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4.2. RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE UMA PROTEÍNA
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Lição de Biocatálise
• Quando existem diferenças significativas em relação à estabilidade de uma
proteína, com a mesma função biológica, essas diferenças ocorrem ao nível de
uma pequena variação na sequência dos amino ácidos sem causar grande
diferenças ao nível da estrutura terceária e, por isso, torna difícil prever a
estabilidade de uma proteína a partir das suas características estruturais.
• Para esclarecer e compreender essa diferença tem de se isolar e purificar as
proteínas com a mesma função biológica, em geral, de fontes diferentes e
analisar:
- Composição de amino ácidos e estrutura primária,
- Estrutura terceária e mobilidade de conformação,
- Resistência à desnaturação reversível e irreversível,
- Dependência da actividade enzimática da temperatura.
4.3 MÉTODOS PARA ESTUDAR AS RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE ENZIMAS
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Lição de Biocatálise
A) Comparação de proteínas homólogas de microorganismos mesófilosao nível da composição de amino ácidos.
B) Comparação de proteínas de microrganismos mesófilos e termófilos onde ocorrem diferenças significativas de estabilidade
C) Comparação de proteínas de mutantes com a proteína da estirpe selvagem e, assim investigar o papel de um resíduo de amino ácido específico na estabilidade da proteína,
D) Proteínas preparadas no laboratório1) IMOBILIZAÇÃO2) MUTAGÉNESE DIRIGIDA3) MODIFICAÇÃO QUÍMICA
4.4 RAZÕES MOLECULARES PARA A ESTABILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
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Lição de Biocatálise
1) Ligação de iões metálicos, substratos, co-factores e outros ligandos de baixo peso molecular,
2) Interacções proteína-proteína e proteína-lípidos,
3) Ligação iónica, dipolo-dipolo e outras interacções electrostáticas,
4) Ligações dissulfureto (-S-S-),
5) Baixo teor de amino ácidos sensíveis à oxidação,
6) Compactação dos resíduos de amino ácidos,
7) Interacções hidrófobas,
8) Barreiras do desdobramento.
4.2. RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE UMA PROTEÍNA
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Lição de Biocatálise
Desnaturação reversível
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Desnaturação reversível
Técnicas para avaliar a desnaturação – absorção ultravioleta
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4.2. RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE UMA PROTEÍNA
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Desnaturação irreversível ou desactivação
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A maior parte dos enzimas, com excepção talvez dos enzimas imobilizados, desactiva de acordo com uma cinética de 1ª ordem:
k
E → Ed
em que E e Ed representam respectivamente o enzima com e sem actividade.
Escrevendo a equação diferencial para o desaparecimento da actividade (-dE/dt=kE) e integrando obtém-se:
kte
E
E−
=
0
em que E0 representa a actividade no tempo zero.
Quando se compara a desactivação de vários enzimas ou de um enzima em diferentes condições, é mais intuitivo comparar-se o tempo de meia vida em vez da constante cinética:
kt
2ln
21
=
t1/2 é o tempo ao fim do qual o enzima perde 50% da sua actividade e éfacilmente dedutível considerando E/E0=0.5.
4.2. RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE UMA PROTEÍNA
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4.2. RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE UMA PROTEÍNA
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Mecanismos de desnaturação ou desactivação
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Estabilidade de Proteínas: Desnaturação - Desactivação
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O modelo mais utilizado é o modelo de desactivação de primeira ordem:
Ekdt
dE
d=−
em que E é a actividade do enzima no reactor no tempo t e kd
é a constante de desactivaçãode primeira ordem. Outros modelos:
ES
k
t
Ed
d
d=−
EP
k
t
Ed
d
d=−
tk
EE
d
0
1+
=
nEtk
t
E
d
d
d=−
(a) desactivação enzimática dependente do substrato
(b) desactivação enzimática dependente do produto
(c) modelo linear invertido
(d) desactivação enzimática dependente do tempo
Lição de Biocatálise (12 de Maio de 2006)
4.2. RELAÇÕES ESTRUTURA/ESTABILIDADE DE UMA PROTEÍNA
Estabilidade operacionalDEQB
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