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Caracterização dos Ácidos Húmicos 42

5 CARACTERIZAÇÃO DOS ÁCIDOS HÚMICOS

5.1 Extração e Purificação

5.1.1 Introdução

As substâncias húmicas (SH) são usualmente fracionadas com

base nas suas solubilidades, sendo os ácidos húmicos (AH) a fração solúvel

em álcalis e insolúvel em meio ácido. O percentual de material húmico

extraído varia consideravelmente de um tipo de matriz para outro, e, em

geral, é maior quando se aumenta o pH do extrator e a temperatura de

extração (Stevenson, 1994).

A solubilização dos AH em meio alcalino se deve à conversão

dos grupos ácidos (principalmente carboxílicos e fenólicos) em íons. A

repulsão eletrostática entre os íons formados e as argilas (também

carregadas negativamente) e a repulsão intramolecular, que leva a uma

conformação menos “enovelada” dos AH, facilita sua hidratação. Ressalta-

se, porém, que sais (humatos) de cátions polivalentes não são solúveis.

De acordo com Stevenson (1994), o método de extração ideal

seria aquele que permitisse o isolamento dos AH inalterados, livres de

contaminantes e representativos de toda a amplitude de massas

moleculares, e que fosse aplicável a qualquer tipo de matriz. Entretanto, tal

método ainda não fora desenvolvido e, provavelmente, nunca o será, dada a

complexidade da matriz.

Dentre os vários solventes empregados nos processos de

extração dos AH em matrizes sólidas, a solução de NaOH é o mais utilizado

e é o sugerido pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS)

(http://www.ihss.gatech.edu). Sua principal vantagem é extrair uma maior


quantidade de material do que qualquer outro extrator disponível. No

entanto, esse extrator tem recebido diversas críticas (Stevenson, 1994),

como o fato de dissolver a sílica e tecidos orgânicos frescos que

contaminariam o extrato, e promover alterações químicas, como auto-

oxidação de alguns componentes orgânicos e condensação entre

aminoácidos e carbonilas de aldeídos aromáticos, decorrentes da absorção

de oxigênio da atmosfera. Nesse último caso, esse efeito pode ser

minimizado, realizando-se a extração sob atmosfera de N2, apesar de Tan et

al. (1991) não terem verificado nenhum efeito da atmosfera sobre as

características físico-químicas de diferentes frações humificadas.

Frente a essas considerações, outros extratores mais brandos

têm sido utilizados, cada um apresentando vantagens e desvantagens, mas

todos com capacidade extratora inferior a do NaOH. Entre os extratores mais

utilizados, além do NaOH, estão o Na2CO3, o Na4P2O7, o Na2B4O7 e o NaF,

além de alguns solventes orgânicos, como piridina, dimetilformamida,

dimetilsulfóxido e ácido fórmico (Hayes e Clapp, 2001; Piccolo et al., 1990).

Reagentes que formam complexos, como EDTA, acetilacetona e

hidroxiquinona, também podem ser utilizados, pois evitam a fixação de

substâncias orgânicas em componentes inorgânicos. Com a finalidade de

aumentar-se a eficiência dos extratores, pode-se submeter a suspensão do

solo a um tratamento de dispersão dos colóides com o uso de vibração

ultrassônica (Novotny, 2002).

Powell e Town (1992) mostraram que a solubilidade das SH

aumenta com o pH e diminui com a intensidade iônica do meio, e

observaram que o Na4P2O7, em pH 9,2, é um bom solvente para AH de

solos, pois apresenta eficiência de extração similar ao NaOH, com um índice

de degradação oxidativa bem menor (Powell e Fenton, 1996; Gregor e

Powell, 1986). Dick et al. (1999) observaram que as SH de solo extraídas

com Na4P2O7 apresentaram maior caráter aromático e maior proporção de

grupos carboxílicos que as SH extraídas com NaOH.

A purificação dos AH é feita geralmente com solução mista de

HCl e HF (conforme sugestão da IHSS), que promove a quebra das ligações

Si–O entre a argila e a matéria orgânica, solubilizando dessa forma os argilo-


minerais. Sánchez-Monedero et al. (2002) verificaram que o tratamento com

HCl-HF reduz significativamente o teor de cinzas dos AH sem grande

alteração na sua composição química e na sua estrutura. Por outro lado,

Piccolo et al. (1990) observaram redução de componentes alifáticos e

carboidratos em SH purificadas com essa solução ácida.

5.1.2 Materiais e Métodos

A extração e purificação dos AH foram feitas de acordo com a

metodologia convencional sugerida pela Sociedade Internacional de

Substâncias Húmicas, com a alternativa de também usar pirofosfato de

sódio no lugar de hidróxido de sódio como extrator. Foram utilizados 100 g

de vermicomposto (para extração com NaOH e com Na4P2O7), 80 g de turfa

(para extração com Na4P2O7) e 25 g de turfa (para extração com NaOH). As

extrações foram feitas em triplicata. O procedimento está resumido a seguir

(para uma quantidade de 100 g de amostra seca ao ar):

• A amostra (previamente seca a temperatura ambiente e peneirada em

malha de 2 mm) foi transferida a um béquer no qual foi adicionado 1,0 L

de solução de HCl 0,1 mol L-1. A suspensão foi agitada por 1 hora.

• Depois de removido o sobrenadante por sifonação, foi adicionado ao

resíduo 1,0 L de solução de NaOH 0,1 mol L-1 (ou Na4P2O7 0,1 mol L-1).

A mistura foi agitada por 4 horas e, em seguida, deixada em repouso por

12 horas a temperatura ambiente.

• A mistura foi então centrifugada a 7500 rpm (5,53 x 103 g) por 20

minutos. O sobrenadante foi novamente centrifugado e, depois,

acidificado com uma solução de HCl 6 mol L-1 até pH 1,0

(aproximadamente 500 mL) e deixado em repouso por 12 horas.

• O precipitado (AH) foi separado da fração solúvel, ácido fúlvico (AF), por

nova centrifugação a 7500 rpm por 20 minutos.

• Em um béquer de plástico, foi adicionado ao AH cerca de 250 mL de

solução composta de HCl 0,1 mol L-1 e HF 0,3 mol L-1. Deixou-se em

agitação por 4 horas e em repouso por, no mínimo, 24 horas.


• A suspensão foi centrifugada (7500 rpm por 20 minutos) e, após se

eliminar o sobrenadante, o resíduo foi transferido, com auxílio de água

destilada, para uma membrana de diálise da marca Spectrapor (Thomas

Scientific), com 65 cm de comprimento por 50 mm de largura, capacidade

de 8,0 mL cm-1 e porosidade para moléculas com massa molecular de

6000 a 8000 daltons. Essa membrana ficou em um recipiente plástico

com água destilada e desionizada (trocada duas vezes por dia) sob

agitação constante por aproximadamente 5 dias.

• O AH foi então liofilizado e mantido em dessecador.

Antes de serem utilizadas na purificação dos AH, as

membranas de diálise foram devidamente tratadas para remoção de

glicerina, traços de compostos sulfurosos e metais, seguindo o procedimento

estabelecido por McPhie:

• As membranas foram fervidas por 1 hora em 1 litro de etanol 50%.

• As membranas foram então agitadas por 1 hora a temperatura ambiente

em solução de NaHCO3 0,01 mol L-1 e EDTA dissódico 0,001 mol L-1.

• Repetiu-se o procedimento com água destilada, depois com nova

solução de NaHCO3 0,01 mol L-1 e EDTA 0,001 mol L-1, e, por fim, com

água destilada.

5.1.3 Resultados e Discussão

A tabela 9 mostra as quantidades de AH de turfa extraídas com

NaOH e com Na4P2O7 (TN e TP, respectivamente) e AH de vermicomposto

extraídas com NaOH e com Na4P2O7 (VN e VP, respectivamente).


TABELA 9 - Quantidade extraída (e quantidade extraída em relação ao teor

de matéria orgânica) de ácidos húmicos de turfa e vermicomposto (entre

parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações).

Amostra Quantidade extraída (%) Quantidade extraída/matériaorgânica (%)

TN 8,60 (0,50) 16,51 (0,96)

TP 7,46 (0,23) 14,32 (0,44)

VN 3,55 (0,37) 12,75 (1,33)

VP 1,04 (0,09) 3,74 (0,32)

Pode ser observado na tabela 9 que a quantidade de ácidos

húmicos extraídos de turfa é muito maior que a quantidade extraída de

vermicomposto. Normalizando-se pelo teor de matéria orgânica, a

quantidade de AH extraídos no vermicomposto ainda assim foi menor que na

turfa. Esse resultado era esperado, uma vez que o vermicomposto teve um

tempo de humificação consideravelmente menor. Além disso, a solução de

NaOH extrai cerca de 3 vezes e meia mais AH de vermicomposto que a

solução de pirofosfato de sódio, fato esse que pode ser explicado pela maior

alcalinidade do hidróxido de sódio. Entretanto, para turfa, a quantidade de

AH extraídos variou muito pouco, alterando-se o extrator. Dados da literatura

(Dick et al., 1999) mostram que, dependendo do solo, a diferença na

quantidade extraída de AH, variando-se o extrator, pode ser maior ou menor.

Além disso, pelo fato de se ter utilizado quantidades iniciais da matriz

diferentes, as possíveis perdas durante o processo de extração podem não

ter sido proporcionais à massa inicial.

5.2 Teor de Cinzas

5.2.1 Introdução

O teor de cinzas corresponde à quantidade de matéria

inorgânica, especialmente sílica e metais, presentes no ácido húmico. Esse


valor reflete na eficiência da extração e purificação. Valores altos de cinzas

podem comprometer a interpretação da análise elementar e interfere nas

análises de NMR e EPR.


Aproximadamente 50,0 mg da amostra de ácido húmico foram

colocados em mufla, a 550 °C, por 4 horas, em um cadinho de platina

previamente tarado. As determinações foram feitas em triplicata.

O teor de cinzas foi calculado seguindo a equação 21:

0

100mmC = (21)

em que: C = teor de cinzas (em %);

m = massa (em miligramas) da amostra calcinada;

m0 = massa (em miligramas) da amostra não calcinada.


Os resultados de teor de cinzas estão expostos na tabela 10.

TABELA 10 - Teor de cinzas das amostras de ácidos húmicos (entre

parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações).

Amostra Teor de cinzas (%)

TN 1,0 (0,3)

TP 1,1 (0,5)

VN 2,1 (0,5)

VP 2,1 (0,1)

Como pode ser visto na tabela 10, os teores de cinzas de todas

as amostras ficaram abaixo de 3%, o que pode ser considerado satisfatório

para as análises subseqüentes.


5.3 Acidez Total, Carboxílica e Fenólica

5.3.1 Introdução

A determinação de acidez em ácidos húmicos é um importante

passo na sua caracterização, pois indica o número de grupos ácidos

(essencialmente carboxílicos e fenólicos) presentes na estrutura. Vários

métodos foram propostos para determinar esses grupos ácidos, desde

titulações potenciométricas diretas (Conte et al., 2003), até métodos

espectroscópicos (Cabaniss, 1991; Masini et al., 1998). Porém, o método

mais utilizado se baseia em titulação potenciométrica indireta, com hidróxido

de bário (para acidez total) e acetato de cálcio (para acidez carboxílica)

(Schnitzer e Gupta, 1965; Schnitzer e Khan, 1972). Esse método se mostrou

mais reprodutivo que as titulações diretas (Perdue, 1985) e é o mais utilizado

para substâncias húmicas (Ayuso et al., 1997; Landgraf et al., 1998b; Poppi

e Talamoni, 1992; Rasyid et al., 1992). Bonn e Fish (1991) estudaram a

relação da acidez carboxílica com a razão acidez total e quantidade de

acetato.


Acidez Total: Uma amostra de 100 mg de AH foi colocada em

um erlenmeyer de 25 mL, juntamente com 10 mL de solução 0,1 mol L-1 de

hidróxido de bário (Ba(OH)2). A água utilizada para preparar a solução

alcalina foi previamente fervida para retirada de CO2. Foi também preparado

uma solução referência (branco), constituída apenas de 10 mL da solução

de Ba(OH)2. Passou-se um fluxo de nitrogênio nos erlenmeyers, que foram

então submetidos à agitação por 24 horas a temperatura ambiente. Em

seguida, a suspensão foi filtrada em papel de filtro comum, sendo coletados

5 mL do filtrado, que foi titulado potenciometricamente com uma solução

padrão de HCl 0,05 mol L-1. O ponto de equivalência foi determinado em pH

8,4. A acidez total foi calculada pela equação 22.


( )alíquota

base

AH

abrancoT V

Vm

CVVA .

.−= (22)

em que: AT = acidez total (em mmolc g-1);

Vbranco = volume de HCl usado na titulação do branco;

V = volume de HCl usado na titulação da amostra;

Ca = concentração da solução de HCl;

mAH = massa de ácido húmico;

Vbase = volume total de Ba(OH)2 utilizado (10 mL);

Valíquota = volume da alíquota utilizado na titulação (5 mL).

Acidez Carboxílica: Uma amostra de 50 mg de AH foi colocada

em um erlenmeyer de 25 mL, juntamente com 20 mL de solução 0,1 mol L-1

de acetato de cálcio (Ca(CH3COO)2). A água utilizada para preparar a

solução foi previamente fervida para retirada de CO2. Foi também preparado

um branco, constituído apenas de 20 mL da solução de Ca(CH3COO)2.

Passou-se um fluxo de nitrogênio nos erlenmeyers, que foram então

submetidos à agitação por 24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, a

suspensão foi filtrada em papel de filtro comum, sendo coletados 10 mL do

filtrado, que foi titulado potenciometricamente com uma solução padrão de

NaOH 0,05 mol L-1. O ponto de equivalência foi determinado em pH 9,8. A

acidez total foi calculada pela equação 3.

( )alíquota

acetato

AH

bbrancoC V

Vm

CVVA .

.−= (23)

em que: AC = acidez carboxílica (em mmolc g-1);

V = volume de NaOH usado na titulação da amostra;

Vbranco = volume de NaOH usado na titulação do branco;

Cb = concentração da solução de NaOH;

mAH = massa de ácido húmico;

Vacetato = volume total de acetato de cálcio utilizado (20 mL);

Valíquota = volume da alíquota utilizado na titulação (10 mL).


Acidez Fenólica: A determinação da acidez fenólica foi feita por

diferença entre a acidez total e a acidez carboxílica.


Os resultados da análise de acidez estão mostrados na tabela

11 e os gráficos titulométricos estão mostrados nas figuras 16 e 17.

TABELA 11 - Acidez total, carboxílica e fenólica das amostras de ácidos

húmicos (valores em mmolc g-1) (n = 6 determinações).

Amostra Acidez total Acidez carboxílica Acidez fenólica

TN 6,8 ± 0,5 3,9 ± 0,2 2,9 ± 0,5

TP 6,8 ± 0,6 4,3 ± 0,4 2,5 ± 0,7

VN 4,8 ± 0,2 2,3 ± 0,2 2,5 ± 0,3

VP 5,7 ± 0,3 2,8 ± 0,1 2,9 ± 0,3

0 5 10 15 20 25 300

2

4

6

8

10

12

14

turfa/NaOH turfa/Na4P2O7 vermicomposto/NaOH vermicomposto/Na4P2O7 branco

pH

Volume de HCl (mL)FIGURA 16 - Curva titulométrica de ácidos húmicos (dissolvidos em solução

de Ba(OH)2) com HCl 0,05 mol L-1 (acidez total).


0 2 4 6 8 105

6

7

8

9

10

11

12

turfa/NaOH turfa/Na4P2O7 vermicomposto/NaOH vermicomposto/Na4P2O7 brancopH

Volume de NaOH (mL)

FIGURA 17 - Curva titulométrica de ácidos húmicos (dissolvidos em solução

de Ca(CH3COO)2) com NaOH 0,05 mol L-1 (acidez carboxílica).

Esses resultados mostram uma maior acidez carboxílica nas

amostras de AH de turfa. Observa-se também uma maior acidez carboxílica

nas amostras de vermicomposto extraídas com pirofosfato de sódio em

relação às extraídas com hidróxido de sódio, ou seja, o pirofosfato de sódio

foi mais seletivo em relação aos grupos funcionais dos AH.

5.4 Titulação Potenciométrica – Funções de Gran

5.4.1 Introdução

Titulações potenciométricas são freqüentemente utilizadas para

se estudar as propriedades ácido-base das substâncias húmicas. A

presença de grupos fenólicos e carboxílicos com diferentes forças ácidas,

aliada a efeitos eletrostáticos, devido à acumulação de cargas na

macromolécula, leva a curvas de titulação sem nenhum ponto de inflexão

abrupta. Assim, o uso de métodos numéricos tem sido proposto para

distinguir grupos ácidos de diferentes forças.

Titulações de ácidos húmicos em meio aquoso usando funções

de Gran modificadas (baseadas em equações lineares) foram estudadas por

alguns pesquisadores (Abate e Masini, 2001; Aleixo et al., 1992; Cabaniss,


1991; Masini, 1994). Masini et al. (1998) utilizaram funções de Gran, com

regressão não-linear, para determinação das constantes de ionização dos

sítios ionizáveis de amostras de AH da Aldrich e de vermicomposto. Outros

modelos potenciométricos também foram utilizados nos estudos das

propriedades ácidas das SH (Bonn e Fish, 1991; Falzoni et al., 1998;

Fukushima et al., 1996; Kurková et al., 2004; Manusa et al., 1992; Marshall

et al., 1995). Métodos baseados em titulações condutimétricas (Van der

Hoop e Van Leeuwen, 1990) e por espectroscopia no infravermelho

(Cabaniss, 1991) também foram propostos.


As titulações potenciométricas foram realizadas, utilizando-se

um pHmetro Metrohm 654, com precisão de 0,1 mV ou 0,001 unidades de

pH, uma bomba de pistão do sistema FIALab 3500 (capacidade de 2,5 mL e

resolução de 0,1 µL) nas titulações, e uma cela de vidro com capacidade de

50,0 mL provida de uma “camisa” externa que permite a circulação de água

com o objetivo de manter a temperatura constante. Durante todas as

titulações, a cela foi termostatizada a 25,0 ± 0,5 °C com auxílio do banho

termostático Ética 521D, e circulado N2 livre de CO2 em seu interior.

Nas titulações dos AH, foram preparadas suspensões das

amostras (cerca de 12 mg) em 25 mL de solução de KNO3 0,1 mol L-1 (para

se ajustar a concentração iônica do meio). As concentrações de AH e a

concentração iônica foram escolhidas como os valores que propiciaram

melhores resultados em experimentos realizados por Masini (1999). As

suspensões foram tituladas com solução de NaOH 0,1241 mol L-1, e foram

obtidos cerca de 80 pontos (volume de NaOH e potencial do eletrodo) para

cada amostra. Uma vez por dia, eram realizados experimentos de calibração

dos eletrodos (para determinação do produto de ionização da água e

conversão de potencial para pH), utilizando-se um volume inicial (Vo) de

27,5 mL (25,0 mL de KNO3 0,1 mol L-1 e 2,5 mL de HCl) e solução de NaOH

0,1241 mol L-1 como titulante (fluxo de 50 µL s-1).


Para determinação dos parâmetros ácido-base (inclusive pKa)

das amostras, foram usadas as funções de Gran, com regressão não-linear.

Para tanto, foi utilizado o algoritmo MIXAC, suportado em linguagem Q-

BASIC. Para a conversão de potencial para pH, utilizou-se o algoritmo

CONVERT, também em linguagem Q-BASIC.

5.4.3 Calibração dos Eletrodos

Pela teoria de Debye-Hückel, mantendo-se constante a

temperatura e o meio iônico, os coeficientes de atividade do íon H+ mantêm-

se constantes durante a titulação. Com isso, a equação de Nernst pode ser

escrita como:

joa EHEE ++= + ]log[16,59 (24)

em que: E = potencial medido;

Eoa = termo que engloba o potencial padrão do eletrodo e o

coeficiente de atividade do íon H+;

Ej = potencial de junção líquida.

O potencial de junção líquida pode ser representado por:

].[].[ −+ += OHJHJE OHHj(25)

em que: JH e JOH são característicos do meio iônico.

Na região ácida da titulação de calibração, o termo JOH[OH–]

pode ser desprezado, e a equação 24 pode ser escrita como:

].[]log[16,59 ++ ++= HJHEE Hoa

(26)

Colocando-se em um gráfico o termo E – 59, 16 log[H+] em

função de [H+], obtém-se uma reta cujo coeficiente angular é igual a JH e o

coeficiente linear igual a Eoa.

De forma análoga, na região alcalina da titulação, o gráfico de

E – 59,16 log[OH–] em função de [OH–] fornece JOH e Eob.

Os valores de [H+] e [OH–] podem ser obtidos pelas equações:

( )b

o

e CVVVV

H .][+−

=+ (27)


( )b

o

e CVVVV

OH .][+

−=−

(28)

em que: Ve = volume de equivalência;

V = volume do titulante adicionado;

Vo = volume inicial do titulado;

Cb = concentração da base.

O volume de equivalência, por sua vez, pode ser determinado

pela interseção das funções de Gran F1 = (Vo + V) x 10E/59,16 (região ácida) e

F2 = (Vo + V) x 10–E/59,16 (região alcalina) com o eixo do volume do titulante

adicionado (V).

Por fim, a constante de ionização da água (Kw), no meio iônico

e temperatura usados, pode ser determinado pela expressão:

16,59log

ob

oa

wEE

K−

= (29)

Assim, a partir de uma titulação potenciométrica de um ácido

forte e uma base forte de concentração conhecida, a temperatura e meio

iônico constantes, é possível determinar os valores de Eoa, JH e JOH, além do

produto iônico da água, Kw. Com isso, torna-se possível relacionar o

potencial medido com [H+] (ou com pH), usando-se a equação 24 para a

titulação de uma amostra desconhecida, realizada nas mesmas condições

de temperatura e concentração iônica.

5.4.4 Cálculo do pKa dos Ácidos Húmicos

Foi utilizado o método não-linear de Gran para determinação

do pKa de uma amostra de AH de vermicomposto. O programa de regressão

não-linear utiliza a equação geral que descreve a titulação de uma mistura

de um ácido forte com N ácidos fracos (sítios ionizáveis):

( ) ( ) { }( ) ( ){ }∑=

+++−

−−+−+−=N

jbjHAHAowbHA CAVVVVHKHCVVHVf

jjo1

...][][.,1 (30)

em que: V = volume do titulante;

Vo = volume inicial presente na cela;


VHAo e VHAj = volume de equivalência para o ácido forte e para o j-

ésimo ácido fraco;

Kw = produto de ionização da água a 25 °C;

Cb = concentração do titulante (em mol L-1).

O termo Aj é definido por:

][ ++=

HK

KA

j

j

HA

HAj (31)

O pH é adotado como variável dependente e o volume do

titulante como variável independente. VHAj e KHAj são os parâmetros

ajustáveis no cálculo, que é realizado minimizando-se o erro da soma, S:

( )2

1'∑

=

−=m

jjj pHpHS (32)

em que: m = total de dados (V, pH) usado na análise de regressão;

pHj = pH experimental;

pH’j = pH calculado.

Os valores de pH foram calculados usando-se uma sub-rotina

iterativa baseada no método de Newton-Raphson. Inicialmente, os valores

de [H+] são calculados usando os valores iniciais estimados para VHAj e KHAj.

As melhores aproximações para os valores de [H+] calculados no ponto

experimental j são obtidos através de sucessivas iterações, k, de acordo

com a equação:

( )( )kj

kjkjkj HVf

HVfHH

,

,,1, ][,'

][,][][

+

++

++ −= (33)

em que: f’(V, [H+]j,k) = primeira derivada da equação 6666.

A equação 33 é usada repetidamente até que ocorra a

convergência a um valor limite, previamente definido por:

00001,0][

][][

,

,1, <−

+

++

+

kj

kjkj

HHH

(34)



A figura 18 mostra as curvas de titulação das amostras de

ácidos húmicos, de onde se pode observar que praticamente não há pontos

de inflexão bem definidos, indicando a presença de grande quantidade de

grupos ácidos com diferentes valores de pKa.

0 400 800 1200 1600 20002

4

6

8

10

12

turfa/NaOH turfa/Na4P2O7 vermicomposto/NaOH vermicomposto/Na4P2O7

pH

Volume de NaOH (µL)

FIGURA 18 - Curvas de titulação experimentais obtidos para os ácidos

húmicos de turfa e vermicomposto (ca. 0,5 g L-1 em KNO3 0,1 mol L-1) com

NaOH 0,1241 mol L-1.

A tabela 12 mostra os valores de pKa obtidos da função de

Gran, com regressão não-linear, de uma amostra de ácido húmico de

vermicomposto.


TABELA 12 - Valores de constante de ionização ácida (Ka e pKa) e

concentração em mmol por grama de ácido húmico (CHA) relacionados às

espécies ionizáveis HAi (i = 1 a 4) de ácidos húmicos de vermicomposto.

Resultados obtidos por função de Gran (regressão não-linear).

HA1 HA2 HA3 HA4

Ka 1,61 x 10-4 2,78 x 10-6 1,23 x 10-7 2,93 x 10-9

pKa 3,79 5,56 6,91 8,53

CHA 0,77 1,25 1,12 0,72

As 3 primeiras espécies (HA1 a HA3) foram tituladas em um

intervalo de pH característico de grupos carboxílicos, enquanto HA4 pode ser

atribuído a grupos fenólicos (Masini, 1999).

Os valores de pKa obtidos para a amostra de AH foi bem

semelhantes aos observados na literatura para AH de vermicomposto

(Masini, 1999; Masini et al., 1998).

5.5 Análise Elementar (CHNS)

5.5.1 Introdução

Os primeiros experimentos para determinação da composição

elementar das SH foram feitos por Sprengel e Berzelius entre os anos de

1826 e 1845 (Stevenson, 1994). Segundo eles, as SH eram constituídas

essencialmente de carbono (C), hidrogênio (H), nitrogênio (N) e oxigênio (O),

sendo C e O os elementos mais abundantes.

Os métodos para determinação desses elementos são muito

variados, dentre eles os métodos químicos. Assim, carbono e hidrogênio

podem ser determinados por combustão completa a seco, nitrogênio pelos

métodos de Dumas ou de Kjeldahl, oxigênio por pirólise redutiva e enxofre

por combustão (Huffman Jr. e Stuber, 1985)

Entretanto, a utilização de analisadores elementares

automáticos trouxe avanços consideráveis nesse sentido, permitindo


análises rápidas e confiáveis. Os analisadores elementares atuais são

baseados na oxidação da amostra em alta temperatura, depois da qual os

gases resultantes são separados por uma coluna cromatográfica e

detectados, geralmente, por condutividade térmica (Skoog et al., 2002).

Informações isoladas sobre a composição elementar dessas

substâncias não são muito conclusivas, e as razões atômicas (H/C, O/C,

C/N) têm sido preferencialmente utilizadas para estabelecer o grau de

condensação, as transformações diagenéticas, bem como as condições

ambientais sob as quais elas foram formadas. Existem, inclusive, diversos

diagramas que relacionam as razões atômicas com o tipo de material

húmico (Yonebayashi e Hattori, 1988).

A razão H/C é freqüentemente associada ao grau de

condensação ou de aromaticidade, e este, por sua vez, ao grau de

humificação, sendo que maiores valores de H/C (ou menores valores de

C/H) indicam maior quantidade de grupos alifáticos, típicos de materiais

menos humificados (Stevenson, 1994). As razões O/C e C/N indicam,

respectivamente, o teor de grupos oxigenados presentes na molécula e o

grau de incorporação de nitrogênio na estrutura. Apesar de não ter uma

relação tão direta, amostras mais humificadas apresentam, em geral,

maiores valores de O/C e C/N (Stearman et al., 1989).

Em geral, ácidos húmicos apresentam menores valores de H/C

e O/C que ácidos fúlvicos (Bravard e Righi, 1991; Rasyid et al., 1992).

Veeken et al. (2000) observaram um decréscimo nas razões H/C e C/N e

aumento na razão O/C quando se aumentava o tempo de compostagem de

resíduos urbanos. Outros parâmetros que podem ser obtidos pela análise

elementar são grau de polaridade, correspondente à razão atômica (O +

N)/C (Fukushima et al., 1996) e grau de oxidação, correspondente à razão

atômica (2O – H)/C (Canellas, 1999).


Os experimentos foram realizados em um analisador elementar

CE Instruments EA 1110 CHNS-O, em que foram utilizados os seguintes


padrões: L-cistina, sulfanilamida, DL-metionina e BBOT (2,5-bis-(5-tert-butil-

benzoxazol-2-il)-tiofeno). Foram pesados, em cada análise, cerca de 2 mg

de amostra. Os valores de C, H, N e S (porcentagem em massa) foram

corrigidos para base seca e sem cinzas (valor corrigido = valor original x 100

÷ (100 – teor de umidade – teor de cinzas)), sendo que do teor de H foi

subtraído o H originário da umidade, antes da correção para base seca e

sem cinzas. O teor de oxigênio foi determinado por diferença a 100% a partir

dos valores de C, H, N e S corrigidos.

Os parâmetros H/C, O/C, C/N e (O + N)/C foram determinados

pelas razões atômicas, ou seja, dividindo-se previamente as porcentagens

em massa dos elementos por suas respectivas massas atômicas.


Os valores de porcentagem em massa de C, H, N, S e O, e as

razões atômicas H/C, e O/C e C/N, estão mostrados na tabela 13.

TABELA 13 - Teor (em massa) de C, H, N, S e O, e razões elementares H/C,

O/C, C/N e (O + N)/C das amostras de ácidos húmicos (entre parênteses:

desvio-padrão; n = 3 determinações).

TN TP VN VP

C (%) 55,82 (0,06) 55,15 (0,25) 53,03 (0,65) 52,81 (0,20)

H (%) 4,45 (0,09) 4,20 (0,14) 5,81 (0,17) 5,21 (0,47)

N (%) 3,11 (0,04) 2,75 (0,08) 3,67 (0,02) 3,58 (0,09)

S (%) nd nd nd nd

O (%) 36,63 (0,09) 37,90 (0,32) 37,49 (0,80) 38,40 (0,59)

H/C 0,96 (0,02) 0,91 (0,03) 1,31 (0,02) 1,18 (0,10)

O/C 0,49 (0,00) 0,52 (0,01) 0,53 (0,02) 0,55 (0,01)

C/N 20,96 (0,27) 23,45 (0,58) 16,85 (0,28) 17,20 (0,49)

(O + N)/C 0,54 (0,00) 0,56 (0,01) 0,59 (0,02) 0,60 (0,01)nd = não detectado.


As razões H/C obtidas para as amostras de AH de

vermicomposto foram maiores que das amostras de AH de turfa (e próximas

às encontradas por Hervas et al., 1989), indicando uma menor proporção de

estruturas condensadas no AH de vermicomposto. Esse resultado confirma

o esperado, uma vez que o vermicomposto é bem menos humificado (e,

conseqüentemente, com menor quantidade de estruturas aromáticas) que a

turfa. Com a razões O/C e (O+N)/C acontece o mesmo, apesar da diferença

ser bem menor, indicando menor quantidade de grupos oxigenados nas

amostras de AH de turfa.

Comparando-se as extrações, observa-se valores muito

próximos entre AH extraídos com NaOH e com pirofosfato de sódio. As

razões H/C são ligeiramente menores para AH extraídos com pirofosfato.

Entretanto, as razões O/C são praticamente iguais entre os AH extraídos

com NaOH e com pirofosfato.

A figura 19 apresenta um diagrama de Van Krevelen que

correlaciona as razões atômicas H/C e O/C, discriminando os diferentes

tipos de materiais e os mecanismos de reação. Pode ser observado que as

amostras estudadas ficaram nas regiões características de turfa e ácidos

húmicos (não há no diagrama região característica de materiais

compostados).

FIGURA 19 - Diagrama de Van Krevelen de correlação entre as razões H/C

e O/C e o tipo de matriz. Os pontos coloridos correspondem às amostras de

ácidos húmicos (preto: TN; vermelho: TP; verde: VN; azul: VP).


5.6 Análise Termogravimétrica

5.6.1 Introdução

No estudo de substâncias húmicas e de matéria orgânica do

solo em geral, a termogravimetria é bastante utilizada para quantificar teor

de umidade e de cinzas (resíduos inorgânicos). Entretanto, alguns autores

têm usado essa técnica, juntamente com outras análises térmicas, para

caracterizar substâncias húmicas (Esteves e Duarte, 1999; Provenzano et

al., 1998; Provenzano e Senesi, 1999) e estudar interações de SH com íons

metálicos (Martyniuk et al., 2001; Prado e Airoldi, 2003).

Diferenças nas curvas termogravimétricas (TG) e

especialmente nas suas primeiras derivadas (DTG), que enfatizam

mudanças no sinal, são provavelmente devido a diferentes graus de

humificação (Busnot et al., 1995; Pietro e Paola, 2004) e a diferentes

mecanismos químicos e biológicos que originaram as substâncias húmicas.

Em substâncias húmicas, as curvas TG e DTG apresentam

duas perdas de massa correspondente à matéria orgânica: uma perda

abaixo de 300 °C, referente à decomposição de carboidratos e grupos

carboxílicos, metil, metileno e alcoólicos e perda de insaturação, e uma

perda a temperaturas mais elevadas (> 300 °C) devido à oxidação e

policondensação de estruturas aromáticas (Campanella e Tomassetti, 1990;

Provenzano et al., 1998). Assim, a razão entre as perdas de massa em

temperaturas maiores e as perdas de massa em temperaturas menores,

chamada de Índice Termogravimétrico (ITG), pode ser um bom indicativo de

quantidade relativa de estruturas aromáticas e, conseqüentemente, do grau

de humificação das amostras.


As análises termogravimétricas (TG) e de calorimetria

diferencial exploratória (DSC) foram realizadas em um sistema de análise

térmica TGA 2050, da TA Instruments. Foram utilizadas as seguintes

condições experimentais nas análises TG: atmosfera oxidante (ar sintético),


com fluxo de 80 mL min-1, intervalo de temperatura de 25 a 800 °C (298 a

1073 K) com razão de aquecimento de 10 °C min-1 e massa de amostra em

torno de 10 mg, acondicionada em um suporte aberto de platina. Para as

análises de DSC, foram utilizados atmosfera oxidante (ar sintético) com fluxo

de 80 mL min-1, intervalo de temperatura de 25 a 550 °C (298 a 823 K) com

razão de aquecimento de 10 °C min-1 e massa de amostra em torno de 10

mg, acondicionada em um suporte fechado (mas não hermeticamente) de

alumínio. As curvas de termogravimetria derivada (DTG) foram obtidas no

software Microcal Origin, a partir das curvas TG. Os índices

termogravimétricos (ITG) foram calculados a partir da razão entre as perdas

de massa no intervalo 350-600 °C e no intervalo 140-350 °C (nas amostras

de AH de turfa) e entre as perdas de massa no intervalo 370-600 °C e no

intervalo 120-370 °C (nas amostras de AH de vermicomposto).

As análises térmicas diferenciais (DTA) foram realizadas em

um sistema de DTA Shimadzu 50H com as seguintes condições: atmosfera

oxidante (ar sintético), intervalo de temperatura de 25 a 900 °C (298 a 1173

K) com razão de aquecimento de 10 °C min-1 e massa de amostra em torno

de 10 mg, acondicionada em um suporte aberto de platina. O sistema foi

calibrado com relação à linha de base e à temperatura com índio e zinco de

alta pureza.


As figuras 20 a 23 mostram as curvas TG e DTG das amostras

de AH. Podem ser observadas três perdas de massa no intervalo 25-800 °C.

A primeira perda de massa (no intervalo 50-130 °C) é representativa de

reações de desidratação. Nas outras perdas de massa, entre 130 e 600 °C,

ocorre o processo de decomposição da matéria orgânica: combustão de

carboidratos (próximo a 300 °C) e degradação térmica de estruturas

aromáticas (próximo a 500 °C). Observa-se também que nas amostras de

AH de turfa (figuras 20 e 21), a perda de massa próxima a 500 °C é dividida

em duas partes, o que não ocorre nas amostras de AH de vermicomposto


(figuras 22 e 23). Por sua vez, nessas últimas, verifica-se um ombro na

curva DTG próximo a 250 °C.

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

20

40

60

80

100

Mas

sa (%

)

Temperatura (oC)FIGURA 20 - Curvas TG (em vermelho) e DTG (em azul) de ácidos húmicos

de turfa extraídos com NaOH.

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

20

40

60

80

100

Mas

sa (%

)

Temperatura (oC)

FIGURA 21 - Curvas TG (em azul) e DTG (em azul) de ácidos húmicos de

turfa extraídos com Na4P2O7.


0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

20

40

60

80

100

Mas

sa (%

)

Temperatura (oC)

FIGURA 22 - Curvas TG (em vermelho) e DTG (em azul) de ácidos húmicos

de vermicomposto extraídos com NaOH.

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

20

40

60

80

100

Mas

sa (%

)

Temperatura (oC)

FIGURA 23 - Curvas TG (em vermelho) e DTG (em azul) de ácidos húmicos

de vermicomposto extraídos com Na4P2O7.

A tabela 14 apresenta as perdas de massa das amostras

(correspondentes aos principais picos mostrados pelas curvas DTG) e os

valores de ITG obtidos. As perdas de massa ocorridas no intervalo de 130 a

360 °C foram menores para AH de turfa (19,95% e 18,31%) que para AH de

vermicomposto (39,74% e 40,06%). Por outro lado, as perdas de massa


ocorridas entre 360 e 600 °C, atribuídas a dissociação e decomposição de

estruturas aromáticas e sistemas polinucleares, foram maiores para AH de

turfa (69,95% e 70,26%) que para AH de vermicomposto (49,26% e

46,96%). Assim, os valores de ITG calculados para as amostras de AH de

turfa foram cerca de 3 vezes maiores que para as amostras de AH de

vermicomposto, confirmando a maior quantidade de estruturas aromáticas

nas amostras de AH de turfa. Entretanto, não se verificou nenhuma

diferença significativa nas perdas de massa e nos valores de ITG entre as

amostras extraídas com NaOH e as extraídas com Na4P2O7.

TABELA 14 - Perdas de massa e índice termogravimétrico (ITG) de

amostras de ácidos húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3

determinações).

Amostra 25-130 °C 130-360 °C 360-600 °C ITG

TN 8,07 (1,73) 19,95 (0,29) 69,86 (1,58) 3,90 (0,13)

TP 9,74 (1,90) 18,32 (0,29) 70,26 (1,24) 3,84 (0,12)

VN 6,40 (1,58) 39,74 (1,49) 49,26 (0,61) 1,24 (0,06)

VP 8,47 (0,77) 40,06 (0,30) 46,86 (0,62) 1,17 (0,01)

A figura 24 mostra as curvas DSC das amostras de AH. Pode

ser verificado um pico endotérmico bem proeminente, relacionado à perda

de água de hidratação. Como os experimentos de DSC foram realizados em

suporte fechado, a pressão de vapor da água dificulta sua saída. Assim, a

perda de água ocorre em temperaturas maiores e pode ser observada por

picos bem agudos. Observa-se também que nas amostras de AH de

vermicomposto, a perda de água ocorre em temperaturas maiores (145 °C)

do que nas amostras de AH de turfa (120 °C), indicando que nessas

amostras, as moléculas de água estão mais fracamente ligadas do que nas

amostras de AH de vermicomposto. Entretanto, os picos relacionados às

reações de oxidação da matéria orgânica foram bastante largos e de baixa

intensidade, provavelmente devido também ao suporte.


0 100 200 300 400 500

-3

-2

-1

0

1

2

exotérmico


Flux

o de

cal

or (W

g-1)

Temperatura (oC)

FIGURA 24 - Curvas DSC das amostras de ácidos húmicos.

As curvas DTA (figura 25) mostram que, ao contrário do que

ocorre nas curvas DSC, o pico endotérmico da perda de água é bem largo,

abrangendo o intervalo de 25 a 120 °C, e praticamente igual para todas as

amostras. Ou seja, a perda de água ocorre de maneira bem lenta e gradual.

Deve-se lembrar que as análises de DTA foram feitas em suporte aberto. As

curvas DTA mostram também dois picos exotérmicos distintos (190-400 e

400-580 °C, sendo que o segundo pico, nas amostras de AH de

vermicomposto extraídas com Na4P2O7, foi desdobrado em dois) bem

proeminentes, típicos da decomposição térmica e oxidação de componentes

orgânicos de diferentes estabilidades térmicas (Pietro e Paola, 2004). Nas

amostras de AH de turfa, o segundo pico, correspondente a oxidação de

estruturas aromáticas, apresentaram intensidade muito maior que o primeiro,

correspondente a degradação de carboidratos e estruturas alifáticas. Por

outro lado, nas amostras de AH de vermicomposto, o primeiro pico

apresentou maior intensidade que o segundo. Os pontos máximos dos picos

exotérmicos ocorreram a 320 °C e entre 460 e 500 °C, próximos aos pontos

máximos verificados nas curvas DTG. Esse fato confirma que as perdas de

massa relacionadas à matéria orgânica são devidas a reações exotérmicas.


0 100 200 300 400 500 600 700 800 900-50

0

50

100

150

200

250

exotérmico


∆T (o C

)

Temperatura (oC)FIGURA 25 - Curvas DTA das amostras de ácidos húmicos.

5.7 Espectroscopia de Absorção no Ultravioleta/Visível

5.7.1 Introdução

Através da espectroscopia de absorção na região do

ultravioleta e visível, é possível calcular a razão E4/E6 (razão entre as

absorbâncias a 465 e a 665 nm). Essa razão é um primeiro indicativo da

proporção de grupos aromáticos. Pelo mesmo propósito, já foram utilizadas

(com menor freqüência) razões entre as absorbâncias a 350 e a 450 nm

(E350/E450) e entre as absorbâncias a 350 e a 550 nm (E350/E550) (Dick e

Burba, 1999). Quanto maior a aromaticidade, menor a razão E4/E6.

Entretanto, deve-se levar em conta que essa relação deve ser interpretada

com cuidado, pois a comparação entre amostras bem distintas pode não ser

conclusiva. Chen et al. (1977) estudaram a correlação entre E4/E6 de AH e

diversos parâmetros, como concentração de AH, viscosidade, pH, massa

molecular e quantidade de radicais livres. Trubetskoj et al. (1999)

fracionaram AH de 4 solos diferentes por SEC-PAGE e observaram que a

razão E4/E6 diminui com o aumento do tamanho molecular. Martin-Neto et al.

(1998) estudaram a correlação entre índice pluviométrico anual e E4/E6 e

concentração de radicais livres (medida por EPR) de amostras de AH.

Verificou-se também boa correlação linear entre aromaticidade e


absortividade a 272 ou 280 nm (Fukushima et al., 1996; Chin et al., 1994;

Traina et al., 1990).

A absorbância da maioria dos ácidos húmicos decresce

exponencialmente com o comprimento de onda (ou pelo menos parte do

espectro possui esse comportamento) (Yonebayashi e Hattori, 1988). Assim,

pode-se relacionar a absorbância E e o comprimento de onda λ:λ.10. baE −= (35)

em que: a e b são constantes.

Dessa forma, o logaritmo da absorbância é uma função linear

do comprimento de onda:

λbaE −= loglog (36)

A inclinação da reta (b) pode ser definida como:

λdEdb log

−= (37)

Utilizando-se comprimentos de onda iguais a 600 e 400 nm e

um parâmetro ∆log K, definido como a diferença entre os logaritmos das

absorbâncias a 400 nm (log E400 ou log K400) e a 600 nm (log E600 ou log

K600) (Kumada, 1987), o valor de b pode ser redefinido como:

200log

600400loglog 600400 KEE

b ∆=

−−

−= (38)

A equação 36 pode ser então reescrita como:

( )λ.200logloglog KaE ∆−= (39)

Fixando-se um comprimento de onda, pode-se relacionar log E

e ∆log K de diversas amostras de ácidos húmicos, resultando em uma

correlação linear com coeficiente angular igual a λ/200 e coeficiente linear

igual a log a. Yonebayashi e Hattori (1988) construíram um diagrama de log

E6001% (absorbância a 600 nm de uma solução de AH a 1%) versus ∆log K

de 41 amostras e encontraram uma correlação de 86,9%, concluindo que o

mecanismo fundamental da absorção de luz de todos os ácidos húmicos era

similar.

Pode-se utilizar, no lugar de E6001%, um outro parâmetro,

chamado de RF, definido como o valor da absorbância a 600 nm


normalizado pela massa de carbono orgânico presente na solução (Kumada,

1987; Maie et al., 2002).


Cerca de 5,0 mg de AH purificado foram dissolvidos em 50,0

mL de uma solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,025 mol L-1, com

pH 8,4. As medidas de absorbância da solução foram obtidas a partir do

espectro na região do visível, utilizando um espectrofotômetro de UV-Visível

Hitachi U3501 e uma cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico.

Com os valores de absorbância nos comprimentos de onda 465

e 665 nm, calculou-se a razão E4/E6. Os parâmetros ∆log K e RF foram

calculados a partir das equações 40 e 41:

600400 logloglog EEK −=∆ (40)

( ) 15.6 cERF = (41)

em que: E400 e E600 = valores de absorbância em 400 e 600 nm;

c = massa (em mg) de C orgânico por volume (em mL) de solução

de AH.


Os espectros de absorbância na região do UV/visível das

amostras de AH estão mostrados na figura 26. Pode ser observado um

comportamento logarítmico dos espectros, pelo menos entre 400 e 800 nm,

o que pode ser verificado pelo gráfico do logaritmo da absorbância em

relação ao comprimento de onda (figura 27). As amostras de AH de

vermicomposto apresentaram um ombro próximo a 280 nm, característico de

grupos cromóforos, como estruturas insaturadas e/ou aromáticas (Prudent et

al., 1995). Nos AH de turfa, a absorção nessa região ocorre de forma mais

intensa e homogênea.


200 300 400 500 600 700 800

0

1

2

3

4

5


Abso

rbân

cia

Comprimento de onda (nm)

FIGURA 26 - Espectros de absorbância no UV/visível das amostras de

ácidos húmicos.

450 500 550 600 650 7000.01

0.1

1


Abso

rbân

cia

Comprimento de onda (nm)

FIGURA 27 - Gráfico de logaritmo de absorbância por logaritmo de

comprimento de onda nas amostras de ácidos húmicos.

Os valores da razão E4/E6 e dos parâmetros ∆log K e RF estão

mostrados na tabela 15.


TABELA 15 - Valores de E4/E6, ∆log K e RF das amostras de ácidos

húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3 determinações).

Amostra Razão E4/E6 ∆log K RF

TN 3,77 (0,02) 0,58 (0,00) 67,68 (1,61)

TP 4,26 (0,01) 0,63 (0,00) 57,65 (2,75)

VN 5,23 (0,28) 0,72 (0,02) 9,98 (0,11)

VP 5,20 (0,21) 0,72 (0,02) 11,88 (0,86)

Pode ser observado na tabela 15 que, em relação as amostras

de AH de turfa, as amostras de AH de vermicomposto apresentaram valores

de E4/E6 e ∆log K maiores e valores de RF consideravelmente menores.

Como os parâmetros E4/E6 e ∆log K diminuem com o grau de humificação, e

o parâmetro RF aumenta com a humificação, esses resultados são um

primeiro indicativo do menor grau de humificação do AH de vermicomposto.

Os valores da razão E4/E6 obtidos pelos AH de vermicomposto estão de

acordo com os valores citados na literatura (Hervas et al., 1989; Landgraf et

al., 1999). Os valores de ∆log K obtidos foram próximos aos citados na

literatura para amostras de solo (Barančiková et al., 1997; Yonebayashi e

Hattori, 1988). Já os valores de RF ficaram abaixo dos obtidos por Maie et

al. (2002) também para amostras de solo. Ao contrário de ∆log K, o

parâmetro RF é bastante afetado pela presença de substâncias não húmicas

nas amostras (Kumada, 1987). Também foi verificado um valor de E4/E6

ligeiramente menor para as amostras de AH de turfa extraídas com NaOH,

quando comparado com as amostras extraídas com Na4P2O7.

5.8 Espectroscopia de Fluorescência

5.8.1 Introdução

A utilização da espectroscopia como uma técnica sensível e

relativamente simples para estudar a estrutura e os grupos funcionais de

ácidos húmicos e demais substâncias húmicas deve-se à presença de várias


estruturas fluorescentes (fluoróforos) na macromolécula húmica, que inclui

desde estruturas aromáticas condensadas a cadeias alifáticas insaturadas.

Além disso, as propriedades fluorescentes de ácidos húmicos dependem de

diversos parâmetros, incluindo sua origem, massa molecular e sua

concentração, pH, intensidade iônica, temperatura e potencial redox do

meio, bem como suas interações com íons metálicos e compostos

orgânicos. O efeito desses parâmetros em ácidos fúlvicos tem sido estudado

por diversos pesquisadores, como relatado por Senesi (1990b).

Apesar de ainda não ser possível identificar todos os

fluoróforos presentes nas SH, algumas moléculas potencialmente

responsáveis por emissão de fluorescência são: salicilato de metila, ácido

salicílico, ácido 3-hidroxibenzóico, ácido caféico, ácido felúrico, β-naftóis

ionizados, cumarinas não substituídas, derivados de cromonas, xantonas e

hidroxixantonas (Giovanela, 2003; Senesi et al., 1991).

Pullin e Cabaniss (1995) estudaram o efeito do pH nos

espectros de fluorescência de 6 amostras de ácidos húmicos e fúlvicos, e

concluíram que os espectros de emissão (com excitação a 340 nm) e os

espectros de excitação (com emissão a 450 nm) tiveram pouca variação,

nos intervalos de pH de 3,2 a 10,3; entretanto, foi observada grande

variação nos espectros no modo síncrono (∆λ = 20 nm).

Recentemente, a espectroscopia de fluorescência tem sido

utilizada na avaliação do grau de humificação de substâncias húmicas. De

acordo com Zsolnay et al. (1999), quando os fluoróforos se tornam mais

condensados, o espectro de emissão tende-se a deslocar para regiões com

maior comprimento de onda. Assim, pode-se estimar o grau de humificação

pela razão entre a área da região de maior comprimento de onda do

espectro e a área da região de menor comprimento de onda.

De acordo com Kalbitz et al. (1999), os espectros no modo

síncrono (variando-se simultaneamente a excitação e a emissão) de

substâncias húmicas apresentam 2 picos em 360 e 400 nm e um ombro em

470 nm, e o máximo de intensidade tende a se deslocar para regiões de

maior comprimento de onda com o aumento do número de anéis aromáticos


substituídos e/ou cadeias insaturadas conjugadas, com alto grau de

ressonância.

De acordo com Milori et al. (2002), a absorção de luz azul por

AH é mais ressonante com estruturas cuja concentração aumenta com o

grau de humificação. Por isso, pode-se estimá-lo pela área total do espectro

de emissão com excitação a 465 nm. Milori et al. estudaram 18 amostras de

AH de 4 solos brasileiros e comparam os diferentes métodos de se estimar o

grau de humificação por fluorescência.


Os espectros de fluorescência foram obtidos por um

espectrômetro de luminescência Perkin Elmer LS 50 B. Os ácidos húmicos

foram dissolvidos em uma solução de NaHCO3 0,05 mol L-1, de modo que a

concentração de AH seja de 20 mg L-1 e o pH igual a 8 (Milori et al., 2002).

Foram obtidos os seguintes espectros:

• Emissão (intervalo de 300 a 650 nm; excitação a 240 nm);

• Emissão (intervalo de 480 a 650 nm; excitação a 465 nm);

• Síncrono (intervalo de excitação de 220 a 600 nm; ∆λ = 55 nm);

• Excitação (intervalo de 220 a 480 nm; emissão a 500 nm);

• Emissão-excitação (3D) (intervalo de emissão de 350 a 650 nm, de 0,5

em 0,5 nm; intervalo de excitação de 220 a 560 nm, de 10 em 10 nm).

Em todos os espectros, a velocidade de varredura foi de 200

nm min-1 e, com exceção dos espectros de emissão-excitação (3D), as

aquisições dos dados de fluorescência no intervalo de emissão ou excitação

selecionado foram de 0,5 em 0,5 nm.

O índice de humificação proposto por Zsolnay et al. (1999)

(A4/A1) foi calculado a partir do espectro de emissão (com excitação a 240

nm) dividindo-se a área sob o espectro entre 570 e 645 nm (A4) pela área

sob o espectro entre 356 e 432 nm (A1).

Os índices de humificação propostos por Kalbitz et al. (1999)

foram calculados a partir do espectro no modo síncrono, dividindo-se a


intensidade de fluorescência a 470 nm pela intensidade a 400 nm (I470/I400) e

pela intensidade a 360 nm (I470/I400).

Já o grau de humificação proposto pelo método de Milori et al.

(2002) (A465) corresponde à área total do espectro de emissão (com

excitação a 465 nm)


Os espectros de emissão (com excitação a 240 nm) das

amostras de AH estão mostrados na figura 28. Pode ser observado que, nas

amostras de AH de turfa, o máximo de intensidade ocorre próximo a 500 nm,

enquanto que, nas amostras de AH de vermicomposto, o máximo ocorre

entre 400 e 450 nm, com um ombro proeminente a 360 nm. Esses espectros

se assemelham aos encontrados em amostras de composto de resíduos

domésticos e industriais (Miikki et al., 1997). Os valores do índice A4/A1

(tabela 16) variaram de 0,053 a 0,475. Os mais baixos valores ocorreram

para as amostras de AH de vermicomposto (0,053 e 0,089) e os valores

mais altos (0,439 e 0,475) ocorreram para as amostras de AH de turfa.

300 350 400 450 500 550 600 650

0

5

10

15

20

25

30 turfa/NaOH turfa/Na4P2O7 vermicomposto/NaOH vermicomposto/Na4P2O7

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(u.a

.)

λem (nm)FIGURA 28 - Espectro de emissão (com excitação a 240 nm) das amostras

de ácidos húmicos.


Os espectros no modo síncrono (figura 29) das amostras de AH

de turfa mostram um pico intenso a 470 nm e dois ombros próximos a 400 e

a 370 nm, um comportamento inverso aos encontrados por Kalbitz et al.

(1999). Nos espectros das amostras de AH de vermicomposto (figuras 29 e

30), além de um sensível decréscimo da intensidade de fluorescência, pode

ser verificado um aparecimento de dois picos de intensidade semelhante, a

375 e a 455 nm, além de dois ombros a 300 e a 400 nm. No espectro de AH

de vermicomposto extraído com NaOH, aparece um ombro proeminente a

330 nm, que não aparece no espectro de AH extraído com Na4P2O7. Os

maiores valores encontrados para os índices I470/I400 e I470/I360, mostrados na

tabela 16, foram para as amostras de AH de turfa extraídos com Na4P2O7

(2,87 e 5,36) e os menores foram para as amostras de AH de

vermicomposto extraídos com NaOH (0,67 para os 2 índices).

250 300 350 400 450 500 550 600

0

20

40

60

80


Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(u.a

.)

λex (nm)

FIGURA 29 - Espectro síncrono (∆λ = 55 nm) das amostras de ácidos

húmicos.


250 300 350 400 450 500 550 600-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16 vermicomposto/NaOH vermicomposto/Na4P2O7

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(u.a

.)

λex (nm)

FIGURA 30 - Espectro síncrono (∆λ = 55 nm) de ácidos húmicos de

vermicomposto.

As figuras 31 e 32 mostram os espectros de excitação (com

emissão a 500 nm). O pico a 465 nm, associado a estruturas mais

humificadas, ocorre, em grande intensidade, nos espectros das amostras de

AH de turfa. Nos espectros de AH de vermicomposto, esse pico é deslocado

para 430 nm, e aparecem picos intensos em 260 e 400 nm. Assim, pode-se

utilizar, como medida de humificação, o comprimento de onda de 465 nm

como fonte de excitação para o espectro de emissão (figura 33). Os

espectros de emissão (com excitação a 465 nm) mostraram variação apenas

na intensidade (com máximo de intensidade a 520 nm). Esse

comportamento é concordante com o encontrado por Milori et al. (1999). O

valor total da área sob a curva (índice A465) variou de 803 a 7446.

Novamente, o menor valor foi encontrado para AH de vermicomposto

extraído com NaOH e o maior valor para AH de turfa extraído com Na4P2O7.


250 300 350 400 4500

10

20

30

40

50

60

70

80


Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(u.a

.)

λex (nm)

FIGURA 31 - Espectro de excitação (com emissão a 500 nm) das amostras


250 300 350 400 4504

6

8

10

12

14 vermicomposto/NaOH vermicomposto/Na4P2O7

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(u.a

.)

λex (nm)

FIGURA 32 - Espectro de excitação (com emissão a 500 nm) de ácidos

húmicos de vermicomposto.


480 500 520 540 560 580 600 620 640 660-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

(u.a

.)

λem (nm)

FIGURA 33 - Espectro de emissão (com excitação a 465 nm) das amostras


Nos espectros em 3D (figuras 34 e 35), pode ser observado

que, enquanto nas amostras de AH de turfa o máximo ocorre com emissão a

500 nm e excitação a 465 nm, nas amostras de AH de vermicomposto o

máximo ocorre com emissão a 410 nm e excitação a 320 nm.

250 300 350 400 450 500 550250

300

350

400

450

500

550

600

650

0

10,20

20,40

30,60

40,80

51,00

61,20

71,40

81,60

λex (nm)

λ em (n

m)

FIGURA 34 - Projeção no plano do espectro de emissão-excitação em 3D de

ácidos húmicos de turfa.


250 300 350 400 450 500 550250

300

350

400

450

500

550

600

650

0

2,2

4,4

6,6

8,8

11,0

13,2

15,4

17,6

λex (nm)

λ em (n

m)

FIGURA 35 - Projeção no plano do espectro de emissão-excitação em 3D de

ácidos húmicos de vermicomposto.

TABELA 16 - Índices de humificação determinados por fluorescência para as

amostras de ácidos húmicos (entre parênteses: desvio-padrão; n = 3

determinações).

Amostra A4/A1 I470/I400 I470/I360 A465

TN 0,439 (0,010) 2,74 (0,03) 5,00 (0,08) 6277 (30)

TP 0,475 (0,005) 2,87 (0,03) 5,36 (0,11) 7446 (192)

VN 0,053 (0,003) 0,67 (0,02) 0,67 (0,04) 803 (45)

VP 0,089 (0,008) 0,91 (0,03) 0,98 (0,05) 1030 (37)

5.9 Espectroscopia de Absorção no Infravermelho (FTIR)

5.9.1 Introdução

A espectroscopia de absorção no infravermelho tem sido

amplamente utilizada na caracterização de substâncias húmicas, existindo

na literatura uma quantidade razoável de informações e dados resultantes

dessa técnica (Barančíková et al., 1997; Filip e Kubát, 2001; Inbar et al.,

1989; Inbar et al., 1990; Lobartini et al., 1989; Miikki et al., 1997; Poppi e

Talamoni, 1992; Provenzano et al., 1998; Rosa et al., 1998; Shin et al., 1999;

Toledo et al., 1984; Wang et al., 1990; Watanabe et al., 1996).


De acordo com Stevenson (1994), a espectroscopia no

infravermelho permite obter informações sobre a natureza, a reatividade e o

arranjo estrutural dos grupos funcionais (principalmente funções oxigenadas)

presentes nas substâncias húmicas, avaliar os efeitos provocados por

modificação química, tais como metilação e acetilação, estabelecer a

presença ou a ausência de impurezas inorgânicas (metais, argilo-minerais) e

analisar interações entre as SH e compostos orgânicos (como pesticidas) ou

metais.

A absorção da radiação na região do infravermelho pela

matéria corresponde à energia de vibração e rotação associada a uma

ligação. Existem 2 tipos de vibrações moleculares: os estiramentos ou

deformações axiais (ν) (simétricas e assimétricas), que correspondem ao

movimento rítmico de expansão e contração ao longo do eixo da ligação, e

as deformações angulares ou simplesmente deformações (δ), nos quais

ocorre uma variação no ângulo da ligação entre os átomos (Silverstein et al.,

1994). Em geral, o espectro é obtido em transmitância ou em absorbância

em função do número de ondas, que varia normalmente de 4000 a 400 cm-1

(2,8 a 50 µm). Atualmente, a maioria dos espectrômetros utiliza a

transformada de Fourier (FTIR) e são baseados no interferômetro de

Michelson.

Os espectros na região do infravermelho dos AH são

relativamente simples, possuindo poucas bandas de absorção e geralmente

alargadas. A complexidade do ambiente química que envolve os

grupamentos funcionais dos AH resulta em uma série de sobreposições de

bandas de absorção. A espectroscopia nessa região apresenta limitações

para caracterização estrutural, mas pode ser muito útil no indicativo da

presença e do comportamento dos grupamentos funcionais (Canella, 1999).

As possíveis atribuições das principais bandas de absorção

usualmente observadas nos espectros no infravermelho dos AH estão

mostradas a seguir (MacCarthy e Rice, 1985; Provenzano e Senesi, 1999;

Schnitzer e Khan, 1972; Stevenson, 1994):


• 3400 – 3300 cm-1: estiramento de O–H;

• 3077 – 3030 cm-1: estiramento de C–H de aromáticos e olefinas (pode

estar encoberto pela banda de estiramento de O–H);

• 2940 – 2840 cm-1: estiramento simétrico e assimétrico de C–H

alifático;

• 2750 – 2400 cm-1: estiramento de O–H de grupos carboxílicos;

• 1725 – 1720 cm-1: estiramento de C=O de ácidos carboxílicos;

• 1660 – 1630 cm-1: estiramento de C=O de amidas e quinonas e de

cetonas conjugadas com ligação de hidrogênio;

• 1650 – 1580 cm-1: estiramento simétrico de C=O de íons carboxilatos;

• 1630 – 1600 cm-1: estiramento de C=C aromático;

• 1590 – 1520 cm-1: deformação de N–H de amidas e estiramento C=N;

• 1500 – 1400 cm-1: estiramento de C=C aromático;

• 1400 – 1380 cm-1: estiramento de C–O fenólico, deformação de O–H

carboxílico, deformação de C–H alifático e estiramento assimétrico de

C=O de carboxilatos;

• 1280 – 1200 cm-1: estiramento de C–O de éteres, ésteres e fenóis e

deformação de O–H carboxílico;

• 1170 – 1000 cm-1: estiramento de C–O de estruturas polissacarídicas;

• 1050 – 950 cm-1: estiramento de C–O de estruturas polissacarídicas e

estiramento de Si–O (impurezas do tipo silicato);

• 950 – 670 cm-1: deformação no plano e fora do plano de C–H

aromático.

Bandas próximas de 1610 cm-1 são geralmente atribuídas a

estiramentos C=C de aromáticos; entretanto, ligações duplas não aromáticas

e quinonas podem absorver nessa região. A ligação C=O de ácidos

carboxílicos absorve em 1720 cm-1; a formação de ligações de hidrogênio

diminui, porém, o comprimento de onda, deslocando a absorbância para

região em torno de 1760 cm-1. Por sua vez, o íon carboxilato (COO–),

resultado da desprotonação de grupos carboxílicos, absorve na região entre

1690 e 1660 cm-1.


Stevenson (1994) classificou os espectros de SH em 3 tipos.

Os espectros de tipo I são caracterizados por bandas de absorção fortes e

evidentes em 3400, 2900, 1720, 1600 e 1200 cm-1. A absorção na região de

1600 cm-1 possui intensidade semelhante à absorção em 1200 cm-1. Os

espectros do tipo III apresentam as mesmas absorções características dos

espectros do tipo I, com a diferença de uma absorção em 2900 cm-1 mais

intensa e com o aparecimento de uma absorção forte em 1540 cm-1. Os

espectros do tipo II são característicos de moléculas húmicas de menor

massa molecular (ácidos fúlvicos) e apresentam, além dessas absorções,

uma absorção muito intensa em 1720 cm-1.

A relação entre as absorbâncias de determinadas bandas tem

sido utilizada por alguns autores (Freixo et al., 2002). Dessa forma, a relação

entre as absorbâncias em 2927 e em 1050 cm-1 (relação entre grupos

apolares e polares) fornece o índice de hidrofobicidade (quanto maior esse

índice, maior resistência à degradação microbiana). A relação entre as

absorbâncias em 1660 e em 2929 cm-1 corresponde ao índice de

aromaticidade.


As amostras de ácido húmico foram analisadas em um

espectrofotômetro com transformada de Fourier da marca Bomem MB-102.

Pesou-se, em uma balança com precisão de 0,01 mg, aproximadamente

0,50 mg de amostra, e, após adicionar 150,0 mg de KBr, a mistura foi

pulverizada e prensada, formando uma pastilha, que foi então analisada no

espectrofotômetro. Efetuaram-se, para cada análise, 32 varreduras de 4000

a 300 cm-1, com resolução de 4 cm-1. Foi realizada 3 análises para cada

amostra, resultando 9 espectros para cada tipo de AH, uma vez que a

extração também foi em triplicata. Os espectros foram tratados pelo

programa Win-Bomem Easy 3.04, acertando-se a linha de base por múltiplos

pontos (Multiple point level) nos valores de número de onda iguais a 3680,

2680, 2220, 1810 e 860 cm-1, e atenuando-se o sinal (smoothing) pelo modo

Fourier a 60%.



A figura 36 mostra os espectros no infravermelho (modo

transmitância) das amostras de AH de turfa e de vermicomposto extraídos

com NaOH e com pirofosfato de sódio.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500-40

-20

0

20

40

60

80

d

c

b

aTr

ansm

itânc

ia

Número de onda (cm-1)

FIGURA 36 - Espectros de absorção no infravermelho das amostras de

ácidos húmicos de vermicomposto extraídos com Na4P2O7 (a) e NaOH (b), e

ácidos húmicos de turfa extraídos com Na4P2O7 (c) e NaOH (d).

Podem ser observados nesses espectros: uma larga banda em

3420 cm-1 associada ao estiramento OH de fenóis e álcoois, além de água,

presente como impureza; picos em 2940 e 2860 cm-1, devido a estiramentos

simétrico e assimétrico, respectivamente, de C–H alifático; picos em 1715 e

1630 cm-1, atribuídos a estiramento C=O de grupos carboxílicos (COOH) e

carboxilatos (COO–), respectivamente (ao pico em 1630 cm-1 está

sobreposto estiramento C=C de aromático); picos em 1515, 1460 e 1425 cm-

1 associados a estiramento C=C aromático; pico em 1250 cm-1, de

estiramento C–O e deformação O–H de grupos carboxílicos, e pico em 1308

cm-1, de estiramento C–O de polissacarídeos.

A figura 36 não revela nenhuma diferença significativa entre os

espectros de AH de vermicomposto extraídos com NaOH e extraídos com


pirofosfato de sódio, seja no deslocamento de bandas a comprimentos de

onda maiores ou menores, seja na intensidade das bandas. Da mesma

forma, não há nenhuma diferença entre os espectros de AH de turfa

extraídos com NaOH e extraídos com pirofosfato de sódio. Assim, não é

possível diferenciar, por FTIR, amostras de AH de mesma matriz extraídas

com essas duas substâncias.

Analisando os espectros, observam-se algumas importantes

diferenças entre os espectros de AH de turfa e de vermicomposto. Na região

compreendida entre 1500 e 1400 cm-1, as bandas, em geral atribuídas a

estiramento C=C aromático, estão mais bem resolvidas nas amostras de AH

de vermicomposto do que nas amostras de turfa, indicando nessas últimas

uma maior complexidade de grupos aromáticos. Além disso, nos espectros

dos AH de vermicomposto, as intensidades relativas das bandas atribuídas a

estiramento C–H alifático são maiores, assim como nessas amostras é bem

mais intenso o pico em 1030 cm-1, associado a estruturas do tipo

polissacarídeo.

5.10 Espectroscopia de Reflectância Difusa no Infravermelho (DRIFT)

5.10.1 Introdução

A espectroscopia tradicional no infravermelho (FTIR) é

extensamente utilizada para AH, especialmente usando-se pastilha de KBr.

Entretanto, há alguns problemas associados ao método de pastilha. O KBr é

higroscópico e é difícil conseguir uma pastilha totalmente livre de

contaminação. Além disso, as altas pressão e temperatura alcançadas no

processo de prensagem das pastilhas podem alterar a natureza física e

química de substâncias húmicas, pela decomposição parcial e ionização de

grupos carboxílicos e fenólicos (Baes e Bloom, 1989). A técnica de

espectroscopia por reflectância difusa (DRIFT) elimina esses problemas,

além de requerer uma preparação mínima da amostra e de ser um método

mais confiável para avaliação semiquantitativa de grupos funcionais. As

medidas de reflectância difusa envolvem a coleta de radiação refletida pela


amostra. Os espectros obtidos por DRIFT são registrados em reflectância

relativa (r) ou em unidade Kubelka-Munk (KM), que é função do coeficiente

de absorção (K) e do coeficiente de espalhamento (S). Um espectro em

unidades KM é análogo a um espectro de absorbância, por isso espectros

de DRIFT são tipicamente utilizados com unidades KM. As atribuições de

picos em DRIFT são as mesmas para FTIR de transmissão.

A função Kubelka-Munk (K/S) pode ser dada pelas equações:

( )Sc

rrSK .

21 2 ε

≅−

= (42)

( ) CcSK logloglog += (43)

em que: K = coeficiente de absorção;

S = coeficiente de espalhamento da amostra;

r = S/R = reflectância relativa (R = coeficiente de espalhamento da

referência);

ε = absortividade molar;

c = concentração do agente de diluição (em mol g-1);

C = constante.

Espectros de diversas amostras de AH foram obtidos

comparativamente por FTIR de transmissão e DRIFT, e verificou-se, nesse

último, uma diminuição da banda relacionada a H2O (Baes e Bloom, 1989;

Niemeyer et al., 1992). Baes e Bloom também compararam DRIFT usando

unidades de reflectância e unidades KM, e observaram que os dois

espectros são bastante similares. Entretanto, observaram que a função KM

tende a amplificar absorções fortes e reduzir absorções fracas, dificultando

uma análise quantitativa acurada.


As amostras de ácido húmico foram analisadas em um

espectrofotômetro Bomem MB-102, adaptado com uma unidade de

reflectância difusa da marca Spectra - Tech Inc. Foram utilizadas

aproximadamente 250 mg de amostra, que foram acondicionadas em uma

célula de 1,2 cm de diâmetro interno. Testou-se, também, uma mistura da


amostra com KBr, mas os resultados obtidos ficaram aquém dos obtidos

com somente a amostra. Efetuaram-se, para cada análise (realizada em

triplicata), 32 varreduras de 4000 a 300 cm-1, com resolução de 4 cm-1. Os

espectros foram tratados de forma similar aos espectros obtidos por

espectroscopia de absorção no infravermelho.


Os espectros de reflectância no infravermelho das amostras de

AH de turfa e vermicomposto (ambos extraídos com NaOH) estão mostrados

na figura 37. Os espectros das amostras de AH extraídos com Na4P2O7

foram similares aos espectros das amostras de AH extraídos com NaOH, e

não estão apresentados neste trabalho.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

b

a

Ref

lect

ânci

a re

lativ

a

Número de onda (cm-1)FIGURA 37 - Espectros de reflectância difusa no infravermelho das amostras

de ácidos húmicos extraídos de turfa (a) e de vermicomposto (b).

Pode ser observado na figura 8 que a resolução e a

sensibilidade ficaram bem pobres quando comparadas com as dos

espectros de absorção. Tal fato deve-se, provavelmente, à utilização de um

espectrofotômetro típico de absorção adaptado ao modo de reflectância.

Dessa forma, não foi possível fazer uma análise criteriosa dos

espectros das amostras de ácidos húmicos, mas pôde ser verificada uma


semelhança com os espectros de absorção, especialmente os espectros das

amostras de AH extraídos de vermicomposto.

5.11 Espectroscopia Raman

5.11.1 Introdução

Apesar das inúmeras técnicas e métodos analíticos aplicados

às substâncias húmicas para elucidar sua estrutura, sua natureza ainda é

motivo de debate, em grande parte devido à inacessibilidade de se separar e

identificar os seus componentes individuais. Nesse aspecto, a

espectroscopia Raman pode ser considerada uma promissora técnica para

caracterizar os “building blocks” das substâncias húmicas (Yang e Wang,

1997).

Os espectros Raman são obtidos irradiando-se uma amostra

com uma fonte laser potente de radiação monocromática no visível ou no

infravermelho, e a radiação espalhada em um certo ângulo é então

detectada. A radiação espalhada é dividida em 3 tipos: espalhamento

Stokes, espalhamento anti-Stokes e espalhamento Rayleigh. O último, cujo

comprimento de onda é exatamente o da fonte de excitação, é bem mais

intenso que os outros tipos. Devido às mudanças de estado vibracional das

moléculas da amostra, a radiação pode ser espalhada também com energias

diferentes da fonte original, podendo ser maiores (espalhamento anti-Stokes)

ou menores (espalhamento Stokes). Pelo fato das linhas Stokes serem mais

intensas que as linhas anti-Stokes, essas últimas praticamente não são

utilizadas. Nota-se que o deslocamento de energia (ou de número de onda)

no espalhamento Stokes (ou no anti-Stokes) corresponde às freqüências de

absorção no infravermelho. Entretanto, os espectros Raman podem dar

informações sobre algumas vibrações (por exemplo, de estiramento de

ligação dupla de olefinas), enquanto que, nos espectros de FTIR, esses

sinais seriam muito fracos ou não detectáveis (Skoog et al., 2002).

O uso da espectroscopia Raman em amostras húmicas,

entretanto, enfrenta alguns problemas. Devido à inerente fluorescência das


amostras, os espectros não podem ser obtidos por técnicas convencionais

de Raman. Em princípio, o uso de Raman com transformada de Fourier (FT-

Raman) e fontes de excitação no infravermelho próximo poderia minimizar

esse efeito, devido à seu pequeno efeito de fluorescência e ressonância.

Contudo, sinais de FT-Raman são freqüentemente encobertos por uma

radiação térmica de fundo (radiação do corpo negro), devido à cor escura

das amostras. Yang e Wang (1997) utilizaram, para minimizar esse efeito,

um tubo de diâmetro grande com uma pequena quantidade de amostra

adsorvida em sua parede. Assim, a energia térmica seria rapidamente

emitida ao ar, permitindo o aparecimento dos sinais de Raman.


Os experimentos forma realizados a temperatura ambiente em

um espectrômetro Bruker RFS 100/S, com detector de germânio refrigerado

com N2 líquido. Foi utilizada uma radiação de 1064 nm (9394,7 cm-1), com

potência na saida de 50 mW, de uma fonte laser Nd/YAG, e geometria de

retroespalhamento. Os espectros foram obtidos com 2500 varreduras (35

varreduras por minuto), com resolução de 4 cm-1 e ganho de 8.

Para minimizar o efeito da radiação de corpo negro, às

amostras foi adicionado alumínio em pó, que permitiu a rápida absorção da

energia térmica (também foi testado o uso de cobre eletrolítico, que, porém

saturava o sinal).


Os espectros das amostras apresentaram apenas duas bandas

de deslocamento Raman. A figura 38 mostra uma parte do espectro Raman

(espalhamento Stokes) entre 1000 e 1800 cm-1. Podem ser observados um

pico mais intenso em 1320 cm-1 e outro, de menor intensidade, em cerca de

1590 cm-1, definidos como banda D e banda G, respectivamente. Esses

mesmos picos foram observados em amostras de ácidos húmicos e fúlvicos

de solo e em amostras de carvão cromatográfico e ativado (Yang e Wang,


1997). As amostras de AH de vermicomposto apresentaram bandas bem

menos intensas: na figura 38, esses sinais foram maximizados, mas pode

ser observada a pior relação sinal-ruído. Esses resultados revelam, então,

uma natureza grafítica das amostras, com carbonos estruturalmente

desordenados, principalmente nas amostras de AH de turfa. Devido ao

fenômeno de radiação de corpo negro, que não foi totalmente eliminado, não

foi possível verificar as bandas de estiramento C–H e de grupos funcionais

como carboxilas e hidroxilas.

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000

0.10

0.11

0.12

0.13

0.14

0.15

0.16

0.17

0.18

d

c

b

a

Inte

nsid

ade

Número de onda (cm-1)

FIGURA 38 - Espectros de FT-Raman (entre 1800 e 1000 cm-1) de ácidos

húmicos de turfa extraídos com NaOH (a) e Na4P2O7 (b), e de ácidos

húmicos de vermicomposto extraídos com NaOH (c) e Na4P2O7 (d).

5.12 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (1H-NMR)

5.12.1 Introdução

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) é

uma potente técnica para estimar a quantidade relativa de grupos orgânicos

funcionais, como estruturas alifáticas, aromáticas, fenólicas e carboxílicas.

Nos ácidos húmicos, a ressonância magnética nuclear de

hidrogênio (1H-NMR) é pouco utilizada, devido à enorme quantidade de


hidrogênios magneticamente diferentes, com conseqüente alargamento das

bandas, além do pico devido a H2O e HOD residuais (mesmo em solução de

D2O), mas ainda assim é utilizada por alguns autores (Gessa et al., 1983;

Preston, 1996; Ricca et al., 2000; Wang et al., 1990) e pode ser uma técnica

complementar a outras, como a 13C-NMR. Os espectros podem ser divididos

em regiões características de H magneticamente diferentes. Entretanto, ao

contrário da ressonância magnética nuclear de carbono 13 (13C-NMR), não

há um consenso entre os autores nessa divisão. Kawahigashi et al. (1996),

estudando frações de AH separados por cromatografia de permeação em

gel, dividiram o espectro de 1H-NMR em 5 regiões: 0,0 – 0,9 ppm (prótons

de grupos metila terminais próximos a prótons alifáticos saturados); 0,9 – 1,6

ppm (prótons de metileno próximos a olefinas ou anéis aromáticos); 1,6 – 3,0

ppm (prótons de metila e metileno próximos a carbonos aromáticos, olefinas

e grupos carbonila e éster); 3,0 – 4,3 ppm (prótons em carbonos próximos a

carboidratos, olefinas e grupos metoxil) e 6,0 – 9,0 ppm (prótons próximos a

carbonos de anéis aromáticos e heteroaromáticos, e a grupos carbonila

ligados a átomos eletronegativos). Watanabe et al. (1996), estudando

frações verdes de AH do tipo Pg, também dividiram o espectro em 5 regiões

(0,5 – 2,8 ppm; 2,8 – 6,5 ppm; 6,5 – 9,5 ppm; 9,5 – 14,5 ppm; 14,5 – 16,8

ppm). Dick et al. (1999), Peuravuori e Pihlaja (1998) e Ricca et al. (1993),

por sua vez, dividiram o espectro em 4 regiões, enquanto Tao et al. (1999)

dividiram-no em apenas 3 regiões: 0,8 – 1,8 ppm (prótons em grupos metila

e metileno); 3,0 – 6,5 ppm (prótons em carbonos próximos a heteroátomos O

ou N) e 6,5 – 10 ppm (prótons aromáticos).


As amostras de AH foram dissolvidas em uma solução de

NaOH em D2O na seguinte proporção: 66,7 mg de AH em 2 mL de solução

de NaOH 0,5 mol L-1 (40 mg de NaOH em 2 mL de D2O). Como se utiliza

aproximadamente 0,6 mL para a análise, a quantidade de AH analisada é de

aproximadamente 20 mg. Foram realizados experimentos com soluções de


AH em solução de Na4P2O7 em D2O, mas houve uma piora na sensibilidade

da análise.

Utilizou-se um espectrômetro Bruker AC 200, nas seguintes

condições: freqüência: 200,13 MHz; largura espectral: 2604,167 Hz; RD

(relaxation delay): 6 s; número de pulsos: 800 a 1000. Como aparece um

pico intenso em 4,6 ppm correspondente a H2O (impureza do D2O), em

alguns espectros, esse pico foi suprimido (ou minimizado) através de uma

pré-saturação. Tetrametilsilano (TMS) foi utilizado com referência interna.

O espectro foi dividido em 4 regiões: 0,0 – 1,5 ppm (prótons de

grupos metila e metileno de carbonos diretamente ligados a outros

carbonos); 1,5 – 2,3 ppm (prótons de grupos metileno e metino ligados a

anéis aromáticos e grupos carboxila e carbonila); 2,6 – 4,1 ppm (prótons

próximos a carbonos ligados a heteroátomos, como O) e 5,5 – 8,0 ppm

(prótons de anéis aromáticos).


Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio

das amostras estão mostrados nas figuras 39 e 40. Na figura 40, o sinal

correspondente a H2O foi minimizado por pré-saturação.

10 8 6 4 2 0 -2

0

2000

4000

6000


Inte

nsid

ade

do s

inal

δ (ppm)

FIGURA 39 - Espectro de 1H-NMR das amostras de ácidos húmicos.


10 8 6 4 2 0 -2

0

3000

6000

9000

12000


Inte

nsid

ade

do s

inal

δ (ppm)

FIGURA 40 - Espectro de 1H-NMR de ácidos húmicos, com saturação do

sinal correspondente a H2O.

As figuras 39 e 40 mostram que as amostras de AH de turfa

apresentaram pior razão sinal/ruído e um alargamento (e deslocamento para

regiões menos blindadas – maiores valores de δ) do pico entre 9,0 e 5,5

ppm. Mas a principal diferença verificada foi na intensidade relativa das

bandas. Não se observou, a priori, diferenças significativas entre amostras

extraídas com NaOH e amostras extraídas com pirofosfato. Os espectros

obtidos, especialmente os de AH de turfa, são bastante similares aos obtidos

por Dick et al. (1999) para AH de solo.

A tabela 17 mostra os valores das intensidades relativas das

regiões do espectro caracterizados por H com diferentes vizinhanças. Pode

ser observado na tabela que as amostras de AH de turfa apresentaram

maior porcentagem de prótons aromáticos (5,5 – 8,0 ppm) que as amostras

de AH de vermicomposto, especialmente as amostras extraídas com

pirofosfato de sódio. À primeira vista, as amostras de AH de turfa também

apresentaram maior quantidade relativa de prótons alifáticos (0,0 – 2,3 ppm);

isso se deve, porém, ao fato de que as amostras de AH de vermicomposto

apresentaram uma grande quantidade de prótons ligados a carbonos

oxigenados (2,6 – 4,1 ppm), como éteres e cetonas.


TABELA 17 - Intensidade relativa de grupos funcionais obtidos pelos

espectros de 1H-NMR.

Amostra R1 (%) R2 (%) R3 (%) R4 (%)

TN 35,1 8,8 28,1 28,1

TN* 32,6 11,2 29,2 27,0

TP 22,4 11,8 29,4 36,5

TP* 25,3 12,0 28,9 33,7

VN 18,3 10,8 52,7 18,3

VN* 18,2 9,1 51,8 20,9

VP 17,6 11,0 53,8 17,6

VP* 17,9 12,8 51,3 17,9R1: 0,0 – 1,5 ppm; R2: 1,5 – 2,3 ppm; R3: 2,6 – 4,1 ppm; R4: 5,5 – 8,0 ppm.* Espectros com pré-saturação de H2O.

5.13 Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 (13C-NMR)

5.13.1 Introdução

O primeiro estudo envolvendo espectroscopia de ressonância

magnética nuclear (NMR) aplicado a substâncias húmicas foi realizado por

Barton e Schnitzer (1963), na avaliação de um AH metilado. Entretanto,

somente nos últimos 15 anos o aprimoramento da tecnologia de NMR tornou

possível sua aplicação rotineira em SH (Preston, 1996). O desenvolvimento

de magnetos supercondutores com altos campos, a técnica da transformada

de Fourier para aquisição e manipulação dos dados, a polarização cruzada e

a rotação no ângulo mágico foram fundamentais para a obtenção de

espectros bem resolvidos (Preston, 1996).

O 13C tem sido o núcleo mais utilizado no estudo das SH,

seguido dos núcleos 1H, 31P e 15N, sendo que apenas 13C e 15N-NMR tem

sido utilizado com mais freqüência para amostras no estado sólido (Hatcher

et al., 2001; Kögel-Knabner, 1997). A técnica de 13C-NMR tem sido utilizada

principalmente na avaliação qualitativa e semiquantitativa das substâncias


húmicas. As frações de AF e AH são analisadas em solução ou no estado

sólido. A grande maioria dos trabalhos envolvendo SH tem sido

desenvolvida com amostras no estado sólido (utilizando-se polarização

cruzada e rotação no ângulo mágico: CP/MAS 13C-NMR), devido ao menor

tempo requerido para a obtenção dos espectros. Entretanto, muitos

trabalhos foram desenvolvidos utilizando-se a ressonância magnética com

amostras no estado líquido (LS 13C-NMR) (Dick et al., 1999; Lobartini et al.,

1989; Mikita et al., 1981; Nardi et al., 2000; Peuravuori e Pihlaja, 1998;

Piccolo et al., 1990; Stearman et al., 1989; Veeken et al., 2000; Wershaw et

al., 1990). Dai et al. (2001) utilizaram a LS 13C-NMR na análise de frações

extraíveis do solo (AH e AF) e a CP/MAS 13C-NMR para a humina e para o

solo in natura. Conte et al. (1997b) compararam as duas técnicas na análise

de AH e AF e verificaram que os espectros de CP/MAS apresentaram maior

intensidade relativa na região de carbonos alquila e menor intensidade na

região de carbonos aromáticos. Canellas et al. (2001) verificaram um

aumento na resolução de espectros de LS 13C-NMR quando os AH eram

previamente tratados com solução de KCl.

A técnica de CP/MAS 13C-NMR pode ser aplicada ao solo sem

a necessidade de extrair a matéria orgânica. Porém, espectros desse tipo

apresentam alargamento das linhas e grande redução da relação sinal/ruído,

devido à presença de grande quantidade de íons paramagnéticos

(especialmente Fe3+ e Mn2+) nas amostras intactas (Hemminga e Buurman,

1997).

Os espectros de 13C-NMR das SH apresentam regiões bem

definidas, que são agrupadas normalmente da seguinte maneira:

• 0 – 45 ppm: referente a C de alquilas;

• 45 – 70 ppm: referente a C–N e C de metoxilas;

• 70 – 110 ppm: referente a C–O em carboidratos;

• 110 – 140 ppm: referente a C aromáticos não oxigenados;

• 140 – 160 ppm: referente a C fenólicos;

• 160 – 190 ppm: referente a C carboxílicos;

• 190 – 200 ppm: referenta a C carbonílicos de aldeídos e cetonas.


As estimativas das porcentagens dos diferentes tipos de

carbono são obtidas a partir da integração dos picos nas regiões específicas

dos espectros (Conte et al., 2003; Giovanela, 2003; Inbar et al., 1990; Kögel-

Knabner et al., 1991; Laird et al., 2001; Lu et al., 2000; Maie et al., 2002;

Marshall et al., 1998; Rasyid et al., 1992; Sardessai e Wahidullah, 1997;

Smeulders et al., 2000; Wattel-Koekkoek et al., 2001).

O teor de aromaticidade é, em geral, determinado através da

razão entre a porcentagem de C a 110 – 160 ppm e a porcentagem de C a 0

– 160 ppm (Ayuso et al., 1997; Inbar et al., 1989; Pérez et al., 2004; Shin et

al., 1999; Tao et al., 1999). A relação entre teor de aromaticidade e grau de

humificação nem sempre é tão direta, uma vez que materiais não

decompostos, como lignina e tanino, também apresentam grupos

aromáticos.

De maneira geral, a região alifática oxigenada (50 – 110 ppm)

da matéria orgânica do solo diminui com a humificação, pois nessa região há

importantes contribuições de compostos de fácil degradação microbiana,

como aminoácidos (53 ppm), metoxila da lignina (58 ppm) e carboidratos de

celulose e hemicelulose (64, 74, 85 e 105 ppm). Por sua vez, a degradação

microbiana leva ao acúmulo de estruturas parafínicas (0 – 50 ppm) e um

alargamento dos picos com perda de resolução devido à alta complexidade

estrutural (Preston et al., 1994) e um específico alargamento na região de

carbonos aromáticos (entre 124 e 145 ppm) devido à diminuição de grupos

aromáticos oxigenados.

A técnica de CP/MAS apresenta, porém, limitações na análise

quantitativa dos espectros (Mao et al., 2000; Preston, 1996), em parte devido

à redução na eficiência da polarização cruzada (CP) para carbonos não

protonados ou regiões com menores tempos de relaxação spin-rede dos

prótons (T1ρ (1H)). O ideal é que o tempo da polarização cruzada (tc) seja

maior que a constante de polarização cruzada (TCH), mas menor que T1ρ

(1H). Espécies paramagnéticas (como Fe3+) pode reduzir o T1ρ (1H),

causando perda de magnetização do hidrogênio antes de transferi-la aos

átomos de carbono (Smernik e Oades, 2000; Pfeffer et al., 1984). Além

disso, se a rotação no ângulo mágico (MAS) não for suficientemente rápida,


pode ocorrer a formação de bandas laterais, reduzindo a intensidade da

banda central (Monteil-Rivera et al., 2000).

Uma alternativa para minimizar o problema das bandas laterais

é o uso da seqüência TOSS (supressão total das bandas laterais) (Mao et

al., 2000); entretanto seu uso pode trazer problemas na quantificação

(Novotny, 2002).

Por sua vez, o problema da polarização cruzada pode ser

minimizado pelo uso da polarização direta (DP/MAS), mas o alto tempo de

relaxação spin-rede do carbono (T1 (13C)) torna a análise extremamente

longa. Mao et al. (2000) demonstrou que a DP/MAS combinada com a

correção do T1 (13C) por CP/T1-TOSS é viável na análise de SH. Hu et al.

(2000) usaram a CP/MAS e a DP/MAS para detectar estruturas cristalinas

nas SH. Outra alternativa é o uso da polarização cruzada com amplitude

variável (VACP), em que a amplitude do campo magnético varia linearmente

durante o tempo de contato (Hatcher et al., 2001; Novotny, 2002).

Variações na técnica de polarização cruzada podem fornecer

informações adicionais. Experimentos com desacoplamento defasado (DD),

por exemplo, que acrescenta um período (de 20 a 120 µs) entre a

polarização cruzada e a aquisição dos dados, durante o qual o desacoplador

fica desligado, podem suprimir seletivamente sinais de C diretamente ligados

a H em estruturas rígidas (Novotny, 2002; Preston, 1996; Kögel-Knabner et

al., 1992). Experimentos com tempo de contato variável (VCT) podem

fornecer o tempo ótimo de contato para cada sinal, com o qual a intensidade

desse sinal é máxima (Conte et al., 1997a, Monteil-Rivera et al., 2000).


Os espectros de 13C-NMR no estado sólido das amostras de

AH foram obtidos em um espectrômetro Varian Unity Inova 400, operando

em uma freqüência de 100,6 MHz para o 13C, acoplado a uma sonda com

MAS da Doty Scientific. Foram utilizadas as técnicas de polarização cruzada

com amplitude variável (VACP) e rotação no ângulo mágico (MAS), com taxa

de rotação de 7 kHz. O tempo de contato foi de 1 ms, o tempo de espera


para relaxação foi de 500 ms (mais de 5 vezes o tempo de relaxação spin-

rede (70 ms)) e a rampa de amplitude variável foi de 110 a 60%, no canal do13C. Esses parâmetros foram baseados em estudos realizados por Novotny

(2002), que otimizaram os melhores valores utilizando o mesmo

equipamento e amostras similares. Outros parâmetros utilizados foram:

largura de pulso de 4 µs, tempo de aquisição dos dados de 12,8 ms e

largura espectral de 50 kHz. Cada espectro contém cerca de 20000

transientes e foi utilizado hexametilbenzeno (HMB) com referência externa.

Utilizaram-se rotores cilíndricos (com diâmetro de 5 mm) de zircônia com

“end-caps” de Kel-F carregados com aproximadamente 50 mg de amostra.

Os espectros foram divididos em 7 regiões: 0 – 45 ppm (C de

alquilas), 45 – 60 ppm (C de O-alquilas), 60 – 110 ppm (C–O em

carboidratos), 110 – 140 ppm (C de aromáticos), 140 – 160 ppm (C de O-

aromáticos), 160 – 185 ppm (C carboxílicos) e 185 – 200 ppm (C de aldeídos

e cetonas), integrando-se as áreas e calculando-se a intensidade de cada

região em relação à área total do espectro. Todas as integrais foram

corrigidas pelas áreas das bandas laterais: cada banda lateral foi subtraída

da região em que ela aparece e somada à área da banda central (Conte et

al., 2003).


Os espectros de 13C-NMR das amostras de AH são

apresentados na figura 41.


350 300 250 200 150 100 50 0 -50 -100 -150 -200

0.0000

0.0004

0.0008

0.0012

0.0016

0.0020

0.0024

0.0028

0.0032

Inte

nsid

ade

do s

inal


δ (ppm)

FIGURA 41 - Espectro de VACP/MAS 13C-NMR das amostras de ácido

húmico.

De um modo geral, os AH apresentam características bastante

similares. A intensidade relativa desses picos, entretanto, varia

consideravelmente entre as amostras extraídas de turfa e as amostras

extraídas de vermicomposto.

Na primeira região dos espectros (0 – 45 ppm), as amostras de

AH de vermicomposto apresentam 2 picos em 23 e 32 ppm, característicos

de CH2 e CH de cadeias alquila, respectivamente (Giovanela, 2002),

enquanto nas amostras de AH de turfa, o pico em 23 ppm aparece na forma

de um ombro.

A segunda região dos espectros é caracterizada por um pico

bem definido a 55 ppm, típico de C de ésteres e éteres alifáticos (metóxi e

etóxi) de lignina. Esse pico é bem mais pronunciado nas amostras de AH de

vermicomposto. Esse resultado é consistente com os resultados obtidos pela

análise elementar e da espectroscopia de ressonância magnética nuclear de

hidrogênio.

A terceira região dos espectros (60 – 110 ppm) apresenta um

pico em 71 ppm, característico de C de éteres e de anéis de polissacarídeos,

e um pico em 104 ppm, atribuído a C ligado a dois átomos de oxigênio e a C

anomérico em polissacarídeos (Giovanela, 2002). Esses picos são


apresentados por todas as amostras, mas com maior intensidade nos AH de

vermicomposto, concordando com seu caráter menos humificado.

Na região característica de C aromáticos (110 – 140 ppm), as

amostras apresentam um pico em 128 ppm, atribuído a C aromáticos não

substituídos ou alquil-substituídos. Nas amostras de AH de vermicomposto,

esse pico é menos intenso e aparece um outro pico em 115 ppm. Esse

resultado, consistente com os espectros no infravermelho, indicam nessas

amostras a presença de grupos aromáticos específicos.

Os espectros das amostras de AH de vermicomposto

apresentam um pico duplo em 147 e 152 ppm. Esse pico, ausente nos

espectros de AH de turfa, refere-se a C aromáticos substituídos por O e N,

como éteres aromáticos, fenóis e aminas aromáticas.

Na região compreendida entre 160 e 185 ppm, é possível

observar um pico centrado em 172 ppm, normalmente associado a C

carboxílico, C de éster e de amida. Esse pico está presente, com

intensidades similares, em todos os espectros.

Por fim, aparece um pico de baixa intensidade em 196 ppm,

associado a C carbonílico de aldeídos e cetonas.

Em todos os espectros, observa-se a presença de bandas

laterais em 215 e 240 ppm.

As áreas relativas das regiões dos espectros e o grau de

aromaticidade (Ar) são mostrados na tabela 18.

TABELA 18 - Intensidade relativa de grupos funcionais e grau de

aromaticidade (Ar) obtidos pelos espectros de 13C-NMR de ácidos húmicos.

Amostras R1 (%) R2 (%) R3 (%) R4 (%) R5 (%) R6 (%) R7 (%) Ar (%)

TN 25,5 10,6 26,2 19,7 5,2 9,5 4,0 28,6

TP 21,9 10,3 25,4 22,7 5,8 10,4 4,6 33,1

VN 23,2 16,2 28,5 15,4 7,2 6,8 1,9 25,0

VP 21,9 14,2 29,2 16,2 8,0 8,0 2,6 27,0R1: 0 – 45 ppm; R2: 45 – 60 ppm; R3: 60 – 110 ppm; R4: 110 – 140 ppm; R5: 140 – 160 ppm;R6: 160 – 185 ppm; R7: 185 – 200 ppm.


Pode ser observado, na tabela 18, que as amostras de AH de

vermicomposto apresentam maiores valores das áreas das regiões

compreendidas entre 45 e 110 ppm, atribuídas a C–O de metoxila e de

carboidratos, e entre 140 e 160 ppm, atribuídas a grupos O-aromáticos;

essas amostras apresentam, porém, menores valores das áreas das regiões

características de C aromáticos não oxigenados (110 – 140 ppm) e de

carboxilas (160 – 185 ppm). Sabe-se que, com o avanço da humificação, o

conteúdo de grupos carboxílicos e aromáticos aumenta, enquanto que o de

O-aromáticos e metoxilas diminuem (Kögel-Knabner et al., 1991; Preston et

al., 1994).

O grau de aromaticidade (Ar) foi maior nas amostras de AH de

turfa, mas a diferença com os valores obtidos para as amostras de AH de

vermicomposto foi menor que o esperado, apesar desses valores serem

condizentes com os obtidos por Inbar et al. (1989). Observa-se também uma

ligeira diferença entre o grau de aromaticidade de amostras extraídas com

NaOH e de amostras extraídas com Na4P2O7, tendo essas últimas

apresentado maiores valores.

5.14 Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR)

5.14.1 Introdução

As espécies paramagnéticas freqüentemente detectadas por

EPR em substâncias húmicas são radicais livres orgânicos, especialmente

semiquinonas, e alguns íons inorgânicos, como Fe3+, Mn2+, Cu2+ e VO2+. Os

íons Fe2+, embora paramagnéticos, não são detectados por EPR, pois,

especialmente em temperatura ambiente, o tempo de relaxação spin-spin

(T2) é extremamente curto, alargando a linha espectral, perdendo-se

resolução e até impossibilitando o registro do espectro.

Os radicais livres, formados no processo de transformação da

matéria orgânica, podem ser estabilizados em estruturas do tipo “spins

traps”, como polifenóis, melaninas e melanoidinas (Jezierski et al., 1998).

Esses radicais, detectados por EPR (no estado sólido ou em solução) como


um sinal estreito e intenso com valor de g entre 2,0030 e 2,0043, são, em

geral, identificados como semiquinonas conjugadas a anéis aromáticos.

Geralmente os radicais livres orgânicos de substâncias

húmicas não apresentam estrutura hiperfina, principalmente em amostras

sólidas. Cheshire e McPhail (1996), entretanto, verificaram sinais com

estrutura hiperfina resolvida, especialmente variando-se alguns parâmetros

experimentais, como amplitude de modulação, potência de microondas e

utilização de segunda derivada nos espectros.

A largura da linha, medida pico a pico no sinal de primeira

derivada, dos radicais orgânicos detectados em substâncias húmicas

geralmente é de 0,2 a 1 mT, sendo menores em solução do que no estado

sólido (Novotny, 2002).

A concentração de radicais orgânicos em substâncias húmicas,

medida na forma de concentração de spins por grama, é um importante

parâmetro que pode ser usado na estimativa do grau de humificação

(Barančíková et al., 1997; Jezierski et al., 1998; Martin-Neto et al., 1998).

A concentração de spins depende de diversos fatores

experimentais, como pH, intensidade iônica, hidrólise ácida, alquilação,

condições redox, irradiação e interação com compostos orgânicos e íons

metálicos (Lu e Johnson, 1997; Senesi, 1990a; Sposito et al., 1996).

Jezierski et al. (2000) investigaram os efeitos de agentes gasosos e

solventes orgânicos e da complexação com íons Cu2+ na concentração de

radicais orgânicos em ácidos húmicos de composto, solo, turfa e carvão.

Pandey et al. (1999) verificaram a formação de uma estrutura

hiperfina de radicais livres de AH complexado com Mn2+. Busnot et al. (1995)

verificaram o sinal de radical livre também em amostras de AH de

sedimentos. Contrariando outros estudos, Miikki et al. (1997) verificaram um

ligeiro decréscimo na concentração de radicais livres com o aumento do

tempo de compostagem de rejeitos domésticos e industriais, provavelmente

devido à polimerização homolítica. Ferreira et al. (2001) estudaram possíveis

sítios hidrofóbicos em ácidos húmicos ao estudar sua interação com spin-

label (sonda para EPR sensível ao ambiente em que está exposta).


A amplitude do sinal de EPR, desde que não haja saturação do

sinal, é proporcional a P1/2, onde P é a potência das microondas. Assim,

para se otimizar a aquisição, deve-se utilizar a maior potência das

microondas abaixo da saturação. Para se obter a potência de saturação,

adquirem-se vários espectros, variando-se P. Em seguida, faz-se um gráfico

de intensidade do sinal (I) versus P1/2 e escolhe-se o valor de P quando a

curva começar a perder a linearidade (Novotny, 2002). Outra forma de se

obter a potência de saturação é construir um gráfico de I/P1/2 versus P1/2.

Nesse caso, escolhe-se o sinal de P quando a curva deixar de permanecer

constante.


As análises de EPR foram realizadas em um espectrofotômetro

Bruker EMX, com cavidade ressonante retangular, operando em Banda X

(cerca de 9 GHz), a temperatura ambiente. Os espectros foram obtidos em

primeira derivada.

Os parâmetros experimentais utilizados foram: potência de

microondas de 0,13 mW (atenuação de 32 dB), determinada através de

experimentos de saturação de potência (figura 42), ganho de 1 x 104 (para a

amostra e o pitch) e 7,93 x 103 (para o rubi), amplitude de modulação de 1 G

(para a amostra e o pitch) e 5 G (para o rubi), tempo de conversão de 10,24

ms. O número de varreduras foi de 2 (para as amostras de AH extraídas de

turfa) e 16 (para as amostras de AH extraídas de vermicomposto). Foram

utilizados entre 5 e 20 mg de amostra. Para verificação do sinal do íon

vanadilo nas amostras de AH de turfa, foi utilizado uma potência de

microondas de 20 mW.

Para o cálculo da concentração de radicais livres, utilizou-se o

método do padrão secundário de Singer, que consiste na utilização de um

cristal de rubi sintético contendo 0,5% de Cr3+. A concentração de spins da

amostra foi calculada conforme a equação 44:


( )

∆=

AAAR

RARA

nGMIGHMI

KN...

....

2

(44)

em que: N = concentração de spins da amostra;

IA e IR = intensidades dos sinais;

MA e MR = amplitudes de modulação;

GA e GR = ganhos;

∆HA = largura de linha do espectro da amostra tomada pico a pico;

n = número de varreduras;

K = constante.

Os subíndices A e R referem-se à amostra e ao rubi,

respectivamente.

O sinal do rubi foi obtido sempre nas mesmas condições e

juntamente com as amostras. Para isso, ele foi mantido permanentemente

dentro da cavidade, com o objetivo de detectar e normalizar quaisquer

alterações na razão entre a energia absorvida e a energia incidente (fator Q).

O valor de K foi determinado, utilizando-se um strong pitch de

KCl (padrão da Varian) contendo 3 x 1015 spins por centímetro. Mede-se

quantos centímetros do pitch foram introduzidos na cavidade ressonante e,

conseqüentemente, o número total de spins (NP). A equação 45 mostra a

expressão para determinação do númeo de spins do pitch.

( )

∆=

PPR

RPRpP GMI

GHMIKN

.....

.2

(45)

em que o subíndice P refere-se ao pitch.

Combinando-se as equações 44 e 45, tem-se:

( )( )

∆

∆=

AAA

AA

PP

PPPP nGM

HIHInGM

NN..

..

...

.2

2 (46)


1E-3 0.01 0.1 1 10 10010

100

1000

10000

potência de saturação escolhida

I/P1/

2

P1/2

FIGURA 42 - Curvas de saturação de potência para as amostras de AH

extraídas de turfa (vermelho) e vermicomposto (preto).


Os espectros de EPR das amostras de AH (figuras 43 e 44)

mostraram dois sinais bem proeminentes: um a aproximadamente 1950 G e

outro a aproximadamente 3390 G (g = 2,003), relativos ao padrão de rubi e

ao radical livre orgânico, respectivamente. Pode-se notar, nas amostras de

AH de turfa, que o pico relativo ao radical livre possui uma intensidade

relativa bem maior do que verificado no espectro do AH de vermicomposto.

As amostras apresentaram também um sinal a 1600 G (g = 4,3)

(figura 45) correspondente a Fe3+ com simetria rômbica, e um conjunto de

sinais (devido a acoplamento hiperfino) (figura 46) correspondente a íons

vanadilo (VO2+) e Cu2+ complexados a ligantes oxigênio e nitrogênio.


0 1000 2000 3000 4000 5000

-80000

-60000

-40000

-20000

0

20000

40000

60000

80000 radical orgânico

rubi

Campo magnético (gauss)

FIGURA 43 - Espectro de EPR de ácidos húmicos de turfa extraídos com

NaOH.

0 1000 2000 3000 4000 5000

-80000

-60000

-40000

-20000

0

20000

40000

60000

80000

radical orgânico

rubi


FIGURA 44 - Espectro de EPR de ácidos húmicos de vermicomposto

extraídos com NaOH


1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900

-800

-400

0

400

800

1200

1600

2000



FIGURA 45 - Espectro de EPR (entre 1300 e 1900 G, correspondente ao

sinal do íon Fe3+) das amostras de ácidos húmicos.

3200 3250 3300 3350 3400 3450 3500 3550 3600-6000

-4000

-2000

0

2000

4000


FIGURA 46 - Espectro de EPR (entre 3200 e 3600 G, correspondente aos

sinais dos íons VO2+ e Cu2+) das amostras de ácidos húmicos.

A tabela 19 apresenta os valores de quantidade de spins

(relativos ao radical orgânico) por grama de amostra.


TABELA 19 - Concentração de spins por grama de ácido húmico (N) e

largura de linha (∆H) do sinal do radical orgânico (n = 6 determinações).

Amostra N (spins/g, x 1016) ∆H (gauss)

TN 38,7 ± 9,8 3,76 ± 0,00

TP 36,9 ± 5,4 3,71 ± 0,06

VN 4,34 ± 0,77 5,43 ± 0,25

VP 4,04 ± 0,79 5,25 ± 0,24

A tabela 19 revela que a concentração de radicais livres nas

amostras de AH de turfa é cerca de 9 vezes maior que nas amostras de AH

de vermicomposto. Esse é, talvez, o maior indicativo da maior humificação

das amostras de AH de turfa. Além disso, as amostras de AH de

vermicomposto apresentaram maior largura de linha do sinal do radical

orgânico, também característico de materiais menos humificados. Por sua

vez, não foi verificada diferença significativa entre as amostras de AH

extraídas com NaOH e as extraídas com Na4P2O7. Os valores de

concentração de spins e largura de linha encontrados nas amostras de AH

de vermicomposto foram próximos a valores encontrados na literatura para

amostras de AH de resíduos urbanos compostados, mas abaixo de valores

encontrados para solos (Martin-Neto et al., 1998; Sposito et al., 1996;

Barančiková et al., 1997; Pérez et al., 2004). Os valores encontrados para

AH de turfa foram ligeiramente maiores que os encontrados na literatura

para o mesmo tipo de material (Jezierski et al., 2000).

5.15 Análises por Eletroforese Capilar de Zona (CZE)

5.15.1 Introdução

Recentemente, tem-se aumentado o interesse na aplicação de

métodos eletroforéticos na separação e caracterização das substâncias

húmicas, especialmente devido à natureza iônica dessas moléculas (De

Nobili et al., 1990; Dunkelog et al., 1997; Janoš, 2003; Pokorná et al., 2000;


Trubetskoj et al., 1997). Rigol et al. (1994) esturdaram a influência dos

tampões na separação de ácidos húmicos. Landgraf et al. (1998a)

estudaram o perfil eletroforético de amostras de AH de solo, turfa e

vermicomposto, e uma amostra de AH comercial. Ácidos húmicos de

vermicomposto foram também o objeto de estudo de Petrussi et al. (1988). A

eletroforese capilar também foi utilizada para se estudar interações de

ácidos húmicos com metais (Keuth et al., 1998; Nordén e Dabek-

Zlotorzynska, 1996; Schmitt et al., 1996). Como os ácidos húmicos são uma

matriz complexa, apresentando alta massa molecular e estrutura

dependente de sua origem, a eletroforese pode ser uma técnica muito útil na

sua separação e caracterização, porque amostras de diferentes origens

podem ser rapidamente analisadas (Fetsch e Havel, 1998; Fetsch et al.,

1998).

A separação em capilares de sílica fundida é o resultado do

fluxo eletroosmótico e o fracionamento das diferentes razões carga/massa

da substância. Se duas amostras de ácidos húmicos exibem o mesmo

comportamento sob um determinado campo elétrico, então elas teriam

similares razões carga/massa (Pompe et al., 1996). A quantidade de grupos

ionizados dessas macromoléculas é basicamente devida à quantidade de

grupos carboxílicos e fenólicos e é dependente do pH da solução (Schmitt-

Kopplin et al., 1998). Os valores de pKa dos grupos carboxílicos nas

substâncias húmicas estão na faixa de 3,5 a 5. Em pHs elevados, os ácidos

húmicos estão mais negativamente carregados, devido à ionização dos

grupos carboxílicos e fenólicos. Assim, uma maior mobilidade eletroforética

dos AH na sua forma aniônica corresponderia a uma maior razão

carga/massa e, conseqüentemente, maior quantidade de grupos carboxílicos

e fenólicos (ou seja, maior acidez) (Pompe et al., 1996; Schmitt-Kopplin et

al., 1998). Entretanto, o uso de CZE fornece apenas resultados qualitativos,

com o objetivo de comparar a acidez de diversas amostras, mas não fornece

um valor absoluto de acidez.



Nos experimentos em eletroforese capilar (CE), utilizou-se um

sistema HP 3DCE (Hewlett Packard) com um capilar de 64,5 cm de

comprimento total, 56 cm de comprimento efetivo e 50 µm de diâmetro

interno. A detecção foi feita "on column" pelo sistema de UV-DAD, para um

comprimento de onda de 214 nm. A injeção utilizada foi do tipo

hidrodinâmica por 5 segundos e a voltagem aplicada foi de 25 kV. A

temperatura permaneceu constante a 25°C.

O condicionamento do capilar foi realizado antes das corridas

eletroforéticas, por lavagem do capilar com as seguintes soluções: 5 minutos

com solução de NaOH 1 mol L-1, 10 minutos com água desionizada e 15

minutos com o tampão de corrida. Entre cada corrida o capilar foi lavado

com solução de NaOH 1 mol L-1 durante 2 minutos, água desionizada por 1

minuto e com 3 minutos com solução tampão. As soluções tampão

utilizadas foram: tampão tetraborato (solução de bórax 0,020 mol L-1, pH 9,2)

e tampão carbonato (solução de NaHCO3 0,020 mol L-1, pH 9,7). Foi usada

uma solução de NaOH 0,05 mol L-1 para alcançar o pH desejado.

As amostras de HA foram dissolvidas em uma solução de

NaOH 0,05 mol L-1 e igual volume de metanol (marcador neutro), de forma

que a concentração final de AH ficasse igual a 0,5 mg mL-1.

O tempo de migração ajustado das amostras foi calculado em

relação ao tempo de migração do marcador do fluxo eletrosmótico (metanol):

maa ttt −=' . (47)

em que: ta’ = tempo de migração da amostra ajustado;

ta = tempo de migração da amostra;

tm = tempo de migração do marcador neutro.

A mobilidade eletroforética das amostras foi determinada

através das equações 48 e 49:

( ) VLvvVLvEv EOFOBSEFEFEF .. −===µ (48)

( )( )VLtltl maEF .−=µ (49)


em que: µEF = mobilidade eletroforética;

vEF = velocidade eletroforética;

vOBS = velocidade eletroforética observada;

vEOF = velocidade do fluxo eletrosmótico;

E = campo elétrico;

L = comprimento total do capilar;

l = comprimento efetivo (até o detector) do capilar;

V = voltagem aplicada.


As figuras 47 e 48 mostram os eletroferogramas das amostras

de AH em tampão tetraborato e carbonato, respectivamente. Os

eletroferogramas foram corrigidos em relação ao tempo de migração do

marcador neutro (metanol) para que o deslocamento das bandas das

amostras fosse mais bem visualizado.

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

-2

0

2

4

6

8

10

12


Abso

rbân

cia

(U.A

.)

Tempo de migração (min)

FIGURA 47 - Eletroferogramas das amostras de ácidos húmicos, utilizando-

se tampão tetraborato.


-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20-4

-2

0

2

4

6

8

10


Abso

rbân

cia

(U.A

.)

Tempo de migração (min)

FIGURA 48 - Eletroferogramas das amostras de ácidos húmicos, utilizando-

se tampão carbonato.

A tabela 20 mostra os valores de tempo de migração ajustado

(ta’ = ta – tm) e de mobilidade eletroforética das amostras de AH.

TABELA 20 - Valores de tempo de migração ajustado (ta’) e mobilidade

eletroforética (µEF) das amostras de ácidos húmicos (entre parênteses:

desvio-padrão; n = 3 determinações).

Amostra Tampão ta' (min) µEF (cm2 min-1 kV-1)

TN tetraborato 5,24 (0,09) -22,77 (0,21)

TP tetraborato 5,32 (0,06) -23,00 (0,29)

VN tetraborato 4,89 (0,19) -21,81 (0,26)

VP tetraborato 5,37 (0,12) -22,71 (0,23)

TN carbonato 3,82 (0,26) -24,07 (0,10)

TP carbonato 3,79 (0,14) -24,22 (0,04)

VN carbonato 3,42 (0,01) -22,97 (0,28)

VP carbonato 3,71 (0,05) -24,16 (0,19)


Observando as figuras 47 e 48 e a tabela 20, verifica-se um

tempo de migração menor para o AH de vermicomposto extraído com

NaOH. Como se trata de um ânion, um tempo de migração menor reflete

uma mobilidade eletroforética menor (em módulo). Essa menor mobilidade

para a amostra de AH de vermicomposto é verificada, seja usando tampão

tetraborato, seja usando tampão carbonato. O sinal negativo dos valores de

mobilidade é devido ao sentido dessa mobilidade, que é contra o fluxo

eletrosmótico. Partindo-se do pressuposto que os grupos aniônicos das

amostras são, basicamente, grupos carboxílicos e fenólicos, e sabendo-se

que a mobilidade de um íon é função da relação carga/massa desse íon,

pode-se inferir uma menor acidez do AH de vermicomposto extraído com

NaOH. Essa observação coincide com os experimentos de acidez por

titulação potenciométrica. Entretanto, para as outras amostras, não foi

observada nenhuma diferença significativa.

5.16 Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)

5.16.1 Introdução

Nas últimas duas décadas, tem-se visto um grande número de

livros e artigos de revisão na área de microcaracterização de solos e de

substâncias húmicas. Dentre as técnicas de imagens mais estudadas,

podem ser citadas a microscopia eletrônica de varredura (SEM), a

microscopia de transmissão eletrônica (TEM), a microscopia de força

atômica (AFM) e a microscopia por tunelamento (STM). Devido à maior

profundidade de foco alcançada, a SEM é mais adequada para a análise de

solos do que a TEM (Chen, 1998). As outras técnicas ainda são

relativamente caras, apesar do crescente uso, principalmente da AFM, no

estudo de compostos húmicos, devido à grande resolução obtida por essas

técnicas (Ferreira, 2002; Ferreira et al., 2001).

Estudos de SEM aplicados a ácidos húmicos e fúlvicos

mostraram que o pH, a concentração da solução do material húmico, o meio


iônico e até o método utilizado para secar e preparar a amostra podem

interferir na forma e no arranjo das partículas (Chen, 1998).


As suspensões dos AH foram preparadas em uma pequena

quantidade de água, colocadas sobre um suporte de alumínio e secas em

estufa a 50 °C.

As micrografias foram obtidas em um microscópio eletrônico de

varredura LEO-440, operando com um feixe de elétrons de 20 keV. As

amostras foram previamente recobertas com uma camada de ouro d 30 nm

de espessura em uma metalizadora Bal-Tec MCS 010.


As micrografias eletrônicas de varredura das amostras de

ácidos húmicos de turfa e vermicomposto são apresentadas na figura 49.

As amostras de AH apresentaram uma morfologia bastante

heterogênea, mas pode-se perceber que as amostras de AH de

vermicomposto (VN e VP) apresentaram partículas com tamanhos menores

que os AH de turfa (TN e TP). De um modo geral, as micrografias

evidenciam que as partículas os AH tendem a se aglomerar em

microporções compactas, com formas e tamanhos variados, destacando-se

a presença de estruturas lamelares e reticulares.


TN TP

VN VPFIGURA 49 - Micrografias de varredura das amostras de ácidos húmicos.

Aumento de 1000 vezes.

5 caracterizaÇÃo dos Ácidos hÚmicos - iqsc.usp.br · acidez total: uma amostra de 100 mg de ah...

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