4-fermentacao(cominibicao)

8/19/2019 4-Fermentacao(cominibicao)

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Bioquímica Experimental II – LOT2006 Profª. Eleonora

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Teoria da Prática:Fermentação

Introdução

ConceitoO termo fermentação no sentido mais amplo possível pode ser definido como todo o processo noqual microrganismo catalisa a conversão de uma substância em um determinado produto, aindapassível de sofrer oxidação. Se tal transformação leva à formação de um excreta, útil eeconomicamente vantajoso, poderá ser utilizada industrialmente. A fermentação industrial é então aexploração racional da atividade metabólica do microrganismo.

Considerações gerais sobre os processos fermentativosAs fabricações de vinho, cerveja, pão e queijo são utilizadas pela humanidade desde antes da eracristã. O conhecimento sobre os microrganismos, sua nutrição e reprodução é, entretanto,relativamente recente. A utilização desses conhecimentos científicos permite então uma escolhamais adequada de nutrientes, condições e até de microrganismos mais aptos a produzir uma dadasubstância de interesse industrial de forma econômica.

Certas substâncias molecularmente complexas como, por exemplo, enzimas, antibióticos evitaminas, cuja obtenção por síntese química é bastante onerosa, e às vezes até impossível, sãoobtidas de forma economicamente viável, através de processos fermentativos.

A indústria de fermentação encontra-se hoje em dia em expansão e os processosfermentativos apresentam-se, algumas vezes, com possibilidade de desenvolvimento, tanto do pontode vista do microrganismo (agente de fermentação) - objeto de estudo da microbiologia ebioquímica, como também do ponto de vista do processo em si - objeto de estudo da engenhariabioquímica.

Classificação da fermentação Os processos fermentativos são classificados de diversas maneiras: quanto ao tipo de processo;quanto à cinética, etc. Entretanto, do ponto de vista estritamente bioquímico pode-se classificá-losapenas como:• Anaeróbicos : onde o aceptor de prótons (H+) e elétrons (e-) liberados nas reações de oxi-redução

que ocorrem intracelularmente é um metabólito (substância orgânica).Exemplos: fermentação alcoólica, fermentação láctica.

• Aeróbicos : onde o aceptor de prótons (H+) e elétrons (e-) é o O2 molecular.Exemplos: fermentação acética, fermentação cítrica.

Fermentação Alcoólica

1. Importância A fermentação alcoólica é importante não só na fabricação de bebidas como vinho, cerveja,cachaça, etc., mas também para fabricação do álcool industrial. O etanol tornou-se, com a crise dopetróleo da década de 70, uma opção como combustível. Além disso, é possível antever suautilização para formação de etileno e butadieno, matérias primas para a indústria de plásticos.Compreende-se, então, o enorme interesse que desperta a melhoria do processo, dos agentes defermentação utilizados e das condições de retificação do álcool obtido.

2. Matéria PrimaAs matérias primas utilizadas na indústria de fermentação alcoólica são originadas direta ouindiretamente da agricultura, ou seja, de recursos renováveis. A escolha da matéria prima e outros


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aditivos para o mosto (meio de cultura que se destina à operação industrial de transformação de umasubstância em excreta útil) é ponto de fundamental importância para a indústria da fermentação. Amatéria prima deve conter substrato utilizável pelo microrganismo, ser de fácil obtenção eestocagem. As matérias primas para a produção de álcool podem ser:• Sacaríneas: possuem como substrato açúcares solúveis (mono e dissacarídeos), por exemplo:

− Melaço - (resíduo da cristalização do açúcar) principal substrato: sacarose− Caldo de cana - principal substrato: sacarose. O caldo de cana é utilizado devido à

importância econômica do etanol.− Suco de frutas - substratos: sacarose, glicose e frutose.As matérias primas sacaríneas podem ser diretamente consumidas pelo agente de fermentação(geralmente leveduras do gêneroSaccharomyces ); as leveduras são capazes de assimilar tantoglicose como frutose e outros monossacarídeos; a sacarose é assimilada sofrendo uma préviahidrólise pela enzima invertase , existente nesses microrganismos.

• Amiláceas: substrato fermentável é o amido. Altos teores de amido são encontrados em raízes(batata e mandioca) e grãos (trigo, milho, cevada e centeio).

As leveduras utilizadas no processo de fabricação do álcool não possuem enzimas capazes dehidrolisar o amido. Uma das perspectivas, ainda em fase de pesquisa, é a introdução de genes quecodificam essas enzimas no genoma de leveduras (objeto de estudo da engenharia genética).O tratamento prévio que sofrem as matérias primas amiláceas é denominado de sacarificação doamido e consiste na transformação do amido em matéria prima fermentável. A sacarificação doamido pode ser feita de varias formas:− Por via química: consiste na hidrólise em presença de H2SO4 5% sob pressão de 2 atm, por

duas horas. Há conversão do amido em glicose, mas apresenta como inconveniente o altocusto e a corrosão que promove nos equipamentos; além disso, exige neutralização para quepossa ser utilizada e o sal resultante leva a um baixo rendimento na fermentação.

− Por via enzimática: utilizam as preparações amilolíticas presentes nos grãos (malte) ouenzimas extraídas de fungos e bactérias (amiloglicosidase s e amilases , respectivamente).

• Celulósicas: substrato é a celulose. Assim como para o amido, é necessária uma hidrólise préviada celulose para que os monossacarídeos e/ou oligossacarídeos liberados possam ser assimiladospelo microrganismo. Esta hidrólise pode ser feita: − Por via química: através de tratamento com H2SO4 a quente sob pressão. É um tratamento

drástico que envolve a hidrólise ácida do material lignocelulósico. Utilizado industrialmentena Alemanha e na Rússia; no Brasil os primeiros testes em escala piloto foram realizados nasinstalações da Fundação de Tecnologia Industrial (FTI) em Lorena/SP, na década de 1980.

− Por via enzimática: este tratamento requer um pré-tratamento da matéria prima para

aumentar a digestibilidade do substrato à enzima. Em que pesem os esforços realizados,ainda não é um processo industrial.

É importante ressaltar que a diversidade de bebidas alcoólicas existentes no mercadodecorre, inicialmente, do tipo da matéria prima utilizada (sacarínea ou amilácea) e, posteriormente,do tratamento a que é submetida à bebida (destilação, tempo de maturação, etc.).

3. Agentes de Fermentação Só no final do século XIX foi identificado o microrganismo responsável pela transformação doaçúcar em etanol. Em todos os casos as leveduras do gêneroSaccharomyces são as mais utilizadas,especificamente as da espécieS. carlsbergensis (para cerveja) eS. ellipsoideus (para vinho).Embora na fabricação, por exemplo, de vinho caseiro se utilize a flora mista presente na própriauva, procura-se no nível industrial usar linhagens puras e selecionadas. Os organismos normalmenteutilizados como agentes de fermentação são anaeróbicos facultativos.


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4. Características do Processo• Temperatura: 25-30oC ⇒ Como o processo é exotérmico, as dornas (equipamento onde ocorre

a fermentação) exigem sistemas de refrigeração.• pH: 4,5-5,0⇒ Como durante o processo há produção de CO2 com conseqüente queda do pH,

são necessárias correções.• Tensão de oxigênio⇒ Anaerobiose ou baixa aeração.

5. Fundamento Bioquímico O procedimento de fermentação ocorre em anaerobiose e do ponto de vista bioquímico, a produçãode etanol ocorre unicamente para que haja a re-oxidação do NADH formado na via glicolítica.

Se à levedura é dado como nutriente um glicídio, por exemplo, a sacarose, primeiro ocorreráa hidrólise da sacarose à glicose e frutose e posteriormente a absorção dos monossacarídeos. Se oglicídio for glicose, como é o caso da prática, ocorre logo a absorção. Os glicídios transportadosentram na via glicolítica.

2 ATP

Glicose→ → → → → → → → → → 2 ácidos pirúvico 2 NADH+H+

O NADH+H+ formado é re-oxidado:

Portanto: Glicose → 2 EtOH + 2 CO2 Isto é: 1 mol → 2 moles + 2 moles

Esta é a equação de Gay-Lussac, que permite o cálculo do rendimento da fermentação. Orendimento de um processo fermentativo pode ser definido como sendo a quantidade de produtoobtido em relação à quantidade de matéria prima introduzida na dorna, ou àquela consumida noprocesso (∆P/ ∆S ou∆P/S0).

Como parte do açúcar consumido resulta em produtos secundários, não é possível atingir orendimento Gay-Lussac ∆P/ ∆S de 0,511. Pasteur, no laboratório, em condições ideais, conseguiuatingir o máximo de 95-96% do rendimento teórico,∆P/ ∆S = 0,485; definindo o chamadorendimento Pasteur, valor muitas vezes tomado como referência para os cálculos de rendimentosindustriais. As operações industriais não são realizadas com os cuidados adotados por Pauster;portanto, o rendimento Pasteur de 100% também não é atingido.

De qualquer forma, o cálculo do rendimento é largamente utilizado pelas indústrias de

fermentação alcoólica, láctica, acética, acetonobutílica, cítrica, etc. Não é aplicável, entretanto, aosprodutos das fermentações biossintéticas como antibióticos e vitaminas, onde não se conhece comexatidão a proporção e os substratos utilizados diretamente para a síntese.

H3C COH

O

C O pi ruvat od esc arboxi l ase

OCCH3H

2 2

2 CO2 ál cool

d esi d rog enas e OH

H H

H CC

H H

2

ácido pirúvico aceta ldeído etano l2 NA DH+H+ 2 NAD+


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Outros parâmetros importantes são:• Eficiência do processo fermentativo - relação percentual entre o peso do produto realmente

obtido no processo fermentativo e o peso do produto previsto estequiometricamente (pesoteórico)

• Eficiência da instalação industrial - relação percentual entre o peso do produto obtido após asfases de fermentação, recuperação e purificação e o peso teórico do produto previstoestequiometricamente.

• Produtividade - quantidade de produto formado por unidade de tempo e de volume de meio (gde produto/L. h)

Industrialmente a concentração de glicídios presentes é avaliada utilizando oDensímetro deBrix, em cuja escala 0o corresponde à água pura e 100o corresponde a uma solução de sacarose de100 g/100 mL. Os valores obtidos são dados em peso de sólidos em suspensão por 100 mL devolume. Já o álcool formado é avaliado por meio doAlcoômetro de Gay-Lussac em que 0o corresponde à água pura e 100o corresponde ao etanol anidro. Os valores obtidos são dados emvolume de álcool por volume de meio.

Após a fermentação as células são separadas do mosto por decantação, centrifugação, etc. ereutilizadas em um novo processo fermentativo, por um dado número de vezes.

6. Destilação A destilação é uma operação industrial que permite a separação de componentes de uma mistura poruma sucessão de vaporizações e condensações; o composto mais volátil se concentra no vapor.

Tratando-se de indústria de bebida alcoólica, esta operação poderá existir ou não,dependendo do tipo de bebida que se deseja fabricar. Bebidas como vinho e cerveja são chamadosbebidas fermentadas e não sofrem destilação, apresentando um teor alcoólico mais baixo que aschamadas bebidas destiladas (entre 3-5% para cervejas e cerca de 9-12% para vinhos). As bebidasdestiladas como, por exemplo: cachaça, rum, uísque, gim, são obtidas por destilação do mosto apósa fermentação. A destilação é diferente para cada caso, mas, em geral, é lenta para evitar que hajaarraste de produtos secundários que altere o sabor e cheiro da bebida. A concentração de etanolnestas bebidas é mais elevada e está situada para cachaça entre 45 e 50%.

No caso de fabricação do álcool industrial, esta operação de destilação é importante e muitocomplexa. A separação da mistura Et-OH: H2O é realizada em colunas, com refluxo, e a operaçãorecebe então o nome deretificação. A coluna é alimentada com o “vinho” (nome genérico do mosto já fermentado) a ser fracionado e o fracionamento vai depender de uma série de fatores, entre eles, aaltura da coluna - um aumento do tamanho facilita a separação. No entanto, o etanol e a águaformam um azeótropo de mínimo (uma mistura que apresenta uma composição de 95% de etanol e5% de água com um ponto de ebulição próprio) e, caso se disponha de uma boa coluna deretificação, esta será a composição do destilado obtido. O enriquecimento em etanol desta misturarequer outro tipo de tratamento em etapa posterior. O resíduo obtido após a destilação é denominadovinhoto (ou vinhaça).

Referências:

Manual de Cursos Práticos em Bioquímica.Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ.Fundamentos de Bioquímica Experimental.José Raul Cisternas, José Varga, Osmar Monte. 2ª ed., Editora Atheneu, São Paulo, 2001.

LEHNINGER - Principles of BiochemistryDavid L. Nelson, Michael M. Cox. Fifth Edition. W. H. Freeman and Company, New York, 2008.


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Roteiro de Prática:Fermentação Alcoólica

1. MATERIAL

− Mosto utilizado: meio YED (1,4% de extrato de levedo; 14% de glicose)

−

Agente fermentativo: Fermento Fleischmann - suspensão a 67% (p.u./v)− Solução de glicose padrão: 10µmol/mL− Ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS) em solução alcalina− Fluoreto de sódio (NaF) 0,05 M− Banho termostatado− Espectrofotômetro− Balança− Destilador− Centrífuga− Banho de gelo

2. OBJETIVO• Calcular a eficiência de uma fermentação de glicose por células deS. cerevisiae através da

medida da produção de etanol e de CO2 e do consumo de glicose.• Verificar o poder de inibição do NaF (inibidor da enolase) no processo fermentativo.

3. PROCEDIMENTO

3.1. Produção de etanol, produção de CO2 e consumo de glicose.a) Em um erlenmeyer de 250 mL preparar 100 mL de meio YED 10%, contendo 20% (p.u./v) de

células (10 mL meio YED + 90 mL de H2O + 20 g de fermento).Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar uma alíquota de 3,0 mL para tubo de centrífuga.Pesar rapidamente o frasco.

b) Centrifugar a alíquota previamente retirada e transferir o sobrenadante para outro tubo.Centrifugar novamente o sobrenadante, transferir para o tubo de ensaio e conservá-lo em banhode gelo. Enquanto isto, o mosto inoculado é deixado em banho à 28ºC, sendo agitadovigorosamente a intervalos de 10 minutos.

c) Após 1 hora de fermentação, agitar bem e pesar o frasco para calcular a quantidade de CO2 desprendido.

d) Centrifugar cerca de 50 mL do meio fermentado e caso o sobrenadante permaneça turvo,centrifugar novamente.

e) Pegar 10 mL do sobrenadante e colocar no compartimento para amostra do destilador, adicionarem seguida 10 mL de H2O e 0,5 mL de NaOH 0,1 N (o hidróxido de sódio é colocado para evitara destilação de alcoóis superiores). Fechar o sistema e recolher os 8 mL iniciais do destilado queconterão todo o etanol presente na amostra. Completar este volume a 10 mL com exatidão.

f) Determinar no destilado o teor de etanol pelo método do dicromato.g) Diluir uma alíquota dos sobrenadantes (tempo inicial e tempo final de fermentação) e determinar

a quantidade de glicose consumida pelo método do DNS.Sugestão para as diluições: tempo inicial: diluição de 10 a 100 vezes

tempofinal: sem diluição ou diluição de 10 vezesh) Calcular o rendimento e a eficiência da fermentação a partir da quantidade de CO2 produzido em

relação à quantidade de glicose consumida.i) Efetuar os mesmos cálculos do item anterior (3.1h), a partir da quantidade de etanol produzido.


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3.2. Inibição da fermentação por fluoreto de sódio (NaF)a) Em um erlenmeyer de 250 mL preparar 100 mL de meio YED 10%, contendo 20% (p.u./v) de

células e 0,05M de NaF (10 mL meio YED + 85 mL de H2O + 20 g de fermento + 5 mL desolução NaF 1 M).

Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar uma alíquota de 3 mL para tubo de centrífuga.Pesar rapidamente o frasco.b) Seguir o mesmo procedimento da etapa anterior a partir do item 3.1b.c) Calcular o grau de inibição provocado pelo fluoreto de sódio após 1 hora de fermentação.d) Interpretar os resultados obtidos.

3.3. Montar uma tabela que contenha todos os resultados obtidos.


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Determinação de Açúcares Redutores pelo Método do 3,5-Dinitro Salicilato(DNS)

1. REAGENTES

− Solução padrão de glicose (10µmol/mL)− Amostras retiradas no tempo inicial e no tempo final de fermentação− Ácido 3,5 dinitrosalicílico em solução alcalina (DNS)− Banho termostatado a 100oC− Espectrofotômetro

2. PROCEDIMENTO

A. Construção da curva padrão de glicídios redutoresSensibilidade do método químico: 1-20µmoles de glicose

1. Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de glicose (10µmol/mL)

Tubo Sol. Glicose(mL)

H2O dest.(mL)

Reagente DNS(mL)

Absorbância(540 nm)

Concentração( )

B 0 1 11 0,2 0,8 12 0,4 0,6 13 0,6 0,4 14 0,8 0,2 15 1 - 1

2. Após a adição dos reagentes, agitar e aquecer a 100oC por 5 minutos, resfriar e adicionar 13 mLde água destilada.

3. Usando o tubo B como “branco de reação”, determinar as absorbâncias a 540 nm.4. Lançar em gráfico as leituras de absorbância x concentração de glicídios e determinar o

coeficiente angular e o fator da reta obtida.5. Verificar quais os limites de sensibilidade do método para a aparelhagem utilizada.

B. Determinação da concentração de glicose nas amostras da fermentaçãoUtilizando a curva padrão obtida, os mesmos reagentes e o mesmo espectrofotômetro, determinara concentração de glicose nas alíquotas dos sobrenadantes dos tempos inicial e final defermentação.

TuboH2O

destilada(mL)

Diluiçãoda

amostra

Amostra(mL)

ReagenteDNS(mL)

Absorbância(540 nm)

Concentração( )

Branco 1 - - 1

Tempo inicial - 1 1Tempo final - 1 1


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Determinação do Álcool pelo Método do Dicromato

1. REAGENTES

− Solução padrão de dicromato de potássio: 33,816 g de K2Cr2O7 dissolvidos em água ecompletados a 1 litro− H2SO4 concentrado− H3PO4 a 85%− Indicador: 0,5 g de sal de bário do ácido 4-difenilamina-sulfônico dissolvido em 100 mL de H2O.

Utilizar o sobrenadante.− Solução de sulfato ferroso amoniacal: 135,1 g de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, 20 mL de H2SO4

concentrado são dissolvidos em água e completados à 1 litro.

2. PROCEDIMENTO

a) 10 mL da solução de dicromato são colocadas em 3 frascos cônicos, adicionando-se, emseguida, 5 mL de H2SO4 concentrado, resfriando-se em água de bica corrente.

b) Colocar em cada frasco 5,0; 2,5 e 1,0 mL do destilado, respectivamente, e completar o volume a5,0 mL com água, quando for o caso.Para o destilado do frasco contendo fluoreto de sódio basta fazer a alíquota de 5 ml.

c) Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 minutos para o etanol ser quantitativamente levado aácido acético.

d) Após os 15 minutos, adicionar 165 mL de água destilada, 18 mL de ácido fosfórico e 0,5 mL dasolução do indicador.

e) Titular com sulfato ferroso amoniacal até a cor da solução mudar de púrpura para verde e anotaro volume consumido (n).

f) Para o ensaio em branco adicionar 5,0 mL de água destilada em lugar da amostra e repetir oprocedimento. Anotar o volume consumido (N).

3. REAÇÃO

2 Cr2O7 -2 + 12 Fe2+ + 14 H+ → 4 Cr3+ + 12 Fe3+ + 14 H2O

2 Cr2O7 -2 + 3 C2H5OH + 16 H+ → 4 Cr3+ + 3 C2H4O2 + 11 H2O

4. EXPRESSÕES PARA O CÁLCULO DO CONTEÚDO DE ETANOL

A = 2 (1- n/N) quando se usa 5,0 mL do destilado



A = concentração de etanol na amostra original (%)

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