Universidade do Vale do ParabaInstituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Biomodulao de cartilagens articulares tratadas com laser 830nm: caracterizao pormeio de Espectroscopia Raman e Histologia

Luciano Moreira Rosa

Dissertao de Mestrado apresentada aoPrograma de Ps-graduao em EngenhariaBiomdica, como complementao doscrditos necessrios para a obteno do ttulode Mestre em Engenharia Biomdica

So Jos dos Campos, SP

2003

Universidade do Vale do ParabaInstituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Biomodulao de cartilagens articulares tratadas com laser 830nm: caracterizao pormeio de Espectroscopia Raman e Histologia

Luciano Moreira Rosa

Dissertao de Mestrado apresentada aoPrograma de Ps-graduao em EngenhariaBiomdica, como complementao doscrditos necessrios para a obteno do ttulode Mestre em Engenharia Biomdica

Orientador: Prof. Dr. Sokki Sathaiah.

Co-orientador: Prof. Dr. Wellington Ribeiro

So Jos dos Campos, SP

2003

Agradecimentos

A Deus por sempre iluminar-me.

Aos meus pais pela educao, amor e carinho dedicados a mim e aos meus

irmos.

minha famlia, em especial a minha av Virginia urea e famlia de minha

esposa, em especial a sua me Ana Maria por ter sempre to bem me acolhido.

Aos meus colegas e amigos Luciano Valentim, Francis R. Nassar, Rodrigo S.

Santos e Renato J. Soares pelo apoio pessoal e profissional.

Aos colegas do IPD Jos de Oliveira, Cibele Lopes, Rodrigo Labat e a todos que

colaboraram para realizao deste trabalho.

Aos professores da graduao pelos conhecimentos transmitidos que me

possibilitaram a formao continuada na ps-graduao, em especial ao Prof. Paulo C.P.

Deliberato, Prof. Marcelo T. Zanin e Prof. Luis Carlos Guanabara.

Ao Professor Ulysses F. Ervilha pela oportunidade e pela confiana profissional

creditada.

Ao Prof. Dr. Miguel A.C. Salgado pela colaborao e ensinamentos nas anlises

histolgicas realizadas neste presente trabalho e ao tcnico de laboratrio Walter Cruz,

pela colaborao na execuo das lminas histolgicas na Faculdade de Odontologia da

Universidade Estadual Paulista.

Universidade do Vale do Paraba UNIVAP pela possibilidade de realizar

este trabalho.

E ao meu orientador Prof. Dr. Sokki Sathaiah e co-orientador Prof. Dr. Wellington

Ribeiro pelos conhecimentos e orientaes transmitidas durante a realizao deste

trabalho, sem os quais no seria possvel a realizao desta monografia.

Dedicatria

Dedico este trabalho minha amada esposa.

Epgrafe

No atentando ns nas coisas que se vem, mas nas que no se vem; porque as quese vem so temporais, e as que no se vem so eternas

2 Co 2.18

Sumrio

1. Introduo............................................................................................ 1

1.1 Caractersticas da cartilagem articular......................................... 3

1.2 Alteraes da cartilagem articular na ausncia de cargas............. 12

1.3 Terapia laser de baixa potncia em cartilagem articular............... 16

1.4 Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)....... 20

2. Objetivos............................................................................................. 25

3. Mtodos............................................................................................... 27

3.1 Animais.......................................................................................... 28

3.2 Modelo animal............................................................................... 29

3.3 Terapia com laser de baixa potncia.............................................. 30

3.4 Sacrifcio dos animais e retirada dos espcimes............................ 33

3.5 Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)....... 34

3.6 Metodologia estatstica.................................................................. 37

3.7 Anlise histolgica......................................................................... 37

4. Resultados............................................................................................ 39

4.1 Modelo Animal.............................................................................. 40

4.2 Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)........ 40

4.3 Anlise estatstica dos resultados Raman....................................... 45

4.3.1 Matriz orgnica........................................................................... 45

4.3.2 Matriz inorgnica........................................................................ 49

4.4 Anlise histolgica......................................................................... 54

5. Discusso.............................................................................................. 58

6. Concluses............................................................................................ 66

7. Referncias bibliogrficas.................................................................... 68

Lista de Figuras

Figura 1.1: Representao esquemtica da diartrose entre fmur e tbia cartilagem

articular (Modificado: JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio

de Janeiro: Guanabara Koogan. 1982)...................................................................... 4

Figura 1.2: Disposio das fibrilas e condrcitos nas zonas da cartilagem

articular (Modificado:. NORDIN, M; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of

the musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989)... 7

Figura 1.3: Resposta das proteoglicanas s foras mecnicas compressivas

(Modificado:. NORDIN, M; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of the

musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989).. 11

Figura 1.4: Desenho do espalhamento da luz de forma inelstica .......................... 20

Figura 1.5: Diagrama de Jablonskii (diagrama dos nveis de energia)..................... 21

Figura 3.1: Procedimento de imobilizao articular do joelho por meio de fio desutura ......................................................................................................................... 30

Figura 3.2: Pontos de aplicao laser nos animais irradiados (Modificado:JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio de Janeiro: GuanabaraKoogan. 1982). ..........................................................................................................

31

Figura 3.3: Aplicao laser pontual em joelho do rato wistar do grupo irradiado.... 32

Figura 3.4: Laser diodo AsGaAl 830nm (IVP) e acessrios ................................... 32

Figura 3.5: Diagrama esquemtico do Sistema Raman no infravermelho prximo. 36

Figura 3.6: Componentes do Sistema Raman (ER-IVP).......................................... 36

Figura 3.7: Trs reas em retngulos em que foram analisadas as intensidades dacolorao de cada corte histolgico........................................................................... 38

Figura 4.1: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens normais de cndilosmediais de fmures de ratos wistar jovens................................................................. 41

Figura 4.2: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular aps 15dias de imobilizao................................................................................................... 42

Figura 4.3: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 7 diasaps a retirada da imobilizao................................................................................. 43

Figura 4.4: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com13 diasaps a retirada da imobilizao.................................................................................. 44

Figura 4.5: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 19dias aps aa retirada da imobilizao......................................................................... 44

Figura 4.6: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado eirradiado com densidade de energia de 80J/cm2 (IIA) aps 15 dias deimobilizao............................................................................................................. 54

Figura 4.7: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado eirradiado com densidade de energia de 720J/cm2 (IIB) aps 15 dias deimobilizao............................................................................................................. 56

Figura 4.8: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e noirradiado (I) aps 15 dias de imobilizao............................................................... 56

Figura 4.9: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo controle (C) aps15 dias de imobilizao............................................................................................. 57

Lista de Grficos

Grfico 4.1: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680cm-1 (MO) aps 15 dias de imobilizao................................................................... 46

Grfico 4.2: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680cm-1 (MO) com 7 dias aps a retirada da imobilizao............................................. 47

Grfico 4.3: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680cm-1 (MO) com 13 dias aps a retirada da imobilizao........................................... 48

Grfico 4.4: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680cm-1 (MO) com 19 dias aps a retirada da imobilizao........................................... 48

Grfico 4.5. Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680cm-1 (MO) em relao ao tempo (dias)...................................................................... 49

Grfico 4.6: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1450cm-1 (MO) em relao ao tempo (dias) ..................................................................... 50

Grfico 4.7: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 961 cm-1 (MI) em relao ao tempo (dias)............................................................................. 51

Grfico 4.8: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza aps 15 diasde imobilizao articular........................................................................................... 58

Grfico 4.9: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza com 19 diasretirada a imobilizao articular................................................................................ 59

Lista de abreviaturas e smbolos

Al Aluminio

As Arsnio

Ca Clcio

Cl Cloro

C Graus Celsius

CCD Camera digital colorida

DNA cido desoxirribonuclico

ER-IVP Espectroscopia Raman no infravermelho prximo

Ga Glio

GAGs Glicosaminoglicanas

HA cido hialurnico

He Hlio

J Joule

LBP Laser de baixa potncia

LLLT Low-level laser therapy

Mg Magnsio

MI Matriz inorgnica

MO Matriz orgnica

MW Miliwatt

Nd Neodmio

Ne Nenio

nm Nanmetro

Pa Pascal

PAS cido peridico e Schiff

PGs Proteoglicanas

pH Potencial de hidrognio

RNA cido ribonuclico

Ti Titnio

UV Ultra-violeta

YAG Ytrium-Alumunium-Garnet

n Ni

Resumo

Existe um interesse em investigar as alteraes nos constituintes bioqumicos dacartilagem articular, afim de prevenir modificaes nas respostas mecnicas que causamefeitos degenerativos. A biomodulao com laser de baixa potncia pode ser utilizadacomo um recurso clnico para estimular os condrcitos a produzirem substncias com asproteoglicanas, glicoprotenas e colgeno para prevenir as alteraes na cartilagemcitadas. Mtodos modernos de diagnsticos pticos, tal como a espectroscopia Ramanno infravermelho prximo permite um diagnstico menos invasivo e uma avaliao dosconstituintes bioqumicos de tecidos biolgicos. Neste presente trabalho foi utilizadoum modelo animal para a imobilizao articular e as consequentes alteraes nosconstituintes bioqumicos da cartilagem, sendo caracterizado por meio daespectroscopia Raman no infravermelho prximo e estudo histolgico. Para o modelode imobilizao, um total de 52 ratos wistar machos foram utilizados e divididos emquatro grupos: grupo imobilizado, grupo controle (sem imobilizao) e outros doisgrupos que foram imobilizados e tratados com laser de baixa potncia com densidade deenergia de 80 J/ cm2 e 720 J/cm2. Os animais foram sacrificados nos perodos de 15 diasaps a imobilizao e 7, 13 e 19 dias de recuperao aps a retirada do fio de suturausado para a imobilizao articular. A irradiao laser foi realizada por meio de umdiodo laser As-Ga-Al com comprimento de onda em 830 nm, em intervalos de 48 horas,durante 34 dias (15 dias de imobilizao mais 19 dias de recuperao). Foram utilizadospara os estudos Raman: um laser Ti:Safira bombeado por um laser argnio noinfravermelho prximo (830 nm), um espectrgrafo dispersivo para a luz espalhadaRaman coletada do tecido e uma cmera digital colorida resfriada com nitrogniolquido para detectar o espectro Raman. Para o estudo histolgico foi usado um corantecom reagente de Schiff especfico de glicosaminoglicanas. Nas anlises detalhadas dosdados espectrais Raman, foram encontrados em ambos grupos tratados, aps o perodode 15 dias de imobilizao articular um aumento na concentrao da matriz orgnicaestatisticamente significante (P

Abstract

There has been a lot of interest to investigate the changes in the biochemicalconstituents of the articular cartilages in order to prevent modifications in themechanical responses that cause degenerative effects. Biomodulation with low-levellaser can be used as a clinical resource to stimulate the chondrocyte cells to producesubstances like proteoglycans, glycoproteins and collagen which in turn can prevent thementioned changes in the cartilage. Modern methods of optical diagnosis such as nearinfrared laser Raman spectroscopy (NIR-RS) can allow a less invasive diagnosis andevaluation of biochemical constituents of biological tissues. In the present work, ananimal model has been used to stimulate articular immobilization and the consequentalterations in the biochemical constituents of the cartilage have been characterized byNIR-RS and histological studies. For the immobilization model, a total of fifty-twowistar male rats have been utilized and they have been divided into four groups:immobilized group, control group (without immobilization) and another two groupswere immobilized and treated with low-level laser therapy (LLLT) with energydensities of 80 J/ cm2 and 720 J/cm2. The animals were sacrificed in the periods of 15days after immobilization, 7, 13 and 19 days of recuperation after the removal of thesuture used for articular immobilization. Laser irradiation has been performed, using aGa-Al-As diode laser with 830 nm wavelength, in the interval of every 48 hrs during theobservational period starting from the first day of immobilization to a maximum of 34(15 days of immobilization plus 19 days of recuperation) days. For Raman studies, aTi:Sapphire laser pumped by an argon laser provides near-infrared laser excitation (830nm). A spectrograph disperses the Raman scattered light collected from the tissue. Aliquid N2-cooled CCD detects the Raman spectra. For histological study, a PAS stainspecific of the glycosaminolglycans was used. From the detailed analysis of Ramanspectral data, it has been found that both the laser treated groups, after the period of 15days of articular immobilization, exhibited a statistically significant (P

1. Introduo

1. Introduo

Os estudos de patologias articulares tm concentrado-se em alteraes

degenerativas da articulao, as quais so evidenciadas pela danificao da superfcie

da cartilagem, sendo encontradas em todos os tipos de articulaes sinoviais. Alm

disso, tambm foram realizados trabalhos em articulaes sinoviais com o objetivo de

estudar como ocorrem as alteraes das substncias qumicas da cartilagem articular e

quais as conseqncias em suas propriedades mecnicas. Nesses experimentos, foram

realizadas algumas formas de induo de degenerao articular em modelos animais,

destacando-se entre elas, o modelo por meio de instabilidade articular, por um excesso

de estresse articular, por trauma direto e pela imobilizao articular (CURRIER;

NELSON, 1992).

Muitas pesquisas tm sido realizadas para investigar essas alteraes, porm

pelo fato da cartilagem articular estar intimamente associada ao osso subcondral para

atuar no sistema de adaptao e mediao de foras mecnicas (NORDIN; FRANKEL,

2001), existe uma dificuldade de isolar eventos ocorridos em um componente que no

afete o outro, dificultando tambm a anlise de alteraes isoladas de cada

componente.

Os estudos realizados com espectroscopia vibracional por emisso ou absoro

demonstram ser um mtodo preciso para anlise qumica de biomateriais quando os

componentes bioqumicos possuem caractersticas espectrais (HANLON, 2000). A

espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP) usada para identificaes

quantitativas de substncias em tecidos biolgicos sem que ocorram danificaes aos

mesmos. Devido a essa caracterstica da ER-IVP, CALL et al (1983) em

experimentos realizados com esse tipo de espectroscopia estudaram os efeitos da

perfuso interna de clcio, magnsio e ATP nas fibras musculares. OTERO (2002)

tambm utilizou as qualidades da ER-IVP para realizar identificaes de bandas

espectrais de colgeno e clcio para diagnstico de alteraes em vlvula cardaca,

assim como LOPES (2002) que analisou a reparao do tecido sseo, alm de WANG

et al (2000) que utilizaram a ER-IVP para anlise de resposta mecnica de tecidos

moles, que demonstrou ser uma importante tcnica para anlise biomecnica de

tecidos.

Como as molculas de protena-polissacardeos denominadas proteoglicanas

(PGs) e glicosaminoglicanas (GAGs) sulfatadas so substncias que sofrem alteraes

quantitativas na fase precoce da degenerao da cartilagem articular, podem com isso

ser parmetro para maior compreenso de estudos de alteraes qumicas articulares,

assim como da anlise biomecnica da cartilagem articular (HAAPALA et al, 2001) e

com isso podem tambm ser utilizadas em mtodos de identificao que mensurem

essas alteraes quantitativas, como por exemplo, a espectroscopia Raman.

A terapia com laser de baixa potncia da cartilagem articular tem com objetivo o

efeito de biomodulao, pois, por meio da bioestimulao, pode-se aumentar o

metabolismo celular dos condrcitos da cartilagem e aumentar o contedo das

substncias qumicas que so importantes para manter em equilbrio o sistema de

proteo mecnica na cartilagem articular (TORRICELLI et al, 2001). AKAI et al

(1987) verificaram essa bioestimulao na resposta mecnica da cartilagem articular

aps a irradiao da luz laser de baixa potncia. Em outros trabalhos os estudos foram

direcionados para a aplicao da luz laser na cartilagem articular para determinar as

propriedades pticas deste tecido (YOUN et al 2000; EBERT et al, 1998; RAUNEST;

SCHWARZMAIER, 1995). Porm a maioria dos estudos com laser de baixa potncia

em articulaes foram realizados para tratamento de processos inflamatrios articulares

(GUERINO et al, 2000; HONMURA et al, 1992; TRAUNER et al, 1998; HENDRICH,

1997; PALGREN et al, 1989; BASFORD, 1987) alm de uma pesquisa especfica por

meio da utilizao de espectroscopia da cartilagem articular (ZAIA et al, 2000).

1.1. Caractersticas da cartilagem articular

A maioria das articulaes do corpo humano representada pela articulao

sinovial ou diartrodial. Uma articulao complexa, projetada basicamente para a

mobilidade, embora muitas destas articulaes tambm proporcionem estabilidade

(NORKIN; LEVANGIE, 2001).

As articulaes sinoviais ou diartrodiais so constitudas de cpsula articular,

principal meio de unio, formada por tecido fibroso, uma espcie de manguito que

envolve a articulao prendendo-se nos ossos que se articulam. Um espao virtual

denominado de cavidade articular envolvido pela cpsula, onde se encontra o lquido

sinovial ou sinvia (figura 1.1). A membrana sinovial a camada interna da cpsula

articular, possui vascularizao e inervao, sendo encarregada da produo da sinvia.

A camada externa da cpsula, denominada de camada fibrosa composta de tecido

conjuntivo fibroso denso, cujas fibras esto firmemente aderida ao peristeo dos ossos

(SPENCE, 1991).

A Cartilagem articular o revestimento das superfcies sseas da articulao

sinovial composta por uma fina camada de aproximadamente 1 a 5 mm. Em virtude

deste revestimento as superfcies articulares se apresentam lisas, polidas e de colorao

esbranquiada, alm de serem avascular e aneural tambm a superfcie de movimento

da articulao sinovial. Possui um grau elevado de especializao para permitir uma

eficaz distribuio de cargas, resistncia s foras de compresso e uma reduo nas

foras de atrito entre as superfcies articulares (DANGELO; FATTINI, 1997;

KUETTNER et al, 1991).

Figura 1.1: Representao esquemtica da diartrose entre fmur e tbia - cartilagem

articular (Modificado: JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan. 1982).

A cartilagem inicia-se a partir do mesnquima embrionrio sendo que a primeira

modificao ocorre com o arredondamento das clulas mesenquimatosas,

multiplicando-se de forma rpida para constituir os aglomerados. Essas clulas

formadas possuem citoplasma muito basfilo sendo denominadas de condroblastos.

Com o incio da sntese da matriz ocorre o afastamento entre os condroblastos, e como

a diferenciao das clulas da cartilagem inicia-se do centro para a periferia, nessa fase

as clulas mais centrais apresentam as caractersticas de condrcitos, enquanto que as

clulas mais perifricas ainda encontram-se com caractersticas de condroblastos

tpicos. O crescimento da cartilagem ocorre por dois processos: pelo crescimento

intersticial, por meio de diviso mittica dos condrcitos preexistentes, e, pelo

crescimento aposional que se faz a partir das clulas do pericndrio, esses novos

condrcitos logo produzem fibrilas colgenas, proteoglicanas e glicoprotenas

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995).

A composio celular na cartilagem articular apresenta condrcitos

escassamente distribudos, menos de 10% do volume tecidual. Apesar desta deficiente

distribuio, os condrcitos so responsveis pela secreo e manuteno dos

componentes orgnicos da matriz extracelular. Alm do colgeno, outras substncias

tambm so produzidas pelos condrcitos como as proteoglicanas e as no protenas

glicosaminoglicanas como o cido hialurnico, esse ltimo responsvel pela

diminuio do coeficiente de atrito da cartilagem (SMITH et al, 2000; ALLAN, 1998).

O componente orgnico extracelular composto por uma densa cadeia de fibras

de colgeno do tipo II situada numa soluo concentrada de proteoglicanas e

representa cerca de 10 a 30% do peso lquido da cartilagem articular, enquanto que as

proteoglicanas representam de 3 a 10% do peso lquido da cartilagem articular, e os 60

a 87% restantes so constitudos por gua, sais inorgnicos, e uma pequena quantidade

de outras protenas, glicoprotenas e lipdeos (BONASSAR et al, 1995; NORDIN;

FRANKEL, 1989).

Na cartilagem hialina das articulaes sivoviais so encontradas quatro zonas ou

camadas distintas: superficial, intermediria ou mdia, hipertrfica ou profunda e

calcificada (figura 1.2). Essas zonas esto relacionadas com a direo dos feixes de

fibrila em relao superfcie e com as caractersticas morfolgicas dos condrcitos

(NORDIN; FRANKEL, 1989; DUNHAM et al, 1988; ROTH et al, 1980).

A zona superficial representa de 10 a 20% da espessura total da cartilagem, na

qual os feixes de fibrilas esto dispostos paralelamente superfcie. Esta camada

regular ajuda a reduzir a frico entre as superfcies articulares opostas. Quanto

disposio dos condrcitos, esses se encontram paralelos superfcie com

caractersticas ovaladas e de pequenas dimenses, alm de possuir organelas reduzidas

e pouco desenvolvidas. Essa considerada uma zona em que a rede de colgeno

encontra-se mais ordenada e em maior concentrao em relao as outras zonas

(NORDIN; FRANKEL, 1989; DUNHAM et al, 1988)

A segunda zona, intermediria ou mdia, representa 40 a 60% da espessura

total. Os feixes de fibrilas esto dispostos aleatoriamente e mais afastados, formando

uma trelia aberta como uma rede de fibras frouxamente enroladas que permite a

deformao e auxilia na absoro de parte da fora imposta sobre as superfcies

articulares. Os condrcitos tambm possuem distribuio aleatria, formas mais

arredondadas e dimenses maiores em relao camada superficial, alm de possuir

um nmero maior de organelas citoplasmticas (KUETTNER et al, 1991; DUNHAM,

1988).

J a terceira zona, profunda ou hipertrfica, representa 30% da espessura total,

algumas fibras situam-se perpendicularmente superfcie, estendendo-se atravs da

interface entre as cartilagens no calcificada e calcificada, nas quais fixam-se

firmemente a cartilagem calcificada. Nessa zona so encontrados condrcitos ricos em

organelas citoplasmticas que possuem direo perpendicular a zona calcificada

(KUETTNER et al, 1991).

A zona calcificada da cartilagem, denominada tambm de quarta zona, localiza-

se adjacente ao osso subcondral e fixa fortemente a cartilagem regio ssea. A

interface entre a cartilagem calcificada e no calcificada denominada marca de mar,

sendo esta regio importante devido sua relao com o crescimento, cicatrizao e

envelhecimento. So encontradas nessa zona clulas e matriz extracelular de

hidroxiapatita de clcio devido proximidade ao osso subcondral (NORKIN;

LEVANGIE, 2001; KUETTNER et al, 1991).

Figura 1.2: Disposio das fibrilas e condrcitos nas zonas da cartilagem articular

(Modificado: NORDIN, M; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of the

musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989).

O componente fibroso do tipo hialino da cartilagem em sua matriz extracelular

compe-se principalmente de colgeno dos tipos II, IX e XI, e embora a gua seja o

componente mais abundante da cartilagem hialina, a substncia fundamental forma um

gel rgido. O colgeno, sendo o principal constituinte na matriz extracelular quase

exclusivamente o do tipo II, apesar de colgenos do tipo VI, IX, X, XII, e XIV estarem

presentes em pequenas quantidades (ALLAN, 1998).

O colgeno uma protena muito abundante e corresponde a 30% de toda

protena do corpo humano, possui grande resistncia tensiva, sendo responsvel pela

integridade funcional das estruturas do tecido conjuntivo (NORKIN; LEVANGIE,

2001).

Estrutura-se na forma fibrilar, sendo representado por um conjunto de trs

cadeias peptdicas seqenciais de aminocidos, entre os quais os elementos

hidroxilados mais representativos esto a hidroxiprolina e a hidrolisina, sendo que a

primeira representa tipicamente 13% da estrutura colgena (DOUGLAS, 2002).

As fibrilas de colgeno do tipo II so estabilizadas por ligaes cruzadas

covalentes que esto presentes em suas molculas. Possuem dimenses reduzidas,

possibilitando que suas fibrilas dispersem na matriz extracelular e consequentemente

aumentem a relao com os agregados de proteoglicanas na cartilagem (ROTH et al,

1980). A rede desse tipo de colgeno responde pela estrutura da cartilagem articular e

proporciona resistncia s foras tensivas empregadas a ela (KUETTNER et al, 1991).

Alm do colgeno tipo II, os outros tipos de colgenos encontrados na

cartilagem articular possuem funes sugeridas para o comportamento mecnico do

tecido, pois atuam na formao e manuteno da rede de fibrilas. O colgeno tipo VI

possui uma funo sugerida de atuao na ligao entre os condrcitos e a matriz

extracelular, sendo que sua concentrao no ultrapassa os 2% do colgeno presente na

cartilagem articular (THOMAS et al, 1994).

Quanto ao colgeno do tipo IX, estudos indicam que responsvel pelas

ligaes covalentes entre a fibrilas de colgeno tipo II (THOMAS et al, 1994; EYRE,

1991), enquanto que a funo do colgeno do tipo X ainda no est bem elucidada,

porm muito encontrado em processos de ossificao endocondral, sendo que ambos

possuem concentrao de 1% cada na cartilagem articular madura (THOMAS et al,

1994). O colgeno tipo XI responde pelo mecanismo de estabilizao da rede colgena,

e sua concentrao, com exceo do tipo II, supera todos os outros tipos de colgeno

com a presena de aproximadamente 3% na matriz extracelular. E para os tipos XII e

XIV, alguns autores sugerem que eles atuem na formao da matriz da cartilagem, alm

de possurem as menores concentraes de colgeno na cartilagem articular,

aproximadamente de 0,1 % (THOMAS et al, 1994; EYRE, 1991).

Alm do colgeno, esto presentes tambm na matriz extracelular da cartilagem

hialina as PGs, assim como outros componentes, as GAGs sulfatadas e no sulfatada

como o cido hialurnico (HA), porm em baixa concentrao (NISHIDA et al, 2000).

As PGs so responsveis pelas propriedades viscoelsticas da cartilagem

articular, atuam na reteno de gua e proporcionam resistncia s cargas compressivas

e para deformao elstica (VOLPI; KATZ, 1991).

Quanto as GAGs, dois sulfatos so encontrados na cartilagem articular, o

condroitin-sulfato e o queratan-sulfato. Estes sulfatos so cadeias de polmeros

repetidos de unidades de dissacardeos especficos, sendo a cadeia condroitin-sulfato

formada por 25 a 30 unidades dissacardeos, enquanto que a cadeia de queratan-sulfato

menor e composta aproximadamente por 13 unidades de dissacardeos. A

concentrao desses sulfatos sofrem alteraes durante o envelhecimento, com um

aumento de queratan-sulfato em relao ao condroitin-sulfato. (BRAND et al, 1991;

NORDIN; FRANKEL, 1989).

A maioria das PGs da cartilagem articular est disposta em forma de agregados

com uma interao na forma no covalente com o HA (GAG no sulfatada)

estabilizado por uma protena de ligao (BRAND et al, 1991).

De acordo com NORDIN e FRANKEL (1989), na cartilagem articular normal, a

estrutura e a interao qumica das GAGs influenciam as propriedades e conformao

dos agregados PGs (figura 1.3). Essas macromolculas de cargas repulsivas estendem-

se no espao interfibrilar formado pelas cadeias de colgeno. Os ctions mveis na

soluo, tais como o sdio e o clcio so atrados para fixarem em grupos nions nas

GAGs, criando uma presso osmtica de dilatao aproximada de 0,35 Mpa. A presso

de dilatao por sua vez resistida e balanceada pela tenso desenvolvida pela cadeia

de colgeno, restringindo as PGs em somente 20% de sua soluo dominante,

consequentemente esta presso de dilatao caracteriza a cadeia de colgeno ao estado

de pr-carga.

Quando uma carga compressiva aplicada na superfcie da cartilagem, ocorre

uma deformao instantnea causada primariamente pela mudana molecular nas PGs

dominante. Essa carga externa faz a presso interna na matriz exceder a presso de

dilatao e o lquido comea fluir para fora do tecido. Como o fluxo do fluido sai, a

concentrao das PGs aumenta, e esta alterao torna a aumentar a presso osmtica de

dilatao, a fora repulsiva das cargas e o volume de estresse compressivo ocorre at o

equilbrio com a carga externa (SCHWARTZ et al, 1994; NORDIN; FRANKEL,

1989).

Alm disso, a alterao do pH, e/ou a concentrao inica alteram as foras das

cargas repulsivas intermoleculares das PGs e causam alterao no tamanho do agregado

dominante. Isto demonstra que a propriedade fisicoqumica das PGs entre as cadeias de

colgeno na cartilagem realiza uma importante funo de resistncia compresso,

sendo que essa qualidade das PGs de resistncia compresso est associada a dois

fatores: o primeiro fator relacionado com a presso osmtica de dilatao dominante

devida interao com os conjuntos dos grupos inicos fixados nas GAGs; e o outro

fator relacionado massa de rigidez compressiva do emaranhado entre os agregados

PGs e a cadeia de colgeno (NORKIN; LEVANGIE, 2001; SCHWARTZ et al, 1994;

KUETTNER et al, 1991; NORDIN; FRANKEL, 1989).

Durante a aplicao e remoo de foras compressivas na articulao, ocorre a

remoo e absoro de gua juntamente com outros nutrientes, sendo considerado

tambm um processo importante para o controle e manuteno da cartilagem. A

mobilidade articular e foras compressivas fisiolgicas resultam no aumento de

proteoglicanas sintetizadas pelos condrcitos, favorecendo as propriedades mecnicas

da cartilagem articular (KIVIRANTA et al, 1987).

As alteraes e danos na cartilagem articular so muito comuns, sendo doenas

debilitantes encontradas na prtica ortopdica. Devido a esse fato o conhecimento da

fisiologia da cartilagem normal pr-requisito para a compreenso dos processos

patolgicos da cartilagem articular (COHEN, 1998).

Figura 1.3: Resposta das proteoglicanas s foras mecnicas compressivas

(Modificado: NORDIN, M.; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of the

musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989).

1.2. Alteraes da cartilagem articular na ausncia de cargas

Na degenerao da cartilagem articular so encontradas vrias alteraes de seus

componentes, sendo estas alteraes de formas evolutivas. Algumas substncias da

cartilagem articular apresentam uma maior alterao na fase precoce de sua

degenerao, como por exemplo, o condroitin-sulfato, PGs, hialuronato e colgeno.

Devido a estas modificaes precoces, aumenta o interesse nos estudos das formas de

identificao destas substncias na cartilagem articular (HAAPALA et al, 2001).

Em experimentos realizados com ovelhas, comparando o estresse articular

causado pela caminhada entre solo de concreto e solo de terra ou mato, RADIN et al.

(1982) obtiveram resultados significantes com o aumento do nvel de rigidez da

cartilagem articular femoral e uma diminuio das GAGs associada rigidez da mesma

cartilagem nas ovelhas que caminharam em solo de concreto em comparao com as

ovelhas que caminharam em solo de terra ou mato. Porm, neste estudo foi realizada

uma induo de uma degenerao crnica da cartilagem articular, pois a anlise da

cartilagem ocorreu somente aps nove meses de caminhada pelas ovelhas.

A ausncia de mobilidade tambm causa efeitos deletrios cartilagem. A

imobilizao um mtodo frequentemente utilizado como terapia para acometimentos

msculo-esquelticos desde a poca de Hipcrates. Quando ocorrem fraturas sseas,

leses ligamentares, musculares e distrbios articulares degenerativos e traumticos

realizado tratamento cirrgico, e ou o tratamento conservador com a imobilizao do

membro, normalmente aplicado por meio de atadura gessada (APPEL, 1986).

Estudos clnicos e experimentais demonstram que a mobilizao precoce

controlada melhor do que a imobilizao do membro para o tratamento primrio de

leses msculo-esquelticas agudas, pois ao contrrio da imobilizao evita a

contratura dos tecidos periarticulares e consequentes danos cartilagem (KANNUS,

2000).

A reduo de movimentos na articulao sinovial altera a morfologia,

bioqumica e caractersticas biomecnicas dos componentes da articulao. A

diminuio do estmulo mecnico na interface das cartilagens pode causar a reduo

da cartilagem e permite que ocorra a sua ossificao endocondral (ROOIJ et al, 2001).

Em outras alteraes resultantes da imobilizao so encontradas: a

proliferao de tecido conectivo fibroso dentro do espao articular, aderncias dos

tecidos conectivos fibrosos das superfcies da cartilagem, atrofia da cartilagem,

ulceraes dos pontos de contatos entre cartilagem-cartilagem, e, em casos extremos, a

disfuno permanente do membro imobilizado. A aplicao de cargas mecnicas

provm importantes estmulos teciduais para o desenvolvimento e manuteno da

homeostase na articulao sinovial, pois o movimento articular melhora o fluxo da

nutrio transinovial. O mecanismo de estimulao celular dos condrcitos

influenciado por foras mecnicas e est relacionado s taxas de sntese e degradao

dos componentes da matriz orgnica (AKESSON et al, 1987).

As alteraes bioqumicas e histolgicas dos componentes da matriz na

imobilizao articular so decorrentes da privao de estresse na articulao. Em

experimentos in vitro para a verificao da reao tecidual sob cargas mecnicas, foi

observado a ocorrncia do aumento no metabolismo do condrcito em resposta

carga de presso hidrosttica intermitente intra-articular, enquanto as cartilagens que

no permaneceram sob esse tipo de carga no apresentaram o aumento do

metabolismo celular (SUCH et al, 1999).

Segundo AKESSON et al (1987), na ausncia de estresse articular ocorrem

alteraes bioqumicas da matriz tecidual tais como a diminuio do contedo de gua,

diminuio de GAGs, diminuio da massa de colgeno e aumento da ligao cruzada

do colgeno. Aps 9 semanas de imobilizao ocorre a reduo de 5% da massa de

colgeno, com o aumento das ligaes cruzadas que so associadas com a sntese de

novo colgeno, e a presena delas em grandes quantidades indica aumento de colgeno

imaturo no tecido. A perda insignificante da massa do colgeno nos estgios precoces

da imobilizao no se repete em estgios de imobilizao mais prolongada, como em

perodos de 12 semanas, no qual ocorre uma grande perda da massa do colgeno, cerca

de 25% com degradao exponencial na imobilizao continuada. As mudanas das

PGs na matriz so inferidas pela gua e alteraes das GAGs na matriz orgnica. Alm

disso, ocorre tambm a perda de cido hialurnico (40%), gua (6%), condroitin-sulfato

(20%) e demartan-sulfato (8%). A implicao da diminuio da gua e das GAGs est

relacionada com a diminuio do espao e da lubrificao deficiente da matriz

orgnica, e essas alteraes causam efeitos mecnicos considerveis nos tecidos moles.

PALMOSKI et al, 1980, relataram ao realizar estudos com um grupo de ces

com uma pata posterior amputada, que aps 6 semanas a cartilagem articular do cndilo

femoral do lado amputado apresentou diminuio da espessura da cartilagem,

diminuio do contedo de GAGs, aumento do contedo de gua, estrutura defeituosa

das GAGs e reduo na sntese de rede de GAGs. Os mesmos autores caracterizaram

essas alteraes como similares s que ocorre no estgio precoce da doena

degenerativa articular. BENICHOU e WIROTIUS (1980) examinaram 53 pacientes

para anlise do quadril do membro inferior amputado, e relataram que metade dos

pacientes apresentou reduo de 50% da reduo da espessura da cartilagem do quadril

do lado amputado e que todos os pacientes tiveram osteoporose desse mesmo lado.

Em outro experimento comparativo de carga articular controlada em joelhos de

ratos realizado por TAGIL e ASPENBERG (1999), foi encontrado crescimento

intrnseco de cartilagem no grupo submetido ao estresse de compresso intermitente

aproximado de 2 Mpa, enquanto no grupo em que os espcimes no foram submetidos

a nenhum tipo de carga, no houve o crescimento intrnseco da cartilagem articular.

Esses resultados esto de acordo com a descrio de modelos tericos que preconizam

que a estimulao mecnica intermitente necessria para manter a diferenciao da

cartilagem articular, pois quando ocorre essa ausncia mecnica, como por exemplo, na

imobilizao articular, a cartilagem substituda por tecido sseo (ROOIJ et al, 2001).

JORTIKKA et al (1997) verificaram a influncia do movimento intra-articular

na cartilagem com experimento de imobilizao articular em joelhos de ces jovens,

sendo que encontraram diferenas significativas bioqumicas na cartilagem articular,

principalmente na reduo do contedo de PGs e condroitin-sulfato, no grupo que

permaneceu imobilizado, e assim como ELDER et al. (2000) sugerem que a quantidade

de movimento articular seja um fator relevante para a condrognese na cartilagem.

Em um trabalho com imobilizao similar ao de JORTIKKA et al (1997), os

pesquisadores ODRISCOLL et al. (1986) utilizaram coelhos e observaram que a

reparao da cartilagem articular danificada foi mais eficaz no membro com a

realizao do movimento contnuo passivo em comparao ao membro imobilizado.

AKESSON et al, 1987 relataram dois experimentos com imobilizao de joelho

de ratos adultos. No primeiro detectaram que as primeiras alteraes ocorreram em

duas semanas, sendo caracterizadas pela atrofia muscular e presena de tecido

conectivo fibroso. A proliferao do tecido conectivo foi estabilizada em 30 dias, neste

perodo tambm foi observado a atrofia da cartilagem pela diminuio de sua espessura.

O perodo de 30 a 60 dias foi caracterizado pelo desenvolvimento de adeso do tecido

conectivo fibroso nas superfcies da cartilagem. Aps 60 dias ocorreu ulcerao da

cartilagem nas reas de compresso. Quanto ao outro experimento, foi utilizada a

imobilizao da articulao com compresso articular extrema pelo mtodo de

imobilizao com flexo forada do joelho, na qual foi observada degenerao

acelerada com leso da cartilagem aps o perodo de 6 dias.

FU et al. (1998), verificaram que aps 6 semanas de imobilizao articular em

coelhos, a cartilagem articular apresentou significante diminuio do contedo de PGs e

uma moderada degenerao da cartilagem.

AKAI et al. (1997), tambm realizaram experimentos com ratos utilizando a

imobilizao com flexo forada do joelho seguindo modelo de WILSON e DHANERS

(1988), com o objetivo de estudar os efeitos do laser de baixa potncia nas propriedades

mecnicas do osso e da cartilagem articular, e obtiveram resultados de alteraes

mecnicas quanto rigidez da cartilagem aps o perodo de uma semana de

imobilizao, sendo realizado aps este perodo o tratamento com laser de baixa

potncia.

USUBA et al. (1998), utilizaram o mesmo protocolo de WILSON e DHANERS

(1988), na imobilizao com flexo forada do joelho em ratos para estudos da

viscoelasticidade de tecidos conectivos periarticulares, e observaram que aps o

perodo de uma semana esses tecidos apresentaram alteraes de suas propriedades

mecnicas.

HAAPALA et al. (2001), em experimentos realizados com a imobilizao da

articulao do joelho direito em ces beagles, demonstraram que aps 11 semanas de

imobilizao, houve uma diminuio dos nveis de interleuk alfa I, inibidor de

metaloproteinase e da concentrao de condroitin-sulfato em 38% em comparao com

o grupo controle. Outro componente apresentou reduo da concentrao na cartilagem

articular aps a imobilizao, o hialuronato, pois foi observado tambm que o seu

decrscimo foi acompanhado da reduo de PGs. A quantidade e qualidade dos

movimentos na articulao so fundamentais para o metabolismo dos condrcitos e

para a eficcia da reparao de defeitos da cartilagem (JORTIKKA et al, 1997).

1.3. Terapia laser de baixa potncia em cartilagem articular

A palavra laser um acrmio resultante de light amplication by stimulated

emission of radiation. Difere de outras fontes de luz por apresentar caractersticas

particulares como a monocromacidade, coerncia, a brilhncia, e a direcionalidade

(NICOLAU, 2001; LOPES, 2001)

O laser o resultado de eltrons ou molculas que, ao serem estimulados,

realizam um salto quntico, passando de um estado energtico mais baixo para um

estado energtico mais alto, tendo como consequncia a emisso de ondas

eletromagnticas com mesma freqncia e nica direo (ORTIZ, 2001; KITCHEN,

1991).

O mecanismo pelo qual o laser de baixa potncia (LBP) atua, est relacionado

com o aumento de ATP e com a modificao do transporte inico, ou seja, ao nvel de

organelas celulares, como as mitocndrias e membranas celulares (KARU, 1987).

A regio do espectro eletromagntico mais utilizada no tratamento por LBP para

tecidos mais profundos est entre 600 nm a 1300 nm, pois nessa regio espectral os

comprimentos de ondas so absorvidos em menor intensidade na pele, proporcionando

uma transmisso mais eficaz. Nessa regio espectral encontram-se a luz visvel

(vermelho) e o infravermelho prximo, sendo denominada tambm de janela espectral

para tecidos biolgicos (RIGAU, 1996).

Segundo KICTCHEN e PARTRIDGE (1991), os comprimentos de onda que

esto na regio do infravermelho prximo possuem maior capacidade de penetrao no

tecido vivo em relao aos comprimentos de onda que afastam dessa regio no sentido

da regio ultravioleta. As caractersticas dos pigmentos influenciam diretamente a

transmisso e absoro da luz laser nos tecidos mais profundos, estando entre esses

pigmentos a melanina, a hemoglobina e a mioglobina (BAXTER, 1997).

O LBP pode gerar dois tipos de reaes no tecido biolgico. O efeito

fotoqumico, que gerado por conseqncias da interao fotoreceptor- luz laser, tais

efeitos so: acelerao na transferncia de eltrons, aumento da produo de super-

xido e formao de oxignio molecular, alm da possibilidade da absoro da luz pela

mitocndria, podendo gerar alteraes na sntese de DNA e RNA, alm do aumento da

proliferao celular. O efeito fotoeltrico do laser no infravermelho est associado s

mudanas no potencial de membranas ocasionando um aumento da sntese de ATP

intracelular nos processos patolgicos, pois intervm no mecanismo de intercmbio

inico da membrana. Em curto prazo o LBP acelera a sntese de ATP, a gliclise e a

oxidao fosforilativa e ao longo prazo a transcrio e replicao do DNA (LOPES,

2002; ORTIZ et al, 2001; NICOLAU, 2001; RIGAU, 1996; KARU, 1999; KARU,

1987).

Para que ocorram os efeitos fotoqumicos, existem fotorreceptores celulares,

sensveis aos determinados comprimentos de onda (KARU, 1987). Segundo LAAKSO

et al (1993) os comprimentos de onda no infravermelho so primeiramente absorvidos

pelas protenas e pela gua, e possuem pouca sensibilidade para os pigmentos como a

melanina e a hemoglobina.

Os fotorreceptores celulares, tambm denominados de cromforos, aps serem

estimulados por uma energia eletromagntica da luz laser convertem em reao

fotoqumica. considerado como fotorreceptor primrio, para a regio espectral no

infravermelho prximo (700 a 900 nm), o citocromo-oxidase, porm este fotorreceptor

somente eficaz quando no est totalmente oxidado ou totalmente reduzido,

permitindo assim, que a bioestimulao ocorra (KARU, 1999; LUBART et al, 1992).

CALATRAVA et al (1997) realizaram um estudo comparativo de terapia com

LBP em leses na cartilagem articular de joelhos de coelhos. Foi comparado o

tratamento entre dois grupos, um grupo com laser He-Ne (vermelho) com comprimento

de onda de 632,8 nm e outro grupo com laser As-Ga (infravermelho) com comprimento

de onda 904 nm. Aps treze sesses de irradiao laser durante duas semanas, no grupo

com laser As-Ga (infravermelho), a cartilagem articular apresentou caractersticas de

cartilagem hialina com poucos componentes fibrosos e aumento do nmero de

condrcitos; enquanto no grupo com laser He-Ne (vermelho), a cartilagem apresentou

reas de tecido de granulao e fibrocartilagem, e o grupo controle apresentou somente

tecido de granulao. Em ambos os grupos irradiados houve um aumento significativo

da quantidade de GAGs e de cidos mucopolissacardeos na cartilagem .

Em outros estudos experimentais foram encontrados resultados similares, quanto

ao aumento do nmero de condrcitos na cartilagem aps o tratamento com LBP,

porm os laseres utilizados foram o He-Ne e o Nd-YAG (LABAJOS et al, 1990;

SCHULTZ et al, 1985). HERMAN e KHOSLA (1988) relataram que aps o tratamento

de cartilagem bovina por irradiao com um laser Nd-YAG, obtiveram resultados

semelhantes quanto ao aumento da quantidade de GAGs na cartilagem, alm do

aumento do colgeno aps doses maiores, alm de aumento da sntese de DNA.

Em experimentos in vitro com culturas de condrcitos tratadas com irradiao

LBP no infravermelho com As-Ga-Al houve aumento significativo no nmero de

clulas, tanto em culturas de condrcitos de coelhos quanto em culturas de condrcitos

humanos, demonstrando um efeito de bioestimulao eficaz (TORRICELLI et al, 2001).

MANZANARES et al (1992), tambm encontraram efeitos de bioestimulao na

cartilagem de crescimento em ratos wistar. O tratamento ocorreu durante trs dias

seguidos com a utilizao de laser He-Ne, obtendo resultados mais significativos com

densidades de energia de 5,4 e 7,2 J/cm2.

AKAI et al (1997) realizaram um trabalho de anlise da biomecnica da rigidez

da cartilagem articular aps o tratamento com laser As-Ga-Al com comprimento de

onda de 810 nm e energia acumulada de 43 J e 65 J. O experimento foi realizado com

ratos wistar com imobilizao em flexo do joelho de um membro inferior mantida por

sete dias. Aps esse perodo o joelho imobilizado foi tratado com irradiao LBP

durante duas semanas com aplicaes realizadas a cada dois dias. O teste biomecnico

com espectrmetro viscoesltico revelou que a rigidez da cartilagem articular do joelho

imobilizado tratado com laser foi preservada, demonstrando ser uma possibilidade de

tratamento para a preveno de alteraes biomecnicas por imobilizao.

O tratamento LBP em processo inflamatrio articular induzido mostrou-se eficaz

num estudo experimental em joelhos de cobaias, promovendo uma reduo na

proliferao de clulas inflamatrias no tecido danificado, alm de induzir a formao

de pontes de cartilagens favorecendo a reparao tecidual da cartilagem lesada

(GUERINO et al, 2000). HONMURA et al (1992) demonstraram em modelo

experimental de induo de inflamao em ratos tratados com irradiao laser de diodo

As-Ga-Al, efeitos positivos para a inibio do edema articular e das alteraes na

formao do tecido de granulao na cartilagem articular.

TRAUNER et al (1998) em experimentos em joelhos de coelhos com artrite

reumatide induzida realizaram o tratamento com LBP de 630 nm com energia total de

100 J/cm2, para verificar a influncia da energia laser entregue na terapia fotodinmica,

obtendo como resultado a eficcia da utilizao do laser com photofrin na reduo de

processo inflamatrio do lquido sinovial. HENDRICH e SIEBERT (1997) tambm

encontraram eficcia na terapia fotodinmica, porm seus experimentos foram

realizados com culturas de clulas de fibroblastos de humanos portadores de artrite

reumatide.

PALMGREN et al (1989) aps estudos clnicos de tratamento com LBP com

pacientes com artrite reumatide obtiveram como resultados diminuio de edema

articular, aumento da flexibilidade articular, alm de relatos de reduo do quadro

lgico como encontrados em estudos similares realizados por outros autores

(AILIOAIE et al, 1999; ASADA et al, 1989; COLOV et al, 1987; BLIDDAL et al,

1987). Por meio da utilizao da biopsia da membrana sinovial do joelho com artrite

reumatide, BARBERIS et al (1996) verificaram a diminuio de prostaglandina aps o

tratamento com irradiao laser He-Ne com densidade de energia de 8 J/cm2. Nos

experimentos realizados por NISHIDA (1988) foram encontrados resultados

semelhantes, alm de outras alteraes histolgicas aps o tratamento de irradiao

articular com laser de baixa potncia.

LONAUER (1986) tambm realizou um trabalho com terapia com LBP em

pacientes portadores de artrite reumatide, relatando que encontrou melhores resultados

quanto diminuio da dor articular, quando utilizou a associao de laser He-Ne com

laser infravermelho do que somente a utilizao isolada do laser He-Ne. Em outro

trabalho AMANO et al (1994) realizaram o tratamento com LBP utilizando o As-Ga-Al

com comprimento de onda de 790 nm, potncia de 10 mW e com durao de 6 dias,

obtendo bons resultados quanto diminuio do infiltrado celular inflamatrio e alvio

da dor. J WALKER et al (1987) utilizaram um laser He-Ne, vermelho, com

comprimento de onda de 632, 8 nm, potncia de 1 mW e durao de tratamento de 10

semanas em pacientes com artrite reumatide, o qual demonstrou ser um tratamento

eficaz para o alvio da dor. Alm da diminuio dos sintomas dolorosos, o LBP tambm

eficaz na melhora da rigidez matinal principalmente quando utilizada a densidade de

energia de 3 J/cm2 (BROUSSEAU et al, 2000).

1.4. Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)

A anlise espectral por meio da utilizao da radiao laser com comprimento de

onda no infravermelho prximo para mensurar a resposta espectral de radiao

espalhada inelstica emitida pelo meio conhecida por efeito Raman. Este efeito foi

primeiramente analisado em experimento por Chandrasekhara Venkata Raman em 1930

(SILVEIRA Jr, 2001,VERDEYEN, 1995).

A espectroscopia Raman verifica o nvel vibracional molecular, situa-se

comumente na regio espectral do infravermelho, sendo que suas frequncias so

determinadas pela diferena entre as frequncias das radiaes incidentes e espalhadas

(SALA,1995).

A absoro, transmisso e espalhamento so efeitos que ocorrem na interao da

radiao eletromagntica com a molcula. A irradiao espalhada com a mesma

frequncia da irradiao incidente denominada de espalhamento elstico (Rayleigh),

enquanto que o espalhamento com frequncia diferente da irradiao incidente

chamado de espalhamento inelstico (figura 1.4) (HALON et al, 2000; VERDEYEN,

1995).

Figura 1.4: Espalhamento inelstico demonstrado na figura pelas setas menores.

A maior parte do espalhamento possui o componente elstico (Rayleigh) e

somente uma pequena frao da irradiao incidente sofre alterao no espalhamento,

ou seja espalhamento inelstico "Raman", sendo que ocorre com a diminuio da

energia (h(ni-nr)) "stokes" ou com o aumento da energia (h(ni +nr)) "anti-stokes" (figura

1.5) (HANLON et al, 2000).

preconizado que a interao entre as molculas possuem banda vibracional

espectral especfica, como uma impresso digital da molcula. So determinadas pelas

frequncias vibracionais caractersticas das ligaes qumicas da molcula. Esse

processo do espalhamento inelstico ou Raman ocorre a partir da irradiao laser, com

uma absoro molecular de um fton incidente e emisso de um fton espalhado

inelstico na transio da molcula de um estado fundamental para o estado vibracional

excitado (SILVEIRA Jr, 2001; VERDEYEN, 1995; SALA, 1995).

Figura 1.5: Diagrama de Jablonskii (diagrama dos nveis de energia), no qual, as linhas

horizontais largas representam os nveis eletrnicos e as linhas horizontais finas

representam os nveis vibracionais de cada nvel eletrnico. S0 estado eletrnico

fundamental; S1 estado eletrnico excitado; nn exc freqncia da radiao de excitao;

nnR freqncia do espalhamento Raman; nn F freqncia da emisso fluorescente; UV

radiao ultravioleta; IV radiao infravermelha (Silveira Jr., 2001).

A espectroscopia Raman um meio seguro para classificar uma substncia

especfica sem a necessidade da extrao do material biolgico, pois analisa o

comportamento vibracional de uma molcula (SATHAIAH et al, 1996).

A anlise por meio da espectroscopia Raman apresenta uma vantagem de possuir

um sinal Raman de baixa intensidade para gua e vidro. Portanto, essas so substncias

que no prejudicam a anlise espectral e isso facilita a coleta de sinal de amostras

(SHIN, 1993).

Vrias aplicaes biomdicas de espectroscopia Raman foram realizadas

(SILVEIRA et al, 2002; PILOTO et al, 2001; LIMA et al, 2000; HANLON, et al, 2000;

SATHAIAH et al, 1996), como por exemplo, WANG et al (2000) que utilizaram em

seus experimentos a espectroscopia Raman para anlise de alteraes moleculares no

tecido conjuntivo sob aplicaes de foras, por esse tipo de espectroscopia oferecer a

importante vantagem da baixa interferncia da gua no sinal Raman. CAILL et al

(1983) elegeram a espectroscopia Raman com laser de argnio (514,5 nm) para analisar

in vitro os efeitos especficos de substncias presentes nas fibras musculares e

obtiveram eficcia na anlise com alteraes dos picos do Ca+ e Mg+ durante a perfuso

intramuscular dessas substncias e tambm durante modificaes de comprimento dos

sarcomros.

As substncias da MO e MI tambm possuem picos espectrais Raman

caractersticos, que foram utilizados para analisar tecidos biolgicos. CARDEN e

MORRIS (2000) estudaram a diferena na largura do pico de hidroxiapatita de clcio

puro e do fosfato (largura de pico maior) em processos de mineralizao ssea em

patologias sseas e biocompatibilidade de implantes sseos pela identificao de sinais

pela espectroscopia Raman. OTERO (2002), por exemplo, realizou um diagnstico

experimental para calcificaes de vlvulas cardacas, no qual foram analisados os picos

espectrais de 960 cm-1 para o clcio e 1450 cm-1 para o colgeno, substncia essa

tambm presente na MO da cartilagem, KONTOYANNIS e VAGENAS (2000) tambm

analisaram o colgeno, porm de forma quantitativa em modelo artificial de

desmineralizao ssea de fmur.

LOPES (2002) utilizou a espectroscopia Raman para anlise da MI e MO em

reparao ssea aps a terapia com LBP, e, observou em seus experimentos, um pico no

espectro em 1450 cm-1 caracterstico para a MO, sendo que esse pico espectral tambm

encontrado na MO da cartilagem articular, porm com uma intensidade elevada.

Portanto, para estudar as substncias da MO na cartilagem articular, os picos

caractersticos com intensidades mais elevadas representadas no sinal Raman so: os

picos espectrais em 1250 cm-1 para Amida III, 1450 cm-1 para C-H/ MO e 1650 cm-1

para Amida I (TIMLIM et al, 1999; BRENNAN et al, 1997; RAVA et al, 1991).

2. Objetivos

2. Objetivos

- Verificar a utilizao da espectroscopia Raman para deteco de alteraes da

cartilagem articular;

- Verificar se a espectroscopia Raman capaz de identificar as alteraes da

cartilagem articular oriundas da imobilizao articular;

- Verificar se existe diferena na aplicao da bioestimulao por meio da terapia

laser de baixa potncia em duas diferentes densidades de energia (80 e 720

J/cm2) na cartilagem articular desprovida de mobilidade.

3. Materiais e mtodos

3. Materiais e mtodos

3.1 Animais

O animal utilizado neste trabalho foi o rato da raa Wistar (Ratus norvegicus

albinus). Cinquenta e dois animais adultos, jovens, machos, pesando 250 50g,

fornecidos pelo biotrio da Unicamp (Campinas-SP). Os mesmos foram mantidos em

gaiolas individuais abastecidas com gua e rao ad libidum, em condies normais de

temperatura e iluminao no biotrio do laboratrio de experimentao animal do IP &

D na Univap.

Grupon de

animais

Sacrifcio

Imobilizado e Irradiado com 80

J/cm2 (IIA)

Imobilizado e Irradiado com 720

J/cm2 (IIB)

Imobilizado e No irradiado

(I)

No imobilizado e No Irradiado

(C)

13

13

13

13

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

Tabela 3.1.: Diviso dos animais em grupo e cronograma do sacrifcio.

3.2 - Modelo animal

Foi realizado o modelo de imobilizao adaptado de WILSON e DHANERS (1988).

No dia do procedimento da imobilizao os animais foram submetidos ao procedimento

anestsico de hidrato cloral intraperitonial (1ml/kg em soluo salina a 10 %). Aps a

anestesia, o membro inferior direito dos animais foi tricotomizado com tosquiadeira

recarregvel (Oster) e, em seguida foi realizada a assepsia com soluo tpica de

polvidona Iodo 10% (LM Farma). Em seguida a esses procedimentos iniciou-se a

transfixao do fio de sutura no absorvvel de mononylon 0.0 (Shalon) para

imobilizao do membro inferior em flexo do joelho. O fio de sutura foi transfixado na

regio proximal e anterior da coxa, entre a face anterior do fmur e a face posterior do

msculo quadrceps femoral, e na regio distal e anterior da perna, entre a face anterior

da tbia e a face posterior do msculo tibial anterior (figura 3.1). Aps esse

procedimento o joelho do animal foi posicionado em flexo de 140 com um

tensionamento do fio de sutura e fixao final por meio de ponto cirrgico. Em seguida

foi realizado um movimento passivo no sentido da extenso do joelho para avaliar se a

fixao estava segura. Aps o trmino dos procedimentos de imobilizao os animais

foram colocados em gaiolas individuais onde permaneceram imobilizados por um

perodo de 15 dias. Ao trmino desse perodo, os fios de sutura foram retirados e os

animais recolocados nas gaiolas.

Figura 3.1: Procedimento de imobilizao articular do joelho por meio de fio de sutura

adaptado de WILSON e DHANERS (1988).

3.3 Terapia com laser de baixa potncia

Os animais foram separados em quatro grupos, dois grupos irradiados e outro dois

no irradiados, contendo 13 animais cada grupo (tabela 3.1). Os grupos dos animais no

irradiados foram subdivididos em: um grupo imobilizado e outro grupo controle (no

imobilizado), enquanto que os grupos irradiados apresentavam todos os animais

imobilizados subdivididos em grupo "A" com densidade de energia utilizada para a

terapia de 80J/cm2 e outro grupo "B" com densidade de energia de 720 J/cm2 (tabelas

3.2 e 3.3). A primeira irradiao laser foi realizada no primeiro dia do procedimento de

imobilizao, sendo que a aplicao foi realizada pela tcnica pontual transcutnea em

quatro pontos ao redor do joelho imobilizado (cndilo femoral lateral e medial, e

plat tibial medial e lateral) a cada 48 horas (figuras 3.2 e 3.3). Os animais que foram

sacrificados com 15 dias de imobilizao receberam um total de 8 aplicaes, os

sacrificados com 7, 13 e 19 dias aps a retirada da imobilizao receberam

respectivamente um total de 11, 14 e 17 aplicaes. O aparelho laser utilizado foi um

diodo com meio ativo AsGaAl, infravermelho prximo, e rea do feixe (fibra ptica) de

0,002827 cm2.

Figura 3.2: Pontos de aplicao laser nos animais irradiados (Modificado:JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan. 1982).

Figura 3.3: Aplicao laser pontual em joelho do rato wistar do grupo irradiado.

Laser diodo 830 nm

Figura 3.4: Laser diodo As-Ga-Al 830nm (IVP) e acessrios: culos de proteo, fibraptica e pedal de acionamento.

Valores

Parmetros de irradiao Grupo "A" (80 J/cm2) Grupo "B" (720 J/cm2)

Densidade de energia por ponto

Potncia

Comprimento de onda

rea do feixe

Modo de aplicao

N de pontos por sesso

Tempo por ponto

20,0 J/cm2

10 mW

830 nm

0, 002827 cm2

Pontual

4

6 segundos

180 J/cm2

10 mW

830 nm

0, 002827 cm2

Pontual

4

50 segundos

Tabela 3.2: Protocolo de irradiao com laser As-Ga-Al.

Total de energia acumulada (J)Sacrifcios

Grupo A (80 J/cm2) Grupo B (720 J/cm2)

15 dias com imobilizao 1,92 16

7 dias aps retirada da imobilizao 2,64 22

13 dias aps retirada da imobilizao 3,36 28

19 dias aps retirada da imobilizao 4,56 34

Tabela 3.3: Total de energia acumulada relacionada com o perodo de sacrifcio.

3.4. Sacrifcio dos animais e retirada dos espcimes

Para o sacrifcio dos animais foi administrado injeo intramuscular de Zoletil

0,8 ml/Kg e aps foi realizada overdose de hidrato cloral (soluo a 10 %) via peritonial

e intracrdia. Em seguida o membro inferior imobilizado foi desarticulado do quadril

para a remoo cuidadosa dos msculos que cruzam a articulao do joelho. Isto feito, o

joelho foi cuidadosamente desarticulado e a cartilagem articular foi retirada juntamente

com a epfise do osso, com irrigao constante de soro fisiolgico 0,9% (Labormdica)

a 10C.

Os perodos de sacrifcios dos animais foram de 15 dias aps a imobilizao

articular e com 7, 13, e 19 dias aps a retirada da imobilizao articular,

correspondendo ao perodo de recuperao, sendo que em cada perodo foram

sacrificados 3 animais de cada grupo para remoo das cartilagens dos cndilos mediais

dos fmures que permaneceram imobilizados.

Os espcimes foram armazenados em nitrognio lquido (-196C) para anlise

por meio de Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP) e posterior

anlise histolgica.

3.5. Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)

Foi realizada anlise da cartilagem articular in vitro por meio de ER-IVP no

Laboratrio de Espectroscopia Biomolecular no Instituto de Pesquisa e

Desenvolvimento (IP&D) na Universidade do Vale do Paraba.

Para a anlise espectral foi utilizado o sistema ptico composto por um laser

Titnio: Safira (cristal) com comprimento de onda de 830nm (Spectra Physics, mod

3900S), potncia de chegada na amostra de 100 mW, sendo bombeado por um laser de

Argnio com comprimento de onda entre 488 e 514 e potncia de 5 W (Spectra

Physics, modelo 2017S).

Um posicionador com deslocamento micromtrico nos trs eixos (x,y,z) foi

necessrio para colocar o porta-amostra com a cartilagem, isso permitiu realizar

espectros em oito pontos diferentes em cada espcime.

Para permitir a passagem do sinal Raman ao espectrgrafo (Chromex, NM,

USA, modelo 250IS) aps o laser incidir sobre a cartilagem, foi necessrio eliminar a

radiao elstica espalhada. Para isso foi utilizado um filtro rejeita-banda notch (Kaiser

Optical System, MI, USA, modelo HNPF 3804) com comprimento de onda de rejeio

de 830 nm localizado na entrada da fenda do espectrgrafo. Em seguida uma cmara

digital colorida (CCD) (Princeton Instruments, NJ, USA, modelo LNCCD 1024x256)

realizou a deteco do sinal luminoso da luz que foi dispersada pelo espectrgrafo

(figuras: 5 e 6). O programa CSMA (Princeton Instruments, NJ, verso 2.4) instalado

no microcomputador (Magitronic, 486/100 MHz) foi utilizado para realizar a aquisio

e armazenamento dos espectros coletados. O programa CSMA controlou o tempo de

exposio do detector e o nmero de aquisies por ponto da amostra, que neste

presente trabalho foi de 5 segundos para o tempo de exposio e 10 aquisies em cada

ponto. Foram realizadas aquisies em 8 pontos de cada cartilagem, sendo adquiridos

um total de 384 espectros de 48 espcimes (Tabela 3.4).

N total de cartilagens n de pontos por cartilagem n total de espectros obtidos

48 08 384

Tabela 3.4: Relao do n total de espectros obtidos dos espcimes

Para os procedimentos de anlise espectral foi realizada a calibrao por meio da

transformao de pixel para cm 1 dos espectros que foram obtidos dos espcimes. O

solvente Indino que possui posies dos picos espectrais conhecidos na literatura

(WOLLMAN, BOHN, 1993), foi utilizado como padro para a calibrao. Para isso o

espectro do Indino foi adquirido no mesmo dia da realizao do experimento para

equivalncia dos picos em cm 1. Aps a obteno dos espectros ocorreu o processo de

filtragem dos espectros para eliminar o background de fluorescncia da amostra, e,

diminuir o rudo gerado pela CCD. Ambos os procedimentos, calibrao e a filtragem

dos espectros foram realizados por meio do Mat Lab (The Mathworks, MA, USA,

verso 4.2) e um programa especfico para anlise de ER-IVP desenvolvido no

Laboratrio de Espectroscopia Biomolecular do IP&D na Universidade do Vale do

Paraba (OLIVEIRA FILHO, 2003). Para prevenir as variveis na execuo do

experimento e possveis interferncias nas anlises dos espcimes, foi necessria a

realizao do procedimento de normalizao dos espectros calibrados por meio de

isolamento de uma regio que no apresentava picos caractersticos dos espcimes

estudado nesse trabalho.

Filtro passa-bandahologrfico Laser de

Ti: SafiraLaser deArgnio

Espectogrfo CCD

Microcomputador

Filtro notchL2

L1

Porta - Amostra

AmostraLentePrisma

Pinhole

Figura 3.5: Diagrama esquemtico do Sistema Raman no infravermelho prximo. (L1 eL2-lentes)

A BC

D

EF

G

Figura 3.6: Componentes do Sistema Raman (ER-IVP). A laser de Argnio; B laserde Ti:Safira; C espectrogrfo; D cmera CCD; E porta-amostras com a epfise do

fmur com a cartilagem; F conjunto de lentes; G . filtro notch .

3.6. Metodologia estatstica

O programa Instat foi utilizado como auxlio para anlise estatstica de todas as

variveis aferidas neste estudo, no qual foi verificado primeiro a normalidade dos dados

por meio do Teste de Kolmorogov e Smirnov. Em seguida, como todos os dados

apresentaram distribuio normal, foram tratados pelo teste de estatstica ANOVA

Turkey-Kramer. O nvel de diferena estatisticamente significante para todos os casos

foi fixado em p

Figura 3.7: Trs reas em retngulos em que foram analisadas as intensidades da

colorao de cada corte histolgico (10x/0.22).

4. Resultados

4. Resultados

4.1. Modelo animal

Com relao aos 52 animais utilizados neste trabalho, dois morreram aps a

anestesia, e, em um animal, o fio de sutura soltou durante o procedimento passivo de

tensionamento em extenso do joelho em seguida ao procedimento de imobilizao.

Todos os animais restantes permaneceram com a imobilizao fixada no perodo

determinado de 15 dias.

4.2. Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)

Na anlise detalhada por meio da espectroscopia Raman para medir as

mudanas bioqumicas nas cartilagens, foram realizados espectros tpicos de cartilagem

retirada da epfise, cartilagem com epfise e do osso (epfise) mostrados na figura 4.1.

Nos espectros Raman da cartilagem normal retirada da epfise ssea apresentaram os

picos espectrais mais importantes relacionados matriz orgnica (MO) em 1450 cm-1 e

1680 cm-1 intensidades elevadas em comparao ao pico espectral relacionado matriz

inorgnica (MI) em 961 cm-1. No espectro filtrado do osso (epfise) os picos espectrais

em 1450 cm-1 e 1680 cm-1 (MO) as intensidades permaneceram baixas enquanto que o

pico em 961 cm-1 (MI) apresentou intensidade elevada quando comparados aos picos

espectrais da cartilagem retirada da epfise ssea. Nos espectros da cartilagem fixada na

epfise ssea o pico em 961 cm-1 (MI) apresentou uma intensidade elevada pelo fato de

haver uma sobreposio do sinal Raman da matriz inorgnica da cartilagem articular e

do osso subcondral, porm os picos da MO apresentaram intensidades elevadas

semelhantes aos espectros obtidos da cartilagem retirada da epfise ssea.

-5000

10000

25000

800 1200 1600

deslocamento Raman (cm -1)

inte

nsid

ade

(u.a

.)

Figura 4.1: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens normais de cndilosmediais de fmures de ratos wistar jovens. Trs bandas espectrais so destacadas, 961

cm-1 correspondente matriz inorgnica (MI), 1450 cm-1 correspondente matrizorgnica (MO) e 1680 cm-1 tambm correspondente matriz orgnica (MO).

Para anlise dos espectros das cartilagens foram utilizadas as intensidades dos

picos espectrais em 1450 e 1680 cm 1 para anlise das mudanas na MO e 961 cm 1

para a MI. As intensidades foram calculadas pela mdia de 24 pontos obtidos das

amostras de cada grupo, sendo determinadas a partir do valor mximo do pico de

interesse subtrado do valor mnimo desse mesmo pico. O valor de interesse resultante

dessa subtrao est relacionado com a concentrao dos componentes da matriz

analisada. Na anlise dos espectros das cartilagens com 15 dias de imobilizao,

ocorreram intensidades mais elevadas nos picos de 1450 e 1680 cm 1 (MO) para os

grupos que permaneceram imobilizados e irradiados (IIA e IIB), enquanto que o grupo

que ficou imobilizado e no irradiado (I) apresentou a menor intensidade quando

comparado com o grupo controle (C) e grupos irradiados Quanto ao pico em 961 cm 1

(MI), houve a mesma tendncia dos picos relacionados MO, com intensidades maiores

1680

1450

961 Cartilagem sem osso

Cartilagem com osso

Osso (epfise)

MO

MO

MI

nos grupos irradiados (IIA e IIB) enquanto que no grupo imobilizado (I) a intensidade

apresentou valores menores (Figura 4.2).

Aps 15 dias de imobilizao

-3000

7000

17000

800 1200 1600

deslocamento Raman (cm-1)

inte

nsid

ade

(u.a

.)

Figura 4.2: Mdias dos Espectros Raman obtidos de cartilagens articular aps 15 diasde imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle sem

imobilizao e sem irradiao; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade deenergia em 80 J/cm2 e IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em

720 J/cm2.

1450 1680

---IIIB

---IIA

---C

--- I

Nos espectros das cartilagens com 7 e 13 dias (Figuras 4.3 e 4.4) aps a retirada

da imobilizao, os grupos imobilizados e irradiados (IIA e IIB) apresentaram uma

reduo das intensidades dos picos espectrais da MO em comparao ao controle (C) e

ao grupo imobilizado sem irradiao (I), sendo que esse ltimo apresentou um discreto

aumento da intensidade. Nos espectros das cartilagens aps 19 dias da retirada da

imobilizao (Figura. 4.5) as alteraes das intensidades citadas com 7 e 13 dias aps a

retirada da imobilizao foram mais acentuadas, principalmente com relao ao grupo

imobilizado sem irradiao (I) que apresentou um grande aumento da intensidade, sendo

superior a todos os grupos experimentais. Com relao s intensidades do pico 961 cm1

da MI foram obtidos nos resultados a mesma tendncia dos picos da MO em todos os

perodos aps a retirada da imobilizao.

Recuperao: 7 dias aps a retirada da imobilizao

-3500

6500

16500

800 1200 1600

deslocamento Raman (cm -1)

inte

nsi

dad

e (u

.a)

Figura 4.3: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 7 dias aps aretirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle semimobilizao e sem irradiao; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de

energia em 80 J/cm 2 e IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em720 J/cm 2.

1450 1680

-IIIB

--IIA

---C

--- I

13 dias aps a retirada da imobilizao

-3000

7000

17000

800 1200 1600

deslocamento Raman (cm-1)

inte

nsid

ade

(u.a

.)

Figura 4.4: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com13 dias apsa retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle sem

imobilizao e sem irradiao; IIA: grupo imobilizado irradiado com densidade deenergia em 80 J/cm 2 e IIB : grupo imobilizado irradiado com densidade de energia em

720 J/cm 2.

19 dias aps a retirada da imobilizao

-4000

6000

16000

800 1200 1600

deslocamento Raman (cm-1)

inte

nsid

ade

(u.a

.)

Figura 4.5: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 19 dias apsaa retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controlesem imobilizao sem irradiao; IIA: grupo imobilizado irradiado com densidade de

energia em 80 J/cm 2 e IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em720 J/cm 2.

1450 1680

---IIB

---IIA

---C

---I

1450 1680

---IIB

---IIA

---C

---I

4.3. Anlise estatstica dos resultados Raman

4.3.1. Matriz orgnica

As mdias das intensidades do pico espectral em 1680 cm 1 referente MO

obtidas de espectros Raman das cartilagens aps 15 dias de imobilizao articular

(Grfico 4.1) apresentaram diferenas estatisticamente significativas entre o grupo

imobilizado e irradiado (IIA) e o grupo controle (C) (p0.05).

Pico espectral Raman 1680 cm -1 (MO) com 15 dias de imobilizao

0

1000

2000

3000

I C IIA IIB

grupos

inte

nsi

dad

e (u

.a.)

Grfico 4.1: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1

(MO) aps 15 dias de imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado; C: grupo noimobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de

energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em720 J/cm2, * estatisticamente significante (p

Com 7 dias aps a retirada da imobilizao (Grfico 4.2) no foram observadas

diferenas significativas entre todos os grupos (p=0.3338), assim como no perodo de

13 dias aps a retirada da imobilizao (p=0.1931, Grfico 4.3). Porm no perodo de

19 dias aps a retirada da imobilizao (Grfico 4.4) foram observadas diferenas

significativas entre o grupo imobilizado e no irradiado (I) e o grupo imobilizado e

irradiado (IIA) (p

Pico espectral Raman 1680 cm-1 (MO) com 13 dias aps a retirada da imobilizao

0

750

1500

2250

I C IIA IIB

grupos

inte

nsi

dad

e (u

.a.)

Grfico 4.3: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1

(MO) com 13 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado;C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com

densidade de energia em 80 J/cm2; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade deenergia em 720 J/cm2.

Pico espectral Raman 1680 cm -1 (MO) com 19 dias aps a retirada da imobilizao

0

750

1500

2250

I C IIA IIB

grupos

inte

nsi

dad

e (u

.a.)

Grfico 4.4: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1

(MO) com 19 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado;C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com

densidade de energia em 80 J/cm2; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade deenergia em 720 J/cm2.

* *

*

Pico espectral Raman 1680 cm -1 (MO)

0

1000

2000

3000

0 7 13 19

tempo (dias)

inte

nsi

dad

e (u

.a.)

I

C

IIA

IIB

Grfico 4.5: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1

(MO) em relao ao tempo (dias). 0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps aretirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado; C: grupo no

imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade deenergia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em

720 J/cm2, * estatisticamente significante (p

Pico espectral Raman 1450 cm-1 (MO)

0

1000

2000

3000

0 7 13 19

tempo (dias)

inte

nsi

dad

e (u

.a.)

I

C

IIA

IIB

Grfico 4.6: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1450 cm-1

(MO) em relao ao tempo (dias). 0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps aretirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado; C: grupo no

imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade deenergia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em

720 J/cm2, * estatisticamente significante (p

e irradiado (IIA) e o grupo controle (C) (p< 0.05). No perodo de 19 dias aps a retirada

da imobilizao foram observadas diferenas significativas entre o grupo imobilizado e

no irradiado (I) e o grupo imobilizado e irradiado (IIA) (p

Picocm-1 Tempo I C IIA IIB

mdias

DP mdias DP mdias

DP mdias

DP

0 1389 * 743 1759 * 623 2479 * 912 2966 * 9567 1924 945 2240 1266 1730 727 1850 99213 1654 738 2131 1058 1692 784 1929. 82319 2313 * 1142 2120 * 918 1459 * 579 1540 * 699

1680

mdias

DP mdias DP mdias

DP mdias

DP

0 1785 * 866 1940 * 570 2690 * 637 2549 * 8407 2223 985 2228 1089 1984 648 1965 74513 1970 664 2176 992 2133 748 2275 72519 2476 * 850 2156 593 1744 * 563 1798 * 615

1450

Picocm-1 Tempo 0 07 13 19

I vs C P>0.05 P = 0.3388 P =0.1931 P>0.05I vs IIA P

Picocm-1 tempo I C IIA IIB

mdias DP mdias DP mdias DP mdias DP0 5626 * 1881 5626 * 1881 8824 * 2625 8862 * 30257 6837 3332 6837 3332 5130 1633 5299 219613 6752 2601 6752 2601 5015 1579 5516 143919 6913 * 2227 6913 * 2227 4217 * 1504 5331 * 2178

961

Tempo 0 07 13 19

I vs C P>0.05 P = 0.1194 P0.05I vs IIA P0.05 P

Pico(cm-1) Tempo I C IIA IIB

0 vs 07 P>0.05 P = 0.3681 P0.0513 vs 19 P>0.05 P = 0.3681 P>0.05 P>0.05

1680

Teste denormalidad

esim sim sim sim

0 vs 07 P>0.05 P = 0.6554 P0.05 P = 0.6554 P>0.05 P>0.0513 vs 19 P>0.05 P = 0.6554 P>0.05 P>0.05

1450

Teste denormalidad

e

sim sim sim sim

0 vs 07 P>0.05 P = 0.2655 P

4.4. Anlise histolgica

Para a anlise histolgica das lminas foi verificada a variao da intensidade de

colorao do PAS por meio de microscopia ptica. A rea correspondente cartilagem

que apresentou colorao mais intensa foi diretamente relacionada com uma maior

concentrao de GAGs da MO. Nas lminas do perodo aps 15 dias de imobilizao,

os grupos IIA e IIB que permaneceram imobilizados e irradiados apresentaram a

colorao PAS mais intensa (figuras 4.6 e 4.7) em comparao com o grupo I que

permaneceu imobilizado e no irradiado (figura 4.8), sendo que o grupo controle (C)

tambm apresentou colorao de maior intensidade (figura 4.9). No perodo de 19 dias

aps a retirada da imobilizao articular as lminas de todos os grupos apresentaram

colorao PAS semelhantes que sugere concentraes similares de GAGs entre todos os

grupos experimentais.

Figura 4.6: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e irradiadocom densidade de energia de 80J/cm2 (IIA) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22),

CA: cartilagem

CA

Figura 4.7: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e irradiadocom densidade de energia de 720J/cm2 (IIB) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22),

CA: cartilagem

Figura 4.8: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e noirradiado (I) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22), CA: cartilagem.

CA

CA

Figura 4.9: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e noirradiado (C) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22), CA: cartilagem.

Para a anlise por meio do software LEICA QWIN foi utilizada a escala do

cinza para investigar a intensidade de colorao. Os valores dessa escala variam de 0 a

254 (u.a.), sendo que o menor valor (0) corresponde mxima intensidade do cinza e o

maior valor (254) a mnima intensidade do cinza. Portanto, nos resultados apresentados,

quanto menor o valor da escala do cinza, maior foi a intensidade de colorao do corte

histolgico pelo PAS representando maior concentrao das GAGs da MO da

cartilagem. Foram obtidas intensidades da escala do cinza em 3 reas de cada corte

histolgico, sendo que cada grupo era formado por 3 animais e cada animal

representado por 3 lminas, constituindo um total de 27 medidas analisadas por grupo

experimental. Aps a realizao da mdia da intensidade da escala do cinza de cada

grupo, no perodo de 15 dias aps a imobilizao articular foram apresentados nos

resultados, valores menores nos grupos imobilizados e irradiados (IIA e IIB) quando

comparados com os valores do grupo imobilizado e no irradiado (I), enquanto que o

grupo controle (C) apresentou valores da escala do cinza tambm menores

demonstrando existir uma concentrao maior de GAGs (Grfico 4.8). No perodo de 19

dias aps a retirada da imobilizao articular, entre todos os grupos foram apresentados

valores semelhantes que sugerem concentrao similares de GAGs da MO da

cartilagem articular entre todos os grupos (Grfico 4.9).

CA

Aps 15 dias de imobilizao

50

140

I C IIA IIBgrupos

inte

nsid

ade

(u.a

)

Grfico 4.8: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza. Os valores soinversamente proporcionais s concentraes de GAGs, as menores intensidadesrepresentam maiores concentraes de GAGs na MO. I: grupo imobilizado e no

irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiadocom densidade de energia em 80 J/cm2; IIB : grupo imobilizado e irradiado com

densidade de energia em 720 J/cm2.

Recuperao: aps 19 dias da retirada da imobilizao

50

140

I C IIA IIB

grupos

inte

nsid

ade

(u.a

.)

Grfico 4.9: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza. I: grupoimobilizado e no irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo

imobilizado e irradiado com densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizadoe irradiado com densidade de energia em 720 J/cm2.

6. Concluses

6. Concluses

- A espectroscopia Raman no infravermelho prximo detectou alteraes nas

cartilagens articulares;

- Aps o perodo de imobilizao articular ocorreu uma reduo nas

concentraes das substncias GAGs na MO da cartilagem identificada pela

espectroscopia Raman no infravermelho prximo;

- O tratamento com laser de baixa potncia promoveu a bioestimulao com o

aumento nas concentraes das substncias GAGs na MO da cartilagem no

perodo timo de 15 dias aps a imobilizao articular;

- As diferentes densidades de energia (80 e 720 J/cm2) utilizadas promoveram

efeitos similares quanto as concentraes de GAGs na MO.

7. Referncias Bibliogrficas

7. Referncias Bibliogrficas

AKAI, M.; USUBA, M.; MAESHIMA, T.; SHIRASAKI, Y.; YASUOKA, S. Laser

Effect on bone and cartilage change induced by joint immobilization in experiment with

animal model. Laser Surg. Med.,v.21, p.480-484, 1997.

AKESON, W.H.; AMIEL, D.; ABEL, M.F.; GARFIN, S.R.; WOO, L.Y. Ef