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VNTR = variable number of tandem repeat.Em relação ao uso dos microssatélites (STR, do inglês short tandem repeat) nos estudos devínculo genético, algumas vantagens em relação às VNTRs podem ser citadas, incluindo a rapideze a facilidade da técnica, a pouca concentração de DNA requerida para o teste (0.1ng a 1ng), apossibilidade de estudar um maior número de locos numa única mistura de reação (PCRmultiplex) obtendo um nível de discriminação excelente e a ótima reprodutibilidade.

Enzimas de restrição: “tesouras” moleculares que clivam o DNA em locais específicosdenominados sítios de restrição, constituídos por quatro a oito pares de bases, distribuídos aolongo da molécula de DNA. São nucleases bacterianas altamente específicas que clivam o DNAestranho. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano. A bactéria protege opróprio DNA através de metilação de alguma bases específicas.Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno.Até o momento mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas e clonadas. Anomenclatura é baseada na abreviação do nome específico do microorganismo do qual aenzima foi isolada e complementado com informações relativas à linhagem. Desta forma,a primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguida de umalgarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem daqual ela foi isolada. Em função disto, o nome da enzima deve ser escrito em itálico e adenominação que o acompanha deve ser escrita em formato normal.Sequência palindrômica: tem um eixo de simetria e a sequência de bases de uma fita é a mesmada fita complementar quando lida na direção oposta.

Uma característica das enzimas de restrição de fundamental importância para abiologia molecular é a especificidade em relação ao sítio de restrição, ou seja, aregião do DNA que a mesma reconhece e realiza a clivagem. O interesse pelasenzimas de restrição aumentou em 1973 quando foi percebido que elaspoderiam ser utilizadas para fragmentar o DNA, deixando extremidades de fitassimples que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que arecombinação poderia ser efetuada in vitro. Além disto, o DNA bacterianopoderia recombinar com o DNA de outros organismos, abrindo a possibilidadede clonar genes das mais diferentes espécies. Este foi um dos eventos maisimportantes da biologia molecular recente, pois abriu um campo fantástico paraa produção de enzimas e anticorpos através da biotecnologia moderna.

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Pseudogenes: já tiveram função de genes e, por mutação, perderam a função noprocesso evolutivo (sequência semelhante à do gene com algum defeito).Repetições agrupadas = sequências em Tandem. Ex.: AGTCAGTCAGTC...- Satélite: principalmente no centrômero sem transcrição segmentos grandes emrepetição (171 pb).- Mini-Satélites: tamanho da repetição: aproximadamente 10 pb Exemplo:(TTAGGG)n principalmente nos telômeros.- Microssatélites: 1 a 6 pb (pares de bases) repetitivos distribuição ao longo dogenoma herança mendeliana (alelos hipervariáveis). Repetições demononucleotídeo: A ou T; dinucleotídeo: CA ou CT.Repetições dispersas:- SINE (“short interespersed elements”): sequências não codificadoras espalhadas nogenoma. Podem saltar e se inserir em certos genes (elementos de transposição). Ex.:sequências Alu (~300 pb que correspondem a 7% do genoma – 25.000 cópias).- LINE (“long interespersed elements”): maiores que os SINE (250 a 500 pb). Tambémpodem se comportar como elementos de transposição, levando a doenças por rupturagênica. Aproximadamente 12.000 cópias (componentes repetitivos dos introns).

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Dada a baixa qualidade e à exiguidade das amostras biológicas que rotineiramente aportam emum laboratório de DNA forense, a metodologia preferencialmente aplicada é baseada na análisede STR. A exposição ao ambiente (umidade, tipo de solo, radiação solar, agentes químicos)degrada as moléculas de DNA, fragmentando-as em pequenos pedaços. Neste caso, a análise deregiões VNTR em DNA degradado torna-se bastante comprometida. Devido ao curto tamanho, asregiões STR podem ser analisadas com maior chance de sucesso já que as modificações sofridaspelos tecidos em degradação não afetam a estabilidade destes marcadores, sendo isso crucialpara a segurança e confiabilidade destas análises. Em relação aos SNPs, a principal vantagem dosmarcadores microssatélites é devido à grande variabilidade que este tipo de marcador exibe.Geralmente um loco do tipo SNP é bialélico, podendo conter três ou no máximo até quatroalelos, sendo um problema para análises de mistura em um caso forense. O pequeno número dealelos acarreta também um pequeno poder de discriminação, sendo necessário um vastonúmero de locos existentes a serem analisados. Já os marcadores microssatélites variam em umloco numa quantidade de a 30 alelos em função do número em que a unidade de repetição éencontrada ao longo daquela região do DNA, obtendo dessa forma um grande poderdiscriminatório por loco. Os fatores responsáveis pela popularização dos STRs como sistemas deescolha em casos de paternidade ou identificação de indivíduos no contexto forense são: a suaabundância no genoma humano, o seu elevado grau de polimorfismo, a possibilidade de estudarvários microssatélites em uma única reação (multiplex) e o desenvolvimento de plataformas paraanálise automatizada. Tais aspectos proporcionam o aumento do poder de discriminação e adiminuição do tempo de análise, bem como das quantidades de DNA e de reagentes utilizados.

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A análise de DNA não identifica um único indivíduo, mas sim fornece a probabilidade,estatisticamente comprovada de sua inclusão. A análise estatística em casos forenses é realizadapara determinar a frequência de ocorrência do perfil obtido, que representa o número de vezesque um determinado perfil ocorre na população. A frequência com que cada alelo ocorre napopulação é determinada previamente por uma amostragem da população de estudo earmazenada em um banco de dados. Atualmente existem milhares de locos STRs identificados ese calcula que no genoma humano exista um STR a cada 10.000 pares de bases, fornecendo umavariedade para a escolha dos locos para testes de identificação.

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Figuras (na ordem de apresentação):1- Deleção ou deficiência: perda de um segmento do cromossomo. Pode ser: (1)deleção terminal do braço curto; (2) deleção terminal do braço longo; (3)deleção do braço longo.2- Duplicações: quando um segmento de um cromossomo apresenta-se duplicado.Resulta de: (1) crossing-over desigual; (2) segregação anormal na meiose em umportador de translocação ou inversão.

3-Inversões: quando um segmento do cromossomo originado de duasquebras sofre rotação de 180° e é ressoldado. Pode ser: (1) Paracêntrica:não envolve o centrômero (pode ocorrer no braço curto ou no braçolongo); (2) Pericêntrica: envolve o centrômero.4- Translocações: troca de segmentos entre cromossomos não homólogos. Pode ser:(1) Simples: quando o segmento perdido por deleção de um cromossomo é inserido emoutro cromossomo; (2) Recíproca: resultam de quebra de cromossomos nãohomólogos, com trocas recíprocas de segmentos soltos; e (3)Robertsoniana: envolve dois cromossomos acrocêntricos que se fundem próximos àregião do centrômero com perda dos braços curtos.

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O procedimento básico para obtenção dos marcadores RFLP envolve várias etapas.Inicialmente, o DNA das amostras a serem analisadas deve ser extraído e purificado. Emseguida, o DNA é tratado com enzimas de restrição, que irá clivá-lo em váriosfragmentos de diferentes comprimentos. Em seguida, os fragmentos são separados poreletroforese em gel de agarose. Os RFLPs não podem ser visualizados diretamente nogel, pois a mistura formada pelos diversos fragmentos de DNA de diferentescomprimentos forma um rastro contínuo no gel. Os fragmentos de DNA separados pelaeletroforese são então desnaturados em fita simples e transferidos para umamembrana de nylon ou nitrocelulose (carregada positivamente). Essa técnica,denominada Southern blot (Southern, 1975), proporciona um suporte sólido para osfragmentos de DNA, que são imobilizados na membrana na mesma ordem que estavamno gel. O próximo passo na detecção dos marcadores RFLPs é a hibridização do DNA dasamostras imobilizadas na membrana com uma sonda radioativa, que seja complementarao fragmento de interesse. Existem alternativas de marcação de sondas, por exemplo,quimioluminescência. A última etapa do processo, conhecida como auto-radiografia,consiste na exposição da membrana hibridizada a um filme fotográfico.

Sondas de DNA: são pequenos pedaços de cadeias simples de DNA cuja sequência debases é conhecida. As sondas utilizadas na hibridização devem ser inicialmentemarcadas com: a) radioisótopos, como 3H, 35S, 125I, 32P e 33P; ou b) materiais não-radioativos, como biotina, digoxigenina ou fosfatase alcalina (quimioluminescência), queposteriormente são reconhecidos por conjugados anticorpos-enzimas. Nesse sistema oanticorpo se liga à molécula de digoxigenina na sonda e a enzima conjugadacatalisa uma reação de quimioluminescência, envolvendo um substrato, que ao serdegradado emite fótons de luz. O resultado é observado em auto-radiografia apósexposição com a membrana marcada. Apesar de a sonda radioativa ser mais sensível, amarcação não-radioativa apresenta a vantagem de ter maior estabilidade e melhorresolução. Estas sondas, diante de um DNA desconhecido, acoplam às sequências dasquais são complementares, ligando-se às mesmas.

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Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio daseqüência do ácido nucléico que se deseja amplificar, dita "seqüência alvo." A partirdisto, desenham-se dois iniciadores ("primers") para dar partida ao processo de sínteseem um local específico.Um iniciador serve para sintetizar a seqüência alvo no sentido 3’-5’e outro para o sentido inverso isto é, 5’-3.’ O iniciador é uma pequena seqüência denucleotídeos que hibridiza no início da seqüência alvo que se quer amplificar e da qualele é complementar.Ao reconhecer o iniciador a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendoà informação contida na seqüência de DNA que será replicada (sintetizada).

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(reference:www.library.thinkquest.org/24355/data/light/details/media/polymeraseanim.html)

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JonBenet Ramsey, de 6 anos, foi encontrada morta a pancadas e estrangulada no porão de suacasa, em Boulder (Colorado), em 26 de dezembro de 1996, num crime que comoveu a sociedadeamericana. A menina era uma das modelos infantis mais famosas nos Estados Unidos. O caso,que despertou imediatamente grande interesse na imprensa nacional americana, nunca foiesclarecido em mais de 10 anos. JonBenet, loira e de olhos azuis, era inscrita pela mãe em váriosconcursos de beleza infantis por sua graça e beleza. Durante um período, a suspeita recaiu sobreos pais da menina, Patsy e John Ramsey. JonBenet foi estrangulada até a morte com um garrotefeito com coisas achadas na casa, seu crânio foi fraturado e a boca estava amordaçada com fitacrepe. Havia sinais de violência sexual.A morte de JonBenet chocou o mundo. Ela era filha de um industrial milionário e da ex-Miss1977 do Estado de West Virgínia. A família morava numa mansão na cidade de Boulder, noColorado. Ninguém diz ter ouvido nada de anormal durante a noite em que a menina foi morta.John Ramsey, o pai, havia chamado a polícia dizendo que a filha fora sequestrada. O rapto eracomprovado por um bilhete exigindo uma quantia específica (US$118 mil). Os investigadoresvasculharam a casa e não encontraram nenhum sinal de arrombamento. Foi John quem desceuao porão e encontrou a filha enrolada num cobertor. As investigações ainda não chegaram anenhuma conclusão definitiva. Mas os principais suspeitos no imaginário popular, e nosindicativos dados pela polícia, são os próprios pais da garota. Existem indícios incriminatórios,como o bilhete de resgate escrito em blocos de anotações pertencente à própria família e aquantia do resgate que coincide exatamente com o bônus de fim de ano recebido por John.Mais de uma década após o assassinato da modelo infantil JonBenet Ramsey, o caso aindaparece inacabado e apoiado apenas em suposições - mesmo após o professor John Mark Karr, de41 anos, ter confessado que estava com a menor no momento de sua morte, assegurando quefoi um acidente e que estava apaixonado por ela.John Mark Karr confessou em Bangcoc que drogou e estuprou JonBenet e acabou matando-aacidentalmente. Porém, as autoridades judiciais americanas se mostram prudentes, assinalandoque a investigação prossegue e que o suspeito deve se beneficiar da suposição de inocência.Ainda não sabe-se se ele realmente drogou a menina de 6 anos, se a molestou sexualmente oumesmo se estava em Colorado no momento em que ela foi morta. A autópsia de JonBenet nãoencontrou evidências que mostrem que ela ingeriu drogas e concluiu que sua morte foi causadapor estrangulamento depois de ter sido espancada - ela teve o crânio fraturado. Foramencontradas feridas vaginais, mas não é certo que a menina tenha sido estuprada. Não haviasêmen em seu corpo.Além disso, os pais e a ex-mulher do acusado disseram às autoridades que Karr não é o assassinoque eles procuram. Um advogado da família disse que existe uma foto em que os três filhos doprisioneiro aparecem juntos em uma celebração natalina em Atlanta (Geórgia) em dezembro de1996 e, que, segundo o pai de Karr, seus netos nunca viajavam sem Karr.

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JonBenet Ramsey, de 6 anos, foi encontrada morta a pancadas e estrangulada no porão de suacasa, em Boulder (Colorado), em 26 de dezembro de 1996, num crime que comoveu a sociedadeamericana. A menina era uma das modelos infantis mais famosas nos Estados Unidos. O caso,que despertou imediatamente grande interesse na imprensa nacional americana, nunca foiesclarecido em mais de 10 anos. JonBenet, loira e de olhos azuis, era inscrita pela mãe em váriosconcursos de beleza infantis por sua graça e beleza. Durante um período, a suspeita recaiu sobreos pais da menina, Patsy e John Ramsey. JonBenet foi estrangulada até a morte com um garrotefeito com coisas achadas na casa, seu crânio foi fraturado e a boca estava amordaçada com fitacrepe. Havia sinais de violência sexual.A morte de JonBenet chocou o mundo. Ela era filha de um industrial milionário e da ex-Miss1977 do Estado de West Virgínia. A família morava numa mansão na cidade de Boulder, noColorado. Ninguém diz ter ouvido nada de anormal durante a noite em que a menina foi morta.John Ramsey, o pai, havia chamado a polícia dizendo que a filha fora sequestrada. O rapto eracomprovado por um bilhete exigindo uma quantia específica (US$118 mil). Os investigadoresvasculharam a casa e não encontraram nenhum sinal de arrombamento. Foi John quem desceuao porão e encontrou a filha enrolada num cobertor. As investigações ainda não chegaram anenhuma conclusão definitiva. Mas os principais suspeitos no imaginário popular, e nosindicativos dados pela polícia, são os próprios pais da garota. Existem indícios incriminatórios,como o bilhete de resgate escrito em blocos de anotações pertencente à própria família e aquantia do resgate que coincide exatamente com o bônus de fim de ano recebido por John.Mais de uma década após o assassinato da modelo infantil JonBenet Ramsey, o caso aindaparece inacabado e apoiado apenas em suposições - mesmo após o professor John Mark Karr, de41 anos, ter confessado que estava com a menor no momento de sua morte, assegurando quefoi um acidente e que estava apaixonado por ela.John Mark Karr confessou em Bangcoc que drogou e estuprou JonBenet e acabou matando-aacidentalmente. Porém, as autoridades judiciais americanas se mostram prudentes, assinalandoque a investigação prossegue e que o suspeito deve se beneficiar da suposição de inocência.Ainda não sabe-se se ele realmente drogou a menina de 6 anos, se a molestou sexualmente oumesmo se estava em Colorado no momento em que ela foi morta. A autópsia de JonBenet nãoencontrou evidências que mostrem que ela ingeriu drogas e concluiu que sua morte foi causadapor estrangulamento depois de ter sido espancada - ela teve o crânio fraturado. Foramencontradas feridas vaginais, mas não é certo que a menina tenha sido estuprada. Não haviasêmen em seu corpo.Além disso, os pais e a ex-mulher do acusado disseram às autoridades que Karr não é o assassinoque eles procuram. Um advogado da família disse que existe uma foto em que os três filhos doprisioneiro aparecem juntos em uma celebração natalina em Atlanta (Geórgia) em dezembro de1996 e, que, segundo o pai de Karr, seus netos nunca viajavam sem Karr.

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John Mark Karr, que foi colocado em liberdade por não existirem provas que o ligassemao assassinato da modelo infantil JonBenet Ramsey, foi detido novamente pararesponder sobre acusações de pornografia infantil. Karr foi detido na Califórnia em 2001por cinco acusações de posse de pornografia infantil, das quais ele alega inocência.

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Em julho de 1987, Randall Scott Jones e Chris Reesh, ambos adolescentes ,estavam atirando com um rifle de caça 30/30 na área de recreação RodmanDam, na Flórida. Enquanto eles estavam atirando, a caminhonete de Jones ficoupresa em uma caixa de areia. Um pescador sugeriu que pedissem ajuda a umcasal que estava com uma picape estacionada nas proximidades. Jones e Reeshse aproximaram da picape, onde Kelly Lynn Perry e seu noivo, Matthew Brock,estavam dormindo.

Na manhã seguinte , os pescadores encontraram os corpos de Perry e Brocknos bosques adjacentes à área de recreação. A polícia investigou e revelou quecada um tinha levado um tiro na cabeça com uma bala de calibre 30 e que Perrytinha sido agredida sexualmente. Sua picape foi roubada . Em agosto, Jones foipreso em Mississippi ao ser encontrado dirigindo a picape de Brock. Reesh foipreso no dia seguinte em Palakta, Florida, depois que Jones disse à polícia queeles estavam juntos naquela noite, em julho. Ambos foram indiciados poracusações de assassinato em primeiro grau e agressão sexual.Uma amostra de sêmen recuperada do corpo de Perry e amostras de sangue deReesh e Jones foram comparadas em um laboratório especializado em testes deimpressão digital de DNA. A impressão digital de DNA resultante indicou qual ohomem foi culpado do estupro. Usando os resultados da impressão digital deDNA e outras provas, as autoridades foram capazes de juntar os eventos docrime.

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Um estudo com mais de 120 SNPs estimou traços físicos como cor de pele, olhos, cabelos epresença ou ausência de sardas, com base apenas na análise do DNA daquelas pessoas, emsequências genéticas tornadas públicas na internet graças à ação voluntária de pessoas de todo omundo que doaram seu material genético para pesquisas, inclusive cientistas renomados, comoJames Watson e Craig Venter. A estimativa foi posteriormente comparada com os traços físicosreais das pessoas, observando-se suas fotos, também disponibilizadas na internet. Outro estudonessa linha descreveu um protocolo de análise simultânea de apenas 24 polimorfismosrelacionados com cor dos olhos e cabelos. Após a publicação desses estudos, a expectativa depredizer traços complexos como pigmentação dos olhos e cabelos por meio da análise do DNAestá sem dúvida se tornando cada vez mais real.

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