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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MOISÉS FERNANDES MARTINS
TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES EM CÉLULAS
ESPERMÁTICAS DE Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Decapoda,
Palaemonidae)
FORTALEZA
2017
1
MOISÉS FERNANDES MARTINS
TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES EM CÉLULAS
ESPERMÁTICAS DE Macrobrachium amazonicum (Decapoda, Palaemonidae)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do
título de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução
Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução
e sanidade de carnívoros, onívoros,
herbívoros e aves.
Orientadora: Profa. Dra. Célia Maria
Souza Sampaio
FORTALEZA
2017
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MOISÉS FERNANDES MARTINS
TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES EM CÉLULAS
ESPERMÁTICAS DE Macrobrachium amazonicum (Decapoda, Palaemonidae)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual
do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do título de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 19 de dezembro de 2017.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Profª. Drª. Célia Maria de Souza Sampaio
Orientadora
____________________________________
Profª. Drª. Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley
Examinadora
____________________________________
Prof. Dr. Manoel Paiva de Araújo Neto
Examinador
4
AGRADECIMENTOS
A todos que colaboraram direta e indiretamente com a produção desse trabalho.
5
RESUMO
As técnicas de criopreservação têm se destacado na aquicultura por viabilizar a
estocagem e o transporte de material genético. Para tanto o uso de agentes crioprotetores
são comumente empregados, contudo, quando utilizados em altas concentrações podem
apresentar efeitos tóxicos. Assim, testes prévios de toxicidade são capazes de
estabelecer as concentrações mais eficazes para os protocolos de criopreservação. Este
estudo avaliou os efeitos de toxicidade dos agentes crioprotetores dimetilsulfóxido
(DMSO), etilenoglicol (EG) e glicerol (GLY) na massa espermática de M. amazonicum.
Para o presente experimento, 150 espermatóforos foram coletados de 30 machos de M.
amazonicum, usando uma adaptação da técnica de leve compressão abdominal. A massa
espermática foi extrusada, formando pools e submetida em DMSO, GLY e EG nas
concentrações de 5, 10 e 15% v/v, preparada em solução salina estéril livre de cálcio
(Ca-F) durante 30 minutos de tempo de equilíbrio. O percentual de espermatozoides
vivos foi determinado por um teste modificado de coloração com eosina-nigrosina e os
espermatozoides foram contados em microscópio óptico (40x) com auxílio de um
hemicitômetro (câmara de Neubauer). Os resultados foram analisados utilizando análise
de variância (ANOVA) e teste de Tukey HSD e Dunnett a um nível de significância de
5%. De acordo com o teste de toxicidade, o GLY foi o menos tóxico entre os
crioprotetores testados em comparação com o controle (P < 0,05) com 47,5 ± 2,2 de
espermatozoides vivos. Os testes de toxicidade de DMSO não revelaram diferença
estatisticamente significativa (P < 0,05) nas concentrações de 5, 10 e 15% com 18,6 ±
1,8, 19,2 ± 2,0 e 16,5 ± 2,7 de espermatozoides vivos, respectivamente. Para testes com
EG, a concentração de 15% resultou em 100% de mortalidade nas células espermáticas
testadas. Este estudo sugere que a massa espermática de M. amazonicum pode ser
criopreservado utilizando GLY 5% como agente crioprotetor.
Palavras-chaves: Camarão da amazônia. Espermatóforo. Criopreservação.
6
ABSTRACT
The cryopreservation techniques have been highlighted in aquaculture by enabling the
storage and transport of genetic material. For this, the use of cryoprotectants is
commonly used, however, when used in high concentrations they may present toxic
effects. Thus, prior toxicity tests are able to establish the most effective concentrations
for cryopreservation protocols. This study evaluated toxicity effects of cryoprotectants
agents dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and glycerol (GLY) on
Macrobrachium amazonicum sperm mass. For the present experiment, 150
spermatophores were taken from 30 M. amazonicum males, collected using an adapting
technique of gentle abdominal compression. The sperm mass were extruded in pools
and submitted in DMSO, GLY and EG at concentrations of 5, 10 and 15% v/v, prepared
in sterile Calcium Free saline (Ca-F saline) for 30 min of equilibration time. The
survival of the sperm was determined by staining with eosin-nigrosin modified and
sperm cells were counted in the optical microscope (40x) with the aid of a
hemacytometer (Neubauer chamber). Results were analysed using analysis of variance
(ANOVA), Tukey’s and Dunnett’s test at a 5% significance level. According
cryoprotectant toxicity assay, GLY was less toxic among the tested cryoprotectants
compared to control (P < 0.05) with 47.5 ± 2.2 of viability sperm. DMSO toxicity tests
revealed no statistically significant difference (P < 0.05) between 5, 10 and 15% sperm
viability with 18.6 ± 1.8, 19.2 ± 2.0 and 16.5 ± 2.7 respectively. For tests with EG, the
concentration of 15% resulted in 100% mortality to tested sperm. This study suggests
that sperm mass from M. amazonicum can be cryopreserved using GLY 5% as a
cryoprotective agent.
Keywords: Amazon River prawn. Spermatophore. Cryopreservation.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Macho de Macrobrachium amazonicum ........................................................ 16
CAPÍTULO I
Figure 1 The sperm survival rate of M. amazonicum submitted to different
cryoprotectants at various dilution percentages compared to the control treatment .... 51
Figure 2 The sperm survival rate of M. amazonicum submitted to different
cryoprotectants at various dilution percentages compared to each other ……………. 52
Figure 3 Viable and non-viable sperm cells of M. amazonicum stained with eosin-
nigrosin ………………………………………………………………………………. 53
8
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Table 1 Percentage of viable sperm of M. amazonicum submitted to different
cryoprotectants at various concentration ……….………………................................. 50
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ca-F – Solução salina livre de cálcio
CC – Cinnamon Claw
CP – Proteína bruta
DMSO – Dimetilsulfóxido
EG – Etilenoglicol
GC1 – Green Claw 1
GC2 – Green Claw 2
GLY – Glicerol
IGS – Índice gonadossomático
IHS – Índice hepatossomático
NL2 –
Nitrogênio puro em estado líquido
PI – Iodeto de propídeo
SYBR-14 – Corante fluorescente de ácidos nucleicos
TC – Translucent Claw
v/v – Percentagem volúmica
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................... 13
2.1 BIOLOGIA DO Macrobrachium amazonicum ................................................ 13
2.2 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO DE CAMARÕES/
CRUSTÁCEOS DECÁPODES ....................................................................... 15
2.3 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DOS ESPERMATÓFOROS DE
CAMARÕES .................................................................................................... 18
2.4 CRIOPRESERVAÇÃO E TOXICIDADE DE AGENTES
CRIOPROTETORES......................................................................................... 20
2.5 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE ESPERMÁTICA DE CAMARÕES ...... 23
3 JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 25
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ............................................................................ 26
5 OBJETIVOS ................................................................................................... 27
5.1 GERAL.............................................................................................................. 27
5.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................. 27
6 CAPÍTULO I ................................................................................................... 27
7 CONCLUSÕES .............................................................................................. 54
8 PERSPECTIVAS ............................................................................................ 55
REFERÊNCIAS ............................................................................................. 56
11
1 INTRODUÇÃO
Macrobrachium amazonicum é uma espécie nativa da Bacia Amazônica, e
se destaca por oferecer um grande potencial para a aquicultura (KUTTY et al., 2000;
NEW, 2005; ROUTLEDGE et al., 2006), além de ser o principal camarão de água-doce
explorado comercialmente nos estados do Pará e Amapá pela pesca artesanal, onde
apresenta uma comercialização significativa (LUCENA-FRÉDOU et al., 2010). M.
amazonicum também é conhecido como “camarão regional” no estado do Pará
(MORAES-RIODADES et al., 1999), “camarão canela” e “camarão sossego”
(VALENTI, 1985) e, atualmente, vem sendo chamado de “camarão da amazônia”
(MORAES-RIODADES; VALENTI, 2009).
O camarão da Amazônia pode alcançar até 16 cm e 30 g (BROWN; NEW;
ISMAEL, 2010). É um camarão pequeno quando comparado a espécies mais
estabelecidas comercialmente como o camarão gigante da Malásia M. rosenbergii,
porém, sua carne apresenta textura mais firme e sabor mais acentuado, por isso, é
melhor aceita nos mercados consumidores (MORAES-RIODADES et al., 1999).
Apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde a Venezuela até o estado do
Paraná e em quase todo o território nacional, ocorrendo nos rios Orinoco, Amazônia,
São Francisco, Paraná e Paraguai (AUGUSTO; VALENTI, 2016; BROWN; NEW;
ISMAEL, 2010).
M. amazonicum vem despertando interesse para o cultivo por apresentar
rápido crescimento, rusticidade e fácil manutenção em cativeiro pois a mesma não
apresenta a agressividade característica de outras espécies do gênero como M.
acanthurus e M. carcinus, além de ser mais resistente a doenças e predadores (LOBÃO;
ROJAS, 1991; MACIEL; VALENTI, 2009). E do ponto de vista ecológico não
apresenta riscos à natureza por escape de viveiros de aquicultura, como observado nas
produções de espécies exóticas (BROWN; NEW; ISMAEL, 2010).
Morfologicamente, o aparelho reprodutor de machos de M. amazonicum
apresenta testículos simétricos, alongados e transparentes. De cada lado dos testículos
partem os ductos deferentes, estruturas enoveladas que apresentam na sua porção final
uma dilatação denominada de ampola do ducto deferente, onde está localizado o
espermatóforo contendo a massa espermática (BROWN; NEW; ISMAEL, 2010; PAPA,
2007; SILVA, 2006). Em geral, espermatozoides da decápodes não apresentam
motilidade, logo, sua sobrevivência pode ser determinada por técnicas de exclusão com
12
uso de corantes supravitais, como eosina-nigrosina ou azul de trypan. Os
espermatozoides viáveis não se impregnam, enquanto espermatozoides inviáveis
adquirem coloração por apresentam lesões na membrana celular que permitem a
penetração do corante supravital (CABRITA et al., 2008).
As técnicas de resfriamento e criopreservação de material genético têm se
destacado nos manejos reprodutivos em aquicultura, por viabilizar a estocagem e o
transporte de material genético (GOLDBERG et al., 2000). A preservação de
espermatóforos por longos períodos caracteriza-se em uma vantagem adicional para
futuros programas de melhoramento genético, assim como já é realizado em outras
espécies de camarões (NIMRAT et al., 2006; VUTHIPHANDCHAI et al., 2005).
A eficiência das técnicas de criopreservação baseia-se em evitar a exposição
dos espermatozoides aos efeitos do choque térmico. Para tanto, a solução conservadora
deve possuir elementos crioprotetores e curvas de congelação e descongelação bem
controlados (UBERTI, 2014). Os agentes crioprotetores ajudam a diminuir criolesões,
mas quando utilizados em altas concentrações podem apresentar efeitos tóxicos aos
espermatozoides (MARIA, 2005).
Portanto, a toxicidade é um dos fatores limitantes para o sucesso de um
protocolo de conservação (MAZZOBRE et al., 2001). Porém, vale ressaltar que a
toxicidade biológica dos agentes crioprotetores está diretamente relacionada às suas
respectivas concentrações. Assim, testes prévios de toxicidade são capazes de
estabelecer as concentrações mais eficazes para os protocolos de criopreservação.
Testes de toxicidade com espermatóforos de decápodes como M. rosenbergii,
Litopenaeus schmitti e L. vannamei indicaram glicerol e DMSO como agentes
crioprotetores indicados por apresentarem taxas de sobrevivência acima de 91%
(CHAVES, 2010CHOW, 1985; UBERTI, 2014).
Desta forma, existe uma necessidade de se estudar a toxicidade de
crioprotetores seminais para o M. amazonicum uma vez que inexistem estudos dessa
natureza para esta espécie.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 BIOLOGIA DO MACROBRACHIUM AMAZONICUM
Os crustáceos são animais que vivem nos ecossistemas aquáticos e
terrestres. Apresentam exoesqueleto, apêndices birremes e possuem dois pares de
antenas (RUPPERT; BARNES, 1994). A ordem decápoda apresenta aproximadamente
10.000 espécies descritas, encontradas em diferentes ambientes, representando um
grupo altamente diversificado que contribui significativamente para o tamanho,
complexidade e o funcionamento das comunidades bentônicas tropicais e subtropicais
(BOWMAN; ABELE, 1982; HENDRICKX, 1995). A infraordem Caridea ostenta a
maioria das espécies de camarão conhecidas, das quais estão agrupadas em 270 gêneros
e 27 famílias. Dentre estas se destaca a família Palaemonidae, cujos representantes
ocorrem em todos os continentes, vivendo principalmente em ambientes de água salobra
e doce. Segundo Melo (2003), são registradas no Brasil 39 espécies de camarões
dulcícolas, pertencentes a três famílias, sendo a Palaemonidae a mais recorrente, cujo
gênero Macrobrachium é representado por varias espécies, dentre elas as mais
conhecidas são M. acanthurus, M. amazonicum, M. brasiliense, M. carcinus, M. olfersi,
M. potiuna, etc.
M. amazonicum apresenta como característica um rostro longo com a ponta
virada para cima que ultrapassa distintamente o escafocerito, com aproximadamente 12
dentes na porção superior e 10 na porção inferior. O telson apresenta uma extremidade
ponte-aguda com cerdas posteriores que não se estendem até a ponta – essas
características não são tão evidentes nos juvenis, dificultando na identificação da
espécie durante esse período. Os dáctilos são 3/4 do comprimento dos quelípodos e são
cobertos com uma camada espessa de cerdas. Geralmente os machos adultos são
maiores que as fêmeas e apresentam os quelípodos proporcionalmente mais
desenvolvidos. Os espécimes apresentam uma coloração transparente e quase incolor
(HOLTHUIS, 1952; MAGALHÃES et al., 2005; MELO, 2003).
M. amazonicum habita diversos tipos de ambientes lóticos na América do
Sul tropical. É bastante encontrado em rios de águas turvas, ricos em sedimentos e sais
dissolvidos, como os rios de águas brancas da bacia Amazônica, os rios e lagoas do
Pantanal (MAGALHÃES, 2000) e reservatórios da região nordeste (ARRAES;
RAMOS-PORTO, 1994). Em geral, o M. amazonicum pode ser encontrado em
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ambientes com diferentes gradientes de salinidade, incluindo ambientes inteiramente
dulcícolas até águas estuarinas, podendo ser dividido em duas populações principais:
costeira e continental (MAGALHÃES et al., 2005; PORTO, 2004; VERGAMINI,
2009).
Segundo Maciel e Valenti (2009) pelo fato de a espécie demonstrar diversas
variações interpopulacionais como morfologia, crescimento, reprodução,
desenvolvimento e fisiologia existe a possibilidade de especiação. Baseado em
variações morfológicas, Porto (2004) propôs que as populações costeiras e continentais
constituíam duas espécies distintas. Além disso, estudos mais recentes apontam
diferenças genéticas no DNA mitocondrial e no rRNA indicando que três grupos
monofiléticos podem ser distinguidos: (1) Amazônia oriental, (2) rios costeiros do norte
e nordeste do Brasil e (3) bacia superior do rio La Plata (Paraná-Paraguai)
(VERGAMINI, 2009). Porém, tais divergências genéticas apresentam variabilidade
intraespecífica, sendo assim, a espécie M. amazonicum ainda é considerada como uma
única espécie.
Além de possuir uma extensa distribuição, o M. amazonicum apresenta
ampla plasticidade ecológica e morfológica (VERGAMINI et al., 2011; PANTALEÃO,
2014). Diferenças quanto a morfometria, morfotipos e diferenciação morfotípica de
machos de M. amazonicum, foram observadas por Moraes-Riodades e Valenti (2004),
Silva (2005) e Silva et al. (2009), que de acordo com analises morfológicas externas,
observaram que as populações de machos adultos provenientes de viveiros de
aquicultura apresentam quatro grupos de machos que diferem entre si pela coloração e
espinação do segundo par de quelípodos e pelo padrão de crescimento. Estes diferentes
morfotipos denominam-se Translucent Claw (TC), Cinnamon Claw (CC), Green Claw 1
(GC1) e Green Claw 2 (GC2). Todos apresentam entre si diferença quanto ao tamanho,
com uma diferença marcante de TC e CC pois estes são menores em relação a GC1 e
GC2. Os autores referem-se ao morfotipo GC2 como machos dominantes e
reprodutivamente ativos, enquanto o morfotipo GC1 classifica-se como um estádio ou
forma de transição. Os diferentes morfotipos de machos são uma característica da
espécie, mas o padrão de desenvolvimento completo das estruturas morfológicas varia
em decorrência do ambiente (MACIEL; VALENTI, 2009). Papa (2007), em estudos
sobre o sistema reprodutor de M. amazonicum, mostrou que todos os morfotipos são
capazes de produzir gametas férteis, porém, a espermatogênese é menor no morfotipo
CC.
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M. amazonicum possui uma atividade reprodutiva contínua ao longo do ano,
contudo apresenta certos períodos mais favoráveis à sua maturação (BIALETZKI et al.,
1997; ODINETZ-COLLART, 1993; SAMPAIO et al., 2007; SILVA et al. 2005). A
fecundidade absoluta é inferior quando comparada a outras espécies do gênero
Macrobrachium. Estas diferenças observadas podem ser atribuídas ao ambiente ou a
características individuais e que a fecundidade aumenta com o crescimento do animal
(SCAICO, 1992).
O ciclo de vida de M. amazonicum é semelhante ao de outas espécies do
mesmo gênero (CARVALHO, 1980; CHOW et al., 1982). A fêmea sofre uma muda
pré-cópula, então, o macho deposita o espermatóforo contendo os espermatozoides em
sua região abdominal, especificadamente no gonóporo. Após isso, a fêmea libera os
ovos que serão fertilizados na passagem pela massa espermática, dando origem aos
embriões que são transferidos e incubados nas cerdas pleopodais até o momento da
eclosão das larvas (CHAVES; MAGALHÃES, 1993; ODINETZ-COLLART). O
embrião eclode no estádio larval de zoea com natação livre que passa por cerca de 9
estágios larvais subsequentes com duração média de 20 dias, variando de acordo com os
padrões de cultivo (GUEST, 1979; MAGALHÃES, 1985). Após sucessivas
metamorfoses, os juvenis assumem um habito bentônico, escalando substratos e
superfícies verticais, comportamento característico de adultos (MORAES-RIODADES;
VALENTI, 2004). Posteriormente, em um curto período de crescimento somático, de
aproximadamente dois meses, desenvolvem-se animais adultos que atingem de 45 a 60
mm (GUEST, 1979; MORAES; RIODADES; VALENTI, 2002; SAMPAIO et al.,
2007; SILVA; SAMPAIO, 2004; SILVA et al., 2005).
2.2 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO DE CAMARÕES/CRUSTÁCEOS
DECÁPODES
Camarões de água doce podem apresentar polimorfismo entre machos que
compõem os indivíduos sexualmente maduros de uma mesma população, deste modo,
os diferentes morfotipos podem adotar estratégias de cópula alternativas (SAGI et al.,
1988). Moraes-Riodades e Valenti (2002) em trabalho com machos de M. amazonicum
oriundos de cultivo identificaram e classificaram quatro morfotipos da espécie. Segundo
os autores, os morfotipos correspondem a castas dentro da população e foi sugerido que
os machos GC1 e GC2 sejam os dominantes e com maior atividade reprodutiva.
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Todavia, estudos posteriores revelaram que não existe diferença na estrutura testicular
dos morfotipos GC1 e GC2 (PAPA et al., 2004), do mesmo modo, com base nos índices
gonadossomático (IGS) e hepatossomático (IHS) de M. amazonicum, também não foi
observado diferenças entre estes morfotipos (PAPA et al., 2004), sugerindo que o
morfotipo GC1 consista em um estádio de transição entre o morfotipo CC e o GC2,
considerando a existência de apenas três morfotipos, a saber, TC, CC e GC2 (PAPA et
al., 2004).
Figura 1 – Macho de Macrobrachium amazonicum.
O aparelho reprodutor dos camarões tem sido descrito em várias espécies,
sendo constituído de dois testículos que são alongados e simétricos, ductos deferentes,
canal ejaculador e estruturas anexas como glândulas androgênicas. (BELL;
LIGHTNER, 1997; KROL et al., 1992).
Carvalho (1980), em analise microscópica do aparelho reprodutor masculino
de M. acanthurus, descreve que os testículos são providos de túbulos seminíferos
enovelados, do qual evidenciam-se as células da linhagem germinativa, e estão
revestidos por uma parede de tecido conjuntivo. A estrutura do testículo, ducto
deferente e espermatóforo, foram observados no camarão M. rosenbergii por Chow et
al. (1982). Os testículos desta espécie unem-se na região anterior do animal e adquirem
a forma de V, estendem-se para a região antero-ventral do estômago ficando sobre o
hepatopâncreas e abaixo do coração. Verdi e Delgado (1998) investigaram a histologia
do aparelho reprodutor masculino do camarão M. borellii, descrevendo que os testículos
Fo
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01
7
17
apresentam túbulos seminíferos enovelados em forma de espiral na região dorso lateral
do animal, cobertos por uma parede de tecido conjuntivo.
Papa et al. (2004), em trabalho de caracterização gonadal de machos de M.
amazonicum, relata que o aparelho reprodutor dessa espécie está localizado na parte
antero-ventral do estômago, sobre o hepatopâncreas e debaixo do coração. Os testículos
são simétricos, alongados, transparentes e situados na região dorsal da carapaça. De
cada lado dos testículos partem os ductos deferentes, finos, tubuliformes divididos em
três regiões: proximal, média e distal. Na região distal, região dilatada dos ductos
deferentes também chamada de ampola terminal, se localiza as glândulas androgênicas
onde situa-se o espermatóforo (PAPA, 2007; SILVA et al., 2009).
Os ductos deferentes possuem em seu interior as células espermáticas, sendo
responsável por encaminhar os espermatozoides dos testículos para os gonóporos
(KROL et al., 1992; DIAZ et al., 2002). Os ductos deferentes da lagosta verde P.
laevicauda surgem da porção mediana de cada testículo, enovelam-se e dirigem-se em
linha reta até alcançarem o quinto par de pereópodes, abrindo-se para o exterior através
do gonóporo (MOTA-ALVES; TOMÉ, 1966), o que foi semelhantemente descrito para
o camarão M. rosenbergii (CHOW et al., 1982) e para o M. amazonicum (SILVA et al.,
2009). Ao passar pelo comprimento do ducto deferente, os espermatozoides são
encapsulados e formam os espermatóforos (SAINTE-MARIE; SAINTE-MARIE, 1999).
A morfologia dos espermatóforos tem sido estudada devido à sua grande importância
filogenética e, também, devido ao desenvolvimento tecnológico para a inseminação
artificial em crustáceos (DIAZ et al., 2002; SUBRAMONIAM, 1993).
O espermatóforo é uma cápsula que contém espermatozoides e os protege
durante a transferência para a fêmea (KROL et al., 1992). O espermatóforo consiste em
uma massa de espermatozoides emparelhados e uma matriz gelatinosa, responsável pelo
empacotamento e direcionamento dos espermatozoides. Essas matrizes são secretadas
por células epiteliais na região proximal dos ductos deferentes (CHOW et al., 1982;
DIAZ et al., 2002; WANG et al., 2002). Na região distal dos ductos deferentes,
denominada ampola terminal, ocorre deposição e a organização dos componentes do
espermatóforo, assim como a finalização da maturação. As células epiteliais dessa
região secretam muco e substancias adesivas responsáveis pela adesão do espermatóforo
no receptáculo das fêmeas (DIAZ et al., 2002; WANG et al., 2002).
Os espermatozoides de M. amazonicum apresentam uma forma de “taça” ou
de “cálice”, possuem a porção apical côncava e a porção distal convexa e uma pequena
18
espícula (SILVA et al., 2009), morfologicamente semelhantes a espermatozoides de M.
rosenbergii (CHOW et al., 1982) e M. acanthurus (CARVALHO, 1980). O núcleo dos
espermatozoides apresenta um aspecto descondensado com cromatina fibrilar e a
espícula não apresenta motilidade, apresentando elementos ultruaestruturais do tipo
microfilamentos e estriações transversais (SILVA et al., 2009). Os estudos que avaliam
a relação entre o número de espermatozoides por espermatóforo têm se restringindo
principalmente às espécies de camarões marinhos, como Penaeus monodom
(PRATOOMCHAT et al., 1993), L. stylirostris (ALFARO-MONTOYA, 1993),
Pleoticus muelleri (DIAZ et al., 2002) e L. vannamei (LEUNG-TRUJILLO, 1985). Os
autores supracitados descrevem que em animais com pesos médios entre 20 e 40 g
foram observadas, respectivamente, médias de 0,8 milhões, 1,6 milhões, 4,7 milhões e
31,9 milhões de células espermáticas por unidade de espermatóforo, indicando que
diferenças entre o número de células dependem da espécie.
2.3 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DOS ESPERMATÓFOROS DE CAMARÕES
O método de extração do espermatóforo pode ter grande influência na
qualidade espermática, um fator decisivo para o sucesso da criopreservação e
inseminação artificial, além de permitir o reaproveitamento do reprodutor e de seleção
dos mesmos por meio da contagem do número de células espermáticas, do percentual de
células vivas e da morfologia dos espermatozoides (CEBALLOS-VAZQUEZ et al.,
2003; LEUNG-TRUJILLO et al., 1985,).
Para a obtenção dos espermatóforos de carídeos, são utilizados quatro
métodos de extrusão. Uma das primeiras a serem desenvolvidas e utilizadas para
obtenção de espermatóforos, foi a técnica de dissecção do macho congelado, com a qual
Clark et al. (1973) obtiveram êxito pela primeira vez na obtenção de larvas resultantes
de fertilização "in vitro" utilizando de gametas de L. aztecus a fresco. Essa técnica
permite o uso de todo o comprimento do ducto deferente, proporcionando maior volume
de sémen para inseminação artificial (GOLDBERG, 1998).
Sandifer e Smith (1979) propuseram a técnica de eletroejaculação, utilizada
primeiramente em Macrobrachium rosenbergii, e esta tornou-se a mais difundida por
ser mais rápida e fornecer o espermatóforo na forma mais similar de como ocorre na
natureza. Ceballos-Vázquez et al. (2003) em trabalho com L. vannamei conseguiram
alto índice de fêmeas inseminadas com espermatóforos obtidos através da técnica de
19
eletroejaculação. A aplicação dos estímulos elétricos é realizada através de sucessivos
toques com eletrodos, no primeiro pleonito e em uma das coxas do quinto par de
pereópodes (AIKEN et al, 1984), com duração de até um segundo, de maneira contínua,
durante aproximadamente um minuto. Assim, a corrente elétrica se fecha através da
resistência encontrada no corpo dos camarões, induzindo a ocorrência de contrações
musculares seguida da expulsão do espermatóforo armazenado na ampola terminal
(GOLDBERG, 1998). Para M. rosenbergii, Bhaskar et al. (2004) afirmam que a
reutilização do macho para uma nova extração do espermatóforo pode ser executada em
intervalos de 24 h e Harris e Sandifer (1986) obtiveram entre 81% e 100% dos
espermatóforos por um período de 29 dias.
Chow et al. (1985) em estudos de criopreservação do espermatóforo de M.
rosenbergii, obtiveram sucesso na fertilização utilizando o espermatóforo recém
depositado no receptáculo seminal da fêmea, por meio da técnica de remoção pós-
cópula. A cópula acontece com a transferência de uma fêmea que recentemente tenha
sofrido muda pré-cópula para um aquário contendo um espécime macho. Durante a
cópula o macho deposita o espermatóforo por intermédio da matriz adesiva no
receptáculo seminal da fêmea, localizado na região abdominal entre o segundo e o
quarto par de pereópodes, tornando possível, através de um método meticuloso a
retirada do espermatóforo com o auxílio de pinças.
A técnica de eletroejaculação permite a expulsão dos espermatóforos
repetidas vezes, porém, a aplicação frequente de estímulos elétricos induz a
melanização dos tecidos reprodutivos culminando em uma diminuição na taxa de
fertilização das fêmeas com o decorrer do tempo (HARRIS; SANDIFER, 1986).
Pesquisas posteriores verificaram que a eletroejaculação compromete a regeneração do
espermatóforo, pois segundo eles, o eletrochoque poderia estar prejudicando as funções
testiculares ocasionando uma diminuição significativa no volume de ejaculado
(DOUGHERTY; DOUGHERTY, 1990; PASCUAL et al. 1998; ROSAS et al. 1993).
Assim, apenas espermatóforos não melanizados devem ser selecionados para estudos de
preservação a fim de garantir que os resultados não sejam prejudicados pela má
qualidade inicial do conteúdo espermático (FERNANDES, 2014).
Atualmente, a técnica de compressão abdominal é o método mais utilizado
devido a simplicidade e praticidade. Em machos no período de intermuda, os
espermatóforos são expelidos pela compressão da região latero-ventral posterior à
inserção do quinto par de pereópodes utilizando os dedos polegar e indicador até atingir
20
a expulsão parcial do espermatóforo, que logo em seguida é retirado completamente
com o auxílio de uma pinça sem atingir o gonóporo a fim de evitar danos ao animal
(ALFARO-MONTOYA, 1998; LIN; TING, 1986). Esse método tem a vantagem de ser
aplicado mais diretamente no ponto de extrusão do espermatóforo, porém, depende da
habilidade do operador para evitar danos ao animal e diminuir o tempo de manipulação
do organismo durante este processo. Nakayama et al. (2008) observaram maior
sobrevivência e qualidade dos espermatóforos regenerados em animais que passaram
por compressão abdominal do que em animais eletroestimulados, de modo que a
primeira técnica possibilita melhor reutilização dos machos. Amrit et al. (2006),
Lezcano et al. (2004), Nimrat et al. (2006) e Vuthiphandchai et al. (2007) obtiveram
espermatóforos de boa qualidade com esta técnica. Em contrapartida, Chamberlain et al.
(1983) em estudos com camarões marinhos, atribuiu a melanização da porção distal dos
ductos deferentes em Penaeus setiferus, P. stylirostris, e L. vannamei por danos
ocasionados pela força exercida com a técnica de compressão abdominal.
2.4 CRIOPRESERVAÇÃO E TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES
A criopreservação é uma técnica que envolve a congelação de tecidos,
células germinativas e embriões, tendo como princípio a redução do metabolismo
celular e, consequentemente, o prolongamento da vida útil das células permitindo a
retomada do desenvolvimento celular normal após períodos indeterminados de
armazenamento (PEGG, 2007).
A criopreservação do espermatóforo é um método valioso na restauração de
espécies em perigo de extinção, bem como uma técnica para manipulação reprodutiva e
a melhoria genética do camarão (MEMON et al., 2012). O processo de criopreservação
de esperma possui etapas importantes, como a coleta das amostras, o tipo do meio
diluidor, tipo e níveis de concentração dos agentes crioprotetores, tempos de equilíbrio,
curvas de congelação, período de preservação em nitrogênio liquido e taxa de
arrefecimento (TIERSCH; GREEN, 2011). Cada etapa dos protocolos de
criopreservação de esperma proporciona riscos relacionados com a lesão celular.
Os agentes crioprotetores tratam-se de solventes orgânicos de baixo peso
molecular, capazes de penetrar nas células e retirarem a água intracelular a uma taxa
que impede a formação de cristais de gelo que possam romper as membranas. Agem em
concomitância com os efeitos causados pelo ritmo de congelamento através da
21
diminuição da concentração osmótica do meio diluidor, tornando mais viscoso e
permitindo um congelamento relativamente mais lento ao material (HAFEZ, 1995).
Além disso, os crioprotetores também atuam prevenindo a exposição do material a altas
concentrações de eletrólitos, através da ligação aos próprios eletrólitos ou pela
substituição parcial pela água (JAIN; PAULSON, 2006; LEIBO, 2000), permitindo a
manutenção da estrutura original da célula espermática, garantindo maiores taxas de
sobrevivência (CASTRO, 2011; CHAVES et al., 2010;). Vários agentes já foram
utilizados isoladamente ou em combinação e a escolha depende da espécie em questão
(GWO, 2000).
Para garantir o sucesso da criopreservação, a composição da solução
crioprotetora, é de fundamental importância, pois a eficiência dos agentes crioprotetores
pode variar em função da estrutura (célula ou tecido) a ser criopreservada (FULLER;
PAYNTER, 2004), do tipo, concentração e tempo de exposição ao agente crioprotetor
utilizado antes do processo de criopreservação propriamente dito. Dependendo da
concentração utilizada, a metabolização celular destes agentes pode gerar subprodutos
potencialmente tóxicos para a célula. Portanto, a toxicidade dos crioprotetores é um dos
fatores limitantes para o sucesso de um protocolo de criopreservação. A alteração da
pressão osmótica celular, resultante da ação do agente crioprotetor, é um dos diversos
fatores que podem prejudicar a sobrevivência da célula (MAZZOBRE et al., 2001).
Porém, vale ressaltar que a toxicidade biológica dos agentes crioprotetores está
diretamente relacionada às suas respectivas concentrações. Assim, testes prévios de
toxicidade são capazes de estabelecer as concentrações mais eficazes para os protocolos
de criopreservação (MAZZOBRE et al., 2001).
Os crioprotetores são divididos em duas categorias, internos (intracelulares)
e externos (extracelulares) (SANTOS et al., 2008), podendo ser usados separadamente
ou associados para diferentes tipos de protocolo de criopreservação. Os crioprotetores
permeáveis protegem as organelas das células durante o resfriamento, os quais são
constituídos por moléculas com baixo peso molecular, que permitem atravessar as
membranas celulares com relativa facilidade, diminuindo a pressão osmótica através da
substituição de água dentro da célula (YANG et al., 2013), sendo os mais empregados:
dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol (GLI), propanodiol (PROP), etilenoglicol (EG) e
propilenoglicol (PROG) (GONÇALVES et al., 2008).
Para camarões peneídeos, diversos crioprotetores já foram testados. Em
2005, Vuthiphandchai et al. testaram acetamida, DMSO, etanol (ET), EG, formamida,
22
GLI, metanol, PROG e sacarose como crioprotetores para embriões de P. monodon,
descrevendo acetamida, DMSO, GLI e sacarose como menos tóxicos. Bart et al. (2006)
utilizaram DMSO, EG e metanol para crioconservar espermatóforos da mesma espécie
por até 48 horas e verificaram que o DMSO foi o mais efetivo contra os efeitos do
resfriamento. Lezcano et al. (2004) pesquisaram o efeito dos crioprotetores DMSO,
metanol, glicerol e EG em espermatozoides de L. vannamei e constataram maiores
índices de sobrevivência para glicerol. Espermatozoides de P. indicus foram
criopreservados com sucesso utilizando uma combinação de DMSO e trealose por 60
dias (DIWAN; JOSEPH, 1998). Destacam-se também os trabalhos com L. vannamei
(NIMRAT et al., 2006), L. schmitti (CASTELO-BRANCO, 2010; FERNANDES et al.,
2014) e P. monodon (NIMRAT et al., 2006; VUTHIPHANDCHAI et al., 2007).
Trabalhos envolvendo a criopreservação em camarões palemonídeos ainda
são escassos, porém, alguns estudos foram realizados utilizando crioprotetores como
glicerol e EG em espermatóforos de M. rosenbergii, indicando o EG como crioprotetor
mais adequado (DAMRONGPHOL; AKARASANON; 2008). Ao aferir a toxicidade
dos agentes álcool metílico, DMSO e EG em embriões de M. amazonicum, Ferreira et
al. (2015) verificaram que o álcool metílico foi menos tóxico em relação aos demais
crioprotetores. Em estudo mais recente, Valentina-Claudet et al. (2016) avaliaram os
efeitos de DMSO, propilenoglicol, metanol, glicerol e etilenoglicol na criopreservação
de espermatóforos de M. rosembergii, verificando que o uso de baixas concentrações de
DMSO constitui-se em um protocolo favorável para tal fim.
Assim como as substâncias crioprotetoras são importantes na preservação
criogênica, o uso de diluidores é fundamental para manter o equilíbrio osmótico do
material e facilitar o contato célula-crioprotetor (MORAES, 2004). O agente
crioprotetor deve ser diluído à concentração desejada antes de ser adicionado à
suspensão de células. Os diluentes, são soluções de sais ou de carboidratos as quais
ajudam a manter as células viáveis durante o processo de congelamento, assegurando a
exposição mais uniforme para o agente crioprotetor quando ele é adicionado a
suspensão de células, reduzindo seus efeitos tóxicos. Têm por principais características
a isotonia, a estabilidade e a esterilidade (LEGENDRE et al., 1996).
Em animais aquáticos, a maioria das moléculas crioprotetores podem ser
diluídas em água do mar (GWO; LIN, 1998; LIU; LI, 2008; PAREDES et al., 2015;
TSAI; LIN, 2009) ou em água doce (FERREIRA et al., 2015), ou frequentemente em
23
meios diluidores com composições que podem variar de acordo com a espécie
(MORALES-UENO et al., 2013).
2.5 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE ESPERMÁTICA DE CAMARÕES
Geralmente a viabilidade espermática pode ser avaliada a partir da
motilidade dos espermatozoides (MATOS et al., 2008; VERSTEGEN et al., 2002).
Porém, este método de avaliação não se aplica em espermatozoides de crustáceos
decápodes devido à ausência de flagelos (CLARK et al. 1981), impossibilitando a
avaliação por meio dos batimentos flagelares. Diante das demandas crescentes por
gametas de alta qualidade emergiu a necessidade de pesquisas capazes de aperfeiçoar a
avaliação das células espermáticas (LUBZENS et al., 1997). Com isso, as técnicas de
criopreservação de células espermáticas de crustáceos são avaliadas por testes de
inseminação ou por técnicas de coloração ou microscopia de fluorescência para a
realização da contagem espermática (BAUER, 1991; GOLDBERG, 1998; WANG et
al., 1995).
Assim, diferentes técnicas são empregadas para avaliar a viabilidade
espermática. A “técnica de exclusão”, com a utilização do corante eosina-nigrosina para
determinar a vitalidade dos espermatozoides através de microscopia é realizada por
meio de esfregaço em lâmina de uma gota da amostra se esperma com uma gota de
eosina (0,5%) e duas gotas de nigrosina (10%). Espermatozoides inviáveis, apresentam
lesões na membrana celular que permitem a penetração do corante supravital eosina
corando o interior do núcleo em vermelho, a nigrosina atua como fundo facilitando a
análise (JEYALECTUMIE; SUBRAMONIAM; 1989; NIMRAT et al., 2008;
VUTHIPHANDCHAI et al., 2005,). Outra técnica de análise de viabilidade é a de
exclusão com o corante azul de trypan, que cora os espermatozoides inviáveis, com
membrana lesada em azul, enquanto os viáveis não se impregnam (AKARASANON et
al., 2004; BHAVANISHANKAR; SUBRAMONIAM; 1997; LEUNG-TRUJILLO;
LAWRENCE, 1987; ROSAS et al., 1993; PASCUAL et al., 1998).
Outra alternativa já testada em camarões é a verificação da reação
acrossômica do espermatozoide por intermédio de microscopia de contraste de fase. A
reação acrossômica é induzida através de uma solução derivada de ovos de fêmeas
sexualmente maduras chamada de “egg water” (GRIFFIN et al, 1987). Os
espermatozoides são submetidos em alíquotas de “egg water” durante 1 hora, assim,
24
induzindo a segunda fase da capacitação espermática, sem contato com a fêmea
(ANCHORDOGUY et al., 1988), caracterizada pelo início das duas primeiras fases da
reação acrossômica, no qual ocorre a retração do espinho do espermatozoide e a
exocitose da vesícula acrossomal respectivamente (CHAVES, 2010).
A técnica de coloração dupla com os fluorocromos iodeto de propídeo (PI) e
SYBR-14 é frequentemente utilizada para avaliar a qualidade do esperma em mamíferos
e tem sido usado cada vez mais frequentemente em espermatozoides de peixes e
mariscos. Espermatozoides viáveis com membranas íntegras fluoresce em verde,
enquanto células danificadas fluorescem em vermelho (CABRITA et al. 2009;
LEZCANO et al. 2004; PANIAGUA-CHÁVEZ, 2006).
Atualmente a técnica mais moderna de avaliação espermática de camarões é
o método de citometria de fluxo, já utilizado em organismos aquáticos para avaliar as
características e integridade da membrana de células espermáticas após a
criopreservação (ADAMS et al. 2003; CABRITA et al. 2005; LEZCANO et al. 2004;
PANIAGUA-CHÁVEZ, 2006). A técnica de citometria de fluxo consiste na coloração
especifica de moléculas por uma substância fluorescente, como o PI, capaz de penetrar
células com lesões na membrana celular, resultando na emissão de fluorescência,
enquanto células viáveis não sofrem marcação (ADAMS et al. 2003).
25
3 JUSTIFICATIVA
A carcinicultura de água doce no Brasil é embasada na espécie M. rosenbergii,
mas, por ser espécie exótica, existem preocupações com problemas inerentes aos
impactos de sua liberação em ambientes naturais e em relação a possíveis problemas
com esses animais, o que causaria um colapso em seu cultivo. Uma alternativa de
espécie para essa atividade é o M. amazonicum, vastamente distribuída nas bacias da
América do Sul, amplamente utilizada na pesca artesanal no Norte e Nordeste do país e
com grande potencial para a aquicultura. Por esse motivo, torna-se importante a criação
de alternativas para conservação das populações naturais desse camarão e a manutenção
destes animais para produção comercial.
Nesse contexto, o processo de resfriamento e criopreservação de
espermatozoides representa uma alternativa viável para preservação de germoplasmas
paternos, bem como para sua reprodução em escala comercial. Na aquicultura, uma das
maiores dificuldades é a dependência da sazonalidade, pois cada espécie responde de
forma diferente a este fator. Assim, a técnica de criopreservação torna-se uma
ferramenta que está diretamente ligada à independência dos períodos reprodutivos
naturais e à conservação das populações naturais. Dessa forma, torna-se importante o
estudo da toxicidade dos agentes crioprotetores utilizados nos protocolos de
criopreservação que possibilitem a manipulação reprodutiva e a melhoria genética do
camarão da Amazônia.
Ademais, para que a criopreservação seja efetiva faz-se necessário conhecer e
entender a interação dos agentes crioprotetores com os espermatozoides de M.
amazonicum uma vez que não existem estudos dessa natureza para esta espécie.
26
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
Espermatozoides de M. amazonicum, não sofrem danos durante a exposição,
por até 30 minutos aos crioprotetores dimetilsulfóxido, etilenoglicol e glicerol
27
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a toxicidade de diferentes agentes crioprotetores internos sobre a
sobrevivência das células espermáticas de M. amazonicum.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) testar a toxicidade dos agentes crioprotetores DMSO, EG e glicerol e nas
concentrações de 5, 10, 15% por até 30 minutos em células espermáticas de M.
amazonicum;
b) definir as concentrações menos letais dos agentes crioprotetores avaliados.
28
6 CAPÍTULO I
Toxicity of cryoprotectants agents in spermatic cells of Macrobrachium
amazonicum (Heller, 1862) (Decapoda, Palaemonidae).
Toxicidade de agentes crioprotetores em células espermáticas de Macrobrachium
amazonicum (Heller, 1862) (Decapoda, Palaemonidae).
Moisés Fernandes Martins, Arthur Vinícius Lourenço Ferreira, Elias José Teles Castro,
Jéssica Vieira Freire, Yago Brito de Pontes, Francisca Amanda da Silva Martins e Celia
Maria de Souza Sampaio.
Periódico: Ciência Rural Submetido em: 06/11/2017
29
Toxicity of cryoprotectants agents in spermatic cells of Macrobrachium
amazonicum (Decapoda, Palaemonidae)
Toxicidade de agentes crioprotetores em células espermáticas de Macrobrachium
amazonicum (Decapoda, Palaemonidae)
Moisés Fernandes Martins1 Arthur Vinícius Lourenço Ferreira
1 Elias José Teles Castro
1
Jéssica Vieira Freire1 Yago Brito de Pontes
2 Francisca Amanda da Silva Martins
2 Celia
Maria de Souza Sampaio3
RESUMO
Para o presente experimento, 150 espermatóforos foram coletados de 30
machos de M. amazonicum, usando uma adaptação da técnica de leve compressão
abdominal. A massa espermática foi extrusada de 10 espermatóforos formando pools e
submetidos em dimetilsulfoxido, etilenoglicol e glicerol nas concentrações de 5, 10 e
15% v/v. O percentual de espermatozoides vivos foi determinado por um teste
modificado de coloração com eosina-nigrosina contadas em microscópio óptico (40x).
De acordo com o teste de toxicidade, o glicerol foi o menos tóxico entre os
crioprotetores testados em comparação com o controle (P < 0,05) com 47,5 ± 2,2 de
espermatozoides vivos. Os testes de toxicidade de dimetilsulfoxido não revelaram
diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) nas concentrações de 5, 10 e 15%.
Para testes com etilenoglicol, a concentração de 15% resultou em 100% de mortalidade
nas células espermáticas testadas. Este estudo sugere que o esperma de M. amazonicum
pode ser criopreservado utilizando glicerol 5% como agente crioprotetor.
Palavras-chave: Camarão da amazônia. Espermatóforo. Criopreservação.
30
ABSTRACT
For the present experiment, 150 spermatophores were taken from 30 M. amazonicum
males, collected using an adapting technique of gentle abdominal compression. The
sperm mass was extruded from 10 spermatophores forming pools and submitted to
dimethylsulfoxide, ethylene glycol and glycerol at concentrations of 5, 10 and 15% v /
v. The survival of the sperm was determined by staining with eosin-nigrosin modified
and sperm cells were counted in the optical microscope (40x). According cryoprotectant
toxicity assay, glycerol was less toxic among the tested cryoprotectants compared to
control (P < 0.05) with 47.5 ± 2.2 of live sperm. Dimethyl sulfoxide toxicity tests
revealed no statistically significant difference (P < 0.05) between 5, 10 and 15%
concentrations. For tests with EG, the concentration of 15% resulted in 100% mortality
to tested sperm. This study suggests that sperm from M. amazonicum can be
cryopreserved using GLY 5% as a cryoprotective agent.
Keywords: Amazon River prawn, Spermatophore, Cryopreservation.
INTRODUCTION
Cryopreservation has various important applications in biotechnology and
reprodutive biology such as the development of selective breeding, restoration of
species in danger of extinction and conservation stocks (MEMON et al., 2012). The
efficiency of cryopreservation techniques for male gametes is based on avoiding the
exposure of sperm to the effects of heat shock. For this, the conservative solution must
have cryoprotective elements and well-controlled freezing and thawing rhythms
31
(UBERTI, 2014). Cryoprotectants allow a reduction of the solidification point of the
solutions during freezing but are minimally toxic and penetrate cell membranes easily
(LEUNG & JAMIESON, 1991; FULLER et al., 2004). The biological toxicity of the
cryoprotectants is directly related to their respective concentrations, becoming one of
the limiting factors for the success of a conservation protocol (MAZZOBRE et al.,
2001). Therefore, it is important to determine cryoprotective efficiency and the toxicity
tolerance of the cell types that are to be cryopreserved (CHAO & LIAO, 2001).
In a study with Litopenaeus schmitti, FERNANDES et al. (2014) analyzed
the effects of cryopreservation of sperm mass and spermatophores for toxicity, relative
ability to protect against injuries caused by the freezing process, and cooling protocols
using GLY and DMSO as cryoprotectants. Subsequently, VALENTINA-CLAUDET et
al. (2016) evaluated the toxicity, viability and fertility potential of cryopreserved sperm
(spermatophores) of M. rosenbergii suspended in DMSO, propylene glycol, methanol,
GLY and ethylene glycol (EG) agents. Decapod crustacean sperm are non-motile
(CLARK, KLEEVE; YUDIN, 1981). Their survival can be determined by eosin-
nigrosin (JEYALECTUMIE & SUBRAMONIAM, 1989) or trypan blue
(BHAVANISHANKAR & SUBRAMONIAM, 1997) staining. Live sperm exclude the
stain while dead sperm incorporate the stain.
Macrobrachium amazonicum is a species native to the Amazon basin, and
is notable for offering great potential for aquaculture (KUTTY et al., 2000; NEW, 2005;
ROUTLEDGE et al., 2006), as well as being the main freshwater prawn commercially
exploited in the states of Pará and Amapá by artisanal fishing, where it presents a
significant commercialization (LUCENA-FRÉDOU et al., 2010). It has a wide
geographic distribution, occurring from Venezuela to the state of Paraná (Brazil) and
almost all of the Brazilian territory (HOLTHUIS, 1952; BIALETZKI et al., 1997) in
32
contrast to what happens in the production of exotic species, does not present risks to
nature by the escape of aquaculture ponds (MORAES-RIODADES & VALENTI,
2004).
In this context, the process of cryopreservation of sperms represents a viable
alternative for the preservation of paternal germplasms. In aquaculture, one of the
greatest difficulties is the dependence of seasonality, since each species responds
differently to this factor. Thus, cryopreservation becomes a tool that allows the
independence of natural reproductive periods and the conservation of natural
populations. This in turn makes the toxicological investigation of cryoprotectants used
in the process relevant (SANSONE et al., 2005; MACIEL & VALENTI, 2009).
Hence, this study aims to test the toxicity of the following cryoprotectants
on sperm mass of M. amazonicum: GLY, DMSO and EG.
MATERIALS AND METHODS
Prawns used in this study were collected in the Sapiranga Lake, located in
Fortaleza, Ceará (03°47′54.79′′S, 038°27′28.73′′W), from July to December 2016.
Prawns were transported to the Laboratory of Prawn Farming of State University of
Ceará in Fortaleza, Brazil. In the laboratory, adult males in the inter-molt period
presenting all thoracic and abdominal appendages were separated and then placed in
formaldehyde solution at 25 ppm for 30 minutes for disinfection in a 10 L tank with
constant aeration.
After disinfection, the prawns were duly acclimatized in a maturation tank
(5.000 L) for a period of seven days at a density of 15 m3 animals. In this tank a mean
water temperature of 30 °C (± 0.6), constant aeration, feeding twice a day with
commercial feed (40% CP) and with 12 h photoperiod of luminosity was maintained.
33
Prawns were weighed to the nearest 0.1 g body weight and measured to the nearest 0.1
cm total body length (base of eyestalk to tip of telson) and carapace length (base of
eyestalk to posterior margin of the carapace). Average weight, total length and carapace
length of males (N= 30) was 4.8 ± 1.0 g, 6.1 ± 0.5 cm and 19 ± 2.4 cm respectively.
At random, 30 prawns were stored in groups of 10 animals in 3 aquariums
with 60 L capacity, with closed water circulation system and 12-hour photoperiod of
luminosity. Every 5 days a different group was used to collect spermatophores, allowing
a period of 15 days for spermatophore renewal. Average water temperature, pH,
ammonia and nitrite levels of aquariums were 30.4 ± 0.7 °C, 7.1 ± 0.4, 0.05 ± 0.1 and 0
respectively.
Completely developed spermatophores were removed by adapting the
technique of gentle abdominal compression by the use of non-serrated cushing forceps
(ARCE et al.,1999; NIMRAT et al., 2006). When the white spermatophores partially
protruded from the ampoules, they were removed by forceps using an aseptic technique.
Average wet weight of spermatophores was around 0.0018 ± 0.0003 g. Only
nonmelanized spermatophores were selected for preservation studies (DOUGHERTY &
DOUGHERTY, 1990).
Cryoprotectants such as dimethyl sulphoxide (DMSO), glycerol (GLY) and
ethylene glycol (EG) (Sigma-Aldrich, Duque de Caxias, RJ, Brasil) were used at three
different concentrations (5, 10 and 15% v/v) using sterile Calcium Free saline (Ca-F
saline) as extender medium. Each spermatophore was then weighed and transferred with
sterile forceps into 1.5 mL eppendorf tubes containing the extender at ambient
temperature (27 °C). Spermatophores were extruded with the aid of a scalpel in the
diluent forming a spermatic solution, in which 100 μml of spermatic solution was
immersed in 100 μl of cryoprotectant solution within a 1.5 ml sterile eppendorf tube.
34
The apparent live of sperm was assessed after 30 min of exposure at room temperature
(27 ºC) and samples of sperm was subjected to vital stains.
The evaluation of the apparent percentage of live and dead spermatozoa was
determined by staining with eosin-nigrosin modified in which 25 μL of 0.5% eosin and
25 μL of 10% nigrosin were added in 50 μL of sperm solution (JEYALECTUMIE &
SUBRAMONIAM, 1989). Sperm were counted in the optical microscope with the aid
of a hemacytometer (Neubauer chamber), according to the method proposed by
LEUNG-TRUJILLO & LAWRENCE (1987). The percentage of live sperm was
calculated in duplicates from counting 100 sperm cells under 40x magnification.
Results are shown as means ± standard error of the mean (SEM). Percentage
data for sperm live counts were analyzed after arcsine transformation; however,
untransformed values are presented for clarity. To investigate the occurrence of
significant differences between the results, an analysis of variance (ANOVA) was
performed, followed, where appropriate, by Tukey’s HSD test for comparison between
treatments, and Dunnett's test for comparison between control and treatments, both with
a significance level of 5%. All data were analyzed using the Graphpad Prism 7 software
package.
RESULTS
The percentage of live spermatozoa was 56.4 ± 3.2. For the DMSO toxicity
test, researchers observed that concentrations of 5, 10 and 15% showed no statistically
significant difference (P < 0.05) between them (Figure 2), but all differed from the
control (P < 0.05) (Figure 1). Sperm mass exposed to a minimum concentration (5%) of
GLY showed a better percentage of live spermatozoa compared to control (Figure 1), in
addition, concentrations of 5 and 10% showed no significant difference (P < 0.05)
35
(Figure 2). In the EG treatment the concentration that reached the highest survival value
was 5% with 10 ± 1.3. In addition, this treatment had 0 survivals at the highest
concentration (15%) and all concentrations showed statistical difference when
compared to the control (P < 0.05) (Table 1).
Sperm cap became markedly swollen, may be due to the swelling of the
acrosome. The structures within the cap region were apparently flocculated in most non-
viable sperm. Most sperm appeared an expansion of the base plate and spike elongation
(Figure 3).
DISCUSSION
Macroscopic assessments performed during sperm counts are used to
evaluate the reproductive potential in penaeid prawns (WANG et al., 1995). Although
fertilization is absolute proof that spermatozoa have a viability quality this method is
impractical considering that the maturation of females in captivity is difficult for M.
amazonicum species.
The present results showed the influence of subjecting the sperm mass
directly in contact with the cryoprotectant due to the low survival rate observed in the
control treatment. The survival rate of sperm submitted only to Ca-F diluent (control)
was lower when compared to studies using complete spermatophores submitted to Ca-F
with the same time of equilibrium as VUTHIPHANDCHAI et al. (2007) with
spermatophores of P. monodon and MEMON et al. (2012) with spermatophores of P.
merguiensis, with 85.0 ± 2.2 and 84.8 ± 0.8 sperm viability, respectively. A similar
result was observed in the study by FERNANDES et al. (2014) that verified the
viability of the sperm mass of L. schmitti, however in this case the sperm were
submitted to cryopreservation of -32 ºC and -120 ºC with 43.57 ± 15.74 and 1.99 ± 3.48,
36
respectively. SALAZAR et al. (2008) reported that the spermatophore wall may serve as
a barrier, interfering with no effect of the cryoprotectant on a cell. Thus, these studies
corroborate with the results obtained in the present study, since less sperm survival was
observed using sperm mass compared with studies using spermatophore. It is also taken
into account that the spermatophore adhesive material that covers the sperm of the
sperm mass can contribute to the protection against the toxic damages of the
cryoprotectants and to the change of osmolarity in them (FERNANDES et al., 2014).
Equilibration time for 30 min is enough to allow penetration of
cryoprotectants into the sperm, as the enhanced period of equilibration is a prerequisite
for cryopreservation of a large biological system (VUTHIPHANDCHAI et al., 2007).
CHOW et al. (1985) reported that prolonged contact of sperm with the cryoprotective
agent could cause a negative effect, multiplying its toxicity, since after 60 minutes of
equilibration time the viability decreased significantly. VALENTINA-CLAUDET et al.
(2016) reported lower sperm survival of M. rosebergii after exposure time of 60 min in
comparison to those exposed to 30 min using the cryoprotectants DMSO, propylene
glycol and DMSO + propylene glycol in the 10% concentration. VUTHIPHANDCHAI
et al. (2007) in their study the P. monodon sperm viability was 0% in DMSO, EG,
propylene glycol, formamide and methanol in 60 min exposure time in the 15%
concentration for all cryoprotectants.
DMSO has been used as a universal cryoprotectant for over four decades
this was found by LOVELOCK & BISHOP, (1959). In this study, the cryoprotectant
toxicity tests results showed no significant difference in the percentage of live
spermatozoa submitted to DMSO at 5, 10 and 15% concentrations in equilibration time
of 30 min (Figure 3), with results between 16.5 ± 2.7 and 19.2 ± 2.0. Differently from
what was observed by BARTH et al. (2006) while working with giant tiger shrimp, P.
37
monodon, used DMSO in 5 and 10% as cryoprotectant. The results showed that 5%
DMSO provided better results when sperm survival reached 79.7%. An increase in
DMSO concentration to 10% resulted in a reduction in sperm survival. It should be
emphasized that the above-mentioned test used complete spermatophores are not
cellular suspensors as not present study. ANCHORDOGUY et al. (1988) studied the
acute toxicity of different cryoprotectants in thawed sperm cells of Sicyonia ingentis,
described DMSO (5%) as the best cryoprotectant in relation to the other concentrations
and the other cryoprotectants used (GLY, sucrose, proline and trehalose). This result
differs from the present study with M. amazonicum, due to the absence of differences
between the concentrations used for DMSO for sperm mass and lower percentage of
live spermatozoa when compared to GLY (5%). However, it corroborates with GWO
(2000) in which it affirms that the choice of the cryoprotectant depends on the species
of crustacean.
RALL (1987) quoted an evidence to suggest that, cells exposed to GLY
resulted in a specific chemical toxic effect. Prior to its evidence, GLY was already
known to protect cells from the deleterious effects of freezing and thawing (SMITH &
POLGE, 1950). The present study showed that sperm submitted in GLY in the
concentrations of 5 and 10% resulted in higher survival percentages, with 47,5 ± 2,2 and
44,1 ± 1,9 respectively. Studies have reported the effectiveness of GLY for
cryopreservation of spermatophores of freshwater prawn M. rosenbergii (CHOW et al.,
1985; AKARASANON et al., 2004) and horseshoe crab L. polyphemus (BEHLMER et
al., 1984). FERREIRA et al. (2015) mentions research that attempts to create a protocol
for cryopreservation of long-term spermatophores for M. rosenbergii, which use EG
and GLY as cryoprotectants. Although PARKS & GRAHAM (1992) have suggested
that glycerol interferes at the hydrophilic end of the phospholipids of cell membranes,
38
leading to their damage, this information is not in agreement with the results found in
the present study, where glycerol proved to be the best cryoprotectant agent for sperm
when compared to DMSO and EG. VALENTINA-CLAUTED et al. (2016) described
DMSO and propylene glycol as least toxic cryoprotectants on sperm viability in M.
rosenbergii, whereas GLY and EG exhibited moderate toxicity. In their study GLY
concentrations of 10% or less seem to cause no permanent harmful effects when the
spermatophore is subjected to this cryoprotectant, while 20% concentration caused
mortality. These findings corroborate in part with the results obtained in this study,
because the cryoprotective agent GLY at 10% concentration did not have significant
difference of the concentration of 5% high percentage of live spermatozoa.
The lower rates of live sperm found for EG at all concentrations may be
associated with several factors. According to AYE et al. (2010), DMSO and its
metabolites have low toxic potential and compared with EG did it did not induce
chromosomal abnormalities, even at high concentrations. Depending on the amount of
metabolized EG, formed glycolic acid exceeds the natural buffering capacity of the cell,
reducing pH and causing cellular acidosis (CARNEY, 1999). For M. amazonicum
embryos, acute cryoprotectant toxicity increased as the EG concentration increased (0.1-
10%) resulting in death of the embryos at concentrations of 3, 5 and 10% (FERREIRA
et al., 2015). In contrast, AKARASANON et al. (2004) emphasize the use of 20% EG
for the long-term cryopreservation of spermatophores of M. rosenbergii. However, the
use of EG as a cryoprotectant agent becomes effective for methods using the full
spermatophore because the membrane surrounding the spermatophore acts to protect the
sperm cells from the toxic effects of EG, while suspension, the cells were more exposed
to toxic metabolites, such as glycolic acid and oxalate (CORLEY et al., 2005).
39
Cryoprotective agents are essential for the cryopreservation of almost all
biological systems. However, in view of the biological and physicochemical effects of
cryoprotectants, the toxicity of these agents is a key factor for cryobiology. The same
was observed in the present study, since some agents in certain concentrations were
toxic to the sperm cell. Differences in sensitivity of invertebrate species to
cryoprotectants among these studies may reflect differences in species tolerance to
cryoprotectants (VUTHIPHANDCHAI et al., 2007). These observations are important
for the continuity of efforts in relation to cryopreservation, since by means of this
biotechnology the preservation of both spermatophore and sperm mass could benefit not
only the conservation of male genetic stocks but also the applications in technological
advances, such as genetic manipulation, which would benefit both species preservation
and aquaculture.
CONCLUSION
In conclusion, GLY can be used in the cryopreservation of sperm mass of
M. amazonicum. For cryopreservation of sperm, the use of 5% glycerol is suggested.
Taking into consideration the experimental character of the study, no works in this area
have tested the toxic effects of cryoprotective agents on sperm from M. amazonicum.
Thus, the protocols must be better investigated and described, mainly, so that they could
be reapplied to avoid the randomness of results. It could be said that this study was a
relevant step in the creation of future sperm cryopreservation protocols of M.
amazonicum.
40
ACKNOWLEDGEMENTS
We would like to thank Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) for their financial support.
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare there are no conflicts of interest.
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50
Table 1 - Percentage of live spermatozoa of M.
amazonicum submitted to different cryoprotectants
at various concentration.
Treatment % 1Control 56.4 ± 3.2ª
DMSO 5% 18.6 ± 1.8d
DMSO 10% 19.2 ± 2.0d
DMSO 15% 16.5 ± 2.7d
EG 5% 10.0 ± 1.3d
EG 10% 5.5 ± 0.6d
EG 15% 0d
GLY 5% 47.5 ± 2.2b
GLY 10% 44.1 ± 1.9c
GLY 15% 23.7 ± 3.1d
Values with different letters (a-c) in the same
column are significantly different (P < 0.05) among
dilution percentage. 1 Control represents sperm suspended in saline Ca-F
extender without cryoprotectants.
51
Figure 1 - The sperm survival rate of M. amazonicum submitted to different
cryoprotectants at various dilution percentages compared to the control treatment.
Values with different letters (a-d) letters in columns differ from each other by Dunnett
test (P < 0.05).
52
Figure 2 - The sperm survival rate of M. amazonicum submitted to different
cryoprotectants at various dilution percentages compared to each other. Values with
different letters (a-e) letters in columns differ from each other by Tukey HSD test (P <
0.05).
53
Figure 3 - Viable and non-viable sperm cells of M. amazonicum stained with eosin-
nigrosin. A: control treatment; B: 10% DMSO treatment (Zoom in the lower right
corner); C: 15% EG treatment and D: 5% GLY treatment (Zoom in the upper right
corner). Red arrows indicate dead sperm, yellow arrows indicate live sperms and white
arrow indicates expansion of base plate and swelling of the sperm acrosome. Scale bar:
100 µm.
54
7 CONCLUSÕES
O EG é o mais tóxico entre os agentes crioprotetores testados, com 100% de
mortalidade na concentração de 15%, portanto, devendo ser descartado a sua
utilização para criopreservação da massa espermática de M. amazonicum;
O DMSO, independente das concentrações utilizadas neste trabalho (5, 10 e
15%), infere danos à massa espermática de M. amazonicum.
O GLY pode ser utilizado como crioprotetor interno em espermatozoides de M.
amazonicum na concentração de 5%.
55
8 PERSPECTIVAS
A realização de novas pesquisas para o desenvolvimento do pacote
tecnológico da espécie M. amazonicum é essencial. Dessa forma os dados do presente
trabalho servem como estudo preliminar envolvendo toxicidade de agentes
crioprotetores com espermatozoides dessa espécie.
Essas observações são importantes para a continuidade dos esforços em
relação à criopreservação, uma vez que, por meio desta biotecnologia, a preservação de
espermatozoides poderia beneficiar não apenas a conservação dos estoques genéticos
masculinos, mas também as aplicações nos avanços tecnológicos, como a manipulação
genética o que beneficiaria tanto a preservação das espécies quanto a aquicultura.
Ademais, a toxicidade dos agentes crioprotetores nos espermatóforos
completos e em diferentes tempos de equilíbrio devem ser testados para formação de
base científica nessa área bem como a criação de protocolos de resfriamento e
criopreservação de espermatóforos e da massa espermática devem ser considerados.
56
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