéticos
refere-se ao pH onde 50% do fármaco está na forma ionizada e 50% na forma
molecular. Quanto maior a proporção do fármaco na forma molecular, melhor
sua absorção, uma vez que a forma ionizada e polar é hidrofílica, e
consequentemente, não atravessaria com facilidade às barreiras celulares.
Em relação à regra de Lipinski, esse método foi desenvolvido por Lipinski
e colaboradores da Pfizer®, e está fundamentada nas propriedades de
aproximadamente 2500 fármacos, com a finalidade de prever a
biodisponibilidade do fármaco por via oral, sua permeabilidade celular e pela
barreira hematoencefálica1 [133-137].
A tabela 23 apresenta os resultados dos parâmetros obtidos para o
ligante H2L3 e o AMD3100 (utilizado como parâmetro de comparação):
1 Consiste em uma organização diferenciada das células endoteliais dos capilares
cerebrais com o objetivo de proteger o sistema nervoso central de substancias xenobióticas.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 122
Tabela 23 – Descritores físico-químicos calculados para predição na
absorção e permeabilidade celular de acordo com as regras de Lipinski
Parâmetros AMD3100 H2L3
Regras de Lipinski
para
biodisponibilidade
oral [138,139]
Regras de Lipinski
modificada para
penetração no SNC
[140]
HBD 0 2 ≤ 5 ≤ 3
HBA 8 8 ≤ 10 ≤ 7
PM 502,80 590,72 ≤ 500 ≤ 400
Log P -0,22 3,86 -1 a 5 -1 a 5
Log D
(pH 7,4) -9,75 5,38 - -
Log S -0,73 -3,84 -4 a -2 -4 a -2
PSA 68,88 65,84 ≤140 Å ≤ 90 Å
Ligações
Rotáveis 2 ˃ 10 ≤ 10 ≤ 10
* Sendo: HBD= ligação de hidrogênio por doação (soma de átomos de N e O); HBA= ligação de hidrogênio por acepção (soma de OH e NH na molécula); PM= peso molecular; Log P= coeficiente de partição hidrófilo-lipofílico; Log D= coeficiente de partição no pH do plasma sanguíneo; Log S= Solubilidade em água; PSA= potencial eletrostático de superfície.
DrugLikeness e Drug-score
O parâmetro drug-score é utilizado para verificar a probabilidade de a
molécula vir a ser um fármaco comercial, e o parâmetro druglikeness verifica a
similaridade estrutural com os fármacos comercializados. Essas análises são
realizadas em comparação com 3.300 fármacos comerciais e 15.000
substâncias químicas [135]. Na tabela 24 os valores obtidos para estes
parâmetros são apresentados.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 123
Tabela 24 – Valores de druglikeness e drug-score obtidos para H2L3
Parâmetros AMD3100 H2L3 Parâmetro de
comparação [134].
Druglikeness 3,42 2,43 -1 a 4
Drug-Score 73% 68% -
Interpretando dos resultados:
De acordo com os resultados, para os parâmetros de Lipinski, tanto o
AMD3100 quanto o ligante H2L3 excedem no peso molecular, apesar dos
valores não serem tão elevados comparando-se com os de referência. Uma alta
massa molar pode sugerir que a absorção e a permeabilidade celular por
processo transcelular ou paracelular sejam dificultadas, o que pode reduzir a
biodisponibilidade.
Para os resultados de druglikeness, o ligante em estudo apresenta
alguma similaridade com fármacos comerciais utilizados na clinica médica. E em
relação ao drug-score, o valor do ligante indica alguma probabilidade de a
molécula vir a ser um fármaco comercial.
Cabe ressaltar que este valor, de drug-score, corresponde apenas a uma
probabilidade com base em apenas 5 parâmetros: toxicidade, Log P, log S, PM e
druglikeness; logo, não considera os demais parâmetros da regra de Lipinski. O
fato de apresentar alto drug-score está em não apresentar fragmentos tóxicos, e
de ter estrutura similar a fragmentos tóxicos e ter estrutura similar a fármacos
comerciais. Seria necessário pensar em outras possibilidades como, a utilização
do ligante como agente quelante hidrofílico, administração por via intravascular,
administração direta no objetivo, ligações apenas a receptores celulares,
interações, entre outros aspectos.
Os valores obtidos em comparação com a regra de Lipinski modificada
para o SNC são importantes porque já se sabe que o SNC é o segundo local
mais comum de manifestação clínica para pacientes portadores do HIV. O vírus
é neurotrópico2, e por isso o SNC pode agir como um reservatório de partículas
virais podendo levar a encefalites e progressiva destruição das funções
cerebrais, o que evidencia a necessidade de liberação de agentes antirretrovirais
nesses locais [141]. Assim, para que o ligante seja um bom candidato a
antirretroviral, é desejável que este tenha boa permeação pela BHE.
2 Isto é, tem afinidade pelo sistema nervoso.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 124
As mesmas análises foram feitas, também, para os ligantes H4L1 e H4L2.
A comparação com os valores obtidos, em comparação às regras de Lipinski
para biodisponibilidade oral, mostra que ambos os ligantes extrapolam em peso
molecular e LogS. E a comparação dos valores para a regra de Lipinski
modificada para o SNC mostra que ambos extrapolam em 5 parâmetros. Em
consequência, ambos os ligantes mostram baixa probabilidade de se tornarem
fármacos (10% para o ligante H4L1 e 12% para H4L2); embora os valores de
druglikeness mostrem que ambos apresentam alguma similaridade com
fármacos utilizados na clínica médica. A baixa qualidade dos valores obtidos
para esses dois ligantes nessa primeira etapa, inviabilizou a continuação dos
cálculos para as etapas seguintes.
Valores de pKa
Em relação ao pKa, os valores calculados são apresentados nas figuras
55 e 56, as quais mostram os pontos susceptíveis de interações e dissociações
protônicas.
Figura 55 – Valores de pKa teóricos do AMD3100.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 125
Figura 56 – Valores de pKa teóricos do ligante H2L3.
No pH do sangue (7,4), devido ao seu pH ser próximo do ponto neutro,
ambos os ligantes apresentam-se na sua forma molecular. As protonações
variam para cada elemento passível a essas possibilidades em uma mesma
molécula; ou seja, ora, com todos protonados ou desprotonados, ora com
apenas um ou dois e de forma alternada. O AMD3100 apresenta 8 pontos
passíveis de dissociações protônicas e o ligante H2L3, 6 pontos. Os valores
experimentais de pKa do AMD3100, apresentam-se na faixa entre 6,0-7,5 [142]; o
que mostra que alguns valores teóricos obtidos estão subestimados e/ou
superestimados.
5.4.4. Metabolismo
O metabolismo tem como função aumentar o caráter hidrossolúvel de um
fármaco e possibilitar sua eliminação por via renal. É dividido em duas fases: a
primeira fase, ou fase de biotransformação: consiste nas reações de oxidação,
redução e hidrólise. E a segunda fase, ou fase de conjugação; consiste na
conjugação do fármaco com moléculas hidrofílicas, tais como: ácido glicurônio,
sulfato, glicina, glutationa. Entre os processos referentes ao metabolismo, 90%
ocorrem por biotransformação oxidativa, uma ação que é promovida por reações
enzimáticas; destaque maior para hemeproteína oxidativa – o citocromo P450,
ou CYP450. A análise do metabolismo foi realizada com base na oxidação
padrão promovida pelo citocromo P450 (pela CYP 3A, corresponde a 55% de
todas as isoformas) e pelas suas isoformas CYP 2C (10%) e CYP 2D6 (30%)
Capítulo 5. Resultados e Discussão 126
com o objetivo de prever as regiões passíveis de oxidação e possibilidades de se
formar subestruturas com propriedades tóxicas [136, 143].
A figura 57 apresenta os pontos susceptíveis de oxidação do ligante
AMD3100 com as três principais isoformas enzimáticas do citocromo P450, e a
tabela 25 as probabilidades do metabolismo.
Figura 57- Pontos moleculares susceptíveis ao metabolismo pela
CYP3A, CYP2C e CYP2D6. O AMD3100 apresentou as mesmas regiões de
metabolismo para as três CYPs.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 127
Tabela 25 – Valores obtidos pela análise de metabolismo do ligante
AMD3100 pela CYP3A, CYP2C e CYP2D6
Para a CYP3A
Cor Átomo Pontuação Acessibilidade Energia
Amarela C30 32,28 0,95 41,1
Salmão C29 32,29 0,95 41,1
Verde C25 32,67 0,90 41,1
Para a CYP2C
Cor Átomo Pontuação Acessibilidade Energia
Amarela C30 45,8 - 41,1
Salmão C29 45,81 - 41,1
Verde C25 45,87 - 41,1
Para a CYP2D6
Cor Átomo Pontuação Acessibilidade Energia
Amarela C30 46,6 - 41,1
Salmão C29 46,61 - 41,1
Verde C25 53,31 - 41,1
A tabela destaca os principais átomos, dentre todos os demais, que
apresentam maiores probabilidades de sofrerem oxidação pela CYP. Quanto
menor o valor da pontuação, maior a probabilidade de metabolismo na região
destacada pelo círculo. Assim como a energia, quanto menor, maior a
probabilidade. Quanto à acessibilidade, esta é uma medida relativa da distância
topológica de um átomo em relação ao centro da molécula. Seu valor é sempre
um número entre 0,5 (átomo no centro) e 1 (átomo no final) [144].
Devido as 3 principais CYPs atacarem as mesmas regiões do ligante
AMD3100, essa análise será feita em relação às três isoformas,
consecutivamente. Pode-se verificar que para todas as isoformas enzimáticas a
energia é a mesma, o que sugere possibilidade de metabolismo pelas três
enzimas, no entanto, destacando a pontuação, se tem uma leve tendência do
processo acontecer primariamente com a CYP3A.
O processo oxidativo decorrente é a formação de hidroxila nas regiões
destacadas, aumentando, dessa forma, sua hidrosolubilidade favorecendo a
eliminação pela via urinária [132,145].
Capítulo 5. Resultados e Discussão 128
A figura 58 apresenta os pontos susceptíveis de oxidação do ligante H2L3
para as três principais isoformas enzimáticas do citocromo P450, e na tabela 26,
as probabilidades do metabolismo.
Figura 58 – Pontos moleculares de H2L3 susceptíveis ao metabolismo
pelos CYP3A, CYP2C e CYP2D6, respectivamente, de cima para baixo.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 129
Tabela 26 - Valores obtidos pela análise de metabolismo do ligante H2L3
pela CYP3A, CYP2C e CYP2D6
Para a CYP3A
Cor Átomo Pontuação Acessibilidade Energia
Amarela C16 31,75 0,76 41,1
Salmão C15 35,25 0,76 41,1
Verde C11 35,35 0,65 41,1
Para a CYP2C
Cor Átomo Pontuação Acessibilidade Energia
Amarela C16 69,89 - 41,1
Salmão C15 69,98 - 41,1
Verde C11 78,66 - 41,1
Para a CYP2D6
Cor Átomo Pontuação Acessibilidade Energia
Amarela C16 67,19 - 41,1
Salmão C15 67,28 - 41,1
Verde C28 79,46 - 74,1
Da mesma forma que o AMD3100, a maior probabilidade de
metabolismo ocorre preferencialmente para a isoforma CYP3A. As três regiões
são de alta probabilidade. O mesmo processo de metabolismo ocorre para esse
ligante.
5.4.5. Toxicidade
A toxicidade é um efeito que pode apresentar sequelas graves ou fatais
ao paciente. Ocorre devido a interações inespecíficas com receptores
inapropriados, metabolismo do fármaco em estruturas moleculares tóxicas, efeito
cumulativo elevando a janela terapêutica ao nível tóxico, entre outros aspectos.
A toxicidade é analisada com base nos efeitos mutagênicos (promoção da
alteração do material genético), efeitos tumorogênicos (promoção de tumores
malignos), efeitos irritantes e efeitos no sistema reprodutor. Essas análises são
realizadas em comparação com 3.300 fármacos comerciais e 15.000
substâncias químicas. Essas análises de predição toxicológica são realizadas de
forma comparativa com fragmentos tóxicos de mais de 3000 fármacos
comerciais [132,135].
Capítulo 5. Resultados e Discussão 130
Em relação à estrutura do ligante H2L3, não foram encontradas
possibilidades de toxicidade em relação à estrutura molecular completa.
Quanto aos fragmentos moleculares que podem ser oriundos do
metabolismo, ou decorrentes da síntese do ligante, a análise não encontrou
fragmentos tóxicos, com isso, essa molécula apresenta-se teoricamente
atóxicas.
5.5. Docking Molecular de H2L3 no Co-receptor CXCR4
A técnica de ancoramento, ou docking molecular, foi utilizada a fim de
predizer que tipo de interações o ligante H2L3 pode produzir no sítio ligante do
receptor CXCR4. Assim, o principal objetivo foi verificar a possibilidade de ação
antagonista nesse receptor, ou seja, se ele pode atuar como inibidor de fusão no
receptor CXCR4.
A estrutura cristalográfica da proteína de membrana CXCR4 foi obtida
no Banco Mundial de Proteínas (PDB: 3ODU). Nessa proteína, há uma molécula
antagonista ancorada, denominada de IT1t (código PDB: IDT), ela apresenta-se
incorporada aos resíduos de aminoácidos constituintes do sítio de interação
principal da proteína. Como essa proteína é um dímero, apenas um monômero
foi utilizado para a análise de docking, visto que, ambos são homólogos.
O ligante AMD3100, novamente, foi utilizado como parâmetro de
comparação, e para este ligante utilizou-se o programa Maestro para a
montagem da estrutura e minimização de energia. Para o ligante H2L3, foi
utilizada a estrutura resultante da otimização feita no cálculo de modelagem
molecular (DFT: B3LYP - 6-311G(2d,2p).
Foi feito também o redocking do antagonista IDT (necessário para
conseguir reproduzir o modo de ligação observado experimentalmente).
Considerou-se pH 5.5 (experimental); Glu288 neutro (pKa = 7,89) para o
redocking do antagonista (necessário para conseguir reproduzir o modo de
ligação observado experimentalmente) e Glu288 carregado negativamente para
os outros compostos (devido à presença de vários grupamentos carregados
positivamente).
Capítulo 5. Resultados e Discussão 131
5.5.1. Resultados
De acordo com o estudo de redocking, a conformação de melhor energia
do antagostista IDT possui RMSD3 igual a 1,572Å com relação à estrutura
experimental, validando assim o protocolo de docking empregado. Na figura 59 é
possível observar as conformações teórica (em azul) e experimental (em verde
com transparência), evidenciando a similaridades de ambas as conformações.A
energia de interação intermolecular obtida de acordo com o campo de força
MMFF94 foi de -39,213 kcal.mol-1, sendo -17,719 kcal.mol-1 devido à energia de
Coulomb e -21,494 kcal.mol-1 relativa ao potencial de van der Waals. As
principais interações realizadas com a proteína se mantiveram (figura 53), e.g.
pontes salinas entre o nitrogênio protonado do sistema imidatiazol com
Glu288(OE1)3,13Å, e entre o nitrogênio protonado do grupo simétrico isotioureia e
o Asp97(OD1)2,95Å.
3 “Root Mean Square Deviation”: medida utlizada para comparar duas conformações de um ligante. Quando menor o RMSD, mais parecidas são as duas conformações. O RMSD é calculado como sendo o desvio médio das distâncias entre cada par de átomos.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 132
Figura 59 – Interação do IDT no CXCR4. Sobreposição do resultado
do doking (azul claro) com a conformação experimental (verde com
transparência) do antagonista IDT no CXCR4.
O AMD3100 interage também interage com o sítio de ligação na mesma
região que o antagonista IDT. A energia proveniente das interações
intermoleculares totaliza -75,827kcal.mol-1, sendo -10.586kcal.mol-1 relativas ao
potencial de van der Waals e -65,241kcal.mol-1 do termo de Coulomb. Este
ligante mantém as mesmas pontes salinas realizadas pelo antagonista IDT,
sendo observados dois nitrogênios protonados do ligante interagindo com
Glu2882,66Å e Asp972,55Å. São observadas ainda duas ligações de hidrogênio com
Ser259(OH)3,52Å e Arg162(oxigênio carbonílico da cadeia principal)3,16Å , como
exposto na figura 60.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 133
Figura 60- Interações do AMD 3100 no CXCR4.
O ligante H2L3 ocupa uma região do sítio de ligação similar ao do
antagonista IDT. A conformação de melhor energia possui interação
intermolecular de -52,645kcal.mol-1, sendo -19,890kcal.mol-1 do potencial de van
der Waals e -32,755kcal.mol-1 do potencial eletrostático. Interage com o sítio de
ligação através de ligações de hidrogênio com o Asp972,54Å e Arg188(oxigênio
carbonílico da cadeia principal)2,93Å, e por stacking com Trp94, como pode ser
observado na figura 61.
Capítulo 5. Resultados e Discussão 134
Figura 61 – Interações do ligante H2L3 no CXCR4.