Capıtulo 4 del libro

MAQUINAS MOLECULARES BASADAS EN ADN

cuyos autores son Mario J. Perez Jimenez y Fernando Sancho Caparrini

Publicado en el ano 2003 por el Secretariado de Publicaciones de la Universidad deSevilla, Coleccion de divulgacion cientıfica, numero 2, ISBN 84-472-0777-3, 2003.

4. Estructura y procesamiento del ADN

Inspirados en el desarrollo y la evolucion natural de los organismos vivos, en general, ydel ADN, en particular, trataremos de presentar sistemas o dispositivos computacionalesartificiales que sean plausibles; es decir, implementables hoy dıa (o en un futuro cercano)con la tecnologıa bioquımica de la que se dispone.

Para ello extraeremos de la propia realidad fısica ciertos objetos que puedan ser con-siderados como datos susceptibles de ser manipulados, ası como ciertas operaciones quepuedan ser ejecutadas sobre dichos objetos. A partir de ahı, hemos de describir procesosa traves de sucesiones finitas de transiciones entre configuraciones que reflejen los distin-tos estados del sistema. La instanciacion de los datos de entrada y de salida permitenconsiderar dichos procesos como computaciones.

La estructura de datos que vamos a considerar es la que proporcionan las moleculasde ADN, y las operaciones seran todas aquellas que en la actualidad pueden ser imple-mentadas, in vitro, con razonable fiabilidad.

En la primera seccion de este capıtulo se presenta de manera sucinta algunos hitosque han marcado de manera decisiva el desarrollo emergente de la computacion a nivelmolecular. En la segunda seccion se estudia brevemente la estructura del ADN, que vaa proporcionar los datos de los sistemas computacionales que seran estudiados a lo largodel texto. Ademas, se analizan los distintos tipos de enlaces que se pueden producir entrelos elementos basicos que integran el ADN, para formar cadenas simples o doble hebras.

La tercera seccion esta dedicada a la descripcion de algunas operaciones que se puedenrealizar en el laboratorio con cadenas del citado acido y que constituyen la base de lasmaquinas moleculares.

4.1. Introduccion

El hombre siempre tuvo el convencimiento de que algunos rasgos de cada generacionse transmitıan a la siguiente (todo ser engendra otros semejantes, sintetizaba una creenciageneralizada). No obstante, las reglas y mecanismos que rigen la herencia eran descono-cidos por completo.

Curiosamente, en 1872, Darwin aseguraba en un artıculo (The expressions of the emo-tions in man and animals) que las leyes que gobiernan la herencia son desconocidas en sumayor parte, mientras que desde hacıa seis anos (1866) estaban publicados los trabajos de

J.G. Mendel en los Anales de la Sociedad de Historia Natural de Brunn. En ellos, Mendelestablecıa los principios que rigen la herencia (los caracteres de los padres no se transmi-ten por azar, sino a traves de un mecanismo preciso con entidad de ley). Concretamente,habıa descubierto que los caracteres se transmitıan de padres a hijos de forma discreta,segun fuese dominante o recesivo. A esos caracteres con la capacidad de tomar valores seles denomino genes.

A principio del siglo XX se descubrio que los cromosomas (descritos por Hofmeisteren 1848 y cuya denominacion se debe a Waldeyer, 1888) estan relacionados directamentecon los mecanismos de la herencia, al ser portadores del material genetico que determinalas caracterısticas de la descendencia. Entre 1943 (Claude, Porter) y 1947 (Mirsky) se des-cubre que los cromosomas estan compuestos, basicamente, por proteınas y ADN. Debidoa la mayor complejidad de la estructura molecular de las proteınas, se tenıa el convenci-miento de que estas debıan ser las encargadas de transportar la informacion genetica delos padres.

Los trabajos de J. Watson y F. Crick de principio de la decada de los cincuenta (entre1951 y 1953) echarıan por tierra el papel relevante atribuido a las proteınas en relacioncon la herencia. Concretamente J. Watson y F. Crick:

Demuestran que las moleculas de ADN codifican toda la informacion genetica delos organismos vivos.

Descifran la estructura molecular del ADN.

Descubren el principio de complementariedad ası como el direccionamiento de dichasmoleculas (por lo cual recibieron el premio Nobel).

Justifican la posibilidad de usar ciertas tecnicas para su manipulacion.

A principio de la decada de los cincuenta comienza a ponerse de manifiesto la analogıaexistente entre algunos procedimientos matematicos y ciertos procesos biologicos. Poruna parte, para calcular el valor de una funcion computable en un elemento, x, de sudominio, es necesario realizar una serie de operaciones elementales del modelo (en el quela funcion es computable) sobre el dato de entrada x; por otra, todo organismo vivo sepuede considerar, en esencia, como el resultado de un proceso evolutivo que consiste enrealizar una serie de operaciones bioquımicas sobre cadenas de acido desoxirribonucleico(ADN).

En cierto sentido, L.M. Adleman materializo esta similitud en noviembre de 1994([1]) mostrando que era posible usar mecanismos bioquımicos para atacar la resolubili-dad mecanica de ciertos problemas matematicos especialmente difıciles. Concretamente,mediante un experimento realizado en el laboratorio L.M. Adleman consiguio resolver unainstancia concreta de un problema presuntamente intratable usando tecnicas de biologıamolecular para la manipulacion del ADN (un problema se dice que es presuntamenteintratable si cualquier solucion algorıtmica conocida del mismo necesita una cantidad derecursos de tipo exponencial en el tamano del dato de entrada).

En abril de 1995, inspirados en las ideas de Adleman, R.J. Lipton [51] describe unmetodo teorico para resolver instancias arbitrarias de otro problema computacionalmente

intratable usando moleculas de ADN, y proporciona por primera vez un procedimientogeneral susceptible de ser considerado como un esquema algorıtmico molecular.

La resolubilidad algorıtmica practica de problemas esta relacionada directamente conla potencia de calculo y la densidad de almacenamiento de informacion de los ordenadoresconvencionales. En este contexto, el paralelismo represento, en su dıa, un avance significa-tivo, y la miniaturizacion de las componentes fısicas de la maquina pasa a ser un objetivoimportante.

Como indicamos en el capıtulo anterior, R.P. Feynman ([29]) introduce el conceptoteorico de computacion a nivel molecular, y lo postula como una revolucion en el marcode la miniaturizacion de las componentes fısicas de las maquinas. A partir de entonces, losorganismos vivos, en general, y algunas moleculas en particular, son consideradas poten-cialmente como maquinas capaces de desarrollar procesos susceptibles de ser interpretadoscomo operaciones de calculo. Las ideas de Feynman adquieren una especial relevancia apartir de 1983, cuando R. Churchhouse establece las limitaciones fısicas de la velocidadde calculo de un procesador convencional.

El auge de los actuales ordenadores electronicos ha sido posible gracias al inventodel transistor que sustituyo a las valvulas y tubos de vacıo de la primera generacionde los ordenadores electronicos. Con los transistores comenzo propiamente la segundageneracion (en 1958) y propicio, por primera vez, la manipulacion electronica del silicio.Los transistores dieron paso, sucesivamente, a los circuitos integrados (tercera generacion,mediados de la decada de los sesenta), compuestos por cientos de transistores, y los chipsde silicio (cuarta generacion, principio de la decada de los setenta) que incorporan milesde transistores y basan su funcionamiento en un proceso de grabado a traves de un rayode luz.

Ası como el transistor permitio por primera vez la manipulacion electronica del silicio,el experimento de Adleman puede ser considerado como un primer paso hacia la cons-truccion de un prototipo de ordenador molecular basado en la manipulacion bioquımicadel carbono.

En julio de 2000, un equipo de cientıficos de la Universidad de California desarrollo uninterruptor del tamano de una millonesima de milımetro (un nanometro), a partir de unamolecula.

Todo parece indicar que este interruptor puede representar una alternativa revolucio-naria en relacion con los actuales chips de silicio, debido a las consideraciones siguientes:

En su funcionamiento sustituye la luz por una reaccion quımica, lo que representaun importante ahorro en el consumo de energıa.

Estos nuevos interruptores podrıan disponer de mas de mil procesadores en el espacioocupado hoy dıa por un procesador (los actuales chips de silicio tienen una alturaaproximada de cinco mil nanometros).

Se estima que estos interruptores podrıan aumentar la velocidad de procesamientode la informacion, cien mil millones de veces la de un ordenador convencional, ypodrıan reproducir la capacidad equivalente a cien ordenadores convencionales enel tamano de un grano de sal fina.

En noviembre de 2001, Ehud Shapiro y otros [8], del Weizmann Institute of Sciencede Tel Aviv, consiguieron implementar una maquina de Turing a traves de moleculas deADN en el laboratorio.

4.2. Estructura del ADN

Tradicionalmente la molecula de ADN se ha representado como una molecula de es-tructura uniforme con apariencia de doble helice (en forma de escalera de caracol), tal ycomo la describieron Watson y Crick inicialmente.

Figura 4.1. Estructura helicoidal de una molecula de ADN

Sin embargo, en los ultimos quince anos los avances tecnicos han permitido desterraresta idea de uniformidad en su estructura, mostrando que se pueden producir variantesmucho mas complejas. Pese a que es imprescindible conocer a fondo dicha complejidadpara poder realizar implementaciones eficientes, y debido al uso que de las moleculasvamos a hacer, nos centraremos en la idea tradicional y mantendremos en mente la visionde una molecula con forma de doble hebra helicoidal (habitualmente, las estructuras mascomplejas en las moleculas de ADN se producen cuando se aumenta la longitud de lasmismas).

El primer dato que llama la atencion es que esta estructura helicoidal (ver figura 4.1)no responde tan solo a un resultado mas o menos aleatorio de la naturaleza, sino quejuega un papel importante a la hora de preservar la seguridad de la informacion que vaescrita en la molecula.

Gracias a esta estructura, dicha informacion, codificada a traves de la sucesion de ba-ses nitrogenadas que conforman la molecula, queda hacia el interior (en la zona media delos peldanos de la escalera), de forma que las paredes exteriores de la helice la protegende posibles alteraciones que se pudieran producir por reacciones con moleculas del en-torno. Los enlaces que mantienen unida la doble helice son localmente debiles (unos masque otros) de tal manera que no precisan mucha energıa para su ruptura. No obstante,globalmente dotan a la molecula de una configuracion que resulta muy estable y robusta.

A lo largo de millones de anos, en el proceso evolutivo de los organismos vivos, sehan desarrollado complejos procedimientos biologicos que permiten modificar, de formacontrolada, la estructura interna de las moleculas de ADN. Ası por ejemplo, algunasenzimas son capaces de reconocer diversos puntos dentro de las largas cadenas de ADN,quedando ancladas a ellos y provocando el comienzo de operaciones tan complejas comoson la separacion o union de la doble hebra, copia de su totalidad o trozos especıficos,modificacion de alguna (o algunas) base concreta, etc.

Para comprender la estructura del ADN es preciso conocer los elementos basicos quelo integran. Por ello, vamos a describir de manera muy somera esas componentes, igno-rando muchos detalles tecnicos de tipo bioquımico que no son relevantes para el desarrolloposterior que se va a realizar.

El acido desoxirribonucleico (ADN) es un polımero que, en su estructura lineal, constade una serie de monomeros denominados desoxirribonucleotidos (que llamaremos breve-mente nucleotidos). A su vez, cada nucleotido consta de (vease figura 4.2) :

(a) Un azucar (desoxirribosa) que tiene cinco atomos de carbono enumerados del 1’ al5’ , y que en el carbono 3’ tiene un grupo hidroxilo (OH).

(b) Un grupo fosfato (P ), unido al azucar por el carbono 5’.

(c) Una base nitrogenada, unida al azucar por el carbono 1’.

La enumeracion con primas de los cinco atomos de carbono que integran el azucar, sedebe a que la base nitrogenada tambien tiene atomos de carbono que son enumerados sinprimas.

Generalmente se identifica cada nucleotido con la base nitrogenada que contiene. Exis-ten cuatro tipos de bases nitrogenadas: adenina, citosina, guanina y timina, que se repre-sentan por las iniciales correspondientes: A, C, G, T. La adenina y la guanina pertenecenal grupo de las purinas, mientras que la citosina y la timina pertenecen al grupo de laspiramidinas.

B

OHP

5

4

2

3

1’

’

’

’

’

Figura 4.2. Estructura esquematica de un nucleotido

De los nucleotidos no solo nos interesa su estructura bioquımica sino la forma en quepueden enlazarse entre sı. Existen dos maneras diferentes:

(a) Mediante un enlace fosfodiester (covalente): el grupo fosfato 5′ de un nucleotido seune al grupo hidroxilo 3′ de otro (ver la figura 4.3).

P

B

5

4

2

3

1’

’

’

’

’

B1 2

5

4

3

2

1’

’

’

’

’

P

OH OH

P

B

5

4

2

3

1’

’

’

’

’

B

OH

5

4

3

2

1’

’

’

’

’

P

OH

43

Figura 4.3. Enlace fosfodiester: cadena simple 5′–B1B2B3B4

(b) Mediante un enlace de hidrogeno que se realiza a traves de las bases nitrogenadas(ver la figura 4.4).

El enlace fosfodiester (covalente) entre nucleotidos permite la construccion de cadenassimples de ADN, como se muestra en la figura 4.3. Dichas cadenas poseen dos extremos decomportamiento muy diferente tanto quımica como biologicamente; uno de ellos con ungrupo fosfato (determinado por un carbono 5′) dispuesto a nuevos enlaces, y el otro conun grupo hidroxilo (identificado por un carbono 3′) en analoga disposicion. Entre otraspropiedades bioquımicas, la diferencia existente entre ambos extremos proporciona unapolaridad o direccionamiento a las moleculas de ADN. Ası hablaremos de la direccion 5′ →3′ o la direccion 3′ → 5′. A la hora de trabajar con cadenas simples, sobreentenderemosque estan escritas en la direccion 5′ → 3′, a menos que se explicite lo contrario. Porejemplo, la cadena CTAGAC es, en realidad, la cadena 5′-CTAGAC-3′ (y que tambiense podrıa leer ası: 3′-CAGATC-5′).

El enlace de hidrogeno es mas debil que el fosfodiester y se rige por el principio decomplementariedad: la adenina solo se puede enlazar con la timina (y recıprocamente), yla citosina solo con la guanina (y recıprocamente). Mas aun, el enlace entre la adenina yla timina se establece a traves de dos puentes de hidrogeno mientras que entre la citosinay la guanina se producen tres puentes de hidrogeno, lo cual proporciona un poco mas defuerza a este ultimo enlace.

Combinando enlaces fosfodiester y enlaces de hidrogeno se obtienen cadenas dobles deADN, como se muestra en la figura 4.4.

Es decir, dicha combinacion proporciona doble hebras que se disponen espacialmenteformando la estructura de doble helice: dos cadenas simples estan alineadas de formaantiparalela (es decir, una con la direccion 5′ → 3′ y la otra con direccion 3′ → 5′) yunidas por enlaces de hidrogeno; los nucleotidos estan unidos por enlaces fosfodiester,con los grupos fosfatos orientados hacia el exterior de la helice y las bases nitrogenadasproximas al centro. Todo ello proporciona una gran estabilidad a la molecula.

Ası pues, en la formacion de doble hebras de ADN existen dos hechos basicos queconviene volver a destacar:

1. Los enlaces de hidrogeno se rigen por el principio de complementariedad de Watson–Crick.

2. Las cadenas simples tienen una direccionalidad dada por el enlace fosfodiester y elenlace de hidrogeno solo puede afectar a dos cadenas simples de polaridad opuesta.Por ejemplo, las cadenas 5′-CTAGAC-3′ y 5′-GATCTG-3′ no pueden formar doblehebras, a pesar de que las sucesiones CTAGAC y GATCTG satisfacen la condicionde complementariedad; en cambio sı la pueden formar las siguientes cadenas sim-ples 5′-CTAGAC-3′ y 3′-GATCTG-5′ porque las correspondientes sucesiones soncomplementarias y, ademas, las cadenas tienen direccionamiento distinto.

P

P

B

5

4

2

3

1’

’

’

’

’

B1 2

5

4

3

2

1’

’

’

’

’

P

OH OH

P

B

5

4

2

3

1’

’

’

’

’

B

OH

5

4

3

2

1’

’

’

’

’

P

OH

43

B B BB--

1 2 3 4

OHP PP

OH OH OH

1’

2

3

5

1’ 1’ 1’

’

’

’

2 2 2

3 3 3

4’ 4’ 4’4’

5 5 5’ ’’

’ ’ ’

’’’

- -

Figura 4.4. Enlace fosfodiester + Enlace de hidrogeno: doble hebra

Si γ es una cadena simple, notaremos γ la cadena formada por los nucleotidos comple-mentarios (las cadenas complementarias se expresaran, en cambio, en la direccion 3′ → 5′,salvo que se explicite lo contrario).

4.3. Procesamiento de cadenas de ADN

La complejidad estructural del ADN, ası como la diversidad en la formacion de estasmoleculas a partir de las distintas combinaciones de las bases nitrogenadas, va acompanada

de una amplia gama de operaciones que sobre ellas se realizan en los seres vivos y que, enlos ultimos anos, se han podido reproducir en el laboratorio. A continuacion describimos,sin entrar en mucho detalle, algunas de estas operaciones, que constituyen la base tantode la ingenierıa genetica como de la computacion molecular basada en ADN. Para mayordetalle se remite al capıtulo 0 de [74] y al capıtulo 1 de [94].

4.3.1. Desnaturalizacion y Renaturalizacion

La estructura en doble helice del ADN es especialmente solida. La estabilidad de ladoble hebra proviene, como hemos comentado anteriormente, de dos tipos de fuerzasquımicas, los enlaces de hidrogeno y los enlaces fosfodiester, ası como en la distribucionespacial de las componentes. Ademas, la helice, en estado natural, se encuentra cubiertapor moleculas de agua que forman lo que podrıa considerarse como una especie de escudo.

El proceso biologico por el cual se rompen los enlaces de hidrogeno de una doble hebradando lugar a dos cadenas simples de ADN, se denomina desnaturalizacion (melting oreannealing). Este proceso se puede simular en el laboratorio calentando la solucion en laque esten las doble hebras de ADN, hasta una temperatura comprendida entre 85 y 94grados centıgrados.

El proceso inverso, denominado renaturalizacion (annealing), se consigue sometiendola solucion con cadenas simples complementarias a un enfriado lento hasta aproximada-mente los 55 grados centıgrados, a fin de permitir que las bases nitrogenadas complemen-tarias se vayan uniendo a traves de los correspondientes enlaces de hidrogeno.

4.3.2. Medida de la longitud de una molecula

La longitud de una cadena simple se define como el numero de bases nitrogenadas quecontiene, y se expresa en mer. La longitud de una cadena doble se define como el numerode pares de bases nitrogenadas complementarias que contiene y se expresa en bp (paresde bases).

La tecnica mas usual que se utiliza para medir una molecula de ADN se denominaelectroforesis en gel. El procedimiento se basa en el hecho de que toda molecula de ADNesta dotada de una carga electrica negativa que es proporcional a su longitud. Ademas,la fuerza necesaria para desplazarla debe ser, igualmente, proporcional a su longitud.Por tanto, si un conjunto de moleculas de ADN es sometido a un campo electrico enuna solucion ideal, todas las moleculas se desplazaran hacia el electrodo positivo a igualvelocidad, con independencia de la longitud que posean. Una forma de discriminar lasmoleculas entre sı, en funcion de su longitud, consiste en sustituir la solucion ideal por ungel, que provoca un rozamiento mayor en las moleculas de mas longitud. Para ello:

Se coloca un gel adecuado en disolucion y se ubica en un recipiente rectangular(habitualmente se consigue anadiendo al disolvente gel en polvo y calentando ladisolucion).

Con la ayuda de un instrumento en forma de peine, y durante el proceso de enfriado,se realizan una serie de ranuras en el gel.

En las distintas ranuras formadas por el peine se colocan las moleculas de ADN quese quieren medir.

Se activa el campo electrico, situando el electrodo positivo en el lado opuesto a lasranuras, desactivandolo cuando la primera molecula llegue a el.

La longitud de cada molecula se calcula a partir de la distancia recorrida durante elproceso y el tiempo transcurrido.

4.3.3. Extraccion de moleculas

Es posible seleccionar de un tubo que contiene en disolucion cadenas simples de ADN,todas aquellas moleculas que contienen como subcadena una cierta cadena prefijada.

Para realizar esta operacion, dado un tubo de ensayo, T , que contiene una solucion concadenas simples de ADN, y γ, una cadena simple de ADN prefijada, se utiliza la tecnicade las sondas metalicas, que consiste en lo siguiente:

Se consideran unas microesferas de hierro que tienen adheridas la cadena 3′ − γ, yse introducen en el tubo T .

Se somete la solucion a un proceso de renaturalizacion.

Se coloca un iman a un lado del tubo, T , y se vierten en otro recipiente, T1, lasmoleculas no adheridas a 3′ − γ.

Se retira el iman, se anade nuevo disolvente y se somete la solucion a un proceso dedesnaturalizacion.

Se vuelve a colocar un iman a un lado del tubo, T , y se vierte en otro recipiente,T2, las moleculas no adheridas a 3′ − γ.

El tubo T1 estara formado por las moleculas del tubo inicial que no contienen a γcomo subcadena, y T2 por aquellas que sı contienen a γ como subcadena.

Esta operacion suele ser problematica a la hora de ser implementada en el laboratorioya que puede dar lugar a errores; es decir, en el tubo T1 podrıa existir alguna moleculaque contiene a γ como subcadena, o bien en el tubo T2 podrıa existir alguna molecula queno contiene a γ como subcadena.

No obstante, como veremos en la seccion 5.3 del capıtulo 5, estos errores se puedenamortiguar y controlar, en cierto sentido.

4.3.4. Alargar y copiar una cadena de ADN

Las enzimas son unas proteinas que catalizan ciertas reacciones quımicas que tienenlugar en los organismos vivos. Algunas enzimas estan especializadas en determinadasreacciones hasta tal punto que son capaces de aumentar la velocidad de la reaccion millonesde veces, lo que permite la supervivencia de muchas celulas. Sin lugar a dudas, las enzimasjuegan un papel fundamental en el mecanismo de la vida.

La ADN polimerasa es la enzima responsable de la replicacion del ADN, sintetizandouna nueva cadena simple usando otra como patron. Se suele decir que la polimerasa es laenzima de la vida. En cierto sentido podemos considerar que esta enzima implementa lacomplementariedad de Watson–Crick.

Para ello, se desliza sobre la cadena patron, leyendo los nucleotidos y escribiendo deacuerdo con una cierta ley. Podemos resaltar la similitud entre la accion de esta enzimay la ejecucion de una maquina de Turing: la cabeza de trabajo de la maquina se desliza atraves de la cinta, va leyendo las casillas y escribe sobre la misma segun le dicta la funcionde transicion de la maquina, que tambien indica como debe continuar desplazandose.

L. Adleman se percato de esta analogıa e intento simular una maquina de Turinga traves de moleculas de ADN y de la enzima polimerasa. Tras fracasar en el intento(conseguido por Ehud Shapiro en noviembre de 2001), L. Adleman trato de resolver unainstancia de un problema NP-completo mediante la manipulacion de moleculas de ADN.Esta vez realizo con exito el experimento.Para copiar una cadena simple de ADN necesitamos tres elementos:

(a) Un molde o patron, que es una cadena simple que codifica por complementariedadla cadena a copiar.

(b) Un cebador (primer), que suele ser una cadena corta enlazada al molde por elextremo 5.

(c) Nucleotidos suficientes en la solucion. La polimerasa se activa cuando llega al extre-mo 3′ del cebador.

El proceso de copiado se realiza en la direccion 5′ → 3′, que se denomina direccion de lavida.

3’OH

cebador

molde5’3’

3’5’

Figura 4.5. Accion de la polimerasa

4.3.5. Sıntesis de una cadena de ADN

Esta operacion permite fabricar cadenas (simples o dobles) de ADN a partir de unasecuencia prefijada.

La sıntesis de una cadena simple se realiza en la direccion 3′ → 5′. El primer nucleotidose adhiere a un soporte solido por el extremo 3′ y se van anadiendo nucleotidos por elextremo 5′. Una cadena corta sintetica de nucleotidos recibe el nombre de oligonucleotido,o mas brevemente, oligo.

Para sintetizar una doble hebra, en primer lugar se sintetiza la hebra 3′ → 5′ y seconsidera un cebador; despues se usa la polimerasa para completar la doble hebra tal ycomo se ha descrito en el apartado anterior. En la actualidad, este proceso puede realizarsede forma automatica.

4.3.6. Alteracion de nucleotidos en una cadena de ADN

Hay un tipo de enzimas, llamadas de restriccion, que reconocen lugares determinadosdentro de las cadenas de ADN, a las que se adhieren. De esta forma, dichas enzimas permi-ten la activacion local de ciertos procesos moleculares que producen una desestabilizacionen las cadenas hasta el punto de provocar su ruptura.

Existe otro tipo de enzimas, denominadas de modificacion, que alteran las cadenasde ADN anadiendo o quitando oligos a las mismas. Este tipo de enzimas suele actuaren colaboracion con una enzima de restriccion que tiene asociado el mismo lugar dereconocimiento.

Las enzimas de modificacion son utiles para controlar algunas operaciones con ADN,especialmente aquellas que utilizan los organismos vivos para protegerse de ataques ex-ternos.

Ası por ejemplo, para defenderse de un cierto virus, una determinada bacteria cuentacon una enzima de restriccion cuyo objetivo es destruir cadenas de ADN del virus. Dichaenzima trabaja en colaboracion con una de modificacion, que tiene el mismo lugar de reco-nocimiento, y cuya mision consiste en alterar temporalmente los lugares correspondientesen las cadenas de ADN de la bacteria a fin de que esta no quede afectada por la accion desu propia enzima de restriccion, consiguiendo ası destruir unicamente el material geneticodel virus. Posteriormente la enzima de modificacion se encarga de restaurar los lugares dereconocimiento alterados.

4.3.7. Degradacion de cadenas de ADN

Las enzimas nucleasas tienen la capacidad de destruir los enlaces fosfodiester. Estasenzimas se pueden clasificar en dos tipos:

Las exonucleasas, que eliminan nucleotidos de una doble hebra, a la vez uno decada extremo y en la direccion 3′ → 5′. Estas enzimas son mas flexibles que laspolimerasas: algunas variedades solo son especıficas para cadenas simples, otraspara doble hebras, otras unicamente eliminan nucleotidos del extremo 5′, y otrassolo del extremo 3′.

El resultado de una enzima de este tipo es un acortamiento de la cadena sobre la

que actua.

CGCTGCGA

AATCTTAG

ΦCGA TTA

Φ5’

Exonucleasa ExonucleasaGCT AAT CT AATTGA

Φ5’

5’3’

3’3’

3’ 5’

5’

3’ 5’

3’

Figura 4.6. Acortamiento de doble hebra por la accion de una enzima exonucleasa

Las endonucleasas pueden cortar cadenas (simples o dobles) de ADN por cualquiersitio. No obstante, existe una variedad (las endonucleasas de restriccion) que solopueden cortar doble hebras por un sitio especıfico (su lugar de reconocimiento). Estetipo de enzimas esta especializado segun el lugar de reconocimiento y la forma derealizar el corte. Si existen varios lugares de reconocimiento en una doble hebra,entonces la endonucleasa de restriccion realizara un corte por cada uno de ellos.

Ası por ejemplo, existe una endonucleasa de restriccion (EcoRI) que tiene como lugarde reconocimiento la cadena 5′GAATTC y el corte lo realiza entre los nucleotidos Gy A. Al activarse esta enzima analiza la hebra buscando esa secuencia en la direccionapropiada (en este caso la direccion 5′ → 3′). Cuando la encuentra secciona la hebrapor el sitio antes indicado.

5’

3’

5’

3’ 5’

3’CACGAATTCGGTGCTTAAGC

CACG

GTGCTTAAAATTCG

GC

Endonucleasa

de restricción 5’

3’

Figura 4.7. Accion de una enzima endonucleasa de restriccion en una doble hebra

Como resultado final de la accion de una enzima endonucleasa de restriccion, se obtienendos doble hebras parciales con sendos voladizos (sticky ends) En el caso del ejemplodescrito en la figura los voladizos que se obtienen son 5′AATT y 3′TTAA.

4.3.8. Rellenado de cadenas de ADN

Al cortar una doble hebra utilizando enzimas nucleasas se producen una serie devoladizos que, en determinadas condiciones, pueden volver a enlazarse entre sı. En estecaso, ası como en otros procesos, pueden aparecer unos pequenos huecos entre nucleotidosconsecutivos de una cadena simple de ADN. La ligasa es una enzima que permite rellenardichas hendiduras restaurando la fortaleza del enlace covalente y la estabilidad de la

molecula.

GTGCTTAA

5’

3’ 5’

3’

GC

5’

5’3’

3’LigasaCACG AATTCG CACG

GTGCTTAA GC

AATTCG5’

5’3’

3’

Figura 4.8. Accion de una enzima ligasa

4.3.9. Recombinacion de moleculas de ADN

Como hemos visto antes, en determinadas condiciones una enzima de restriccion puedecortar una doble hebra de ADN, dando lugar a la aparicion de doble hebras parciales conunos voladizos.

Existen muchas enzimas de restriccion que tienen los mismos lugares de reconocimientoy, por tanto, producen voladizos identicos. De esta manera, en una disolucion en la queexistan doble hebras parciales con voladizos que son complementarios Watson-Crick, existela posibilidad de que algunas de esas doble hebras vuelvan a enlazarse por un proceso derenaturalizacion, fortalecido por la accion de la enzima ligasa que rellena las posibleshendiduras que pueden aparecer en el proceso de union.

De esta manera se produce una nueva operacion molecular que se conoce por el nom-bre de recombinacion. Esta operacion da lugar a un proceso denominado hibridacion demoleculas de ADN.

En el ejemplo descrito en la figura 4.9 se han considerado dos enzimas de restriccion (laTaqI y la SCiNI) que tienen como lugares de reconocimiento 5′-TCGA-3′ y 5′-GCGC-3′,respectivamente. Es interesante observar que estos lugares son palindromas en el siguientesentido: la lectura de la cadena en la direccion 5′ → 3′ es la misma que la lectura desu complementaria en la direccion 5′ → 3′. Este hecho suele ser bastante usual entre lasenzimas de restriccion.Ademas, puede ocurrir que los cortes producidos en una doble hebra por enzimas dereconocimiento produzcan voladizos identicos. En esas circunstancias, un proceso de re-naturalizacion combinado con la accion de la enzima ligasa puede generar moleculas de

ADN circulares.

CCCCCTCGACCCCC

GGGGGAGCTGGGGG

AAAAAGCGCAAAAA

TTTTTCGCGTTTTT

CCCCCTCGACCCCC AAAAAGCGCAAAAAGGGGGAGCTGGGGG TTTTTCGCGTTTTT

CCCCCTCGCAAAAAGGGGGAGCGTTTTT

AAAAAGCGACCCCC

TTTTTCGCTGGGGG

Enzima Enzima

de restricción de restricción

(TaqI) (SciNI)

Ligasa+

Renaturalización

5’ 5’

5’ 5’

5’5’

5’

5’ 5’

5’5’

3’

3’

3’ 3’

3’

3’

3’

3’3’

3’

3’

5’3’

Figura 4.9. Recombinacion de moleculas de ADN

4.3.10. Copias multiples (amplificacion) de cadenas de ADN

La tecnica de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) fue descubierta por K.Mullis en 1985 y permite generar gran cantidad de copias de una cadena molde o patron.Esta tecnica es muy eficiente y tiene una gran cantidad de aplicaciones en ingenierıagenetica, analisis del genoma, diagnosis clınica, arqueologıa, paleontologıa, etc.

La tecnica de la reaccion en cadena de la polimerasa funciona como sigue:

Supongamos que disponemos de una doble hebra, α, de la que queremos realizarcopias identicas, y cuyos bordes 3′ son β (“ borde superior”) y γ (“borde inferior”).

En la fase inicial se prepara una solucion que contiene la molecula α, oligos 3′ − β,5′− γ, nucleotidos en cantidades elevadas, y la enzima polimerasa (debido a que enun paso posterior se efectuara un calentamiento de la disolucion, se usa una variedadde la polimerasa resistente a altas temperaturas, para que la energıa proporcionadaa la disolucion no destruya los enlaces propios de la enzima).

La fase de ejecucion propiamente dicha consta de una serie de ciclos cada uno delos cuales comprende tres pasos:

(a) Desnaturalizacion: se calienta la solucion hasta una temperatura cercana a lade ebullicion con el fin de romper los enlaces de hidrogeno.

(b) Renaturalizacion: mediante un enfriado lento se producen enlaces entre losbordes y los oligos proporcionados inicialmente.

(c) Extension: se calienta nuevamente la solucion hasta unos 72 grados con el finde que la polimerasa extienda los bordes, reconstruyendo la cadena de ADNoriginal por medio de la complementariedad de las bases.

En cada uno de los ciclos anteriores se duplica el numero de doble hebras α; portanto, al reiterar este proceso n veces se obtienen 2n copias de la molecula patron.

4.3.11. Lectura de una cadena de ADN

El Proyecto Genoma Humano, iniciado en 1990 y coordinado por instancias publicasde E.E.U.U., tenıa como objetivo descifrar antes del ano 2003 la secuenciacion correcta delADN humano. Craig Venter, un cientıfico heterodoxo que participaba en dicho Proyecto,creo en 1998 una empresa privada (PE Celera Genomics) en la que consiguio descifrar, enel ano 2000, unos 3.120 millones de pares de nucleotidos que componen el ADN humano(aun quedan por transcribir unos 40.000 “huecos” y verificar varias veces los resultadosde Venter, a fin de elevar a definitivo los resultados provisionales obtenidos). El trabajoconsistio en la lectura correcta de una cadena de ADN extraordinariamente grande. Exis-ten distintas tecnicas en la actualidad para poder realizar la lectura de una cadena simplede ADN. A continuacion describimos (sin entrar en detalles) una de ellas.

Se consideran ciertos nucleotidos que han sido modificados levemente, denominadosnucleotidos analogos, que se denotan por ddA, ddC, ddG, ddT , asociados a los nucleotidosA,C,G, T , respectivamente. La operacion de lectura de una cadena simple de ADN, α, serealiza como sigue:

Se extiende α por el extremo 3′ de acuerdo con un molde γ, formando una cadenasimple β.

Se preparan cuatro tubos (TA, TC , TG, TT ) conteniendo cadenas β, oligos 5′ − γ,polimerasa y nucleotidos en suficiente cantidad. Ademas, en el tubo TX se anadirannucleotidos analogos del tipo ddX, para cada X ∈ {A,C,G, T}.

A partir de la cadena simple β y de los oligos 5′ − γ, en cada tubo TX se obtienendoble hebras parciales β′.

En el tubo TX , la polimerasa completa las doble hebras parciales β′. No obstante,en este proceso apareceran doble hebras parciales no completas cuando se elija elnucleotido analogo ddX en lugar de X.

Se somete la solucion a un proceso de desnaturalizacion y se extraen de la solucionlas cadenas simples que contienen a 5′ − γ.

Se colocan las cadenas extraıdas en una solucion y se ordenan segun su longitud,mediante la tecnica de la electroforesis en gel.

Por ultimo, se leen los nucleotidos del extremo 3′ de las cadenas ordenadas: la cadenacomplementaria sera α.

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