PUCRS FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA

Estudo do compartilhamento de antígenos entre Angiostrongylus

spp. e outros helmintos.

Bianca Barbieri Cognato

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL Av. Ipiranga 6681 - Caixa Postal 1429

Fone: (051) 320-3500 - Fax: (051) 339-1564 CEP 90619-900 Porto Alegre - RS

Brasil

2013

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA

Estudo do compartilhamento de antígenos entre Angiostrongylus spp. e outros

helmintos.

Bianca Barbieri Cognato

Orientador: Dr. Carlos Graeff-Teixeira

Co-Orientadora: Dra. Alessandra L. Morassutti

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

PORTO ALEGRE- RS- BRASIL

2013

I

SUMÁRIO

Relação de figuras ..................................................................................................... III

Relação de tabelas..................................................................................................... VI

Agradecimentos ........................................................................................................ VII

Resumo .................................................................................................................... VIII

Abstract ...................................................................................................................... IX

1.INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 10

1.1 Parasitos ........................................................................................................... 10

1.2 Angiostrongylus cantonensis ............................................................................. 10

1.2.1 Ciclo de vida ................................................................................................... 12

1.2.2 Distribuição .................................................................................................... 13

1.2.3 Diagnóstico .................................................................................................... 15

1.3 Angiostrongylus costaricensis ........................................................................... 16

1.3.1 Ciclo de vida ................................................................................................... 17

1.3.2 Distribuição .................................................................................................... 18

1.3.3 Diagnóstico .................................................................................................... 19

1.4 Reatividade Cruzada ......................................................................................... 20

1.5 Reatividade cruzada e helmintos ....................................................................... 21

1.6 Reatividade cruzada e alergenos ...................................................................... 24

2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 26

3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 27

3.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 27

3.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 27

4. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 28

4.1 Locais de execução ........................................................................................... 28

4.2 Obtenção dos ovos de Strongyloides spp. ......................................................... 28

4.3 Manutenção in vitro para obtenção de L3 (larvas de terceiro estágio) de

Strongyloides spp. ................................................................................................... 28

4.4 Obtenção de vermes adultos de Strongyloides spp. .......................................... 28

4.5 Amostras de soro de pacientes com Angiostrongilíase ...................................... 29

4.6 Obtenção de antígenos de Strongyloides spp., Ascaris lumbricoides, Fasciola

hepatica, Toxocara canis e Hymenolepis nana ....................................................... 29

4.7 Obtenção de antígenos dos possíveis alergenos .............................................. 29

4.8 Eletroforese Unidimensional e Bidimensional .................................................... 30

II

4.9 Western Blot ...................................................................................................... 30

4.10 Medição das bandas ....................................................................................... 31

4.11 Espectrometria de massas e identificação de proteínas .................................. 31

4.12 Questões Éticas .............................................................................................. 33

5. RESULTADOS ....................................................................................................... 34

5.1 Obtenção dos ovos de Strongyloides spp. ......................................................... 34

5.2 Manutenção in vitro para obtenção de L3 (larvas de terceiro estágio) de

Strongyloides spp. ................................................................................................... 36

5.3 Obtenção de vermes adultos de Strongyloides spp. .......................................... 36

5.4 Obtenção de antígenos ..................................................................................... 37

5.5 Eletroforese Bidimensional ................................................................................ 38

5.6 Eletroforese Unidimensional .............................................................................. 39

5.7 Western Blot ...................................................................................................... 39

5.8 Espectrometria de massas e identificação de proteínas .................................... 48

5.9 Reconhecimento de HSPs ................................................................................ 52

6. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 54

REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 60

APÊNDICE 1 .............................................................................................................. 69

III

Relação de figuras

Figura 1 – Verme de Angiostrongylus cantonensis. Em “A” verme fêmea mostrando o intestino e tubo reprodutor espiralado. Em “B” verme macho, mostrando em detalhe o espículo.........................................................................................................................11 Figura 2 – Ciclo de vida de Angiostrongylus cantonensis. ...........................................13 Figura 3 – Distribuição mundial de Angiostrongylus cantonensis. ...............................14 Figura 4 – Distribuição de Angiostrongylus cantonensis no Brasil. Pontos verdes destacando casos de doença humana. Pontos rosa destacando hospedeiros intermediários ou roedores contendo o parasito. .........................................................14 Figura 5 – Vermes de Angiostrongylus costaricensis visualizados nas artérias mesentéricas de roedor infectado experimentalmente com o nematódeo. ..................16 Figura 6 – Ciclo de vida de Angiostrongylus costaricensis. .........................................18 Figura 7 – Distribuição mundial de Angiostrongylus costaricensis. ..............................19 Figura 8 – Esquema de reatividade cruzada, quando um determinado antígeno não específico se liga a um anticorpo. ................................................................................20 Figura 9 – Ovo de Hymenolepis diminuta encontrado nas fezes de ratazana naturalmente infectada. ................................................................................................34 Figura 10 – Ovo de Strongyloides spp. encontrado nas fezes de ratazana naturalmente infectada. ......................................................................................................................35 Figura 11 – Verme de Hymenolepis diminuta encontrado no intestino delgado de ratazana naturalmente infectada. .................................................................................35 Figura 12 – Ovos de Syphacia spp. encontrados nas fezes de ratazana naturalmente infectada. ......................................................................................................................35 Figura 13 – Verme de Nippostrongylus brasiliensis encontrado no intestino de ratazana naturalmente infectada. ................................................................................................36 Figura 14 – Diferentes larvas obtidas através do processo de Sedimentação espontânea.Em detalhe, no centro da foto A, uma larva de Angiostrongylus cantonensis. .................................................................................................................37 Figura 15 – Gel Bidimensional de Angiostrongylus cantonensis utilizando 90µg de proteínas. ......................................................................................................................38 Figura 16 – Gel Bidimensional de Fasciola hepatica utilizando 90µg de proteínas. .......................................................................................................................................38 Figura 17 – Gel unidimensional, utilizando 5µg de antígeno de cada parasito. 1 – Fasciola hepatica; 2 – Ascaris lumbricoides; 3 – Hymenolepis diminuta; 4 –

Toxocara canis. ..............................................................................................................39

Figura 18 – Western Blot mostrando a reatividade cruzada entre todos os grupos de parasitos reagindo contra soro positivo para angiostrongilíase, com as respectivas

IV

concentrações 0,5µg e 1µg. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis. .......................................................................................................................................40 Figura 19 – Gel unidimensional de poliacrilamida mostrando as bandas compartilhadas com o soro positivo para Angiostrongilíases, que foram recortadas e submetidas a espectrometria de massas. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis. .........................................................................................................................................40

Figura 20 – Western Blot mostrando a reatividade cruzada utilizando antígenos dos possíveis alergenos contra soro positivo para Angiostrongilíases. A – antígeno de amendoim; B – antígeno de morango; C – antígeno de tomate; D – antígeno de pólen. .......................................................................................................................................41 Figura 21 - Gel unidimensional mostrando as bandas compartilhadas pelo soro de Angiostrongilíases que foram recortadas e submetidas a espectrometria de massas. A – antígeno de amendoim; B – antígeno de morango; C – antígeno de tomate; D –

antígeno de pólen............................................................................................................41

Figura 22 – Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Toxocara canis reagindo

contra soro positivo para Angiostrongilíase. ..................................................................42

Figura 23 – Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Angiostrongylus cantonensis

reagindo contra soro positivo para Angiostrongilíase. ...................................................43

Figura 24 – Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Ascaris lumbricoides reagindo

contra soro positivo para Angiostrongilíase....................................................................43

Figura 25 – Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Fasciola hepatica reagindo

contra soro positivo para Angiostrongilíases. ................................................................44

Figura 26 – Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Hymenolepis diminuta

reagindo contra soro posivito para Angiostrongilíases. ................................................44

Figura 27 – Western Blot utilizando 5µg antígeno dos diferentes alergenos contra soro negativo para Angiostrongilíases. A – antígeno de amendoim; B – antígeno de morango; C – antígeno de tomate; D – antígeno de pólen. .........................................................................................................................................45

Figura 28 – Western Blot utilizando 5µg antígeno dos diferentes alergenos contra soro positivo para Angiostrongilíases. A – antígeno de amendoim; B – antígeno de morango; C – antígeno de tomate; D – antígeno de pólen. .........................................................................................................................................45

Figura 29 – Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra soro positivo para Angiostrongilíases. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis. .........................................................................................................................................46

Figura 30 – Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra soro positivo para Angiostrongilíases. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis. .........................................................................................................................................46

V

Figura 31 – Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra soro negativo para Angiostrongilíases. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis. .........................................................................................................................................47

Figura 32 – Western Blot utilizando 50µg de antígeno de amendoim contra 15

diferentes soros positivos para Angiostrongilíases.........................................................47

Figura 33 – Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos os parasitos contra anti-HSP70. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.......................................52 Figura 34 – Western Blot utilizando 10µg de antígeno de todos parasitos contra anti - HSP70. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris

lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis. .....................................53

VI

Relação de tabelas

Tabela 1 - Quantidade de proteína encontrada em cada extrato bruto dos parasitos. .......................................................................................................................................37 Tabela 2 - Resumo das bandas reconhecidas pelos parasitos e alergeno amendoim quando em contato com soro positivo para Angiostrongilíases....................................42 Tabela 3 - Identificação de proteínas que foram recortadas dos géis de eletroforese unidimensional, submetidas à digestão por tripsina e analisadas por espectrometria de massas. ........................................................................................................................49 Tabela 4 - Distância percorrida pela banda no gel de poliacrilamida a partir do ponto de partida de migração do gel, correspondente ao reconhecimento destas bandas no Western Blot pelo soro positivo para Angiostrongilíases. ............................................51

VII

Agradecimentos

Agradeço ao Prof. Dr. Carlos Graeff-Teixeira, por todo o conhecimento

transmitido, pela paciência, e por demonstrar tanto amor ao que faz.

Meu muito obrigado a todo o grupo de Parasitologia, pelos ensinamentos, pelas

discussões, mas principalmente pelas amizades que conquistei nesses anos. Com

certeza, mais do que colegas de trabalho, tenho grandes amigos.

Agradeço a Alessandra L. Morassutti, que sentou comigo e com tanto carinho

explicou praticamente tudo que aprendi ao longo dos dois anos de mestrado. Muito,

muito obrigada!

Minha linda e muito especial família, agradeço por terem sempre acreditado em

mim. Amo muito todos vocês!

A todos meus queridos amigos da Biologia e da vida. Obrigada pelo

companheirismo, pelas conversas, pela cumplicidade! Vocês são demais!

Agradeço meu namorado, Bruno meu lindo, principalmente pela paciência e por

me mostrar que as coisas não são tão complicadas quanto parecem, e que a força que

temos é sempre maior do que pensamos ter!

Muito obrigada a todos que fizeram parte dessa conquista!

VIII

Resumo

Duas espécies de parasitos nematódeos da família Angiostrongylidae, do gênero Angiostrongylus de localização intra-arterial são capazes de produzir doença em humanos: Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis. Ambas as espécies são parasitos próprios de roedores e a infecção humana é considerada acidental. No homem, A. cantonensis é o causador da meningite eosinofílica e A. costaricensis causador da angiostrongilíase abdominal. Como não há eliminação de formas parasitárias na infecção humana, o diagnóstico se torna difícil e métodos moleculares se tornam necessários. Depois de anos da descoberta das angiostrongilíases, ainda há muitos esforços no estudo e desenvolvimento de um teste de diagnóstico específico e sensível capaz de discriminar as Angiostrongilíases de outras parasitoses. Neste contexto, a reatividade cruzada se torna um problema na especificidade de testes sorológicos. O objetivo principal deste trabalho foi analisar o compartilhamento de antígenos entre Angiostrongylus spp. e os parasitos Strongyloides spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta e Toxocara canis, assim como identificar essas moléculas compartilhadas. Para obtenção de antígenos, algumas ratazanas foram capturas e suas fezes analisadas através do método de Baerman além de terem sido semeadas em Placas de Ágar. Foram obtidas larvas de Strongyloides spp. e Angiostrongylus spp. Nas artérias pulmonares de uma ratazana foram encontrados 11 vermes fêmeas e 2 vermes machos de A. cantonensis, que deu origem ao primeiro relato da ocorrência deste parasito no Rio Grande do Sul. No intestino delgado foi obtido um verme de Strongyloides spp e da análise do intestino delgado foram obtidos vermes de Hymenolepis diminuta. A partir dos vermes adultos dos parasitos, foram obtidos os antígenos utilizados neste trabalho. Além disso, foram utilizados antígenos de alergenos como o amendoim, tomate, pólen e morango. Para identificação dos antígenos compartilhados, as proteínas foram separadas por eletroforese uni e bidimensional ensaiadas pela técnica de Western-Blot utilizando-se soro de pacientes com angiostrongilíases. Todos os antígenos foram reconhecidos pelo soro de pacientes infectados com angiostrongilíases, sendo um total de quatorze bandas identificadas como imunogênicas. As quartorze bandas foram recortadas dos géis de poliacrilamida e analisadas por espectrometria de massas. As proteínas identificadas foram: Fosfoenolpiruvato carboxiquinase, Proteína de choque térmico 70 (HSP70), Proteína hipotética DAPPUDRAFT, 60 kDa Chaperonina 5, Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, Cadeia A sigma classe GST, Glucose-6-fosfato isomerase, Piruvato desidrogenase subunidade E1, Glutamato desidrogenase 2 , arachin Ahy-1, Full=Allergen Ara h 1, clone P41B , Gly1. Os dados gerados no presente trabalho demonstram que há compartilhamento de antígenos entre organismos de diferentes grupos taxonômicos, como também com os alergenos testados. Além disso, a descrição e a análise de componentes moleculares compartilhados podem ajudar na compreensão da história evolutiva e da filogenia destes organismos. Palavras-chave: Angiostrongylus cantonensis; Angiostrongylus costaricensis; reatividade cruzada;

IX

Abstract

Two species of parasites nematode of Angiostrongylidae family, genus Angiostrongylus intra-arterial localization are capable of human desease production: Angiostrongylus costaricensis and Angiostrongylus cantonensis. Both species are rodent’s parasites and the human infection is considered incidental. On humans, A. cantonensis cause eosinophilic meningitis and A. costaricensis cause abdominal angiostrongiliase. Since there is no elimination of parasitic forms in human infection, diagnosis becomes difficult and molecular methods are necessary. After years of discovery of angiostrongilíases, there are still many efforts in the study and development of a specific and sensitive diagnostic test capable of discriminating Angiostrongyliases of the other parasites. In this context, cross-reactivity becomes a problem in specificity of serologic tests. The main objective of this study was to analyze the sharing of antigens between Angiostrongylus spp. and parasites Strongyloides spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta and Toxocara canis, and identify these molecules shared. To obtain antigens, some rats were captures and their feces analyzed by the method of Baerman addition to being seeded Agar Plates. Were obtained larvae of Strongyloides spp. and Angiostrongylus spp. In pulmonary arteries were found 11 female worms and 2 male worms of A. cantonensis, which led to the first report of the occurrence of this parasite in Rio Grande do Sul. In the small intestine was obtained a Strongyloides spp worm and analysis of small intestine were obtained Hymenolepis diminuta worms. From the adult worms of parasites were obtained antigens used in this study. Furthermore, we used antigens of allergens such as peanut, tomato, strawberry and pollen. To identify shared antigens, proteins were separated by one and two dimensional electrophoresis technique assayed by Western blot using sera of patients with angiostrongyliases. All antigens were recognized by sera from patients infected with angiostrongyliases, being a total of fourteen bands identified as being immunogenic. The fourteen bands were cut out of polyacrylamide gels and analyzed by mass spectrometry. The proteins identified were: Phosphoenolpyruvate carboxykinase, heat shock protein 70 (HSP70), DAPPUDRAFT hypothetical protein, 60 kDa Chaperonin 5, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, sigma class GST Chain A, Glucose-6-phosphate isomerase, pyruvate dehydrogenase subunit E1, Glutamate dehydrogenase 2, arachin Ahy-1, Full = Allergen Ara h 1, clone P41B, Gly1. The data generated in this study show that there is sharing of antigens between organisms of different taxonomic groups, but also with allergens tested. Moreover, the description and analysis of shared molecular components can help in understanding the evolutionary history and phylogeny of these organisms.

Keywords: Angiostrongylus cantonensis; Angiostrongylus costaricensis; cross- reactivity

10

1. INTRODUÇÃO

Os organismos ao longo da evolução se diferenciam, e através de estudos

filogenéticos é possível compreender a relação evolutiva entre os diferentes grupos. A

taxonomia, classificação, identificação e designação dos organismos, são baseadas

em informações da filogenia. Através destes estudos é possível compreender melhor

as similaridades e diferenças entre organismos do mesmo ou de diferentes grupos.

As espécies Angiostrongylus cantonensis e Angiostrongylus costaricensis, são

helmintos nematódeos estudados no Laboratório de Biologia Parasitária da PUCRS e

são o elemento central de projetos e estudos, no desenvolvimento de testes de

diagnóstico. Para o estudo de reatividade cruzada feito neste trabalho, foi feita a

análise de extratos protéicos de outros helmintos (buscando similaridades e

diferenças) e outras substâncias alergenas comparando com soros de pacientes

positivos para angiostrongilíases, disponíveis na soroteca do Laboratório de

Parasitologia Molecular do Instituto de Pesquisas Biomédicas da PUCRS.

1.1 Parasitos

Na superfamília Metastrongyloidea, o gênero Angiostrongylus possui pelo

menos 20 espécies de parasitos infectantes para as espécies de mamíferos

(Bhaibulaya, 1991). Duas espécies de localização intra-arterial, pertencentes a esta

superfamília, são capazes de produzir doença em humanos: Angiostrongylus

costaricensis e Angiostrongylus cantonensis (Rey, 1991). Ambos são parasitas

próprios de roedores e a infecção humana é considerada acidental. Uberlaker, 1986

sugeriu que estas duas espécies fossem reorganizadas para um novo gênero:

Parastrongylus. Contudo, até hoje essa nova organização não tem sido utilizada.

1.2 Angiostrongylus cantonensis

O verme Angiostrongylus cantonensis (Fig. 1) foi descoberto nas artérias

pulmonares e coração de ratos domésticos em Guangzhou, China, por Chen em 1935.

Este parasito está associado à meningite eosinofílica no homem, e foi recuperado

(larvas L5) pela primeira vez em Taiwan no ano de 1944, no líquor de um homem

jovem com sintomas de meningite (Nomura & Lin, 1945).

11

Figura 1 – Verme de Angiostrongylus cantonensis. Em “A” verme fêmea mostrando o

intestino e tubo reprodutor espiralado. Em “B” verme macho, mostrando em detalhe o

espículo. (Fonte: Lindo, et al 2002).

Vermes adultos machos medem em torno de 20-25 mm de comprimento e

0,32mm a 0,42mm de largura. Na cavidade bucal possuem dois dentes laterais, sem

lábios. Possuem um esôfago claviforme e um poro excretor logo após o esôfago. As

espículas são ligeiramente iguais em comprimento. Possuem bursa copulatória de

aproximadamente 50µm de tamanho e possuindo pares de raios ventrais, laterais,

mediolaterais, externolaterias, dorsais e espículas bem desenvolvidas que determinam

a espécie. Vermes adultos de fêmeas medem em torno de 22-34 mm de comprimento

e 0,34 a 0,56 de largura. A cutícula é fina e transparente, podendo-se perceber o

disposição helicoidal dos órgãos genitais em torno do tudo digestivo, contrastando sua

coloração esbranquiçada com a tonalidade avermelhada do intestino. Apresenta uma

ligeira dilatação na cutícula da extremidade cefálica, abertura bucal pequena e ovalada

e apresentando seis papilas peribucais. (Topley & Wilson’s, 1998).

12

1.2.1 Ciclo de vida

No ciclo evolutivo (Fig. 2) as larvas de primeiro estágio (L1) são eliminadas nas

fezes dos roedores e no hospedeiro intermediário evoluem para L3 (larvas de terceiro

estágio). A. cantonensis possui ciclo vital heteroxênico, utiliza uma variedade de

moluscos como hospedeiro intermediário, entre eles caramujos como Bradybaena

similaris, lesmas dos gêneros Veronicella, Limax e Deroceras. Como hospedeiros

definitivos destacam-se Rattus rattus e R. norvegicus. A presença do parasito também

foi relatada em porcos e cabras (Alicata 1963, 1964b). As L3, são infectantes para os

vertebrados, são neurotrópicas e, no hospedeiro natural, migram para o cérebro onde

crescem e amadurecem para adultos. Os vermes adultos migram para a artéria

pulmonar onde se reproduzem e os ovos são liberados. Os ovos se desenvolvem em

larvas de primeiro estágio, estas, penetram na cavidade aérea do pulmão, migram

para o trato respiratório e são eliminadas nas fezes do hospedeiro.

O homem pode adquirir a infecção através da ingestão de alimentos crus

contendo as larvas infectantes ou por ingestão dos hospedeiros intermediários. Uma

vez engolidas, as larvas invadem o tecido intestinal, antes de chegar ao fígado. No

homem, após duas semanas, as larvas chegam ao sistema nervoso central, causando

uma intensa reação inflamatória retendo as larvas que acabam morrendo nas

meninges que, por sua vez, causam forte reação inflamatória que desenvolve a

meningite eosinofílica seguida de encefalite. Assim como parasitos do gênero

Gnatostoma e a cisticercose, a agiostrongilíase pode se localizar no globo ocular, uma

localização não muito frequente, mas aparentemente relacionada a características de

neotropismo, causando assim a Angiostrongilíase Ocular (Sinawat et al, 2008; Wang

et al, 2008). A meningite eosinofílica ocorre, pois o parasito aloja-se no sistema

nervoso central. A patogenia depende diretamente dos danos causados pela

movimentação das larvas e da reação inflamatória granulomatosa. Os sintomas em

pacientes adultos são principalmente dores de cabeça (95%), rigidez do pescoço

(46%), vômito (38%) e náuseas (28%) (Wang et al., 2008). Esta infecção não possui

tratamento anti-helmíntico específico, e a eficácia deste tratamento em eliminar o

verme ainda não foi comprovada.

13

Figura 2 – Ciclo de vida de Angiostrongylus cantonensis (Fonte: Wang et al., 2008)

1.2.2 Distribuição

Segundo Wang et al (2008) mais de 2820 casos já foram relatados em mais de

30 países (Figura 3), e infecções humanas já foram descritas na Ásia (Filipinas,

Indonésia, Malásia, Tailândia, Vietnã, Taiwan, Hong Kong e Japão), Taiti, Nova

Caledônia, Papua Nova Guiné, Austrália e desde 2007 no Brasil.

A identificação do parasito e o isolado em laboratório foi reportado pela

primeira vez no Brasil no estado do Espírito Santo após o diagnóstico de meningite

eosinofílica em dois pacientes (Caldeira et al, 2007), seguido de dois casos em

Pernambuco (Lima et al, 2009). Larvas, vermes e DNA de A. cantonensis já foram

detectados em hospedeiros em várias regiões da costa brasileira (Carvalho et al,

2012), assim como nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Santa Catarina, Pará e

14

Rio Grande do Sul. (Vide apêndice, Cognato et al, 2012). (Teles et al, 1997; Neuhauss

et al, 2007; Simões et al, 2011; Maldonado et al, 2010; Moreira et al, 2012;) (Fig. 4).

Figura 3 – Distribuição mundial de Angiostrongylus cantonensis (Fonte: Wang et al,

2008)

Figura 4 – Distribuição de Angiostrongylus cantonensis no Brasil. Pontos verde

destacando casos de doença humana. Pontos rosa destacando hospedeiros

intermediários ou roedores naturalmente infectados. (Fonte: Grupo de Biologia

Parasitária da PUCRS, 2012).

15

As regiões brasileiras onde já foi reportada a presença de A. cantonensis são

regiões portuárias ou próximas de portos. O parasito dissemina-se pela introdução de

hospedeiros infectados trazidos por navios cargueiros vindos de regiões endêmicas,

trazendo ratazanas ou hospedeiros intermediários infectados (Graeff-Teixeira, 2007).

Aguiar et al 1981, relataram casos de meningite eosinofílica em regiões de Havana,

Cuba, onde ratazanas e moluscos foram encontrados naturalmente infectados.

1.2.3 Diagnóstico

A recuperação de larvas de A. cantonensis no líquor e na câmara do olho

confirmam a angiostrongilíase humana. Contudo, a freqüência de detecção é muito

baixa. Larvas foram recuperadas em apenas 28 (11%) de 259 casos humanos em

Taiwan, e apenas 10 (2%) de 484 casos humanos na Tailândia (Wang et al, 2008). O

histórico de ingestão do hospedeiro intermediário é de grande importancia para o

diagnóstico da infecção (Wang et al, 2008). Na maior parte dos casos de

angiostrongilíases, só se tem o diagnóstico quando se isola o parasito, ou através de

sorologia, portanto o diagnóstico diferencial da meningite eosinofílica é importante

visando à exclusão de casos de outras parasitoses cujas manisfestações clínicas são

semelhantes. A eosinofilia acima de 10% no líquor é indicativa da infecção por A.

cantonensis, porém também poderá ocorrer em infecções com helmintos dos gêneros

Gnathostoma, Paragonimus, Toxocara, Trichinella e Taenia entre outros. (Graeff-

Teixeira et al, 2007; Cross, 1987; Jaroonvesama, 1988). Raramente a confirmação do

diagnóstico se dá pelo encontro de larvas no líquido cefalorraquidiano (LCR) ou na

cavidade orbitária do indivíduo infectado (Eamsobhana, 2006), portanto testes

sorológicos são alternativas importantes para o diagnóstico, sendo o método de ELISA

(Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) o mais empregado (Eamsobhana et al.,

2009).

Diversas proteínas já foram descritas para utilização no diagnóstico da

angiostrongilíase. Dentre estas, um componente de 31 kDa tem demonstrado

resultados promissores no diagnóstico da angiostrongilíase cerebral. Após etapas de

purificação, este antígeno apresentou sensibilidade e especificidade de 100% pelo

teste de ELISA (Eamsobhana et al, 1997; Eamsobhana et al, 2009, Kirsch et al,

2008).

16

1.3 Angiostrongylus costaricensis

A angiostrongilíase abdominal é causada pelo Angiostrongylus costaricensis

(Fig. 5), um nematódeo próprio de roedores silvestres. A espécie foi descrita na Costa

Rica, por Pedro Morera e Rodolfo Céspedes em 1971 após o registro e estudo de várias

lesões intestinais caracterizadas por processo inflamatório intestinal granulomatoso com

intensa eosinofilia. (Céspedes et al, 1967)

Figura 5 – Vermes de Angiostrongylus costaricensis visualizados nas artérias

mesentéricas de roedor silvestre (Oligoryzomys nigripes) infectado experimentalmente

com o nematódeo. (Fonte: Grupo de Biologia Parasitária da PUCRS)

A morfologia do verme adulto foi descrita pela primeira vez por Morera &

Cépedes, 1971. O Angiostrongylus costaricensis é um verme filiforme, apresentando a

extremidade anterior arredondada e provida de três pequenos lábios. Encontram-se aí

seis papilas sensoriais dispostas em dois círculos. A cutícula é transparente e lisa,

exceto nas extremidades, quando é mais espessa e ligeiramente estriada. A fêmea

mede em torno de 24 a 27 mm de comprimento e 0,30 mm de largura (Morera &

Céspedes, 1971), possui esôfago claviforme e intestino simples. O macho mede cerca

de 15 a 18 mm de comprimento por 0,28 mm de largura (Santos, 1985), com tubo

digestivo do mesmo tipo e testículo longo, cujo canal se abre em uma bolsa

copuladora, de tamanho médio provida de dois espículos delgados (Morera, 1973;

Rey, 1991)

17

1.3.1 Ciclo de vida

As larvas de primeiro estágio são liberadas juntamente com as fezes de

roedores infectados. Moluscos ingerem as larvas que chegam ao tecido fibromuscular,

local onde sofrem a primeira muda durante o quarto dia de infecção, se transformando

em larvas de segundo estágio. Entre o 11° e 12º dia pós-infecção sofrem mais uma

muda, tornando-se L3, infectivas para os vertebrados, podendo ser eliminadas

juntamente com o muco liberado pelos moluscos. Após a ingestão das L3, através da

alimentação por frutas, verduras ou o próprio molusco, larvas penetram à parede do

íleo-terminal, onde migram pelos vasos linfáticos mesentéricos, diferenciando-se em

larvas de quinto estágio. Após cerca de uma semana, essas retornam ao intestino

onde vão atingir a maturidade sexual, tornando-se vermes adultos. (Mota & Lenzi,

1995)

O homem, ingerindo as larvas de terceiro estágio, pode desenvolver a infecção

e apresentar doença, a qual pode ser reconhecida a partir de quadros clínicos de

abdômen agudo. Os vermes podem desenvolver lesões sobre o endotélio das artérias

mesentéricas, além do desenvolvimento de reações inflamatórias associados aos

ovos, larvas e produtos excretados por estes parasitos (Morera & Céspedes, 1971;

Morera, 1985). Mota e Lenzi (1995) propuseram um ciclo que difere do anteriormente

descrito, pela existência de uma via pulmonar para a passagem da circulação linfática

venosa para o sistema arterial e de uma via venosa portal. Angiostrongilíase

abdominal tem variada gravidade podendo comprometer a região da válvula íleo-cecal,

apêndice (Céspedes et al, 1967, Loria-Cortes & Lobo-Sanahuja, 1980) e intestino

delgado (Graeff-Teixeira, 1986). A doença pode evoluir para a oclusão intestinal com

agravamento da dor, distensão abdominal, ruídos hipercinéticos e parada na

eliminação de fezes.

Como sintomas, os pacientes podem apresentar dores abdominais, febre,

anorexia, mal-estar, náusea, vômitos, constipação ou diarréia (Graeff-Teixeira, 1987).

Essa infecção também não possui tratamento efetivo (Mentz et al, 2004) e, a sua

rápida evolução leva, muitas vezes, a exigir intervenção cirúrgica (Graeff-Teixeira et al,

1991).(Fig. 6).

18

Figura 6 – Ciclo de vida de Angiostrongylus costaricensis (Fonte: Rey, 1991)

1.3.2 Distribuição

Esta parasitose tem sido registrada desde o sul dos Estados Unidos até o norte

da Argentina. No Brasil, descreveram-se casos no Distrito Federal (Barbosa et

al,1980), no Espírito Santo (Pena, Andrade-Filho & Assis, 1995), em Minas Gerais

(Rocha, Moscardini-Sobrinho & Salomão, 1991), no sul do estado de São Paulo,

Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Ziliotto et al, 1975; Ayala, 1982; Agostini

et al, 1984) (Fig. 7).

19

Figura 7 – Distribuição mundial de Angiostrongylus costaricensis (Fonte: Grupo de

Biologia Parasitária da PUCRS, 2010).

O Rio Grande do Sul, principalmente na sua metade norte, é o estado do Brasil

onde foi registrado e diagnosticado o maior número de casos (Graeff-Teixeira, et al

1991). Estes costumam ocorrer no final da primavera, verão e início do inverno,

mostrando sazonalidade. As baixas temperaturas provavelmente inibem a evolução

das larvas nos moluscos (Ishii, 1984) e, além disso, o calor e a umidade da primavera

e verão coincidem com a reprodução e maior atividade das lesmas.

1.3.3 Diagnóstico

Já que não há relato da presença de ovos ou larvas desse nematódeo ao

exame parasitológico de fezes (Mojon 1994; Pena, et al 1995), o diagnóstico da

angiostrongilíase abdominal deve ser feito por métodos imunológicos. Na Costa Rica é

empregado um teste de aglutinação em látex (Lobo-Sanahuja, et al 1987) e no Brasil

está disponível um teste de ELISA, com sensibilidade de 76% e especificidade de

98%, para detecção da fase aguda da infecção (Graeff-Teixeira et al, 1997). Silva, et al

2003 propuseram uma PCR para detecção de ácidos nucléicos do parasito presentes

no soro de pacientes.

20

No entanto, o diagnóstico definitivo é feito nos cortes histológicos de biópsia ou

peças cirúrgicas (Graeff-Teixeira, et al 1991) evidenciando a presença de nematódeos

ou ovos intra-arteriais.

1.4 Reatividade Cruzada

Embora as reações antígeno-anticorpo sejam altamente específicas, em alguns

casos o anticorpo induzido por um antígeno pode reagir de maneira cruzada com um

antígeno não relacionado. Esta reatividade cruzada ocorre quando dois antígenos

diferentes compartilham um epitopo idêntico não relacionado que possui propriedades

químicas similares. (Kuby, 2008)

Reações cruzadas aparecem porque o antígeno envolvido na reação cruzada

compartilha um mesmo epitopo com o antígeno imunizador ou porque ele tem um

epitopo que é estruturalmente semelhante ao epitopo no antígeno imunizante (multi-

especificidade). (Fig.8)

Figura 8 – Esquema de reatividade cruzada, quando um determinado antígeno não

específico se liga a um anticorpo. Fonte: Microbiologia e Imunologia online

http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm)

Os testes imunológicos utilizados no diagnóstico de diversas parasitoses

apresentam muitas vezes a limitação quanto a obtenção de antígenos específicos, ou

seja, antígenos exclusivos de um determinado organismo cuja infecção queremos

diagnosticar pela detecção dos anticorpos produzidos. Isso se deve ao fato do

compartilhamento de moléculas homólogas entre grupos taxonômicos próximos. A

reatividade cruzada entre Angiostrongylus cantonensis e A. costaricensis com outros

helmintos já foi relatada em ensaios de detecção de anticorpos em indivíduos

infectados com Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Toxoplasma gondii,

21

Schistosoma japonicum, Paragonimus westemani, Clonorchis sinensis, Echinococcus

granulosus, Spirometra erinacei, Taenia solium. (Chen et al, 2011). Vitta et al, 2010

demonstraram reatividade cruzada com Gnathostoma sp, Wuchereria bancrofti,

Paragonimus westermani e Opisthorchis viverrini. Dekumyoy et al, 2000 obtiveram em

seus experimentos casos de reatividade cruzada com Strongyloides spp., Toxocara

spp., além de outros já citados. Nuamtanong, 1996 demonstraram reatividade cruzada

com Trichinella spiralis, Trichuris spp. e Opisthorchis spp. Eamsobhana et al, 1998

mostraram reatividade cruzada entre o extrato bruto de A. cantonensis com

Gnathostoma spinigerum, um parasito clinicamente relacionado com A. cantonensis.

A. cantonensis e A. costaricensis são organismos congenéricos, e, portanto

compartilham vários determinantes antigênicos (Dekumyoy et al, 2000). A utilização de

antígenos para o imunodiagnóstico da angiostrongilíase é dificultado pela obtenção de

material biológico. A. cantonensis pode ser mantido em laboratório com mais eficácia e

prover grandes quantidades de antígenos heterólogos. Estes antígenos podem ser

usados no desenvolvimento de ensaios de imunodiagnóstico que detectam reatividade

cruzada com anticorpos de A. costaricensis. (Ben et al, 2010). A. cantonensis e A.

costaricensis compartilham epitopos antigênicos comuns, onde há anticorpos que

reconhecem proteínas de ambas as espécies. Morassutti et al, 2012, isolaram e

caracterizaram o componente de 31 kDa presente no extrato bruto de vermes de A.

cantonensis. A análise por eletroforese bidimensional revelou a presença de quatro

spots, onde pelo menos três diferentes proteínas em cada um dos spots foram

identificadas: subunidade épsilon do coatomero, proteína 14-3-3 e proteína contendo

domínio NAC. Este componente apresentou reatividade cruzada com soro de

pacientes infectados com Strongyloides spp., Trichinela spp., Echinococcus spp., e

Toxocara spp., sugerindo compartilhamento antigênico de algumas proteínas entre

parasitos nesta mesma região o que torna o estudo do compartilhamento

indispensável para futuros testes de diagnóstico.

1.5 Reatividade cruzada e helmintos

Estrongiloidíase, causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis, é uma das

mais importantes infecções intestinais em humanos e está distribuído por todo mundo

em países tropicais e países de clima temperado (Grove, 1996). No Brasil, as

infecções variam muito com a região, sendo que Uberlândia, cidade localizada na

região sudeste, no estado de Minas Gerais, é considerado uma região hiperendêmica

22

para S. stercoralis (Machado & Costa-Cruz, 1998). No Brasil, a prevalência da doença

fica em torno de 3 a 13%, ocorrendo de forma assintomática na maior parte dos

indivíduos infectados. Contudo, é considerado de grande importância por causar

hiperinfecção e disseminação em pacientes imunodeprimidos, principalmente sob o

uso de corticóides. O diagnóstico definitivo geralm ente é feito mediante a detecção de

larvas nas fezes; mas como a quantidade de parasitos é baixa na maioria dos casos e

a eliminação de larvas é reduzida e irregular, esta se torna extremamente difícil. (Silva,

et al 2003). Sendo assim, o desenvolvimento de testes sorológicos para o diagnóstico

da estrongiloidíase torna-se uma alternativa necessária. (Liu &Weller, 1993). Um dos

grandes problemas envolvendo a estrongiloidíase é em relação à dificuldade de se

detectar larvas em fezes humanas, em função da maioria dos casos envolverem

doença crônica, baixos níveis de infecção e eliminação larval mínima e de forma

irregular. Apesar do método da placa de Ágar para cultura de fezes parecer mais

eficaz do que métodos parasitológicos mais comumente utilizados, ainda assim é uma

técnica custosa e pouco sensível em alguns casos de pouca ou irregular eliminação de

larvas. (Arakaki et al, 1990; Sato et al, 1995; Dreyer et al, 1996; Uparanukraw et al,

1999). Detecção de anticorpos pelo teste IFAT (Indirect fluorescent antibody test) e

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) podem servir como complemento ao

diagnóstico parasitológico das estrongiloidíases (Conway et al, 1993a, Costa-Cruz et

al 1997, De Paula et al 2000), porém estes testes já demonstraram reatividade

cruzada com filária, esquistossomos, ancilostomídeos, Ascaris lumbricoides, Trichuris

trichuria e Echinococcus. (Gam et al, 1987, Conway et al, 1993a,b, Lindo et al, 1994).

Yoshiya et al, 1985 demonstraram que a reatividade cruzada de soros humanos com

outros helmintos é significativamente mais fraca se comparada com Strongyloides

spp.

Toxocara canis é o principal causador da toxocaríase humana, sendo

considerado um grave problema epidemiológico em vários países. O homem é

considerado um hospedeiro acidental, e pode vir a se infectar ingerindo os ovos dos

parasitos ou então ingerindo fígado de aves ou bovinos infectados. (Despommier,

2003; Morimatsu et al, 2006; Yoshikawa et al, 2008; Choi et al, 2012). Apesar da

maioria das infecções causadas por Toxocara spp. serem assintomáticas, a migração

das larvas em órgãos internos através do sangue pode causar uma variedade de

manifestações clínicas, como larva migrans viceral, larva migrans ocular,

meningoencefalite eosinofílica, toxocaríase oculta e neurotoxocaríase (Glickman,

1993; Fan et al, 2003). O exame de biópsia do tecido afetado pode indicar um

diagnóstico definitivo, porém tais biópsias raramente estão disponíveis. Portanto, o

diagnóstico confirmatório da toxocaríase humana tem sido feito em larga escala

23

através do imunodiagnóstico e/ou técnicas moleculares. O teste de ELISA baseado em

antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis, é um método sensível e

específico para detecção de T. canis em infecções humanas, porém a eficácia destes

ensaios é reduzida pelo problema da reatividade cruzada de moléculas, especialmente

em países subdesenvolvidos, onde é mais comum o poliparasitismo. (Smith et al,

2009).

Ascaríase é o parasitismo desenvolvido no homem pelo nematódeo denominado

Ascaris lumbricoides. Esta é a mais cosmopolita e a mais freqüente das helmintíases

humanas, principalmente em países subdesenvolvidos onde as condições de

saneamento básico são precárias ou inexistentes. A OMS (2000) estimou em um

bilhão e meio o número de pessoas infectadas, das quais 400 milhões apresentavam

sintomatologia, havendo cerca de 100 mil mortes concentradas nos países

subdesenvolvidos da África, Ásia, Oceania e Américas. Em 1974, Stoll calculou que

30% da população mundial estariam infectadas com o parasito. Na maioria dos casos

a infecção é leve e clinicamente benigna, se bem que um único verme possa

responder por acidentes graves, de natureza obstrutiva, exigindo tratamento cirúrgico

de urgência. O diagnostico dessa parasitose é feito através de exame direto de fezes

(sedimentação espontânea). A ascaríase é uma infecção parasitária de fácil

contaminação, ocorrendo pela ingestão dos ovos embrionados, ou pela ingestão de

alimentos mal lavados. O número de ovos diários depositados pela fêmea é de

aproximadamente 200.000 por dia, e a viabilidade dos ovos pode durar meses em

condições favoráveis de temperatura e umidade. Todos esses fatores ajudam na

disseminação do parasito e da infecção, tornando a co-infecção de Ascaris

lumbricoides com outros parasitos muito comum. Yang & Kennedy (1979) observaram

reação cruzada no teste de ELISA entre soros de pacientes com infecções causadas

com Toxocara canis e Ascaris lumbricoides. Além da diversidade de estudos

relacionando a Ascaríase com doenças alérgicas. (Gardette et al, 2012).

Fasciolose é uma das principais doenças parasitárias em animais, podendo

infectar o homem através do parasito Fasciola hepatica. Este trematódeo está

distribuído mundialmente, sendo mais encontrado em regiões temperadas. (Mas-

Coma S, 2005). A fasciolose tem grande impacto econômico sobre a indústria de

criação de animais em todo mundo, devido as grandes perdas que pode causar. A

Organização Mundial da Saúde reconheceu a fasciolose humana como um grave

problema de saúde pública, com uma estimativa de 17 milhões de pessoas infectadas

no mundo todo. O número de casos humanos ainda não é estimado corretamente em

muitos países, isto porque o diagnóstico parasitológico é dificultado, pois nas primeiras

semanas de infecção não é possível a visualização de ovos nas fezes. (Tantrawatpan,

24

C et al, 2003). Em função disso, diagnóstico sorológico se torna importante, já que

anticorpos podem ser detectados antes mesmo das duas primeiras semanas, o que

facilita um tratamento precoce e previne danos irreversíveis ao fígado.

Hymenolepis diminuta, também conhecida como a tênia do rato, é raramente

encontrado em seres humanos, e é adquirida pela ingestão acidental do hospedeiro

intermediário, artrópodes contendo a larva cisticercóide. A infecção por H. diminuta em

humanos é rara, tipicamente ocorre em casos isolados, tais como os relatos de casos

que descrevem um único indivíduo infectado (Levi et al, 1987; Varghese et al, 1998).

Poucos casos foram relatados especialmente em crianças com taxa de prevalência

que variam entre 0,001% e 5,5% (McMillan et al, 1971;. Naquira et al, 1973.;

Panpiglione et al, 1987; Lo et al, 1989; Mercado & Arias, 1995; Tena et al, 1998).

Apenas na Guatemala constatou-se incidência de 1% em um inquérito coprológico.

Em condições favoráveis para a transmissão, com grande densidade de ratos, como

se observou em determinadas regiões da Índia, a prevalência pode chegar a 6% na

população humana. A maioria das infecções geralmente é assintomática, mas

ocasionalmente, os pacientes podem apresentar coceira e leves desconfortos

gastrointestinais tais como dor abdominal, irritabilidade e diarreia. Sua importância

médica é quase nula, porém a literatura científica sobre a biologia e imunologia é

vastíssima, por constituir excelente modelo laboratorial para estudo de cestoides e da

relação parasito-hospedeiro. (McKay, 2010).

O fato de uma grande quantidade de pessoas estarem infectadas em regiões de

alta endemicidade para parasitoses poderia afetar a especificidade dos testes para o

diagnóstico das angiostrongilíases, já que foi demonstrada a reatividade cruzada com

vários grupos. Com o objetivo de se estudar o compartilhamento de antígenos

utilizando diferentes grupos taxonômicos, foi utilizado os parasitos citados acima.

1.6 Reatividade cruzada e alergenos

Doenças alérgicas e infecções por helmintos são consideradas condições

médicas distintas, porém, nas últimas décadas, recentes descobertas indicam uma

associação entre elas. A natureza desta relação e os mecanismos envolvidos ainda

não estão claros e geram controvérsia. Em ambas reações, a resposta imune tem

papel central para restaurar o equilíbrio e são caracterizadas por altos níveis de IgE,

eosinofilia, aumento de mastócitos e células T que secretam preferencialmente

citocinas próprias da resposta regulada por células Th2. Estudos epidemiológicos

mostram que doenças alérgicas e helmintíases são inversamente associadas. Um

25

exemplo recente entre essas relações está o trabalho de (Pinto et al, 2004), onde

testaram a hipótese e confirmaram de que a infecção por Angiostrongylus

costaricensis diminuiu a resposta inflamatória no pulmão de camundongos infectados.

Tudo isso pode ser explicado também pela teoria da higiene, onde relata que a

redução a exposição a micróbios, e uma subsequente ausência de resposta

imunológica a estes organismos, são responsáveis pelo aumento da prevalência de

doenças alérgicas. (Strachan, 1989)

A característica mais intrigante da imunidade tipo 2 (relacionada a alergias e

doenças parasitárias) é a sua propensão de ser ativada em resposta a uma grande

variedade de substâncias ambientais, como os alergenos. Não há uma classificação

específica para estas substâncias, pois não compartilham qualquer propriedade que

poderia defini-los como tal. (Aalberse, 2000). Portanto, alergenos são aquelas

substâncias que desencadeiam qualquer resposta alérgica.

Além das proteínas, que são amplamente estudadas em relação a sua

composição, identificação e interação nos organismos, assim como na reatividade

cruzada, estão também uma classe de compostos que há pouco tempo não era

considerada imunogênico, os açúcares. Helmintos em geral, possuem em sua

superfície grandes quantidades de glicanos, ou seja, açúcares. Assim como outros

animais, possuem a capacidade de sintetizar glicolipídios, polissacarídeos e

glicosaminoglicanos (Cummings & Nyame 1996; Khoo & Dell 2001). Os parasitos

utilizam esse mecanismo de síntese de açúcares como uma forma de sobrevivência e

defesa, regulando e suprimindo a resposta imune do hospedeiro. Em alguns casos, os

glicanos imunogênicos parecem estar restritos a um ou algumas espécies, tais como

tyvelose contendo glicano encontrados no parasito Trichinella spiralis, zoonose

causadora da triquinelose em humanos (Reason et al, 1994).

Com o intuito de verificar a reação cruzada entre a resposta imunológica das

infecções com os parasitos já citados anteriormente, foram testados os seguintes

alergenos: amendoim, morango, pólen, tomate, que em algum nível possuem

açúcares em sua composição.

26

2. JUSTIFICATIVA

Principalmente pela expanção do número de casos e aumento da área

geográfica de ocorrência, especialmente a angiostrongilíase cerebral tem causado

preocupação nos últimos anos (Wang et al, 2008). Como visto anteriormente, nessas

parasitoses não há eliminação de formas parasitárias na infecção humana, exigindo

assim métodos moleculares para o diagnóstico. Porém, até hoje, quase 80 anos após

o descobrimento do parasito e da doença não foi desenvolvido um teste de diagnóstico

específico e sensível capaz de discriminar as Angiostrongilíases de outras parasitoses

e com reagentes amplamente disponíveis e produzidos de forma reprodutível. A

reatividade cruzada tem sido um problema para o desempenho satisfatório de

especificidade de testes sorológicos (Graeff-Teixeira et al, 1997; Mesén-Ramirez et al,

2008). Durante o estabelecimento do parasitismo muitas moléculas provenientes do

parasito e do hospedeiro interagem entre si, sendo principalmente produtos da

degradação celular gerada no momento da infecção, desprendimento cuticular, ou

pela excreção de metabólitos do parasito (Morassutti et al, 2012). Estas moléculas,

também são capazes de gerar ou induzir uma resposta imune humoral, o que propicia

os estudos imunológicos para o diagnóstico. No caso das angiostrongilíases, já foi

demonstrado que pacientes infectado com outros helmintos são capazes de reagir

com antígenos brutos de Angiostrongylus spp. o que torna o estudo compartilhamento

destas moléculas dos diferentes grupos de parasitos citados nesse trabalho

fundamental para o melhoramento dos métodos de diagnóstico desta parasitose.

Portanto, a compreensão das moléculas compartilhadas entre os diferentes

grupos taxonômicos capazes de gerar resposta imunológica inespecífica podem

auxiliar no desenvolvimento de testes diagnósticos específicos subtraindo antígenos

compartilhados e/ou selecionando compostos específicos de cada espécie. Além

disso, este trabalho poderá aprimorar a compreensão dos mecanismos de

reconhecimento e dos processos de evolução molecular de diferentes grupos de

helmintos. É relevante ressaltar também a importância do conhecimento destes

antígenos como marcadores de relações filogenéticas para serem usados como uma

ferramenta de proximidade filogenética entre espécies. O objetivo principal deste

trabalho foi identificar quais moléculas são compartilhadas por A. cantonensis e

parasitos de diferentes grupos taxonômicos, eventualmente parasitando humanos,

como os nematódeos Toxocara canis, Ascaris lumbricoides e Strongyloides spp; o

cestódeo Hymenolepis diminuta, e o trematódeo Fasciola hepatica, como também os

possíveis alergenos amendoim, morango, pólen e tomate.

27

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Estudar a reatividade cruzada entre A. cantonensis, outros helmintos e alergenos.

3.2 Objetivos Específicos

Verificar se há compartilhamento de antígenos entre Angiostrongylus spp e os

seguintes helmintos Strongyloides spp Ascaris lumbricoides, Toxocara canis,

Hymenolepis diminuta e Fasciola hepatica.

Verificar se há compartilhamento de antígenos entre Angiostrongylus spp e alergenos.

Identificar componentes compartilhados pelos diferentes parasitos e alergenos.

Identificar componentes do extrato bruto de L3 de Strongyloides spp. reconhecidos por

soros de pacientes infectados por Angiostrongylus spp.

Investigar a utilidade de extratos protéicos de Strongyloides spp. para remoção de

antígenos de reatividade cruzada com Angiostrongylus spp.

28

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Locais de execução

O projeto foi realizado no Laboratório de Biologia Parasitária da PUCRS,

Laboratório de Parasitologia Molecular do Instituto de Pesquisas Biomédicas PUCRS,

Laboratório de Proteômica da UNIPAMPA e Laboratório de Genômica Estrutural e

Funcional do Departamento de Biotecnologia da UFRGS.

4.2 Obtenção dos ovos de Strongyloides spp.

Para a obtenção dos ovos de Strongyloides spp. foram coletadas fezes de

ratazanas naturalmente infectadas. Para tanto, foram espalhadas pelo Campus central

da PUCRS, com a devida autorização da Prefeitura Universitária, armadilhas para a

coleta das ratazanas, que foram atraídas por iscas (chocolate, presunto, pasta de

amendoim). O animal foi mantido em cativeiro, dentro das armadilhas, apenas pelo

tempo necessário para coleta de suas fezes. Após a coleta, as mesmas foram abertas

e os animais foram devolvidos ao seu habitat natural. As fezes recolhidas foram

submetidas ao método de sedimentação espontânea, para a obtenção dos ovos.

4.3 Manutenção in vitro para obtenção de L3 (larvas de terceiro estágio) de

Strongyloides spp.

Os ovos foram mantidos em placas de ágar como descrito por (Arakaki, 1990), à

temperatura de 27°C em câmara climática com umidade controlada, para o

desenvolvimento das larvas de primeiro e posteriormente terceiro estágio.

4.4 Obtenção de vermes adultos de Strongyloides spp.

Cinco ratos (Rattus norvegicus) adultos foram infectados através de inoculação

subcutânea com aproximadamente 1.500 L3 provenientes da cultura in vitro. Os

animais foram anestesiados previamente com Isoflurano por inalação, e eutanasiados

com CO2 após quatro dias de infecção. Vermes adultos foram retirados da mucosa do

intestino delgado através de raspagem da mucosa do intestino com o auxílio de

espátula estéril.

29

4.5 Amostras de soro de pacientes com Angiostrongilíase

Foram utilizadas amostras de soro humano de pacientes com Angiostrongilíase

abdominal e Angiostrongilíase cerebral. Ambas as amostras foram provenientes da

soroteca mantida no Laboratório Parasitologia Molecular do Instituto de Pesquisas

Biomédicas do Hospital São Lucas da PUCRS.

4.6 Obtenção de antígenos de Strongyloides spp., Ascaris lumbricoides,

Fasciola hepatica, Toxocara canis e Hymenolepis diminuta

Antígenos dos diferentes parasitos foram obtidos através da maceração dos

seus vermes adultos. Strongyloides spp. e Hymenolepis diminuta foram recuperados

da mucosa do intestino delgado de ratos naturalmente infectados. Vermes de

Toxocara canis foram coletados a partir de fezes de cachorros naturalmente infectados

pelo parasito. Os vermes de Fasciola hepatica foram gentilmente cedidos pelo Dr.

Martin Cancela, do Centro de Biotecnologia da UFRGS, obtidos a partir de fígados de

bovinos infectados. Para a extração de antígenos de A.lumbricoides, recuperado de

amostra de fezes humanas cedida pelo Laboratório de Análises Clínicas do Hospital

Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, T.canis e H. diminuta foi utilizado 0,330g

de vermes de cada parasito. Aproximadamente 40 vermes fêmeas de A. cantonensis

foram usados para a extração. Os vermes foram macerados em um microtubo com a

ajuda de um pistilo e nitrogênio líquido, e adicionado tampão de extração contendo

10µl de detergente triton X 14, 10ml de PBS e 20µl de inibidores de proteases. As

amostras foram centrifugadas a 20.000 xg por 40 minutos em uma centrífuga a 4ºC, e

após a retirada de todo sobrenadante, foi feito a quantificação das proteínas através

do Kit Qubit da Invitrogen.

4.7 Obtenção de antígenos dos possíveis alergenos

A obtenção das moléculas antigênicas dos possíveis alergenos amendoim,

morango, pólen e tomate foram feitos seguindo o mesmo protocolo de extração

descrito no item 4.6.

30

4.8 Eletroforese Unidimensional e Bidimensional

As moléculas obtidas da extração de antígenos citados nos itens anteriores

(4.6 e 4.7) foram separadas pelo método de eletroforeses uni e bidimensional. Na

eletroforese bidimensional, durante a primeira dimensão denominada focalização

isoelétrica (IEF), as proteínas são separadas em um gradiente de pH imobilizado.

Quando estas proteínas são submetidas a uma corrente elétrica, elas migram até

atingirem uma posição estacionária onde possuam carga líquida zero (ponto

isoelétrico). Na segunda dimensão, as proteínas separadas pela IEF são submetidas a

uma eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, que separa as proteínas de

acordo com suas massas moleculares. Como os parâmetros usados na primeira

dimensão (ponto isoelétrico) e na segunda dimensão (massa molecular) são

independentes, uma grande resolução é atingida.

Para a primeira dimensão, as moléculas obtidas foram precipitadas com 1,5ml

de TCA (ácido tricloroacético) em acetona 20%, deixadas overnight e após submetidas

a passos de lavagem com acetona. Após, o material foi ressuspendido em tampão de

reidratação contendo uréia 7 M, tiouréia 2 M, CHAPS 4 % (w/v), DTT 66 mM e

anfólitos 0,5 % (v/v) (Amersham Bioscience/GE Healthcare). As amostras foram

aplicadas às tiras de 7 cm de pH imobilizado (IPG, GE Healthcare, Piscataway, NJ)

com intervalo de pH 3-10.A focalização isoelétrica foi feita com a utilização do

equipamento Multiphor II (GE, USA) de acordo com o protocolo já estabelecido

anteriormente (Morassutti et al., 2012).

Para a segunda dimensão, as tiras foram equilibradas com tampão contendo

glicerol 30 %, uréia 6 M, DTT 1 % e SDS 2 %, por 10 minutos e depois com o mesmo

tampão com a adição de 4 % de iodacetamida por mais 10 minutos. Após o equilíbrio

das tiras e para as separações por eletroforese unidimensional foi utilizado gel de

poliacrilamida 12 % (SDS-PAGE) para a separação das proteínas por massa

molecular. A corrida foi realizada a 120 V por 1 hora.

4.9 Western Blot

Após a separação das moléculas pela eletroforese uni e/ou bidimensional, a

visualização das moléculas de possível reatividade cruzada foi analisada pelo método

de Western Blot. Os extratos dos diferentes parasitos foram separados por

31

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para membrana de

nitrocelulose Hybond-C extra (Amersham), utlizando-se o sistema de transferência em

banho (GE, USA) em tampão glicina contendo metanol (0,25M de TRIS, 1,91M de

glicina e metanol 20%).

Após a transferência as membranas de nitrocelulose foram bloqueadas overnight

à 4º C, com solução bloqueadora (bloto), contendo PBS Tween-20 a 0,05 % (PBST) e

leite desnatado 5 %. A membrana foi lavada 3 vezes por 5 minutos com PBST à

temperatura ambiente e depois incubada por 1 hora a 37º C com soro de pacientes, na

proporção de 1/100 em bloto. Após, a membrana foi lavada novamente por 3 vezes

durante 5 minutos com PBST à temperatura ambiente e então, incubada com

anticorpo secundário acoplado com peroxidase (anti IgG humano), diluído em bloto

(1/2000) por uma hora a 37º C. Após outras três lavagens, a revelação da reação foi

feita através de incubação com DAB (diaminobenzidina) e adição do substrato da

enzima, peróxido de hidrogênio 0,015% em PBS. A análise dos spots (pontos de

reconhecimento) e das bandas imunogênicas foi feita através da visualização dos géis.

4.10 Medição das bandas

As bandas das proteínas contidas nos géis foram comparadas às bandas

reconhecidas pelo soro positivo de angiostrongilíases nas membranas provenientes

dos experimentos de Western Blot, através da medição das distâncias percorridas

pelas proteínas com uma régua milimetrada. Como parâmetro de início da corrida foi

desenhado uma linha cor de rosa na membrana, e a partir dessa marca foi

determinada a distância percorrida pela banda. Após a identificação da banda

correspondente no gel estas foram recortadas do gel SDS-PAGE com bisturi e

analisadas pelo método de espectrometria de massas.

4.11 Espectrometria de massas e identificação de proteínas

A identificação das proteínas presentes nos spots ou bandas imunogênicas

obtidas através da eletroforese unidimensional/bidimensional e revelação do Wertern-

blot foram feitas por espectrometria de massas, utilizando o equipamento Q-TOF

MS/MS em colaboração com o Laboratório de Genômica Estrutural e Funcional do

Centro de Biotecnologia da UFRGS. Sendo que os arquivos gerados pelo

espectrômetro foram analisados pelo programa de identificação de peptídeos

MASCOT. (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html)

32

Digestão em gel das amostras: As amostras de proteínas foram digeridas

com solução de tripsina (20ng/µL) como descrito por Shevchenko e colaboradores

(1996), e os peptídeos obtidos foram dessalinizados usando OASIS HLB (Waters,

Milford, USA). Para a digestão em gel das amostras, as bandas foram recortadas

cuidadosamente do gel SDS-PAGE com o auxílio de bisturi. As bandas foram

submetidas a uma solução contendo 50% de metanol e 5% de ácido acético em água

overnight à temperatura ambiente. Após este período essa mesma solução foi

substituída por mais 200µl por mais 3 horas. Após este período essa mesma solução

foi descartada e aos géis foi adicionado 200µl de acetonitrila, que após 5 minutos foi

descartada. As amostras foram submetidas a uma centrífuga a vácuo para a

evaporação de qualquer resíduo de acetonitrila por mais 3 minutos. Após esta etapa

foi adicionado 50µl de DTT 10mM por 30 minutos e após descartado para que fosse

adicionado a mesma quantidade de iodacetamida 50mM pelo mesmo período de

tempo a temperatura ambiente. As amostras então foram lavadas com 100 µl de

bicarbonato de amônio 100mM e descartado após 10 minutos. As amostras foram

desidratadas com 200µl de acetonitrila por mais 5 minutos, e descartada para a adição

de 100µl de bicarbonato de amônio por mais 10 minutos. Após este período, foi

removido e foram adicionadas mais duas etapas de acetonitrila com 200µl cada. Após

as etapas de acetonitrila, as amostras foram submetidas novamente a centrífuga a

vácuo por 3 minutos. 50µl de solução de tripsina foi adicionado às amostras por 10

minutos no gelo. O excesso de tripsina foi removido e adicionado 20µl de bicarbonato

de amônio 50mM overnight a 37°C. Após este período, foi adicionado 30µl de

bicarbonato de amônio 100mM, levados ao vortex e incubadas por 10 minutos. O

sobrenadante foi removido e colocado em um novo microtubo. Os peptídeos foram

extraídos do gel adicionando 30µl de solução de extração (5% de ácido fórmico em

50% de acetonitrila), incubado por 10 minutos e então coletados e colocados no novo

microtubo. O processo foi repetido e adicionado ao obtido anteriormente. As amostras

foram centrifugadas e evaporadas até a formação de pellets. Os pellets foram

ressuspendidos em 10µl ácido fórmico 0,1%, e então levados a epectrômetro de

massas.

Análise por espectrometria de massas e identificação dos peptídeos: Os

peptídeos foram analisados pelo equipamento de cromatrografia líquida acoplada ao

espectrômetro de massas (LC-MS/MS) Waters nanoACQUITY UPLC, Waters

Micromass Q-Tof Micro or Q-Tof Premier (Waters MS Technologies, Manchaester,

UK). Os peptídeos foram eluídos a partir da coluna de fase reversa para

espectrômetro de massa a uma razão de fluxo de 200nl/min, em um gradiente linear

de 10-50% água/acetonitrila, durante 30 minutos. As análises foram realizadas usando

33

dados dependentes do modo de aquisição (DDA). Comutação automática de MS para

MS/MS foi realizada para a contagem de íons precursores que foram maiores a 8, e a

energia de colisão MS/MS foi dependente de um íon precursor m/z e do estado de

carga. Experimentos de espectrometria de massas foram realizados em duplicata.

Os dados obtidos por MS/MS foram processados usando o programa MASCOT

software (Matrix Science, London, UK) utilizando DATABASE (NCBInr). Para esse

procedimento foram utilizados os seguintes parâmetros: máximo de um sítio de

clivagem perdida, alquilação carbamidometilação fixa de cisteínas, oxidação variável

de metioninas e uma tolerância de 0,1 unidades de massa e fragmentos de íons.

4.12 Questões Éticas

Os animais foram tratados de acordo com as regulamentações brasileiras, lei

11794-08/10/2008, decreto 6899-15/07/2009 e das recomendações seguidas pelo

Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONEA), e com protocolo

aprovado pelo Comitê de Ética, registro CEUA 11/00279.

34

5. RESULTADOS

5.1 Obtenção dos ovos de Strongyloides spp.

Com o objetivo de se obter ovos de Strongyloides spp. para o desenvolvimento

de larvas e vermes adultos, foram feitas várias tentativas de captura de ratazanas

naturalmente infectadas.

Duas ratazanas foram capturadas e mantidas em caixas de plástico, com

recolhimento diário das fezes e limpeza. As fezes coletadas eram submetidas ao

método de Baermann (Baermann, 1917). Após a análise do material fixado em lâminas

e visualizado em microscópio óptico, foram observados ovos de vários parasitos, como

de Strongyloides spp, (Fig.10) Syphacia spp (Fig.12 A e B) e Hymenolepis diminuta.

(Fig. 9)

Durante o processo de captura, uma terceira ratazana foi coletada e após

algumas horas veio ao óbito. O animal foi levado à necropsia, e foram encontrados

vermes adultos de Hymenolepis diminuta no intestino delgado, (Fig. 11) e de

Nippostrongylus brasiliensis no intestino delgado (Fig. 13 A e B). Nas artérias

pulmonares do roedor foram encontrados vermes de Angiostrongylus cantonensis,

achado que deu origem ao artigo apresentado no apêndice deste trabalho, e que será

submetido à revista Emerging Infections Diseases (CDC). (apêndice 1)

Figura 9: Ovo de Hymenolepis diminuta encontrado nas fezes de ratazana

naturalmente infectada. (400x)

35

Figura 10: Ovo de Strongyloides spp. encontrado nas fezes de ratazana naturalmente

infectada. (400x)

Figura 11: Verme adulto de Hymenolepis diminuta encontrado no intestino

delgado de ratazana naturalmente infectada. (4x)

Figura 12 A e B: Ovos de Syphacia spp. encontrados nas fezes de ratazana

naturalmente infectada. (100x e 400x respectivamente)

36

Figura 13 A e B: Verme de Nippostrongylus brasiliensis encontrado no intestino

grosso de ratazana naturalmente infectada. (100x e 400x respectivamente)

5.2 Manutenção in vitro para obtenção de L3 (larvas de terceiro estágio)

de Strongyloides spp.

As fezes obtidas das ratazanas capturadas foram semeadas em placas de ágar

(Arakaki, 1990) das seguintes maneiras: suspensão resultante do método de

Baerman: a) isolada ou contendo fezes da ratazana; b) desmanchadas ou c) inteiras.

Nas duas primeiras tentativas nenhum verme adulto foi recuperado. Como já

descrito na literatura, larvas de Strongyloides spp. cultivadas em placas de ágar são

capazes de se desenvolver, podendo chegar a fase L3 ou até mesmo vermes adultos.

Porém, nenhuma larva foi capaz de se desenvolver nesse meio e não tivemos êxito na

tentativa de conseguir desenvolvimento de larvas através da manutenção das placas

de ágar. Desta forma o material obtido de fezes de ratazanas não foi suficiente para

obtenção de antígenos para os testes programados.

5.3 Obtenção de vermes adultos de Strongyloides spp.

Algumas fezes coletadas foram processadas pelo método de sedimentação

espontânea, e o sedimento analisado em microscópio óptico. Vários tipos de larvas

foram encontradas, possuindo morfologia semelhante. Haviam também larvas com

movimentação e morfologia características da espécie A. cantonensis, bem como

possíveis larvas de Strongyloides spp. (Fig. 14). Porém, nenhum verme adulto foi

obtido.

37

Figura 14 - A e B, Diferentes larvas obtidas através do processo de Sedimentação

espontânea. Indicado por uma seta, na foto A, uma larva de Angiostrongylus

cantonensis (400x).

5.4 Obtenção de antígenos

A partir dos vermes adultos de A. cantonensis, F. hepatica, A. lumbricoides, H.

diminuta e T. canis foram obtidos os antígenos utilizados, estes foram quantificados

pelo kit Qubit da Invitrogem e está detalhado na tabela 1.

Tabela 1: Quantidade de proteína encontrada em cada extrato bruto dos parasitos

adultos.

Parasitos Concentração de proteínas

Angiostrongylus cantonensis

5,68 mg/ml

Fasciola hepatica 5,48 mg/ml

Ascaris lumbricoides 1,89 mg/ml

Hymenolepis diminuta 6,24 mg/ml

Toxocara canis 1,13 mg/ml

38

5.5 Eletroforese Bidimensional

Tiras de pH (3-10) imobilizadas em gel foram reidratadas com 90µg de antígeno

de A. cantonensis e F. hepatica precipitados com TCA em acetona 20, e submetidas a

eletroforese bidimensional com uma voltagem total de 35.300Vh, onde dois géis foram

obtidos. Nota-se nas figuras 15 e 16, que há vários spots na mesma região no gel,

cerca de 9 spots em A. cantonensis , e 14 em F. hepatica.

Figura 15: Gel Bidimensional de Angiostrongylus cantonensis utilizando 90µg de

proteínas. Em detalhe, spots na região ácida do gel.

Figura 16: Gel Bidimensional de Fasciola hepatica utilizando 90µg de proteínas. Em

detalhe, spots na região ácida do gel.

39

5.6 Eletroforese Unidimensional

Como um primeiro teste foi utilizado 5µg de antígeno bruto de cada parasito a

fim de visualizar as proteínas no gel de poliacrilamida. Neste primeiro gel (Fig. 17), é

possível visualizar várias bandas de proteínas entre 225kDa e 17kDa, sendo que na

canaleta número 2, correspondente ao extrato de Ascaris lumbricoides as

proteínasestão distribuídas predominantemente nas regiões entre 76 e 225kDa.

Figura 17: Gel unidimensional, utilizando 5µg de antígeno de cada parasito.1 –

Fasciola hepatica; 2 – Ascaris lumbricoides; 3 – Hymenolepis diminuta; 4 – Toxocara

canis.

5.7 Western Blot

A figura 18 mostra os componentes que foram reconhecidos por soro contendo

anticorpos anti - A. cantonensis, revelados por Western-blot após eletroforese

unidimensional.

40

Figura 18: Western Blot mostrando a reatividade cruzada entre todos os grupos de

parasitos reagindo contra soro positivo para angiostrongilíase, com as respectivas

concentrações 0,5µg (esquerda) e 1µg (direita): 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 –

Fasciola hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara

canis.

Nove bandas dos diferentes parasitos foram reconhecidas por Western Blot,

recortadas dos géis de poliacrilamida e submetidas à digestão por tripsina para

identificação por espectrometria de massas. (Fig.19)

Na região de 52kDa todos os parasitos testados apresentaram alguma proteína

de mesma massa molecular. F. hepatica e H. diminuta compartilharam uma região

logo acima de 52kDa, assim como proteínas de baixo peso molecular,

aproximadamente 15kDa.

Figura 19: Gel unidimensional de poliacrilamida mostrando as bandas compartilhadas

com o soro positivo para Angiostrongilíases, que foram recortadas e submetidas a

espectrometria de massas. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 –

Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.

41

Quando os alergenos foram testados, o antígeno de amendoim apresentou

compartilhamento na região acima da banda de 52kDa, na região de 38kDa mostrando

duas bandas de maior intensidade, e também duas bandas entre as regiões de 24 e

31kDa. O antígeno de morango apresentou reconhecimento na região de 52kDa,

assim como o antígeno de tomate onde pode-se visualizar reconhecimento na mesma

região. (Fig. 20)

Figura 20: Western Blot mostrando a reatividade cruzada utilizando antígenos dos

alergenos contra soro positivo para Angiostrongilíases. A – amendoim; B – morango; C

– tomate; D – pólen.

Figura 21: Gel unidimensional mostrando as bandas compartilhadas pelo soro de

Angiostrongilíases que foram recortadas e submetidas a espectrometria de massas. A

– antígeno de amendoim; B – antígeno de morango; C – antígeno de tomate; D –

antígeno de pólen.

42

Cinco bandas do alergeno amendoim foram comparadas com o Western Blot,

recortadas do gel de poliacrilamida e submetidas à digestão por tripsina para serem

identificadas por espectrometria de massas. (Fig. 21)

Portanto, nove bandas dos parasitos e cinco bandas dos alergenos foram

recortadas dos géis e submetidas ao espectrômetro de massas, totalizando quatorze

bandas. Na tabela 2 se encontra um quadro resumo das bandas e dos parasitos

correspondentes.

Tabela 2: Resumo das bandas reconhecidas pelos parasitos e alergeno

amendoim quando em contato com soro positivo para Angiostrongilíases.

Bandas F. hepatica A. lumbricoides H. diminuta T. canis Amendoim

Entre 76 e 52kDa X X X

52kDa X X X X

38kDa X XX

Abaixo de 17kDa X X

Entre 31 e 24 kDa XX

Na eletroforese bidimensional e Western Blot utilizando antígenos dos

parasitos A. cantonensis, F. hepatica, A. lumbricoides, H. diminuta e T. canis, somente

as regiões ácidas foram reconhecidas pelo soro positivo de Angiostrongylus spp. com

maior evidência. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana

de nitrocelulose e todos os extratos protéicos submetidos ao mesmo soro positivo para

a Angiostrongilíase cerebral. (Fig. 22, 23, 24, 25 e 26)

Figura 22: Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Toxocara canis reagindo

contra soro positivo para Angiostrongilíase, sendo a região ácida a mais reconhecida

pelo soro.

43

Figura 23: Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Angiostrongylus cantonensis

reagindo contra soro positivo para Angiostrongilíase, sendo a região ácida a mais

reconhecida pelo soro.

Figura 24: Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Ascaris lumbricoides reagindo

contra soro positivo para Angiostrongilíase, sendo a região ácida a mais reconhecida

pelo soro.

44

Figura 25: Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Fasciola hepatica reagindo

contra soro positivo para Angiostrongilíases, sendo a região ácida a mais reconhecida

pelo soro.

Figura 26: Western Blot utilizando 30µg de antígeno de Hymenolepis diminuta

reagindo contra soro positivo para Angiostrongilíases, sendo a região ácida a mais

reconhecida pelo soro.

Utilizando antígenos dos 4 tipos de alergenos contra soro negativo para

Angiostrongilíases, foi possível observar componentes reconhecidos no antígeno do

morango nas regiões entre 102 e 76kDa, entre 76 e 52 kDa e 24kDa. (Fig. 27). Já

utilizando os mesmos antígenos contra soro positivo para angiostrongilíase, houve

reconhecimento intenso com o amendoim nas regiões 102 e 52kDa, 38kDa, entre 31 e

24kDa e uma forte banda abaixo de 24kDa. (Fig. 28)

45

Figura 27: Western Blot utilizando 5µg antígeno dos diferentes alergenos contra soro

negativo para Angiostrongilíases. A – antígeno de amendoim; B – antígeno de

morango; C – antígeno de tomate; D – antígeno de pólen.

Figura 28: Western Blot utilizando 5µg antígeno dos diferentes alergenos contra soro

positivo para Angiostrongilíases. A – antígeno de amendoim; B – antígeno de

morango; C – antígeno de tomate; D – antígeno de pólen.

A fim de se testar a memória imunológica de cada paciente, assim como a

reatividade dos diferentes soros, foi realizada eletroforese unidimensional e Western

blot utilizando antígenos dos diferentes parasitos, porém com diferentes soros

positivos para as Angiostrongilíases, mostrando a reatividade cruzada em regiões e

intensidades diferentes. (Fig.29 e 30)

46

Figura 29: Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra soro

positivo (1577) para A.costaricensis. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola

hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.

Figura 30: Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra soro

positivo (1558) para A.costaricensis. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola

hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.

Após a eletroforese unidimensional utilizando 5µg de cada antígeno, o gel

obtido foi submetido a Western blot contra soro negativo para Angiostrongilíases. Na

figura 31, bandas dos parasitos foram reconhecidas em várias regiões, sendo mais

evidente na região de 52kDa, o mesmo não ocorreu com o antígeno de T. canis, onde

nenhuma banda foi reconhecida (canaleta 5).

47

Figura 31: Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra soro

negativo para Angiostrongilíases. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola

hepatica; 3 – Ascaris lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.

Para análise de reatividade cruzada entre antígeno de amendoim e diferentes

soros positivos para Angiostrongilíases, experimentos de Western-blot foram realizado

(Fig. 32). Cerca de 50µg de antígeno de amendoim e soro de cada paciente positivo

foram utilizados. Cada soro foi adicionado a uma canaleta e a revelação da reação foi

feita através de incubação com DAB (diaminobenzidina) e adição do substrato da

enzima, peróxido de hidrogênio 0,015% em PBS. Pode-se notar que as regiões de

64kDa e região abaixo de 19kDa, foram as que demonstraram mais reação cruzada.

Figura 32: Western Blot utilizando 50µg de antígeno de amendoim e 15 diferentes

soros positivos para Angiostrongilíases.

48

5.8 Espectrometria de massas e identificação de proteínas

A partir de nove componentes provenientes dos géis contendo antígenos dos

parasitos e 5 componentes provenientes dos géis de alergenos, quatorze bandas

foram reconhecidas. Destas, onze diferentes proteínas foram identificadas utilizando o

programa MASCOT (tabela 3). Os peptídeos obtidos a partir das bandas 4, 9, 10, 11

não apresentaram homologia com as proteínas depositadas no banco de dados

utilizados para a pesquisa.

Na banda 1, antígeno de H. diminuta foram encontradas as proteínas

Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase e Proteína de Choque Térmico 70 (HSP70). Na

banda 2, antígeno de H. diminuta foram encontradas as proteínas Hipotética

DAPPUDRAFT e Chaperonina 5 60 kDa. Na banda 3, antígeno de F. hepatica foi

encontrada a proteína HSP70. Na banda 5, antígeno de H. diminuta foi encontrada a

proteína Gliceraldeído-3-Fosfato-Desidrogenase. Na banda 6, antígeno de F. hepatica

foi encontrada a proteína Cadeia A sigma classe GST. Na banda 7, antígeno de A.

lumbricoides foram encontradas as proteínas Glucose-6-Fosfato Isomerase, Piruvato

Desidrogenase subunidade E1 e Glutamato Desidrogenase 2. Na banda 8, antígeno

de amendoim foi encontrada a proteína arachin Ahy-1. Nas bandas 12, 13 e 14,

antígeno de amendoim, foram encontradas as proteína Full=Allergen Ara h 1 clone

P41B , proteína Gly1 e Piruvato desidrogenase subunidade E1. Cada distância

percorrida pela banda no gel foi medida a partir do ponto de partida de migração

correspondente ao reconhecimento destas bandas no Western Blot pelo soro positivo

para Angiostrongilíases e está detalhada na tabela 4.

Foram utilizados como parâmetros de escolha de peptídeos aqueles com os três

maiores scores, ou então aquelas proteínas que continham peptídeo único.

49

Tabela 3: – Identificação de proteínas que foram recortadas dos géis de eletroforese

unidimensional, submetidas a digestão por tripsina e analisadas por espectrometria de

massas.

Bandas Sequência do Peptídeo Nome da proteína (massa) Organismo Score

Banda Y-P (HD) 1 K.FVCAAFPSACGK.T Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase (55577) Echinococcus multilocularis 411

K.VINNWPCNPEK.T

R.RPEGIPLVYEAR.T

R.LIMSFGSGYGGNSLLGK.K

R.AINPEAGFFGVAPGTNHK.T

K.WEDPAGVPVSVFMFGGR.R

K.RNTTIPTK.Q Proteína de Choque Térmico 70 - HSP70 (72851) Echinococcus granulosus 370

R.TTPSYVAFTDTER.L

K.NQVAMNPTNTVFDAK.R

K.STAGDTHLGGEDFDSR.L

R.IINEPTAAAIAYGLDKK.V

Banda P (HD) 2 R.ILGLGDLGAYGMGIPVGK.L Proteína Hipotética DAPPUDRAFT (304467) Daphnia pulex 100

K.LVIEVAQKTSDLAGDGTTTATVLAR.A Chaperonina 5 60 kDa (57684) Rhodopirellula baltica SH1 87

Banda Y-P (FA) 3 R.ARFEELNADLFR.S Proteína de Choque Térmico 70 - HSP70 (70951) Fasciola gigantica 399

R.TTPSYVAFTDTER.L

R.QATKDAGAISGLNVLR.I

R.IINEPTAAAIAYGLDK.K

K.VTDAVVTVPAYFNDSQR.Q

K.SINPDEAVAYGAAVQAAILSGDK.S

Banda P (FA) 4 QUERATINA

Banda B (HD) 5 R.TAAQNIIPASTGAAK.A Gliceraldeído-3-Fosfato-Desidrogenase (36298) Spirometra erinaceieuropaei 67

Banda B (FA) 6 R.VPLLDVTGPDGK.L Cadeia A Sigma Classe GST (24690) Fasciola Hepatica 183

K.MMGETDEEYYLIER.I

Banda P (AS) 7 K.HFVALSTNGPK.V Glucose-6-Fosfato Isomerase (64225) Ascaris suum 420

K.LLEGASLVDEHFLK.A

K.TFTTQETITNAESAK.E

R.FAAYFQQGDMESNGK.F

K.FSLQLDTADGPILFDYSK.N

R.NVSDKPITVDGQNVTADVNK.V

K.IINELEGIFEGAGWNVIK.V Piruvato Desidrogenase subunidade E1 (99948) Escherichia coli O157:H7 str. EDL933 233

K.DYGVGSDVYSVTSFTELAR.D

K.YPETAALVADWTDEQIWALNR.G

K.VQIEPNSELLSR.T Glutamato Desidrogenase 2 (55726) Ascaris suum 171

K.VIAEAANGPTTPAAEK.I

R.TGITSEEEIVSSALEYSMQR.S

Banda B (AM) 8 K.TANELNLLILR.W arachin Ahy-1 (61810) Arachis hypogaea 1146

R.SPDIYNPQAGSLK.T

R.QQPEENACQFQR.L

 R.FNLAGNHEQEFLR.Y

R.GENESDEQGAIVTVR.G

R.RFNLAGNHEQEFLR.Y

R.FQGQDQSQQQQDSHQK.V

50

Bandas Sequência do Peptídeo Nome da proteína (massa) Organismo Score

R.RPFYSNAPQEIFIQQGR.G

R.QILQNLRGENESDEQGAIVTVR.G

R.GYFGLIFPGCPSTYEEPAQQGR.R

R.IESEGGYIETWNPNNQEFECAGVALSR.L

R.IESEGGYIETWNPNNQEFECAGVALSR.L

R.AGQEQENEGGNIFSGFTPEFLAQAFQVDDR.Q

Banda B (TX) 9 nada

Banda P (TX) 10 nada

Banda L-V (AM) 11 nada

Banda P (AM) 12 R.EREEDWR.Q Full=Allergen Ara h 1, clone P41B (71701) Arachis hypogaea 1735

K.LFEVKPDKK.N

K.GTGNLELVAVR.K

R.NNPFYFPSR.R

R.SSENNEGVIVK.V

R.QFQNLQNHR.I

K.SFNLDEGHALR.I

R.GRQPGDYDDDR.R

K.VSKEHVEELTK.H

K.EGALMLPHFNSK.A

K.DLAFPGSGEQVEK.L

R.IPSGFISYILNR.H

R.KSFNLDEGHALR.I

R.EGEQEWGTPGSHVR.E

R.VLLEENAGGEQEER.G

K.GSEEEGDITNPINLR.E

R.IVQIEAKPNTLVLPK.H

R.NTLEAAFNAEFNEIR.R

K.KGSEEEGDITNPINLR.E

R.IFLAGDKDNVIDQIEK.Q

R.EEEEDEDEEEEGSNR.E

R.NTLEAAFNAEFNEIRR.V

R.REEEEDEDEEEEGSNR.E

K.NPQLQDLDMMLTCVEIK.E

K.ISMPVNTPGQFEDFFPASSR.D

Banda B (AM) 13 R.QQPEENACQFQR.L Gly1 (60754)  Arachis hypogaea   413

R.FNLAGNHEQEFLR.Y

R.GENESEEEGAIVTVK.G

R.RPFYSNAPQEIFIQQGR.G

R.GYFGLIFPGCPSTYEEPAQQGR.R

R.AGQEEENEGGNIFSGFTPEFLAQAFQVDDR.Q

Banda V-L (AM) 14 K.IINELEGIFEGAGWNVIK.V Piruvato Desidrogenase subunidade E1 (99948 ) Escherichia coli O157:H7 str. EDL933 297

K.LIQLMNETVDGDYQTFK.S

K.DYGVGSDVYSVTSFTELAR.D

51

Tabela 4: Distância percorrida pela banda no gel de poliacrilamida a partir do ponto de

partida de migração do gel, correspondente ao reconhecimento destas bandas no

Western Blot pelo soro positivo para Angiostrongilíases.

Bandas Distância da banda

1 2 cm

2 2,7 cm

3 2 cm

4 2,7 cm

5 5,5 cm

6 5,5 cm

7 2,7 cm

8 4 cm

9 3,7 cm

10 2,7 cm

11 4,9 cm

12 2,3 cm

13 4 cm

14 5 cm

52

5.9 Reconhecimento de HSPs

Durante a identificação das proteínas, foram identificadas proteínas de choque

térmico (HSP70) em Hymenolepis diminuta e Fasciola hepatica. A fim de se verificar a

presença de HSPs na região de reconhecimento pelo anticorpo foi feito eletroforese

unidimensional e Western Blot utilizando diferentes concentrações de antígenos de

todos os parasitos reagindo contra anti-HSP70. Na figura 33, onde foi utilizado 5µg de

antígeno podemos visualizar o reconhecimento do extrato protéico de A. cantonensis

em uma concentração em quase todas as regiões, sendo bem evidente entre as

regiões de 64 e 82kDa, onde HSP70 se encontra. Já na figura 34, utilizando 10µg de

antígeno o reconhecimento de A.cantonensis se manteve, porém com mais evidência,

compreendendo todos os pesos moleculares. Também foi observado reconhecimento

de F. hepatica e T. canis entre as regiões de 64 e 82kDa.

Figura 33: Western Blot utilizando 5µg de antígeno de todos parasitos contra anti -

HSP70. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris

lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.

53

Figura 34: Western Blot utilizando 10µg de antígeno de todos parasitos contra anti -

HSP70. 1 – Angiostrongylus cantonensis; 2 – Fasciola hepatica; 3 – Ascaris

lumbricoides; 4 – Hymenolepis diminuta; 5 – Toxocara canis.

54

6. DISCUSSÃO

A dificuldade no diagnóstico das angiostrongilíases, abdominal e cerebral, se

deve ao fato de não ocorrer eliminação de formas parasitárias (ovos/larvas) nas fezes,

portanto, testes moleculares se tornam essenciais para elaboração de diagnósticos

para essas parasitoses. O grande desafio encontrado nos testes moleculares é a

busca por especificidade. A interação antígeno-anticorpo, quando consideramos

epitopos e sequências hipervariáveis das imunoglobulinas, é tida como 100%

específica, ou seja, determinado epitopo somente se liga a determinada sequência do

anticorpo. Porém, epitopos antigênicos podem ser compartilhados entre diferentes

organismos o que produz reações cruzadas reduzindo a especificidade de testes

imunodiagnósticos. Muitos relatos na literatura já descreveram essa reatividade,

porém são poucos os estudos que identificam e analisam detalhadamente estas

moléculas compartilhadas.

A reatividade cruzada entre A. cantonensis e A. costaricensis com outros

helmintos já foi relatada em ensaios de detecção de anticorpos em indivíduos

infectados com diversos parasitos. Chen e colaboradores (2011) relataram essa

reação cruzada com Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Toxoplasma gondii,

Schistosoma japonicum, Paragonimus westemani, Clonorchis sinensis, Echinococcus

granulosus, Spirometra erinacei, Taenia solium. Vitta e colaboradores (2010)

demonstraram reatividade cruzada com Gnathostoma sp, Wuchereria bancrofti,

Paragonimus westermani, Opisthorchis viverrini. Dekumyoy e colaboradores (2000)

obtiveram em seus experimentos casos de reatividade cruzada com Strongyloides

spp., Toxocara spp., além de outros já citados. Nuamtanong e colaboradores (1996)

demonstraram reatividade cruzada com Trichinella spiralis, Trichuris spp. e

Opisthorchis spp. Eamsobhana e colaboradores (1998) mostraram reatividade cruzada

entre o extrato bruto de A. cantonensis com Gnathostoma spinigerum, um parasito que

causa patologia clinicamente semelhante ao que acontece com a infecção humana por

A. cantonensis. Além disso, co-infecções por helmintos em humanos é comum em

regiões tropicais no mundo todo, onde a transmissão por geo-helmintos muitas vezes

ocorre simultaneamente. (Buck et al, 1978, Petney & Andrews, 1998) Geiger, e

colaboradores (2011), estudaram a relação do parasito Necator americanus e a co-

infecção por helmintos, demonstrando que a co-infecção crônica causada por

espécies de nematódeos e trematódeos consideravelmente altera a resposta imune a

antígenos brutos de ancilostomídeos.

Os testes imunológicos e moleculares para a detecção de anticorpos provaram

ser úteis para estudos epidemiológicos por um longo período de tempo. (Agudelo-

55

Florez et al, 2009; Eamsobhana & Yong, 2009; Nkouawa et al, 2010; Chen et al,

2011). No entanto, estes métodos possuem limitações na medida em que não se torna

possível detectar várias infecções parasitárias aplicando apenas uma técnica.

Strongyloides spp. e Ascaris lumbricoides, por exemplo, são parasitos disseminados

no mundo inteiro, onde milhões de pessoas se encontram infectadas, e especialmente

no caso das estrongiloidíases onde grande parte dos casos são assintomáticos.

Portanto, muitas pessoas possuem anticorpos contra esses helmintos. Este dado se

revela um problema quando testes de padronização de antígenos são feitos, e

indivíduos que já possuem anticorpos para determinadas parasitoses são ditos como

indivíduos com soro negativo.

Chen e colaboradores (2012) desenvolveram uma metodologia baseada em

microarranjo de uma plataforma para triagem populacional de parasitoses como

cisticercose, triquinelose, paragonimíases, esparganoses e angiostrongilíases,

consideradas doenças tropicais, e compararam com teste de ELISA tradicional. Os

resultados indicaram que os diferentes parasitos provavelmente possuem antígenos

específicos para o diagnóstico, portanto, eles podem ser utilizados para a detecção

específica e diferencial. Por exemplo, proteínas do cisticerco de Taenia solium ou de

Cysticercus cellulosae com peso molecular de 100,95 ou 26kDa podem ser utilizadas

no teste confirmatório de casos de neurocisticercose (Chen et al, 2012). Já o antígeno

de 98kDa, seria um candidato para o uso no diagnóstico das Angiostrongilíases.

Porém, se sabe que esses antígenos específicos se tornam cada vez mais difíceis de

serem detectados a medida que estudos de reatividade cruzada crescem e

demosntram o compartilhamento de moléculas.

Lescano e colaboradores (2012), demonstraram a resposta humoral de ratos

infectados com Toxocara canis, e co-infectados com Ascaris suum, Taenia crassiceps,

Schistosoma mansoni, Strongyloides venezuelensis ou Toxoplasma gondii.,

demonstrando reatividade cruzada entre T. canis e A. suum. Lynch e colaboradores (

1988), mostrou essa mesma reatividade cruzada ocorrendo com humanos na

Venezuela.

No presente estudo, objetivou-se estudar a reatividade cruzada e a

identificação das moléculas compartilhadas entre A. cantonensis com Strongyloides

spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta e Toxocara canis,

assim como os alergenos amendoim, morango, tomate e pólen. Para que fosse

atingida uma maior variedade de grupos taxonômicos, os parasitos escolhidos para o

teste da reatividade cruzada abrangem cestódeos, trematódeos e nematódeos.

Inicialmente, se tentou coletar larvas de Strongyloides spp., provenientes de

ratazanas naturalmente infectadas, a fim de se obter vermes adultos para a extração

56

de antígenos. Algumas ratazanas foram capturadas e suas fezes processadas e

submetidas aos métodos de sedimentação espontânea e método de Baerman

(Baermann, 1917). A análise do material fecal dessas ratazanas, por microscópio

óptico, mostrou a variedade de organismos que podem parasitar um único indivíduo. O

poliparasitismo vinculado a co-infecção parasitária pode ser um dos fatores que

desencadeiam resposta de reatividade cruzada, como já visto em trabalhos citados

anteriormente.

Nas análises das fezes obtidas, se observou larvas de A. cantonensis e das

artérias pulmonares da ratazana vermes do parasito. Esta descoberta é de grande

importância para saúde pública no país, já que não havia sido relatado anteriormente

infecções por A. cantonensis no Rio Grande do Sul. Carvalho e colaboradores (2012)

investigaram a presença de A. cantonensis em portos da costa brasileira, inclusive o

porto de Rio Grande, onde não foi encontrado nenhum caso de hospedeiro

intermediário infectado. Até então, dois casos de doença humana haviam sido

relatados (Caldeira et al, 2007; Lima et al, 2009) e mais quatro casos de hospedeiros

intermediários contendo o parasito. (Teles et al, 1997; Neuhauss et al, 2007; Simões et

al, 2011; Maldonado et al, 2010; Moreira et al, 2012). Estes dados se tornam muito

importantes porque demonstram a expansão da área de ocorrência, agora atingindo o

extremo sul do país.

Os parâmetros utilizados para identificação das larvas de A.cantonensis não se

aplicam as características das larvas de Strongyloides spp. e ancilostomídeos. Estes

dois últimos parasitos possuem fases larvais distintas até o desenvolvimento dos

vermes adultos. Essas fases possuem muitas semelhanças entre as duas espécies, e

detalhes minuciosos que discriminam uma da outra, por exemplo: larvas rabditóides

(L1) com esôfago rabditóide curto em Strongyloides spp. e longo em ancilostomídeos,

e as larvas filarióides (L3) infectantes com cauda afilada em ancilostomídeos e

bifurcada em Strongyloides spp. (Rey, 1991). O tempo de desenvolvimento larval é

crucial na identificação de ambas as espécies uma vez que podem apresentar

características morfológicas semelhantes. Apesar de estas características

diferenciarem as espécies, a discriminação de cada estágio larval é muito complexa.

Durante a eletroforese unidimensional, bidimensional e Western-blot foi

possível identificar spots imunogênicos na região ácida dos géis de A. cantonensis, F.

hepatica, A. lumbricoides, H. diminuta e T. canis. Morassuti et al, 2011 isolaram e

identificaram as proteínas encontradas na região de 31kDa de extrato bruto de A.

cantonensis, e que interessantemente também se encontravam nesta mesma região

ácida.

Muito além das moléculas que podem ser compartilhadas por organismos

57

parasitos que conferem reatividade cruzada, estão as moléculas que também

desencadeiam uma resposta de hipersensibilidade, tais como alergenos, portanto

também foram utilizados antígenos de amendoim, morango, tomate e pólen. Todos os

processos envolvendo os diferentes antígenos foram realizados utilizando diferentes

concentrações de antígenos para titulação do mesmo aplicado ao gel. Muitos testes de

diagnóstico quando desenvolvidos, não levam em consideração o aspecto de

concentração de antígenos utlizado e acabam sendo específicos para determinado

antígeno. No entanto, quando são testados com diferentes antígenos não

relacionados, como, por exemplo, alergenos, acabam demonstrando o mesmo

reconhecimento. Portanto, o que antes era específico para uma parasitose, na

verdade é uma proteína, ou banda compartilhada por outros helmintos ou mesmo

outra molécula que gera reação imunológica.

No primeiro teste de eletroforese unidimensional utilizando extrato de todos os

parasitos, foi possível visualizar muitas bandas se concentrando na mesma região,

com pesos moleculares similares. Portanto, essas bandas foram incubadas com soro

positivo para Angiostrongilíases através de Western Blot, para se identificar quais

seriam compartilhadas com Angiostrongylus. spp. Praticamente todas as regiões dos

diferentes parasitos foram reconhecidas pelo soro; o que já se esperava, tendo em

vista que organismos geneticamente e evolutivamente mais relacionados

compartilham epitopos idênticos e que, portanto compartilham algumas moléculas

imunogênicas (Kuby, 2008). Este reconhecimento inespecífico pode gerar resultados

falsos e dificultar o diagnóstico. As concentrações dos antígenos foram modificadas ao

longo dos testes, a fim de se testar até que medida tal antígeno era realmente

reconhecido por determinado anticorpo, ou então o simples fato de haver acúmulo de

proteínas seria o suficiente para haver reconhecimento. A diversidade de antígenos

que cada indivíduo entra em contato durante a vida seja viral, bacteriano, parasitário

ou por alergenos é muito grande e variada, até mesmo a diversidade genética de cada

população humana pode influenciar, já que diferentes regiões podem ter variações nas

suas respostas imunológicas. Além disso, a memória imunológica de cada indivíduo

varia muito, o que pode ser imunogênico para um organismo, pode não ser para outro.

Isto pode ser observado nos resultados obtidos nas figuras 27, 28, 29, 30, 31 e 32.

Foram recortadas dos géis quatorze bandas, onde foi possível identificar onze

diferentes proteínas dos parasitos e alergenos reconhecidas pelo soro das

Angiostrongilíases, confirmando assim a hipótese do compartilhamento de antígenos.

Sabendo que as informações relacionadas à sequência de genes de A. cantonensis

são ainda muito limitadas, a identificação das respectivas proteínas foi baseada em

resultados para proteínas homólogas de organismos relacionados.

58

Das proteínas identificadas, proteína de choque térmico 70 (HSP70), Classe

sigma GST e proteína Full=Allergen Ara h 1, destacam-se por já terem sido referidas

como imunogênicas.

HSP70 foi reconhecida na região de 52kDa no antígeno de F. hepatica, e

apresenta sequência de peptídeos iguais ao de Fasciola gigantica, um trematódeo do

mesmo gênero e que provavelmente possuem uma história evolutiva muito

semelhante. HSPs (heat shock proteins) são proteínas altamente conservadas ao

longo da evolução e estão presentes em ambos os organismos eucarióticos e

procarióticos. (Hartl & Hayer-Hartl, 2002). Essas proteínas são agrupadas em

diferentes famílias com base nas suas massas moleculares, e desempenham papel de

chaperonas, auxiliando no dobramento adequado de proteínas recém-sintetizadas.

Essa proteína tem sido também identificada em produtos de secreção e excreção de

muitos parasitos, incluindo A. cantonensis (Morassutti et al, 2011), além de ter sido

relatada na ativação de macrófagos, e de induzir a produção de citocinas pró-

inflamatórias durante infecção in-vitro por Trypanosoma carassi. (Oladiran & Belosevic,

2009). HSP70 também foi encontrada em soro de pacientes infectados com

Schistosoma mansoni, Echinococcus granulosos e T. carassi (Kanamura et al, 2002;

Ortonaet al, 2003; Oladiran & Belosevic, 2009), sugerindo que a HSP70 de A.

cantonensis também pode estar envolvido na estimulação imune, produção de

citocinas e patogênese como reportado em T. carassi.

A proteína GST classe sigma for reconhecida na região próxima de 17kDa, e

possui sequência de peptídeos igual ao de Fasciola hepatica. A análise de enzimas

purificadas de GSTs já foi identificada em vários parasitos, tais como Taenia solium

(Vibanco-Pérez et al, 1999), H. polygyrus (Brophy et al, 1994) e Fasciola hepatica

(Chemale et al, 2006). A identificação e caraterização destas enzimas se torna

importante no entendimento dos mecanismos de evasão do sistema imune dos

parasitos, já que estas proteínas possuem papel importante na defesa contra resposta

de estresse oxidativo. GSTs já foram selecionadas como alvos para o

imunodiagnóstico (Cheng et al, 2007), e uma GST de A. costaricensis foi identificada

como um potencial antígeno , podendo ser usada no diagnóstico de A. costaricensis

no Western-blot (Abraham et al, 2004) e também encontrada em A. cantonensis, mas

sem comprovação de ser uma proteína imunogênica. (Morassutti et al, 2011).

Proteína Full=Allergen Ara h 1 foi reconhecida na região de 52kDa do

amendoim e compartilha quase todos os peptídeos deste alergeno. O amendoim é um

dos alimentos que mais causam alergias no mundo todo. Apesar da severidade das

reações alérgicas que este alimento pode causar, e o aumento da prevalência dessa

alergia em crianças e adultos, ainda não há cura. (Sicherer & Sampson, 2007).

59

Bashir, et al 2002, através de experimento induzindo infecção parasitária de helmintos

em camundongos e alimento-os com amendoim, constataram que a infecção gerou

uma proteção contra a alergia causada pelo alimento, que envolveu mecanismos

imunorreguladores bloqueando IgE específicos do alergeno.

Tendo em vista a relação das infecções parasitárias com doenças alérgicas, os

resultados obtidos neste trabalho, através da identificação das proteínas

compartilhadas entre Angiostrongylus. Spp e amendoim são dados importantes para

fomentar uma melhor compreensão da alergenicidade de moléculas de helmintos.

Em conclusão, os dados deste trabalho reforçam a importância do

conhecimento detalhado da reatividade cruzada, demonstrando e identificando várias

proteínas de outros organismos que são reconhecidas pelos anticorpos de indivíduos

infectados com metastrongilídeos.

Quanto aos epitopos compartilhados entre diferentes organismos, outras

possibilidades de aproveitamento da reatividade cruzada permancem como

perspectivas: a) a remoção destes epitopos ou dos anticorpos que os reconhecem, na

busca de testes imunodiagnósticos mais específicos; b) a utilização de antígenos

heterólogos em situações onde determinado organismo é de difícil obtenção; c)

proteção cruzada como estratégia de vacinação. Estas perspectivas também

representam oportunidade para melhor conhecer, de forma geral, a interação parasito-

hospedeiro e as relações filogenéticas na diversidade dos seres vivos.

60

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69

APÊNDICE 1

First report of Angiostrongylus cantonensis in Porto Alegre, Rio Grande do Sul,

southern Brazil.

Bianca B. Cognato; Alessandra L. Morassutti; Ana Cristina Aramburu da Silva; Carlos

Graeff-Teixeira.

Laboratório de Biologia Parasitária da Faculdade de Biociências e Laboratório de

Parasitologia Molecular do Instituto de Pesquisas Biomédicas da Pontifícia

Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Av Ipiranga 6690, 90690-900

Porto Alegre RS, Brazil. Phone: +55 51 3320.3500 extention: 4144 Fax: +55 51

3320.3568

Angiostrongylus cantonensis is a lungworm found in rats (mainly Rattus norvegicus)

and the main etiological agent eosinophilic meningitis after accidental human infection.

Parasitological diagnosis is difficult because larvae are seldom found in cerebrospinal

fluid examinations, molecular methods are thus required. According to Wang et al

(2008) (1) more than 2820 cases have been reported in approximately 30 countries

most in Asia and the Pacific Islands. A. cantonensis infection has been increasingly

detected in travelers returning from endemic areas (2) and it is now considered a

growing food safety concern (3).

The laboratory isolation and identification of this parasite were reported for the first time

in Brazil in the state of Espirito Santo after eosinophilic meningitis was diagnosed in

two patients there (4), followed by the diagnosis in two patients in Pernambuco (5). A.

cantonensis larvae, worm or DNA have been detected in hosts from several locations

coastal Brazil, from Pará in the north to Santa Catarina in the south (6,7,8)

While trying to isolate larvae of Strongyloides ratti or S. venezuelensis in an

investigation of cross-reacting antigens to A. costaricensis one rat (R. norvegicus) was

70

captured in Vila Fátima, Porto Alegre, Brazil (30° 2' 53.99" S 51° 9' 30.69" W). It was

kept alive for the collection of larvae from feces. The animal died a few hours after

capture and a necropsy was performed. The lungs showed several areas with white

hard consolidated lesions that were removed and analyzed under a stereomicroscope.

Eleven female and two male worms were found in the pulmonary arteries. They were

clarified with creosoto and mounted on slides for examination under an optical

microscope. The morphology of the male´s copulatory bursa (figure 1) and the average

lengths of the worms (females, 26.8 ± 2.41 cm; males, 20 ± 1,41 cm) were in

accordance with data from the literature (9). Real time polymerase chain reaction

demonstrated a similarity in cycle thresholds (CTs) between DNA sequences from the

worms (CT=12) and those from Akita strain of A. cantonensis (CT=8).

A. cantonensis probably entered Brazil on cargo ships from endemic areas carrying

infected rats or an intermediate host (10). Porto Alegre is a commercial port city on the

Guaíba River where ships deliver many products such as fertilizers, soybeans and salt

from many parts of the world including India, Egypt, China and other areas of Brazil.

Other Brazilian locations where the presence of A. cantonensis has been reported are

also in or adjacent to harbors indicating that dispersion of the nematode might be

occurring through rats on ships. Vila Fátima is approximately 11 km from the Guaíba

harbor, it is linked to the port by a stream, Arroio Dilúvio, that is also partially linked to

the wastepipe effluent system, which provides a natural habitat and pathway for rats.

Although raw mollusks are not typically consumed in Brazil, currently available data

indicate that sanitary education and epidemiological surveillance must be urgently

updated. The increasing global transit of persons and good is rapidly changing the

distribution pattern of infections agents such as A. cantonensis.

71

A50µm

50µmB

AA50µm

50µmB

50µm

50µmB

A

Adult worms detected in the pulmonary arteries of a rat in Porto Alegre, southern

Brazil. Ventral image (A) and drawing (B) of a male worm´s copulatory bursa, indicating

the bursal rays: ventral (VRs), ventrolateral (VLR), mediolateral (MLR), posterolateral

(PLR), externolateral (EDR), and dorsal (DR).

72

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