AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE MEMBRANAS DE

COLÁGENO VISANDO À APLICAÇÃO COMO BIOMATERIAL

Ana C. M. Nozaki1, Rodrigo F. C. Marques2, Ivana M. A. Diniz3, Márcia M. Marques3,

Juliana Marchi1

1Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André (SP), Brasil 2Universidade Federal de Alfenas (MG), Brasil

3Departamento de Dentística, Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo (SP), BrasilE-mail: ana.nozaki@ufabc.edu.br

Resumo. Os biomateriais são materiais sintéticos ou naturais que devem estar em contato e interagir com sistemas biológicos. Os materiais à base de colágeno têm sido estudados há muito tempo e sua aplicação como biomaterial tem apresentado ótimos resultados no tratamento de diferentes tecidos. A avaliação de biomateriais envolve diversos testes, dentre testes in vitro, in vivo e estudos clínicos, para caracterização da interação dos materiais com o ambiente biológico e os riscos relacionados à sua aplicação. O objetivo deste estudo foi a avaliação dos aspectos biológicos de membranas de colágeno, em contato com células, visando a aplicação no tratamento de lesões de diferentes tecidos. A caracterização das membranas de colágeno foi realizada através de testes de cultura celular para análise da citotoxicidade e adesão. De acordo com os resultados obtidos, foi possível observar que as membranas de colágeno não apresentaram citotoxicidade, as células aderiram adequadamente na superfície do material no período de análise e que houve alta proliferação celular na placa de cultura, junto às membranas, até 7 dias. As características biológicas apresentadas pelas membranas de colágeno mostram que este biomaterial é um potencial candidato à aplicação como suporte para o crescimento celular.

Palavras chave: Citotoxicidade. Adesão. Colágeno. Biomateriais.

1. INTRODUÇÃO

Biomateriais são materiais destinados à interface com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo [Williams et al, 1992].

Segundo Hoffman (2004), os biomateriais podem ser divididos em 4 classes: polímeros, metais, cerâmicas e compósitos. O colágeno é um polímero natural biodegradável, podendo ser aplicado como um produto de engenharia tecidual quando o objetivo é reparo ou remodelamento de diferentes tecidos, como pele, cartilagem e ossos, mas não quando a estabilidade do material é necessária por longos períodos, devido justamente à sua característica de biodegradação [Pachence et al, 2000].

Existem mais de 20 tipos de colágeno, sendo o colágeno do tipo I uma forma fibrilar que representa 25% da massa protéica do corpo humano. Devido a esta prevalência e à possibilidade de ser separado dos tecidos, o colágeno do tipo I é o mais utilizado em dispositivos médicos [Batich et al, 2009]. Ele é encontrado em grandes quantidades em

tendões, pele, osso e fáscia dos mamíferos, sendo estas estruturas fontes convenientes para a sua obtenção e isolamento [Pachence et al, 2000].

Há grande homologia na estrutura da molécula de colágeno do tipo I entre diferentes espécies, isto explica porque o colágeno do tipo I, de origem animal, pode ser utilizado para implantação em humanos [Li, 2003].

O colágeno tem sido estudado há muitos anos e sua aplicação no tratamento de diversos tecidos lesados, tais como pele, nervos, tendões e cartilagem, tem apresentado ótimos resultados [Carvalho et al, 2009; Delistoianov et al, 2008, Tovar 2009; Mimura et al, 2008; Frenkel et al, 1997]. Estes resultados positivos estimulam o estudo de novos materiais à base de colágeno que possam ser utilizados como biomaterial.

1.1 Testes de avaliação biológica de biomateriais

A biocompatibilidade de um material não envolve apenas os efeitos que os materiais podem causar no organismo, mas também, as ações do ambiente fisiológico sobre o biomaterial.

Os biomateriais, tanto naturais quanto sintéticos, apresentam características que definem sua biocompatibilidade e bioestabilidade, as quais devem ser conhecidas para que se possa predizer o comportamento do dispositivo durante o período de aplicação clínica [Abraham et al, 2004].

De acordo com Cano et al (2004), os ensaios biológicos para avaliação da biocompatibilidade dos materiais podem ser realizados através de uma grande variedade de testes in vitro e in vivo. Tais testes podem fornecer informações úteis a respeito da interação do material com o ambiente fisiológico e dos possíveis riscos associados à sua aplicação, permitindo assim, identificar os materiais que não apresentam características adequadas à utilização em estudos clínicos.

Os testes de citotoxicidade in vitro devem ser realizados inicialmente para avaliar os materiais e identificar aqueles que apresentam comportamento citotóxico. Desta maneira, é possível selecionar apenas os materiais mais adequados para a aplicação in vivo, minimizando assim o número de animais experimentais.

O teste de compatibilidade in vivo, ou seja, com animais, é necessário para prever quando um dispositivo médico apresenta risco potencial para os pacientes. Para isto, os animais devem ser selecionados de acordo com a aplicação do dispositivo, considerando-se a anatomia e a bioquímica semelhante à situação de aplicação humana. Além disso, o protocolo de ensaio deve ser determinado com base em leis que regem o uso de animais em laboratório, garantindo assim que os mesmos sejam tratados eticamente [Ratner et al, 2004].

A norma ISO 10993-5 (2009) apresenta três categorias de testes de citotoxicidade in vitro: teste de extrato, teste de contato direto e teste de contato indireto. Os testes de extrato e de contato direto possibilitam a avaliação qualitativa e quantitativa da citotoxicidade dos materiais ou da viabilidade das células quando em contato com os materiais. Por outro lado, o teste de contato indireto permite apenas a avaliação qualitativa da citotoxicidade.

A avaliação quantitativa da viabilidade celular pode ser realizada através de métodos colorimétricos utilizando-se corantes como o MTT, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio) e o MTS, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (Fig. 1).

O MTT é um sal amarelo que é reduzido pela atividade da enzima desidrogenase mitocondrial resultando em um sal de formazan de cor púrpura. Esta redução ocorre somente nas células vivas. Desta maneira, a viabilidade celular pode ser determinada pela intensidade da coloração púrpura que é proporcional à quantidade de cristais de formazan formados. A

desvantagem da utilização deste corante é a necessidade do uso de solventes orgânicos como o DMSO ou o isopropanol para dissolver os cristais de formazan que são insolúveis em água.

O corante MTS é reduzido da mesma forma que o MTT, pela enzima desidrogenase mitocondrial, com a formação de cristais de formazan. A diferença é que os cristais formados a partir do MTS são solúveis em água e, portanto, o uso de solventes orgânicos não é necessário. O MTS é utilizado em conjunto com um agente acoplador de elétrons, o PMS (fenazina metosulfato).

Figura 1 – Estruturas moleculares dos corantes: a) MTT; b) MTS (Fonte: Barltrop & Owen, 1991).

O objetivo deste trabalho foi caracterizar biologicamente as membranas de colágeno através dos testes de extrato e de contato direto para avaliação da citotoxicidade, além da realização do teste de adesão celular.

2. METODOLOGIA

Para os testes celulares, todas as amostras foram inicialmente esterilizadas com radiação gama (25kGy) (Centro de Tecnologia das Radiações do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, CTR-IPEN, São Paulo).

2.1 Teste de extrato

O teste de citotoxicidade de extrato das membranas de colágeno foi realizado de acordo com o estudo de Nogueira et al (2010), baseado na norma ISO 10993-5 (2009), com algumas modificações necessárias.

Inicialmente as amostras foram cortadas em 1cm² em condições estéreis e em seguida foram colocadas em tubos falcon com 1mL de meio de cultura RPMI sem soro, por 48 horas, para preparação do extrato. Após este período foi feita a filtragem das amostras e as diluições seriadas do extrato para concentrações de 100, 50, 25, 12,5 e 6,25%. Os controles positivo e negativo foram uma solução de fenol 0,4% e polietileno de alto peso molecular, respectivamente.

A análise da citotoxicidade foi realizada utilizando-se o corante vital MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil-2Htetrazólico) [Cory et al, 1991], utilizado para determinação do número de células viáveis em proliferação. Os extratos obtidos da membrana de colágeno, do controle positivo e do controle negativo, bem como o branco (apenas meio de cultura RPMI) foram pipetados em placas de 96 poços, sendo 50µL de solução por poço, em quadruplicata. Uma suspensão de células de ovário de hamster Chinês

(CHO-k1) com 6x104células/mL foi preparada e 50µL (3000 células) foram pipetados por poço. Então, as células foram incubadas em estufa a 37°C, por 72h em atmosfera umidificada com 5% de CO2. A viabilidade celular foi medida pela adição de solução MTS com PMS (fenazina metasulfato), um acoplador de elétrons, na diluição de 20:1. Em seguida, as placas foram incubadas por 2h a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. As microplacas foram lidas em espectrofotômetro a 490 nm e os cálculos para obtenção dos valores de viabilidade celular seguiram o seguinte procedimento:

1. Cálculo da média da densidade óptica das 4 medidas de densidade óptica de cada diluição, do branco e do controle celular;

2. Subtração da média do branco das médias do controle e das diluições; 3. Cálculo da viabilidade celular média pela Eq. (1):

VC=ODDODC

x100

Sendo, VC= viabilidade celular; DOD= média da densidade óptica da diluição; DOC= média da densidade óptica dos controles.

A partir dos dados obtidos foi plotado o gráfico de viabilidade celular em função da concentração da amostra.

2.2 Teste de contato direto

Para este teste, três amostras foram cortadas em formato quadrangular de 5mm x 5mm e colocadas no centro dos poços da placa de cultura de 24 poços.

Foi utilizada uma linhagem celular de fibroblastos derivados de gengiva humana (FMM1), os quais foram cultivados em meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glicose (LGC, Biotecnologia LTDA, Cotia, SP, Brasil), contendo 10% de soro fetal bovino (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) e 1% de solução antibiótica-antimicótica (100 UI/ml de penicilina, 100 microgramas/ml de estreptomicina e 0,25 microgramas/ml de anfotericina B).

As células foram incubadas a 37 ºC em uma atmosfera umidificada contendo 5% CO2

até a semiconfluência. As amostras esterilizadas foram colocadas em microplacas de 24 poços, cobertas com meio de cultura e aproximadamente 1 x 104 células foram colocadas na superfície de cada amostra e em um poço vazio como controle. Então as microplacas foram incubadas a 37°C, em atmosfera umidificada com 5% de CO2. O meio de cultura das placas foi trocado a cada dois dias. Após 2 e 7 dias foram obtidas micrografias através de Microscópio Invertido (Nikon TMS) da interface membrana/placa de cultura, tal como ilustrado na Fig. 2.

(1)

Membrana de colágeno

Poço da placa de cultura, com meio de cultura DMEM

Exemplo de local de obtenção da micrografia em Microscópio Invertido

Figura 2 – Representação esquemática da micrografia óptica da interface membrana/placa de cultura.

As micrografias ópticas foram comparadas entre os diferentes períodos de observação para avaliação da proliferação celular na placa de cultura, na interface com a membrana de colágeno.

2.3 Teste de adesão

Inicialmente, as amostras foram cortadas em formato quadrangular de 5mmx5mm. O procedimento de plaqueamento foi o mesmo aplicado ao teste de contato direto, porém, as células foram cultivadas por 1 e 4 horas para análise da adesão celular.

Após o cultivo das células, as amostras foram fixadas com uma solução de glutaraldeído a 2.5% por 2 horas. A seguir, as amostras foram pós fixadas em tetróxido de ósmio a 1% (Electron Microscopy Sciences, FT Washington, PA) em solução tampão fosfato 0.1 M e desidratadas em uma seqüência de etanol (30% até p.a.). As amostras desidratadas foram secas quimicamente por 2 horas em capela utilizando hexametil disilasano (HMDS) (Sigma Aldrich, St Louis, USA). Então, as amostras secas foram recobertas com uma fina deposição de ouro (equipamento Bal Tec SCD 050 Sputter Coater) para que fossem analisadas as superfícies das membranas através de Microscopia Eletrônica de Varredura (equipamento Philips XL30). As imagens foram comparadas entre os diferentes períodos para análise da evolução do processo de adesão das células sobre as membranas.

3. RESULTADOS

3.1 Teste de extrato

As Tabelas 1, 2 e 3 apresentam os dados de densidade óptica obtidos com a leitura das microplacas com o extrato da membrana de colágeno e dos controles positivo e negativo, respectivamente, bem como os valores de viabilidade celular calculados para cada concentração através da Eq. (1).

Tabela 1 – Densidade óptica das diluições dos extratos da membrana de colágeno.

ColágenoBranc

o Controle 6.25% 12.5% 25% 50% 100%

-0.0015 0.5921 0.5994 0.6014 0.5943 0.6576 0.6438

0.0015 0.5839 0.6263 0.5993 0.6528 0.6399 0.5992

0.0012 0.6016 0.6332 0.6199 0.6465 0.6593 0.6195

-0.0011 0.5547 0.6236 0.6968 0.6536 0.6528 0.6236

Média 0.0000 0.5831 0.6206 0.6393 0.6368 0.6524 0.6215

Desvio Padrão 0.001 0.020 0.015 0.051 0.029 0.009 0.018Viabilidade celular – VC (%) - 100 106 110 109 112 107

Desvio Padrão (%) - 3.4 2.5 8.7 4.9 1.5 3

Tabela 2 – Densidade óptica das diluições do controle positivo (fenol 0,4%).

Fenol 0,4 % - Controle PositivoBranco Controle 6.25% 12.50% 25% 50% 100%

0.0069 0.8213 0.7654 0.7231 0.7529

0.6317

0.0529

0.0001 0.8358 0.7564 0.6910 0.7179

0.5434

0.0354

-0.0031 0.8114 0.7108 0.7101 0.7401

0.4967

0.0275

-0.0038 0.7795 0.7482 0.6780 0.7272

0.4488

0.0197

Média 0.0000 0.8120 0.7452 0.7005 0.7345

0.5301

0.0338

Desvio Padrão 0.005 0.024 0.024 0.020 0.015 0.078 0.014Viabilidade celular – VC (%) - 100 91.8 86.3 90.5 65.3 4.2

Desvio Padrão (%) - 2.9 2.9 2.4 1.8 9.6 1.7

Tabela 3 – Densidade óptica das diluições do controle negativo (PEAD).

PEAD – Controle Negativo

Branco Controle 6.25% 12.50% 25% 50% 100%

-0.0008 0.8542 0.8070 0.8466 0.8236 0.8390 0.8012

0.0018 0.8392 0.8437 0.8286 0.8344 0.7452 0.7989

-0.0005 0.8199 0.811 0.8125 0.7889 0.7751 0.7574

8

-0.0006 0.8462 0.8308 0.8240 0.8430 0.7713 0.7733

Média 0.0000 0.8200 0.8234 0.8280 0.8225 0.7827 0.7827

Desvio Padrão 0.001 0.015 0.017 0.014 0.024 0.040 0.021Viabilidade celular – VC (%) - 100 100.4 101.0 100.3 95.5 95.5

Desvio Padrão (%) - 2.5 2 1.7 2.9 4.8 2.5

De acordo com os dados obtidos neste ensaio, a membrana de colágeno não apresentou citotoxicidade, pois a viabilidade celular manteve-se acima de 100% para todas as concentrações, tendo-se o PEAD como controle negativo e o fenol a 0,4% como controle positivo (Fig. 3).

Figura 3 – Análise da viabilidade celular em relação às diferentes concentrações de extratos da membrana de colágeno e dos controles negativo (PEAD) e positivo (fenol).

3.2 Teste de contato direto

A Fig. 4 apresenta as imagens obtidas com microscópio óptico invertido (Nikon TMS) durante diferentes períodos de cultivo. Estas imagens mostram que as células proliferaram adequadamente nos poços, podendo-se observar que houve grande aumento no número de

células na placa, inclusive em contato direto com a membrana no decorrer do período de observação de 2 a 7 dias. Este fato é mais um indicativo de que a membrana não é citotóxica, visto que, caso o material apresentasse citotoxicidade, as células não conseguiriam sobreviver na placa de cultura, juntamente com a membrana.

A membrana de colágeno não é translúcida e, por isso, aparece opaca quando observada em microscópio invertido, não sendo possível a visualização das células cultivadas sobre ela. Porém, a crescente proliferação celular na placa de cultura e na interface com a membrana durante todo o período de análise indica que, provavelmente, também há um significativo número de células em sua superfície.

Figura 4 - Fotomicrografias ópticas das membranas de colágeno mostrando a proliferação celular na placa de cultura (P), em contato com a membrana de colágeno (M) em diferentes

períodos de cultura celular. A) após 2 dias de cultivo celular e B) após 7 dias de cultivo celular.

3.3 Teste de adesão

A Fig. 5 apresenta as Micrografias Eletrônicas de Varredura do teste de adesão durante 1 e 4 horas. Como pode ser observado, as células aderiram adequadamente ao material nos períodos observados. Em 1 hora (Fig. 5-A), as células iniciaram o processo de adesão através de prolongamentos citoplasmáticos que se estenderam sobre a superfície do material. Na quarta hora de cultivo (Fig. 5-B), as células apresentaram-se mais achatadas e com prolongamentos citoplasmáticos mais aderidos na superfície da membrana e ligando algumas células a outras. Isto indica que as membranas de colágeno apresentam uma superfície adequada à adesão dos fibroblastos cultivados.

2 dias

M

M7 dias

P

P

Figura 5 – Micrografias eletrônicas de varredura das membranas de colágeno após experimento de adesão celular por diferentes períodos. A) após 1 hora de cultivo celular e B)

após 4 horas de cultivo celular.

Por outro lado, também pode ser observado nas Micrografias Eletrônicas de Varredura da Figura 5, que não há poros conectados com a superfície do material. Sendo assim, não é possível que as células penetrem o interior das membranas. Mas, apesar da falta de uma superfície porosa, esta análise de adesão mostrou que os fibroblastos cultivados sobre as membranas de colágeno monocamada aderiram adequadamente à superfície do material, tal como esperado para estas células, mostrando mais uma vez que o material não é citotóxico, pois apresentou boa interação direta com as células cultivadas sobre a sua superfície, não causando a morte das mesmas. Uma possível aplicação para esta membrana de colágeno seria o uso como sutura da lesão condral após o transplante autólogo de condrócitos. Frequentemente, esta sutura é realizada com periósteo retirado, por exemplo, da tíbia do paciente [Cohen et al, 2008]. A membrana de colágeno sem aberturas de poros em sua superfície permitiria a sutura e a manutenção adequada dos condrócitos transplantados no local da lesão condral. Mais estudos serão necessários para avaliação da possibilidade de utilização destas membranas para esta finalidade.

4. CONCLUSÕESAs características biológicas apresentadas pelas membranas de colágeno nas análises

realizadas neste trabalho mostraram que este biomaterial apresentou comportamento adequado in vitro, quando em ambiente fisiológico e em contato com as células, como pode ser observado pela ausência de citotoxicidade, além da adesão e proliferação celular na superfície e em torno das membranas de colágeno em diferentes períodos. Estes resultados indicam que o material é um possível candidato à aplicação como suporte para o crescimento celular na regeneração tecidual.

AGRADECIMENTOSÀ UFABC, FAPESP e CNPq pela estrutura e apoio financeiro; aos laboratórios de

microscopia do Centro de Ciência e Tecnologia de Materiais do IPEN (CCTM-IPEN) pelo auxilio com a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) das membranas de colágeno; à Profª. Drª. Olga Zazuco Higa e seus alunos Tatiana F. da Cunha e Fernando José Costa Baratéla pela ajuda com o ensaio de citotoxicidade de extrato.

REFERÊNCIAS

A B

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CYTOTOXICITY EVALUATION OF COLLAGEN MEMBRANES AIMING THE APPLICATION AS A BIOMATERIAL

Ana C. M. Nozaki1, Rodrigo F. C. Marques2, Ivana M. A. Diniz3, Márcia M. Marques3,

Juliana Marchi1

1Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André (SP), Brasil 2Universidade Federal de Alfenas (MG), Brasil

3Departamento de Dentística, Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo (SP), Brasil

E-mail: ana.nozaki@ufabc.edu.br

Abstract. The biomaterials are synthetic, natural or modified materials, intended to be in contact and interact with the biological system. The collagen based materials are studied for a long time and its application as a biomaterial is showing great results in the treatment of different tissues. The evaluation of biomaterials involves several tests, including in vitro and in vivo assays, and clinical studies, for characterize the interaction of the materials with biological environments and the related risks of its application. The aim of this study was to evaluate the biological aspects of collagen membranes, in saline solution and in contact with cells, for application in the treatment of different tissues. The characterization of collagen membranes was performed through cell culture tests for analysis of the cytotoxicity and cell adhesion. Through the cell culture tests, it was possible to observe that the collagen membrane is not cytotoxic, the cells adhered adequately in the surface of the material and that there was high cell proliferation in the culture plate, together with the membranes until 7 days. The biological characteristics presented by the collagen membrane showed that this biomaterial is a potential candidate to be applied as a support for cell growth.

Keywords: Cytotoxicity, Adhesion, Collagen, Biomaterials