3macculturaviral_alunos

Quirina Santos-CostaURIA-CPM, FFUL

Parte III:

1.CULTURA DE CLULAS

a)Objectivo

b)Tipo de Culturas Celularesc)Passagem das Clulas

2.COLECO DE CLULAS

a)ECACC

b)ATCC

c)NIH

3.MEIOS DE CULTURA

4.Como escolher um meio

5.Constituintes bsicos do meio de cultura

6.DESCONGELAO: COMO INICIAR UMA CULTURA

7.TRIPSINIZAO

8.CONTAGEM DE CLULAS

CULTURA DE CLULAS

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Objectivo: Isolamento viral a partir de material biolgico adequadoPropagao in vitro de vrus j isolados

Condies:

CULTURA DE CLULAS

EsterilidadeFrascos de cultura em plstico ou vidro tratadosMeios de cultura*Estufa de CO2Microscpio invertidoHote de fluxo laminar vertical

*Meios de cultura: satisfao das exigncias nutricionais das clulas

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TIPOS DE CULTURAS CELULARES

Modo de propagao: 1. Suspenso2. Monocamada

Natureza das clulas:1. Primrias2. Secundrias3. Contnuas

Morfologia das clulas:1. Epiteliais2. Fibroblsticas3. Outras (clulas sanguneas, nervosas, musculares)

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Modo de propagao:

1. Suspenso: as clulas crescem sem estarem aderentes entre si ou ao suporte slido (paredes interiores do frasco de cultura ou outro recipiente onde estejam a ser cultivadas)

2. Monocamada: crescem aderindo ao suporte slido e entre si. Estas clulas necessitam, para serem transferidas para outro suporte slido, de serem dissociadas entre si e do suporte slido onde se fixaram (mtodos enzimticos e/fsicos).

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Natureza das clulas

Clulas primrias: resultam directamente de um rgo ou tecido animal;tm uma vida limitada.

Clulas secundrias: Derivam de subculturas das clulas primrias;Podem atingir as 50 passagens ou subculturas.

Clulas contnuas: Derivam de tecidos cancerosos ou de clulas primrias e secundrias que sofreram transformao;Tm a capacidade de se multiplicarem ilimitadamente, sem inibio de contacto e com grande rapidez.


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Modo de propagao: 1. Suspenso2. Monocamada

Natureza das clulas:1. Primrias2. Secundrias3. Contnuas

Morfologia das clulas:1. Epiteliais2. Fibroblsticas3. Outras (clulas sanguneas, nervosas, musculares)

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COLECO DE CLULAS

Ser possvel introduzir, propagar, consolidar e disseminar erros durante a manipulao numa linha celular?

Sim, repare-se que, muitos contaminantes so invisveis ao olho nu (micoplasma ou vrus que no induzem efeito citoptico), ou seja existem contaminaes inaparentes!

Sistematizam as tcnicas de culturaCrioconservao em Azoto LquidoTcnicos permanentes e especializadosControlo de Qualidade para contaminaes microbianas, nomeadamente o MicoplasmaGarantem a identidade e a pureza da linha celularRecomendaes

caractersticas a linha celularcomo manter a linha celularcomo lidar com dificuldadesqual o meio de cultura apropriadoqual o material necessrioquais as condies de incubao, etc.formulrios de encomendaquem pode depositarcomo pode depositaretc.

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AS MEGASTORESEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), HLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, UK. Telephone (44) 980610391; fax (44) 980 611315.

Description of holdings: 1200 cell lines and hybridomas, 250 HLA-defined cell lines, and approximately 7000 human genetic and chromosome abnormality cell lines (2000 stored as untransformed lymphocytes).

American Type Culture Collection (A TCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. Telephone (301) 991 2600; fax (301) 231 5826.

The A TCC has a large and comprehensive stock of material built up over a considerable period of time. A certain number of deposits carry 'certified cell line' status and extensive testing programmes have been carried out on this material. The whole of the collection comprises over 3200 cell lines and hybridomas from approximately 75 different species.

National Institute of Health (NIH)About us.

The NIH AIDS Reagent Program evolved from a small bank of HIV research materials into a unique worldwide resource of state-of-the art reagents for HIV and other pathogens. Many of these reagents are not commercially available. The first Catalog, published in 1988, listed 62 reagents from 20 contributors. Reagents are shipped to scientists all over the world. The value of the NIH AIDS Reagent Program is evident from the diversity of registered users; as of June 2003, scientists from the US and 65 foreign countries registered to receive reagents. During the past year over 14,000 reagents were provided. US scientists obtaining AIDS reagents from the program work primarily in academ-ic settings.

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http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/common/catalog/cellBiology/cellBiologyIndex.cfmhttp://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/http://www.ecacc.org.uk/


COLECO DE CLULAS DE CULTURA CELULAR

EPITELIAL: 293T

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EPITELIAL/FIBROBLSTICA: GHOST (derivadas das Hos=osteosarcoma humano)

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FIBROBLSTICA:Vero; Fibroblastos de Salmo, MRC-5


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LINFOCTICA:Linfcitos humanos mortos


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SUSPENSO: J774

LINFOBLASTIDE PROMONOCTICA: U937


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MEIOS DE CULTURA

De um modo geral as clulas requerem um ambiente estril, componentes nutricionais, pH e temperatura estveis.Hoje em dia j existem vrias formulaes de meios de cultura disponveis, de acordo com o tipo de cultura com que se est a trabalhar.

Exemplos: BME (basal medium Eagles) EMEM (minimum essencial medium with Earls salts) DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium, meio sinttico complexo) RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio sinttico complexo) CMRL (basal mdium designed for serum-free formulations) D-22 (basal medium for insect cell culture)

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COMO ESCOLHER UM MEIO?

a. Tipo de clulasi. Aderentes (Vero)ii. Suspenso (Ly Humanos)iii. Tipo de densidade celular (baixa, para clonagens: 293T, meio com HEPES)(elevada: bio-reactores com densidades na ordem do s108clulas/mL)

b. Sistemas estticosSo os sistemas clssicos de cultura em frasco deitado ou na vertical, em laboratrio de baixa ou mdia produtividade.

c. Sistemas dinmicos ou perfuso contnua (sistema aberto)O meio ter que ter partida todos os nutrientes necessrios para a durao da cultura, nomeadamente em termos de fontes de energia, mas tendo em conta que a degradao destes aumenta os nveis de toxicidade. Portanto podem ser introduzidos controladamente no meio.II

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http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Europe_Home/Portugal.htmlhttp://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.aidsreagent.org/http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=1


CONSTITUINTES BSICOS DO MEIO?

a. gua

b. Sais inorgnicos (oligoelementos) Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3- Mantm o potencial de membrana So co-factores nas reaces ezimticas intracelulares Factores de adeso (tripsinizao)

c. sistemas tampo O meio de cultura necessita de sistemas tampo para compensar a evoluo do CO2, libertado pelas clulas e da produo de cido lctico, resultante do metabolismo da glucose.

Explos (no txicos, com pKa=6,1): Bicarbonato Fosfato

A conjugao da concentrao de bicarbonato e a tenso de CO2 promove a osmolaridade e pH correctos.

d. hidratos de carbono Glucose Maltose Sacarose Frutose Galactose

A glucose o hidrato de carbono mais usado como fonte de energia do meio.

e. Indicadores de pH Vermelho de fenol (2mg/L)

Qualquer que seja o meio requer a presena de um indicador de pH, que nos chamar mais facilmente ateno para as alteraes que possam ocorrer devidas ao metabolismo das clulas.

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f. vitaminas cido para-amino benzico Biotina cido flico cido nicotnico Riboflavina Tiamina Inositol Vit. B12 Vit. E Vit. A

So intervenientes em numerosos processos metablicos.

g. Aminocidos essenciais Arginina Cistena Prolina L-Glutamina, etc.

h. lpidos (cidos gordos) Colesterol cido linolnico e linoleico cido palmtico, etc.

um dos componentes fornecido pelo soro.

CONSTITUINTES BSICOS DO MEIO?

i. SUPLEMENTOSi. Hormonasii. Soroiii. P r o t e n a s e pptidos para meios sem s o r o ( a l f a - g l o b u l i n a , fibronectina, albumina e transferrina)iv. A n t i b i t i c o s e Antifngicos Gentamicina (50ug/mL) Penicilina (100UI)/mL / Estreptomicina (50ug/mL) A n f o t e r i c i n a B (fungisona)

Mantm a esterilidade do meio, mas numa escala industrial esto ausentes.No podem ser citotxicosTm que ser de largo espectro, e induzir o mnimo de resistnciasAteno relao custo/benefcio.

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MEIOS COM SORO, PORQU?

Em 1950 o primeiro meio com soro teve um sucesso imenso, porque este aditivo fornecia elementos essenciais, mas desconhecidos, ao meio, e de uma forma emprica:

Factores de Crescimento (estimulam e aceleram o crescimento e diferenciao celular; previnem os processos de Apoptose)

o EGF, IL-6, PDGF, Insulina Albumina

o liga-se aos ies txicos, funcionando como agente desintoxicante;o um carrier de Vit. lipossolveis e esterideso um factores de proteco contra os choques fsicos das pipetagens, etc.

Factores de Adeso celularo Fibronectinao Lamininao Fetuna

Transportador do io Fe+++. O complexo Transf/Fe+++ fundamental nos receptores celulares.

o Transferrina Antiproteases (previne a degradao proteoltica das clulas e do prprio meio)

o Alfa1-antitripsina (tripsinizao) Alfa2-macroglobulina

TIPOS DE SOROFCS (soro bovino fetal)NCS (soro de recm-nascido de vitela), com altos teores de biotina.Vrias espcies animais e de animais de diferentes idades.Os soros de animais adultos no so to eficientes, porque no so to ricos.So obtidos no matadouro, por puno cardaca assptica, ou por animais dadores.

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MEIOS SEM SORO

Sempre que possvel seria desejvel que no se usasse soro nos meios de cultura:

um componente emprico e com elementos no quantificados (albumina); No pode ser usado no fabrico de produtos bio-farmacuticos; No pode ser usado em tcnicas que requerem um meio sinttico de composio bem definida e conhecida, nomadamente em estudos de factores de crescimento, citocinas, molculas de adeso, etc.; Pode transportar vrus ou factores de inibio.

O meio sem soro: reprodutvel; No tem factores desconhecidos.

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TCNICA DE DESCONGELAO:COMO INICIAR UMA CULTURA

Processo rpidoLibertar do DMSO que txico. Lanar as clulas em cultura (Controlo de qualidade do processo de CONGELAO: Descongelar uma ampola criopreservada com 24h, para que se veja se a congelao foi eficiente e se as clulas tm boa viabilidade).

I. A partir de Frascos de Cultura, transportados T. A.

O frasco de Cultura vem com o volume completo at ao mximo, de modo a evitar entradas de ar o contaminaes. Assim que chega ao laboratrio, as clulas devem ser passadas de imediato, para evitar o prolongamento do sofrimento de ausncia de temperatura ideal e % de CO2.

1. Transferir a suspenso ou fazer uma desagregao por enzimtica (tripsinizao), qumica (EDTA) ou mecnica (cell-scrapper) para tubo(s) estril de 50mL 2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4C3. Rejeitar o sobrenadante por decantao.4. Ressuspender as clulas na quantidade de volume de Meio de Cultura adequado. 5. Transferir para frasco de cultura de cultura adequado6. Examinar ao MO invertido

Incubar em estufa 37C, 5%CO2.

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TCNICA DE DESCONGELAO:COMO INICIAR UMA CULTURA

II. A partir de Criotubos, transportados em Gelo Seco (-20-30C)

Material:

Material tcnico protector (luvas, bata, protector dos sapatos, culos ou viseira)Cmara de fluxo estabilizadaEstufa CO2Banho a 37C Frasco de cultura T25 identificado com: Nome do tcnico; data; n de passagem tipo de culturaMarcadorFalcon50mLPipetas graduadasPipetador automticoSuporte com gelo1 Criotubo com clulas J774 Suspenso40mL Meio RPMI 1640 N, pr-aquecido1 Criotubo com clulas aderentes40mL Meio DMEM N, pr-aquecidoCentruga JOUANlcool 70

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PASSAGEM DE CLULAS

Passagem das clulas ou subcultura:

Consiste na d issoc iao, por aco enzimtica (tripsina) ou fsica (raspadores), de uma cultura celular e utilizao das clulas da resultantes para estabelecer uma nova cultura.

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TRIPSINIZAO

Objectivo: Libertar as clulas do suporte slido (parede do frasco de

cultura) e dissociar as clulas entre si.

Material:frascos de culturaTripsina-EDTAPBS sem Ca2+ nem Mg2+

Meio Dulbeccos DMEM completo:1mM L-Glutamina1mM piruvato de sdio1mM A.A. no essenciais10% (v/v) soro bovino fetal2,5 g/ml fungizona50 g/ml gentamicina

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TRIPSINIZAO

Tcnica adaptada aula prtica de Virologia:

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CONTAGEM DE CLULAS EM

HEMATMETRO DE NEUBAUER

1 2

3 4

N/4 * 105 clulas / ml

1m

1m

Altura= 0,1 mmrea= 1mm*1mm=1mm2

Volume= 0,1mm3

N (1+2+3+4) 0,1 L 4

X 1000 L

Diluio com Azul de Tripan 1/10 (90 L + 10 L)

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BIBLIOGRAFIA

http://www.aidsreagent.org/

http://www.atcc.org/

http://www.cdc.gov/

http://www.ecacc.org.uk/

http://www.invitrogen.com/

http://www.nuncbrand.com/

http://www.sigmaaldrich.com/II MAC

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