2009 - estudo morfométrico, evolutivo e filogeográfico nas espécies do gênero pterophyllum...
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL
E RECURSOS NATURAIS – PPGBTRN
Estudo morfométrico, evolutivo e filogeográfico nas espécies do gênero Pterophyllum, Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) da
Bacia Amazônica.
NATASHA VERDASCA MELICIANO
Manaus – AM Abril, 2009.
NATASHA VERDASCA MELICIANO
Financiamento: CT-Amazonia/CNPq (Processo No. 554057/2006-9) BECA (B/2006/01/BMP/09)
Estudo morfométrico, evolutivo e filogeográfico nas espécies do gênero Pterophyllum, Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) da Bacia
Amazônica.
ORIENTADOR: Dr. TOMAS HRBEK Co-orientador: Dra. Izeni Pires Farias
Dissertação apresentada ao Programa de Pós - Graduação em Biologia tropical e Recursos Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
Manaus – AM Abril, 2009.
I
FICHA CATALOGRÁFICA
SINOPSE
M522 Meliciano, Natasha Verdasca Estudo filogeográfico do gênero Pterophyllum, Heckel, 1840 (Cichlidae/Heroini) na Bacia Amazônica, utilizando o gene do citocromo b
e morfometria geométrica / Natasha Verdasca Meliciano.--- Manaus : [s.n.], 2008. xi, 71 f. : il. Dissertação (mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador : Tomas Hrbek Co-orientador : Izeni Pires Farias Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Pterophyllum – Filogeografia. 2. Pterophyllum – Morfometria. 3. Peixes - Amazônia. I. Título. CDD 19. ed. 597.5
SINOPSE
Neste trabalho foi desenvolvido, um estudo filogeográfico dos peixes do gênero
Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae) no contexto amazônico, utilizando como
ferramentas o gene mitocondrial do citocromo b e morfometria geométrica, buscando
entender como este grupo, com três espécies (P. scalare, P. altum e P. leopoldi), está
atualmente distribuído e quais são os prováveis processos evolutivos que provocaram
ou que mantêm a disposição genética e morfométrica encontrada nestes peixes ao
longo da bacia amazônica. Como resultado foi visto que a delimitação taxonômica
molecular condiz com a validação das espécies existentes para o gênero e está,
também, refletida na diferencição morfométrica observada. O processo evolutivo da
espécie de mais ampla distribuição, P. scalare, é resultante de antigos eventos de
fragmentação seguidos por episódios de expansão geográfica e populacional, em
conjunto com processos de fluxo gênico associado às planícies de inundação e
limitado pela composição química das águas, podendo ser visto tanto no perfil
molecular quanto no morfológico destes peixes. Foi evidenciado, também, variações
morfométricas nas regiões de simpatria entre duas espécie do gênero (P. altum e P.
scalare), diferente do que foi visto nas regiões de ocorrência de somente uma das
duas espécies. Contudo é necessário identificar o valor ecológico e evolutivo das
variaçãoes morfométricas observadas nas regiões de simpátria e de ambientes
aquáticos distintos.
II
Aos meus queridos pais, Maria Fernanda Ferreira Verdasca Meliciano e Rogério Ruas dos Santos Meliciano. Às minhas amigas e irmãs, Vanessa Verdasca Meliciano e Priscilla Verdasca Meliciano.
III
AGRADECIMENTOS
Não só nesta trajetória, mas durante toda minha vida, gostaria de agradecer a Deus,
pois me presenteou com a vida, força e coragem, reafirmando minha fé perdida.
Agradeço a minha família pelo apoio, compreensão, carinho e paciência
demonstrado, independente de minhas atitudes. Maior gratidão devo aos meus pais, Rogério
Ruas dos Santos Meliciano e Maria Fernanda Ferreira Verdasca Meliciano, pela palavra
sempre oportuna. À minha mãe dedico gratidão adicional por ter apoiado este sonho, mesmo
quando esteve com sua saúde frágil. Agradeço também as minhas duas irmãs, Vanessa
Verdasca Meliciano e Priscilla Verdasca Meliciano, que me deram forte base familiar.
Ao meu querido Olavo, agradeço pela ajuda neste projeto, pelo carinho, apoio e
compreensão, estando sempre presente, ao meu lado, mesmo fisicamente distante.
Agradeço aos meus antigos amigos e aos novos, que conquistei nesta jornada,
especialmente: Annelyse, Cleiton, Murilo, Marcelo (Brasa), Sílvia, Renato, Carlos (Kaká),
Pedro (Peter), Rafael (Narck), Rafael (Rafolia), Marco, Gisele, Michelly, Rafael
(Angrizzane), Frida e Rafinha, por terem assumido o papel de família postiça.
Agradeço a todas as pessoas que me ajudaram no desenvolvimento deste trabalho,
que agora as considero como amigas e colegas de ofício. A meu ver, realmente praticaram
ciência, democratizando o conhecimento e trabalhando em equipe.
Sou grata aos meus amigos de trabalho no laboratório, pelo ótimo ambiente que
promoveram e pelos ensinamentos que melhoraram decisivamente minha pesquisa: Adam,
Andréia, Áureo, Carlinha, Cleiton, Maria da Conceição, Daniel, Eduardo, Edvaldo, Fábio,
Kelmer, Liza, Mário, Marina, Pedro Sena, Pedro Ivo, Rafinha, Themis, Valéria, Waleska e
Will, todos unidos formam um exemplo de equipe.
Agradeço aos docentes Dr. Lúcia Rappi-Py Daniel, Dr. Eliana Feldberg e Dr. Jansen
Zuanon, pela prestatividade e por contribuir cientificamente para este trabalho. Agradeço a
equipe da RDS Piagaçú – Purus, pela ajuda durante algumas coletas. Tenho gratidão a muitas
outras pessoas que me assistiram durante as coletas deste trabalho, que mesmo sem saber o
significado deste projeto me ajudaram muito sem interesse algum: Senhor Carlos, Senhora
Ray e família, Senhora Iolanda, Senhora Rosa e família, Senhor Elder Batista, Senhor Fábio,
Senhora Raimunda Farias e família, “Serelepe” e ao Senhor Xavier, Senhora Raimunda e
família Nogueira.
IV
Agradeço, especialmente, meu orientador o professor Dr. Tomas Hrbek, por acreditar
em mim, por acompanhar e contribuir significativamente no meu desenvolvimento
acadêmico. O Dr. Tomas me aceitou sem ao menos me conhecer, me orientou com liberdade
e exigência ao mesmo tempo. Respeitou-me como indivíduo e reconheceu-me como
pesquisador, permitindo o meu desenvolvimento científico e a realização deste sonho. É com
muita admiração, orgulho e respeito que demonstro o meu sincero obrigado.
Com muito carinho agradeço minha co-orientadora, a professora Dr. Izeni Pires
Farias, pela confiança, por estar sempre presente e pelos ensinamentos de Genética e Biologia
Evolutiva. Mesmo sendo minha co-orientadora, esteve sempre muito próxima, me
acompanhando de perto, estando disposta sempre que necessário.
Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais
do convênio INPA/UFAM, especialmente ao curso de Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva (GCBEV/INPA), pela oportunidade de mestrado. Agradeço aos integrantes
docentes do curso GCBEV/INPA, pelos conhecimentos adicionados durante o mestrado.
Agradeço a Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pelo espaço utilizado do
Laboratório de Genética Animal (LEGAL), sob a coordenação da Professora Dr. Izeni Pires
Farias.
Agradeço a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior)
pela bolsa de estudos oferecida. Ao IEB (Instituto Internacional de Educação no Brasil) /
programa BECA e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico) pelo financiamento deste trabalho, sob os processos de número:
B/2006/01/BMP/09 e 554057/2006-9, respectivamente.
Muito Obrigado!!!
V
RESUMO
Este trabalho foi desenvolvido em dois capítulos: no primeiro foi abordado o enfoque
genético e no segundo foi trabalhado o aspecto morfométrico dos peixes do gênero
Pterophyllum, amplamente distribuídos pela bacia amazônica, buscando entender os
prováveis processos históricos e atuais, que causaram ou que mantêm o padrão filogeográfico,
haplotípico e morfométrico, observados nestes peixes, utilizando como ferramentas o gene
mitocondrial do citocromo b e morfometria geométrica, aplicados no estudo de peixes
amostrados em quatorze localidades ao longo dos principais tributários Negro, Solimões e
Amazonas. Como resultado, foi visto que, mesmo existindo variação entre os morfotipos e a
distribuição espacial e a caracterização genética, os padrões morfométricos encontrados
apresentam forte relação com o grupo taxonômico delimitado molecularmente. Além disso,
ambas análises (molecular e morfométrica) concordaram com a identificação taxonômica
clássica efetuada para as três espécies validadas para o gênero. Em particular, na espécie P.
scalare foi possível observar a existência de uma complexa história filogeográfica, modelada
por processos antigos de fragmentação, seguidos por episódios de expansão geográfica,
juntamente com eventos de fluxo gênico e isolamento influenciados pela ampla distribuição
da espécie. Porém, não foi possível observar relação entre a distância geográfica e a
divergência genética e morfológica entre as localidades estudadas, onde se observou maior
variação genética e morfológica intralocal do que entre localidades distintas, resultado que
pode estar relacionado com as planícies de inundação amazônicas, que oferecem
intercomunição, permitindo fluxo gênico e a homogeneidade morfológica encontrada entre as
localidades amostradas. Alternativamente, a homogeineidade morfológica observada na
espécie P. scalare, em toda extenção coletada, também, pode ter explicações ecológicas
decorrentes da oferta de recursos e inexistência de espécies simpátricas, ao contrário das
regiões de simpatria entre P. scalare e P. altum, sugerindo a existência de plasticidade
fenotípica em P. scalare e que o padrão morfométrico encontrado nas regiões coletadas de P.
altum pode ser resultado da existência de P. scalare nas regiões de Santa Isabel e Boa Vista.
A distinta composição química e física das águas podem ter atuado na significante
diferenciação morfométrica e na estruturação genética populacional, sendo um fator limitante
para a dispersão destes peixes e promovendo diferenciação morfológica. Por outro lado, a
significante diferenciação morfométrica entre os diferentes habitats aquáticos pode ser
meramente resultante de acúmulo por deriva genética. Dessa maneira, é preciso identificar a
importância ecológica da variação morfométrica entre os diferentes ambientes para que se
tenha entendimento do valor adaptativo e evolutivo dessas variações morfológicas.
VI
ABSTRACT
This study was developed in two chapters: the first chapter focuses on genetic and the
second on morphometric aspects of the genus Pterophyllum, which is widely distributed in the
Amazon basin. The goal was to understand the probable historical and ongoing processes that
caused and maintain phylogeographic and morphometic patterns observed in this group of
fishes, using cytochrome b mitochondrial gene and geometric morphometric data from
fourteen localities along Negro, Solimões and Amazonas rivers. It was observed that even
existing significant varied morphotypes, the morphometric patterns showed a strong
relationship with the taxonomic group molecularly determined. Furthermore, both analysis
(molecular and morphometric) agree with classical taxonomical identification done for the
tree valid species in the Pterophyllum genus. In the P. scalare specie, a complex
phylogeographic history was found, resulting from ancient fragmentation events followed by
episodes of geographic expansion and restricted gene flow with isolation by distance.
Although the relation between geographic, genetic and morphological distances was not
significant in the studied area, it had higher genetic and morphological variation within
localities. This result may be attributed to the Amazon floodplain that offers
intercommunication, allowing gene flow and the morphologic homogeneity found in the
sampled locations. The morphologic homogeneity observed in P. scalare specie along the
sampled sites may be related with the ecological resource availability and the inexistence of
sympatric species, differing from regions with P. scalare and P. altum (Santa Isabel and Boa
Vista), suggesting the existence of phenotype plasticity in P. scalare and the morphometric
pattern found in P. altum may be a result of the presence of P. scalare. The distinct water
composition may have significantly influenced the morphometric differentiation and
population genetic structure and maybe a limiting factor for the dispersion of this fish. Put
differently the significant morphometric differentiation between habitats may be a
consequence of genetic drift accumulation. Thus, it is necessary to identify the ecological
importance of morphometric variation found between different environments for a complete
understanding of the adaptive and evolutionary value of these morphological variations.
VII
SUMÁRIO
FICHA CATALOGRÁFICA ................................................................................................. I
SINOPSE .................................................................................................................................. I
AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... III
RESUMO ................................................................................................................................. V
ABSTRACT .......................................................................................................................... VI
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... IX
LISTA DE GRÁFICOS .......................................................................................................... X
LISTA DE TABELAS .......................................................................................................... XI
I. Introdução Geral .................................................................................................................. 1
I.1. A Bacia Amazônica ............................................................................................................. 1
I.2. A família Cichlidae .............................................................................................................. 2
I.3. Aspectos evolutivos da família Cichlidae .......................................................................... 4
I.4. A Tribo Heroini ................................................................................................................... 6
I.5. O gênero Pterophyllum Heckel, 1840 ................................................................................ 7
CAPÍTULO 1 - “Filogenia e Filogeografia do gênero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amazônica, utilizando o gene do citocromo b”. .............. 11
1. Introdução ............................................................................................................................ 11 1.1. Objetivos ........................................................................................................ 14
1.1.1. Objetivo Geral ................................................................................................... 14 1.1.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 14
2. Material e Método ................................................................................................................ 15 2.1. Amostragem .................................................................................................. 15 2.2. Identificação Taxonômica .............................................................................. 16 2.3. Métodos Moleculares: Extração de DNA, Amplificação e Seqüenciamento ................................................................................................... 17 2.4. Análises Moleculares .................................................................................... 18
2.4.1. Alinhamento, Edição de seqüências e Análises de Composição Molecular ...... 18 2.4.2. Análises Moleculares ......................................................................................... 19
3. Resultados ............................................................................................................................. 23 3.1. Alinhamento, Edição de seqüências e Análise de Composição Molecular .............................................................................................................. 23
VIII
3.2. Análises Moleculares .................................................................................... 24
a) Análise Filogenética .......................................................................................... 24 b) Análise Filogeográfica ...................................................................................... 25 c) Análise genético - populacional e demográfica (por localidade) ............... 26
4. Discussão e Conclusão ......................................................................................................... 36 a) Análise de Composição Molecular ................................................................... 36 b) Análise Filogenética ......................................................................................... 36 c) Análise Filogeográfica ...................................................................................... 37 d) Análise genético - populacional e demográfica (por localidade) .................... 39
CAPÍTULO 2 - “Estudo da forma corporal de peixes do gênero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da bacia Amazônica, utilizando morfometria geométrica”. ..................................................................................................... 46
1. Introdução ............................................................................................................................ 46 1.1. Objetivos ........................................................................................................ 49
1.1.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 49 1.1.2. Objetivos Específicos .................................................................................... 49
2. Material e Método ................................................................................................................ 50 2.1. Amostragem .................................................................................................. 50 2.2. Identificação Taxonômica .............................................................................. 51 2.3. Métodos Moleculares: Extração de DNA, Amplificação, Seqüenciamento e Análises ................................................................................. 52 2.4. Métodos Morfométricos ................................................................................. 53
2.4. 1. Coleta de dados Morfométricos ........................................................................ 53 2.4.2. Demarcação de pontos anatômicos e Obtenção de dados morfométricos ........ 53
2.5. Análises Estatísticas ..................................................................................... 55
3. Resultados ............................................................................................................................. 57
4. Discussão e Conclusão ......................................................................................................... 65
II. Conclusão Geral ................................................................................................................ 70
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 72
ANEXOS ................................................................................................................................. 89
IX
LISTA DE FIGURAS
Introdução geral
Figura 1: Distribuição geográfica mundial da família Cichlidae............................................ 4
Figura 2: Pterophyllum scalare (Schultze, 1823)................................................................... 8
Figura 3: Pterophyllum altum (Pellegrin, 1903)...................................................................... 8
Figura 4: Pterophyllum leopoldi (Gosse, 1963)...................................................................... 9
Figura 5: Esquema da distribuição geográfica das espécies do gênero Pterophyllum......................10
Capítulo 1 – “Filogenia e Filogeografia do gênero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae /
Heroini) na Bacia Amazônica, utilizando o gene do citocromo b”
Figura 6: Mapa com a distribuição dos pontos amostrados................................................................ 16
Figura 7: Árvore de relacionamento de haplótipos – critério Máxima Verossimilhança (HKY85),
indicando os valores de boostrap acima de 60%.......................................................................... 29
Figura 8: Diagrama da rede haplotípica de clados hierarquizados por meio da análise NCA-
P.altum......................................................................................................................................... 31
Figura 9: Diagrama da rede haplotípica de clados hierarquizados por meio da análise NCA-
P.scalare....................................................................................................................................... 32
Capítulo 2 – “Estudo da forma corporal de peixes do gênero Pterophyllum Heckel, 1840
(Cichlidae / Heroini) ao longo da Bacia Amazônica, utilizando
morfometria geométrica”
Figura 10: Mapa com a distribuição dos pontos amostrados.......................................................... 51
Figura 11: Descrição esquemática de pontos anatômicos....................................................... 56
X
LISTA DE GRÁFICOS
Capítulo 1 – “Filogenia e Filogeografia do gênero Pterophylum Heckel, 1840
(Cichlidae / Heroini) na Bacia Amazônica, utilizando o gene do citocromo b
Gráfico 1: Composição percentual de bases............................................................................ 24
Gráfico 2: Relação entre a distância e as taxas de transição (ts) e transversão (tv)................. 24
Capítulo 2 – “Estudo da forma corporal de peixes do gênero Pterophyllum Heckel,
1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da Bacia Amazônica, utilizando
morfometria geométrica”
Gráfico 3: Distribuição dos haplótipos ao longo dos dois primeiros componentes principais
construídos com as variáveis morfométricas................................................................... 60
Gráfico 4: Distribuição das localidades amostradas ao longo dos dois primeiros
componentes principais construídos com as variáveis morfométricas............................ 60
Gráfico 5: Distribuição das localidades amostradas da espécie P. scalare (grupo Ptero 3)
ao longo dos dois primeiros componentes principais construídos com as variáveis
morfométricas.................................................................................................................. 64
Gráfico 6: Distribuição das populações amostradas da espécie P. scalare (grupo Ptero 3)
ao longo dos dois primeiros componentes principais construídos com as variáveis
morfométricas.................................................................................................................. 64
XI
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1 – “Filogenia e Filogeografia do gênero Pterophylum Heckel, 1840
(Cichlidae / Heroini) na Bacia Amazônica, utilizando o gene do citocromo b
Tabela 1: Resultado das análises do agrupamento dos clados hierarquizados para as espécies
P.altum e P.scalare, mostrando somente clados com permutações significativas (X2) para
estrutura geográfica (p < 0,05)..................................................................................................... 30
Tabela 2: Índices de diversidade genética, testes de neutralidade e de expansão populacional, onde
N = Nº amostral, S = N° Sítios Segregantes ou Polimórficos e NH = N° de haplótipos. Estão
representados os parâmetros populacionais de acordo com a localidade, espécie, agrupamento
filogenético formado e N > 5....................................................................................................... 33
Tabela 3: Análise de Variância Molecular (AMOVA), entre todas as localidades, com N > 5, nas
espéceis P.altum e P.scalare. É significativa a estrutura populacional nas duas espécies (P <
0,001)........................................................................................................................................... 34
Tabela 4: Comparações par a par dos valores de Fst (abaixo e cor preta) e Nm (acima e cor azul)
entre as localidades analisadas com N > 5 na espécie P.scalare............................................. 34
Tabela 5: Distância genética intralocalidade. Estão representados os parâmetros populacionais de
acordo com a localidade, espécie e agrupamento filogenético formado. O desvio padrão foi
estabelecido com base em 200 replicações de bootstrap......................................................... 35
Tabela 6: Distância genética entre localidades par a par, pertencentes à espécie P.scalare,
estabelecida com base em 200 replicações de bootstrap.............................................................. 35
Capítulo 2 – “Estudo da forma corporal de peixes do gênero Pterophyllum
Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da Bacia Amazônica, utilizando
morfometria geométrica”
Tabela 7: Pesos das variáveis morfométricas sobre os cinco primeiros componentes da análise de
componentes principais....................................................................................................... 59
Tabela 8: Pesos das variáveis morfométricas sobre os cinco primeiros componentes da análise de
componentes principais na espécie P. scalare (grupo Ptero 3)................................................ 63
1
I. Introdução Geral
I.1. A Bacia Amazônica
A região amazônica possui a maior bacia hidrográfica do mundo, com cerca
de 7 x 106 km2, abrangendo nove países ao longo de sua extensão (Brasil, Peru,
Bolívia, Colômbia, Equador, Venezuela, Suriname e Guianas). É formada,
principalmente pelo rio Amazonas e um conjunto de incontáveis outros rios e
igarapés, além de um complexo sistema de sub-bacias, tendo principal destaque: a
sub-bacia do Rio Negro com 750 000 km2 de área e a sub-bacia do rio Madeira com
1.300 000 km2 (Goulding, 1980, 1981; Santos; Ferreira, 1999). Em termos de
extensão, o rio Amazonas possui 6.518 km, só sendo ultrapassado pelo rio Nilo com
6.671 km, e sua largura varia entre 1.8 km (em Óbidos) até 20 km (na
desembocadura do rio Negro) (Santos; Ferreira, 1999).
Uma importante característica desta bacia consiste em uma alta pluviosidade
que é distribuída desigualmente ao longo do ano nas diferentes sub-regiões,
fazendo com que existam épocas de seca (chamada de verão) e chuvosas
(chamada de inverno), sendo que os afluentes da margem direita (como os rios:
Madeira, Tapajós e Xingu) não têm a mesma dinâmica de chuvas que os afluentes
da margem esquerda (como o rio Negro) (Sioli, 1984; Santos; Ferreira, 1999),
promovendo ciclos de cheia e vazante, que durante o inverno (cheia) compreendem
as regiões de planície e dão origem as florestas de inundação (“várzea” e “igapó”).
Dessa forma, o sistema da bacia amazônica é basicamente de origem fluvial onde o
sistema Solimões-Amazonas representa um coletor final de toda drenagem formada
por igarapés, riachos, córregos, várzeas e rios (Santos & Ferreira, 1999).
A natureza dos rios amazônicos é diferente entre si e isso se deve a
existência de características físicas e químicas distintas das águas, o que leva a
classificação dos rios em: rios de água branca, negra e clara (Sioli, 1984). A
diferença limnológicas entre as classes dos rios amazônicos está profundamente
relacionada às origens geológicas de cada tipo de água (Lundberg et al., 1998).
2
Geologicamente, a formação do sistema fluvial amazônico foi moldada por
profundas transformações que consistiram no surgimento da cadeia andina, na
interação dos escudos cristalinos das Guianas e do Brasil, no envolvimento de uma
planície sedimentar situada na região central e nos movimentos de invasão e
regressão das águas marinas. Dentre elas, a mais notável transformação geológica
ocorreu no Cenozóico quando os Andes emergiram formando uma importante
barreira com o oceano Pacífico, fazendo com que a comunicação existente entre o
sistema de rios da região amazônica e o oceano Pacífico fosse interrompida e um
novo mecanismo de drenagem foi estabelecido passando do sentido leste-oeste
para oeste-leste, desembocando no Atlântico (Lundberg et al., 1998). Essas
transformações geológicas não só moldaram o sistema amazônico, mas, também,
delimitaram toda distribuição fluvial na América do Sul (Lundberg et al., 1998; Albert
et al., 2006).
Dessa maneira, ao longo dos milhões de anos subseqüentes à elevação dos
Andes, o continente sulamericano tem sofrido grandes mudanças geológicas e
ambientais (Lundberg et al., 1998). O levantamento da cordilheira andina,
juntamente com outros fenômenos geológicos e variações sazonais ambientais
influenciaram os processos evolutivos e de diversificação de alguns grupos de
animais, principalmente, dos peixes (Albert et al., 2006), onde a família Cichlidae
merece destaque, por apresentar notória capacidade adaptativa e de diversificação
(Kocher, 2004; Turner, 2007).
I.2. A família Cichlidae
A família Cichlidae pertence à ordem Perciformes e representa um dos mais
diversificados grupo de peixes de água doce do mundo. Com 1.300 espécies (de um
número maior e estimado de 2000) é considerada a quarta família com o maior
número de espécies dentre os vertebrados (Kullander, 1998).
Sua distribuição geográfica abrange a África (com o maior número de
espécies), o Oriente médio (Iran e Síria), o sul da Índia e do Sri Lanka, as ilhas de
Madagascar, Cuba e Hispaniola e as Américas Norte, Central e do Sul (Figura 1)
(Kullander, 1998; 2003; Chakrabarty, 2004).
3
Na América do Sul são conhecidas aproximadamente 291 espécies válidas
distribuídas em 39 gêneros, sendo um grande número delas encontradas na
Amazônia, possuindo importância econômica na região tanto como fonte de proteína
animal, como para fins ornamentais (Chao, 1995; Kullander, 2003).
Os peixes desta família são encontrados nos mais diferentes habitats,
compreendendo margens de rios, igarapés, florestas alagadas, lagos e locais
rochosos, tendo preferência por ambientes lênticos, existindo algumas espécies
adaptadas a ambientes reofílicos (Lowe-McConnell, 1991; Kullander, 2003). São
conhecidos pelo comportamento territorialista e de cuidado parental e, na sua
maioria, se alimentam de pequenos invertebrados e de vegetais, com um número
pequeno de grupos que se alimentam de outros peixes e de plâncton (Kullander,
2003). A diversidade encontrada neste grupo abrange os mais diferentes aspectos
que variam desde características morfológicas e ecológicas, como, também, no
comportamento e na dieta (Lowe-McConnell, 1969a; Kullander; Nijssen, 1989), o
que demonstra uma grande capacidade adaptativa nos peixes desta família (Lowe-
McConnell, 1969b; Kocher, 2004).
A família Cichlidae é monofilética e estava subdividida em oito subfamílias,
sendo três do velho mundo (Etroplinae, Pseudocrenilabrinae e Heterochromidinae) e
cinco do novo mundo (Retroculinae, Cichlinae, Astronotinae, Geophaginae e
Cichlasomatinae), (Farias et al., 1998; Kullander, 1998). Em 2000, Farias e
colaboradores rejeitaram as subfamílias Cichlinae e Astronodontinae, o que também
foi proposto por López-Fenández et al., 2005, com relação ao grupo formado pela
subfamília Cichlinae, restando monofilia para três subfamílias do novo mundo
(Retroculinae, Geophaginae e Cichlasomatinae).
4
I.3. Aspectos evolutivos da família Cichlidae
A diversidade encontrada na família Cichlidae, como um todo, é atribuída à
complexidade de habitats ocupados por este grupo, que não só proporcionaram
eventos de especiação, como originaram um rápido processo de irradiação, como foi
visto entre os ciclídeos africanos (Liem, 1991; Parker & Kornfield, 1997, Turner,
2007) e nas Américas Central (Concheiro-Pérez et al., 2007) e do Sul (Lopéz-
Fernandez et al., 2005).
A historia evolutiva dos ciclideos teve início a partir de um grupo basal de
formato mais plesiomórfico existente no continente Gondwana, que divergiram no
ancestral comum ao agrupamento formado pelos ciclídeos da Índia e de
Madagascar e no antecessor comum dos ciclídeos africanos e neotropicais, que se
diferenciaram após o evento vicariante de separação do continente Gondwana há
aproximadamente 105 - 90 milhões de anos (Ma) (Stiassny, 1991; Farias et al.,
1998; 1999; Lundberg et al., 1998; Avise, 2000).
Uma segunda hipótese evolutiva foi proposta em trabalhos mais recentes, os
quais cogitam a possibilidade desta família ter passado por prováveis dispersões
marinhas durante o período Terciário, alcançando a porção oeste da Índia e de
Figura 1: Distribuição geográfica mundial da família Cichlidae. Fonte: Sparks, 2001.
5
Madagascar posteriormente a separação destas regiões da Gondwana há,
aproximadamente, 150 milhões de anos (Ma) (Murray, 2001; Vences et al., 2001;
Briggs, 2003).
Desde sua separação, os ciclídeos africanos e neotropicais experimentaram
efeitos bem distintos do meio ambiente, que levaram à nítidas diferenças entre estes
dois grupos e dentro de cada um, configurando conjuntos evolutivos próprios e com
alta diversidade (Farias et al., 1999).
No caso sul-americano, principalmente na região noroeste, os ciclídeos
tiveram sua história evolutiva influenciada por diferentes mudanças geomorfológicas,
dentre as quais se destacam: o desenvolvimento dos Andes, acompanhado de
transgressões e regressões marinhas e a formação do moderno fluxo oeste-leste
dos rios Amazonas e Orinoco, proporcionando eventos para a especiação e
enriquecimento do grupo na América do Sul (Lundberg et al., 1998). Ready et al.,
(2006) relacionaram o perfil filogeográfico observado nos peixes do gênero
Symphysodon aos eventos geomorfológicos do arco do Purus e a mudança de
direção da drenagem amazônica, além da adaptação destes peixes às planícies
baixas de inundação, influenciando a distribuição genética, morfológica e a
diversificação desses peixes. Entretanto não foi observada relação entre o tempo de
divergência do gênero e a origem geológica do arco, que está estimada em três
milhões de anos (3 Ma.). Farias e Hrbek (2008) ao estudarem os padrões de
diversificação no mesmo gênero observaram que estes peixes possuem sua
distribuição filogeográfica relacionada às diferenças química e física das águas,
além da influência do arco do Purus na diversificação do gênero, já proposta por
Ready et al. (2006).
Entre os ciclídeos neotropicais, estudos filogenéticos, tanto de base
morfológica quanto molecular, demonstraram uma origem monofilética deste grupo,
que, de acordo com os caracteres compartilhados, foi posteriormente subdividido por
Kullander (1998) em cinco grandes agrupamentos (subfamílias) conhecidos como:
Cichlasomines, Geophagines, Cichlinae, Retroculinae e Astronotinae, sendo
Retroculinae a subfamília mais basal e Geophaginae e Cichlasomatinae as mais
derivadas (Kullander, 1998, Farias et al., 1998; Farias et al., 1999). López-
Fernández et al., 2005, rejeitou a subfamília Cichlinae, invalidando as sinapomorfias
(caracteres osteológicos), que colocavam Crenicichla + Teleocichla como um
6
agrupamento irmão de Cichla dentro da subfamília Cichllinae, considerando tanto
Crenicichla, como Teleocichla pertencentes da subfamília Geophaginae, como já
tinha sido proposto por Farias et al. 2000, que também não encontrou monofilia para
a subfamília Astronotinae, separando Chaetobranchus de Astronotus.
Farias et al. (1998) utilizando o gene mitocrondrial 16S rRNA, identificou
monofilia, em grande parte, nas subfamílias do Neotrópico, além de maior
diversidade nucleotídica quando comparado ao grupo externo Africano (5.3%),
sugerindo que as linhagens sulamericanas apresentam origens mais antigas do que
se especula ou que estas experimentaram um rápido processo de evolução
molecular, principalmente na subfamília Geophaginae, que, segundo López-
Fernández et al., 2005, experimentou um rápido processo de irradiação (de acordo
com o sensu de Geophaginae de López-Fernandez et al, 2005).
I.4. A Tribo Heroini
A tribo Heroini (Kullander, 1998) pertence à subfamília Cichlasomatinae e é
considerada uma das mais diversas tribos entre os ciclídeos neotropicais
(Concheiro-Pérez et al., 2007). Compreende mais de 139 espécies e está
amplamente distribuída desde Buenos Aires, Argentina, até o Texas nos Estados
Unidos (Kullander, 2003; Concheiro-Peréz et al., 2007).
Na América do Sul é representada por 27 espécies distribuídas em dez
gêneros (Kullander, 1998; Santos, 2006): Heros Heckel, 1840, Pterophyllum Heckel,
1840, Uaru Heckel, 1840, Symphysodon Heckel, 1840, Hoplarchus Kaup, 1860,
Mesonauta Günther, 1862, Caquetaia Fowler, 1945, Hypselecara Kullander, 1986,
Heroina Kullander, 1996.
Este grupo é diversificado e apresenta variação morfológica principalmente
com relação aos caracteres tróficos, o que dificulta estudos filogenéticos e baseados
na morfologia deste grupo, assim como a identificação taxonômica e classificação
sistemática destes peixes (Concheiro-Peréz, 2007). No entanto a monofilia deste
grupo é bem suportada. Cichocki (1976), utilizando dados morfológicos (morfologia;
número de espinhos na nadadeira anal; ligamentos do palatino e padrões dentários),
7
encontrou monofilia para o grupo, o que mais tarde foi corroborado por Kullander
(1996) e Farias et al. (1998; 1999; 2000; 2001), que também encontraram relação
filogenética entre as tribos heroines e cichlasomines. Ainda de acordo com Farias et
al. (1998), esta tribo (Heroini), juntamente com Cichlasomini, ocupa a posição mais
derivada e recente na subfamília Cichlasomatinae tendo seu aparecimento no final
do Terciário.
I.5. O gênero Pterophyllum Heckel, 1840
Dentre os diversos ciclídeos ornamentais na Amazônia, encontra-se o acará-
bandeira (Chapman et al., 1997; Yamamoto et al., 1999). Este peixe pertence ao
gênero Pterophyllum Heckel, 1840, sendo um representante da tribo Heroini, que faz
parte da subfamília Cichlasomatinae (Kullander, 1998; 2003).
As espécies da tribo Heroini apresentam, em geral, um corpo lateralmente
bem achatado de contornos dorsais e ventrais arqueados.
Isso é bem evidente no gênero Pterophyllum, que também apresenta as
nadadeiras dorsal e anal altas com raios de comprimento crescente e decrescente
no sentido antero-posterior dando uma aparência triangular a forma corporal (Lowe-
McConnell, 1969a; Kullander, 1986). A nadadeira caudal é truncada e apresenta
filamentos de raios extensos, a nadadeira pélvica apresenta raios de comprimento
alongado e juntamente com a nadadeira anal não apresentam escamas. O corpo
apresenta com um contorno pré-dorsal côncavo com a presença de um entalhe
próximo do focinho; a base da nadadeira dorsal é convexa e semicircular e o
contorno total dorsal é maior que o ventral. O focinho é longo e triangular, visto
lateralmente, e a região interorbital é levemente elevada. As mandíbulas são
anteriores à região orbital sendo a mandíbula inferior situada posteriormente,
levemente projetada para frente e inclinada para cima. O abdômen e o pedúnculo
caudal são curtos, as escamas pequenas e lábios moderadamente grossos
(Kullander, 1986).
A coloração é cinza prateada contrastando com barras verticais de cor cinza
amarronzadas ou pretas distribuídas ao longo do corpo. Além disso, contém a região
8
Figura 3: Pterophyllum altum (Pellegrin, 1903).
Lee Newman
http//cichlidae.com
Bjame Saetrang
http//cichlidae.com
peitoral prateada e uma mancha preta na base da nadadeira dorsal. Possuem baixa
mobilidade, comportamento territorialista e são encontrados em água branca ou em
água negra com aspecto turbido, preferindo habitats lacustres ou águas lênticas
próximas às margens de vegetação densa (Kullander, 1986) e alimentam-se de
pequenos invertebrados (Yamamoto et al., 1999). Sua distribuição geográfica
compreende: Peru, Brasil, Venezuela, Colômbia, Guiana, Guiana Francesa e
Suriname (introduzido) (Lowe-McConnell, 1969a; Kullander, 1986; 2003).
De acordo com Kullander (1986, 2003) existem três espécies válidas neste
gênero: P. scalare (Schultze, 1823), P. altum Pellegrin, 1903 e P. leopoldi (Gosse,
1963).
P. scalare (Localidade tipo: localidade incerta): é
a mais estudada dentre todas as espécies conhecidas e
bem apreciada entre os peixes ornamentais. Apresenta
7,5cm de comprimento padrão (CP), 30-39 escamas ao
longo da linha lateral e o entalhe no contorno pré-dorsal
próximo ao focinho, sendo menos aparente a mancha
preta localizada na base da nadadeira dorsal citada na
descrição acima. Sua distribuição geográfica abrange a
região da bacia amazônica no Peru, Brasil, Colômbia ao longo dos rios Ucayali,
Solimões, Amazonas (até Belém), médio rio Negro e nos rios Madeira e Branco.
Também é encontrado nos rios Araguaia (estado de Tocantins) e Oiapoque entre o
estado do Amapá (BR) e a Guiana Francesa, no rio Essequibo na Guiana e
recentemente foi introduzido no Suriname. (Lowe-McConnell,
1969a; Kullander, 1986; 2003) (Figura 2 e 5).
P. altum (Localidade tipo: alto do rio Orinoco/
Município de Atabapo): os representantes desta espécie
possuem um corpo mais triangular, barras verticais mais
amplas, contorno pré-dorsal mais visível, maior número de
escamas (46-48) ao longo da linha lateral e comprimento
padrão (CP) de 6,5cm. Sua distribuição compreende o alto rio
Negro (bacia amazônica) e alto rio Orinoco nas regiões da
Colômbia e Venezuela, preferencialmente em água preta e limpa (Lowe-McConnell,
1969a; Kullander, 1986; 2003) (Figura 3 e 5).
Figura 2: Pterophyllum scalare (Schultze, 1823).
http//cichlidae.com
http//cichlidae.com
9
P. leopoldi (Localidade tipo: nas proximidades (90 km) de Manacapuru): os
representantes desta espécie diferenciam-se por terem a região pré-dorsal menos
evidente, apresentando um contorno mais contínuo. Na base da nadadeira dorsal,
possui a mancha preta, já descrita acima, bem evidente.
Dentre as três espécies é a que tem os menores
comprimento padrão (CP) e número de escamas ao longo
da linha lateral, que são respectivamente 5 cm e 27-29.
São encontrados nas águas dos rios Solimões e
Amazonas desde Manacapuru até Santarém (BR) e na
drenagem do rio Essequibo na Guiana (Kullander, 1986;
2003). De acordo com Kullander (1986), esta é a espécie,
que apresenta maior semelhança morfológica com o
gênero Mesonauta Günther, 1962 (Figura 4 e 5).
Historicamente, alguns estudos ressaltaram algumas questões sobre análise
taxonômica e filogenética, gerando incertezas na delimitação e na estrutura deste
gênero. Existem cinco espécies nominais neste gênero sendo: Zeus scalaris
Schultze, 1823 (Platax scalaris Cuvier, 1831), Plataxoïdes dumerilii Castelnau, 1855,
Pterophyllum altum Pellegrin, 1903, Pterophyllum eimekei Ahl, 1928 e Pterophyllum
leopoldi (Gosse, 1963) (Kullander, 1986; 2003). Lowe-McConnell em 1969(a) citou
problemas sobre a validação do gênero e a existência de sobreposição dos
caracteres merísticos. Kullander em 1986 ressaltou que o grupo apresentava uma
baixa resolução taxonômica, tendo como causas a falta ou a conservação precária
de exemplares tipo, a existência de espécies sinônimas e a considerável variação
dos caracteres merísticos utilizados. Dessa forma, sugeriu que Zeus scalaris,
Plataxoïdes dumerilii, Pterophyllum eimekei eram do mesmo gênero (Pterophyllum)
e espécie sinônimas de Pterophyllum scalare e que Pterophyllum altum e
Pterophyllum leopoldi seriam duas espécies distintas.
Atualmente estas três espécies estão definidas para o gênero, mas estudos
de natureza evolutiva, principalmente moleculares, são escassos neste grupo. Além
disso, a existência de variação morfológica e a sobreposição dos caracteres
merísticos, como o número de escamas, podem representar diferentes mortipos, o
que dificulta a identificação taxonômica das espécies deste genêro (Lowe-
McConnell, 1969(a); Kullander, 1986).
Figura 4: Pterophyllum leopoldi (Gosse, 1963).
http//cichlidae.com
10
Figura 5: Esquema da distribuição geográfica das espécies do gênero Pterophyllum. * O asterisco de cor verde indica a localidade, aonde a espécie P. scalare foi introduzida.
Dessa maneira, diante da carência de dados, da grande capacidade
adaptativa dos heroíneos, em geral, resultando na alta diversidade morfológica desta
tribo e da variedade de morfotipos existente nas espécies do gênero Pterophyllum,
este trabalho propõe um estudo filogeográfico, evolutivo e morfométrico nas três
espécies válidas de peixes do gênero Pterophyllum, amplamente distribuídos pela
bacia amazônica, buscando entender como se encontra a distribuição da variação
genética e morfométrica nas espécies ao longo da respectiva distribuição geográfica,
assim como investigar a delimitação da variação morfológica e genética das três
espécies ao longo da bacia amazônica, utilizando, como ferramentas, o gene
mitocondrial do citocromo b e morfometria geométrica.
Esta dissertação foi desenvolvida em dois capítulos, visando simplificar a
redação e uma melhor compreensão do objetivo proposto deste trabalho. Dessa
forma, no primeiro capítulo, foi abordado sob o enfoque genético e no segundo foi
trabalhado o aspecto morfométrico aplicados no estudo de peixes amostrados ao
longo dos rios Negro, Solimões e Amazonas.
11
CAPÍTULO 1
“Filogenia e Filogeografia do gênero Pterophyllum Heckel,
1840 (Cichlidae / Heroini) na Bacia Amazônica, utilizando o
gene do citocromo b”.
1. Introdução
Estudos filogeográficos proporcionam consistente informação evolutiva em
peixes de água doce, pois têm a capacidade de estabelecer ligações entre a
evolução dos organismos aquáticos e os eventos hidrogeológicos que os cercam,
uma vez que dependem diretamente dos sistemas fluviais como meio de dispersão
(Bermingham & Martin, 1998; Avise, 2000; Sivasundar et al., 2001). Neste contexto,
marcadores moleculares genéticos (nuclear e mitocondrial) vêm sendo amplamente
utilizados, mostrando-se muito eficazes em reconstruções filogeográficas e outras
abordagens evolutivas em diferentes níveis taxonômicos, podendo chegar ao de
espécie (Avise, 1994; Puorto et al., 2001).
Dentre os marcadores moleculares genéticos, o DNA mitocondrial (DNAmt)
tem sido empregado extensivamente nos mais diferentes aspectos evolutivos como,
por exemplo, em: reconstruções genealógicas, estudos filogenéticos, no
delineamento de processos evolutivos e na diversificação de um dado taxa em
relação a sua distribuição geográfica (Bermingham & Mortiz, 1998; Avise, 2000).
Isso se deve ao fato desta molécula ser mais compacta, simples e apresentar um
mecanismo de evolução mais rápido, quando comparado ao DNA nuclear. Além
disso, possui o padrão de herança vinculado à mãe (Brown et al., 1982; Meyer,
1993; 1994; Ballard & Whitlock, 2004). Essas características, em conjunto, fazem
esta molécula útil para estudos evolutivos (Lee et al., 1995).
Em se tratando do DNAmt, o gene do citocromo b tem sido a região mais
conhecida e utilizada em estudos moleculares dos mais variados como em estudos
sistemáticos, filogenéticos e populacionais de vertebrados, principalmente de peixes
(Meyer & Wilson, 1990; Meyer, 1993; 1994). No entanto, pesquisas evolutivas e
12
moleculares nesse grupo ainda são escassas se levarmos em conta a grande
diversidade de peixes encontrada nesta família e suas questões evolutivas
(Bermingham & Martin, 1998). Isto é mais evidente na região neotropical, mesmo
esta área possuindo uma das maiores drenagens de água doce do mundo
(amazônica) e uma rica fauna ictiológica, cuja variedade de peixes da família
Cichlidae merece destaque (Kullander, 1998; Farias et al., 1998).
Até hoje, a maioria dos estudos moleculares estão concentrados em ciclídeos
do velho mundo. Entre os estudos com táxons neotropicais poucas pesquisas
possuem representantes sul-americanos (ex. Zardoya et al., 1996; Roe et al., 1997;
Concheiro-Pérez et al., 2007), portanto questões taxonômicas e filogenéticas em
relação aos grupos da América do Sul continuam sem respostas e confusas (Farias
et al., 1998; Kullander; 1998). Farias e colaboradores, em 1998, foram pioneiros no
estudo molecular e sistemático de táxons sul-americanos aumentando esforços em
1999, 2000 e 2001. Farias et al. (1998; 1999; 2000; 2001) e López-Fernández et al.
(2005), utilizando dados moleculares e morfológicos em conjunto, obtiveram maior
resolução filogenética entre os ciclídeos neotropicias, mostrando a utilidade dos
dados moleculares mitocondriais em estudos evolutivos de grupos de ciclídeos,
como no caso dos geofagíneos e heroíneos (Farias et al., 1998; López-Fernández
et al., 2005;Concheiro-Pérez et al., 2007).
A tribo Heroini (Kullander, 1998) é uma das maiores e mais diversas tribos
entre os ciclídeos neotropicais. Atualmente, compreende 139 espécies válidas, que
estão amplamente distribuídas desde Buenos Aires (Argentina) até o Texas
(Estados Unidos), apresentando maior representatividade na América Central, onde
constituem 25% da ictiofauna da região (Kullander, 2003).
Além dos níveis de diversidade de espécies encontrados, os representantes
deste grupo possuem altos níveis de variação morfológica e diferentes morfotipos
(ex:Pterophyllum sp.), dificultando a identificação taxonômica nesta tribo e reflete a
existência de capacidade adaptativa, como é o caso dos heroíneos da
centroamérica (Concheiro-Pérez et al., 2007), indicando versatilidade de resposta
evolutiva deste grupo de peixes perante variações geológicas e ambientais
(Concheiro-Pérez et al., 2007, Ready et al., 2006). Recentemente Ready et al.
(2006) e Farias & Hrbek (2008), observaram que a história do desenvolvimento
geológico amazônico, juntamente com suas características ambientais participaram
13
do padrão de distribuição e diversificação do heroíneo Symphysodon, ao longo de
sua ampla distribuição pela planície baixa amazônica.
Uma vez que: 1) eventos geomorfológicos e hidrológicos podem influenciar o
padrão de distribuição e evolução dos organismos aquáticos; 2) marcadores
genético - moleculares são eficazes em estudos filogeográficos e de taxonômicos; 3)
existem relações entre o padrão filogeográfico dos peixes da tribo Heroini e os
eventos geológicos que os cercam; 4) é conhecida a variedade de padrões
biogeográficos para região amazônica e 5) dados evolutivos sobre os ciclídeos
neotropicais são carentes, o presente trabalho propõe uma análise filogeográfica,
populacional e evolutiva das espécies pertencentes ao gênero Pterophyllum Heckel,
1840, no contexto amazônico, com a finalidade de entender como estas espécies
estão evolutivamente relacionadas entre si e como se encontram geneticamente
distribuídas pela bacia amazônica, buscando os prováveis processos atuantes na
distribuição filogeográfica destes peixes ao longo da bacia amazônica, utilizando
como ferramenta o gene mitocondrial do citocromo b.
14
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo Geral
Buscar as relações filogenéticas entre os indivíduos coletados e entre as
espécies descritas para o gênero e, com base nisso, relacionar à taxonômia válida
para o gênero e, partir disso, definir e discutir o perfil genético populacional e
filogeográfico observado nas espécies do gênero Pterophyllum da Amazônia, ao
longo da área coletada, buscando entender os prováveis processos evolutivos, que
influenciaram ou que matem a distribuição genética encontrada nas espécies
delimitadas, utlizando a identificação taxonômica, as relações filogenéticas, a
distribuição filogeográfica, a estrutura e as características populacionais de cada
espécie, associada à distribuição geográfica coletada, tendo em vista as hipóteses
filogeográficas para diversificação evolutiva no ambiente amazônico.
1.1.2. Objetivos Específicos
Identificar os indivíduos coletados, com base na descrição taxonômica de
cada espécie descrita para o gênero;
Seqüenciar e caracterizar o segmento do gene mitocondrial citocromo b no
grupo de estudo;
Inferir as relações filogenéticas entre os indivíduos coletados;
Relacionar a identificação taxonômica com a hipótese filogenética resultante;
Testar a existência de hipóteses de distribuição filogeográfica em cada
espécie;
Determinar os índices de diversidade genética nas espécies, de acordo com
as localidades amostradas;
Testar estrutura genética populacional, dentro de cada espécie, entre as
localidades amostradas;
Definir a distribuição genética populacional das espécies do gênero ao longo
da área coletada, testando a correlação entre a distância genética e
geográfica;
Discutir a distribuição genética populacional e o padrão filogeográfico das
espécies do gênero Pterophyllum perante o contexto amazônico.
15
2. Material e Método
2.1. Amostragem
Levando-se em conta a distribuição dos peixes do gênero Pterophyllum
(Kullander, 2003), foram coletados 328 espécimes ao longo dos rios: Negro (Boa
Vista N=16, Santa Isabel N=34, Barcelos N=21 e Novo Airão N=4), Solimões
(Amanã N=17, Mamirauá N=45, Campina N=2, Iranduba N=16 e Janauacá N=27),
Amazonas (Catalão N=29, encontro das águas, Careiro da Várzea N=5, Careiro do
Castanho N=28), e alguns afluentes (Purus N=33, Solimões X Tapajós, Santarém
N=51), totalizando catorze pontos de coleta (Figura 6), das quais oito foram
coletadas, anteriormente, por Izeni P. Farias (seis localidades) e por Tomas Hrbek
(dois pontos). A diferença do N coletado é decorrente de problemas logísticos de
campo (tempo, clima e recursos financeiros). As coletas foram autorizadas pelo
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA)
sob o processo de n° 02001.000162/2006-67.
O processo de captura foi efetuado com o auxílio de um rapiché e de uma
rede de cerco. Após a captura, anestesiou-se cada exemplar com 0,4 ml - 1,0 ml de
uma solução de eugenol 10% (diluído em etanol), de acordo com o protocolo de
eutanásia estabelecido pela American Veterinary Medical Association (AVMA).
Posteriormente, a nadadeira peitoral direita de cada espécime foi removida e fixada
em um tubo eppendorf contendo álcool 95%. Após a retirada da nadadeira, cada
indivíduo foi etiquetado e fixado numa solução de formol diluída a 10%, que foi
substituída por uma solução de álcool 70%, sendo estes as amostras que serão
utilizadas no próximo capítulo.
Do total de coletas, de seis pontos somente foram obtidos o tecido, enquanto
que o restante das localidades (oito pontos) tem-se tanto o tecido como o indivíduo
fixado. Cada amostra de tecido foi depositada na Coleção de Tecidos de Genética
Animal – CTGA (Fiel Depositário/CGEN) do Laboratório de Evolução e Genética
Animal (ICB / UFAM).
16
2.2. Identificação Taxonômica
Para traçar o perfil genético e filogeográfico das espécies existentes no
gênero é preciso delimitar taxonomicamente o indivíduos coletados. Para isso, os
espécimes coletados foram identificados com base na descrição taxonômica
(abordada no item I, 5 da introdução geral) das espécies conhecidas para o gênero
Pterophyllum, segundo Kullander (1986; 2003), resumida em:
P. scalare: 7,5cm de comprimento padrão (CP); 30-39 escamas ao longo da
linha lateral; presença do entalhe próximo ao focinho; a mancha escura
localizada na base da nadadeira dorsal é menos aparente;
Figura 6: Mapa com a distribuição dos pontos amostrados. As cores sinalizadas dentro de cada circunferência indicam a ocorrência de qual espécie na área coletada. A figura de triângulo (vermelho) simboliza a cidade de Manaus, indicando um ponto de referência. A distância relativa entre os pontos amostrados, considerando o curso dos rios, está exposto no Anexo I.
17
P. altum: 6,5cm de comprimento padrão (CP); 46-48 escamas ao longo da
linha lateral; presença do entalhe próximo ao focinho; a mancha escura
localizada na base da nadadeira dorsal aparente; corpo mais triangular;
barras verticais mais amplas;
P. leopoldi: 5,0cm comprimento padrão (CP); 27-29 escamas ao longo da
linha lateral; entalhe próximo ao focinho menos evidente; mancha escura na
base da nadadeira dorsal bem evidente.
Vale ressaltar que a amostragem efetuada no Careiro da Várzea não teve
seus indivíduos coletados e consequentemente não foram identificados em
laboratório, sendo considerados como P. leopoldi por meio de comunicação
pessoal da identificação de campo do coletor professpr Dr. Tomas Hrbek.
2.3. Métodos Moleculares: Extração de DNA, Amplificação e
Seqüenciamento
Uma amostra (5 – 25 mg) de tecido da nadadeira fixada em álcool foi
cortada e o DNA total (nuclear e mitocondrial) foi isolado, seguindo o protocolo de
extração de DNA via proteinase K/ fenol/ clorofórmio de Sambrook et al. (1989), que
compreende as seguintes etapas: (1) rompimento da célula, (2) isolamento dos
ácidos nucléicos pela remoção das proteínas e outras estruturas celulares e (3)
purificação final, tendo como produto final o DNA diluído. O material genético
extraído foi submetido à reação de amplificação da região do gene mitocondrial do
citocromo b, via PCR (Polimerase Chain Reaction – Reação da Polimerase em
Cadeia), utilizando os primers (iniciadores) Cich_Glu5 Lcytb (forward) – 5’ – GAC
YAA TGA CTT GAA AAA CCA C - 3’ e Cich_Thr6 Rcytb (reverse) – 5’ – TGG TGC
TCT ACR CTG ACY TAC T - 3’, ambos desenvolvidos para este trabalho por Tomas
Hrbek. A PCR foi realizada para um volume final de reação de 15 µl, contendo: 1,5 µl
de dNTPs (10 mM); 1,2 µl de tampão 10X (100 mM Tris – HCL / pH 8.4, 500 mM
KCl); 1,2 µl de cada primer (2 µM); 1,5 µl de MgCl2 (25 mM); 1µl de DNA (50 ng/µl);
0,3 µl (0,3 U) da DNA polimerase Taq (1U/µl) e 7,1 µL de água miliq. Os ciclos de
amplificação foram realizados da seguinte maneira: um único ciclo de pré-
desnaturação de 1 minuto a 72 oC, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94 oC
18
por 40 segundos; anelamento a 52 oC por 40 segundos e extensão a 72 oC por 1
minuto, terminando com uma etapa de extensão final realizada a 72 oC por 5
minutos. O produto da PCR foi visualizado em gel de agarose 1%, corado com
brometo de etídeo (EtBr - 0,5 µg/mL) e observado em um transluminador de luz UV
Image Master (Pharmacia Biotech). As amostras da PCR positivas foram purificadas
através da precipitação com acetato de amônia e etanol 95%, para que os produtos
da PCR sejam limpos de resíduos de baixo peso molecular, tais como sais, primers
e dNTPs. Para a reação de seqüenciamento (também uma PCR) foi utilizado o kit de
reação kit “ET Terminator Cycle Sequencing Kit” (Amersham Bioscience), em uma
placa específica, para um volume final, por amostra, de 10 µL, contendo: 4 µL de
DNA amplificado e purificado; 2 µL de dois oligonucleotídeos (primers - iniciadores)
internos (2 µM); 2 µL de tampão do kit e 2 µL de água autoclavada deionizada. Os
ciclos da reação de seqüenciamento foram realizados a 52 oC (anelamento) e
seguindo protocolo recomendado pelo fabricante do kit de reação kit “ET Terminator
Cycle Sequencing Kit” (Amersham Bioscience). Como primers foram utilizados o
PteroIntF510_Cytb (forward) - 5’ – CTT TGA GGG GGC TTT TCA GT - 3’
(seguimento final do gene) e PteroIntR701_Cytb (reverse) - 5’ – GTC TTT GTA
GGA RAA GTA GGG - 3’ (seguimento inicial do gene), ambos internos e
desenvolvidos para este trabalho por Tomas Hrbek. Os produtos resultantes desta
PCR foram precipitados adicionando-se 1 µL de acetato de amônia (7,5 M) e 27,5 µL
de etanol absoluto, de acordo com as instruções do fabricante. Posteriormente
esses produtos foram ressuspendidos e resolvidos no seqüenciador automático ABI
3130xl (Applied Biosystems Inc.).
2.4. Análises Moleculares
2.4.1. Alinhamento, Edição de seqüências e Análises de Composição Molecular
As seqüências obtidas foram editadas manualmente no programa BioEdit
Version 7.0.9.0/2007 (Hall, 1999) e alinhadas por meio do aplicativo ClustalW
(Thompson et al., 1994), implementado no BioEdit.
19
A composição molecular de bases, a identificação de sítios variáveis e a
existência de códons de parada inesperados foram checados no programa MEGA
4/2007 (Kumar et al., 2004). Com o programa DAMBE/4.5.53/2001 (Xia, 2000)
avaliou-se a existência de saturações entre os eventos mutacionais de transversão
(TV) e transição (TS), comparando graficamente as distâncias genéticas (p) e o
número de substituições (TS ou TV) para casa posição no códon (Farias et al.,
2001). Se a relação ts/tv for < 1, será evidenciado a existência de saturação. Do
banco de dados gerado foram escolhidas algumas seqüências, que foram
submetidas ao banco de dados do GeneBank do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), para
checagem da identidade do segmento seqüenciado, por meio do aplicativo online
BLAST do NCBI .
2.4.2. Análises Moleculares
a) Análise Filogenética
Com o banco de dados das seqüências foi gerada uma árvore filogenética
entre os haplótipos obtidos, para a determinação de relacionamento evolutivo entre
os indivíduos identificados em cada espécie e entre as espécies do gênero, visando
traçar hipóteses filogenéticas para o grupo e, também, relacionar a identificação
taxonômica morfológica com o perfil genético molecular encontrado. A árvore
filogenética entre os haplótipos foi desenvolvida utilizando o critério de Máxima
Verossimilhança (MV) (Felsenstein, 1981), implementado no programa
Treefinder/2008, (Jobb, 2008), com base no modelo molecular evolutivo de
Hasegawa – Kishino – Yano (HKY85), porque este modelo molecular evolutivo
considera a composição molecular desigual entre as bases e diferenças na taxas de
substituição nucleotídica (transição e transversão), mostrando-se um modelo robusto
e de processamento computacional viável. Como teste de consistência da árvore foi
utilizado o método de bootstrap com 1000 pseudoreplicações de amostragem.
20
b) Análise Filogeográfica
Com base nos haplótipos obtidos em cada espécie, foi estimada uma rede de
haplótipos usando o programa TCS 1.18 (Clement et al., 2000) que utiliza o
algoritmo de parcimônia estatística (SP) descrito por Templeton et al. (1992),
estabelecendo relacionamento entre os haplótipos de acordo com os passos
mutacionais. A rede de haplótipos formada foi submetida ao processo descrito por
Templeton et al. (1987) e Templeton & Sing (1993) de hierarquização, onde os
haplótipos distantes por um passo mutacional entre si são agrupados no sentido da
extremidade para o interior da árvore haplotípica, formando uma série de níveis mais
complexos de agrupamentos, em que, no final, encontram-se agrupados num único
nível maior, que depois é traduzido em uma matriz de dados. Com estes dados e as
distâncias geográficas entre as localidades amostradas, que foram estimadas em
quilômetros, seguindo o curso dos rios, foi realizada a análise de NCA (Nested
Clade Analysis – Análise de Clados Agrupados) (Templeton, 1998) no programa
GEODIS 2.4 (Posada et al., 2000). Os resultados desta análise (Dc e Dn
significativos) foram interpretados por meio de uma chave de inferência
desenvolvida por Templeton (2005), disponível online pelo endereço
http://darwin.uvigo.es. A distância entre os pontos de coleta foi estimada com base
no programa GoogleEarth™ (Anexo I ). Embora existam ressalvas e críticas com
relação a este método analítico (ex.Panchal & Beaumont, 2007; Petit, 2008),
compartilho a opinião com outros autores de que a análise de NCA é uma
abordagem útil para determinação de inferências ao redor de antigos e atuais
processos evolutivos atuantes na modelagem e na distribuição da diversidade
genético-populacional, auxiliando no desenvolvimento de hipóteses filogeográficas
passíveis de validação em outros testes estatísticos (ex.Templeton, 2004; Garrick et
al., 2008). Dessa maneira, testes adicionais serão desenvolvidos, sempre que
necessário, para a validação das inferências oferecidas pelo NCA.
21
c) Análise populacional (por localidade)
Feito o relacionamento molecular e evolutivo dos haplótipos e a distribuição
filogeográfica em cada espécie, foram desenvolvidas análises populacionais, com
base na identificação taxonômica, nos agrupamentos de haplótipos formados por
Máxima Verossimilhança e pela rede de haplótipos, considerando um N amostral
superior a cinco (N < 5) e cada ponto de coleta como uma unidade populacional,
buscando mapear a distribuição e detectar o comportamento da diversidade gênica
ao longo das áreas amostradas.
Com o programa, Arlequin/3.1 (Excoffier et al., 2005) determinou-se os
seguintes parâmetros moleculares populacionais (localidade – ponto de coleta): 1 - o
nível de variação genética dentro das localidades amostradas, com base no número
de haplótipos observados em cada população (na), assumindo que cada mutação
nova gera um novo haplótipo; 2 - o índice de diversidade gênica (h), probabilidade
de duas seqüências tomadas ao acaso em uma população sejam diferentes entre si
(Li, 1997); 3 - o índice de diversidade nucleotídica (p ), média das diferenças
nucleotídicas em cada sítio entre duas seqüências tomadas da população ao acaso
(Tajima, 1983 ; Nei, 1987; Li, 1997) e 4 - número de sítios segregantes (S), sítios
que são variáveis ao longo de seqüências distintas (Li, 1997).
Com o mesmo programa (Arlequin/3.1) foi testada a existência de estrutura
de populacional, efetuando-se uma análise de variância molecular (AMOVA) global e
par a par, considerando cada ponto de coleta como uma população e N amostral
mínimo de cinco, com o nível de significância das comparações par a par ajustado
pela correção de Bonferroni (Rice, 1989). Essa análise é análoga às análises de
variância convencional (ANOVA), porém avalia a variância de freqüências gênicas,
considerando as mutações existentes entre os haplótipos, seguindo níveis
hierárquicos de comparações entre haplótipos de: 1 - uma mesma população; 2 -
populações distintas vistas para a par e 3 - grupos populacionais regionais (Excoffier
et al., 1992).
22
O fluxo gênico foi avaliado com base no número de migrantes por geração
(Nm), estabelecido pela relação entre o índice Fst de Wright (1951), o tamanho
efetivo populacional (Ne) e a taxa de migração entre duas populações (m), sob o
modelo de migração de ilhas, sendo Fst = 1/(4Nm+1) (Wright, 1951). Para o DNAmt
a equação é modificada para Fst = 1/(2Nm+1), em conseqüência do mecanismo de
evolução haplóide e herança materna desta molécula (Ballard & Whitlock, 2004). O
nível de significância das comparações múltiplas foi corrigido pela correção de
Bonferroni (Rice, 1989).
Para testar se as mutações observadas eram neutras ou estavam sob
seleção foram realizados os testes de neutralidade de D de Tajima (1989) e Fs de
Fu (1997), com nível de significância ajustado pela correção de Bonferroni (Rice,
1989). O teste de D de Tajima examina a significância da diferença entre o número
de sítios segregantes (S) e a diversidade nucleotídica encontrada (p ). O teste Fs de
Fu é baseado na probabilidade de observar determinado número de alelos em uma
amostra de determinado tamanho, levando em conta a diversidade nucleotídica
encontrada (p ). Ambos os métodos estão embasados no balanço entre a
neutralidade e a seleção (Li, 1997; Ford, 2002). Ademais, estes dois testes são
sensíveis aos eventos de variação no tamanho populacional, e por isso foram
aplicados, também, com esta finalidade analítica (Ford, 2002; Durand et al., 2005;
Santos et al., 2007).
Em cada localidade foi observado a distribuição das freqüências haplotípicas
(Mismatch Distribution) entre o observado e o esperado, considerando a distribuição
das diferenças par a par de haplótipos de uma dada população, partindo do
pressuposto de que uma população em equilíbrio demográfico (de tamanho
constante) apresenta uma distribuição multimodal (Rogers; Harpending, 1992). Para
testar a significância dessa distribuição foi aplicado um teste que utiliza o índice de
desigualdade de Harpending (r) com o suporte de consistência de 10.000
replicações e um intervalo de confiança de 95% (Durand et al., 2005).
O teste de correlação de Mantel (Mantel, 1967) foi aplicado buscando testar
alguma correlação significativa entre as distâncias genéticas por localidade (Fst)
encontradas e a distância geográfica entre as mesmas, ajustando o nível de
confiança para 1000 permutações com o nível de significância estabelecido em 5%.
O cálculo do Nm (número de migrantes), os testes de neutralidade (D de
Tajima e Fs de Fu) e de Mantel foram desenvolvidos, também, no programa
23
Arlequin/3.1, enquanto que a representação gráfica da distribuição e o teste de
Mismatch Distribution foram realizados no aplicativo DNAsp/4.5/2008 (Rozas et al.,
2003).
Calculou-se, também, a distância genética (d) entre e dentre os pontos
coletados, com base na identidade ou similaridade genética entre os indivíduos
dentro de uma mesma localidade e entre localidades distintas, tomadas duas a
duas, com base nas freqüências alélicas encontradas (Nei, 1972), utilizando, para
isso, o programa MEGA 4 / 2007 (Kumar et al., 2004).
Por causa do número amostral (N) inferior a cinco (N < 5) as localidades
Campina (N=2) e Novo Airão (N=4) foram descartadas das análises populacionais.
3. Resultados
3.1. Alinhamento, Edição de seqüências e Análise de Composição
Molecular
Do total coletado, foram obtidas, amplificadas com sucesso e seqüenciadas,
244 seqüências alinhadas com 1134 pb (pares de base), dos quais 190 foram
polimórficos e 175 parcimoniosamente informativos. A composição percentual de
bases foi de T = 31,3%; C = 31,1%; A =24,1% e G = 13,5% (Gráfico 1). Foi
encontrado apenas um códon parada na porção terminal (3’) da seqüência do
citocromo b. As seqüências obtidas corresponderam à seqüência depositada no
GeneBank do NCBI de Pterophyllum scalare (acesso: AF370676, Farias et al.,
2001), de acordo com o BLAST efetuado. A relação entre as taxas de transição (ts),
transversão (tv) e a distância genética não indicou existência de saturação, estando
indicado no gráfico 2 divergências moleculares entre e dentro de cada espécie.
24
Gráfico 2: Relação entre a distância e as taxas de transição (ts) em azul e transversão (tv) em verde. Estão representados nos dois eixos deste gráfico a distribuição das divergências existentes entre e dentre as três espécies estudadas do gênero.
31,1%
24,1%
13,5% 31,3%
TCAG
Gráfico 1: Composição percentual de bases.
3.2. Análises Moleculares
a) Análise Filogenética
Na árvore de haplótipos resultante, utilizando o critério de máxima
verossimilhança (MV), foi possível observar três grandes grupos, os quais foram
chamados de P. leopoldi, P. altum e P. scalare, representando as três espécies
25
morfológicas e taxonômicas do gênero, formando agrupamentos monofiléticos com
níveis de bootstrap maiores que 90%. A árvore foi coincidente com a identificação
taxonômica dos indivíduos coletados. O agrupamento P. leopoldi (Ptero1), com cinco
exemplares, foi representado somente pela localidade do Careiro da Várzea,
enquanto que o grupo P. altum (Ptero2) contém 24 indivíduos provenientes de Santa
Isabel (14) e de Boa Vista (10) e o grupo P. scalare (Ptero3) compreendeu em 215
espécimes de todas as localidades, exceto do Careiro da Várzea (Figura7).
b) Análise Filogeográfica
Por representarem três linhagens filogenéticas e três distintos grupos
taxonômicos, resultando na falta de conexão no network (rede) entre os haplótipos
das três espécies pela parcimônia estatística ao nível de confiança de 95% e pela
existência de muitas ambigüidades (loops), as redes (networks) das três espécies
foram desenvolvidas separadamente, de acordo com as linhagens filogenéticas
principais formadas na árvore de MV (Máxima Verossimilhança). Como resultado,
foram obtidas duas redes (networks) referentes, somente, ás espécies P. altum e
P.scalare, já que P. leopoldi contém indivíduos de uma mesma localidade (Careiro
da Várzea) e este network seria inviável para as análises de NCA. As redes de
haplótipos das espécies P. altum e P. scalare formaram clados hierarquizados de
níveis máximos de 4 e 7, respectivamente (Figura 8 e 9). Os clados hierarquizados
cujas hipóteses nulas de panmixia ou de ausência de relação entre a distribuição
geográfica e haplotípica foram rejeitadas (p < 0,05) estão discriminados na (Tabela
1). A análise de NCA para o grupo P. altum sugere que o episódio demográfico mais
antigo representa uma colonização a longa distância combinada com eventos
antigos de expansão geográfica gradual e de fragmentação (nível 4) (Figura 8 e
Tabela 1). Já para o grupo P. scalare a análise de NCA propõe como episódios mais
antigos eventos de isolamento por distância e de fluxo gênico restrito, além de
episódios de colonização a longa distância combinada com eventos de uma antiga
expansão geográfica e gradual juntamente com episódios de fragmentação (nível 6).
Num momento mais recente, o NCA sugere a existência de fragmentação alopátrica
e de colonização a longa distância combinada com uma antiga e gradual expansão
26
geográfica com eventos de fragmentação (nível 5), seguido por eventos de fluxo
gênico restrito, isolamento por distância e de fragmentação alopátrica (nível 4), com
subseqüentes períodos de colonização a longa distância em conjunto com uma
antiga e gradual expansão geográfica e com processos de fragmentação, além da
existência eventos de fragmentação alopátrica (nível 3). Nos momentos mais
recentes de história genealógica e evolutiva do grupo P. scalare, a análise de NCA
indica provável expansão geográfica contígua (nível 2) (Figura 9 e Tabela 1). A
distribuição e a freqüência dos haplótipos, obtidos nos networks, das duas espécies
(P. altum e P.scalare) estão disponibilizados no Anexo II.
c) Análise genético - populacional e demográfica (por localidade)
A partir dessas três espécies (P.leopoldi, P.altum e P.scalare), linhagens
evolutivas monofiléticas e grupos taxonômicos distintos, e tendo como base: o
agrupamento filogenético, distribuição filogeográfica, localidade e um N superior a
cinco (N > 5), foram obtidos os índices genético-populacionais, os resultados de
estrutura e de distribuição populacional, por espécie e ponto de coleta amostrado.
Dessa forma, as localidades de Campina (N = 2), Novo Airão (N = 4) e Boa Vista (N
= 3), agrupadas em P.scalare foram descartadas dessas análises por apresentarem
um número amostral inferior a cinco.
Os parâmetros genéticos populacionais obtidos, em cada espécie, podem ser
visualizados na Tabela 2. O número de haplótipos por localidade variou desde 4
(Boa Vista) a 6 (Santa Isabel) para P.altum e de 2 (Santa Isabel) a 15 (Catalão) para
P.scalare, dentro do total de 97 haplótipos nesta espécie. O número de sítios
polimórficos em P.altum esteve entre 3 (Boa Vista) a 15 (Santa Isabel) e de 1 (Santa
Isabel) a 39 (Catalão) em P.scalare. A espécie P.leopoldi contém uma única
localidade com o número de haplótipos e de sítios polimórficos igual a 5. Os níveis
de diversidade gênica (H) variaram de 0,7111+/-0,1175 (Boa Vista) a 0,8132+/-
0,0737 (Santa Isabel) em P. altum; de 0,1538+/-0,1261 (Santa Isabel) a 0,9643+/-
0,0772 (Amanã) em P. scalare e 1,0000+/-0,1265 (Careiro da Várzea) para P.altum.
Os índices de diversidade nucleotídica estiveram entre 0,000823 (+/0,000696; Boa
Vista) e 0,002442 (+/-0,001542; Santa Isabel) para P.altum; 0,00014 (+/-0,000227;
27
Santa Isabel) a 0,01109 (+/-0,00580; Purus) para P.scalare e 0,002381(+/-0,001769;
Careiro da Várzea) para P.leopoldi.
Para o teste de neutralidade D de Tajima, somente as localidades de Santa
Isabel da espécie P.altum e as do Catalão, de Santarém e de Barcelos de P.scalare
resultaram em valores negativos e significativos para um p = 0,05, sendo que a
população de Santarém mostrou significância ao p = 0,01. Para o teste de
neutralidade Fs de Fu, a única localidade (Careiro da Várzea) de P.leopoldi e quatro
localidades (Amanã, Mamirauá, Santarém e Barcelos), coletadas de P.scalare,
tiveram valores negativos e significativos com p = 0,05, exceto a região de
Santarém, que obteve valor também negativo, mas significância a um p = 0,01
(Tabela 2). Depois da correção de Bonferroni para o grupo P.scalare (p = 0,0011),
nenhum dos valores estimados para teste D de Tajima foram significativos, enquanto
que para o teste de neutralidade de Fs de Fu, Santarém ainda manteve significância
no seu resultado. Dentre estes dois testes de neutralidade, o teste Fs de Fu tem
uma capacidade analítica mais sensível para a detecção de expansão demográfica
(Fu, 1997; Durand et al., 2005).
Nas análises de AMOVA foram encontrados os resultados de Fst = 0,38245
(p < 0,001), para as localidades de P.altum, sendo que 61,75% da variação
observada foi intrapopulacional e 38,25% entre populações, enquanto que para a
espécie P.scalare o Fst observado foi de 0,47833 (p < 0,001), em que 47,83% da
variação está entre populações e 52,17% é de origem intrapopulacional (Tabela 3).
Para P.scalare, a variação do Fst entre as localidades, para a par, foi mais marcante
com relação aos pontos de Santa Isabel e de Barcelos, possuindo os maiores
índices significativos de Fst (com a correção de Bonferroni de p = 0,0011) entre
comparações par a par com as demais populações (Tabela 4).
A estimativa do número efetivo de migrantes por geração (Nm) entre as
diferentes localidades em P.scalare mostrou os menores valores de migrantes por
geração (Nm < 1), indicativo de um fluxo gênico restrito, entre as comparações com
as localidades de Santa Isabel e Barcelos, ao passo que as correlações com as
localidades de Catalão e Careiro do Castanho (C. Castanho) apresentaram os
maiores níveis de Nm (Catalão X Careiro do Castanho/Nm = 21; Careiro do
Castanho X Janauacá/Nm = 10), o que pode ser correlacionado com a não
significância do F st (Tabela 4). O Nm encontrado entre os locais de Santa Isabel e
Boa Vista na espécie P.altum foi de um Nm = 0,80736.
28
O teste de equilíbrio demográfico mostrou o índice de desigualdade de
Harpending (r) significativo (p < 0,05) em dois pontos para P. scalare: Purus,
Janauacá, o que mostra desequilíbrio demográfico nestas populações (Tabela1),
indicando que a hipótese nula (Ho) de ausência expansão demográfica pode ser
rejeitada nestas populações. No entanto, os resultados encontrados, por meio
desses testes, nestas localidades não foram corroborados pelos testes de
neutralidades, expostos na tabela 2.
No teste de Mantel não foi encontrada significância na correlação entre a
variação genética e a distribuição geográfica ao longo de todas as localidades
amostradas da espécie P. scalare (r = 0,003820; p = 0,011000 > 0,05) e, dessa
forma, o aumento da distância genética observada não está diretamente
relacionado com o aumento da distância geográfica entre as localidades
amostradas.
Na espécie P.scalare, a localidade de Purus alcançou o maior índice de
distância genética intrapopulacional (d = 0,011; 1,1%), enquanto que Santa Isabel
obteve o menor valor, sendo d = 0,000; 0,00%. Já para P.altum, Santa Isabel
resultou no maior valor de d (0,002; 0,2%) e Boa Vista no menor valor (d = 0,001;
0,1%). A única população de P.leopoldi, Careiro da Várzea, teve d = 0,002; 0,2%
(Tabela 5). Nas comparações interpopulacionais, tomadas duas a duas, dentro de
P.scalare, as combinações entre as populações das regiões de Barcelos, Santa
Isabel e Boa Vista e as demais localidades alcançaram os maiores valores de
distância genética obtidos (d = 0,010 = 1,0% e = 0,017 = 1,7%) e a comparação
entre as populações de Santarém e Mamirauá resultou no menor valor de distância
genética interpopulacional encontrado (d = 0,001; 0,1%) (Tabela 6). A comparação
entre as populações de Santa Isabel e Boa Vista na espécie P.altum, resultou na
distância d = 0,001; 0,1%.
29
Figura 7: Árvore de relacionamento de haplótipos – critério Máxima Verossimilhança (HKY85), indicando os valores de boostrap acima de 60%, onde Careiro = Careiro da Várzea; StaIsa = Santa Isabel e CCast = Careiro do Castanho. Foi utilizado como grupo externo o gênero Symphysodon (acesso DQ990693 do NCBI).
30
Grupo (espécie) Clado Chave de inferência Padrão inferido
P.altum
4-1 1-2-11-YES-12-13-YES-21-NO Colonização à distância combinados com antigos eventos de expansão geográfica gradual
e de fragmentação.
P.scalare
2-20 1-2-11-12-NO Expansão geográfica contígua.
3-12 1–2–11-17-NO Resultado inconclusivo.
3-19 1-19-20-2-3-4-9-NO Fragmentação alopátrica.
3-20 1-19-20-2-11-12-13-YES-21-NO
Colonização à distância combinados com antigos eventos de expansão geográfica gradual
e de fragmentação.
4-1 1-2-3-4-9-NO Fragmentação alopátrica.
4-4 1- 2- 3- 4- NO Fluxo gênico restrito com isolamento por distância.
5-2 1-19-20-2-3-5-15-NO-21-NO Colonização à distância combinados com antigos eventos de expansão geográfica gradual
e de fragmentação.
5-3 1- 19- 20- 2- 3- 4- 9-NO Fragmentação alopátrica.
6-1 1-19-20-2-11-YES-12-13-YES-21-NO
Colonização à distância combinados com antigos eventos de expansão geográfica gradual
e de fragmentação.
6-3 1- 2- 3- 4-NO Fluxo gênico restrito com isolamento por distância.
7-1 1- 2- 11- 17-NO Resultado Inconclusivo.
Tabela 1: Resultado das análises do agrupamento dos clados hierarquizados para as espécies P.altum e P.scalare, mostrando somente clados com permutações significativas (X2) para estrutura geográfica (p < 0,05).
31
1-1
1-2
1-3
1-4
1-5
1-6
1-7
1-8
1-9
2-2
2-1
2-3
2-4
2-5
3-2
3-1
4-1
1 2
3
4
5
6
7
9
10
8
Figura 8:
Diagrama da rede haplotípica de clados hierarquizados por meio da análise NCA (espécie P.altum – Ptero2). Cada cor representa um nível hierárquico e haplótipos hipotéticos intermediários são indicados por “o”.
32
Figura 9: Diagrama da rede haplotípica de clados hierarquizados por meio da análise NCA (espécie P.scalare - Ptero3 ). Cada cor representa um nível hierárquico e haplótipos hipotéticos intermediários são indicados por “o”. .
33
Espécie (grupo) Localidade N S NH H (Diversidade Gênica
Haplotípica) (Diversidade nucleotídica /sitio)
D de Tajima
Fs de Fu r (médio)
P.leopoldi
Careiro da Várzea 5 5 5 1,0000+/-0,1265 0,002381+/-0,001769 0,84298 -2,44206* 0,0893
Total 5 5
5
P.altum
Sta. Isabel 14 15 6 0,8132+/-0,0737 0,002442+/-0,001542 -1,68371* -0,11467 0,09213
Boa Vista 10 3 4 0,7111+/-0,1175 0,000823+/0,000696 -0,43130 -1,02041 0,09112
Total 24 18 10
P.scalare
Catalão 25 39 15 0,9400+/-0,0270 0,00518+/-0,002850 -1,63881* -3,59288 0,08836
Purus 22 36 14 0,9394+/-0,0325 0,01109+/-0,005800 1,06495 -0,32785 0,09141*
Amaná 8 9 7 0,9643+/-0,0772 0,00289+/-0,001890 -0,26159 -2,98845* 0,76700
Janauacá 18 19 13 0,9477+/-0,0392 0,00564+/-0,003130 0,61929 -3,38627 0,09214*
Sta.Isabel 13 1 2 0,1538+/-0,1261 0,000136+/- 0,000227 -1,14915 -0,53714 0,09072
Mamairauá 30 12 10 0,7609+/-0,0721 0,00164+/-0,001079 -1,24968 -3,47563* 0,08922
Santarém 42 10 10 0,5540+/-0,0911 0,00069+/-0,000570 -1,95025** -7,33915** 0,08783
C.Castanho 19 15 8 0,7251+/-0,1066 0,00301+/-0,001800 -0,76355 -0,58309 0,09367
Iranduba 12 22 6 0,8636+/-0,0716 0,00929+/-0,005130 1,97847 3,33541 0,08809
Barcelos 17 26 12 0,8897+/-0,0732 0,00390+/-0,002260 -1,71327* -4,29105* 0,08547
Total 206 189 97
Tabela 2: Índices de diversidade genética, testes de neutralidade e de expansão populacional, onde N = Nº amostral, S = N° Sítios Segregantes ou Polimórficos e NH = N° de haplótipos. Estão representados os parâmetros populacionais de acordo com a localidade, espécie, agrupamento filogenético formado e N > 5. Os valores marcados de vermelho indicam os valores que foram significativos depois da correção de Bonferroni.
Nota: *< 0,05; **< 0,01; Correção de Bonferroni para Pterophyllum scalare = 0,0011.
34
Tabela 3: Análise de Variância Molecular (AMOVA), entre todas as localidades, com N > 5, nas espécies P.altum e P.scalare. É significativa a estrutura populacional nas duas espécies (P < 0,001).
Tabela 4: Comparações par a par dos valores de Fst (abaixo e cor preta) e Nm (acima e cor azul) entre as localidades analisadas com N > 5 na espécie P.scalare. Os valores em vermelho correspondem respectivamente aos maiores índices significativos de Fst e aos valores significativos de baixo Nm.
*p < 0, 0011 (Correção de Bonferroni)
Espécie (grupo) Fonte da variação d.f. Soma dos
quadrados Componentes da
Variância Porcentagem
(%) de variação P. altum Entre populações 1 8,300 0,62494 Va 38,25
Dentro das populações 22 22,200 1,00909Vb 61,75 Total 23 30,500 1,63403 100
P. scalare Entre populações 9 390,319 2,04418 Va 47,83
Dentro das populações 196 436,963 2,22940 Vb 52,17
Total 205 827,282 4,27358 100
Localidade 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1. Catalão ---------- 3,62393 6,53057 4,62633 0,20854 5,69430 5,81159 21,76281 1,93979 0,24202 2. Purus 0,12124 ---------- 2,04260 1,98533 0,36588 1,11917 0,84761 1,77230 2,37188 0,42245 3. Amanã 0,07112 0,19665 ---------- 2,12719 0,06277 5,92176 1,16324 3,13211 1,59236 0,16769 4. Janauacá 0,09754 0,20118*
0,19032 ---------- 0,21189 1,38778 1,06459 10,63784 1,35073 0,23328 5. Sta. Isabel 0,70567* 0,57745*
0,88847*
0,70235*
---------- 0,07027 0,03231 0,11472 0,23442 0,08210 6. Mamirauá 0,08072* 0,30880*
0,07786 0,26486*
0,87678* ---------- 5,42796 4,08526 0,81009 0,11602 7. Santarém 0,07922* 0,37103*
0,30062*
0,31957*
0,93930* 0,08435* ---------- 4,41031 0,53716 0,07618 8.C.Castanho 0,02246 0,22004*
0,13766 0,04489 0,81337* 0,10905 0,10183 ---------- 1,29603 0,17032 9. Iranduba 0,20494 0,17410 0,23896 0,27016*
0,68081* 0,38165* 0,48209* 0,27839 ---------- 0,36236 10.Barcelos 0,67384* 0,54204*
0,74885*
0,68187*
0,85896* 0,81167* 0,86779* 0,74591* 0,57980 *
----------
P.altum F st = 0,38245, p < 0,001; P.scalare F st = 0,47833, p < 0,001
35
Tabela 6: Distância genética entre localidades par a par, pertencentes à espécie P.scalare, estabelecida com base em 200 replicações de bootstrap. Os números de coloração azul e vermelha representam, respectivamente, os maiores e menores valores obtidos.
Espécie (grupo) Localidade Distância
Desvio Padrão População Distância Desvio Padrão
P.leopoldi
Careiro da Várzea 0,002 0,001 P.scalare
Catalão 0,005 0,001 Janauacá 0,006 0,002 Purus 0,011 0,002 StaIsabel 0,000 0,000
Iranduba 0,009 0,002 Santarém 0,001 0,000 Amaná 0,003 0,001 C.Castanho
0,003 0,001 Mamirauá 0,002 0,001 Barcelos 0,004 0,001 Subtotal 1 0,03 0,007 Subtotal 2 0,014 0,004
Total 0,044 0,011 P.altum
Sta. Isabel 0,002 0,001 Boa Vista 0,001 0,000
Total 0,003 0,001
Localidade 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1. Catalão ----- 2. Purus 0,009
----- 3. Amanã 0,005
0,010
----- 4. Mamirauá 0,004
0,009
0,002
----- 5. Janauacá 0,006
0,011
0,006
0,005 ----- 6. Sta. Isabel 0,011
0,016
0,011
0,010 0,011
----- 7. Santarém 0,003
0,008
0,002
0,001 0,004
0,009
----- 8. C.Castanho 0,004
0,009
0,003
0,003 0,005
0,010
0,002
----- 9. Iranduba 0,009
0,013
0,008
0,008 0,010
0,015
0,007
0,008
----- 10.Barcelos 0,014
0,017
0,014
0,013 0,015
0,016
0,013
0,014
0,015
-----
Tabela 5: Distância genética intralocalidade. Os números de coloração azul e vermelha representam, respectivamente, os maiores e os menores valores obtidos. Estão representados os parâmetros populacionais de acordo com a localidade, espécie e agrupamento filogenético formado. O desvio padrão foi estabelecido com base em 200 replicações de bootstrap.
36
4. Discussão e Conclusão
a) Análise de Composição Molecular
Neste trabalho foram estudas características gerais do genoma mitocondrial de
vertebrados como a composição molecular de bases e a existência de saturação. A
menor porcentagem observada de guanina (13,5%) em relação às demais bases
constitui um fenômeno comumente encontrado no DNA mitocondrial dos vertebrados
(Gráfico 1) (Zhang & Hewitt, 1996). Eventos de saturação não foram vistos, o que é
esperado entre táxons filogeneticamente muito relacionados entre si, assim como em
níveis populacionais (Meyer, 1993; Farias et al., 2001) (Gráfico 2).
b) Análise Filogenética
A árvore de Máxima Verossimilhança apresentou três grandes grupos definidos
(bootstrap > 95%) e relacionados com as três espécies descritas para o gênero
Pterophyllum (P. leopoldi, altum e scalare, nesta ordem), se considerarmos a
identificação taxonômica efetuada, a distribuição geográfica, proposta no esquema da
figura 5, e os níveis de consistência filogenética destas três linhagens. Mesmo não
tendo conseguido coletar indivíduos P. leopoldi e existindo diferentes morfotipos no
gênero, principalmente em P. scalare, o que poderia confudir a identificação das
espécies, foi possível separar molecularmente as três espécies para o gênero e os 5
espécimes coletados no Careiro da Várzea foram determinados P. leopoldi, de acordo
com o perfil filogenético obtido e comunicação pessoal do coletor Tomas Hrbek. A
capacidade de separação entre as três espécies reconhecidas para o gênero mostra
que o gene mitocondrial do citocromo b pode ser um marcador molecular útil em
estudos filogenéticos e sistemáticos de ciclídeos de níveis taxonômicos mais altos,
37
como o de espécie. Farias et al., 2001, ao estudarem a eficácia do gene do citocromo b
como um marcador molecular de relacionamento filogenético e sistemático de ciclídeos
africanos e neotropicais, encontraram boa performance desta região mitocondrial em
diferentes níveis taxonômicos.
O agrupamento formado por P. leopoldi (Ptero1) e P. altum (Ptero2) é
monofilético, o que é interessante dentro do ponto de vista morfológico destas duas
espécies, pois apresentam maior diferenciação morfológica entre si, em comparação
com P. scalare, segundo a descrição taxonômica de cada espécie, abordada nos itens
I.5. da Introdução geral e 2.2 do Material e Método deste trabalho. Além disso, foi
encontrada uma distribuição geográfica mais restrita ao Careiro da Várzea (Careiro)
para P. leopoldi, ao passo que P.altum foi encontrado presente em Santa Isabel e Boa
Vista. O grupo P. scalare (Ptero3) está agrupado de maneira monofilética (grupo irmão)
ao conjunto formado por P. leopoldi e P. altum e tem uma distribuição mais ampla ao
longo de toda região amostrada neste trabalho, exceto na região do Careiro da Várzea
(Figura 7), sendo Santa Isabel e Boa Vista localidades de simpatria entre duas destas
linhagens (Ptero 2 e Ptero 3) ou espécies (P. altum e P. scalare). Embora as espécies
Pterophyllum leopoldi (Ptero1) e Pterophyllum scalare (Ptero3) tenham registros de
distribuição geográfica simpátrica entre o eixo Iranduba - Santarém, o mesmo não foi
evidenciado filogeneticamente nestas localidades (Figura 7).
c) Análise Filogeográfica
Na espécie P. altum, a análise de NCA sugeriu, que a distribuição da
diversidade genética observada nas localidades de Santa Isabel e Boa Vista (Figura
8; Anexo II) tenha sido resultado de eventos históricos de colonização à distância
combinados com antigos eventos de expansão geográfica gradual e de
fragmentação (clado 4-1) (Tabela 1), podendo ser observado na significância do
teste de neutralidade D de Tajima na localidade de Santa Isabel, a existência de
expansão demográfica nesta região.
38
Para a espécie P.scalare a história de diversificação evolutiva proposta pelo
NCA mostrou-se mais complexa e indica que esta espécie, ao longo da área
amostrada, passou por pulsos de expansão geográfica (clados 2-20; 3-20; 5-2; 6-1),
colonização à distância e de fragmentação (clados 3-20; 5-2; 6-1), intercalados por
episódios de fluxo gênico restrito, de isolamento por distância (clados 4-4; 6-3) e de
fragmentação (clados 3-19; 4-1; 5-3) (Tabela 1). No entanto os resultados de Nm e
do teste de Mantel (Tabela 4), não corroboram a existência de fluxo gênico restrito e
isolamento por distância no clado 4-4 (Figura 9), que contém haplótipos das regiões
de Santarém; Purus; Janauacá; Iranduba; Catalão; Mamirauá; Amanã; Campina e
Careiro do Castanho. Uma provável explicação para a inferência de fluxo gênico
restrito oferecida para o clado 6-3 (Figura 9, Anexo II), pode estar relacionada aos
haplótipos agrupados, neste clado, entre as localidades de Santa Isabel + Boa Vista
e Barcelos, todas de água preta, e as regiões de Santarém + Purus + Janauacá +
Iranduba + Catalão + Mamirauá + Amanã + Campina + Careiro do Castanho, todas
de água branca, o que também foi observado na representação filogenética da
árvore de MV (Figura 7), possivelmente resultado de fluxo gênico restrito entre os
diferentes tipos químicos e físicos de águas (Sioli, 1984) como pode ser visto nos
índices de Nm e acarretanto estrutura populacional pelo significante Fst (para a par;
Tabela 4).
Os padrões de fragmentação alopátrica sugeridos para os clados 3-19; 4-1 e
5-3 (Tabela 1; Figura 9) não apresentam uma explicação direta sobre qual barreira
evolutiva teria influenciado no padrão da distribuição genética entre as localidades
que compõem os clados destes níveis hierárquicos. No caso do clado 3-19, o
panorama observado de fragmentação e diversificação dos haplótipos entre as
regiões de Santa Isabel + Boa Vista e de Barcelos, pode estar relacionado à
influência da drenagem do rio Branco na região de Barcelos, atuando como uma
barreira entre os indivíduos de Barcelos e as regiões de Santa Isabel e Boa Vista, o
que reflete os índices significativos e elevados de Fst e de Nm inexistente entre
essas localidades, sendo este fenômeno, de separação haplotípica, também
observado no relacionamento filogenético entre essas localidades (68,44%; Barcelos
e 98,08%; Santa Isabel + Boa Vista; Figura 7).
39
No caso das hipóteses oferecidas de expansão geográfica gradual nos clados
3-20; 5-2 e 6-1 (Tabela 1; Figura 9), são corroboradas pela significância dos testes
de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu nas localidades de Amanã, Santarém e
Mamirauá (Tabela 2). Já para o clado 2-20 a hipótese de expansão geográfica
contígua pode ser associada à significância do r nas localidades de Janauacá e
Purus no teste desigualdade de Harpending, porém estas regiões não apresentaram
significância qualquer nos testes de neutralidade.
d) Análise genético - populacional e demográfica (por localidade)
Os parâmetros genético populacionais de diversidade gênica maiores do que os
de diversidade nucleotídica (Tabela 2) podem estar relacionados a eventos de
expansão populacional depois de longos períodos de redução do tamanho efetivo da
população (Grant; Bowen, 1998), o que pode ser corroborado pelos resultados
significativos obtidos nos testes de neutralidade (D de Tajima e Fs de Fu) e de
desigualdade de Harpending (r) em algumas das localidades estudadas (Tabela 2),
atuando, também, nas inferências de expansão populacional propostas pelo NCA
(Tabela 1), tanto para Pterophyllum scalare, quanto P. leopoldi.
Os resultados de estrutura populacional obtidos neste trabalho sugerem que a
espécie P. scalare (Ptero3) não se comporta como uma população panmítica ao longo
das localidades amostradas pela bacia amazônica, possuindo níveis significativos (p <
0,0011) de estrutura populacional entre algumas regiões, sendo reforçado pelo baixo
fluxo gênico (Nm), como é mostrado pela tabela 4. A AMOVA generalizada em
Pterophyllum scalare também resultou num Fst (0,47833) significativo (p < 0,001),
porém maior parte da variação genética encontrada foi atribuída a diferenças genéticas
intralocais, representando 52,17% da variação (Tabela 3), sendo que o mesmo
resultado, de maior variação genética intrapopulacional (61,75%) do que
interpopulacional (38,25%), foi visto nas populações de P. altum (Ptero2) com um Fst
significativo igual a 0,38245 (p < 0,001) e Nm = 0,80736, o que significa, que nesta
espécie, também não foi encontrado panmixia.
40
Em relação as localidades de P. scalare próximas do eixo Solimões - Amazonas,
os Fsts significativos observados, associados aos índices de baixo fluxo gênico (Nm),
entre algumas das comparações populacionais de P. scalare (Tabela 4), juntamente
com as inferências de fluxo gênico restrito do teste de NCA (Figura 9 e Tabela 1),
podem estar relacionados com a ampla distribuição geográfica entre as localidades
amostradas no Solimões – Amazonas (Figura 5 e Anexo I), o que pode acarretar
estrutura populacional e fluxo gênico restrito. Mesmo não existindo correlação
significativa entre a distância geográfica e a variação genética pelo teste de Mantel, o
que leva a rejeição da hipótese de isolamento por distância sugerida pelo NCA, é
possível observar que os maiores níveis de fluxo gênico foram encontrados entre locais
geograficamente mais próximos entre si (Tabela 4). Peixes com ampla distribuição
geográfica podem exibir baixa conectividade genética quando possuem características
biológicas e comportamentais tais como o territorialismo, sedentarismo e preferência
por habitats mais isolados, resultando em baixa dispersão e conseqüente estrutura
genética populacional, sendo este o caso dos peixes da família Cichlidae, que possuem
comportamento territorialista, filopátrico e habitam preferencialmente ambientes
lacustres e mais lênticos (Lowe-McConnell, 1991; Chelappa; Yamamoto, 1999;
Kullander, 2003). Espécies do gênero Cichla (tucunaré) da bacia amazônica detêm
pronunciado territorialismo e filopatria, o que pode ter determinado o baixo fluxo gênico
encontrado entre suas populações (Willis et al., 2007).
Mesmo em áreas geográficas mais restritas, os ciclídeos podem apresentar
reduzido fluxo gênico e estrutura gênica entre locais próximos, como é caso dos
ciclídeos africanos (ex. Melanochromis auratus), podendo ser conseqüência de
adaptações a variações geológicas e ambientais pontuais (Markert et al., 1999),
proporcionando oportunidades para os eventos de adaptação e de especiação. Em
contrapartida espécies migradoras e de grande dispersão como, Colossoma
macropomum (tambaqui), mostraram, em estudos genéticos, o comportamento
populacional de panmixia ao longo da bacia amazônica (Santos et al., 2007).
Sivasundar et al (2001) notaram pouca estrutura genética entre os peixes migradores
da espécie Prochilodus lineatus ao longo de mais de 1.500 quilômetros (km) de
extensão geográfica na bacia dos rios Paraná – Paraguai.
41
No entanto, mesmo com a existência de filopatria, territorialismo e sedentarismo
nos ciclídeos do gênero Pterophyllum e com evidências de estrutura populacional
(Tabela 4) e reduzido fluxo gênico entre alguns pontos amostrados de P. scalare
(Ptero3), é possível observar, tanto na árvore de Máxima Verossimilhança (Figura 7)
como na rede de relacionamento de haplótipos (Figura 9; Anexo II), a existência de
haplótipos compartilhados entre localidades geograficamente distantes, ao longo do
eixo Solimões – Amazonas (Santarém X Mamirauá ou X Amanã = 1300 km; Anexo I).
Uma possível explicação para o resultado observado está na dinâmica das planícies de
inundação periódicas (“várzea” e “igapó”), muito comuns na bacia amazônica, que
podem estabelecer fluxo gênico, migração (Tabela 4) e o provável padrão de
colonização à distância proposto pelo NCA (Clados 3-20, 5-2 e 6-1, Figura 9 e Tabela
6). Dessa maneira, os sistemas de “várzea” e “igapó” podem formar um amplo sistema
aquático interconectado, aumentando as possibilidades de eventos de migração e de
fluxo gênico (Cantanhede et al., 2005). Ready et al. (2006), ao estudarem caracteres
morfológicos e genéticos nas espécies do gênero Symphysodon, atribuíram o limitado
número de espécies observado dentro do gênero a coesão genética, possibilitada pelo
fluxo gênico entre as populações associadas às planícies de inundação, habitat onde
esses peixes estão amplamente distribuídos na Amazônia. Portando a variação do nível
de água pode influenciar os padrões de diversificação em populações naturais
dispostas ao longo de sistemas aquáticos, ocasionando eventos de diversificação e de
especiação, mediante ao rompimento ou a manutenção do fluxo gênico, mesmo em
animais de conduta territorialista e filopátrica, que podem comprometer a capacidade de
dispersão e de fluxo gênico.
Dessa maneira, a flutuação periódica do nível das águas pode estar ligada à
difusa relação entre a distribuição geográfica e a haplotípica na espécie P. scalare
(Ptero3) (Figuras 7 e 9) como, por exemplo, o forte agrupamento filogenético formado
entre alguns indivíduos das populações de Purus e de Novo Airão, como mostra na
figura 7 (bootstrap de 98,93%). Essas duas populações encontram-se geograficamente
mais distantes entre si, quando comparadas com as populações de: Iranduba,
Janauacá, Catalão, Careiro do Castanho e Careiro da Várzea em relação aos peixes da
localidade Purus, ao passo que a população de Novo Airão situa-se geograficamente
42
mais próxima das localidades de: Janauacá, Catalão, Careiro do Castanho, Careiro da
Várzea, Iranduba e Barcelos (Anexo I). Além disso, estas duas localidades são
influenciadas por uma distinta dinâmica hídrica, relacionada aos rios Negro e Solimões
(Figura 6). Mas olhando-se atentamente pode-se perceber que algumas áreas estão
localizadas geograficamente de maneira intermediária entre estas duas populações
como as regiões de Iranduba, Catalão, Janauacá, Careiro do Castanho e Careiro da
Várzea e, por conseguinte, sugere-se a possibilidade de existir uma provável conexão
entre essas localidades, garantindo fluxo gênico auxiliado pela flutuação do nível das
águas.
Eventos de flutuação do nível das águas durante a escala geológica são muito
conhecidos como um dos principais fatores no processo de diversificação dos ciclídeos
dos lagos africanos (Turner, 2007; Egger et al. 2007; Koblmüller et al., 2007; Crispo &
Chapman, 2008). Porém o presente estudo trata de uma dinâmica periódica e anual do
nível das águas durante as estações de verão e inverno amazônico e que contribui para
a homogeneidade genética entre os pontos amostrados do eixo Solimões - Amazonas,
superando características comportamentais da família Cichlidae.
Ao longo das regiões coletadas de P. scalare do rio Negro (Barcelos a Santa
Isabel) nota-se maiores níveis de estrutura genética e de fluxo gênico restrito, do que
entre as localidades amostradas do eixo Solimões-Amazonas e geograficamente mais
distantes entre si como Santarém e Amanã. Além disso, a população de Barcelos se
diferenciou significativamente das demais populações de P. scalare, incluindo as de
água preta, o que pode ser visto na distribuição de haplótipos da rede (Figura 9; Anexo
II), na árvore da MV (Figura 7) e nos índices populacionais de Nm e de Fst da Tabela
4, evidenciando ausência de fluxo gênico e estrutura gênica. Até o momento, são
poucos os registros científicos que abordem eventos geomorfológicos antigos nesta
área que descrevam padrões semelhantes biogeográficos em outros grupos de
animais. Uma provável explicação para o padrão encontrado, nessa localidade de P.
scalare em questão, poderia estar relacionada à maior influência das populações de P.
scalare provenientes do rio Branco, que sofreram diferentes processos evolutivos
próprios da drenagem onde vivem, o que pode estar contribuindo, também, para distinta
diversificação populacional observado na população de Barcelos, o que proporciona a
43
inferência de fragmentação alopátrica sugerida pelo NCA (clado 3-19; Figura 9, Tabela
1). No entanto, para testar tal hipótese é necessário uma amostragem proveniente da
localidade do rio Branco. Lovejoy & Araújo (2000) encontraram maior relação
filogenética entre os peixes do gênero Potamorrhaphis das regiões de Apure (baixo
Orinoco), Barcelos (rio Negro) e Santarém (rio Amazonas) do que entre populações
mais próximas e de mesma drenagem como Belém (rio Amazonas), Atabapo e Santa
Rita (duas últimas são do rio Orinoco). Além disso, foi observado, também, forte
estrutura genética de acordo com localidade amostrada, o que foi relacionada com a
baixa capacidade de dispersão do grupo estudado. Com base nesses dados, os
pesquisadores sugeriram a existência de uma histórica conexão entre as áreas de
Barcelos, Santarém e Apure, intermediada pelo rio Branco, por meio da comunicação
entre as bacias dos rios Branco, Essequibo (na Guiana) e Orinoco. Alternativamente, a
diferenciação genética notada na região de Barcelos com as demais localidades
coletadas pode ser resultante de variações químicas na qualidade da água antes e
depois da confluência do rio Branco com o Negro, gerando maiores níveis de estrutura
genética e de fluxo gênico restrito entre esse ponto e as demais localidades, o que
pode ser visto na estrutura filogenética entre os pontos coletados de Novo Airão e
Barcelos.
A significante estrutura populacional e fluxo gênico inexistente observado nas
comparações entre as populações de P. scalare (Ptero3) provenientes de Barcelos e
Santa Isabel com as demais localidades (Tabela 3) e o padrão do agrupamento
formado na árvore MV (Figura 7) e de relacionamento de haplótipos (Figura 9; Anexo II)
encontrado nestas populações pode estar relacionado às diferenças químicas e físicas
dos dois tipos de água encontradas nos rios Negro e Solimões (Sioli, 1984). Esta
hipótese também foi sugerida por Thoisy et al. (2006), Vasconcelos et al. (2006) e Willis
et al. (2007) para explicar o padrão de diversificação das populações de Melanosuchus
niger, Caiman crocodilus e de espécies do genero Cichla coletadas entre estes dois
tipos de águas. Farias e Hrbek (2008) notaram fluxo gênico restrito com isolamento por
distância entre as populações de discus do baixo rio Amazonas (branca) e as rio Negro
(preta) e relacionaram este resultado ao comportamento adaptativo desses peixes as
diferenças químicas e físicas das águas branca e preta. Dessa forma, as diferenças nas
44
condições limnológicas dessas águas atuariam como um fator ecológico limitante para a
migração entre as populações dos distintos tipos de águas, restringindo o fluxo gênico.
Esse tipo de estrutura populacional, limitada por condições ambientais, também foi
descrita para os ambientes lacustres dos lagos africanos, onde trabalhos já mostraram
a existência de correlações entre a estrutura de habitats e a diferenciação populacional
de haplochromíneos africanos (Markert et al., 1999).
Com base nos resultados moleculares obtidos neste estudo foi possível distinguir
molecularmente as três espécies dentro do grupo Pterophyllum, espécies já
reconhecidas para o gênero, mostrando a eficácia do marcador molecular utilizado. No
geral, os padrões filogeográficos que resultaram na distribuição e na diversificação
observadas nas espécies do gênero Pterophyllum, mostraram-se como um mosaico de
processos evolutivos. De acordo com os resultados obtidos, eventos de expansão
demográfica, aparentemente, influenciaram a história evolutiva das espécies P. altum e
P. scalare. Apesar das características comportamentais (ex. territorialismo, filopatria e
sedentarismo) e dos níveis de estruturação genéticos populacionais (Fst) significantes
e de fluxo gênico restrito entre alguns pontos de coleta, foi encontrado maior variação
genética dentro das localidades amostradas em cada espécie, do que entre pontos
distintos, assim como evidência de fluxo gênico entre pontos distantes entre si, o que
influênciou a falta de correlação significativa, pelo teste Mantel, entre a distribuição
geográfica e haplotípica em Pterophyllum scalare, apresentando sua diversificação
genética, influenciada, em parte, pela ampla distribuição geográfica desta espécie e, em
grande parte, pela dinâmica periódica de cheia a vazante da bacia amazônica. As
diferenças encontradas no padrão de distribuição genética dos diferentes tipos de água
(branca e preta) em P. scalare pode estar relacionado à variação das influências e
dinâmicas ambientais nos rios Solimões – Amazonas e Negro, como características
físico – químicas. No caso das regiões coletadas de P. scalare do rio Negro, foi
sugerido e existência de uma contribuinção limitante de dispersão do rio Branco entre
Barcelos e Boa Vista + Santa Isabel, resultando na inferência filogeográfia de
fragmentação alopátrica. De uma maneira resumida notou-se, neste estudo, que a
distribuição da variabilidade genética segue um comportamento diferenciado de acordo
com: 1- as duas espécies P. scalare e P. altum; 2- a dinâmica de variação do nível das
45
águas em P. scalare; 3- as diferenças limnológicas das águas branca e preta, P.
scalare; 4- as influências das drenagens principais, mais próximas dos pontos
coletados: rios Solimões – Amazonas, Negro e Branco, P. scalare e 5- da variação
histórica do tamanho populacional nos pontos coletados de P. altum e P. scalare.
46
CAPÍTULO 2
“Estudo da forma corporal de peixes do gênero Pterophyllum Heckel, 1840 (Cichlidae / Heroini) ao longo da bacia Amazônica,
utilizando morfometria geométrica”.
1. Introdução
Pesquisas relacionadas ao formato corporal dos organismos assumem
importante papel em estudos biológicos, uma vez que podem refletir experiências
biológicas e evolutivas (Bookstein, 1991; Zelditch et al., 2004), tendo como base o
conceito de que o fenótipo apresentado por um organismo decorre da interação
existente entre um dado genótipo e o meio ambiente em que se encontra (Ricklefs;
Miles, 1994) e que a evolução de um mesmo fenótipo em populações naturais situadas
em um mesmo ambiente pode ser evidência de seleção natural e de adaptação
(Mcguigan et al., 2005).
De um outro ponto de vista, variações estruturais podem afetar o
comportamento e a interação ecológica dos organismos, principalmente se levarmos
em conta características físicas e químicas do ambiente (Webb, 1984). Dessa maneira,
o formato corporal pode ter relevância evolutiva e ecológica para um dado organismo
(Klingenberg et al., 2003). Diante disto, análises de estruturas morfológicas como as
morfométricas podem ser de grande valia (Schluter, 1993), sendo utilizada em distintas
abordagens biológicas durante anos (Monteiro et al., 2002; Rosenberg, 2002).
Historicamente, o estudo da variação corporal consistia em medidas relativas
de estruturas anatômicas que eram analisadas por meio de arranjos canônicos,
componentes principais e outros recursos de estatísticos multivariados, configurando a
técnica denominada de morfometria tradicional (Monteiro et al., 2002).
O avanço de ferramentas estatísticas e computacionais, das teorias
matemáticas de espaço forma (Goodall, 1983; Kendall, 1984) e o desenvolvimento de
novas abordagens metodológicas (Bookstein, 1991), permitiram novas aplicações
47
biológicas para esse tipo de estudo, que se tornou mais acurado em definir, quantificar
e explicar estatisticamente as origens, manutenção e as conseqüências dos padrões
morfológicos encontrados, sendo esta nova abordagem chamada de morfometria
geométrica, a qual considera variações geométricas da forma (espaço geométrico
ocupado), com base numa configuração de pontos anatômicos e na redução dos efeitos
inerentes ao tamanho, a localização e a posição estrutural ocupada, oferecendo dados
mais informativos, de fácil manipulação e maior compreensão dos resultados obtidos
(Monteiro et al., 2002; Parsons et al., 2003).
No caso dos peixes da família Cichlidae, a plasticidade fenotípica e as
variações estruturais apresentadas são bem evidentes, assumindo um importante papel
no desenvolvimento evolutivo, ecológico e comportamental de cada espécie
(Klingenberg et al., 2003), como é visto nos ciclídeos dos lagos africanos, que
representam um excepcional exemplo de especiação, diversificação, irradiação e
convergência adaptativa, possuindo elevado número de morfotipos e variação
morfológicas, além dos altos níveis de endemismo (Greenwood, 1991; Joyce et al.
2005). Dessa forma, torna-se importante a determinação do grau de variação
morfométrico, assim como das características morfológicas neste grupo de peixes,
podendo ser de grande valia o uso combinado de ferramentas moleculares neste tipo
de quantificação, auxiliando na elaboração dos prováveis mecanismos evolutivos
atuantes na diversificação desses peixes (Monteiro; Gomes-Jr, 2005; Kassan et al.,
2007).
Kocher et al (1993), utilizando dados do DNA mitocondrial e de morfometria,
identificaram separação genética entre dois ciclídeos de morfotipos similares entre dois
lagos africanos Malawi e Tanganyika, mostrando que outros aspectos, além dos
genéticos, estão influenciando o padrão morfométrico observado. Monteiro e Gomes-Jr
(2005), utilizando dados combinados de morfometria geométrica e parâmetros
genéticos (herdabilidade, Ne e número de gerações) encontraram tendências de seleção
direcional entre populações da espécie de peixes Poecilia vivípara (Poeciliidae),
indicando a existência de aspectos genéticos na determinação morfológica deste
peixes, sendo um exemplo de que este tipo de estudo combinado pode ser de grande
utilidade, podendo ser aplicado em vários grupos de peixes.
48
Já Ready et al., (2006) não encontraram relação entre os dados moleculares e
os morfotipos das espécies do gênero Symphysodon (tribo Heroini), questionando a
determinação morfológica das espécies deste gênero, o que é evidenciado para mais
grupos de heroíneos, em que a variação morfológica e a existência de morfotipos
podem levar a incertezas taxonômicas e evolutivas, como aconteceu com o histórico
taxonômico dos peixes do gênero Pterophyllum (Lowe-McConnell, 1969(a); Kullander,
1986) e com a sistemática e taxonômia dos heroíneos da América Central (Concheiro-
Pérez et al., 2007).
Klingenberg et al. (2003) em estudos com o gênero Amphilophus, utilizando
morfometria geométrica detectaram diferenças significativas entre as três espécies do
estudo (A. citrinellus, A. labiatus, A. zaliosus), especialmente em A.citrinellus, que
apresentou diferenças de acordo com a distribuição geográfica e os morfotipos de cor e
de trófico. Parsons et al. (2003) analisando duas dessas espécies (A. citrinellus, A.
zaliosus) e comparando os dois tipos de abordagem morfométrica (clássica e moderna)
entre si, concluíram que tanto um método quanto o outro eram eficazes em diferenciar
morfologicamente cada espécie, no entanto o poder de resolução de dados oferecido
pela morfometria geométrica era maior, o que também foi visto por Maderbacher et al.
(2008), ao aplicar as duas técnicas morfométricas no estudo morfométrico das
populações de Tropheus moorii do lago Tanganiyka.
Diante da capacidade adaptativa dos ciclídeos, da evidência de diversificação
ecológica e evolutiva dos heroíneos, da variedade morfológica e de morfotipos neste
grupo e do poder de dicernimento taxonômico e de detecção da variação morfológica
oferecido pela morfometria geométrica, o presente trabalho pretende utilizar os dados
de morfometria geométrica e de genética molecular (DNAmt - citocromo b) para testar a
existência das relações existêntes entre os padrões morfológicos e as espécies válidas,
assim como comparar o perfil morfométrico encontrado com a distribuinção genética e
geográfica encontradas nas espécies de ciclídeos do gênero Pterophyllum ao longo da
bacia amazônica, buscando entender os prováveis eventos evolutivos (como
adaptação, plasticidade fenotípica e convergência adaptativa) que resultaram na
variação morfológica observada, buscando justificá-la por meios das teorias
biogeográficas desenvolvidas para o contexto amazônico.
49
1.1. Objetivos
1.1.1 Objetivo Geral
Discutir os padrões de variação morfológica nas espécies do gênero
Pterophyllum ao longo da bacia amazônica, com base na caracterização morfométrica,
na identificação taxonômica, na distribuição geográfica e ambiental e no perfil
haplotípico encontrado, buscando compreender os processos que deliniaram a
diversificação morfológica observada, por meio das ferramentas de morfometria
geométrica, associado aos resultados de genética molecular (gene mitocondrial do
citocromo b) obtidos no capítulo anterior.
1.1.2. Objetivos Específicos
Relacionar a identificação taxonômica com o padrão morfométrico de cada
espécie;
Caracterizar a variação morfométrica nas espécies do gênero Pterophyllum, ao
longo da área coletada;
Testar e discutir as prováveis relações existentes entre os padrões
morfométricos encontrados entre as populações das espécies do gênero
Pterophyllum e sua respectiva caracterização genética;
Testar e discutir as prováveis relações existentes entre os padrões
morfométricos encontrados nas espécies do gênero Pterophyllum e sua
respectiva distribuição geográfica e ambiental.
50
2. Material e Método
2.1. Amostragem
Levando-se em conta a distribuição dos peixes do gênero Pterophyllum na bacia
amazônica (Kullander, 2003), foram coletados 215 espécimes ao longo dos rios: Negro
(Boa Vista N=16, Santa Isabel N=34, Barcelos N=21), Solimões (Iranduba N=16 e
Janauacá N=21), Amazonas (Careiro do Castanho N=28), e alguns afluentes (Purus
N=28, Santarém N=51 na região Solimões X Tapajós), totalizando oito pontos de coleta
(Figura 10), das quais duas foram coletadas, por Tomas Hrbek (Boa Vista a Santa
Isabel). As coletas foram autorizadas pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) sob o processo de n° 02001.000162/2006-67.
O processo de captura foi efetuado com o auxílio de um rapiché e de uma rede
de cerco. Após a captura, anestesiou-se cada exemplar com 0,4 ml -1,0 ml de uma
solução de eugenol 10% (diluído em etanol), de acordo com o protocolo de eutanásia
estabelecido pela American Veterinary Medical Association (AVMA). Posteriormente, a
nadadeira peitoral direita de cada espécime foi removida e fixada em um tubo
eppendorf contendo álcool 95%. Cada amostra de tecido foi depositada na Coleção de
Tecidos de Genética Animal – CTGA (Fiel Depositário/CGEN) do Laboratório de
Evolução e Genética Animal (ICB / UFAM). Após a retirada da nadadeira, cada
indivíduo foi etiquetado e fixado numa solução de formol diluída a 10%, que depois foi
substituída por uma solução de álcool-etanol 70%.
51
2.2. Identificação Taxonômica
Para as comparações morfométricas entre os indivíduos de cada espécie e para
relacionar a identificação taxonômica, baseada em caracteres merísticos, com os dados
morfométricos obtidos, os espécimes coletados foram identificados com base na
descrição taxonômica (abordada no item I, 5 da introdução geral) das espécies
conhecidas para o gênero Pterophyllum, segundo Kullander (1986; 2003), resumida em:
P. scalare: 7,5cm de comprimento padrão (CP); 30-39 escamas ao longo da linha
lateral; presença do entalhe próximo ao focinho; a mancha escura localizada na
base da nadadeira dorsal é menos aparente;
Figura 10: Mapa com a distribuição dos pontos amostrados. As cores sinalizadas dentro de cada circunferência indicam a ocorrência de qual espécie na área coletada. A figura de triângulo (vermelho) simboliza a cidade de Manaus, indicando um ponto de referência. A distância relativa entre os pontos amostrados, considerando o curso dos rios, está exposto no Anexo I.
52
P. altum: 6,5cm de comprimento padrão (CP); 46-48 escamas ao longo da linha
lateral; presença do entalhe próximo ao focinho; a mancha escura localizada na
base da nadadeira dorsal aparente; corpo mais triangular; barras verticais mais
amplas;
P. leopoldi: 5,0cm comprimento padrão (CP); 27-29 escamas ao longo da linha
lateral; entalhe próximo ao focinho menos evidente; mancha escura na base da
nadadeira dorsal bem evidente.
2.3. Métodos Moleculares: Extração de DNA, Amplificação, Seqüenciamento e Análises
Amostras de tecido foram retiradas da nadadeira peitoral e submetidas ao método
de extração de DNA total (nuclear e mitocondrial) via proteinase K/ fenol/ clorofórmio
desenvolvido por Sambrook et al. (1989) e descrito na seção 2 do material e método
(2.3. Métodos Moleculares: Extração de DNA, Amplificação e Seqüenciamento) do
capítulo anterior, assim como os procedimentos de amplificação e seqüenciamento do
gene mitocondrial do citocromo b. Com estes dados foi gerada uma árvore de
relacionamento de haplótipos de Máxima Verossimilhança, seguindo os critérios de
analíticos propostos na seção 2.4.2.a. do capítulo 1, resultando na árvore filogenética
representada pela figura 7. Neste capítulo os dados moleculares filogenéticos serão
utilizados com o objetivo de relacionar os padrões morfométricos encontrados entre as
espécies e as populações das espécies do gênero Pterophyllum e sua respectiva
caracterização genética.
53
2.4. Métodos Morfométricos
2.4. 1. Coleta de dados Morfométricos
Cada exemplar fixado em formol e transferidos para o álcool 70% teve seu perfil
esquerdo fotografado por uma câmera digital (Cânon EOS Rebel XT), em máxima
resolução, mantendo sempre a câmera na mesma distância, em posição perpendicular
e central ao exemplar, com zoom constante de 5.5 mm (zoom natural), utilizando
somente o foco e a luminosidade como recurso fotográfico. Foram escolhidos de 15 –
20 indivíduos por localidade, totalizando 142 indivíduos (Santa Isabel N=22; Barcelos
N=18; Boa Vista N=16; Purus N=20; Iranduba N=9; Janauaca N=20; Santarém N=20;
Careriro do Castanho N=17). Os espécimes que tiveram sua boca e opérculos fixados
acidentalmente abertos foram descartados deste estudo.
2.4.2. Demarcação de pontos anatômicos e Obtenção de dados morfométricos
Em cada indivíduo fotografado foram digitalizados pontos anatômicos
referências, num total de dezenove, utilizando o aplicativo tpsDig/2.10/2006 (Rohlf,
2006). Os pontos foram selecionados com base no critério de homologia morfométrica e
pela maior capacidade de cobrir a extensão corporal (Sneath; Sokal, 1973), utilizando
como referencial os esquemas de marcos anatômicos propostos por Klingenberg et al.,
2003 e Parsons et al., 2003, sumarizado na figura abaixo (Figura 11).
A obtenção dos dados brutos de morfometria geométrica foi efetuada, seguindo
a metodologia de sobreposição dos marcos anatômicos GLS (Generalized Least
Squares Procrustes Superimposition – Supersobreposição dos Quadrados Mínimos de
Procrustes), que utiliza como critério de otimização a soma mínima dos quadrados das
distâncias, ou distância de Procrustes, entre os pontos homólogos (Rohlf; Slice, 1990;
Rohlf; Marcus, 1993), retirando, consequentemente, da análise morfométrica os efeitos
do tamanho, da localização e da posição corporal (Bookstein, 1989; Monteiro; Gomes-
54
Jr, 2005). Dessa maneira, de cada espécime, fotografado e marcado com os pontos, é
calculado seu respectivo centro de configuração (média das coordenadas X e Y de
cada ponto). Com isso, uma medida conhecida como centróide é calculada (raiz
quadrada da soma dos quadrados das distâncias entre todos os pontos da configuração
e seu respectivo centro), sendo esta a única medida de tamanho morfométrico
considerada, por ser desvinculada da forma (Zelditch et al, 2004). Feito isto, uma
configuração de pontos foi selecionada ao acaso e, a partir desta, outras configurações
foram sobrepostas, passando por eventos de translação, rotação e escalonamento,
tendo como base de referência o centróide (escalonado para o valor de 1 e centrado na
origem 0,0) e os pontos homólogos de cada configuração, utilizando como método de
otimização a soma mínima dos quadrados das distâncias entre os pontos homólogos
das configurações. Então uma configuração média é calculada e o processo de
sobreposição é iniciado mais de uma vez até a configuração média resultante do último
ciclo de sobreposição não se diferencie da configuração média gerada do ciclo anterior
(Rohlf; Slice 1990; Rohlf; Marcus 1993), sendo esta a configuração média chamada de
“consenso”. Como conseqüência dos efeitos de translação, rotação e escalonamento as
formas comparadas entre si assumem novas posições no espaço (conhecida como
espaço de Kendall, ou espaço forma), que ao serem projetadas em um espaço
tangente, foram traduzidas em novas coordenadas de (X, Y) de pontos. Estas
coordenadas alinhadas foram, então, projetadas num espaço de deformação, gerando
componentes de deformação parciais e uniformes, sendo estes as variáveis utilizadas
nas análises (Monteiro et al., 2002; Zelditch. et al, 2004; Monteiro; Gomes-Jr, 2005).
Estes componentes de deformação refletem as diferenças entre uma dada forma em
relação a uma outra configuração de referência (muitas vezes é a forma consenso).
Neste caso, a referência utilizada foi o consenso de todas as configurações gerado pela
sobreposição dos marcos anatômicos GLS (Generalized Least Squares Procrustes
Superimposition – Supersobreposição dos Quadrados Mínimos de Procrustes). A
utilização dos componentes parciais e uniformes é muito comum na literatura como
meio de acesso as variações estruturais da forma e como dados para análises
estatísticas multivariadas (Bookstein, 1991).
55
A sobreposição de imagens foi efetuada no aplicativo tpsSuper/1.14/2004
(Rohlf, 2007) e os componentes de deformação uniformes e parciais foram obtidos pelo
aplicativo tpsRelw/1.45/2007.
2.5. Análises Estatísticas
Com as variáveis geradas (dados da distância de Procrustes transformados)
pelo procedimento descrito acima (Supersobreposição dos Quadrados Mínimos de
Procrustes) estavam correlacionadas, foi efetuado uma Análise de Componentes
Principais ACP (Principal Components Analysis - PCA) para produzir um menor número
de variáveis independentes. Os primeiros componentes gerados pela análise, que
compreendessem 50% da variação total morfológica (Gauch, 1982, Simões et al.,2008)
foram utilizados como variáveis dependentes em uma análise de variância multivariada
(MANOVA), para testar a significância da variação morfológica entre os grupos
taxonômicos de cada indivíduo e entre as localidades coletadas neste estudo expostas
na seção 2.1 do material e método neste capítulo. A delimitação dos táxons foi
desenvolvida com base: 1) na identificação taxonômica (por meio dos caracteres
merísticos descritos na seção 2.2 do material e método deste capítulo) e 2) na
caracterização molecular genética (com base no perfil molecular do gene mitocondrial
do citocromo b obtido no capítulo 1), resultado de uma árvore de haplótipos de Máxima
Verossilhança (MV) (Felsenstein, 1981) gerada no capítulo anterior deste trabalho
(Figura 7). Seis morfotipos incluídos não tiveram sua seqüência determinada e,
portanto, não ocuparam posição na árvore de MV (Máxima Verossimilhança). Todas as
análises estatísticas foram realizadas através do programa computacional Systat/8.0
(Wilkinson, 1998). O critério de escolha dos primeiros componentes principais que
totalizem a soma de 50% de toda a variação encontrada tem como respaldo o fato de
que os primeiros componentes principais contém a maior parte da informação de
similaridade entre amostras, ao passo que componentes principais mais distantes
tendem a reter variação relativa ao ruído do tratamento adotado (Gauch, 1982).
56
Figura 11: Descrição esquemática de pontos anatômicos. 1. Junção entre o pré-maxilar e o etmoidal; 2. Junção entre o lábio inferior e a mandíbula; 3. Concavidade pré-dorsal; 4. Final da porção mandibular; 5. Margem anterior ocular; 6. Margem posterior ocular; 7. Margem inferior ocular; 8. Limite opercular; 9. Base superior da nadadeira peitoral; 10. Base inferior da nadadeira peitoral; 11. Base anterior da nadadeira pélvica; 12. Base posterior da nadadeira pélvica; 13. Base anterior da nadadeira anal; 14. Base posterior da nadadeira anal;
15. Base inferior da nadadeira caudal;
16. Base superior da
57
3. Resultados
Do total de indivíduos fixados (N=215), foram selecionadas, de acordo com as
condições de fixação, 142 amostras (Santa Isabel N=22 – 3 P. scalare + 19 P. altum;
Barcelos N=18 – P. scalare; Boa Vista N=16 – 4 P. scalare + 12 P. altum; Purus N=20 –
P. scalare; Iranduba N=9 – P. scalare; Janauaca N=20 – P. scalare; Santarém N=20 –
P. scalare; Careiro do Castanho N=17 – P. scalare), que ao serem fotografadas e
analisadas, pela Supersobreposição dos Quadrados Mínimos de Procrustes, geraram,
para cada configuração, 17 variáveis morfométricas (1 componente de deformação
uniforme e 16 componentes de deformação parciais, projetadas nos eixos X e Y). No
entanto, somente os 16 componentes de deformação parciais foram usados, porque
representam variações de deformação entre determinadas regiões da forma corporal,
enquanto que os componentes de deformação uniformes, embora informativos, refletem
variações morfométricas na sua totalidade, num único sentido e em eixos ortogonais, o
que impossibilita a identificação de variações morfológicas regionais e diluí variações
morfométricas localizadas.
Esses componentes de deformação parciais, ao serem reduzidos de
dimensionalidade, resultaram em trinta e dois componentes principais, dos quais
somente os cinco primeiros (CP1 = 22,97%; CP2 = 14,79%; CP3 = 10,12%; CP4 =
7,72%; CP5 = 5,34%) foram utilizados como variáveis dependentes, porque explicaram
maior parte da variação observada, num total de 60,9%. Além disso, os eigenvalues
resultantes em cada componente foram > 1,5 e possuem maior parte da explicação
para a distribuição da variação morfométrica encontrada, segundo o scree plot obtido
neste modelo de ordenação em componentes principais.
Algumas das variáveis, nos quatro primeiros componentes, obtiveram maiores
escores (valores de loadings > 0,600) do que outras, indicando que algumas das
variáveis morfométricas tiveram maior contribuição na distribuição da variação
morfológica em cada componente (principalmente nos dois primeiros componentes), o
que pode ser visto nos valores de loadings marcados de azul na tabela 7.
58
No teste estatístico de MANOVA, com os cinco primeiros componentes principais
como variáveis dependentes, observou-se significância entre a variação morfológica e
as diferentes localidades (Wilks' Lambda = 0,040; p < 0,001; 35 g.l., onde PC1, PC2,
PC4 e PC5 com p < 0,001). Também foi encontrado resultado significativo com relação
ao grupo haplotípico de cada indivíduo, sua caracterização taxonômica e a variação
morfológica encontrada (Wilks' Lambda = 0,194; p < 0,001; 10 g.l., onde PC1 com p <
0,001 e PC2 e PC4<0,05). A separação da distribuição morfométrica dos indivíduos em
relação aos grupos de haplótipos, espécies e as diferentes localidades também foi
evidenciada na representação gráfica dos componentes 1 e 2, sendo marcante ao
longo do componente principal 1 (CP1) a separação em relação à espécie (P. scalare e
P. altum) e ao grupo haplotípico (Ptero2 e Ptero3), concordando com a identificação
taxonômica morfológica e estrutura filogenética (do capítulo 1) das espécies P. altum e
P. scalare (Gráfico 3). Além disso, foi observado que a separação entre estas espécies
e o grupo haplotípico está mais relacionada às variáveis de maior peso neste
componente: PW11_X; PW12_X; PW15_X; PW15_Y; PW16_X e PW16_Y, o que reflete
diferenças pontuais entre o formato corporal dessas duas espécies (P. altum e P.
scalare), resultando na significância observada (Tabela 7). Ainda foi visto que 4 das 6
variáveis morfométricas com os maiores escores estiveram relacionadas à variação da
forma no eixo longitudinal (no eixo X) dos pontos, refletindo uma deformação maior
nesse sentido entre os peixes analisados dos diferentes haplótipos e espécies (Tabela
7).
Já no componente principal 2 (CP2) ficou mais evidente a distinção dos
morfotipos organizada de acordo com as localidades (Gráfico 4), sendo que a variação
morfométrica significativa observada entre as localidades teve maior contribuição das
variáveis PW5_X; PW5_Y e PW9_Y, possuindo os maiores loadings neste componente
(Tabela 7), indicando maior variação latitudinal (no eixo Y) entre os peixes de
localidades distintas. Ainda neste componente, foi observado que os espécimes de P.
altum das localidades de Boa Vista e Santa Isabel mostraram pouca sobreposição na
distribuição gráfica deste componente, o mesmo ocorreu para P. scalare provenientes
do rio Negro que mostraram uma separação gráfica em comparação as demais
localidades coletadas desta espécie (Gráfico 3), o que será discutido mais adiante.
59
Através da determinação morfométrica foi possível sugerir o grupo haplotípico
dos seis indivíduos, que não foram determinados no capítulo 1 sendo, cinco indivíduos
da espécie P. altum (Ptero2) e um P. scalare (Ptero3), corroborando com a identificação
taxonômica desses espécimes (Gráfico 3). Não foi possível testar a separação
morfométrica de P. leopoldi dentro do grupo porque não se obteve espécimes coletados
e fixados desta espécie para as análises.
Variável Morfométrica CP1 CP2 CP3 CP4 CP5 PW1_X 0,316 -0,167 0,763 0,301 0,118 PW1_Y 0,386 -0,320 0,547 -0,008 0,099 PW2_X 0,290 0,596 -0,426 -0,164 -0,02 PW2_Y 0,414 0,402 -0,295 -0,142 -0,296 PW3_X 0,105 0,010 -0,184 0,411 0,108 PW3_Y 0,542 0,344 0,042 0,378 -0,228 PW4_X -0,506 0,210 0,220 0,354 -0,102 PW4_Y 0,046 0,495 0,198 0,202 0,015 PW5_X 0,058 -0,665 -0,556 0,139 0,166 PW5_Y 0,208 0,740 -0,493 -0,128 -0,018 PW6_X 0,026 0,286 0,143 0,473 0,538 PW6_Y -0,535 -0,070 -0,117 -0,538 0,181 PW7_X 0,353 -0,469 -0,162 0,083 0,057 PW7_Y -0,564 0,039 0,162 -0,219 0,084 PW8_X -0,105 0,587 0,535 -0,299 0,107 PW8_Y 0,095 -0,356 0,672 0,159 -0,319 PW9_X -0,008 0,238 0,321 -0,604 0,255 PW9_Y -0,270 -0,624 0,103 -0,238 0,424
PW10_X -0,103 0,555 0,037 0,317 -0,108 PW10_Y -0,412 -0,204 -0,014 0,315 0,182 PW11_X 0,645 -0,381 0,179 -0,137 -0,333 PW11_Y 0,355 0,332 0,448 -0,505 0,076 PW12_X -0,821 -0,153 -0,125 -0,141 -0,092 PW12_Y -0,553 -0,225 -0,315 0,106 0,152 PW13_X 0,561 -0,172 0,102 0,211 0,225 PW13_Y -0,452 -0,215 0,186 -0,174 -0,537 PW14_X 0,331 0,586 0,037 0,106 0,398 PW14_Y -0,673 0,433 0,152 0,191 -0,083 PW15_X -0,798 0,084 0,062 -0,074 0,210 PW15_Y -0,847 0,061 0,187 0,194 0,025 PW16_X -0,772 0,401 0,135 0,128 -0,099 PW16_Y -0,826 -0,081 -0,010 0,170 -0,233
Eigenvalues 7,353 4,735 3,239 2,471 1,711 % da variação explicada 22,97 14,79 10,12 7,72 5,3
Tabela 7: Pesos das variáveis morfométricas sobre os cinco primeiros componentes da análise de componentes principais. Os valores marcados de azul indicam os maiores loadings (>0,600) obtidos.
60
Gráfico 3: Distribuição dos haplótipos ao longo dos dois primeiros componentes principais construídos com as variáveis morfométricas.
Gráfico 4: Distribuição das localidades amostradas ao longo dos dois primeiros componentes principais construídos com as variáveis morfométricas.
61
Considerando o padrão de distribuição da variação morfométrica encontrado ao
longo da distribuição geográfica do grupo P. scalare (Ptero3) (Gráfico 3), foi aplicado,
novamente, uma Análise de Componentes Principias (ACP/PCA), para a redução de
dimensionalidade das variáveis correlacionadas em um número menor de variáveis
independentes, utilizando somente as variáveis morfométricas dos indivíduos do grupo
P. scalare (Ptero3), considerando, também, o indivíduo molecularmente não
determinado, mas taxonomicamente P. scalare e agrupado morfometricamente neste
grupo (Gráfico 3). Como resultado observou-se que os cinco primeiros componentes
principais explicaram 54,58% da variação morfológica do grupo P. scalare (Ptero3)
(CP1=19,56%; CP2=13,29%; CP3=9,05%; CP4=6,49%; CP5=6,16%) com eigenvalues
> 1,9. No entanto, somente os quatro primeiros componentes foram responsáveis pela
maior parte da explicação para a distribuição da variação morfométrica encontrada,
enquanto que o quinto componente principal possuiu grande parte da variação
observada relativa ao ruído do tratamento adotado, de acordo com o scree plot obtido
neste modelo de ordenação em componentes principais. Por isso, só serão utilizados
os quatro primeiros componentes principais para as análises estatísticas multivariadas.
Os quatro primeiros componentes principais (CP1, CP2, CP3 e CP4)
apresentaram algumas variáveis com valores de loadings maiores em relação aos
demais (p > 0,600) (Tabela 8), o que está relacionado à maior contribuição destas
variáveis morfométricas para a distribuição morfométrica em cada componente. Na
organização espacial morfométrica do componente principal 1, foi notado que os
indivíduos da espécie P. scalare estavam distribuídos graficamente em dois grandes
grupos o quais foram chamados de “negro”: Barcelos (todos indivíduos/N=18) + Santa
Isabel (todos indivíduos/N=3) + Boa Vista (N=3) + Careiro do Castanho (N=1), maioria
do rio negro, e o outro “branco”: Santarém (todos indivíduos/N=20) + Janauaca (todos
indivíduos/N=20) + Iranduba (todos indivíduos/N=9) + Purus (todos indivíduos/N=20) +
Careiro do Castanho (N=16) + Boa Vista (N=1), grande parte relacionada à calha dos
rios Solimões-Amazonas (Gráfico 5).
Com estes grupos, separados seguindo a distribuição espacial no primeiro
componente principal do gráfico 5, como variáveis independentes e os quatro primeiros
componentes principais obtidos como variáveis dependentes foi desenvolvido uma
62
MANOVA para testar a significância da variação morfométrica em relação à distribuição
das localidades de P. scalare nestes dois grupos (Ptero3). O resultado foi um F
significativo (Wilks' Lambda = 0,262; p < 0,001; 4 g.l., onde PC1 com p < 0,001). Na
representação gráfica da distribuição morfológica de P. scalare (Ptero3) nestes dois
grupos, notou-se uma separação ao longo do eixo PC1, tendo como variáveis de maior
peso: PW5_X; PW10_X; PW11_X; PW14_Y; PW15_Y; PW16_X (Gráfico 6), estando a
variação morfométrica mais relacionada ao eixo X (longitudinal) entre os peixes desses
dois conjuntos geográficos, contribuindo para a significância observada na MANOVA.
63
Variável Morfométrica CP1 CP2 CP3 CP4 CP5 PW1_X 0,028 0,803 -0,096 0,196 -0,097 PW1_Y -0,383 0,658 -0,036 -0,045 -0,455 PW2_X 0,348 -0,428 -0,240 -0,329 0,112 PW2_Y 0,118 -0,274 -0,122 -0,151 0,637 PW3_X 0,09 -0,202 -0,337 -0,010 -0,216 PW3_Y 0,209 0,141 -0,441 -0,383 -0,276 PW4_X 0,564 0,070 0,248 0,131 -0,101 PW4_Y 0,549 0,159 0,003 0,134 0,03 PW5_X -0,695 -0,489 -0,254 0,127 -0,016 PW5_Y 0,566 -0,603 -0,073 -0,062 -0,139 PW6_X 0,349 0,159 -0,499 0,189 -0,246 PW6_Y -0,043 -0,178 0,385 0,293 0,225 PW7_X -0,518 -0,119 0,051 0,397 0,047 PW7_Y 0,228 0,192 -0,059 -0,201 0,375 PW8_X 0,582 0,552 0,009 -0,067 0,168 PW8_Y -0,158 0,723 0,096 -0,166 0,266 PW9_X -0,019 0,512 0,005 0,257 0,236 PW9_Y -0,556 0,086 0,131 0,464 0,184
PW10_X 0,659 -0,062 0,014 -0,062 0,068 PW10_Y 0,114 -0,156 0,223 0,605 -0,366 PW11_X -0,644 0,195 0,436 -0,290 -0,003 PW11_Y 0,078 0,674 0,076 0,016 0,251 PW12_X 0,006 -0,236 0,572 -0,192 -0,320 PW12_Y 0,051 -0,498 -0,107 0,297 0,541 PW13_X -0,296 0,230 -0,721 -0,092 0,175 PW13_Y -0,064 0,200 0,549 -0,257 0,162 PW14_X 0,527 0,086 -0,425 0,333 -0,032 PW14_Y 0,773 0,056 0,044 -0,116 -0,011 PW15_X 0,437 0,214 -0,083 0,511 0,157 PW15_Y 0,674 0,109 0,239 0,161 -0,225 PW16_X 0,832 0,027 0,162 -0,078 0,090 PW16_Y 0,462 -0,180 0,517 0,032 0,064
Eigenvalues 6,261 4,254 2,899 2,080 1,972 % da variação explicada 19,565 13,293 9,059 6,499 6,162
Tabela 8: Pesos das variáveis morfométricas sobre os cinco primeiros componentes da análise de componentes principais na espécie P. scalare (grupo Ptero 3). Os valores marcados de azul indicam os maiores loadings
(>0,600) obtidos.
64
Gráfico 5: Distribuição das localidades amostradas da espécie P. scalare (grupo Ptero 3) ao longo dos dois primeiros componentes principais construídos com as variáveis morfométricas.
Gráfico 6: Distribuição das populações amostradas da espécie P. scalare (grupo Ptero 3) ao longo dos dois primeiros componentes principais construídos com as variáveis morfométricas.
65
4. Discussão e Conclusão
Neste estudo observaram-se variações morfométricas significativas
relacionadas às espécies válidas, ao grupo haplotípico e à distribuição geográfica,
sugerindo que fatores taxonômicos, filogenéticos, genéticos e ambientais estão
influenciando o perfil morfométrico destes peixes. Klingenberg e colaboradores (2003)
ao estudarem três espécies de ciclídeos do gênero Amphilophus em lagos próximos da
Nicarágua encontraram variação morfométrica significativa entre as três espécies
estudadas, corroborando descrições taxonômicas pré-existentes para o grupo. No
entanto, Ready e colaboradores (2006) encontraram certa dificuladade para separar
morfologicamente duas espécies descritas para o gênero Symphysodon (S. discus e S.
aequifasciatus), conseguindo identificar morfologicamente somente a espécie S. tarzoo
neste genêro.
Considerando a distribuição morfométrica ao longo dos componentes principais
foi possível constatar que a maior parte da variação morfométrica encontrada foi
explicada por divergência genética entre as linhagens de P. scalare e P. altum,
representando 22,97% da variação observada no componente principal 1, seguido pela
variação morfológica de acordo com a distribuição geográfica coletada, explicando
14,5% da variação observada no componente principal 2 (Gráficos 3 e 4), sendo que
algumas das váriáveis morfométricas obtidas tiveram maior peso em relação às demais
variáveis, indicando que algumas regiões do formato corporal entre os grupos
analisados (de espécies e de locadidades amostradas) foram mais responsáveis pela
separação morfométrica significativa observada (Tabela 7), mostrando que a variação
morfológica na direção do eixo X contribuiu mais para as varições entre as espécies e
grupo haplotípico e as variações no eixo Y tiveram maior peso para as diferenças
significativas observadas entre os pontos coletados.
Olhando separadamente a variação morfológica resultante entre as localidades
amostradas nas espécies de P. altum (Ptero2) (Gráfico 4) e P. scalare (Ptero3)
(Gráficos 4 e 5), é possível sugerir a atuação de fatores ecológicos locais mostrando um
exemplo da capacidade adaptativa da família Cichlidae e da tribo Heroini (Lowe-
McConnell, 1969b; 1999; Kocher, 2004; Concheiro-Pérez et al., 2007).
66
Outro fato, relacionado à distribuição morfométrica entre as localidades
amostradas, está no comportamento de ocupação espacial ao longo do componente
principal 2 das duas espécies (P. altum e P. scalare), que em simpatria (Santa Isabel e
Boa Vista) estão dispostas espacialmente, neste componente, com pouca sobreposição
entre os indivíduos, quando comparado ao padrão de distribuição espacial da espécie
P. scalare nas demais regiões, onde ocorre isoladamente. Além disso, grande parte dos
indivíduos na espécie P. scalare das localidades coletadas na calha Solimões-
Amazonas estiveram graficamente dispostos mais próximos dos indivíduos de P. altum,
quando comparados com amostras simpátricas de P. scalare coletados no rio negro
(Gráfico 4), indicando maior similaridade morfométrica entre indivíduos de espécies
diferentes do que dentro de uma mesma espécie. Este padrão de distribuição
morfométrica nas duas espécies pode ser decorrente da existencia de plasticidade
fenotípica, uma vez que em simpátria indivíduos que apresentam nichos ecológicos
similares podem apresentar maior divergência fenotípica quando comparadas em
alopatria por conseqüência da competitividade entre si por recursos (Schluter, 2000;
Adams et al., 2007).
Nas populações amostradas P. scalare foi observado maior variação
morfométrica intralocal do que entre localidades distintas, principalmente entre as
regiões do eixo Solimões – Amazonas (Gráfico 4 e 5). Ready et al (2006) observaram
um padrão parecido de variação morfológica similar ao analisarem populações de
Symphysodon ao longo da bacia amazônica (principalmente entre o eixo Solimões-
Amazonas), sugerindo uma distribuição morfológica populacional pouco relacionada às
localidades amostradas, encontrando maior variação morfológica dentro das
populações consideradas no estudo. Dessa forma, a pequena variação morfológica
encontrada entre as localidades coletadas de Pterophyllum scalare, pode ser
conseqüência da ampla distribuição geográfica deste grupo, ao longo de grandes
tributários e canais principais que, juntamente com as florestas de inundação, podem
estar garantindo um certo nível de fluxo gênico entre regiões (Tabela 4 do Capítulo 1),
mantendo a similaridade genética (Tabela 6 do Capítulo 1) e a menor variação
morfológica ao longo da área estudada. Cantanhede e colaboradores (2005),
estudando populações de peixe boi da espécie Trichechus inunguis, mamífero com
67
distribuição ampla na bacia amazônica, encontraram relativo fluxo gênico e semelhança
fenotípica entre as diferentes populações do grupo, considerando-o como uma
população panmítica mantida pela dispersão relacionada à dinâmica das planícies de
inundação, o que também foi visto por Hrbek et al. (2005) em populações de pirarucu
(Araipama gigas). Outra hipótese, aqui sugerida, é de nível ecológico e comportamental
em que a ampla distribuição geográfica e a menor sobreposição dos indivíduos e das
espécies, associadas à abundante disponibilidade de recursos pode estar gerando uma
distribuição morfológica mais homogenia entre as localidades. No entanto, maiores
esforços devem ser aplicados no desenvolvimento e na validação desta última hipótese.
Um outro padrão de distribuição morfométrica pode ser sugerido ao olharmos
para o gráfico 5 e 6 com relação aos indivíduos da espécie P. scalare (Ptero3) das
localidades de Barcelos, Boa Vista e Santa Izabel, resultando em uma significativa
separação morfológica destes pontos em relação aos demais morfotipos das outras
regiões, ao longo do componente principal 1. Uma possível explicação pode estar nas
diferenças de origem e de composição química e física das águas dos principais
afluentes (rios Negro, Solimões e Amazonas), onde estas localidades estão situadas,
influenciando a diferenciação morfológica, o reduzido fluxo gênico e a estrutura
genética populacional observados entre estas regiões em relação as outras localidades
(Gráfico 5 e Tabela 4 do Capítulo 1) (Sioli, 1984; Lowe-McConnell, 1991). Um fenômeno
similar foi constatado na diferenciação genética (Vasconcelos et al., 2006; Willis et al.,
2007) e morfológica (Willis et al., 2007) em outros grupos de animais distribuídos ao
longo dos principais tributários da bacia amazônica, sendo considerado como um fator
geológico limitante para distribuição geográfica das espécies e para o fluxo gênico
populacional, promovendo oportunidades de diversificação (Willis et al., 2007). Por
outro lado, a diferenciação morfológica encontrada em P. scalare situado nesses dois
tipos de água pode estar relacionado ao reduzido fluxo gênico entre estas duas
drenagens, originando um padrão morfológico distinto apenas pelo acumulo de
diferenças morfométricas por deriva genética. Para verificar a existência de relações
entre a variação morfológica e as diferenças ambientais é preciso localizar e definir a
importância ecológica das diferenças morfológicas encontradas, o que está previsto
futuramente neste trabalho.
68
Numa visão conjunta de todo o contexto de distribuição morfológica entre as
localidades nota-se uma separação morfométrica entre os indivíduos da região de
Barcelos (Gráficos 4 e 5) e as localidades restantes, apresentando um perfil de
distribuição haplotípica semelhante quando comparada a árvore e a rede de haplótipos
(Figura 7; Figura 9), gerados no capítulo 1. Mesmo com o conhecimento da influência
de eventos geológicos (como os arcos geológicos Purus e Vaupés) na modelagem do
rio Negro (Lundberg, 1998), pouco se conhece sobre a existência de alguma barreira
geológica significativa e especifica nesta região. Além disso, registros científicos que
descrevam padrões morfológicos e biogeográficos semelhantes em outros grupos de
animais são inexistentes. Porém não pode descartar a existência de uma diferenciação
morfológica e genética e que fatores ambientais históricos e/ou atuais estejam
relacionados à separação morfológica e genética observada, assumindo o papel de
causa (primário) ou de manutenção (secundário) do resultado observado, levando-se
em consideração a complexidade em se distinguir eventos ecológicos primários de
secundários (Coyne; Orr, 2004). Provavelmene essa diferenciação morfológica pode ser
resultante da maior influência do rio Branco na região de Barcelos e da diferenciação
química na qualidade da água antes e depois da confluência do rio Branco com o
Negro, como já foi sugerido no capítulo 1, levando tanto a diferencição morfológica,
como genética dos peixes nessa região.
Num contexto geral, a utilização em conjunto de ferramentas moleculares e de
morfometria geométrica pode ser de grande valia em estudos evolutivos, principalmente
em organismos que apresentam alta variabilidade morfológica e difierentes morfotipos,
como é o caso dos peixes do gênero Pterophyllum. Apesar da existência de diferentes
morfotipos em P. scalare, foi possível separar morfometricamente duas espécies de
Pterophyllum (P. altum e P. scalare), concordando com a identificação taxonômica e a
estrutura filogenética molecular de P. scalare (Ptero3) e P. altum (Ptero2) observada no
primeiro capítulo.
Além disso, o perfil de variação e determinação morfológica encontrados nos
nas duas espécies de Pterophyllum estudadas é composto por fatores tanto ambientais
(extrínsecos) quanto genéticos (intrínsecos), existindo variação morfológica
intraespecífica, condicionadas pelo fluxo gênico (migração), pela dinâmica das planícies
69
de inundação, pela composição das águas, por adaptações morfológicas ambientais e
pela existência de plasticidade fenotípica nestes peixes, refletindo variações
morfométricas em determidadas regiões da forma destes peixes. No entanto, para
verificar a existência de relações entre a variação morfológica e as diferenças
ambientais é preciso localizar e definir a importância ecológica das diferenças
morfológicas encontradas.
70
II. Conclusão Geral
Mesmo existindo na literatura evidências de diferentes mortipos e sobreposição
de alguns caracteres merísticos no gênero Pterophyllum, neste trabalho foi possível
delimitar de maneira molecular e morfológica as espécies existentes no gênero
Pterophyllum (P. scalare, P. altum e P. leopoldi) e a estrutura taxonômica observada no
primeiro capítulo também pode ser vista nos resultados morfométricos do capítulo dois,
exceto para a determinação morfométrica de P. leopoldi. Particularmente na espécie
Pterophyllum scalare, observou-se uma complexa história filogeográfica, modelada por
processos antigos e incertos de fragmentação, seguidos por episódios de expansão
geográfica, juntamente com eventos de fluxo gênico e isolamento influenciados pela
ampla distribuição da espécie. No entanto, não foi encontrado alguma relação entre a
distância geográfica e a diferenciação genética e morfológica ao longo da área
amostrada, mesmo sendo um grupo muito distribuído pela bacia amazônica, possuir
comportamento territorialista e baixa mobilidade associada aos ambientes lenticos. Os
índices de fluxo gênico e a homogeniedade morfológica observados nas comparaçãoes
das áreas coletadas, principalmente, no eixo Solimões-Amazonas, estão possivelmente
relacionados ao sistema das planícies de inundação, que durante a cheia, oferecem
intercomunição entre populações, mesmo distantes entre si, acarretando numa maior
variabilidade genética e morfológica intrapopulacional do que entre populações. A
homogeineidade morfológica na espécie P. scalare observada em toda extenção
coletada da drenagem Solimões-Amazonas, também, pode ter explicações ecológicas
decorrentes da disponibilidade de recursos e inexistência de espécies simpátricas, ao
contrário do que é visto nas regiões de simpatria entre P. scalare e P. altum, sugerindo
a existência de plasticidade fenotípica em P. scalare e que o padrão morfométrico
encontrado nas regiões coletadas de P. altum pode estar sendo influenciado pela
existência de P. scalare nas regiões de Sante Isabel e Boa Vista.
As diferenças químicas e físicas das águas se caracterizaram como um fator
limitante para migração entre as localidades estudadas de Pterophyllum scalare,
resultando numa estrutura populacional entre essas águas, que, também, modelaram
uma diferenciação morfológica entre os distintos tipos de águas, sendo considerado,
71
por outros trabalhos, como um fator geológico limitante para distribuição geográfica das
espécies e para o fluxo gênico, promovendo oportunidades de diversificação. O padrão
diferenciado molecular e morfológico de Pterophyllum scalare da região de Barcelos em
relação as demais localidades pode ser decorrente da influência da drenagem do rio
Branco nesta região e pelas diferenças químicas existentes antes e depois da
confluência deste rio com o Negro, porém maiores esforços devem ser aplicados para a
validação desta hipótese. No entanto, embora se tenha observado morfometricamente
diferenciação significativa relacionada à variação geográfica que foram associadas às
propriedades químicas e físicas das águas e mesmo encontrando maior contribuição de
algumas regiões morfológicas nos padrões morfométricos resultantes, é preciso
associar as diferenças morfométricas obtidas à importância ecológica entre as
diferentes localidades e ambientes para que se tenha entendimento do valor adaptativo
e evolutivo, uma vez que as diferenças morfométricas encontradas podem ser
meramente resultado de acúmulo por deriva genética. Neste trabalho o marcador
molecular do citocromo b mostrou-se um bom marcador molecular, sendo eficaz em
estudos filogenéticos e de taxonomia molecular, concordando com identificação
taxonômica efetuada e o perfil morfométrico obtido dos espécimes coletados. A análise
combinada entre morfometria geométrica e genética molecular pode ser de grande valia
na determinação de eventos evolutivos, dando maior suporte as inferências evolutivas
aqui trabalhadas.
72
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ANEXOS
ANEXO I DISTÂNCIA GEOGRÁFICA ENTRE LOCALIDADE
Indica-se, neste anexo, a distâncias (em Km) entre as localidades amostradas, de acordo com o curso do rio, por meio do
programa GoogleEarth™.
Localidades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1. Campina **** 2. Catalão 622 **** 3. Purus 244 377 **** 4. Novo Airão 742 200 497 **** 5. Amanã 112 734 689 854 **** 6. Janauacá 557 64 347 185 692 **** 7. Santa Isabel 1.357 741 1.111 621 1.467 797 **** 8. Boa Vista 1.382 759 1.134 639 1.490 820 30 **** 9. Mamirauá 39 660 622 781 96 630 1.394 1.417 **** 10. Santarém 1.342 743 1.097 863 1.454 784 1.479 1.503 1.381 **** 11. Careiro do Castanho 675 114 430 249 787 75 864 888 713 786 **** 12. Iranduba 573 61 326 181 669 36 797 818 610 781 111 **** 13. Barcelos 1.060 438 811 318 1.167 521 303 321 1.094 1.181 567 494 **** 14. Careiro da Várzea 628 38 384 157 740 71 773 797 667 716 121 68 476 ****
90
ANEXO II
Indica-se, neste anexo, as distribuição haplotípica das espécies P.altum e P.scalare no network do NCA (Nested Clade
Analysis) (Figuras 8 e 9) .
Network : Pterophyllum altum
Campina
Catalão
Purus
Novo Airão
Amanã
Janauacá
Santa Isabel
Boa Vista
Mamirauá
Santarém
Careiro do Castanho Iranduba
Barcelos
Haplótipos N°
1 1 2 5 3 1 4 1 5 2 6 4 7 3 8 1 9 5
10 1 TOTAL 0 0 0 0 0 0 14 10 0 0 0 0 0
91
Network : Pterophyllum scalare Campina Catalão
Purus
Novo Airão
Amanã Janauacá
Santa Isabel
Boa Vista Mamirauá
Santarém Careiro do
Castanho Iranduba
Barcelos
Haplótipos N°
1 3 2 1 3 1 4 1 5 1 6 2 7 1 8 1 1 9 1
10 1 11 1 12 1 4 13 1 14 1 15 3 1 16 1 17 1 18 1 19 2 20 1 21 1 22 1 23 2 24 1 2 25 1 26 4 27 2 28 2 4 1 1 14 28 10 4 29 1
92
Campina Catalão
Purus
Novo Airão
Amanã Janauacá
Santa Isabel
Boa Vista Mamirauá
Santarém Careiro do
Castanho Iranduba
Barcelos
Haplótipo N°
30 3 1 31 1 32 1 33 1 34 1 35 1 36 1 37 1 38 2 39 4 1 1 2 2 40 1 1 41 2 42 1 43 4 44 4 45 1 46 1 47 2 48 2 49 1 50 1 51 1 52 1 1 1 53 1 54 1 55 1 56 4 1 57 1 58 1 59 1 60 6
Continuação
93
Campina Catalão
Purus
Novo Airão
Amanã Janauacá
Santa Isabel
Boa Vista Mamirauá
Santarém Careiro do
Castanho Iranduba
Barcelos
Haplótipo N°
61 1 62 1 63 1 64 1 65 1 66 1 67 1 68 1 69 1 70 1 71 3 1 2 72 1 73 2 74 1 75 1 76 1 77 12 3 78 1 79 1
TOTAL 2 25 22 4 8 18 13 3 30 42 19 12 17
Continuação
94
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