Alexandre Soares Rosado

Unidade de Ecologia microbiana e biotecnologia do

Petróleo do polo de Biotecnologia BIOINOVAR -

UFRJ

13 de setembro de 2013 -UERJ

Biorremediação de ambientes

contaminados por petróleo e

derivados

Origem do Petróleo

O petróleo é originado de grandes deposições fósseis, é uma

mistura bastante complexa de compostos orgânicos e com um alto

conteúdo de energia.

Rocha geradora

Tipos de hidrocarbonetos encontrados no

Petróleo)

• Fração saturada – Parafinas ( n-alcanos, alcanos ramificados) e Naftenos ( cicloalcanos)

• Fração insaturada (aromáticos, oleofinas, diolefinas e acetilênicos)

• Compostos não hidrocarbônicos, como os ácidos naftênicos e sulfurados

Os efeitos tóxicos imediatos

Os efeitos crônicos da poluição com petróleo são pouco conhecidos.

Moléculas de baixa

massa molecular

Moléculas de alta massa

molecular

Toxicidade

Efeitos carcinogênicos e

citogenéticos de longo prazo

Diminuição da diversidade de espécies

Petróleo

A principal fonte de energia do planeta, de distribuíção não

homogênea entre os países e um recurso não-renovável

A sociedade atual é extremamente dependente da utilização de

petróleo para o seu desenvolvimento.

O Petróleo se tornou provavelmente a mais importante substância

negociada entre países e corporações levando a guerras, massacres e

extermínios.

Crise do petróleo na década de 1970

A Primeira Guerra do Golfo

Diferentes guerras entre os países árabes, inclusive a Guerra Irã-Iraque

A luta pela independência da Chechênia

Guerra Iraque-Estados Unidos (Invasão do Iraque)

Petróleo

FONTES DE POLUIÇÃO DE HIDROCARBONETOS NO MAR

Esgoto Industrial e Urbano 62%

Navios não Petroleiros 15%

Fonte Natural 10%

Operação de Petroleiros 7%

Acidentes com Petroleiros 3%

Exploração & Produção 2%

Terminais / Refinarias 1%

Biodegradação

Utilização de hidrocarbonetos por microrganismos:

ZoBell, 1946, observou a capacidade degradativa de

bactérias pertencentes a 30 gêneros

Ampla distribuição na natureza.

Utilização dependente da natureza química e das

condições ambientais.

Ataque inicial por oxigenases

O2 O2

Degradação por vias periféricas

Ciclo TCA

CO2

H2O

PO4 3-

SO4 2-

Fe3+

Biomassa celular

Multiplicação

NH4=

HIDROCARBONETOS

O2

http://www.miamisci.org/microbes/images/soil-bacteria.gif

http://archive.globe.gov/sda/tg97/soil/img/big/forest_soil.jpg

http://www.umcpegypt.umd.edu/img/dna2.jpg

http://earthstar2000.com/ebay/microtube.jpg

http://www.bio.ic.ac.uk/research/rhac/Gel020706-3.gif http://www.stanford.edu/group/CFRL/chromatogram.jpg

http://plantbio.berkeley.edu/~volkman/courses/dendrogram.gif http://www.santarosa.edu/lifesciences/ensatree.gif

DIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA

MICROBIANA PROMOVENDO

SUSTENTABILIDADE”

O que procuramos?

Estudos sobre a diversidade

e

Bioprospecção

microbiana

Uso de “ Tecnologias Limpas”

Aplicação

de ações que levem ao desenvolvimento sustentável

Estratégias de Remediação

Quantidade do contaminante

Características do ambiente

Seleção

Tecnologias mais

adequadas

•Melhor relação custo-benefício

•Tempo de tratamento

Biorremediação

Processo Promissor

Aceitação

•Agências

Reguladoras

•Opinião pública

FORMA “NATURAL” DE TRATAMENTO

Técnica de remediação Euro/m3

Incineração Ex-situ 785

Aterro Ex-situ 231

Lavagem/Trat. térm. 226-229

Fitorremediação 122 (22-222)

Imobilização In/Ex-Situ 112-139

Air Sparging/Bomb. Trat. 91-71

Biorremediação-Landfarming 62-73

Muros reativos/de contenção 50-55

Atenuação natural monitorada 20

Fonte: www.cordis.lu (junho, 2006)

Custos de técnicas de remediação

Países (11) da CEE

Bioestimulação

Bioaumento

Correção de fatores e/ou adição de

nutrientes específicos para garantir a

quantidade e a qualidade da

microbiota nativa

Adição de linhagens microbianas

compatíveis com o local contaminado

TÉCNICAS DE TRATAMENTO BIOLÓGICO

EMM

Manguezais no Brasil:

Também conhecidos como florestas de mangue ou simplesmente mangues, estes ecossistemas costeiros, situam-se na faixa tropical e subtropical do mundo. No Brasil, estes ambientes distribuem-se ao longo da costa desde o Estado do Amapá até Santa Catarina, perfazendo uma área total de 25.000 Km2 (Vergara-Filho, 1993).

Avaliação de diferentes estratégias para

biorremediação de manguezais

I. Avaliação Pré-tratamento

II. Experimento de microcosmo

III. Experimento Piloto

Amostra de manguezal

Análise físico-química

Análise textural

Análise microbiológica

Análise da profundidade de penetração do óleo e potencial Redox

Técnicas convencionais Isolamento e Contagem de

Rizosfera e sedimentos

Caracterização dos isolados e Potencial de biodegradação

Seleção dos isolados degradadores

Técnicas Moleculares Rizosfera e sedimentos

Biblioteca de clones

Perfil genético da comunidade microbiana (PCR/DGGE)

Etapa I

Planejamento fatorial

Microcosmos

Sem a planta Com a planta

Etapa II

Experimento Piloto

Químico (TPH, óleo residual) Monitoramento Físico químico

Toxicológico Ecológico

Etapa III

Diagnóstico do ambiente

Portão Efluente

3m 3m 3m

Amostra composta controle 1

Amostra composta controle 2

Amostra composta controle 3

0

20

40

60

80

100

120

Gama proteobacteria

alpha proteobacteria

delta proteobacteria

beta proteobacteria

Gama proteobacteria

alpha proteobacteria

delta proteobacteria

beta proteobacteria

a b

c d

e

Bacteria (a); Pseudomonas (b); Actinobacteria (c); Betaproteobacteria (d) and; Alphaproteobacteria (e). O manguezal é representado por nove pontos (1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C) e o manguezal de referência é representado pela sigla “cab”. S e R indicam amostras de sedimento ou rizosfera, respectivamente.

log CFU/ml

log CFU/ml

Amostras Contagem

(NMP de mo. Deg.de óleo/ 100mL)

R ctr 23 X 102

R3A 43 X 102

R3B 24 X 103

R3C 21 X 103

R2A 23 X 102

R2B 23 X 102

R2C 93 X 102

R1A 23 X 102

R1B < 3 X 102

R1C 15 X 102

S ctr < 3 X 102

S1 comp. 4 X 102

S2 comp. 9 X 102

S3 comp. 2,3 X 103

A B C D E F

1 2 3 4

Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de óleo

Produção de Biossurfactantes

Inoculação das estirpes degradadoras em meio BH

líquido acrescido de óleo a 0,1% para

acompanhamento do perfil de degradação.

Compostos alvo (µg/l, ppb)

Controle

Estirpe R1C -2A

% de degradação

n C10

825,02

21,09

97,44 n C11

1186,84

5,6

99,52 n C12

1401,15

3,25

99,77 n C13

1954,97

40,58

97,92 n C14

2211,94

47,21

97,86 n C15

2471,63

3,1

99,88 n C16

2452,62

1,68

99,93 n C17

3220,89

28,75

99,1 n C18

1961,78

50,58

97,42 n C19

1631,63

1,1

99,93 n C20

1440,83

1,6

99,99 n C21

1388,57

5,61

99,59 n C22

1193,70

8,05

99,32 n C23

1123,38

10,74

99,04 n C24

1046,75

18,62

98,22 n C25

1040,54

2,42

99,77 n C26

849,03

31,54

96,28 n C27

783,62

2,45

99,7 n C28

550,06

16,09

97,07 n C29

480,66

15,37

96,8 n C30

376,32

18,83

95 n C31

526,44

31,52

94 n C32

383,55

27,80

92,75 n C33

288,29

22,84

92,07 n C34

185,65

12,67

93,17 n C35

144,77

9,72

93,28 n C36

114,29

14,40

87,4 Total

333.521,8

1.287,56

99,61

Montagem do Consórcio

Utilização de bomba peristáltica para formação de células em grânulos

Microcosmos

Produção e plantio das mudas

Montagem do Experimento de campo

Montagem do Experimento de campo

Experimento de biorremediação – Campo e Viveiro

Crescimento Vegetal

Fisiologia Vegetal

Taxa de atividade fotossintética das mudas no viveiro e no manguezal

Produção de pigmentos pelas mudas no viveiro e no campo

Taxa de atividade fotossintética das mudas do

campo e no viveiro submetidas aos diferentes

tratamentos de biorremediação

Análise de teores de nutrientes em amostras foliares

Análises microbiológicas Sedimento

Campo -9 meses após inoculação

Análises microbiológicas Rizosfera

Campo –Antes da inoculação e 3 meses após inoculação

L. racemosa

Análises microbiológicas Rizosfera

Viveiro – 3 meses após inoculação

L. racemosa

Análises microbiológicas Rizosfera

Campo – 6 meses após inoculação

R. mangle

Conclusões, Considerações finais e

Recomendações

O projeto intitulado “Avaliação de diferentes

estratégias para biorremediação de manguezais”

contribuiu de maneira bastante abrangente para guiar

futuros estudos de biorremediação de manguezais.

Além de ter contribuído com um extenso

levantamento acerca da diversidade microbiana de

um manguezal brasileiro, esse trabalho pioneiro,

utilizou pela primeira vez diferentes estratégias de

biorremediação in situ em manguezal brasileiro e

técnicas moleculares de monitoramento microbiano.

Esse é o primeiro estudo a realizar esse tipo de mapeamento e correlação entre a diversidade microbiana (utilizando-se métodos convencionais e moleculares) e a estrutura heterogênea química de manguezais, demonstrando que essa diversidade corresponde às variações químicas de diferentes nichos dentro de um mesmo ambiente.

“DNA Barcoding” Indicadores de qualidade

Montagem do consórcio bacteriano de degradação de óleo a ser aplicado nos

experimentos de biorremediação

Nesse ponto, a equipe se deparou com um dos desafios desse projeto; Montar uma estratégia que permitisse a manutenção do consórcio microbiano e do fertilizante (Bioestímulo) em campo ao longo do tempo, sem que houvesse uma “lavagem” desses inóculos devido à ação da maré. Solução encontrada-Fertilizantes: Fertilizantes de liberação lenta, enterrados no sedimento contido

Solução desenvolvida – Consórcio: As bactérias do consórcio foram “encapsuladas” em uma matriz que além de permitir a manutenção física das bactérias no campo, permitiu ainda a liberação desses organismos gradativamente.

Dessa forma, desenvolvemos e utilizamos uma estratégia utilizando os microrganismos e fertilizantes associados às mudas do replantio, garantindo não apenas a manutenção dos inóculos em campo como ainda o estabelecimento desses nas rizosferas das mudas. Assim, além da aplicação na degradação do óleo no sedimento, as próprias mudas puderam utilizar esses inóculos, que por sua vez permitiram um melhor e mais rápido desenvolvimento das plantas.

Segundo obstáculo

A grande heterogeneidade da distribuição do óleo em manguezais (não permite uma avaliação clara dos resultados das análises de HTP e HPA)

Nossa recomendação é que em estudos de biorremediação de manguezais outros

parâmetros sejam levados em conta para avaliar a recuperação do ambiente, entre eles, o uso de indicadores biológicos de

recuperação como a diversidade microbiana e as respostas vegetais.

Microrganismos já são propostos na literatura como excelentes indicadores de alterações e recuperação ambiental; Quanto aos vegetais, eles são uma das bases do ecossistema manguezal. Dessa forma, havendo recuperação das espécies vegetais em manguezais, outros organismos tendem a retornar a esse ambiente e todo o ecossistema tende a se reestruturar e recuperar.

O monitoramento microbiológico e do desenvolvimento de plantas revelou o eficiente estabelecimento dos inóculos através da observação das alterações dos perfis microbianos de áreas sob diferentes tratamentos (microrganismos indicadores de alterações, no caso, dos tipos de tratamento estabelecidos);

O tratamento de Bioestímulo + Bioaumento proporcionou melhor desenvolvimento das espécies vegetais (tanto L. racemosa quanto R. mangle).

Resultado... Estimulo no crescimento das plantas, degradação de

hidrocarbonetos, manutenção da microbiota nativa

=

Recuperação do ambiente sem causar impactos secundários

EMM

Exploring our microbial collection potential

Agradecimentos:

Raquel Peixoto, Norma

Rumjanek, Andrew Macrae,

Heitor Coutinho

Flavia Freitas, Gina Vasques,

Staffan Kjellberg

Fábio Mota & Lucy Seldin

Petrobras

Embrapa

CNPq

asrosado@micro.ufrj.br