ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«УЛЬЯНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

УДК 579.67: 579.8 На правах рукописи

ХИТРОВА АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА

РSEUDOMONAS PSEUDOALCALIGENES: БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА,

РОЛЬ В МИКРОЦЕНОЗЕ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ ТОМАТА

03.02.03 – Микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Наталия Иосифовна

Потатуркина-Нестерова

Ульяновск - 2018

2

Оглавление

ПЕРЕЧЕНЬ ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ .................................................................. 4

ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 12

1.1. Характеристика микробиоты ризосферы и ризопланы растений .................. 12

1.2. Влияние ризобактерий на жизнедеятельность растений ................................ 21

1.3. Роль бактерий рода Pseudomonas в симбиотическом сообществе

ризобактерий и растений ........................................................................................... 30

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................... 36

2.1. Объекты исследования ....................................................................................... 36

2.1.1. Культуры микроорганизмов ........................................................................ 36

2.1.2. Культура томатов Lycopersicon esculentum Mill. ....................................... 37

2.1.3. Питательные среды для культивирования и идентификации

ризобактерий ........................................................................................................... 38

2.2. Методы исследования ......................................................................................... 39

2.2.1. Бактериологические методы иследования микробиоценоза ризосферы и

ризопланы томатов ................................................................................................. 39

2.2.2. Молекулярно-генетический метод выявления нуклеотидных

последовательностей фрагмента гена 16S рРНК и гена trpA,

детерминирующего синтез L-триптофана P. pseudoalcaligenes ........................ 43

2.2.3. Показатели межвидового взаимодейсвия в бактериальном блоке

ризосферы и ризопланы томатов ........................................................................... 47

2.2.4. Методы определения биологических свойств ризобактерий

P.pseudoalcaligenes .................................................................................................. 49

2.3. Методы статистического анализа данных ........................................................ 53

3

ГЛАВА 3. БАКТЕРИИ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ LYCOPERSICON

ESCULENTUM MILL. .................................................................................................... 54

3.1. Бактериальный комплекс прикорневой зоны Lycopersicon esculentum Mill. 54

3.2. Биологические свойства ризобактерий прикорневой зоны томатов ............. 57

3.3. Численность ризобактерий в различные вегетационные периоды томатов . 64

3.4. Частота встречаемости ризобактерий в различные вегетационные периоды

томатов ........................................................................................................................ 71

3.5. ПЦР идентификация ризобактерий вида P.pseudoalcaligenes ........................ 73

ГЛАВА 4. МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕЖВИДОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В

БАКТЕРИАЛЬНОМ БЛОКЕ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ ТОМАТОВ В

РАЗЛИЧНЫЕ ВЕГЕТАЦИОННЫЕ ПЕРИОДЫ ......................................................... 80

4.1. Результаты определения показателя постоянства микроорганизмов ............ 81

4.2. Характеристика видового разнообразия ........................................................... 84

4.3. Изменения индекса флористической значимости ризобактерий ................... 86

4.4. Динамика индекса контагиозности ризобактерий ........................................... 88

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

РИЗОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P.PSEUDOALCALIGENES ....................... 92

5.1. Поверхностные и колонизационно-адгезивные свойства ризобактериальных

штаммов P. pseudoalcaligenes ................................................................................... 92

5.2. Выявление гена, детерминирующего синтез L-триптофана

P.pseudoalcaligenes ................................................................................................... 102

5.3. Антагонистические свойства P. pseudoalcaligenes по отношению к

бактериальным фитопатогенам .............................................................................. 109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 125

4

ПЕРЕЧЕНЬ ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК – абсцизовая кислота

АСМ –атомно-силовая микроскопия

ГЖХ – газожидкостная хроматография

ГЖХ – газожидкостная хроматография

ИУК - индолил-3-уксусная кислота

КОЕ - колониеобразующая единица

КОЕ/мл – колониеобразующих единиц на 1 мл

ПЦР – полимеразная цепная реакция

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Растения и колонизирующие его микроорганизмы представляют собой

единую систему, внутри которой существует взаимосвязь между

микроорганизмами, а также между микро- и макроорганизмами (Бухарин,

Валышев, Елагина, 2002; Несвижский, Воробьев, 2002; Бондаренко, Грачева,

Мацулевич, 2003). Микробная колонизация является процессом расселения

микроорганизмов в различных биотопах, для которой характерны определенная

видовая иерархия и тактическое разнообразие в системе «микроорганизм-хозяин»

(Попкова, 2004). Примером таких взаимоотношений является агроэкосистема,

функционирование которой зависит от ряда факторов, в частности, от

микроорганизмов, влияющих на продуктивность растений (Терещенко,

Бубина,2009).

В природных условиях микроорганизмы никогда не существуют в виде

чистых культур, они являются частью экосистемы. Разнообразие микробных

функций в природе определяется их повсеместным распространением и широтой

метаболических возможностей. Растительно-микробные ассоциации

представляют собой надорганизменные системы, обладающие новыми и

уникальными свойствами, изученными далеко не в полной мере.

Известно, что микробиоценоз почвы, ассоциированной с растениями,

разнообразен и зависит от почвенно-климатических факторов, вида

возделываемой культуры, времени вегетации растения и других параметров

окружающей среды. Корневая система растений заселена полезными, вредными и

нейтральными для растений микроорганизмами (Белимов, 2008).

При оценке бактериального разнообразия почв методом посева практически

невозможно описать разнообразие всех групп и таксонов бактерий. Г.М. Зеновой

с соавт. (2002) предложено выбрать модельную группу бактерий, все

представители которой способны расти на одной и той же питательной среде. При

этом становится возможным определение доли разных таксонов бактерий в

сообществе, выявление доминантов, субдоминантов и минорных компонентов,

6

т.е. анализ сообщества на основании использования различных общепринятых

синэкологических показателей.

Таким образом, учитывая значение микробного состава для

жизнедеятельности растения, изучение таксономического состава микробиоты

культурных растений является чрезвычайно актуальной проблемой. Однако,

результаты исследователей, касающихся изменений микробиоты в зависимости от

фазы вегетации и вида растения противоречивы. Имеются данные о составе

микробиоценоза ризосферы многих злаковых растений, картофеля, свеклы,

тыквы, некоторых плодово-ягодных культур (Чудинова, 2007; Алесина, 2010;

Ibekweа, 2010; Lioussanne, 2010; Turnbull, 2012; Tian, 2014). Микробиота

прикорневой зоны такого важного сельскохозяйственного растения, как томаты, и

ее роль в развитии данного растения остается мало изученной.

Структура микробного сообщества ризосферы и ризопланы томата,

изменение его биоэкологических характеристик в процессе вегетации растения

влияют на стабильность агроэкосистемы и продуктивность

сельскохозяйственного растения, однако они также до сих пор мало изучены. Не

определены основные показатели межвидового взаимодействия микробиоценоза,

позволяющие раскрыть закономерности существования микроорганизмов

в данном биотопе.

Цель исследования

Дать эколого-микробиологическую характеристику культивируемой части

бактериального сообщества ризосферы и ризопланы Lycopersicon esculentum Mill.

и определить изменение биологических свойств Рseudomonas pseudoalcaligenes в

различные фазы вегетации в условиях растительно-микробной ассоциации.

Для реализации этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить видовую структуру культивируемого бактериального блока

ризосферы и ризопланы Lycopersicon esculentum Mill. в зависимости от периода

вегетации.

7

2. Дать характеристику межвидового взаимодействия компонентов

микробного консорциума ризосферы и ризопланы Lycopersicon esculentum Mill. в

различные фазы вегетации растения.

3. Оценить изменения биологических свойств бактериального комплекса

ризосферы и ризопланы томатов в процессе вегетации на примере

микросимбионта Рseudomonas pseudoalcaligenes.

Методология и методы исследования

В основу диссертационного материала положен принцип изучения и

анализа фактического материала. Для достижения поставленной цели

диссертации и решения задач исследования в работе использовали следующий

комплекс методов: лабораторный, аналитический и статистический. Методики

исследования, состоящие из нескольких этапов с использованием

соответствующих методов исследования, подробно изложены во второй главе

диссертации.

Степень достоверности, апробация результатов и личное участие автора

Диссертация выполнена в соответствии с планом научной работы ФГБОУ

ВО «Ульяновский государственный университет».

Основные положения работы представлены на III Международной научно-

практической конференции (30 сентября 2014г., Белгород) и Международной

научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 150-летию

со дня рождения В.П. Горячкина (5 июня 2018г., Москва).

Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны

совместно с научными руководителями на основании целенаправленных

исследований. Представленные экспериментальные и теоретические результаты

получены лично автором. Автор принимал непосредственное участие в

подготовке и проведении экспериментов, обработке и обсуждении полученных

результатов, подготовке публикаций. Автор лично проводил эксперименты по

изучению таксономических и биоэкологических особенностей микробиоценоза

8

ризосферы и ризопланы сельскохозяйственной культуры Lycopersicon esculentum

Mill. в разные вегетационные периоды, а также исследованию биологических

свойств ризосферных штаммов Р. pseudoalcaligenes.

Определение жирно-кислотного состава клеточных мембран ризосферных

штаммов Р. pseudoalcaligenes выполнено в Центре коллективного пользования

«Симбиоз» Федерального государственного бюджетного учреждения науки

«Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской

академии наук» (руководитель к.б.н. А. А. Широков). Часть работ выполнена в

лаборатории зондовой и электронной микроскопии научно-исследовательского

технологического института им. С. П. Капицы Ульяновского государственного

университета (зав. лабораторией – к.ф.-м.н. Е.С. Пчелинцева).

Полученный материал был обработан с помощью современных методов

статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту

1. В культивируемой части бактериального блока прикорневой зоны L.

esculentum Mill. преобладают тринадцать видов ризобактерий, относящихся к

девяти родам и восьми семействам – Moraxellaceae, Micrococcaceae,

Pseudomonadaceae, Alcaligenaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae,

Burkholderiaceaeи Shewanellaceae. Показатели численности исследуемой группы

бактерий прикорневой зоны увеличивались в процессе вегетации томатов с

8,80±2,73lgКОЕ/г в ризосфере и 3,59±1,45 lgКОЕ/г в ризоплане в фазу всходов до

максимальных значений в фазу плодоношения - 170,57±35,15 lg КОЕ/г и

73,43±13,75 lgКОЕ/г соответственно.

2. Среди представителей бактериального комплекса вид P. pseudoalcaligenes

превалировал по показателям численности и частоты встречаемости с

наивысшими значениями в фазу плодоношения (в ризосфере 52,40±11,70 lgКОЕ/г

и 94,6±2,4% соответственно; в ризоплане 14,55±2,23 lgКОЕ/г и 87,5±2,6%

соответственно). Доминирующее значение вида P. pseudoalcaligenes в

исследуемой группе бактерий прикорневой зоны томатов во все фазы вегетации

9

подтверждалось показателями межвидового взаимодействия, достигавшими

максимального уровня в фазу плодоношения томатов в биотопах ризосферы и

ризопланы: показатель постоянства (89,6±2,4* и 87,5±2,6* соответственно;

р<0,05), индекс экологической значимости (13,0±0,1 и 12,3±0,4 соответственно;

р<0,05) и индекс контагиозности (0,66*±0,03 и 0,64*±0,02 соответственно;

р<0,05). Показатель видового разнообразия в ризоплане был выше, чем в

ризосфере, в фазу плодоношения он составил 0,11±0,03 и 0,05±0,02

соответственно; его значения в процессе вегетации снижалось в 22,8 и 20,4 раз

соответственно.

3. Изменения в ризосфере и ризоплане в процессе вегетации томатов

сопровождались трансформацией биологических свойств ризосферных изолятов

P. pseudoalcaligenes, оказывающих прямое и опосредованное влияние на

растение-ассоцианта. О наличии прямого механизма свидетельствовало

увеличение содержания в бактериальных клетках изученных штаммов количества

ненасыщенных жирных кислот: Trans-9-октадеценовая кислоты в 1,4 раза и Cis-9-

гексадеценовая кислоты в 1,3 раза, подтверждающее усиление адгезивной

активности. Увеличение данного показателя достигало максимальных значений в

фазу плодоношения растения (75,0±3,0* нН).

Концентрация гена trp A, детерминирующего синтез L-триптофана,

оказывающего прямое стимулирующее воздействие на рост корневой системы

томатов, также возрастал в процессе вегетации растения, максимальная его

концентрация наблюдалась в фазу плодоношения (50*106ДНК/мл).

Опосредованное влияние на растение-ассоцианта проявлялось

антагонистической активностью P. pseudoalcaligenes по отношению к

бактериальным фитопатогенам, максимально проявлявшейсяв фазу

плодоношения (по отношению к Pseudomonas syringae 10,4±1,7*мм, по

отношению к Pectobacterium carotovora 6,7±1,6*мм).

10

Научная новизна работы

Впервые дана таксономическая и биоэкологическая характеристика

микробиоценозов ризосферы и ризопланы сельскохозяйственной культуры

L.esculentum Mill. в процессе вегетации растения.

Впервые изучено прямое и опосредованное влияние P. pseudoalcaligenes на

растение-ассоцианта. При помощи высокоразрешающей атомно-силовой

микроскопии и газожидкостной хроматографии изучены колонизационно-

адгезивные свойства ризосферных штаммов P. pseudoalcaligenes, являющихся

показателями структурно-функциональной стабильности микробиоценоза.

Впервые у штаммов P. pseudoalcaligenes определены генетические

детерминанты фитогормональной активности, являющейся одним из важнейших

механизмов положительного влияния ризобактерий на растение-ассоциант.

Получены новые данные об антагонистической активности ризосферных

штаммов P. pseudoalcaligenes по отношению к фитопатогенам Pectobacerium

carotovora subsp. carotovora и Pseudomonas syringae pv. lachrymans.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в ходе исследования данные расширяют представление о

эколого-микробиологических особенностях микробиоты ризосферы и ризопланы

L.esculentum Mill. в условиях растительно-бактериальной ассоциации.

Выявлены свойства ризосферных бактерий P.pseudoalcaligenes,

оказывающих влияние на развитие и урожайность важной сельскохозяйственной

культуры L.esculentum Mill. – колонизационно-адгезивный потенциал,

фитогормональная активность и способность подавлять бактериальные

фитопатогены.

В ходе выполнения исследования были разработаны протоколы проведения

ПЦР с серией новых праймерных систем для идентификации ризосферных

штаммов P. pseudoalcaligenes и выявления фитогормональной активности

бактерий данного вида, что позволит выделять штаммы ауксинпродуцирующие

перспективные для разработки микробиологических препаратов.

11

Выделенные и изученные штаммы бактерий P. pseudoalcaligenes, которые

являются одними из доминирующих бактерий в микробном сообществе

ризосферы и ризопланы томатов, характеризуются высоким колонизационно-

адгезивным потенциалом, проявляют фитогормональную и антагонистическую

активность, представляют собой ценный биологический ресурс для проведения

прикладных исследований в области разработки биопрепаратов для

растениеводства.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные материалы используются в работе ООО «Поволжская Агро

Комания» (Акт внедрения от 15.09.2017 г.).

Изданы практические рекомендации для студентов, бакалавров, магистров,

а также специалистов, работающих в сфере сельскохозяйственной микробиологии

и агрономии «Применение ПЦР для идентификации Pseudomonas

pseudoalcaligenes» (г. Ульяновск: УлГУ, 2018).

Материалы работы внедрены в учебно-педагогический процесс

преподавания основ микробиологии, биологии экологического факультета

ФГБОУ ВО УлГУ (Акт о внедрении от 8 сентября 2017 г.).

Публикации

Результаты исследований по теме диссертации изложены в 16 работах, в

том числе 13 статей в журналах, из них 6 – в журналах из перечня ВАК, 2 учебно-

методических пособия и 1 монография.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 153 страницах. Состоит из введения,

обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных

исследований, заключения и списка литературы. Библиография содержит 242

источников, из них 144 отечественных и 98 иностранных. Работа иллюстрирована

27 таблицами и 23 рисунками.

12

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика микробиоты ризосферы и ризопланы растений

Микробное сообщество почвы представляет собой динамичную систему,

которая является неотемлемым компонентом любого фитоценоза. Изучение

структуры микробных сообществ, а также механизмов взаимодействия между

микро- и макроорганизмами, обеспечивающих устойчивое существование

экосистемы в целом является одной из важнейших задач экологии (Коробова,

2007).

В настоящее время одним из основных вопросов современной почвенной

микробиологии является оценка изменений в агроэкосистеме

сельскохозяйственных растений, функционирование которой в основном

обусловлено микроорганизмами. Кроме того, микроорганизмы выполняют

функцию индикаторов, отражающих состояние агробиоценоза и наиболее быстро

реагирующих на любые изменения в нем (Тахмина, 2014).

Основные параметры структуры микробного сообщества и характера его

функционирования влияют на стабильность агроэкосистемы и продуктивность

сельскохозяйственного растения. Исследователи выделяют различные критерии

эколого-микробиологической оценки почвы, однако унифицированных методов

оценки состояния почвенной микробиоты не разработано (Терещенко, Бубина,

2009).

Известны различные показатели позволяющие раскрыть закономерности

существования микроорганизмов в биоценозе. Показатель встречаемости

позволяет оценить типологию доминант по формуле С.И. Сытника (1989).

Известно, что не все представители микробиоты способны оказывать на нее

одинаковое воздействие и есть лишь некоторые виды составляющие основу

микроэкосистемы и определяющие ход биоценотических отношений в нем.

Сочетания доминантных видов определяют индивидуальный ценотип, а вместе

с ним и отличительные черты конкретной экосистемы (Крамарь, 2014).

Отсутствие доминантных видов в микробиоте, а также появление широкого

13

спектра добавочных и транхиторных видов свидетельствует о дисбиотических

процессах в микробиоте (Даньшина, 2012).

Уровень видового разнообразия микробиоты является показателем его

экологической устойчивости и появление новых доминант в сообществе

характеризует его стрессовое состояние (Добровольская, 2002). Видовое

разнообразие микробного сообщества подвержено изменениям под воздействием

различных факторов, сопровождающиеся сменой доминирующих видов,

колебаниями численности микроорганизмов разных групп и даже изменением

состава членов сообщества (Добровольская, 2002; Шамин, 2014).

Характер распределения представителей микробиоты в определенном

биотопе показывает индекс контагиозности, снижение данного показателя может

привести к освобождению экологических ниш, которые успешно занимают

представителип транзиторной группы микроорганизмов (Касаткина, Ильина,

2011). А.В. Курзин (2009) отмечал увеличение индекса контагиозности

патогенной флоры в микробиоценозе кишечника при протозойной инвазии.

Степень обогащенности почвы органическими веществами показывает

соотношение численности микроорганизмов в ризосфере и ризоплане (Теппер,

2004). Отмечают, что высокая обсемененность корней растений при низкой

плотности микроорганизмов в ризосфре говорит о смещении микробоценоза в

неустойчивое состояние.

Микробное сообщество растений стало объектом активных исследований во

второй половине прошлого столетия (Егоров, 2003; Кацы, 2003; Бороздина, 2011;

Блинков, 2013; Khalid et al., 2004). Взаимоотношения микроорганизмов с

растениями основаны на обмене метаболитами и на обеспечении физического

контакта. Микроорганизмы создают среду обитания для растений, обеспечивают

их химическими соединениями, необходимыми для их роста и развития, в свою

очередь микроорганизмы получают пространство для роста, возможность

перемещения и распространения вместе с частями растения, а в ряде случаев и

защиту от внешних воздействий. Известно, что растение оказывают влияние на

микробное сообщество, выделяя вещества-аттрактанты или репелленты.

14

Установлено, что особое значение для жизнедеятельности растений имеет

микробиота ризосферы – почвы, окружающей корень, и ризопланы,

непосредственно прилегающей к поверхности корней. Размеры данных зон

зависят от вида растения, типа почвы и других факторов (Добровольская, 2002;

Бирюкова, 2001; Колесников, 2012; Широких, 2007; Нетрусов и др., 2004).

Доказано, что микробиота данного биотопа оказывают стимулирующее

влияние на рост и развитие растений, регулируя их активность и продуктивность

за счет синтеза физиологически активных веществ, способности к азотфиксации,

мобилизации питательных элементов из почвы, а также устойчивости растений к

фитопатогенам (Захарченко, 2009). Ризобактерии участвуют в процессах

формирования почвенных структур и биогеоценозов, устанавливая с растениями

прочную симбиотическую связь (Казеев и др., 2003).

Микробное сообщество ризосферы и ризопланы растений в большой

степени сходно с микробиотой почвы, однако состав микробного спектра

прикорневой зоны отличается от почвенной биоты, не ассоциированной с

растениями, что обусловлено корневыми экссудатами, являющимися

питательным субстратом, содержащим сложные смеси легкодоступных

органических источников энергии для ризобактерий (Шапошников, 2003;

Тихонович и др., 2011; Воронина, 2011; Sanon et al., 2009; Gomes et al., 2001).

Показано, что в почве, где не произрастают растения, число

микроорганизмов меньше в 100 раз по сравнению с ризосферной зоной, которая

характеризуется высокой плотностью микроорганизмов (Емцев, 2005; Бегжанова,

2013; Снисаренко, 2014; Bais, 2006; Beneduzi, 2012;).

Исследованиями N. C. M. Gomes et al. (2001), И.А. Казарцева (2013),

C.Peiffer et al. (2013) также показаны отличия качественных характеристик

микробного спектра почвенной и прикорневой зон. Установлено, что в ризосфере

овса посевного (Avena sativa) доминируют бактерии рода Pseudomonas, а в

окружающей почве – рода Arthrobacter (Снисаренко, 2014; Абдуллаева, 2014). В

ризосферной зоне кукурузы количество фосфатрастворяющих,

лецитинминерализующих бактерий и грибов в 5-10 раз превышает численность

15

данных микроорганизмов в почве, не ассоциированной с растением (Liao et al.,

2002).

Количественные показатели почвенных микроорганизмов зависят от

погодных условий, системы обработки почвы, вида возделываемых культур

ипериода вегетации растения, большая доля почвенной биоты приходится на

сапрофитные бактерии, также в большом количестве представлены актиномицеты

и грибы (Селюк, 2013; Ефремова, 2016).

Показаны количественные различия микробного состава почвы в

зависимости от ее типа, так, 1 г подзолистых и дерново-подзолистых почв

содержит примерно 1 млн. клеток микроорганизмов, черноземы и каштановые

почвы – 3,4-3,6; бурые и сероземные – 4,5 млн. клеток (Шеуджен, 2017).

Видовой состав микроорганизмов в почвах также различный. Для чернозема

Западной Сибири характерны микробы, разрушающие целлюлозу и вызывающие

нитрификацию. Для выщелочного чернозема отмечают преобладание неспоровых

форм бактерий, таких как Pseudomonas, олигонитрофильные бактерии,

усваивающие минеральный азот, и аммонифицирующие микроорганизмы.

Численность спорообразующих микроорганизмов значительно ниже, и они

представлены видами B. megaterium и B. mesentericus. Широко распространены

актиномицеты A. albidus, A. griseus и A. violaceus и грибы родовPenicillium,

Aspergillus, Trichoderma, Alternaria и Cladosporium (Ферапонтова, 2015; Шеуджен,

2017).

Установлено, что качественный и количественный состав микробиоты

ризосферы и ризопланы различен и зависит от таких факторов, как физическая

удаленность флоры от корневых выделений, вид растения, его вегетативная фаза,

тип почв, почвенно-климатические факторы и другие (Морецкая, Демченко, 2008;

Иутинская и др., 2010; Mathimaran et al., 2005; Vestberg et al., 2005; Jefwa et al.,

2006).

Известно, что микробиота ризосферы благодаря симбиотической связи с

растениями обладает устойчивостью к воздействиям окружающей среды, по

16

сравнению с почвенной флорой (Кравченко, 2011; Тихонович, 2011, Проворов,

2011; Снисаренко, 2014; Phillips, 2004).

Физическая удаленность микроорганизмов от корневых экссудатов влияет

как на видовой состав и количественные показатели прикорневого микробоценоза

(Снисаренко, 2014; Бороздина, 2011; Абдуллаева, 2014). Показано, что ризосферу

астрагала чаще колонизируют целлюлозоразлагающие бактерии, а

ризопланумикроорганизмы, вступающие в симбиотические отношения с корнями

растения (Bacterium). Бактерии рода Azotobacter активно колонизируют как

ризоплану, так и ризосферу астрагала (Малинина, 2016).

Аналогичные показатели имеют ризосфера и ризоплана овса посевного. В

ризосфере доминируют целлюлозоразлагающие микроорганизмы, актиномицеты

и грибы, в то время как в ризоплане, непосредственно прилегающей к

поверхности корней, преобладают сапрофитные бактерии.

М.Н. Артамоновой (2017) показано, что ризосфера является более

колонизированной нишей, чем ризоплана. В ризосфере тыквы преобладают

спорообразующие бактерии, а для ризопланы характерно доминирование

грамотрицательных бактерий рода Shewanella и Serratia. В тоже время, по

данным Т.А. Снисаренко (2014) количество выделенных микроорганизмов в

образцах ризопланы больше, чем в образцах ризосферы.

Таксономический спектр ризобактерий разнообразен и включает большое

количество грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, которые

по литературным данным относятся к филам Acinetobacteria, Bacteroides,

Firmicutes и Proteobacteria (Figueiredo et al., 2010; Bulgarelli D., 2013). Наиболее

изученными среди них являются представители родов Azospirillum, Azotobacter,

Arthrobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Serratia, Acinetoobacter, Klebsiella,

Psеudomonas, Bacillus и другие (Chelins Marisa et al., 2000; Егоров, 2003;

Arkhipova et аl., 2004; Phạm Bích Hiên, PhạmVăn Toản, 2003).

Показано, что видовое разнообразие ризобактерий прикорневой зоны

специфично для каждого вида растения (Kuske et al., 2002; Селиверстова и др.,

2008). Отмечено преобладание в ризосфере грамположительных бактерий над

17

грамотрицательными (Gomes et al., 2001;Soderberg et al., 2004). Однако известны

результаты исследований, в которых показано доминирование в ризосфере

кукурузы грамотрицательных бактерий родов Burkholderia, Paenibacillus,

Pseudomonas (Добровольская, 2002; Chelius, Triplett, 2000; Picard et al., 2000).

В настоящее время изучен состав микробиоценоза ризосферы и ризопланы

многих зерновых культур, таких как овес, пшеница, рожь, ячмень, и других, а

также бобовых культур – фасоль, горох, ячмень (Алексина, 2010; Гордеева, 2012;

Леонтьевская, 2014; Снисаренко, 2014; Joshi, 2011). Имеются также работы,

посвященные изучение видового разнообразия прикорневой зоны льна,

хлопчатника, моркови, капусты, лука, картофеля, свеклы, огуреца, тыквы и

древесно-плодовых культур (Шильникова и др., 2006; Масленникова, 2014;

Благова, 2014; Berg et al., 2005; Ibekwea, 2010).

Микробный состав ризосферы и ризопланы овса посевного представлен

такими ризобактериями как Pseudoтoпas, Klebsiella, Enterobakter, Alcaligenes

(Снисаренко, 2014). Корневая система пшеницы, ячменя и овса колонизирована

бактериями рода Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, актиномицетами и грибами

(Гажеева, 2011). Из ризосферы ржи выделяли Azospirillum, Bacillus, Azotobacter,

Arthrobacter, Agrobacterium, доминирующее положение занималибактерии родов

Pseudomonas, Enterobacter (Волкогон, 2001). Ризобактерии рода Klebsiella были

обнаружены в ризосфере и ризоплане пшеницы, риса, табака ячменя и

подсолнечника (3лотников, Казакова, 2006; Bacon, Hinton, 2006).

В ризосфере льна-долгунца отмечали представителей рода Bacillus, из

азотфиксирующих организмов Azotobacter, олигонитрофиллы, из

целлюлозоразрушающих − Sorangium cellulosum и Sporocytophaga myxococcoides

(Чудинова, 2007). На плодах моркови спектр доминантов предствлен

анаэробными бактериями семейства Enterobacteriaceae. В ризосфере картофеля

были обнаружены Arthrobacter и Azotobacter, в ризоплане – цитофаги и

миксобактерии (Леонтьевская, 2014). Для ризосферы кукурузы харктерно наличие

представителей родов Arthrobacter, Nocardiopsis, Aeromonas, Butyrivibrio,

18

Burkholderia, Pseudomonas,Clostridium, Bacillus, Cytophaga. и Bacteroides

(Романычева, 2014; Picard et al., 2000; Huang et al., 2010; Peiffer, 2013).

На примере некоторых растений показано, что бактериальный состав

ризосферы и ризопланы зависит от вегетативной фазы растения (Чудинова, 2007;

Артамонова, 2017; Tian, 2014; Turnbull, 2014). Это связано с изменением

характера корневых выделений в процессе развития растения, за счет чего

происходит замена бактерий, питающихся корневыми экзометаболитами,

гидролитиками, разлагающими корневой опад и биомассу отмерших бактерий

(Лобакова, 2004; Joshi, 2011; Добровольская, 2002; Воронина, 2011).

Показано, что на ранних стадиях роста лука, пшеницы, ячменя и овса в

прикорневой зоне доминируют грамотрицательные бактерии, такие как

псевдомонады, азотобактер, флавобактерии, на поздних вегетативных фазах

растений в микробных сообществах доминируют грамположительные бактерии –

бациллы, микобактерии, стрептомицеты, целлюлозоразрушающие

микроорганизмы и актиномицеты, обладающие способностью разлагать

труднодоступные органические субстраты (Широких и др., 2006; Гажеева, 2011;

Ферапонтова, 2015).

Эти данные подтверждают работы А.Ю. Малининой (2016). Автором

установлено, что прикорневая зона A. austriacusв начальные периоды вегетации

характеризуется наличием бактерий родов Azotobacter, Bacterium, Azotomonas и

Pseudomonas, к осени увеличивается процент содержания бактерий родов

Agrococcus, Agrobacterium (способный разлагать целлюлозу и лигнин), Bacillus и

Streptococcus.

При исследовании микробоценоза прикорневой зоны злаковых растений

показано, что количество спорообразующих бактерий в общей численности

сапротрофных микроорганизмов ризосферы была максимальна в фазе

формирования зерна, среди неспороносных микроорганизмов бактерии рода

Pseudomonas доминировали в ризосфере исследуемых растений в фазах выхода в

трубку и колошения (Гажеева, 2011).

19

Для микробоценоза корневой системы тыквы отмечено доминирование в

фазу всходов неспорообразующих бактерий по сравнению со спорообразующими

бациллами, а в фазе плодоношения численность бацилл была максимальной

(Артамонова, 2017).

Показано также изменение количественных показателей микроорганизмов

ризосферы в зависимости от стадии развития растения. По мнению Т.М. Фунг

(2015) это обусловлено развитием корневой системы растения в процессе

вегетации и, следовательно, изменением количества корневых выделений,

служащих источником питания для бактерий. В работе Т.П. Гажеевой (2011) для

исследованных яровых злаковых растений (пшеница Triticum aestivum L., ячмень

Hordeum distichon L., овес Avena sativa L.) было отмечено изменение общей

численности микроорганизмов ризосферы по фазам вегетации, таким образом,

что в фазу кущения общая численность микроорганизмов была минимальна и

достигала максимальных величин в фазу колошения.

В работе Т.А. Снисаренко (2014) показано, что максимальное количество

бактерий как в ризосфере, так и в ризоплане обнаружено в фазе цветения

растений, наименьшеѐ же количество соответствует стадии созревания. В то же

время, при исследовании микробоценоза картофеля Е.А. Леонтьевская (2014)

отмечала иную динамику численности бактериальных сообществ в процессе

онтогенеза растения, согласно ее данным максимальные показатели наблюдались

в период бутонизации, минимальные – на стадии всходов.

Показано, что микробиоценоз ризосферы и ризопланы, а также почвы

является динамичной структурой, количественный и качественный состав

которой зависит от различных биотических и абиотических факторов и

специфичен для каждого вида растения. Эколого-микробиологические

характеристики микробного сообщества являются показателямипочвенного

«здоровья» и, как следствие, состояния растения (Селивановская,2009; Карпеева

2011; Степанов, 2012).

На примере ряда сельскохозяйственных культур, показано, что видовой

состав и количественные характеристики почвенной и прикорневой микробиоты

20

необходимы для понимания взаимодействия в системе микроорганизм-растение.

Это позволяет управлять ростом и активностью как микро-, так и

макрокомпонентов данной экосистемы для использования их в агрономически

значимых процессах (Умаров, 2004; Полянская, 2017). Однако до сих пор

микробиота такого важного сельскохозяйственного растения, как томаты, и ее

роль в развитии данного растения остается мало изученной.

Плоды томатов богаты клетчаткой, пектиновыми веществами,

органическими кислотами, в частности лимонной кислотой, каротиноидами,

сахарами, белками, витамином С, солями железа, фосфора и калия,

определяющих питательные и диетические свойства свежей и переработанной

продукции, а также лечебные свойства которые защищают клеточную мембрану

от негативного влияния свободных радикалов, образующихся в результате

биохимических реакций в организме (Иванова, 2004). В настоящее время

наметилась тенденция к восстановлению больших посевных площадей под

томатом в открытом грунте, способных обеспечить перерабатывающую отрасль

необходимым количеством сырья (Мачулкина, 2010). Кроме того томаты имеют

важное значение для пищевой промышленности, по объему посевных площадей

под томаты Россия занимает 8 место в мире (Jianbin Liu et al., 2010; Lioussannt,

2010).

Таким образом, учитывая значение микробного состава для

жизнедеятельности растения, изучение таксономического состава микробиоты

культурных растений является чрезвычайно актуальной проблемой. Однако,

результаты исследователей, касающихся изменений микробиоты в зависимости от

фазы вегетации и вида растения противоречивы. Изучению микробоценоза

ризосферы и ризопланы такой важной сельскохозяйственной культуры, как

томаты, посвящены лишь единичные работы.

21

1.2. Влияние ризобактерий на жизнедеятельность растений

Установлено, что микроорганизмы, ассоциированные с растениями,

активизируют рост и развитие последних, оказывают положительное влияние на

урожайность, что позволяет снизить количество вносимых удобрений (Кравченко,

2002; Моргун, 2009).

Многие авторы отмечают высокую ризобактериальную эффективность

флуоресцентныхпсевдомонад и ряда бацилл. Для данных ризобактерий показана

высокая колонизирующая активность, способность к синтезу метаболитов-

стимуляторов роста растения, что способствует достоверному увеличению

урожайности сельскохозяйственных культур (Khalid et al., 2004). При инокуляции

ризобактериями рода Bacillus лиственных культур выявилиускорение роста

черенков на 42% (Erturk et al., 2010). Значительное увеличение урожайности

яблонь отмечали при инокуляции штаммами Bacillus M3 и Microbacterium

FS01(Karlidag et al., 2007).

Несмотря на важность микробиоты ризосферы и ризопланы для

жизнедеятельности растений они могут участвовать в некоторых нежелательных

процессах. В частности, поглощать питательные вещества, вносимые с

удобрениями, что приводит к их повышенному расходу. Так, установлено, что на

содержание ризосферных микроорганизмов растения тратят 30-50% продуктов

фотосинтеза (Умаров, 2007).

Известны различные механизмы положительного влияния ризобактерий на

растения. В настоящее время их делят на две группы – прямые и опосредованные

(Моргун, 2009). К прямым способам воздействия на растения относят:

ассоциативную азотфиксацию,образование ростстимулирующих веществ и

легкоусвояемых форм железа, фосфора, что способствует их поглощению из

почвы и доставку в растения, а также формирование специфических трофических

связей и уменьшение уровня этилена. К непрямым способам относят

предотвращение или уменьшение роста фитопатогенных почвенных

микроорганизмов за счет выделения бактерицидных и антифунгальных

22

метаболитов (Боронин, 2000; Штерншис и др., 2000; Benizri et al., 2001; Figueiredo

et al., 2010).

Одним из наиболее изученных механизмов положительного влияния

ризобактерий на растения является ассоциативная азотфиксация. Ранее функция

азотфиксации приписывалась лишь некоторым бактериям, таким как –

Azotobacter, Clostridium, Azospirillum, Beijeriпckia, Derxia. В настоящее время

доказано, что способностью к фиксации азота из атмосферы отмечаются 80-90%

всех известных бактерий (Фунг, 2015). К диазотрофам в настоящий момент

относят представителей родов Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter,

Agrobacterium, Azotobacter, Pseudomonas, Enterobacter, Кlebsiella, Burkholderia,

Flavobacterium, Campylobacter, Bacillus, Klebsiella, Erwinia, Clostridium,

Escherichia, Citrobacter и другие (Егоров, 2003; Алексина, 2010; Chelins et al.,

2000; Arkhipova et аl., 2004).

Почвенные микроорганизмы способны к фиксации азота и без ассоциации с

растениями, однако доказано, что нитрогеназная активность в таком случае

значительно ниже. Показано, что в прикорневой зоне проростков риса

азотфиксация происходит в 50 раз активнее, по сравнению с данным

бактериальным процессом без ассоциации с растениями (Фунг, 2015).

В.С. Юргина (2010), в то же время, утверждает, что для повышения

продуктивности растений с помощью ассоциативных азотфиксаторов большое

значение имеет первоначальная обеспеченность растений минеральным азотом.

Автор предполагает, что дефицит минерального азота в почве приводит к

снижению листовой поверхности растения и его фотосинтетической активности,

что ведет за собой снижение экзометаболической активности корневой системы,

необходимой для питания бактерий ассоциантов.

Г.А. Воробейников с соавторами (2011) также считают важным условием

успешной растительно-бактериальной ассоциации обеспечение достаточного

минерального питания и оптимальной дозой азота в почве с низким содержанием

гумуса по их мнению является 60 кг N/га.

23

Многочисленные работы посвящены ассоциации азотфиксирующих

микроорганизмов с различными представителями злаковых растений

(Воробейников, 2011; Кириченко, 2011).

Для бактерий рода Azospirillum доказана азотфиксирующая роль в

ассоциации с такими растениями как, кукуруза, рис, сахарный тростник, сорго и

кормовые травы (Фунг, 2015). Из ризосферы ржи изолировали различные

диазотрофы с высоким потенциалом азотфиксации: Azospirillum, Enterobacter,

Bacillus, Azotobacter, Pseudomonas, Arthrobacter, в том числе Agrobacterium

(Волкогон, 2001). Аэробные азотфиксаторы семейства Azotobacteriaceae -

Azotobacter и Beijerinckia были обнаружены в прикорневой зоне кукурузы, овса,

сои и сахарного тростника (Кириченко, Коць, 2011).

К важнейшим механизмам эффективного растительно-микробного симбиоза

относится синтез ризобактериями фитогормонов. Доказана способность

ризобактерий синтезировать фитогормональные вещества, способствующие

регулированию роста и развития растения, а также установлению связей растения

с почвенными микроорганизмами (Моргун, 2009). Известны основные группы

фитогормонов, синтезируемые ризобактериями – ауксины, гибберелины,

цитокинины, абсцизовая кислота и другие (Кудоярова, 2011).

Типичным ауксином является индолил-3-уксусная кислота (ИУК),

котораяоказывает влияние на корневую систему растения, а именно удлинение

главного корня, развитие боковых корней и корневых волосков,

сопровождающеесяизменением морфологии корней – их изгибанием,

скручиванием и ветвлением (Casson et al., 2003; Khalid et al., 2004; Wittenmayer et

al., 2005). Кроме того, синтез ауксинов инициирует деление клеток, их

дифференциацию и растяжение. Это может иметь значение для ускоренного

роста, потребления питательных элементов и устойчивости растения к стрессам

(Цавкелова и др., 2005).

Существуют данные, что продукция ризобактериальными штаммами

ауксинов повышает вероятность образования растительно-бактериальной

24

ассоциации, тем самым помогая растению пережить неблагоприятные стрессовые

условия (Олюнина, 2004).

Ризобактерии способны синтезировать ИУК из L-триптофаза через такие

продукты как, индолил-3-ПВК, индолил-3-уксусный альдегид и другие (Koul,

2015). Известны некоторые почвенные микроорганизмы, способные к синтезу

ауксинов из триптофана, их относят к родам Azotobacter, Azospirillum,

Enterobacter, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas и др. (Моргун, Кириченко, 2009).

Многие авторы показывают влияние данного фитогормона на различные

ростовые характеристики растений и их урожайность. Для ризобактерий рода

Bacillus отмечают способность к синтезу ИУК и влияние на различные растения.

Стимуляция корнеобразования и влияние на прорастание семян ризобактерий

данного рода с помощью синтеза фитогормона ауксина показано для орхидных

(Шеховцова, 2011).

Стимуляция роста корневой системы и стебля, а такжеувеличение

количества молодых побегов отмечали при инокуляции ризобактериями рода

Bacillus ямса (Dioscorea rotundata L.), при этом объясняли данное влияние

продукцией ИУК (Swain et al., 2007). Увеличение урожайности различных

сельскохозяйственных культур установлено при использовании

микробиологического удобрения «Экстрасол» на основе Bacillus subtilis, который

способен к синтезу ИУК (Чеботарь с соавт., 2007).

Ризобактерии рода Azotobacter показаны как активные продуценты

фитогормона ауксина, влияющие на длину корня пшеницы и массу проростка

(Ahmad 2005; Khalid et al., 2004). Достоверное увеличении веса корневой системы

и надземной части, а также лучшее цветение различных сельскохозяйственных

растений отмечали при инокуляции ризобактериями рода Azospirillum (Dobbelaere

et al., 2001).

В.В. Моргун (2009) с соавт. доказали, что инокуляция проростков пшеницы

ризобактериями оказывала стимулирующее действие на рост корней, а также

массу сухого вещества и удлинение проростков, отмечая корреляционную

зависимость между увеличением ростовых характеристик растения и синтезом

25

ауксинов ризобактериями in vitro. Н.П. Ковалевская (2015) также отмечала

выраженное комплексное влияние ризобактерий Pantoea на развитие корней и

побегов пшеницы, что совпадало с максимумом синтеза бактериями ИУК.

Установлено, что при низком содержании триптофана в среде

микроорганизмы характеризуются низкой синтезирующей активностью ИУК, а

при экзогенном введении триптофана продукция данного фитогормона

увеличивается в десятки раз (Цавелкова, 2006, Моргун, 2009). Так было отмечено

повышение ауксинобразующей активности в 14 раз при обогащении среды

триптофаном (Моргун, 2009). Изучена способность Klebsiella planticola ТСХА-91

синтезировать индолил-3-уксусную кислоту из триптофана. Отмечали увеличение

роста и количества корней фасоли (Блинков, 2013).

Несмотря на то, что большое количество авторов отмечают влияние

ауксинов на стимуляцию удлинения и роста корней, увеличение урожайности

растений, известно, что синтетические экзогенные ауксины тормозят рост корней

в длину (Stepanova et al., 2007; Teale et al., 2005). Л.Н. Олюнина с соавт. (2004)

отмечают, что при высокой концентрации экзогенной ИУК ауксиновый

метаболизм сдвигается в сторону распада и снижения уровня эндогенной формы

фитогормона. Также известно, что суперпродуцентами индолил-3-уксусной

кислоты являются фитопатогены, которые оказывают ингибирующее действие на

растения (Duca D., 2014).

К следующей группе фитогормонов относятся цитокинины и их

производные – кинетин, зеатин, изопентениладенин и некоторые другие (Моргун,

2009). Ризобактериальные цитокинины способствуют повышению всхожести

семян, активизации роста за счет инициации деления клеток, увеличения ширины

клеток, кроме того увеличению площади поверхности корня

сельскохозяйственных культур за счет формирования большого количества

боковых и придаточных корней (Феоктистова, 2016; Werner et al., 2003).

Ризобактерии для которых отмечают способность к синтезу цитокининов относят

к родам – Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas и др. (Кудоярова, 2011).

26

О положительном влиянии на растения данных фитогормонов могут

свидетельствовать результаты инокуляции ризобактериями рода Bacillus

проростков пшеницы, которая сопровождалась увеличением длины и ширины

листьев, накоплением массы сырого и сухого вещества растений (Архипова,

Веселов, 2006). Установлено также влияние данного фитогормона на содержание

в листьях хлорофилла, уровень которого можно сравнить с действием

синтетических БАП (Моргун, 2009).

Отмечено влияние данных фитогормонов на развитие растений,

находящихся в неблагоприятных условиях (повышение концентрации солей,

гербицидов, отрицательные температуры, засуха). Растения,

инокулированные цитокининпродуцирующими бактериями рода Bacillus при

дефиците воды способны поддерживать водный обмен и высокий уровень

скорости роста, кроме того отмечали эффективность предобработки семян и

повышение урожайности (Мартыненко, 2009).

Фитогормоны гиббереллины стимулируют вегетативный рост растения,

активизируя процессы растяжения и деления клеток, ускоряют прорастание

семян.Синтез данных фитогормонов выявлен у ризобактерий родов Azotobacter,

Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium, Agrobacterium

(Цавкелова, Климова, 2006).

Гиббереллины применяют в картофелеводстве, при вторичной (летней)

посадке картофеля, поскольку предпосевная обработка клубней такими

препаратами может ускорять появление всходов и увеличивать количество

проросших глазков (Исаева, 2009). Аналогично, значительная стимуляция роста

карликовых мутантов кукурузы и риса были обеспечены гибберелино-подобными

веществами, продуцируемыми Azospirillum spp. (Boiero et al., 2007).

Показано различное ростостимулирующее влияние ризобактериальных

фитогормонов на растения, однако есть данные, что смешанные культуры

микроорганизмов продуцируют большее количество фитогормонов. Это

доказывает опыт определения количества фитогормонов в смешанной культуре

Azospirillum brasilense и Arthrobacter diacomelloi, в которой количество ауксинов,

27

гибберелинов и цитокининов превышало их содержание в данных монокультурах

(Кравченко, 2002).

Следующим механизмом прямого влияния ризобактерий на растения

считают трансформацию труднорастворимых фосфорных соединений в

легкоусвояемые (Kang, 2006). Ризобактерии с помощью ферментов – фитаз,

нуклеаз, фосфотаз и фосфолипаз способны к минерализации недоступных

фосфорных соединений в ионы РО42-

, которые легко усваиваются растениями

(Звягинцев, 2005, Sharma, 2013).

Фосфор оказывает влияние на рост растенй, кроме того благодаря процессу

растворения ризобактериями фосфатов высвобождаются метаболиты,

подавляющие некоторые фитопатогены, к таким метаболитам относят

сидерофоры, фитогормоны и литические ферменты (Василев, 2006).

Способность мобилизировать труднорастворимые фосфаты обнаружена у

ризобактерий рода Bacillus, Enterobacter и Pseudomonas (Akkopii, 2005; Kang, Cho,

2006). При инокуляции томата ризобактериями рода Pseudomonas и Enterobacter

выявляли снижение фузариозного увядания и увеличение ростовых показателей

растения, при этом в корнях фиксировали увеличение фосфора (Akkopii et al.,

2005). Инокуляция фосфатмобилизующими штаммами Burkholderia silvatlantica,

Burkholderiaspp., Herbaspirillum seropedicae приводила к увеличению в

вермикомпосте доступного для растений фосфора (Busato et al., 2012).

Известно, что адаптивный потенциал ризобактерий зависит от состава

структурных элементов их клеточной поверхности. Жирные кислоты, являясь

компонентом клеточной стенки бактерий, способны определять физико-

химические свойства клетки, такие как адгезия, текучесть, устойчивость к

внешним воздействиям. Так, Ю.В. Захаровой и А.С. Сухих (2015) отмечено

повышение адгезивных свойств бактерий и изменение поверхностных

характеристик, обусловленное присутствием у бактерий ненасыщенных и

разветвленных жирных кислот. Исследования соотношения жирных кислот

элементов клеточной поверхности азоспирилл показали, что высокое содержание

ненасыщенных жирных кислот способствует высокому адаптивному потенциалу

28

и широкой распространенности микроорганизмов (Игнатов, 2009). В работе Т.Н.

Мельничук с соав. (2014) показано, что количество жирных кислот и их

качественный состав оказывал влияние на колонизационную способность

штаммов бактерий к растению.

Установлено, что любые изменения в микросимбиозе приводят к

изменению поверхностных свойств микроорганизмов, что обусловлено различием

в путях синтеза жирных кислот у бактерий. Однако вопросы влияния состава и

структуры жирных кислот на биологические свойства микроорганизмов, от

которых зависит стабильность микросимбиоценоза остаются мало изученными

(Будников, 2010).

Непрямые механизмы ростстимулированияризобактериями растений

заключаются в подавлении грибковых и бактериальных фитопатогенов.

Биоконтрольная функция ассоциативных бактерий в отношении патогенной

микрофлоры корней растений осуществляется разными способами, во-первых, это

синтез ризобактериямиантифунгальных веществ и вытеснение фитопатогенных

бактерий или грибов в результате подавления их роста, во-вторых, путем

конкуренции за жизненно важный элемент питания, как железо (Боронин, 2000,

Benizri, 2006, Haas, 2005).

Следует отметить, что один штамм ризосферных бактерий может

использовать несколько механизмов воздействия на фитопатогены одновременно

(Figueiredo et al., 2010).

Железо необходимокак для жизнедеятельности бактерий, так и растений, но

в силу своей малорастворимости труднодоступно. Продукция сидерофоров

ризобактериями удовлетворяет их потребность в железе, кроме того способствует

ингибированию конкурентной микрофлоры. Утилизация железа происходит

только при наличии специфичного рецепторного белка на наружной мембране

бактерий, благодаря чему данный элемент может быть недоступным для

фитопатогенов (Crowley, 2006). Однако конкуренция за железо эффективна

только при низком его содержании в почве и при определенной ее кислотности,

29

избыточное содержание железа может привести к репрессии синтеза сидерофоров

(Феоктистова, 2016).

Биоконтроль заражения растения фитопатогенами различной природы

осуществляется ризобактериями с помощью синтеза антибиотикоподобных и

фунгитоксичных веществ (Моргун, 2009). Установлено, что различные вещества,

выделяемые ризобактериями способны подавлять фитопатогены, к ним относят

гидролитические ферменты, антибиотики, токсины, которые приводят к

ингибированию роста патогенной флоры или ее гибели даже при низких

концентрациях (Beneduzi, 2012).

Антагонизм – часто встречающееся в природе явление, которое проявляется

в конкуренции паразитных и сапрофитных видов микроорганизмов (Dawidziuk,

2014). Среди ризобактерий наиболее изученными штаммами антагонистами

являются представители родов Pseudomonas, Bacillus и Azotobacter (Мелентьев,

2007; Гуревич, 2012; Pierson, 2010; Chowdhury, 2015).

Подавляющее действие на фитопатогены штамма Pseudomonas spр. В-6798

показано по отношению к Fusarium oxysporum var. lini и F. oxysporum var. gladioli,

возбудителям корневых гнилей злаковых культур (Минаева, 2008). Для

ризобактериальных изолятов рода Bacillus, Pseudomonas и микромицетов

Тrichoderma koningii 406, выделенных из прикорневой зоны картофеля, пшеницы,

кукурузы и розы показана антагонистическая активность по отношению к

фитопатогенным грибам рода Fusarium (Кабрера Фуентес, 2010).

Единичные работы отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют о

способности ризобактерий к формированию биопленки на корневой системе

растений (Mc Spadden, 2004; Selim et al., 2005; Bent et al., 2002). Ризобактерии,

находясь в гетерогенных условиях почвы (почва – ризосфера – растение),

нуждаются в богатом наборе адаптивных способностей. Таким образом,

биопленкогенез ризобактерий может играть существенную роль в успешном

функционировании их ассоциации с растениями (Шелудько, 2010; Zaied et al.,

2009).

30

В.В. Моргун (2009) отмечает, что одним из свойств ризобактерий является

способность синтезировать экзополисахаридный комплекс, обеспечивающий

вязкость и условия для успешной агрегации с другими почвенными

микроорганизмами, создавая ассоциации на корневой поверхности растений и

защищая их от неблагоприятных условий. Такая способность доказана для

Azotobacter vinelandii при культивировании на 4-оксибензойной кислоте (Vargas-

Garcia, 2003).

Показно, что фитопатогенные бактерии Ralstonia solanaceanum, Ps. syringae

способны к образованию внеклеточных полисахаридов и формированию

биопленки (Круглова, 2009; Daniels, 2002; Hammerschmidt, 2004; Hoang, 2004).

Приобретение данного свойства бактерии используют для колонизации и

инфицировании растения (Marketon, 2003; Quinones,2005; Yao, Luo, 2004).

Таким образом, корневые экссудаты растений являются субстратом и

факторами роста микробных сообществ. В свою очередь, прикорневая

микробиота, оказывает множественное влияние на рост и развитие растения за

счет синтеза различных метаболитов, кроме того выполняет антифитопатогенную

роль. Существуют данные о возрастании положительного эффекта ризобактерий,

которые находятся в ассоциации с другими микроорганизмами. В тоже время

исследования растительно-микробного взаимодействия томата с

микроассоциантамипосвящены лишь узкому спектру микроорганизмов.

Неизученным остается влияние продуцируемого бактериями прикорневой зоны

фитогормонов, активно участвующих в развитии растения, а также

антогонистическое действие микробиоты данного биотопа по отношению к

фитопатогенам данных растений.

1.3. Роль бактерий рода Pseudomonas в симбиотическом сообществе ризобактерий

и растений

Бактерии рода Pseudomonas являются типичным ассоциантам растений и

наибольшее количествобактерий как в ризосфере, так и в ризоплане приходится

31

именно на представителей данного рода (Алексина, Снисаренко, 2010; Клыкова,

2016).

Бактерии рода Pseudomonas широко населяют биосферу и участвуют в

процессах минерализации различных органических соединений, а также в очистке

окружающей среды от загрязнений. Многие представители данного рода

являются возбудителями заболеваний человека и животных, наиболее

распространенной является синегнойная палочка (Смирнов,1990).

Известно, что ризосферные бактерии рода Pseudomonas обладают

совокупностью полезных свойств, благодаря которым, они положительно влияют

нарост и развитие растений (Haasand Défago, 2005). Кроме того, данные

ризобактерии являются наиболее изученной группой микроорганизмов,

обладающих антагонизмом по отношению к почвеннымфитопатогенам

(Червериков, 2012; Логинов и др., 2001; Bloemberg&Lugtenberg, 2001; Whipps,

2001). Ризобактерии P. putida, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. сorrugate и др.

способствуют ускорению роста и развития растений (Бурова, 2006; Криг, 2007;

Анохина, 2011; Клыкова, 2016).

В работе О.М. Минаевой (2008) отмечено, что период наибольшей

численности микроорганизмов в ризосфере совпадает с периодом активного роста

кукурузы, овса, пшеницы и картофеля. Инокуляция ризобактериальными

штаммами P.fluorescens 92rk и P190r томатов и огурцов привела к увеличению

объема плодов, общей длины корня и его площади поверхности (Saravana kumar,

Samiyappan, 2007).

Положительное воздействие формальдегидутилизирующих псевдомонад

показано в работе Е.Е. Акимовой (2007), свидетельствующей об увеличении

продуктивности картофеля при инокуляции как в лабораторных, так и в полевых

опытах. Показана способность ризосферных бактерий P.chlororaphis

контролировать заболеваемость растений и стимулировать их рост вусловиях

засоления почв и засухи (Клыкова, 2016; Egamberdieva, 2012).

Многими авторами показана способность псевдомонад фиксировать

атмосферный азот, синтезировать различные фитогормоны, также сидерофоры и

32

различной природы антибиотики и антибиотикоподобные вещества (Акимова,

2007; Клыкова, 2016).

Показана способность к фиксации атмосферного азота бактериями рода

Pseudomonas в неблагоприятных условиях. Так в холодных климатических зонах

в ризосфере растений азотфиксирующие псевдомонады доминировали над

представителями других таксономических группазотфиксаторов (Боронин, 2000;

Свешникова, 2003; Клыкова, 2016).

Синтез данными бактериями фитогормонов считается одним из важных

механизмом стимулирования роста и развития растения. У них отмечают синтез

ауксинов, гибберелинов, цитокининов и других биологически активных веществ,

стимулирующих рост и развитие растения (Феклистова, 2004; Четвериков, 2011;

Клыкова, 2016).

Способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту доказана для

видов P. amygdali, P. aureofaciens, P. fluorescens, Р. putida, P. syringae pv

savastanoi (Свешникова, 2003; Храмцова, 2006; Лукаткин, 2009).

А.А. Лукаткин и соавторы (2009) производили обработку семян овощных

культур бактериальной суспензией P. aureofaciens, что приводило к ускоренному

всходу и развитию ростков, авторы объясняют это синтезом псевдомонадами

фитогормона – индолил-3-уксуной кислоты.

Установлено, что Р. putida способны разлагать фитогормоны при их

высоких концентрациях для снятия ингибирующего действия суперпродуцентов

ИУК (Leveau, Lindow, 2005). Однако показано, что лишь 9 видов

ризосферныхпсевдомонад из 40 обладали способностью к синтезу ИУК в

прикорневой зоне некоторых растений. Кроме того для фитопатогенных

микроорганизмов рода Pseudomonas также отмечают способность к синтезу

индолил-3-уксусной кислоты, однако корреляционной зависимости между

патогенностью и способностью к синтезу фитогормонов выявлено не было

(Свешникова, 2003).

Для ряда представителей рода Pseudomonas отмечают способность к

синтезу фитогормона – гибберелина, оказывающий влияние на прорастание

33

семян. В работе И.Н. Феклистовой (2016) установлено, что бактеризация семян P.

aurantiaca привела к увеличению различных ростовых параметров проростков

семян овощных культур.

Кроме перечисленных механизмов прямого положительного влияния

ризобактерий данного рода на растения отмечают также их способность, к

синтезу веществ, растворяющих труднодоступные соединения фосфора, оказывая

воздействие на фосфорное питание растений (Дунайцев, 2007). Примером может

являться P. entomophila, вид выделенный из прикорневой зоны разных растений,

произрастающих на неорошаемых почвах Индии (Shahbaz-Mohammadi et at,

2011).

Наиболее изученными механизмами положительного влияние

ризобактериальных псевдомонад на растения является подавление

фитопатогенной флоры с помощью синтеза антибактериальных и антигрибных

метаболитов и конкурентной борьбе за питательный субстрат, с помощью синтеза

триглицеридов и сидерофоров (Maksimov et al., 2011).

Для группы флюоресцирующих псевдомонад отмечают способность к

повышенному синтезу сидерофоров, так как имеют более высокое сродство к

трѐхвалентному железу, за счѐт чего выигрывают в конкурентной борьбе с

фитопатогенами за такой жизненно важный элемент, как железо, что также

приводит к угнетению роста последних (Штерншис и др.,2000; Минаева, 2007).

Показано подавление почвенных патогенных грибов сидерофорами

флуоресцентных псевдомонад путем продуцирования железо-хелатирующего

комплекса, данное свойство, недоступно для других организмов (Dwivedi, Johri,

2003). Однако данный механизм работает лишь при недостатке ионов железа в

почве, так сидерофорпсевдобактин, синтез которого характерен для Pseudomonas

putida B10, подавлял Fusarium oxisporum в почвах с дефицитом железа

(Щербаков, 2013).

В то же время, существуют работы в которых антагонистическая роль

сидерофоров, синтезируемых флюоресцентными псевдомонадами далеко не

34

однозначна, не выявлена корреляционная зависимость между синтезом

сидерофоров и антагонизмом (Акимова, 2007).

Для ризобактерий рода Pseudomonas были выделеные новые формы

метаболитов –триглицеропептиды, оказывающие фунгистатическое действие на

грибковые фитопатогены, ограничивая развитие ростовых трубок растущих гиф

(Четвериков, 2012). Триглицеропептиды не являются сидерофорами, так как в

своем составе лишены флюоресцентного хроматофората и по фунгистатическому

действию не уступают известным антибиотикоподобным веществам, которые

синтезируют псевдомонады (Сулейманова, 2007).

Большое внимание исследователей направлено на антагонистические

свойства бактерий рода Pseudomonas с помощью синтеза различного рода

антибиотиков и бактериоцинов (Максимова, 2009; Феклистова, 2016; Lugtenberg,

Kamilova, 2009). Известно более 300 метаболитов бактерий данной группы

оказывающих антагонистическое действие (Логинов, 2003; Сулейманова, 2007;

Четвериков, 2012; Клыкова, 2016; Anandaraj, 2010).

В работе Е.Е. Акимовой (2007) показано снижение развития заболеваний

картофеля при бактеризации клубней и растений Pseudomonas sp. В-6798.

фитофторозом, ризоктониозом и паршой обыкновенной.

Обширная литература посвящена антифунгальным свойствам бактерий рода

Pseudomonas. Литическое действие псевдомонад на почвенные грибы описано

Худяковым в 1935 г. Был опоказано, что P. aeruginosa и P. fluorescens — одни из

наиболее активных видов в группе миколитических бактерий (Neeraja et al., 2010;

Maksimov et al., 2011).

В работе Т.О. Анохиной (2011) для видов P. aureofaciens, P.putida, P.

fluorescens, P. chlororaphis отмечали антагонистическую активность к

фитопатогенам.

P. fluorescens способен угнетать рост фитопатогенных грибов Rhizoctonia

solani и Phitium ultimum– важного патогена сеянцев хлопчатника. Обработка

семян штаммом Ps. fluorescens увеличивала выживаемость растений на 28-71 %

(Романенко, 2008; Клыкова, 2016).

35

Pseudomonas cocovenenans обладает выраженным антагонизмом грибковых

фитопатогенов, угнетая их рости прорастание спор. Для вида P. aurantiaca

отмечают широкий спектр антимикробного действия в отношении

грамположительных бактерий – бацилл, стафилококков и стрептококков,

коринебактерий и микобактерий, кишечной палочки протея, Erwinia aroidea,

Candida albicans (Клыкова, 2016).

Таким образом, можно отметить, что среди бактерий рода Pseudomonas

известно много видов, участвующих в формировании ризосферы растений.

Наиболее изученными среди них являются P. fluorescens, P.putida, P. chlororaphis,

P. amygdali, P. aurantiaca, P. aureofaciens и P. entomophila (Акимова, 2007;

Минаева, 2008; Клыкова, 2016). Вид P.pseudoalcaligenes, в настоящее время

изучен лишь как деструктор органического загрязнения, в качестве ассоцианта

корневой системы растения данный микроорганизм не изучался.

36

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Культуры микроорганизмов

Объектом исследования являлись штаммы Pseudomonas pseudoalcaligenes,

выделенные из ризосферы и ризопланы Lycopersicon esculentum Mill. в различные

фазы вегетации.

Исследуемые микроорганизмы выделяли из прикорневой зоны томатов в

различные фазы вегетации, характерные для однолетних растений – фаза всходов

– от посадки пророщенного семени в почву до появления 3-4 настоящих листьев,

фаза бутонизации – начало появления бутонов до их полного формирования, фаза

цветения – раскрытие цветка до полного отцветания, фаза плодоношения –

появление плодов до их созревания. Всего было отобрано 280 проб корневых

смывов: 140 смывов ризосферы и 140 ризопланы, по 35 проб в течение каждого

вегетационного периода растения (табл.1).

Таблица 1

Количество образцов смывов прикорневой зоны

LycopersiconesculentumMill.

Вегетационные фазы Количество смывов:

ризосферы ризопланы

Всходы 35 35

Бутонизация 35 35

Цветение 35 35

Плодоношение 35 35

Всего 140 140

Из полученных корневых смывов выделяли чистые культуры ризобактерий,

изучали их биологические свойства и производилиих идентификацию.

В качестве контроля при исследовании нуклеотидных последовательностей

генов, детерминирующих экспрессию предшественника фитогормона ауксина –

L-триптофана, а также для идентификации ризосферного вида Pseudomonas

37

pseudoalcaligenes на основе выявления нуклеотидных последовательностей

фрагмента гена 16S рРНК использовали штамм Pseudomonas pseudoalcaligenes

B4342, полученный из Всероссийской коллекции промышленных

микроорганизмов (ФГУП ГосНИИГенетика).

При определении антагонистической активности Pseudomonas

pseudoalcaligenes по отношению к бактериальным фитопатогенам использовали

культуры Pectobacterium carotovora subspр. carotovora (Jones, 1901, Bergeyetai,

1923) – возбудителя мягких гнилей овощных культур и Pseudomonas syringae pv.

lachrymans (Smith, Bryan, 1915, Carnser, 1918) – возбудителя угловатой

пятнистости овощных культур. Данные культуры были получены из

Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов и сортов-

идентификаторов патогенных штаммов микроорганизмов ФГБНУ

«Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии».

2.1.2. Культура томатов Lycopersicon esculentum Mill.

В качестве опытного растения использовали томаты гибридного сорта

«Женарос», наиболее часто выращиваемый в почвенно-климатических условиях

Ульяновской области.

Данный сорт является среднеранним индетерминантным гибридом томата с

высокими стабильными урожаями, характеризуется хорошей завязываемостью.

Плоды плоско-округлые весом 220-270 г с хорошей транспортабельностью.

Созревание происходит через 120 дней после всходов, растение среднемощное,

масса плода 180-200 грамм (плоды крупные). Гибрид устойчив к экстремальным

условиям. Обладает комплексной устойчивостью к болезням (к вирусам,

кладоспориозу, фитофторозу, фузариозу, вертициллезу и нематодам).

Предназначен для потребления в свежем виде и консервирования

(http://teplichnoe73.ru).

38

Культуру Lycopersicon esculentum Mill. выращивали на площади 20 м2 в

теплицах ООО «Поволжская Агро Компания» на территории Ульяновской

области в соответствии с нормами технологического проектирования тепличных

комбинатов для выращивания овощей и рассады (НТП 10-95) с использованием

универсального тепличного пропаренного почвогрунта, применяемого под все

виды растений, выращиваемых в условиях защищенного грунта (ГОСТ Р 53380-

2009 Почвы и грунты. Грунты тепличные. Технические условия.)

2.1.3. Питательные среды для культивирования и идентификации ризобактерий

Возможность биологических методов учета почвенных бактерий

ограничена в том смысле, что нельзя предложить среды, обеспечивающей рост

всех почвенных бактерий (Зенова, 2002). Культивирование микроорганизмов,

выделенных из ризосферы и ризопланы томатов, производили на простых (МПА,

ООО «БиоХолд», Россия) и специальных плотных питательных средах. Для

культивирования бацилл использовали картофельно глюкозный агар (Lab-Biomed,

Россия), неферментирующих бактерий - ГРМ-агар (ЗАО – «НПО БИОКОНТ»,

Россия), энтеробактерий и псевдомонасов агар Эндо (HiMedia Laboratories Pvt.

Limited, Индия), Среда Левина (ООО «БиоХолд», Россия) и агар МакКонки

(Witec,Россия). Для определения сахаролитических свойств использовали среды

Гисса с соответствующим сахаром и индикатором Андреде (НПО Микроген,

Россия).

Для определения ферментации глюкозы или ее ферментации использовали

среду Хью-Лейфсона следующего состава: пептический перевар животной ткани-

2 г/л, дрожжевой экстракт-0,5 г/л, NaCl - 30 г/л, глюкоза- 10 г/л, бромкрезоловый

пурпурный-0,015 г/л, агар-агар-3 г/л. Для изучения биохимических свойств

изолированных из прикорневой зоны томатов энтеробактерий пользовались

Цитратным агаром по Симмонсу (ООО «Лаб-БиоМед», Россия). Гидролиз

крахмала определяли на картофельном агаре, для чего чашки Петри с суточной

39

культурой бактерий на картофельном агаре заливали раствором Люголя. При

положительном результате наблюдали светлые участки вокруг колоний.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Бактериологические методы иследования микробиоценоза ризосферы и

ризопланы томатов

2.2.1.1. Отбор проб ризосферы и ризопланы томатов и почвогрунта

Для изучения микробного состава ризосферы из почвенных монолитов с

растениями стерильным пинцетом и ножницами отбирали 5,0 г молодых корней

(примерно одного диаметра) с приставшими к ним частицами почвы. Корни

помещали в колбу со 100,0 мл стерильного физиологического раствора и

взбалтывали в течение 2,0 мин. Содержимое колбы стерильной пипеткой

наносили на питательную среду и культивировали 48 часов при температуре

37°С.

Для выделения микроорганизмов ризопланы использовали метод

последовательного отмывания корней (Теппер, 2004). В ѐмкости с

физиологическим раствором размачивали корни растения с прилипшими частями

почвы, после чего 3 раза переносили в пробирки со стерильным физиологическим

раствором, а затем 4 раза промывали в стерильной воде. Отмытые корни

стерильными ножницами измельчали и помещали в стерильную чашку Петри.

Отбирали 5 г корней и растирали их в стерильной ступке. Затем измельченные

корни помещали в колбу со стерильным физиологическим раствором, чтобы

общий объем суспензии составлял 50,0 мл. В колбу помещали 5 г стерильного

кварцевого песка и взбылтывали 5 мин. После чего из колбы переносили 5 мл

суспензии в другую колбу с 45 мл стерильной воды, затем последовательно

переносили 5 мл суспензии во вторую, третью, четвертую, пятую, шестую, также

содержащие по 45,0 мл стерильной воды. В каждой колбе корни отмывали по 5

мин.

40

Таким образом, получали 7 последовательных корневых смывов, которые

культивировали на питательной среде в течении 2-3 дней при комнатной

температуре (Зенова, 2002).

Отбор проб почвогрунта производили с соблюдением правил асептики в

стерильные пергаментные пакеты. Получали среднюю пробу путем смещивания

пять образцов по «принципу конверта» (Теппер, 2004). С площади 100 м2

отбирали четыре образца в точках по углам и один – ближе к центру

прямоугольника. Для культивирования микроорганизмов почвогрунта получали

суспензию и производили посев на питательные среды (Звягинцев, 2005).

2.2.1.2. Количественный учет микроорганизмов

Для определения количества бактериальных клеток в исследуемых

корневых смывах использовали чашечный метод Коха (Прунтова, 2005).

Результаты количественного учета микроорганизмов, выражали в

колониеобразующих единицах (lgКОЕ/г).

Первым этапом данного метода производили высев почвенной суспензии на

плотную питательную среду. Для определения количества бактерий в ризосфере

использовали первое разведение, высев седьмого разведения – для ризопланы.

Перед посевом разливали расплавленную питательную среду в ряд стерильных

чашек Петри по 15-20 мл в каждую и оставляли на горизонтальной поверхности

до застывания. На поверхность просушенной питательной среды стерильной

пипеткой наносили 0,1 мл соответствующего разведения и равномерно

распределяли по поверхности агара. Посевы инкубировали в термостате при

температуре 37°С в течении 48ч. Затем подсчитывали выросшие колонии.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляли по формуле:

М =а

V∗ 10n

где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число колоний на чашке

Петри; V – объем суспензии, взятый для посева, мл; 10n – коэффициент

разведения.

41

Оценивали ризосферный эффект по соотношению численности

микроорганизмов в ризосфере и почве (R/S) (Зверев, 2016).

Частоту встречаемости отдельных штаммов рассчитывали как отношение

количества проб, содержащих исследуемый штамм, к общему количеству проб с

наличием роста.

Микробиологические исследования производили на базе лаборатории курса

микробиологии ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет» и

бактериологической лаборатории ГУЗ «Городская клиническая больница №1» г.

Ульяновска.

2.2.1.3. Идентификация микроорганизмов

Идентификацию изолированных ризобактерий в ходе предварительного

скрининга для убыстрения процесса и его удешевления осуществляли по

морфологическим, тинкториальным и культурально-биохимическим свойствам.

Морфологические и тинкториальные свойства изучали с помощью

биологического микроскопа со встроенной цифровой камерой DMB-200 (Россия,

общее увеличение-15х100). Идентификацию выделенных культур проводили с

помощью программного обеспечения для автоматизированной идентификации

бактерий производства ООО «НПО Диагностические системы» и «Определителя

бактерий» (Берджи, 2013).

В процессе идентификации у неферментирующих бактерий определяли

подвижность, спорообразование, наличие оксидазы, лизиндекарбоксилазы,

аргининдекарбоксилазы, окисление глюкозы OF, лактозы, мочевины, разжижение

желатина, образование индола и сероводорода, рост на среде Симмонса и

чувствительность к пенициллину.

Энтеробактерии идентифицировали по наличию уреазы,

орнитиндекарбоксилазы, лизиндекарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы,

расщеплению малоната натрия, образованию индола, сероводорода, реакции

Фогеса-Проскауэра и окислении глюкозы OF, росту на среде Симмонса также

определяли подвижность, спорообразование.

42

Для идентификации бацилл определяли подвижность, наличие спор,

продуцирование каталазы, расщепления маннита, крахмала, мочевины,

способность к гемолизу и реакцию Фогеса-Проскауэра.

Подвижность микроорганизмов определяли методом Шукевича. Для

определения способности бактерий к спорообразованию использовали

микроскопический метод, препарат окрашивали по методу Бурри-Гинса.

Гидролиз крахмала определяли на картофельном агаре, для чего чашки

Петри с суточной культурой бактерий на картофельном агаре заливали раствором

Люголя. При положительном результате наблюдали светлые участки вокруг

колоний.

Для определения сахаролитических свойств, выделенных микроорганизмов

делали посев на среды Гисса с соответствующим сахаром и индикатором

Андреде. Изучение пептолитических свойств проводили с помощью посева на

пептонную среду с добавлением индикаторов: для обнаружения сероводорода –

сульфат железа, для обнаружения аммиака – лакмус, для индола – щавелевая

кислота. Для определения способности ризобактреий разжижать желатин

производили посев на среду с его содержанием.

Наличие каталазы определяли с помощью 1% раствора перекиси водорода.

Для выявления способности к гемолизу производили посев на кровяной агар.

Обнаружение способности микроорганизмов окислять глюкозу в анаэробных

условиях производили посевом на среду Хью-Лейфсона.

Реакцию Фогеса–Проскауэра ставили для обнаружения ацетоина, который

образуется при расщеплении бактериями глюкозы по бутиленгликолевому пути,

использовали среду Кларка с добавлением КОН, культивировали

микроорганизмы в присутствии кислорода.

43

2.2.2. Молекулярно-генетический метод выявления нуклеотидных

последовательностей фрагмента гена 16S рРНК и гена trpA, детерминирующего

синтез L-триптофана P. pseudoalcaligenes

Производили молекулярно-генетическую идентификацию ризосферных

штаммов P.pseudoalcaligenes на основе анализа нуклеотидных

последовательностей фрагментов гена 16S рРНК гена. C помощью баз данных

GeneBank (США), EMBL (Европейская молекулярно-биологическая библиотека)

был изучен нуклеотидный состав гена 16S рРНК P. pseudoalcaligenes и

определена позиция гена (рис. 1).

Рис.1. Позиция гена 16s рРНК в хромосоме Pseudomonas pseudoalcaligenes

При помощи ПЦР с детекцией результатов в режиме real time определяли

также синтез генов, детерминирующих прродукцию L-триптофана

ризобактериальными штаммами P. pseudoalcaligenes. L-триптофан является

предшественником индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), увеличивающей

вероятность образования растительно-бактериальной ассоциации, оказывает

влияние на корневую систему растения, в результате которого происходит

удлинение главного корня, развитие боковых корней и корневых волосков

(Олюнина, 2004; Casson et al., 2003; Khalid et al., 2004; Wittenmayer et al., 2005).

В базах данных GeneBank (США) и EMBL (Европейская молекулярно-

биологическая библиотека) был найден ген P. pseudoalcaligenes, ответственныйй

за синтез L-триптофана – trpA (рис.2).

44

Рис.2. Позиция гена trpA в хромосоме Pseudomonas pseudoalcaligenes

Исследование нуклеотидных последовательностей генов,

детерминирующих экспрессию предшественника фитогормона ауксина – L-

триптофана проводили в культуре P.pseudoalcaligenes, выделенной из

прикорневой зоны томатов в разные фазы вегетации.

В качестве контрольного микроорганизма был использован штамм

Pseudomonas pseudoalcaligenes B4342 полученный из Всероссийской коллекции

промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИГенетика).

При проведении PCR-real time использовали реакционную смесь,

содержащую краситель EVA Green и набор праймеров для определения

фрагментов генов, детерминирующих синтез L-триптофана (ЗАО «Синтол», г.

Москва).

Выделение бактериальной ДНК

Для подготовки проб бактериальных клеток P. pseudoalcaligenes,

содержащих геномную ДНК производили посев чистой культуры на скошeнный

агар, инкубировали при 37˚С 24 часа. Выросшие колонии помещали в 0,9 %

NaCl, предварительно разлитый в условиях стерильности в микропрoбирки

«Эппендорф», объемом 0,5 мл. Осаждали на центрифуге при 1300 об/мин 10

минут. Для разведения полученного центрифугата до конечной концентрации 104

КОЕ/мл использовали буфер, который содержал 2,5mMMgCl2и 0,01% желатин.

Для выделения геномной ДНК исследуемых микроорганизмов применяли

комлект реагентов для выделения ДНК из биопроб - "Проба ГС" (ООО "ДНК-

Технология", Москва). Разрушение бактериальных клеток производили с

помощью лизирующего раствора, после чего производили осаждение ДНК на

45

нуклеосорбенте, в качестве которого использовали двуокись кремния.

Полученные образцы хранили при температуре 4˚С.

ПЦР-амплификация

Для синтеза ДНК использовали програмируемый амплификатор ДТ-96 (ДТ-

прайм), ДТ-322 (ООО "ДНК-Технология", г.Москва). Амплификацию проводили с

применением стандартной лиофилизированной реакционной смеси с буферной

системой (ООО"ИзоГен", Москва), которая подходит для для классической схемы

ПЦР. Также использовали Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq-

полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами в присутствии

красителя SYBRGreenI (ЗАО "Синтол", Москва).

Для проведения амплификации готовили реакционную смесь, состав

которой указан в таблице 2, конечный объем смеси для ПЦР составлял 2,5 мл с

учетом внесения бактериальной ДНК. Предварительно готовили микропробирки

«Эппендорф» объемом 0,5 мл, которые маркировали согласно протоколу

исследования.

Таблица 2

Пропорции амплификационной смеси

Компоненты Объем, мкл (на одну реакцию)

10 х ПЦР-буфер Б 2,5

DNTP 2,5

25 мМMgCl2 2,5

Деионизированная вода 15,5

Taq-полимераза 0,5

Праймеры 1,0

Концентрация и температура отжига праймеров были подобраны с

помощью программ GeneRunnеrVersion 3.05 и PrimerBlast (ресурсы GeneBank).

Выбранные пары праймеров проверялись на работоспособность и фактическую

специфичность, а также производилась оптимизация режима проведения ПЦР на

мyзейном штамме Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11 ( ВКПМ В-4347).

46

Программа амлификации состояла из нескольких эпатов, которые

представлены в таблице 3.

Таблица 3

Программа для амплификации ДНК

Для амплификаторов с активным регулированием (по раствору в пробирке)

«Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Россия)

№ цикла Шаг Температура Длительность Количество

повторов

1 1 94˚С 2 мин 1

2 1

2

3

95˚С

57˚С

72˚С

10 сек

10 сек

20 сек

35

3 1 72˚С 2 мин 1

После окончания реакции производили детекцию продуктов амплификации,

использовали метод горизонтального электрофоретического разделения

фрагментов ДНК в агарозном геле.

Детекция продуктов амплификации ДНК

После окончания реакции производили детекцию продуктов амплификации

ДНК с использованием метода горизонтального электрофоретического

разделения фрагментов ДНК в 2,3% агарозном геле. Электрофоретическое

разделение производили при напряжении электрического поля 15 В/см с

экспозицией 20 минут с использованием навески для приготовления которой в 1

литре дистиллированной воды растворили трис-боратную буферную смесь 0,089

М трис-борат, 0,089 М борную кислоту, 0,002 М ЭДТА (НПФ "ДНК-Технология",

Москва). В ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм регистрировали

продукты амплификации в виде оранжево-красных светящихся полос.

47

Полученные результаты электрофореза анализировали с помощью

видеосистемы, соединенной с ПК с помощью программы Gel Explorer и Gel

Analyzer для точной оценки размера ампликонов.

2.2.3. Показатели межвидового взаимодейсвия в бактериальном блоке ризосферы

и ризопланы томатов

Было проведено изучение горизонтальной структуры бактериального блока

ризосферы и ризопланы томатов, изучения динамики в бактериальном

сообществе и выявления экологической значимости бактериальных ассоциантов.

Для этого производили оценку таких критериев как, показатель постоянства,

видовое разнообразие, индекс экологической значимости, индекс контагиозности

(Крамарь, 2005; Сытник, 1989).

Степень участия различных представителей микробоценоза в его структуре

определяли с помощью показателя постоянства, который вычисляли по формуле

(Домбровский, Бодрягина, 1986):

C= %100P

p,где

С – показатель постоянства;

р – число выборок, содержащих изучаемый объект;

Р – общее число взятых образцов.

В зависимости от полученного значения виды подразделяли на: постоянные

- наличие более чем в 50 % образцов; добавочные - в 49 - 25 %; и случайные -

менее чем в 25 % образцов.

Видовое разнообразие сообществ микроорганизмов, населяющих различные

биотопы, определяли по формуле Р. Уиттекера (1980):

d=N

S, где

d – видовое разнообразие;

S – количество видов;

N – общая плотность бактерий.

48

По мнению Ю. Одум (1986), показатель видового разнообразия является

существенной характеристикой сообщества и говорит об уровне его

функциональной стабильности. Нетрусов отмечает, что видовое разнобразия в

сообществе может измененяться как при улучшении условий среды, так и при

ухудшении таких условий (Нетрусов, 2004).

Для характеристики микрофлоры как экологической системы, раскрытие еѐ

ценотической структуры применяли метод учѐта количественных соотношений

встречаемости определенных типологических групп микроорганизмов, используя

индекс флористической значимости (Даньшина, 2012). При помощи данного

показателя оценивали структуру микробоценоза и количественное соотношение в

нем определенных групп микроорганизмов (Крамарь, 2005). Определяли индекс

флористической значимостипо формуле, предложенной М.П. Наткевичайте-

Иванаускене (1985):

V =zmn

g

100,где

V – индекс значимости;

g – сумма встречаемости видов данной группы;

n – число описанных пробных площадок;

m – среднее число видов на пробной площадке;

z – число видов в данной группе.

С помощью индекса контагиозности выявляли характер пространственного

распределения экологических групп в биотопе (Уиттекер, 1980). Для расчета

использовали формулу:

UK=X

S,где

UK – индекс контагиозности;

S – выборочная дисперсия;

X – среднеарифметическая плотность.

При равномерном пространственном распределении экологических групп в

биотопе индекс контагиозности значительно меньше единицы. Случайному

49

распределению соответствует значение данного показателя равному единице. В

случае группового пространственного распределения индекс значительно больше

единицы (Сытник, 1989).

Снижение показателя индекса контагиозности облигатной флоры биотопа

свидетельствует об освобождении экологических ниш, которые успешно

занимают представители транзиторной микробиоты. При этом величина индекса

контагиозности не является эталоном всех форм биоценотических

взаимоотношений и необходимо изучить индекс значимости (Крамарь, 2005).

2.2.4. Методы определения биологических свойств ризобактерий

P.pseudoalcaligenes

Определяли механизмы прямого и непрямого влияния ризобактериальных

штаммов P.pseudoalcaligenes на томаты в процессе их вегетации. Для этого

исследованию подвергали состав жирных кислот клеточных мембран бактерий

данного вида, изолированных из прикорневой зоны растения. Определяли

поверхностные и адгезивные свойства P.pseudoalcaligenes с помощью атомно-

силовой микроскопии. Выявляли нуклеотидные последовательности гена,

кодирующего синтез L-триптофана, предшественника фитогормона ауксина, а

также антагонистическую активность штаммов данного вида, выделенного в

различные фазы вегетации томатов.

2.2.4.1. Газожидкостная хроматография состава жирных кислот клеточных

мембран P. pseudoalcaligenes

Определение жирно-кислотного состава экзополимерного комплекса

P.pseudoalcaligenes в зависимости от фазы вегетации растения производили

газово-жидкостной хроматографией на базе Центра коллективного пользования

«Симбиоз» Федерального государственного бюджетного учреждения науки

«Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» Российской

академии наук (г. Саратов).

50

При проведении газожидкостной хроматографии исользовали стандартный

протокол Microbial Identification System (MIS) (Sasser, 1990). Изучение жирно-

кислотного состава экзополимерного комплекса начинали с культивирования P.

pseudoalcaligenes на плотной питательнойсреде при 37оС экспозиция 24 ч. Для

выполнения сапонификации выделенную чистую культуру микроорганизмов с

помощью бактериальной петли (40мг) помещали в пробирку с 1 мл реагента: 45 г

гидроксида натрия, 150 мл метанола и 150 мл дистиллированной воды. Далее

взбалтывали пробирки и помещали их на водяную баню на 30 мин при

температуре 100оС.

Следующим этапом являлось метилирование жирных кислот, для чего

добавляли 2 мл реагента: 325 мл 6М соляной кислоты, 275 мл метанола.

Полученную смесь нагревали на водяной бане при температуре 80оС в течении 10

минут.

Далее производили экстракцию метиловых эфиров жирных кислот, для

этого в пробирку добавляли 1,25 мл реагента: 200 мл гексана и 200 млметил-терт-

бутилового эфира. С помощью вортекса встряхивали пробирки в течении 10 мин.

и наблюдали разделение двух фаз – нижней (водной) и верхней (органической).

Нижнюю фазу удаляли из пробирки с помощью пипетки.

В верхнюю органическую фазу вносили 3 мл реагента, который состоит из

18,8 г гидроксида натрия, растворенного в 900 мл дистиллированной воды,

полученную смесь взбалтывали в течении 5 минут. Пипеткой отбирали 2/3

органической верхней фазы и переносили их в стеклянные виалы объемом 2 мл.

При хроматографическом определении жирно-кислотного состава

экзополимерного комплекса P. pseudoalcaligenes пользовались газовым

хроматографом Shimadzu GC-2010 (Япония). Хроматорафическое разделение

компонентов выполняли на капиллярной колонке HP5MS диаметром 0,2 мм и

длиной 25 м, толщина слоя 0,33 мкм. Газ-носитель – гелий, скорость потока – 24

мл/мин, скорость потока через колонку –1,2 мл/мин. Используемый

температурный режим во время анализа: температура испарителя 280°С, при

начальной температуре термостата колонки 80°С, экспозиция 4 мин, далее нагрев

51

до 240°С со скоростью 7°С/мин, до 320°С со скоростью 15°С/мин, затем

термостатирование при 320°С до конца анализа. Объѐм анализируемой пробы – 2

мкл, общее время анализа – 35 мин, время задержки работы детектора – 4 мин.

2.2.4.2. Атомно-силовая микроскопия в изучении поверхностных и

колонизационно-адгезивных свойств P.pseudoalcaligenes

Изучение поверхностных и колонизационно-адгезивных свойств

ризобактерильных штаммов P.pseudoalcaligenes в процессе онтогенеза растения

производили с помощью сканирующего зондового микроскопа Solver P47-PRO

(NT-MDT, Россия) в лаборатории зондовой и электронной микроскопии научно-

исследовательского технологического института им. С.П. Капицы ФГБОУ ВО

«Ульяновский государственный университет».

Для сканирования образцов использовали зонды с золотым напылением

серии NSG10 (NT-MDT, Россия) размером 95х30 мкм, с жесткостью 17Н/м,

радиусом закругления иглы 10 нм и резонансной частотой 271 кГц. Применяли

полуконтактный метод, который дает возможность изучить количественные

параметры бактериальной клетки, а также увидеть дву- и трехмерные

изображения бактерий (Яминский,1997).

Каплю супензии ризобактерий бактерий в физиологическом растворе

(4мкл) помещали на поверхность подложки из свежесколотой слюды размером

6х6 мм2. Наблюдали с помощью АСМ сразу же после высыхания капли.

Первым этапом микроскопии регистрировали оптическое изображение

бактериальных клеток, затем выбирали участок образца с помощью механической

системы микропозиционирования при оптическом контроле положения зонда в

плоскости образца выбирали участок для АСМ-измерений. В результате получали

двумерные (2D) и трехмерные (3D) сканированные изображения. Изучение

морфологии и линейных размеров ризобактерий осуществляли путем обработки

полученных АСМ-изображений в программе DebugNova1.1.0.1847.

С помощью инструмента Analysis открывали изображение в новом окне, в

верхней части которого располагается панель инструментов. Length Instrument

52

позволял оценить линейные размеры - длину и ширину. С помощью

инструментов Center cross section и Arbitary cross section были получены

изображения с профилем фазового сдвига выбранной области образца, а X cross

section и Y cross section- по осям Х и Y соответственно. Профиль фазового сдвига

позволял оценить высшую и низшую точку образца, что, в свою очередь, дало

возможность вычислить третий параметр - высоту бактериальной клетки.

Изменение контраста и четкости изображения достигалось благодаря

функции Z coloration и Smooth Switcher. Изучение ультраструктуры

бактериальных клеток и их поверхностей было возможным благодаря 3D

изображению, которое получали с помощью инструмента 2D/3D Image

representation. Использование функции 3D light sourse position позволило изменять

уровень освещенности в различных точках полученного изображения. Благодаря

возможности перемещения в двух плоскостях на 360º получали изображение в

удобном ракурсе.

2.2.4.3. Определение антагонистических свойств P.pseudoalcaligenes по

отношению к бактериальным фитопатогенам

Наличие антагонистической активности у ризосферных микроорганизмов

определяли методом диффузии в агар.

В качестве бактерий-антагонистов использовали культуры фитопатогенов,

вызывающих поражение овощных культур:Pectobacterium carotovora subsp

carotovora (Jones, 1901, Bergeyetai, 1923) – возбудителя мягких гнилей овощных

культур и Pseudomonas syringae pv. lachrymans (Smith, Bryan, 1915, Carnser,1918) –

возбудителя угловатой пятнистости овощных культур.

Культуры фитопатогенов были предоставлены Государственной коллекцией

фитопатогенных микроорганизмов и сортов-идентификаторов патогенных

штаммов микроорганизмов ФГБНУ «Всероссийским научно-исследовательским

институтом фитопатологии».

53

В качестве тест-культуры были использованы штаммы Pseudomonas

pseudoalcaligenes, выделенные из прикорневой зоны томатов в различные фазы

вегетации.

На поверхности МПА в чашке Петри производили посев радиальным

штрихомтест-культуры исследуемых ризосферных штаммов - Pseudomonas

pseudoalcaligenes и инкубировали при температуре 370 С в течение 48 ч.По

истечении этого срока между полосками колоний штамма-антагониста засевали

прерывистым кругом испытуемые культуры фитопатогенов, к которым ожидали

проявление антагонистического действия. Посев производили таким образом,

чтоб испытуемые культуры не соприкасались с радиальными штрихами штамма-

антагониста, а отступали на 1-2 мм от них. О наличии и степени

антагонистической активности судили по отсутствию роста вокруг радиального

штриха тест-культуры. Зону лизиса измеряли в мм.

2.3. Методы статистического анализа данных

Полученные в ходе исследований численные материалы были обработаны

статистически с определением средних значений, среднего квадратичного

отклонения, средней ошибки средней, различие считались достоверными для

уровня значимости p<0.05. Статистическая обработка данных проводилась с

помощью автоматизированных программ «Биостатистика» и Microsoft Office

Excel 2007.

54

ГЛАВА 3. БАКТЕРИИ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ LYCOPERSICON

ESCULENTUM MILL.

3.1. Бактериальный комплекс прикорневой зоны Lycopersicon esculentum Mill.

В работе был исследован микробиоценоз ризосферы (140 образцов) и

ризопланы (140 образцов) L. esculentum Mill. в различные фазы вегетации - в фазу

всходов, бутонизации, цветения и плодоношения. В каждый из периодов

вегетации растения было отобрано и изучено по 35 образцов корневых смывов

ризосферы и ризопланы.

Установлено, что культивируемый блок ризосферы и ризопланы томатов,

включает представителей 8 семейств: Moraxellaceae, Micrococcaceae,

Pseudomonadaceae, Alcaligenaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae,

Burkholderiaceae и Shewanellaceae.

Семейства Alcaligenaceae, Micrococcaceae, Burkholderiaceae и

Shewanellaceae были представлены каждое одним родом и видом. Семейства

Moraxellaceae, Bacillaceae и Pseudomonadaceae – одним родом и двумя видами. И

семейство Enterobacteriaceae включало два рода и три вида микроорганизмов

(табл. 4).

Таблица 4

Структура культивируемой части бактериального блока прикорневой зоны

Lycopersicon esculentum Mill.

№

п/п Семейства

Роды Виды

1. Moraxellaceae Acinetobacter A.iowffii

A.calcoaceticus

2. Pseudomonadaceae Pseudomonas P.pseudoalcaligenes

P. fluorescens

3. Alcaligenaceae Alcaligenes A.faecalis

4. Micrococcaceae Arthrobacter A. globiformis.

4. Enterobacteriaceae Enterobacter

E.aerogenes

E. intermedius

55

Klebsiella K.mobillis

5. Bacillaceae Bacillus B.subtilis

B.megaterium

6. Burkholderiaceae Burkholderia B.mallei

7. Shewanellaceae Shewanella S. putrefaciens

Установлено, что видовой состав в исследуемой группе бактерий ризосферы

и ризопланы томатов изменялся в зависимости от фазы вегетации. Представители

семейства Moraxellaceae, Shewanellaceae и Alcaligenaceae были выделены из

прикорневой зоны томатов только в фазу всходов.

В фазу бутонизации, цветения и плодоношения изолировали

представителей семейств Pseudomonadaceae, Micrococcaceae, Burkholderiaceae,

Enterobacteriaceae и Bacillaceae.

В фазу всходов из исследуемой группы бактерий прикорневой зоны томатов

изолировали представителей 7 семейств – Moraxellaceae, Alcaligenaceae,

Micrococcaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Shewanellaceae и

Bacillaceae. Видовой состав включал Acinetobacter iowffii, Acinetobacter

calcoaceticus, Arthrobacter globiformis, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Alcaligenes

faecalis, Enterobacter aerogenes, Shewanella putrefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus

megaterium.

В фазу бутонизации были обнаружены микроорганизмы 5 семейств

Micrococcaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae,

Burkholderiaceae. Видовой состав - A. globiformis, P. pseudoalcaligenes, P.

fluorescens, E. aerogenes, E. intermedius, K. mobillis, B. mallei, B. subtilis, B.

megaterium.

Для фазы цветения отмечали микроорганизмов 5 семейств Micrococcaceae,

Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Burkholderiaceae, которые

были представлены следующимивидами - A. globiformis, P. pseudoalcaligenes,

P.fluorescens, E. aerogenes, E.intermedius, K. mobillis, B. mallei, B. subtilis (табл.5).

56

В фазу плодоношения изолировали ризобактерии 5 семейств

Micrococcaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae,

Burkholderiaceae, которые были представлены следующими видами - A.

globiformis, P. pseudoalcaligenes, P.fluorescens, E. aerogenes, E.intermedius, K.

mobillis, B. mallei, B. subtilis.

Таблица 5

Видовое разнообразие исследуемой ризобактерий в разные вегетационные

периоды томатов

Фаза всходов Фаза

бутонизации

Фаза цветения Фаза

плодоношения

A.iowffi + - - -

A.calcoaceticus + - - -

A. faecalis + - - -

S. putrefaciens + - - -

A. globiformis + + + +

P. pseudoalcaligenes + + + +

P.fluorescens - + + +

B.mallei - + + +

E.aerogenes + + + +

E.intermedius - + + +

K.mobillis - + + +

B.subtilis + + + +

B.megaterium + + - -

Таким образом, видовой состав исследуемой группы ризобактерий

L.esculentum Mill. включал восемь семейств, девять родов и тринадцать видов.

Виды P. pseudoalcaligenes, A. globiformis, E.aerogenes и B.subtilis встречались во

все фазы вегетации в ризосфере и ризоплане томатов. Ризобактериальные

штаммы вида B.megaterium были выделены в фазу всходов и бутонизации. Также

в фазу бутонизаци и последующие фазы отмечали наличие новых видов, таких

57

как B.mallei, K.mobillis, P.fluorescens и E.intermedius. Виды A.iowffii,

A.calcoaceticus, A.faecalis и S.putrefaciens выделяли в фазу всходов растения в

другие периоды развития растения данные микроорганизмы не высевались из

прикорневой зоны.

3.2. Биологические свойства ризобактерий прикорневой зоны томатов

Представители семейства Moraxellaceae относились к одному роду

Acinetobacter. Ризобактерии данного рода имели палочковидную форму,

отмечалась способность к образованию капсулы, по Граму окрашивались

отрицательно (рис. 3а).

A.calcoaceticus обладал подвижностью, вид. A. iowffii не имел способности к

движению. Были не требовательны к питательным средам (МПА). На

питательных средах образовывали непигментированные или желто-бежевого

цвета колонии маслянистой консистенции, выпуклые, блестящие с ровным краем,

на среде Эндо образовывали лактозонегативные колонии (рис. 3б).

На кровяном агаре давали выпуклые серовато-белые колонии с зоной β-

гемолиза. Представители данного рода обладали типичными биохимическими

свойствами неферментирующих бактерий (табл. 6).

а) б)

Рис. 3. а) морфология бактерий рода Acinetobacter, окраска по Граму,

световая микроскопия. Увеличение 16×100; б) лактозонегативные

колониипредставителей рода Acinetobacter на среде Эндо

58

Семейство Alcaligenaceae, представленное одним видом A.faecalis – по

морфологическим свойствам представляли собойкороткие одиночные

грамотрицательные палочки (рис.4). Проба Шукевича на подвижность

положительная, рост бактерий по поверхности скошенного агара. На питательных

средах давали рост в виде непигментированных колоний. На кровяном агаре

образовывали прозрачные мелкие колонии. Данный вид обладал типичными

биохимическими свойствами (табл. 6).

Рис.4. Морфология A.faecalis

Окраска по Граму. Увеличение 16×100

Семейство Shewanellaceae включало один вид S. putrefaciens на МПА

данные микроорганизмы давали рост в виде полупрозрачных слизистых

выпуклых колоний, размером 2,3±1,4 мм. На агаре Мак Конки образовывали

колонии желто-коричневого цвета. Бактерии обладали подвижностью. По граму

окрашивались отрицательно, имели палочковидную форму. Микроорганизмы

обладали типичными биохимическими свойствами.

Семейство Micrococcaceae было представлено в ризосфере и ризоплане

томатов одним видом A. globiformis. Данные бактерии имели вид

грамположительных кокковидных клеток не способных к образованию эндоспор.

На плотных питательных средах образуют бесцветные круглые гладкие колонии,

с ровным краем, диаметром 1,5 - 2,0 мм (табл.6).

59

Таблица 6

Биохимические свойства ризобактерий семейств Moraxellaceae, Alcaligenaceae и

Shewanellaceae

Биохимические свойства

A. io

wff

ii

A. ca

lcoace

ticu

s

A. fa

ecali

s

S.p

utr

efaci

ens

A. glo

bif

orm

is

Разжижение желатина – – – + +

Расщепление мочевины + + –

Выделение лизиндекарбоксилазы – – –

Выделение аргининдекарбоксилазы – + –

Чувствительность к пенициллину – + +

Выделение сероводорода – – – +

Выделение индола – – –

Рост на среде Симмонса с цитратом натрия – + +

Выделение оксидазы – + + +

Ферментация 10% лактозы – – – +

Окисление глюкозы OF – +/–* – + +

* - 40% штаммов A. faecalis окисляли глюкозу OF, 60% штаммов –нет.

Виды семейства Pseudomonadaceae - P. pseudoalcaligenes и P. fluorescens

имели вид неспоробразующих прямых или изогнутых грамотрицательных.

Изучение культуральных свойств показало, что данные микроорганизмы на среде

Эндо образовывали кремовые лактозонегативные колонии (рис.5), на кровяном

агаре отмечали рост в виде серо-белых колоний,обладали подвижностью.

60

Рис. 5. Лактозонегативные колонии P.pseudoalcaligenes на среде Эндо

Для видовой идентификации бактерий рода Pseudomonas определяли

флюоресценцию в УФ свете и биохимические тесты (табл.7).

Таблица 7

Биохимические тесты для бактерий рода Pseudomonas

Биохимические свойства P.pseudoalcaligenes P. fluorescens

Разжижение желатина – +

Расщепление мочевины +

Выделение лизиндекарбоксилазы – –

Выделение аргининдегидролаза + +

Чувствительность к пенициллину –

Выделение сероводорода – –

Выделение индола – –

Рост на среде Симмонса с цитратом натрия +

Выделение оксидазы + +

Выделение каталазы + +

Ферментация 10% лактозы – –

Окисление глюкозы OF +/–* +

*+/- - признак вариабелен

61

Семейство Burkholderiaceae представлено видом B.mallei. Имели вид

грамотрицательных тонких, слегка изогнутых палочек с закругленными концами.

Не обладали подвижностью и способностью образовывать споры. На

питательных средах отмечали рост в виде серых гладких прозрачных колоний. По

биохимическим свойствам не разжижали желатин, не ферментировали мочевину,

давали отрицательную пробу на лизиндегидролазу, оксидазоотрицательные.

Семейство Enterobacteriaceae было представлено двумя родами Enterobacter

и Klebsiella.

Представители рода Enterobacter – имели видпрямых мелких

грамотрицательных неспорообразующих палочек. Посев по методу Шукевича

давал рост по всей поверхности агара, что характерно для обладающих

подвижностью микроорганизмов. При посеве на среду Эндо дают рост в виде

малиновых лактозопозитивных колоний (рис.6а).

K.mobillis – были представлены прямыми,крупными неподвижными

палочками, расположенными одиночно,в парах или в коротких цепочках.

Обладали способностью к капсулообразованию. Изучение культуральных свойств

показало способность данного вида расти на простых питательных средах, на

среде Эндо образовывали лактозопозитивные колонии (рис.6б).

а) б)

Рис. 6. Лактозопозитивные колонии бактерий рода Enterobacter (а) и

Klebsiella (б) на среде Эндо

62

Для видовой идентификации E. intermedius, E. aerogenes и K. mobillis

опрежеляли их биохимические свойства (табл.8).

Таблица 8

Биохимические тесты бактерий семейства Enterobacteriaceae

Биохимические свойства

E. in

term

ediu

s

E.a

erogen

es

K.m

obil

lis

Расщепление мочевины – – –

Выделение лизиндекарбоксилазы – + +

Выделение орнититндекарбоксидазы + + +

Выделение фенилаланиндезаминазы – –

Выделение сероводорода – –

Выделение индола – –

Рост на среде Симмонса с цитратом натрия + + +

Расщепление малоната натрия + + +

Реакция Фогеса- Проскауэра + +

Выделение оксидазы –

Окисление глюкозы OF + +

Виды, относящиеся к семейству Bacillaceae имели вид грамположительных

палочковидных подвижных микроорганизмов, способных образовывать

эндоспоры.

Изучение культуральных свойств рода Bacillus показало их способность

расти на простых питательных средах (МПА) с образованием серовато-белых

колоний с неровным краем, на кровяном агаре образовывали белые крупные

колонии без зон гемолиза (рис.7).

63

Рис.7. Рост Bacillus на кровяном агаре

Видовую идентификацию проводили с помощью определения

биохимических свойств ризобактерий (табл. 9).

Таблица 9

Биохимические свойства B. subtilis и B. megaterium

Биохимические свойства B. subtilis B. megaterium

Расщепление мочевины – +

Реакция Фогеса- Проскауэра + –

Выделение каталазы + –

Выделение лецитиназы – –

Выделение гемолизина – –

Ферментация крахмала + +

Ферментация маннита + –

Следовательно, изолированные штаммы ризобактерий обладали типичными

морфологическими, тинкториальными и культурально-биохимическими

свойствами.

64

3.3. Численность ризобактерий в различные вегетационные периоды томатов

Изучали изменение численности бактериального комплекса ризосферы и

ризопланы томатов в процессе онтогенеза растения. Данный количественный

показатель регистрировали в фазы всходов, бутонизации, цветения и

плодоношения томатов.

Установлено, что численность микроорганизмов ризосферы и ризопланы

томатов различна. Более плотно заселенной нишей бактериями являлась

ризосфера во всех вегетационных периодах томатов. Так в фазу всходов общая

численность ризосферы (8,8*±2,73 lgКОЕ/г) и была достоверно выше численности

ризопланы (3,59*±1,45 lgКОЕ/г) в 2,4 раза. В фазу бутонизации общая

численность в ризосфере превышала показатель ризопланы в 2,3 раза и составляла

40,56*±7,52 lgКОЕ/г в ризоплане 17,48*±6,2 lgКОЕ/г. В фазу цветения и

плодоношения отмечали также достоверное превышение показателя общей

численности бактерий ризосферы над ризопланой в 2,2 (79,91*±10,34 lgКОЕ/г и

39,49*±6,92 lgКОЕ/г) и 2,3 раза (170,57*±35,15 lgКОЕ/г и 73,43*±13,75 lgКОЕ/г)

соответственно. Спорообразующие микроорганизмы ризосферы по численности

также превышали показатель ризопланы, в фазу всходов в 2,1 раз, в фазу

бутонизации, цветения и плодоношения в 4,8, 1,3 и 1,8 раз соответственно.

Микроорганизмы не образующие спор имели схожую динамику и их превышение

численности ризосферы над ризопланой составили - в 2,6 раза в фазу всходов, в

2,3 раза в фазу бутонизации, в 2,2 равза в фазу цветения и в 2,3 раза в фазу

плодоношения томатов. Численность отдельных представителей микробиоты

ризосферы также превышала в два и более раз численность микроорганизмов

ризопланы.

В фазу всходов общая численность исследуемой группы бактерий в

ризосфере томатов составляла 8,80±2,73 lgКОЕ/г почвы, из которой на

численность ризобактерий не образующих спор приходилось 6,53±2,32 lgКОЕ/г

почвы и на спорообразующие приходилось 2,27±0,38 КОЕ/г почвы. В ризоплане в

данную фазу вегетации численность бактерий составляла 3,59±1,45 lgКОЕ/г

корней, из которой на спорообразующих приходилось лишь 1,08±0,27 lgКОЕ/г

65

корней, численность ризобактерий не способных к спорообразованию составляла

2,51±1,18 lgКОЕ/г корней.

В период бутонизации отмечали рост численности бактерий как в

ризосфере, так и в ризоплане. Так в ризосфере численность ризобактерий

увеличилась в 4,6 раз и составил 40,56±7,52 lgКОЕ/г почвы, в ризоплане данный

показатель увеличился в 4,9 раза и его значение 17,48±6,2 lgКОЕ/г корней. При

этом рост численности отмечали только для ризобактерий не способных к

спорообразованию, и в ризосфере их показатель составлял 39,45±7,07 lgКОЕ/г

почвы, в ризоплане 17,25±6,16 lgКОЕ/г корней. Численность спорообразующих

бактерий в ризосфере снизилась до 1,11±0,15 lgКОЕ/г почвы, что в 2,4 раза

меньше по сравнению с предыдущей фазой, в ризоплане до 0,23±0,06 lgКОЕ/г

корней, в 4,7 раз меньше.

Во время цветения растения численность ризобактерий увеличилась и

составляла в ризосфере 79,91±10,34 lgКОЕ/г почвы, что в 2 раза превышает

данный показатель в фазу бутонизации. Отмечали увеличение численности

неспорообразующих ризобактерий, их значение в ризосфере 79,76±10,3 lgКОЕ/г

почвы, численность спорообразующих бактерий составляла 0,15±0,04 lgКОЕ/г

почвы, что меньше в 7,4 раза чем данный показатель в предыдущую фазу. В

ризоплане численность ризобактерий составляла 36,49±6,92 lgКОЕ/г корней, из

которых лишь 0,12±0,01 lgКОЕ/г корней приходилось на спорообразующие

бактерии, что меньше в 1,9 раз данного показателя в фазу бутонизации,

численность неспорообразующих составляла 36,37±6,91 lgКОЕ/г корней.

На стадии плоношения отмечали следующие показатели численности

ризобактерий томатов – в ризосфере 170,57±35,15 lg КОЕ/г почвы, что в 2,1 раза

больше данного показателя в фазу цветения, и в ризоплане 73,43±13,75 lgКОЕ/г

корней, что в 2 раза превышает показатель численности в предыдущую фазу

вегетации. Численность неспорообразующих бактерий составляла в ризосфере

170,48±35,12 lgКОЕ/г почвы, в ризоплане 73,38±13,74 lgКОЕ/г корней.

Спорообразующие бактерии в данную фазу вегетации имели самые низкие

значения и их численности в ризосфере составляла 0,09±0,03 lgКОЕ/г почвы, что

66

ниже данного показателя в фазу цветения в 1,6 раза, в ризоплане 0,05±0,01 lg

КОЕ/г корней, что меньше в 2,4 раза.

Показано, что общая численность ризобактерий бактериального комплекса

увеличивается в процессе онтогенеза растения, так в ризосфере в фазу всходов

общая численность ризобактерий составляла 8,80±2,73 lgКОЕ/г, в фазу

плодоношения растения данный показатель в ризосфере составлял 170,57±35,15

lgКОЕ/г, что в 19,4 раза превышает численность на ранних сроках развития

растения. В ризоплане в фазу всходов показатель численности составлял

3,59±1,45 lgКОЕ/г, в фазу плодоношения 73,43±13,75 lgКОЕ/г, что выше в 20,5

раз. Численность микроорганизмов увеличивалась за счет роста количества

ризобактерий не способных к спорообразованию, во всех фазах вегетации

отмечали рост данных бактерий (рис.8).

Рис.8. Динамика численности исследуемой бактерий, не образующих споры в

ризосфере и ризоплане в различные периоды вегетации Lycopersicon esculentum

Mill.

0

50

100

150

200

250

Численность

ризобактерий

lgКОЕ/гБактерии ризосферы, не

образующие спор

Бактерии ризопланы, не

образующие спор

67

В фазу всходов показатель численности бактерий, не образующих споры в

ризосфере составлял 6,53±2,32 lgКОЕ/г в фазу плодоношения 170,48±65,12

lgКОЕ/г, в ризоплане соответственно 2,27±0,38 lgКОЕ/г и 73,38±33,74 lgКОЕ/г.

Численность спорообразующих бактерий уменьшалась в процессе

онтогенеза, так в фазу всходов отмечали численность в ризосфере 2,51±1,18

lgКОЕ/г в ризоплане 1,08±0,28 lgКОЕ/г, в заключительной фазе вегетации

растения отмечали численность соответственно 0,09±0,03 lgКОЕ/г и 0,05±0,01

lgКОЕ/г (рис.9).

Рис.9. Изменение численности спорообразующих бактерий в ризосфере и

ризоплане в различные периоды вегетации Lycopersicon esculentum Mill.

Анализ показателей численности отдельных видов в исследуемой группе

ризосферы и ризопланы томатов выявил, что максимальные значения

численности видов ризосферы отмечалось у A.iowffii, B.subtilis и

P.pseudoalcaligenes. В фазу всходов их показатели составили соответственно

1,50±0,50 lgКОЕ/г почвы, 1,52±0,26 lgКОЕ/г почвы и 2,74±0,90 lgКОЕ/г почвы.

Для ризопланы в данный период вегетации видами с максимальными

показателями численности явились также A.iowffii, B.subtilis и P.pseudoalcaligenes.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Численность

ризобактерий

lgКОЕ\гСпорообразующие бактерии

ризосферы

Спорообразующие бактерии

ризопланы

68

Их показатели составили соответственно 0,60±0,26 lgКОЕ/г корней, 0,92±0,18

lgКОЕ/г корней и 1,14±0,52 lgКОЕ/г корней (табл.10).

В период бутонизации растения максимальные показатели численности

среди ризосферных видов бактерий были у P.pseudoalcaligenes 15,00±4,04*

lgКОЕ/г почвы, P.fluorescens 7,03±2,51* lgКОЕ/г почвы и E.aerogenes 6,46±3,73*

lgКОЕ/г почвы. В ризоплане показатели численности этих же видов были

максимальными и составляли соответственно 6,25*±1,69 lgКОЕ/г корней,

2,96±1,03* lgКОЕ/г корней и 3,00±1,02* lgКОЕ/г корней.

Максимальные показатели численности в период цветения томатов, как в

ризосфере, так и в ризоплане отмечали для видов P. pseudoalcaligenes,

P.fluorescens и E.aerogenes. Их значения в ризосфере составляли соответственно

26.00±5.09* lgКОЕ/г почвы, 12,01±4,02* lgКОЕ/г почвы и 15,00±3,21* lgКОЕ/г

почвы. Для ризопланы отмечали иные показатели численности данных видов

10.00±1.56* lgКОЕ/г корней, 6,57±1,22* lgКОЕ/г корней и 6,00±1,17* lgКОЕ/г

корней соответственно.

Таблица 10

Численность микроорганизмов ризосферы и ризопланы томатов в разные фазы

вегетации (lgКОЕ)

Ризосферные

штаммы

Фаза

всходов

Фаза

бутонизации

Фаза

цветения

Фаза

плодоношения

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

A.iowffii 1,50

±0,50

0,60

± 0,26

- - - -

A.calcoaceticus 1,17

±0,50

0,40

± 0,17

- - - - - -

A.faecalis 0,41

±0,22

0,10

± 0,08

- - - - - -

69

S.putrefaciens 0,24

±0,11

0,07

±0,03

- - - - - -

A. globiformis 0,18*

±0,09

0,11*

±0,06

4,16*

±1,53

2,01*

±0,94

8,00*

±1,21

6,00*

± 1,09

17,00*

±6,25

10,00*

±2,31

P.pseudoalcaligenes 2,74*

±0,90

1,14*

± 0,52

15,00*

± 4,04

6,25*

±1,69

26,00*

±5,09

10,00*

± 1,56

52,40*

±11,70

14,62*

±2,56

P.fluorescens - - 7,03*

±2,51

2,96*

±1,03

12,01*

±4,02

6,57*

±1,22

30,76*

±8,06

14,55*

± 2,23

B. mallei - - 5,0*

±0,30

2,50*

±0,21

7,00*

± 1,14

3,40

±0,51

19,99*

±5,82

8,00*

±3,85

E.aerogenes 0,29*

±0,15

0,09*

±0,06

6,46*

±3,73

3,00*

±1,02

15,00*

± 3,21

6,00*

± 1,17

27,00*

±6,29

12,00*

± 3,51

E.intermedius 0,30*

±0,09

0,18*

±0,05

3,75*

±1,55

2,04*

±0,40

7,33*

±1,10

3,21*

±0,60

K.mobillis - - 1,50*

±0,87

0,35*

±0,22

8,00*

±1,23

2,36*

±1,36

16,00*

±4,90

11,0*

±5,28

B.subtilis 1,52*

± 0,26

0,92*

± 0,18

0,95*

±0,08

0,15*

±0,03

0,15*

± 0,04

0,12

±0,01

0,09*

±0,03

0,05

± 0,01

B.megaterium 0,75*

±0,12

0,16

±0,06

0,16*

±0,07

0,08

± 0,03

- - - -

Примечание: * - показатель достоверности различия численности

микробиоты ризосферы и ризопланы в зависимости от фазы вегетации растения

(р<0,05)

В фазу плодоношения преобладающими видами ризосферы томатов были

P.pseudoalcaligenes, P.fluorescens и E.aerogenes, их показатели численности

составляли соответственно 52,40±11,70 lgКОЕ/г почвы, 30,76±8,06 lgКОЕ/г почвы

и 27,00±6,29 lgКОЕ/г почвы. Для ризопланы численность данных видов

составляла соответственно 14,62±2,56 lgКОЕ/г корней, 14,55±2,23 lgКОЕ/г корней

и 12,00±7,51 lgКОЕ/г корней.

Установлено, что максимальные показатели численности отмечались у

P.pseudoalcaligenes и в ризосфере, и в ризоплане в течение всего периода

вегетации томатов. В фазу всходов численность данного вида в ризосфере

70

составляла 2,74±0,90 lgКОЕ/г почвы, в ризоплане 1,14±0,52 lgКОЕ/г корней, в

фазу бутонизацииэтот показатель в ризосфере возрос в 5,5 раз и составил

15,0±4,04 lgКОЕ/г почвы, в ризоплане – в 5,5 раза (6,25±1,69 lgКОЕ/г корней).

В дальнейшем онтогенезе происходило увеличение численности данного

вида ризобактерий в ризосфере и ризоплане томатов. В фазу цветения показатель

численности в ризосфере увеличился в 1,7 раз в ризоплане в 1,6 раз и составил

соответственно 26,0±5,09 lgКОЕ/г почвы и 10,0±1,56 lgКОЕ/г корней. В фазу

плодоношения увеличение численности ризоабктерий происходит в 2 раза в

ризосфере и в 1,5 раза в ризоплане, соответственно составляли 52,40±11,70

lgКОЕ/г почвы и 14,62±2,56 lgКОЕ/г корней.

Вид E.aerogenes изолировали из ризосферы и ризопланы в течение всего

онтогенеза растения и его показатели численности были также высокими во все

фазы вегетации. В ризосфере его численность составляла 0,29±0,15 lgКОЕ/г

почвы, в фазу бутонизации 6,46±3,73 lgКОЕ/г почвы, в фазу цветения 15,00±3,21

lgКОЕ/г почвы и в фазу плодоношения 27,00±6,29 lgКОЕ/г почвы. В ризоплане

0,09±0,06 lgКОЕ/г корней в период всходов, 3,00±1,02 lgКОЕ/г корней

бутонизации, 6,00±1,17 lgКОЕ/г корней цветения и в перио плодоношения

численность составляла 12,00±3,51 lgКОЕ/г корней.

В фазу всходов максимальные значение численности показали также виды

A.iowffii и B.subtilis, их значения в ризосфере составляли соответственно 1,50±0,50

lgКОЕ/г почвы и 1,52±0,26 lgКОЕ/г почвы, в ризоплане значение численности

составляло соответственно 0,6±0,26 lgКОЕ/г корней и 0,92±0,18 lgКОЕ/г корней.

Однако A.iowffii изолировали лишь в период всходов растения, а численность

B.subtilis в последующие фазы вегетации показывал минимальные значения.

Для оценки типа ризосферного эффекта в прикорневой зоны томатов

определяли соотношение численности микроорганизмов в ризосфере и почве R/S

(rhizospherе/soil – ризосфера/почва) в процессе развития растения. Значение

данного показателя достоверно увеличивалось в процессе вегетации томатов по

сравнению с начальной фазой развития растения, так в фазу всходов R/S составил

71

0,91±0,3, в фазу бутонизации - 5,29±1,2*, в фазу цветения и плодоношения

17,95±2,1* и 24,7±2,9* соответственно).

3.4. Частота встречаемости ризобактерий в различные вегетационные периоды

томатов

Отмечали изменение частоты встречаемости в исследуемой группе ризосферы

и ризопланы в процессе различные фазы вегетации томатов. Показатели частоты

встречаемости ризобактерий томатов показаны в таблице 11.

Таблица 11

Показатели частоты встречаемости ризобактерий в процессе вегетации

томатов (%)

Ризосферные

штаммы

Фаза

всходов

Фаза

бутонизации

Фаза

цветения

Фаза

плодоношения

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

ри

зосф

ера

ри

зоп

лан

а

A.iowffii 77,6

±5,2

64,4

±3,4

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

A.calcoaceticus 70,6

±4,0

57,5

±3,2

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

A.faecalis 68,1

±3,4

48,8

±2,3

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

S.putrefaciens 44,0

±2,2

31,2

±3,5

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

A.globiformis 53,6*

±2,6

50,6*

±2,2

59,8*

±3,1

51,9

±4,2

66,4*

±2,1

53,7

±3,0

67,2

±2,8

55,6*

±1,9

P.pseudoalcaligenes 78,3*

±1,3

67,5*

±1,5

82,6*

±2,5

74,4*

±2,1

88,6*

±2,6

81,5*

±2,8

94,6*

±2,4

87,5*

±2,6

P.fluorescens 0,0 0,0 64,5*

±3,9

60,1*

±3,1

80,2*

±2,3

70,9*

±4,1

85,4*

±2,4

79,3*

±3,2

72

B. mallei 0,0 0,0 64,4*

±5,1

61,3*

±5,4

77,5*

±4,3

81,3*

±2,1

84,4*

±2,0

83,9

±2,4

E.aerogenes 65,0*

±3,4

48,9*

±3,6

73,0*

±3,2

58,8*

±3,1

79,1*

±2,3

70,9*

±2,6

81,3

±5,5

78,1*

±3,8

E.intermedius 0,0 0,0 46,3*

±2,3

32,1*

±3,5

58,3*

±3,6

52,1*

±5,5

70,3*

±4,6

70,1*

±4,1

K.mobillis 0,0 0,0 61,3*

±3,3

58,1*

±2,9

70,6*

±2,3

68,3*

±2,9

78,1*

±3,9

75,8*

±2,0

B.subtilis 76,0*

±3,3

48,6*

±4,0

52,5*

±2,9

42,0*

±2,2

38,8*

±2,9

26,9*

±1,9

30,5*

±1,6

20,3*

±2,9

B.megaterium 50,0*

±2,1

44,0*

±4,2

43,1*

±2,4

36,9*

±2,5

0,0 0,0 0,0 0,0

Примечание: * - показатель достоверности различия частоты встречаемости

микроорганизмов ризосферы и ризопланы в зависимости от фазы вегетации

растения (р<0,05)

В фазу всходов показатели частоты встречаемости были высокими для

видов A.iowffii и P.pseudoalcaligenes и B. subtilis в ризосфере, они составили

77,6±5,2%, 78,3±1,3% и 76,0±3,3% соответственно, в ризоплане A. iowffii, A.

calcoaceticus и P. pseudoalcaligenes – 64,4±3,4%, 57,5±3,2% и 67,5±4,0%

соответственно.

В фазу бутонизации максимальные значения частоты встречаемости

показаны у вида P.pseudoalcaligenes, в ризосфере и ризоплане данный показатель

составил 82,6±2,5% и 74,4±2,1% соответственно, для вида E. аerogenes 73,0±3,2%

и 58,8±3,1% соответственно и P.fluorescens, его показатели частоты

встречаемости в ризосфере и ризоплане составляют соответственно 64,5±3,9%,

60,1±3,1%.

В фазу цветения томатов ризобактерии, имеющие высокий показатель

частоты встречаемости относились к видам P.pseudoalcaligenes и его занчение в

ризосфере 88,6±2,6% и в ризоплане 81,5±2,8%. P.fluorescens в ризосфере показал

80,2±2,3% в ризоплане 70,9±4,1%. У вида E.aerogenes частота встречаемости в

ризосфере составила 79,3±2,3% и ризоплане 70,9±2,6%.

73

В период плодоношения опытного растения наиболее часто из ризосферы и

ризопланы изолировали вид P.pseudoalcaligenes и его значения соответственно

94,6±2,4% и 87,5±2,6%. Для B.mallei частота встречаемости составила 84,4±2,0% в

ризосфере и 83,9±2,4% в ризоплане. Высокие показатели частоты встречаемости

отмечали также для P.fluorescens и в ризосфере этот показатель составлял

85,4±2,4%, в ризоплане 79,3±3,2%.

Установлено, что в исследуемой группе бактерий наиболее высокие

показатели частоты встречаемости отмечали у видов P.pseudoalcaligenes и E.

aerogenes, которые были выделены во всех вегетационных фазах прикорневой

зоны томатов. В фазу всходов высокие показатели частоты встречаемости

установлены для вида A.iowffii, однако данный вид не выделяли в другие

вегетационные периоды. В фазы бутонизации, цветения и плоношения высокие

значения частоты встречаемости отмечали для P.fluorescens, B.mallei и K. mobillis.

На протяжении всего онтогенеза растения выявлено превышение

численности как спорообразующих, так и неспорообразующих микроорганизмов

ризосферы над данным показателем ризопланы.

3.5. ПЦР идентификация ризобактерий вида P.pseudoalcaligenes

Произведена видовая идентификация ризосферных штаммов, имеющих

максимальные значения в прикорневой зоне томатов в течении всего развития

растения. Для этого с помощью баз данных GeneBank (США), EMBL

(Европейская молекулярно-биологическая библиотека) был изучен нуклеотидный

состав. гена 16S рРНК Pseudomonas pseudoalcaligenes (рис. 10) и проведен подбор

праймеров для ПЦР (табл.12).

Pseudomonas pseudoalcaligenes partial 16S rRNA gene, strain BE172

GenBank: LT601337.2

FASTA Graphics Go to:

LOCUS LT601337 1131 bp DNA linear BCT 07-JUN-2018

DEFINITION Pseudomonas pseudoalcaligenes partial 16S rRNA gene, strain BE172.

ACCESSION LT601337

VERSION LT601337.2

74

KEYWORDS .

SOURCE Pseudomonas pseudoalcaligenes

ORGANISM Pseudomonas pseudoalcaligenes

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales;

Pseudomonadaceae; Pseudomonas; Pseudomonas

oleovorans/pseudoalcaligenes group.

REFERENCE 1

AUTHORS Eduardo-Correia,B., Morales Filloy,H. and Abad,J.P.

TITLE Multiresistance to different antibiotics among aquatic bacteria

from the Huelva estuary

JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 1131)

AUTHORS Abad,J.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (14-JUN-2016) Departamento de Biologia Molecular,

Autonomous University of Madrid, Facultad de Ciencias-edif.

Biologia, 28049, SPAIN

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..1131

/organism="Pseudomonas pseudoalcaligenes"

/mol_type="genomic DNA"

/strain="BE172"

/db_xref="taxon:330"

/country="Spain:Huelva's estuary"

gene <1..>1131

/gene="16S rRNA"

rRNA <1..>1131

/gene="16S rRNA"

/product="16S ribosomal RNA"

ORIGIN

1 ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca

61 gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag

121 ggcagtaagc taataccttg ctgttttgac gttaccgaca gaataagcac cggctaactt

181 cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa

241 agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg

301 catccaaaac tggcgagcta gagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg

361 aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga

421 cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt

481 aaacgatgtc aactagccgt tgggttcctt gagaacttag tggcgcagct aacgcattaa

541 gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg

601 cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg

661 acatgctgag aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg

721 catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc

781 cttgtcctta gttaccagca cgtaatggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac

841 cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggccaggg ctacacacgt

901 gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc

961 gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc

75

1021 gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc

1081 atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccttc ggggggacgg t

//

Рис.10. Нуклеотидный состав гена 16S Ribosomal Pseudomonas pseudoalcaligenes

Таблица 12

Праймеры и фрагменты амплифицируемых участков

Параметр Характеристика

участок гена 16S рРНК

Прямой праймер (f) 5’-3’ att-aag-ttg-acc-gcc-tgg-gg

Обратный праймер (r) 5’-3’ cag-act-gcg-atc-cgg-act-ac

Расчетная температура

плавления прямого праймера

60,0˚С

Расчетная температура

плавления обратного

праймера

60,0˚С

Длина амплифицируемого

участка (п.о.)

449

3.5.1. Программа для амплификации ДНК

Для проведения амплификации предварительно подготовили суспензию

ДНК исследуемых бактериальных клеток, произвели очистку нуклеиновых кислот

от посторонних веществ (ионов, ферментов, белков). Для очистки применяли

различные методики: сорбентная с использованием гуанидинтиоционата,

фенольно-хлороформная экстракция ДНК, лизис под действием температуры и

осаждение клеточного детрина.

Концентрация и температура отжига праймеров были подобраны с

помощью программ Gene Runnеr Version 3.05 и Primer Blast (ресурсы GeneBank).

Таблица 13

Программа амплификации ДНК

Для амплификаторов с активным регулированием (по раствору в пробирке)

«Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Россия)

76

№ цикла Шаг Температура Длительность Количество

повторов

1 1 94˚С 2 мин 1

2 1

2

3

95˚С

57˚С

72˚С

10 сек

10 сек

20 сек

35

3 1 72˚С 2 мин 1

Выбранные пары праймеров проверялись на работоспособность и

фактическую специфичность, а также производилась оптимизация режима

проведения ПЦР на мyзейном штамме Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11

(ВКПМ В-4347) (Табл. 13).

3.5.2. Результаты детекции нуклеотидных последовательностей гена

16S рРНК P.pseudoalcaligenes

Было проведено исследование методом ПЦР изолированных культур

P.pseudoalcaligenes с разработанными олигонуклеотидами. После окончания

реакции производили детекцию продуктов амплификации, для чего использовали

метод горизонтального электрофоретического разделения фрагментов ДНК в

2,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Процесс электрофореза

осуществлялся движением от катода(-) к аноду(+) в течении 20 минут при

напряжении электрического поля 15 В/см. Визуальную регистрацию

нуклеотидных последовательностей производили в ультрафиолетовом свете при

длине волны 254 нм (рис.11).

77 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 11. Результаты амплификации фрагмента гена 16s ribosomal культур

Pseudomonas pseudoalcaligenes (1-14)

Для подтверждения эффективности праймерной системы для

идентификации вида Pseudomonas pseudoalcaligenes определена его

специфичность для различных бактериальных культур с помощью

горизонтального электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 2,5%

агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Визуальную регистрацию

нуклеотидных последовательностей производили в ультрафиолетовом свете при

длине волны 254 нм (рис.12).

Рис. 12. Результаты амплификации фрагмента гена 16s ribosomal различных

культур для проверки специфичности праймерных систем Pseudomonas

pseudoalcaligenes: 1 - P. pseudoalcaligenes; 2,3 - Р. fluorescens; 4,5 - P.

syringae; 6,7 - P. carotovorum; 8,9,10 - K+; 11,12 - B. mallei; 13,14 - A.

calcoaceticus; m - маркер молекулярного веса.

78

а)

б)

Рис. 13. Результаты определения специфичности праймерных систем при

идентификации ризосферных штаммов P.pseudoalcaligenes: а) прямой

праймер; б) обратный праймер

Специфичность данной праймерной системы для идентификации

P.pseudoalcaligenes по отношению к культурам P. fluorescens, P. syringae, P.

carotovora, B. mallei и A.calcoaceticus составила 95% (рис.13, табл. 14).

Таблица 14

Результаты выявления ризосферных штаммов с помощью специфичной

праймерной системы

Виды микроорганизмов Количество штаммов*

Бактериологический

метод

ПЦР

P.pseudoalcaligenes 32 32

P.fluorescens 30 2

P. syringae 30 2

P. carotovora 30 1

79

B. mallei 30 2

A.calcoaceticus 30 1

* Примечание: количество штаммов, дающих положительный результат со

специфичными праймерными системами

Следовательно, результаты выявления ризосферных штаммов с помощью

специфичной праймерной системы показали совпадение результатов при

использовании бактериологического метода и ПЦР только у P.pseudoalcaligenes,

что указывает на возможность использования этой системы для идентификации

данного вида ризобактерий.

Таким образом, среди культивируемых гетеротрофных бактерий из

ризосферы и ризопланы L.esculentum Mill преобладали виды из восьми семейств и

тринадцати видов. Общая численность модельной группы ризобактерий в

процессе вегетации увеличивалась в ризосфере в 19,4 раза, в ризоплане в 20,5 раз.

Максимальные показатели численности в данном бактериальном комплексе

ризосферы на протяжении всех периодов вегетации томатов выявлены у P.

pseudoalcaligenes (2,74±0,90 lgКОЕ/г; 15,00±4,04 lgКОЕ/г; 26,00±5,09 lgКОЕ/г и

52,40±11,70 lgКОЕ/г соответственно). В ризоплане показатели численности

данного вида также превалировали над другими представителями бактериальной

ассоциации, но были меньше значений численности ризосферных бактерий во

все фазы вегетации – в 2,4, в 2,4, в 2,6 и 3,6 раза.

P.pseudoalcaligenes по показателю частоты встречаемости в ризосфере и

ризоплане томатов также превалировал. В ризосфере значения данного показателя

во все фазы вегетационного развития составили 78,3±1,3%, 82,6±2,5%, 88,6±2,6%

и 94,6±2,4% соответственно. В ризоплане частота встречаемости

P.pseudoalcaligenes, как и других видов была ниже, чем в ризосфере (67,5±1,5%,

74,4±2,1%, 81,5±2,8%, 87,5±2,6%).

80

ГЛАВА 4. МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕЖВИДОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В

БАКТЕРИАЛЬНОМ БЛОКЕ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ ТОМАТОВ В

РАЗЛИЧНЫЕ ВЕГЕТАЦИОННЫЕ ПЕРИОДЫ

Известно, что микроорганизмы и их деятельность в прикорневой зоне

являются одним из важных факторов, обусловливающих функционирование

агроэкосистемы. Сохранение и поддержание ризобактериями параметров

микробиома, его структуры в пространстве и времени считают основным

свойством почвенной биоты и экосистемы. Одним из основных вопросов

современной почвенной экологии является характеристика микробиоты

ризосферы, как индикатор состояния ассоциантов в единой экосистеме

(Терещенко, Бубина, 2009).

Анализ качественных и количественных характеристик представителей

исследуемой группы ризосферы и ризопланы L. esculentum Mill. показал, что

изученный бактериальный комплекс изменялся в процессе вегетации растения.

Межвидовое взаимодействие в бактериальном блоке ризосферы и ризопланы

томатов в процессе развития растения производили с помощью оценки

пространственной структуры изменений микробиоты, видовой иерархии в

исследуемом микробном сообществе. Для этого определяли ряд значимых

экологических критериев устойчивости микробного сообщества, таких как,

показатели постоянства микроорганизмов и их видового разнообразия, индексов

контагиозности и флористической значимости.

Для определения данных показателей использовали значения численности

исследованной группы бактерий ризосферы, ризопланы в различные фазы

вегетации растения (фаза всходов, бутонизации, цветения и плодоношения)

представленные в главе 3.

81

4.1. Результаты определения показателя постоянства микроорганизмов

Показатель постоянства позволяет оценить долю участия видов в структуре

биоценоза и типологию доминант микробиоты. Классифицировали

представителей микробиоты ризосферы и ризопланы томатов на доминирующие

виды (более 50% образцов), добавочные (49% - 25%) и случайные или

транзиторные виды (менее 25% образцов).

Таблица 15

Видовая структура бактериального комплекса прикорневой зоны томатов в фазу

всходов (%)

№ п/п Микроорганизмы

Показатель постоянства,%

Ризосфера

(n=35)

Ризоплана

(n=35)

Доминирующие виды

1 P.pseudoalcaligenes 74,6±2,6* 64,4±1,4*

2 A.iowffii 60,6±2,2 56,4±2,1

3 A.calcoaceticus 60,6±2,0 57,5±3,2

4 E.aerogenes 55,0±3,4* 50,9±3,6*

5 A.globiformis 58,1±1,4* 52,6±1,2*

6 A.faecalis 53,6±3,6 51,8±1,3

7 B.subtilis 53,0±1,3* 50,0±1,1*

Добавочные виды

8 B.megaterium 30,0±5,1 27,0±4,2

Транзиторные виды

9 S. putrefaciens 24,0±2,2 21,2±3,5

* - достоверность показателя постоянства в фазу плодоношения по

сравнению с фазой всходов

В фазу всходов доминирующая группа микробиоценоза ризосферы и

ризопланы томатов представлена семью видами, максимальные значения

показателя постоянства у P.pseudoalcaligenes – в ризосфере 74,6±2,6%, в

82

ризоплане 64,4±1,4 %. Группа добавочных видов представлена B.megaterium,

транзиторным видом явился S. putrefaciens (табл.15).

Таблица 16

Структура видов микробоценоза ризосферы и ризопланы томатов в фазу

бутонизации

№ п/п Микроорганизмы

Показатель постоянства, %

Ризосфера

(n=35)

Ризоплана

(n=35)

Доминирующие виды

1 P.pseudoalcaligenes 81,3±2,8 73,8±2,1

2 P. fluorescens 70,1±1,1 64,5±2,3

3 A.globiformis 59,3±2,1 55,6±2,9

4 E.aerogenes 65,0±2,2 58,8±2,1

5 K.mobillis 53,3±3,3 50,1±2,9

5 B.mallei 54,4±2,1 51,3±2,4

Добавочные виды

6 B.subtilis 45,6±2,8 32,5±2,9

Транзиторные виды

7 E. intermedius 26,3±2,3 22,1±3,5

8 B.megaterium 23,1±3,4 16,9±4,5

* - достоверность показателя постоянства в фазу плодоношения по сравнению с

фазой всходов

Видовой состав доминирующей группы микробоценоза ризосферы и

ризопланы в данную фазу вегетации отличается от фазы всходов. В

доминирующую группу добавились виды P. fluorescens, K.mobillis и B.mallei.

Максимальные значение показателя постоянства также характерны для

P.pseudoalcaligenes – в ризосфере 81,3±2,8%, в ризоплане 73,8±2,1% (табл.16).

Таблица 17

Видовая структура прикорневой зоны томатов в фазу цветения

№ п/п Микроорганизмы

Показатель постоянства, %

Ризосфера

(n=35)

Ризоплана

(n=35)

Доминирующие виды

83

1 P.pseudoalcaligenes 82,6±2,5 81,5±2,8

2 P. fluorescens 81,2±2,3 70,9±2,1

3 A.globiformis 67,2±2,8 51,9±2,2

4 E.aerogenes 61,3±2,5 58,1±2,8

5 B.mallei 57,5±2,3 51,3±2,6

Добавочные виды

6 K.mobillis 48,1±3,9 45,0±4,0

7 E. intermedius 40,3±4,6 30,1±4,1

Транзиторные виды

8 B.subtilis 16,9±1,9 12,5±1,6

* - достоверность показателя постоянства в фазу плодоношения по сравнению с

фазой всходов

Видовой состав доминирующих групп в фазы цветения и плодоношения

одинаков и представлен семью видами. Максимальные значения данного

показателя выявлены у P.pseudoalcaligenes. Значение показателя постоянства

данного вида в фазу цветения 82,6±2,5 % и 81,5±2,8% соответственно, в фазу

плодоношения 89,6±2,4% и 87,5±2,6% соответственно.

Добавочным видом в фазы цветения и плодоношения выявлен B.subtilis

(табл.17,18).

Таблица 18

Видовая структура микробоценоза ризосферы и ризопланы томатов в фазу

плодоношения

№ п/п Микроорганизмы

Показатель постоянства, %

Ризосфера

(n=35)

Ризоплана

(n=35)

Доминирующие виды

1 P.pseudoalcaligenes 89,6±2,4* 87,5±2,6*

2 P. fluorescens 80,4±2,4 79,3±2,2

3 A.globiformis 66,4±2,1* 51,9±2,2*

4 E.aerogenes 78,1±2,3* 76,9±2,6*

5 B.mallei 84,4±2,0 81,3±2,4

Добавочные виды

6 K.mobillis 77,6±4,3 71,3±3,9

7 E. intermedius 68,3±5,6 52,1±5,5

84

Транзиторные виды

8 B.subtilis 10,2±3,1* 8,4±2,4*

* - достоверность показателя постоянства в фазу плодоношения по сравнению с

фазой всходов

Таким образом, показано что, в бактериальном комплексе ризосферы и

ризопланы томатов изменения носят последовательный характер и проявляются

на уровне экосистемы. Это выражалось в появлении среди доминантных видов

представителей добавочной биоты, а именно в фазу всходов доминантными

видами являлись A.iowffii, A.calcoaceticus и A.faecalis, которые в другие фазу не

были изолированы ни из ризосферы ни из ризопланы томатов. Виды

P.pseudoalcaligenes и E.aerogenes были доминантными на протяжении всего

процесса развития томатов. Вид B.subtilis относился к группе доминантных только

в фазу всходов, в другие фазы показатель постоянства данного вида был ниже

50%. В фазы бутонизации, цветения и плодоношения доминантная группа

включала P. fluorescens, A.globiformis и B.mallei, спорообразующий вид B.subtilis

перешел в группу добавочных микроорганимзов.

Основна исследуемой груупы бактерий ризосферы и ризопланы томатов

сформирована видами P.pseudoalcaligenes, P. fluorescens, A.globiformis и

E.aerogenes. Максимальные значения показателя постоянства, а значит основная

доля участия в структуре микробиоты на протяжении всего периода вегетации

томатов отмечали для вида P.pseudoalcaligenes.

4.2. Характеристика видового разнообразия

Уровень видового разнообразия микробоценоза является одним из наиболее

важным критериев устойчивости основных экологических функций почвы и

позволяет дополнить картину количественных показателей экосистемы

(Терещенко, Бубиной, 2009; Dobrovol’skaya, 2015). Коэффициент видового

разнообразия показывает соотношение между числом видов в биоценозе и общим

числом особей (Сытник, 1989).

Видовое разнообразие в фазу всходов в ризосфере составило 1,02*±0,4, в

ризоплане 2,51*±0,6. В фазу бутонизации данный показатель снизился в

85

ризосфере в 2,4 раз и составил 0,42*±0,1, в ризоплане в 4,9 раз и составил

0,51*±0,4. В период цветения томатов наблюдали снижение коэффициента

видового разнообразия в 2,1 и 2,3 раза соответственно, и показатель в ризосфере

0,20*±0,05, в ризоплане 0,22*±0,04. В фазу плодоношения также отмечали

снижение видового разнообразия микробиоты ризосферы и ризопланы в 2 раза по

сравнению с предыдущей фазой вегетации томатов, и в ризосфере он составил

0,05*±0,02, в ризоплане 0,11*±0,03 (рис.14).

Рис.14. Динамика видового разнообразия микробоценоза ризосферы и

ризопланы томатов в процессе вегетации

Показано, что видовое разнообразие микробных ассоциаций ризопланы

выше данного показателя ризосферы на протяжении всего вегетативного развития

томатов более чем в два раза.

Определение коэффициента видового разнообразия ризосферы и ризопланы

томатов показало, что происходило достоверное снижение его уровня в процессе

вегетации растения (р<0,05). Следовательно, в процессе вегетации растения

происходило увеличение численности микроорганизмов при сохранении

количества видов.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Уровень

видового

разнообразия

Периоды вегетации томатов

Ризосфера

Ризоплана

86

4.3. Изменения индекса флористической значимости ризобактерий

Индекс флористической значимости позволяет дать характеристику

ценотической структуры экосистемы микробиоты. Изучение флористической

значимости видов микробного сообщества ризосферы и ризопланы томатов

выявило следующее (табл. 19).

Таблица 19

Индекс флористической значимости групп ризобактерий томатов (%)

Микроорганизмы

Обследованные группы

Фаза всходов

Фаза

бутонизации

Фаза цветения

Фаза

плодоношения

ри

зосф

ера

(n=

35)

ри

зоп

лан

а

(n=

35)

ри

зосф

ера

(n=

35)

ри

зоп

лан

а

(n=

35)

ри

зосф

ера

(n=

35)

ри

зоп

лан

а

(n=

35)

ри

зосф

ера

(n=

35)

ри

зоп

лан

а

(n=

35)

Acinetobacter 4,3

±0,2

2,8

±0,1

- - - - - -

Alcaligenes 2,9

±0,3

2,4

±0,1

- - - - - -

Shewanella 2,2

±0,4

1,5

±0,2

- - - - - -

Burkholderia - - 3,3*

±0,3

2,9*

±0,1

4,1*

±0,3

4,5*

±0,2

5,1*

±0,4

5,6*

±0,3

Klebsiella - - 2,5*

±0,2

2,1*

±0,4

3,8*

±0,3

4,2*

±0,3

4,7*

±0,3

5,1*

±0,4

Arthrobacter 2,2*

±0,2

2,9*

±0,3

3,0*

±0,4

4,0*

±0,2

4,3*

±0,4

4,9*

±0,2

5,4*

±0,4

5,4*

±0,2

Pseudomonas 4,0*

±0,2

3,1*

± 0,3

8,7*

±0,4

7,3*

±0,3

12,1*

±0,4

11,4*

±0,2

13,0*

±0,1

12,3*

±0,4

Enterobacter 3,0*

±0,4

2,6*

±0,5

5,1*

±0,4

4,9*

±0,2

6,4*

±0,4

5,9*

±0,3

8,8*

±0,4

7,8*

±0,5

Bacillus 3,1*

±0,2

2,4*

±0,3

2,2*

±0,2

1,8*

±0,1

1,9*

±0,2

1,2*

±0,1

1,5

±0,3

1,0

±0,1

Примечание * - достоверность различия показателя в зависимости от фазы

вегетации томатов (р<0,05)

Результаты расчета индекса значимости экологических групп показали, что

в фазу всходов наиболее значимыми микроорганизмами в ризосфере и ризоплане

являлись бактерии рода Acinetobacter и их показатели значимости составляли

87

4,3*±0,2% и 2,8*±0,1% соответственно и Pseudomonas - 4,0*±0,2 % и 3,1*±0,3 %

соответственно.

В фазу бутонизации самые высокие показатели флористической значимости

имели ризобактериии рода Pseudomonas 8,7*±0,4 % в ризосфере и 7,3*±0,3 % в

ризоплане и бактерии рода Enterobacter 5,1*±0,4 % и 4,9*±0,2 % соответственно.

Следующий период - цветение характеризовался следующими значимыми

экологическими группами - в ризосфере бактерии рода Pseudomonas со значением

12,1*±0,4% и Enterobacter 6,4*±0,4%, в ризоплане 11,4*±0,2 % и 5,9*±0,3 %

соответственно.

В фазу плодоношения также наиболее значимыми группами в ризосфере

являлись бактерии рода Pseudomonas и Enterobacter, со значениями 13,0*±0,1 % и

8,8*±0,4 % соответственно, в ризоплане 12,3*±0,4 % и 7,8*±0,5 соответственно.

В процессе определения индекса флористической значимости показана

смена экологически значимых видов в разные фазы развития томатов. Такие виды

как Acinetobacter, Alcaligenes и Shewanella встречались только в фазу всходов, в

дальнейшие периоды вегетации они не были обнаружены.

Роды Burkholderia и Klebsiella, наоборот, в первую фазы не были выделены,

затем индекс их флористической значимости постоянно увеличивался, достигая

максимума в фазу плодоношения.

Ризобактерии родов Pseudomonas, Arthrobacter и Enterobacter были

изолированы из ризосферы и ризопланы томатов на протяжении всего

вегетационного периода и их флористическая значимость увеличивалась,

максимальный показатель был в фазу плодоношения. Так, увеличение показателя

флористической значимости в фазу плодоношения по сравнению с фазой всходов

у бактерий рода Pseudomonas отмечали в ризосфере в 4,3 раза, в ризоплане в 4,7

раз; бактерии рода Arthrobacter - в ризосфере в 2,4 раза, в ризоплане в 1,7 раз;

Enterobacter в ризосфере в 2,2 раза, в ризоплане в 2,5 раз (рис.15).

88

Рис. 15. Рост индекса флористической значимости видов относительно

фазы всходов

Bacillus имели противоположную динамику - уровень индекса

флористической значимости у них снижался и в ризосфере, и в ризоплане в 3,4

раза.

Установлено, что наиболее значимыми представителями микробиоты

ризосферы и ризопланы томатов во всех фазах вегетации являлись ризобактерии

рода Pseudomonas, которые демонстрировали стойкий рост индекса

флористической значимости.

4.4. Динамика индекса контагиозности ризобактерий

Индекс контагиозности показывает равномерность распределения видов в

пространстве на единицу площади (Сытник, 1989). Степень контагиозности

равная единице свидетельствует о случайном распределении бактерий, выше

единицы – о групповом распределении и меньше единицы - равномерном

видовом распределении прикорневой зоны томатов.

Установлено, что характер распределения микроорганизмов в исследуемых

биотопах разнообразен (табл.20).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

У

р

о

в

е

н

ь

ф

л

о

р

и

с

т

и

ч

е

с

к

о

й

з

н

а

ч

и

м

о

с

т

и

Pseudomonas

Arthrobacter

Enterobacter

Bacillus

89

Таблица 20

Индекс контагиозности ризосферных бактерий томата

Фаза всходов

Фаза

бутонизации Фаза цветения

Фаза

плодоношения

Ри

зосф

ера

(n=

35

)

Ри

зоп

лан

а

(n=

35

)

Ри

зосф

ера

(n=

35

)

Ри

зоп

лан

а

(n=

35

)

Ри

зосф

ера

(n=

35

)

Ри

зоп

лан

а

(n=

35

)

Ри

зосф

ера

(n=

35

)

Ри

зоп

лан

а

(n=

35

)

Acinetobacter 0,33±

0,01

0,31±

0,03 -

- - - -

Alcaligenes 0,96±

0,01

0,94±

0,02 - -

- - - -

Shewanella 0,97±

0,03

0,92±

0,02

- - - - - -

Burkholderia -

-

0,22*

±0,01

0,26*

±0,03

0,31*

±0,02

0,33*

±0,02

0,39*±

0,04

0,31

± 0,04

Klebsiella -

-

0,95

±0,01

0,96

±0,02

0,94

±0,04

0,95

±0,01

0,97

±0,01

0,96

± 0,05

Arthrobacter 0,22*

±0,01

0,25*

±0,02

0,29*

±0,01

0,33*

±0,03

0,38*

±0,04

0,41*

±0,02

0,46*±

0,02

0,45*

± 0,01

Pseudomonas 0,35*

±0,02

0,33*

±0,03

0,49*

±0,04

0,43*

±0,01

0,58*

±0,02

0,51*

±0,04

0,66*±

0,03

0,64*

± 0,02

Enterobacter 0,20*

±0,02

0,24*

±0,02

0,30*

±0,02

0,35*

±0,02

0,39*

±0,01

0,41

±0,01

0,45*

±0,03

0,43 ±

0,04

Bacillus 0,31*

±0,02

0,33*

±0,01

0,21*

±0,01

0,25*

±0,03

0,19

±0,01

0,16

±0,01

0,14

±0,03

0,15

± 0,04

Примечание: * - достоверное отличие от значения индекса контагиозности в

зависимости от фазы вегетации растения (p<0,05)

Равномерное распределение характерно для следующих групп ризобактерий

- Acinetobacter, Arthrobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Enterobacter и Bacillus,

значение индекса контагиозности данных групп бактерий было меньше единицы.

Для Alcaligenes, Shewanella и Klebsiella характерно случайное распределение в

биотопе, значение их индекса контагиозности в ризосфере и в ризоплане было

близко к единице.

90

Отмечали изменение индекса контагиозности представителей микробиоты

ризосферы и ризопланы томатов в зависимости от вегетативного периода

растения. В фазу всходов равномерным распределением в биотопе

характеризовались группы ризобактерий - Acinetobacter, Arthrobacter,

Pseudomonas, Enterobacter и Bacillus. В фазу бутонизации, цветения и

плодоношения группы Arthrobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Enterobacter и

Bacillus.

Достоверный рост индекса контагиозности ризосферы в процессе развития

растения отмечали у бактерий родов - Arthrobacter, Pseudomonas, Burkholderia и

Enterobacter. Показатель контагиозности ризобактерий родов Pseudomonas,

Arthrobacter, Burkholderia и Enterobacter в фазу плодоношения превышал данный

показатель, полученный в фазу всходов, практически в 2 раза. Ризобактерии рода

Bacillus имели иную динамику. Показатель индекса контагиозности в процессе

вегетации томатов снижался в фазу плодоношения по сравнению с начальным

периодом в 2,2 раза. Динамика уровня индекса контагиозности ризопланы

аналогична с изменением данного показателя в ризосфере томатов.

Установлено, что в микробиоте ризосферы и ризопланы томатов выявлено

достоверное увеличение контагиозности представителей доминантной

микробиоты, что свидетельствует о равномерном участии в горизонтальной

структуре микробного сообщества основных симбионтов биоценоза.

Максимальные значения индекса контагиозности выявлены у ризобактерий рода

Pseudomonas.

Таким образом, анализ межвидивого взаимодействия в группе бактерий

ризосферы и ризопланы томатов показал, что изменения проявляются на уровне

экосистемы и носят последовательный характер. В результате экологического

мониторинга микробиоты ризосферы и ризопланы L. esculentum Mill. в различные

периоды развития установлено, что основа исследуемой бактерийльной группы

представлена видами - P.pseudoalcaligenes, P. fluorescens, A.globiformis и

E.aerogenes. Виды, являющиеся доминантными в ризосфере и ризоплане томатов,

характеризовались равномерным участием в горизонтальной структуре

91

бактериальной ассоциации и ростом индекса контагиозности в процессе

вегетации томатов. У ризобактерий P.pseudoalcaligenes выявлен максимальный

показатель постоянства на протяжении всех периодов вегетации томатов.

Максимальные значения индекса контагиозности и флористической

значимости в течение всего развития томатов выявлены у ризобактерий рода

Pseudomonas. Показано, что видовое разнообразия бактериальных ассоциаций

ризопланы выше данного показателя ризосферы на протяжении всего

вегетативного развития томатов более чем в два раза. Кроме того, происходило

снижение видового разнообразия как в ризосфере, так в ризоплане в процессе

вегетации томатов.

92

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

РИЗОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P.PSEUDOALCALIGENES

Известно, что все механизмы влияния ризобактерий на растения делят на

прямые и непрямые. Одним из важнейших прямых механизмов является синтез

ризобактериями фитогормонов, а непрямых – антагонистическая активность по

отношению к фитопатогенам (Моргун, 2009). Показано, что количественные и

качественные показатели состава ненасыщенных жирных кислот клеточных

структур микроорганизмов оказывают влияние на их адаптивный потенциал, в

том числе на адгезивные и колонизационные свойства бактерий (Захарова, Сухих

2015).

В собственных исследованиях в результате экологической оценки

микроценоза ризосферы и ризопланы томатов показано, что вид P.

pseudoalcaligenes является доминирующим и экологически значимым в течение

всех периодов развития растения. В связи с этим далее нами проведено изучение

состава жирных кислот, адгезивные и поверхностные свойства мембран

ризобактерий P. pseudoalcaligenes.

Оценку прямого влияния ризобактерий на томаты производили путем

выявления гена, кодирующего синтез L-триптофана, являющегося

предшественником фитогормона ауксина, способствующего развитию корневой

системы растений. Для характеристики непрямого влияния ризобактерий на

растения определяли антагонистическую активность ризобактерий данного вида

по отношению к бактериальным фитопатогенам.

5.1. Поверхностные и колонизационно-адгезивные свойства ризобактериальных

штаммов P. pseudoalcaligenes

Известно, что жирные кислоты мембран микроорганизмов являются

фактором, определяющим поверхностные свойства этих мембран и адгезивную

активность бактерий (Бухарин, 2008; Будников, 2010).

93

С помощью газожидкостной хроматографии изучили состав жирных кислот

мембран ризосферных штаммов P. pseudoalcaligenes, выделенных из корневой

системы томатов в фазу всходов, бутонизации, цветения и плодоношения

(рис.13).

Таблица 21

Количественное соотношение жирных кислот у штаммов, выделенных в

различные фазы вегетации растения (%)

Название жирной кислоты

в ф

азу

всх

од

ов

в ф

азу

бу

тон

иза

ци

и

в ф

азу

цвет

ени

я

в ф

азу

плод

он

ош

ени

я

Додекановая кислота 12:0 0,82±

0,3

0,73±

0,4

1,12±

0,6

1,13±

0,4

2-гидрооксидодекановая кислота 2ОН 12:0 5,23±

1,8

3,91±

0,9

5,42±

1,2

8,83±

1,4

3-гидрооксидодекановая кислота 3ОН 12:0 0,61±

0,3

0,51±

0,2

0,63±

0,3

0,59±

0,4

Тетрадекановая кислота 14:0 1,10±

0,5

0,88±

0,2

1,37±

0,3

1,45±

0,4

13-метилтетрадекановая кислота i15:0 0,89±

0,3

1,23±

0,6

0,73±

0,4

0,53±

0,2

Пентадекановая кислота15:0 0,48±

0,1

0,54±

0,1

0,51±

0,3

0,50±

0,2

3-гидроокситетрадекановая кислота 3ОН

14:0

0,31±

0,2

0,36±

0,2

0,24±

0,1

0,19±

0,1

14-метилпентадекановая кислота i16:0 0,26±

0,1

0,38±

0,2

0,20±

0,1

0,16±

0,1

Cis-9-гексадеценовая кислота16:1 9 18,36*

±1,2 21,70*

±0,9

23,29*

±0,5 24,21

±0,7

Гексадекановая кислота16:0 25,17±

1,2

24,66±

2,0

25,43±

1,9

22,51±

2,1

15-метилгексадекановая кислота i17:0 0,50±

0,2

0,67±

0,4

0,39±

0,2

0,29±

0,1

Cis-9.10-метиленегексадекановая

кислота17:0cis

15,55±

1,4

15,94±

1,3

15,96±

2,1

14,37±

1,6

Гептадекановая кислота17:0 0,65± 0,85± 0,53± 0,38±

94

0,2 0,3 0,1 0,2

Trans-9-октадеценовая кислота18:1 9trans 9,47*

±0,3

11,54*

±0,6

12,36*

±0,2

13,04

±0,7

Октадекановая кислота18:0 0,63±

0,2

1,07±

0,4

0,50±

0,2

0,24±

0,1

Нонадекановая кислота19:0 0,40±

0,2

0,52±

0,3

0,29±

0,1

0,21±

0,1

* Примечание * - достоверность различия количества ненасыщенных

жирных кислот в разные фазы вегетации (р<0,05)

Основными компонентами клеточных мембран P. pseudoalcaligenes,

выделенными в течение всего периода вегетации растения являлись насыщенные

гексадекановая кислота (16:0) и Cis-9.1-метиленегексадекановая кислота (17:0cis),

а также ненасыщенные жирные кислоты Cis-9-гексадеценовая кислота (16:1 9) и

Trans-9-октадеценовая кислота (18:1 9trans), что характерно для данного вида

(табл.21).

Из ненасыщенных кислот наиболее высокие показатели имели Trans-9-

октадеценовая кислота и Cis-9-гексадеценовая кислота, их количество

увеличивалось в процессе роста растения. Так, содержание Cis-9-гексадеценовой

кислоты возрастало в 1,3 раза, с 18,36*±1,2% в фазу всходов до 24,21*±0,7% в

фазу плодоношения. Trans-9-октадеценовой кислоты – в 1,4 раза: с 9,47*±0,3% в

фазу всходов до 13,04*±0,7% в фазу плодоношения.

Доминирующими насыщенными жирными кислотами являлись

гексадекановая кислота (16:0) и Cis-9.1-метиленегексадекановая кислота (17:0cis)

(рис.16 а,б,в,г).

95

а)

96

б)

97

в)

98

г)

Рис. 16. Газожидкостные хроматограммы жирных кислот исследуемых штаммов

P. pseudoalcaligenes, выделенных из ризосферы Lycopersicon esculentum Mill. в

фазы: а) всходов; б) бутонизации; в) цветения; г) плодоношения

99

Следовательно, в составе мембран обнаружены жирные кислоты,

характерные для ризосферных штаммов P. pseudoalcaligenes. В процессе развития

Lycopersicon esculentum Mill. обнаружено увеличение содержания в ризосферных

штаммах P. pseudoalcaligenes ненасыщенных жирных кислот, достигавшее

максимума в фазу плодоношения. Уровень Trans-9-октадеценовой кислоты

повышался в 1,3 раза, Cis-9-гексадеценовой кислоты – в 1,4 раза, что

свидетельствует об увеличении их колонизационно-адгезивных свойств и

адаптивного потенциала.

Характер поверхности бактериальных клеток P. pseudoalcaligenes в

различные фазы вегетации томатов выявляли с помощью атомно-силовой

микроскопии (АСМ). Для этого определяли наличие шероховатости

поверхностной мембраны и упругость цитоплазмы, от которой зависит наличие

шероховатости, а также адгезивные свойства поверхностных мембран.

АСМ показала, что ризосферные штаммы P. pseudoalcaligenes имели

характерную для вида палочковидную форму с закругленными концами.

Производили изучение морфометрических показателей штаммов P.

pseudoalcaligenes, отобранных в различные фазы вегетации томатов. Измерению

подвергали такие характеристики как, ширина, длина, высота, объем клеток

(табл. 22).

Таблица 22

Морфометрические показатели ризобактерий P. pseudoalcaligenes, выделенных в

различные фазы вегетации томатов

Периоды

вегетации

растения

Морфометрические показатели клеток

Длина, мкм Ширина, мкм Высота, мкм Объем, мкм3

Фаза всходов 2,21±0,20 0,66±0,08 1,22±0,02 1,78±0,02

Фаза

бутонизации 2,10±0,34 0,81±0,03 1,31±0,05 2,23±0,03

Фаза цветения 2,25±0,30 0,92±0,05 1,14±0,04 2,36±0,08

Фаза

плодоношения 2,14±0,11 0,73±0,09 1,21±0,02 1,89±0,08

*- различия параметров в фазы роста достоверны при р <0,05

100

Морфометрические показатели псевдомонад в исследуемых образцах в

процессе развития растения достоверно не изменялись. Средние значения

линейных параметров ризобактерий P. pseudoalcaligenes составили в длину

2,4±0,2 мкм, в ширину 1,1±0,1 мкм, 1,2±0,1 мкм в высоту (рис.17 а, б).

А) Б) в

Рис.17. Сканирующая микроскопия штаммов P. pseudoalcaligenes,

морфометрические показатели: а) длина клеток; б) ширина клеток

Величина высоты складок поверхности ризобактерий в фазу всходов

составляла 116±79,97 нм, в фазу бутонизации - 120±65,5 нм, в фазу цветения и

плодоношения - 119±49,3 нм и 124±48,4 нм соответственно. Однако,

шероховатость поверхности клеток P. pseudoalcaligenes, выделенных в различные

периоды онтогенеза растения, не имела достоверных различий (р<0,05) (рис.18).

101

Рис. 18. Шероховатость поверхности клеток P. pseudoalcaligenes (нм)

Показатель упругости цитоплазмы P. pseudoalcaligenes также не имел

достоверных изменений в зависимости от периода вегетации растения (р<0,05). В

фазе всходов томатов он составил 4,7±0,2 МПа, бутонизации – 5,3±0,1 МПа,

цветения – 5,0±0,3 МПа и фазе плодоношения – 6,6±0,3 МПа (рис.19).

Рис. 19. Показатель упругости цитоплазмы ризобактерий P. pseudoalcaligenes в

фазу всходов томатов

102

Изучение адгезивных свойств штаммов P. pseudoalcaligenes показало их

изменение в различные фазы вегетации томатов. В фазе всходов и данный

показатель составил 31,0±4,0* нН и соответственно. В фазе бутонизации,

цветения и плодоношения значения силы адгезии составили 43,0±5,0 нН, 67,0±4,0

нН и 75,0±3,0* нН соответственно. Однако адгезивная активность в фазе

плодоношения была достоверно выше соответствующего показателя фазы

бутонизации (р<0,05).

Следовательно, морфометрические показатели, шероховатость

поверхностных мембран и упругость бактериальных клеток P. pseudoalcaligenes

не имели достоверных различий в зависимости от периода вегетации томатов

(р>0,05). Однако, адгезивные свойства ризосферных штаммов P. pseudoalcaligenes

достоверно увеличивались в фазы цветения и плодоношения по сравнению с

начальными периодами вегетации растения. Максимальные значения данного

показателя выявлены в период плодоношения томатов (75,0±3,0 нН).

5.2. Выявление гена, детерминирующего синтез L-триптофана P.pseudoalcaligenes

Синтез ризобактериями фитогормонов является одним из наиболее

эффективных механизмов влияния на растения по (Koul V., 2015).

Ризобактерильная индолил-3-уксусная кислота (ИУК) оказывает воздействие на

развитие корневой системы, что приводит к ускоренному росту растения,

лучшему усвоению питательных веществ из почвы. Данный фитогормон также

способствует формированию растительно-бактериальной ассоциации и

устойчивости растения к неблагоприятным условиям (Олюнина, 2004).

Известно, что L-триптофан является предшественником фитогормона ИУК

(Цавкелова и др., 2005). В связи с этим далее опледеляли способность

синтезировать триптофан ризобактериальными штаммами P.pseudoalcaligenes.

Для этого использовали метод ПЦР с детекцией результатов в режиме real-time.

103

5.1.1. Подбор праймеров для выявления гена trpA

С помощью баз данных GeneBank (США), EMBL (Европейская

молекулярно-биологическая библиотека) был изучен генетический состав

ризобактерий, выделенных из прикорневой зоны томатов и найдены два гена

P.pseudoalcaligenes, ответственные за синтез L-триптофана –trpA.

Исследование нуклеотидных последовательностей генов,

детерминирующих экспрессию предшественника фитогормона ауксина – L-

триптофана проводили в культуре Pseudomonas pseudoalcaligenes, выделенной из

прикорневой зоны томатов (в разные фазы вегетации). В качестве контрольного

микроорганизма был использован штамм Pseudomonas pseudoalcaligenes B4342,

полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов

(ФГУП Гос НИИГенетика). Исследуемые нами гены не являются уникальными

для вида Pseudomonas pseudoalcaligenes, поэтому был определен специфический

участок данных генов доступных в базе данных GeneBank. К данным участкам

были подобраны праймеры с помощью базы данных PrimerBLAST в режиме on-

line (табл.23). В основе выбора праймеров мы руководствовались следующими

требованиями:

– оптимальная длина праймера должна составлять 20–32 пары нуклеотидов;

– температура плавления праймера должна быть 60–70˚С;

– размер фланкируемого праймерами участка гена не менее 100 и не более

1000 п.о;

– количество GCв праймере должно составлять 40-60%;

– прймеры должны быть специфичными, для предотвращения вероятности

неправильной интерпретации результатов. В случае подбора не специфичных

праймеров в реакционной смеси синтезируются короткие и длинные участков

неспецифической ДНК, которые могут привести к появлению нечетких полос -

шмер. При подборе праймерой следует учитывать 3-конец участка праймера, так

как достраивание комплементарной цепи ДНК Taq-полимеразов происходит с

этого участка;

104

– разница температур плавления праймерной пары должна быть в пределах

2-4˚С.

Таблица 23

Праймеры и фрагменты амплифицируемых участков

Параметр Характеристика

участок гена trp A

Прямой праймер (f) 5’-3’ cac-gca-ccc-ctt-cgg-c

Обратный праймер (r) 5’-3’ cga-tct-gcc-ggt-gtg-cat

Расчетная температура

плавления прямого праймера

60,0˚С

Расчетная температура

плавления обратного

праймера

60,0˚С

Теоретическая

специфичность

Все, доступные для изучения штаммы P.

pseudoalcaligenes

Длина амплифицируемого

участка (п.о.)

285

Определяли специфичность праймерной системы для различных

близкородственных кульур (рис.20).

а)

105

б)

Рис. 20. Проверка специфичности праймерных систем для определения

нуклеотидных последовательностей trpA ризосферных штаммов

P.pseudoalcaligenes: а) прямой праймер; б) обратный праймер;

Следовательно, данная праймерная система является специфичной для

данного вида, что указывает на возможность ее использования для определения

нуклеотидных последовательностей гена trpA.

5.1.2. Программа для амплификации ДНК

Для проведения амплификации предварительно подготовили суспензию

ДНК исследуемых бактериальных клеток, произвели очистку нуклеиновых кислот

от посторонних веществ (ионов, ферментов, белков). Для очистки применяли

различные методики: сорбентная с использованием гуанидинтиоционата,

фенольно-хлороформная экстракция ДНК, лизис под действием температуры и

осаждение клеточного детрина.

Концентрация и температура отжига праймеров были подобраны с

помощью программ GeneRunnеrVersion 3.05 и PrimerBlast (ресурсы GeneBank).

Выбранные пары праймеров проверялись на работоспособность и фактическую

специфичность, а также производилась оптимизация режима проведения ПЦР на

106

мyзейном штамме Pseudomonas pseudoalcaligenes MV-11 ( ВКПМ В-4347) (Табл.

24).

Таблица 24

Программа амплификации ДНК

Для амплификаторов с активным регулированием (по раствору в пробирке)

«Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Россия)

№ цикла Шаг Температура Длительность Количество

повторов

1 1 94˚С 2 мин 1

2 1

2

3

95˚С

57˚С

72˚С

10 сек

10 сек

20 сек

35

3 1 72˚С 2 мин 1

6.1.3. Результаты детекции нуклеотидных последовательностей гена trp А,

ответственного за синтез P.pseudoalcaligenes L-триптофана

После окончания реакции производили детекцию продуктов амплификации,

использовали метод горизонтального электрофоретического разделения

фрагментов ДНК в 2,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Процесс электрофореза осуществлялся движением от катода(-) к аноду(+) в

течении 20 минут при напряжении электрического поля 15 В/см. Визуальную

регистрацию нуклеотидных последовательностей производили в

ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм (рис.21).

1 2 3 4 5 6 7 8 m 9 10 11 12 13 14 15 16 m 17 18 19 20 21 22

107

23 k- m 24 25 26 27 28 29 30 k- k- m k+ k+ k+ k+ k+ 31 32 k- k-

Рис. 21. Pseudomonas pseudoalcaligenes trpA (размер ампликона 285 п.о.)

1-8 – P.pseudoalcaligenes, выделенный в фазу всходов; 9-16 – P. pseudoalcaligenes,

выделенный в фазу бутонизации. 17-24 – P.pseudoalcaligenes,выделенный в фазу

цветения; 25-32 – P.pseudoalcaligenes, выделенный в фазу плодоношения; k+ –

положительный контрольный образец Pseudomonas pseudoalcaligenesMV-11; k- –

отрицательный контрольный образец; m – маркер молекулярного веса.

Таким образом, выявлены гены ризобактериальных штамов

P.pseudoalcaligenes, ответственные за синтез триптофана, который является

предшественником фитогормона индолил-3-уксусной кислоты.

5.1.4. Количественная оценка генов trpA

Для количественной оценки продуктов амплификации использовали

исследование в режиме «реального времени» (PCR real-time). Производили

флюоресцентную детекцию искомых генов, для чего отмечали увеличение

сигнала отделенного флуорофора в процессе амплификации. При этом нарастание

данного сигнала прямо пропорционально концентрации синтезированных

специфических продуктов ДНК-амплификации (табл.25).

Для данного исследования использовали краситель EVA Green, так как он

не ингибирует работу ДНК-Taq-полимеразы. Детекцию продуктов амплификации

выполняли по каналу Fam с максимумом поглощения-494 нм, максимумом

испускания-521 нм.

108

Использовали протокол амплификации с детекцией на температурной полке

59˚С для амплификаторов с активным регулированием (по раствору в пробирке):

ДТ-96 (ДТ-прайм), ДТ-322 производства "ДНК- Технология" (г. Москва).

Таблица 25

Программа для амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме

«реального времени»

№ цикла Шаг Температура Длительность Количество

повторов

1 1 95 5 мин 1

2 1

2

3

95

60

72

10 сек

10 сек

30 сек

35

3 1 72 2 мин 1

С помощью флуоресцентной детекции искомого гена trpA в режиме

«реального времени» были также определены концентрации копий ДНК в

образцах, отобранных из ризосферы в различные фазы роста томатов.

Таблица 26

Концентрация копий ДНК гена trpA в различные периоды вегетации томатов

Фазы вегетации Номер лунки Ср, Fam Концентрация, копий

ДНК/мл

Фаза всходов А1 26,2 0,8*104

А2 26,7 1,2*104

А3 27,2 2,1*104

А4 26,8 1,4*104

А5 26,6 1,1*104

Фаза

бутонизации

А6 26,6 1,2*104

А7 27,3 2,3*104

А8 30,1 28,6*104

В1 29,2 12,9*104

В2 29,2 13,1*104

Фаза цветения В3 29,3 13,3*104

109

В5 30,3 36,8*104

В6 30,6 48,4*104

В7 30,3 34,5*104

В8 31,1 71,4*104

С1 30,4 39,5*104

С2 26,0 0,6*104

Фаза

плодоношения

С3 28,2 4,9*104

С4 33,2 53*106

С5 26,6 1,0*104

С6 29,1 10,0*104

С7 30,7 10*106

С8 33,7 50*106

Из таблицы 26 видно, что максимальная концентрация копий участков гена

trp A наблюдалась у штаммов P.pseudoalcaligenes, выделенных из ризосферы

растения в фазе плодоношения - 53*106

копий ДНК/мл. Минимальные

концентрации участков искомого гена выявлялись у ризобактерий, выделенных из

ризосферы томатов в фазе всходов. Данные показатели составили 0,8*104

копий

ДНК/мл.

5.3. Антагонистические свойства P. pseudoalcaligenes по отношению к

бактериальным фитопатогенам

Далее определяли непрямые механизмы влияния ризобактерий на

L.esculentum Mill. В связи с этим была изучена антагонистическая активность

ризобактериальных штаммов P.pseudoalcaligenes по отношению к бактериальным

фитопатогенам, которые являются возбудителями заболеваний овощных культур,

в том числе томатов.

В качестве тест-культур использовали возбудителей мягкой бактериальной

гнили Pectobacterium carotovora subsp carotovora (Jones, 1901, Bergeyetai, 1923) и

Pseudomonas syringae pv. lachrymans (Smith, Bryan, 1915, Carnser,1918),

вызывающий бактериальную пятнистостость растений. Штаммы фитопатогенов

получены в Государственной коллекции фитапатогеннх микроорганизмов и

110

сортов-идентификаторов патогенных штаммов микроорганизмов Федерального

государственного бюджетного научного учреждения "Всероссийской научно-

исследовательский институт фитопатологии".

Степень антагонистической активности ризобактериальных штаммов

P.pseudoalcaligenes определяли по размерам зон задержки роста тест-культур

фитопатогенных бактерий (Егоров, 2004).

Показано, что уровень антагонистической активности штаммов

P.pseudoalcaligenes, выделенных в различные фазы вегетации L. esculentum Mill.,

по отношению к бактериальным фитопатогенам отличается (табл.27).

Таблица 27

Антагонистическая активность P. pseudoalcaligenes по отношению к

фитопатогенамв различные фазы вегетации

Тест-культура

штамма

фитопатогена

Размер зоны ингибирования роста, мм

Фаза всходов Фаза

бутонизации

Фаза цветения Фаза

плодоношения

Pseudomonas

syringae

6,5±1,2* 8,1±1,3* 9,2±1,3* 10,4±1,7*

Pectobacterium

carotovora

4,1±1,1* 5,5±1,0* 6,4±1,2* 6,7±1,6*

* Показатель достоверности различия антагонистической активности

ризосферных штаммов по отношению к различным фитопатогенам (р<0,05).

Достоверно более высокий уровень антагонистической активности P.

pseudoalcaligenes был выявлен по отношению к фитопатогену Pseudomonas

syringae. Отмечали рост зон ингибирования фитопатогена, так увеличение по

сравнению с фазой плодоношения было в 1,6 раз, в 1,3 раз и 1,1 раза

соответственно в фазу всходов, бутонизации и цветения (рис.22).

111

Рис.22. Антагонизм P. pseudoalcaligenes по отношению к Pseudomonas

syringae: А - фаза всходов, Б - фаза бутонизации, В - фаза цветения, Г - фаза

плодоношения.

Антагонистическая активность P. pseudoalcaligenes по отношению к

фитопатогену Pectobacterium carotovora достоверно ниже показателей по

отношению к фитопатогену Pseudomonas syringae. Так, в фазу всходов,

бутонизации и цветения показатель ниже в 1,3 раза, в фазу плодоношения в 1,5

раз. Однако отмечали также максимальный уровень антагонистической

активности в фазу плодоношения, который был в 1,3 раза выше по сравнению с

начальным периодом вегетации томатов (рис.23).

112

Рис.23. Антагонизм P. pseudoalcaligenes по отношению к Pectobacterium

carotovora: А - фаза всходов, Б - фаза бутонизации, В - фаза цветения, Г -

фаза плодоношения.

Установлено, что ризосферные штаммы P. pseudoalcaligenes обладают

антагонистической активностью по отношению к бактериальным фитопатогенам

Pectobacterium carotovora subsp carotovora и Pseudomonas syringae pv. Lachrymans.

Достоверно более высокий уровень активности отмечали по отношению к

штамму Pseudomonas syringae pv. Lachrymans.

Таким образом, изучение биологических свойств ризобактериального вида

P.pseudoalcaligenes и их изменение в зависимости фазы вегетации томатов

показало стабильность поверхностных свойств ризобактерий. Адгезивные

свойства изменялись в процессе развития томатов и максимальные значения

приобретали в фазу плодоношения растения.

Состав жирных кислот P.pseudoalcaligenes был характерен для данного

вида, его основными компонентами являлись: насыщенные гексадекановая

кислота (16:0) и Cis-9.1-метиленегексадекановая кислота (17:0cis) и

113

ненасыщенные жирные кислоты Cis-9-гексадеценовая кислота (16:1 9) и Trans-9-

октадеценовая кислота (18:1 9trans).

Увеличение количества ненасыщенных жирных кислот - Trans-9-

октадеценовая кислоты в 1,4 раза и Cis-9-гексадеценовая кислоты в 1,3 раза

свидетельствовало о наличии прямого механизма влияния P.pseudoalcaligenes на

томаты, заключающегося в увеличении адаптивного потенциала и адгезивной

активности микроорганизмов.

Изучение молекулярно-генетических свойств также показало, что

концентрация гена trp A, ответственного за синтез L-триптофана, увеличивается в

процессе онтогенеза томатов и максимальная его концентрация характерна для

фазы плодоношения.

Максимальный уровень антагонистической активности отмечали также в

поздние фазы онтогенеза томатов - в фазу плодоношения. Наиболее высокий

уровень активности выявлен к штамму Pseudomonas syringae pv. Lachrymans.

114

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микробные сообщества, ассоциированные с растениями, представляют

огромный интерес для отечественных и зарубежных исследователей (Бухарин,

2011). Развивающаяся корневая система, проникая вглубь почвы, вступает во

взаимодействие с почвенными микроорганизмами, животными и корнями других

растений. Вокруг корня в зонах ризосферы и ризопланы формируется особый

экзосимбиоз, характеризующийся более высокой плотностью микроорганизмов,

чем почва (Zilber-Rosenberg, Rosenberg, 2008).

Количество микробных клеток в ризосфере может превышать их число в

окружающей почве за счет стимуляции роста микробного сообщества ризосферы

продуктами жизнедеятельности корневой системы растения (Иутинская и др.,

2010; Бороздина, 2011). С другой стороны, микробиота ризосферы и ризопланы

оказывает значительное влияние на функционирование растения-ассоцианта

(Абдуллаева, 2014; Добровольская, 2002). Показано, что микробное сообщество

прикорневой зоны, как один из основных компонентов агроэкосистемы, способно

оказывать влияние на ее нормальное функционирование, а структурные или

пространственные изменения микробиоценоза, и потеря стабильности данной

системы могут привести к снижению продуктивности растения ассоцианта

(Терещенко, Бубина, 2009; Vandenkoornhuyse et al., 2015).

Установлено, что растения являются центрами формирования

микробиоценоза прикорневой зоны, выявлена таксономическая структура

некоторых из них (Феоктистова и др., 2016). Т.П. Гажеева (2011) в своей работе

дала характеристику микробиоценозу ризосферы и ризопланы злаковых растений

пшеницы, овса и ячменя, где превалирующими видами в зависимости от фазы

вегетации растения являлись представители родов Pseudomonas и Bacillus.

Е.А. Леонтьевская (2014) изучала структуру бактериальных сообществ

овощных культур – лука, моркови и картофеля, отмечала доминирование

ризобактерий рода Arthrobacter в прикорневой зоне моркови и картофеля, а также

подвижных протеобактерий рода Aquaspirillum у лука. Однако, микрофлора такой

важной сельскохозяйственной культуры как, томаты остается мало изученной.

115

Результаты собственного исследования микробиоценоза ризосферы и

ризопланы L. esculentum Mill. показали его высокое таксономическое

разнообразие. Микробное сообщество данных биотопов представлено 8

семействами: Moraxellaceae, Micrococcaceae, Pseudomonadaceae, Alcaligenaceae,

Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Burkholderiaceae и Shewanellaceae.

Наибольшее количество видов отмечали для семейства Enterobacteriaceae,

оно включало представителей двух родов – E. аerogenes, E. ntermedius и K.

mobillis. Семейство Moraxellaceae было представлено двумя видами одного рода

A. iowffii, A.calcoaceticus, также как и семейство Pseudomonadaceae –

P.pseudoalcaligenes, P. fluorescens и спорообразующие бактерии семейства

Bacillaceae – B. subtilis и B.megaterium. Одним видом были представлены

семейства Alcaligenaceae – A. faecalis, Micrococcaceae – A. globiformis,

Burkholderiaceae – B.mallei и Shewanellaceae – S. putrefaciens.

Известно, что на таксономический состав микробиоценоза прикорневой

зоны и его количественные характеристики оказывают влияние период вегетации

растения, а также физическая удаленность биоты от корневых выделений

растения-ассоцианта (Морецкая, Демченко, 2008; Тихонович, 2011, Проворов,

2011; Mathimaran et al., 2005; Jefwa et al., 2006). Это объясняют сменой основных

компонентов корневых эксудатов в процессе вегетации растения (Добровольская,

2002; Лобакова, 2004; Воронина, 2011; Vestberg et al., 2005; Joshi, 2011).

Анализ литературных данных показал, что различия таксономического

состава и количественных характеристик в зависимости от вегетативной фазы

растения подробно изучены на примере злаковых растений (Гажеева, 2011). В

прикорневой зоне пшеницы, ячменя и овса наблюдали минимальную в фазу

кущения, а максимальную численность ризобактерий в фазу колошения растений.

Отмечено также, что доля спорообразующих микроорганизмов увеличивается в

процессе онтогенеза злаков и достигает максимума в стадию формирования зерна,

количество неспорообразующих бактерий рода Pseudomonas становится

максимальным в стадию выхода в трубку и колошения (Гордеева, 2012). В

прикорневой зоне овса посевного выявлены иные закономерности, так

116

максимальную численность отмечают в фазу цветения растения, минимальную –

в фазу созревания, превалирующими ризобактериями являются

грамотрицательные бактерии родов Pseudoтoпas, Klebsiella, Enterobaсter и

Alcaligenes (Снисаренко, Асексина, 2014).

Результаты собственного исследования показали изменение

таксономического состава культивируемой части бактериального блока

ризосферы и ризопланы L. esculentum Mill. в процессе вегетации. Максимальное

видовое разнообразие исследуемой бактериальной группы отмечается в фазу

всходов и представлен семью семействами – Moraxellaceae, Alcaligenaceae,

Micrococcaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Shewanellaceae и

Bacillaceae. В фазы бутонизации, цветения и плодоношения в микробном

сообществе количество семейств снижалось до пяти – Micrococcaceae,

Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Burkholderiaceae.

Максимальные значения общей численности бактерий бактериального

комплекса ризорсферы и ризопланы L. esculentum Mill. отмечены в фазу

плодоношения, когда численность микроорганизмов в ризосфере превышала в

19,4 раза и в ризоплане в 20,5 раза по сравнению с фазой всходов. Рост

численности происходил за счет увеличения количества неспорообразующих

ризобактерий, спорообразующие виды демонстрировали иную динамику

численности, их максимальные показатели выявлены в стадию всходов томатов.

Общая численность бактерий ризосферы превышала данный показатель

ризопланы более чем в два раза (170,57±35,15 lgКОЕ/г почвы и 73,43±13,75

lgКОЕ/г корней соответственно).

Максимальные значения численности на протяжении всего периода

вегетации томатов и в ризосфере, и в ризоплане отмечены у вида

P.pseudoalcaligenes, достигавших наибольших показателей в фазу плодоношения

(52,4±11,7 lgКОЕ/г почвы и 14,62±2,56 lgКОЕ/г корней соответственно).

Одной из характеристик ризосферы различных растений, отражающей ее

заселенность микроорганизмами, является количественное отношение R/S

(rhizosphera/soil – ризосфера/почва), данную величину называют ризосферным

117

эффектом. Величина R/S показывает, во сколько раз количество микроорганизмов

определенной таксономической группы в ризосфере данного растения превышает

количество этих микроорганизмов в почве. Для большинства бактерий величина

R/S колеблется от 2 до 25. Зарубежные авторы А. Beneduzi, А. Ambrosini и L.M.P.

Passaglia, (2012) отмечают, что при нормальной колонизации данной ниши этот

показатель должен составлять в пределах от 10 до 100.

Результаты собственного исследования показали, что значение R/S

достоверно увеличивалось в процессе вегетации томатов по сравнению с

начальной фазой развития растения, так в фазу всходов R/S составил 0,91±0,3, в

фазу бутонизации - 5,29±1,2*, в фазу цветения и плодоношения 17,95±2,1* и

24,7±2,9* соответственно, что обусловлено изменеием характера и количества

эксудатов корневой системы томатов в процессе развития растения.

Известно, что количество микроорганизмов в ризосфере меняется в течение

вегетации растений, однако данные по такому важному показателю состояния

микробиоты ризосферы и ризопланы растений, как частота встречаемости,

противоречивы. Так, работами М.Н. Артамоновой (2017) показаны высокий

уровень частоты встречаемости спорообразующих бактерий, энтеробактерий и

псевдомоносов в ризосфере и ризоплане тыквы в фазу плодоношения. В то же

время Е.В.Калмыковой (2012) показано, что наибольшее количество ризобактерий

сосредоточено в прикорневой зоне в период интенсивного развития растения,

когда происходит активное выделения через корни органических веществ. По

мнению этого автора ко времени созревания растения количество микробов в

ризосфере обычно уменьшается. Собственные исследования показали, что

максимальные показатели частоты встречаемости и численности

микроорганизмов в прикорневой зоне томатов были в фазу плодоношения.

Наиболее высокие показатели частоты встречаемости во время всего

вегетационного периода растения выявлены у вида P.pseudoalcaligenes, так в фазу

плодоношения они составили 94,6±2,4% в ризосфере и 87,5±2,6% в ризоплане.

Известно, что микробиота прикорневой зоны растений является одним из

основных компонентов агроэкосистемы, способствующая ее нормальному

118

функционированию (Добровольская, 2002; Терещенко, Бубина, 2009). Для

экологической характеристики компонентов микробиоты ризосферы и ризопланы

томатов и раскрытия ее ценотической структуры применяли метод учета

количественных соотношений встречаемости отдельных типологических групп

микроорганизмов.

Основной бактериального камплекса ризосферы и ризопланы томатов был

представлен видами – P. pseudoalcaligenes, P. fluorescens, A. globiformis и E.

аerogenes, которые входили в доминантную группу на протяжении всего периода

вегетации томатов. Максимальные значения показателя постоянства и в

ризосфере, и в ризоплане на протяжении всех периодов вегетации томатов и в

ризосфере и в ризоплане выявлены у вида P.pseudoalcaligenes: в фазу всходов -

74,6%±2,6 и 64,5%±1,4, в фазу бутонизации - 81,3%±2,8 и 73,8%±2,1, в фазу

цветения - 82,6%±2,5 и 81,5%±2,8 и в фазу плодоношения 89,6%±2,4 и 87,5%±2,6

соответственно.

Уровень видового разнообразия микробоценоза является одним из наиболее

важным критериев устойчивости основных экологических функций почвы и

позволяет дополнить картину количественных показателей экосистемы

(Терещенко, Бубиной, 2009; Dobrovol’skaya et al., 2015). Проведенные

исследования выявили снижение показателя видового разнообразия в процессе

вегетации томатов в ризосфере в 20,4 раза и в ризоплане в 22,8 раза. При

незначительном снижении количества видов полученные данные

свидетельствуют о росте численности микроорганизмов.

Индекс флористической значимости позволяет выявить участие отдельных

видов в структуре микробиоценоза. В процессе определения индекса

флористической значимости показана смена экологически значимых видов в

разные фазы развития томатов. Однако, наиболее значимыми представителями

микробиоты прикорневой зоны являлись ризобактерии рода Pseudomonas,

которые демонстрировали стойкий рост индекса флористической значимости во

все фазы вегетации томатов в ризосфере и ризоплане, достигая максимального

119

уровня в фазу плодоношения – 13,0±0,1* и 12,3±0,4* соответственно (4,0±0,2* и

3,1± 0,3* в фазу всходов; р<0,05).

Индекс контагиозности характеризуется коэффициентом вариации

и показывает равномерность распределения видов в пространстве на единицу

площади (Сытник, 1989). При случайном распределении бактерий исследуемого

микробиоценоза прикорневой зоны томатов степень контагиозности равна

единице. Групповое распределение характеризуется индексом контагиозности

выше единицы. В случае равномерного распределения микроорганизмов значение

степени контагиозности меньше единицы. Собственные исследования показали,

что доминантная группа микробиоценоза ризосферы и ризопланы томатов

характеризовалась равномерным распределением в пространстве и их индекс

контагиозности достоверно увеличивался в процессе вегетации растения, что

свидетельствует о равномерном участии в горизонтальной структуре микробного

сообщества основных симбионтов биоценоза. Максимальные значения индекса

контагиозности выявлены у ризобактерий рода Pseudomonas в фазу

плодоношения в ризосфере 0,66*±0,03 и в ризоплане 0,64* ± 0,02.

Установлено, что ценотип исследуемого бактериального блока ризосферы и

ризопланы изменялся на уровне экосистемы и имел последовательный характер.

Анализ видового состава микробных ассоциаций ризосферы и ризопланы выявил

стабильность биоценотических связей, проявляющаяся равномерным участием в

горизонтальной структуре микробного сообщества доминантных видов, ростом

их индекса контагиозности в процессе вегетации томатов и увеличением

доминирования основных симбионтов на фоне снижения представителей

добавочной и транзиторной флоры.

По результатам анализа экологических и микробиологических показателей

культивируемой части бактериального сообщества ризосферы и ризопланы L.

esculentum Mill. вид P.pseudoalcaligenes имел максимальные значения

численности, частоты встречаемости, индекса экологической значимости и

показателя постоянства. В условиях экосистемы микробно-растительных

взаимодействий особую значимость приобретает вопрос о влиянии

120

микросимбионтов на макросимбионты, поэтому дальнейшее исследование было

направлено на оценку воздействия на томаты доминантного вида ризобактерий

P.pseudoalcaligenes.

Известно, что колонизация бактериями корней растений начинается с

адгезии бактериальных клеток на поверхности корней. Далее метаболическая

активность почвенных микроорганизмов в значительной мере оказывает влияние

на плодородие почвы и рост растений. Г.К. Будниковым (2010) показано, что

ненасыщенные жирные кислоты повышают адгезивные свойства бактерий и их

адаптивный потенциал. Любые изменения в микросимбиоценозе провоцируют

различия в механизмах синтеза жирных кислот микроорганизмов, которые в свою

очередь влияют на поверхностные характеристики клеток бактерий (Захарова,

Сухих, 2015).

В связи с этим в собственных исследованиях был определен состав жирных

кислот P.pseudoalcaligenes в различные фазы вегетации томатов. Показано,

что по сравнению с фазой всходов количество ненасыщенных жирных кислот

Cis-9-гексадеценовой и Trans-9-октадеценовой увеличивалось в фазу

плодоношения в 1,3 раза и в 1,4 раза соответственно, что свидетельствовало о

росте адгезивной активности и адаптивного потенциала данных ризобактерий в

процессе вегетации растения.

Подтверждение изменений адгезивных свойств P.pseudoalcaligenes в

процессе вегетации проводили при помощи АСМ. Проведенные исследования

показали увеличение способности данных бактерий к адгезии, достигавшей

максимума в фазу плодоношения (75,0±3,0* нН), что совпадает с наивысшим

уровнем ненасыщенных жирных кислот (Cis-9-гексадеценовая кислота – 24,21%

±0,7*; Trans-9-октадеценовая – 13,04 %±0,7*).

Существует прямая и опосредованная стимуляция роста растений. Прямая

или непосредственная стимуляция роста растений осуществляется за счет

синтеза метаболитов, полезных для растений. Литературные данные

свидетельствуют о способности бактерий рода Pseudomonas синтезировать

различные фитогормоны. Например, ризобактериальные виды P. amygdali, P.

121

aureofaciens, P.fluorescens, Р. putida и P. syringae pv savastanoi способы

синтезировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), оказывающую

положительное влияние на корневую систему растения-ассоцианта (Храмцова,

2006; Лукаткин, 2009). Известны различные способы синтеза данного

фитогормона бактериями, одним из самых распространенных считают

образование ИУК из ее предшественника L-триптофана.

Для выявления способности ризосферных штаммов P. pseudoalcaligenes к

синтезу триптофана в собственных исследованиях у них проводили выявление

гена trp A, ответственный за синтез L-триптофана (предшественника ИУК).

Обнаружено, что максимальная концентрация копий участков данного гена

наблюдалась у изолятов, полученных из ризосферы растения в фазе

плодоношения – 53*106копий ДНК/мл. Минимальные концентрации участков

искомого гена выявлялись у ризобактерий, выделенных из ризосферы томатов в

фазе всходов. Данные показатели составили 0,8*104копий ДНК/мл.

Далее определяли опосредованную стимуляцию роста растений

ризосферными изолятами P. pseudoalcaligenes за счет вытеснения и подавления

развития почвенных фитопатогенов или микроорганизмов, угнетающих рост

растений.

Согласно литературным данным ризобактерии рода Pseudomonas обладают

антагонистической активностью по отношению к бактериальным и грибковым

фитопатогенам (Клыкова, 2016; Анохина, 2011; Романенко, 2008). В работе О.М.

Минаевой (2008) показана способность штамма Pseudomonas spр. В-6798

подавлять рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum v ar. lini и F.

oxysporum var. gladioli, приводящим к развитию корневых гнилей злаковых

культур. Однако антагонистическая активность ризобактерий вида P.

pseudoalcaligenes по отношению к фитопатогенам остается не изученной. Более

того, известны и фитопатогенные штаммы бактерий данного рода, например P.

pseudoalcaligenes var. citrulli, являющийся патогеном для арбуза, P.

pseudoalcaligenes var. konjac, вызывающий заболевание съедобного растения

122

konjac и P. syringae pv. Lachrymans, поражающий овощные культуры (Смирнов,

1990).

Проведенные исследования показали, что ризосферные штаммы P.

pseudoalcaligenes обладают антагонистической активностью по отношению к

бактериальным фитопатогенам Pectobacterium carotovora subspр carotovora и

Pseudomonas syringae pv. Lachrymans. Достоверно более высокий уровень

активности отмечали по отношению к штамму Pseudomonas syringae pv.

Lachrymans (6,5±1,2*мм в фазу всходов, 8,1±1,3*мм; 9,2±1,3*мм и 10,4±1,7*в

фазы бутонизации, цветения и плодоношения соответственно). Максимальный

уровень антагонистической активности выявили в фазу плодоношения по

отношению к обоим фитопатогенам, и увеличение зоны ингибирования роста

отмечали в 1,6 раз для P. carotovora и P. syringae. Следовательно, в условиях

микробно-растительного взаимодействия показано наличие как прямой, так и

опосредованной стимуляции роста томатов под действием ризосферных штаммов

P. pseudoalcaligenes.

123

ВЫВОДЫ

1. В ходе первичного скрининга ризобактериальных ассоциаций

томатов установлено, что в таксономическом составе культивируемого

гетеротрофного бактериального блока прикорневой зоны L.esculentum Mill

преобладают тринадцать видов ризобактерий, относящихся к девяти родам и

восьми семействам - Moraxellaceae, Micrococcaceae, Pseudomonadaceae,

Alcaligenaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Burkholderiaceae и Shewanellaceae.

Наибольшая численность ризобактерий выявлена в фазу плодоношения томатов,

отмечался рост данного показателя в ризосфере в 19,4 раза, в ризоплане в 20,5 раз

по сравнению с фазой всходов. Среди представителей исследуемых бактерий

ризосферы и ризопланы вид P. pseudoalcaligenes превалировал по показателю

численности и частоты встречаемости, показывая максимальные значения в фазу

плодоношения(52,40±11,70 lgКОЕ/г; 94,6±2,4% и 14,55±2,23lgКОЕ/г; 87,5±2,6%

соответственно).

2. В процессе развития томатов выявлены изменения межвидовых

взаимоотношений в бактериальном блоке ризосферы и ризопланы. Среди

доминантной группы бактерий ризосферы и ризопланы во все фазы вегетации

томатов наивысшие значения показателя постоянства выявлены у вида P.

pseudoalcaligenes(89,6±2,4% и 87,5±2,6% в фазу плодоношения в ризосфере и

ризоплане соответственно). Доминирующее значение вида P. pseudoalcaligenesв

структуре ценотипа прикорневой зоны томатов во все фазы вегетации

подтверждалось показателями индекса контагиозности (<1,0) и флористической

значимости (13,0±0,1 и 12,3±0,4 в ризосфере и ризоплане в фазу плодоношения

соответственно). Численность культивируемых ризосферных бактерий

достоверно превышала численность бактерий ризопланы, однако показатель

видового разнообразия в ризоплане был выше, чем в ризосфере (в фазу

плодоношения в ризосфере и ризоплане соответственно 0,05±0,02 и 0,11±0,03).

3. Изменения в микросимбиозе в процессе вегетации томатов

сопровождались повышением уровня у ризосферных изолятов P.

124

pseudoalcaligenes Trans-9-октадеценовой и Cis-9-гексадеценовой ненасыщенных

жирных кислот в 1,4 и 1,3 раза соответственно. Их количество достигало

максимума в фазу плодоношения, что свидетельствовало о повышении

адгезивной активности бактерий.

Изучение адгезивных свойств P.pseudoalcaligenes в процессе вегетации,

проведенное при помощи атомно-силовой микроскопии, также показало

увеличение способности данных бактерий к адгезии, уровень которой достигал

максимума в фазу плодоношения (75,0±3,0 нН).

4. Показано, что в условиях микробно-растительных взаимодействий

ризосферные штаммы P. pseudoalcaligenes могут оказывать положительное

влияние на томаты. Выявление гена trp A, ответственного за синтез L-триптофана,

стимулирующего рост корневой системы растения-ассоцианта, показал, что

максимальная концентрация копий участков данного гена наблюдалась у

изолятов, полученных из ризосферы растения в фазе плодоношения –

53*106копий ДНК/мл, минимальная в фазу всходов – 0,8*10

4 копий ДНК/мл.

Установлена антагонистическая активность P. pseudoalcaligenes по

отношению к бактериальным фитопатогенам Pectobacterium carotovora subspр

carotovora и Pseudomonas syringae pv. Lachrymans, максимально проявлявшаяся в

фазу плодоношения соответственно. Наиболее высокий уровень активности

выявлен к штамму Pseudomonas syringae pv. Lachrymans (6,5±1,2*мм в фазу

всходов, 8,1±1,3*мм; 9,2±1,3*мм и 10,4±1,7*в фазы бутонизации, цветения и

плодоношения соответственно).

125

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абдуллаева, Ш.А. Видовой состав ксилотрофных грибов обнаруженных на

древесных растениях, используемых в озеленении городов Азербайджана /

Ш.А. Абдуллаева, С.И. Махмудов, С.М. Джабраилзаде и др. // Вестник

Московского государственного областного университета. Серия

«Естественные науки». - 2014. - № 1. С. 38–45.

2. Акимова, Е.Е. Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798

нафитопатогенные грибы и высшие растения: дис. ... канд. биол. наук:

03.00.16 /Акимова Елена Евгеньевна. - Томск, 2007.- 134 с.

3. Алесина, Н.В. Влияние различной влажности почвы на состав микробных

ценозов ризосферы и ризопланы на примере овса (Avena sativa) / Н.В.

Алесина, Т. А. Снисаренко / Вестник Московского государственного

областногоуниверситета. Серия «Естественные науки». – 2010. - №2. – С.

38–45.

4. Анохина, Т.О. Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода

Pseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие

полициклическиеароматические углеводороды: дис. ... канд.биол.наук:

03.01.06/ Пущино, 2011. - 146 с.

5. Артамонова, М.Н. Антагонистическая активность ассоциативных

ризобактерий / М.Н. Артамонова, А.С. Алексеева, Н.И. Потатуркина-

Нестерова // Международный журнал экспериментального образования. -

2013. - № 10. (часть2). - С. 276-279

6. Артамонова, М.Н. Ризосферные бактерии Bacillus subtilis и их

ростостимулирующее влияние на Cucurbita pepo L. : дис. ...канд.биол.наук:

0,.02.03 / Артамонова Марина Николаевна. - Москва, 2017. - 181с.

7. Бегжанова, З. С. Особенности ризосферной микрофлоры

пустынныхрастений - фитомелиорантов в южном Приаралье / З. С.

Бегжанова // Актуальныепроблемы современной науки. – 2013. - №2. – С.

215-215.

126

8. Беззубенкова, О.Е. Микрофлора ризосферы и ризопланы и еѐ влияние на

растительный организм / О.Е. Беззубенкова, М.Н. Юхлимова, Н.И.

Потатуркина, Н.И. Нестерова // Естественные и технические науки – 2012. –

№ 4. – С. 99-102.

9. Бирюкова, О.В. Эндофитная ризобактерия Klebsiella planticola,

взаимодействие с растением и цнозом микромицетов в фитоплане и

ризосфере: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07 /Бирюкова Оксана

Владимировна. – М., 2001. – 169 с .

10. Благова, Д.К. Выделение и характеристика бактериальных эндофитов

моркови (Daucus carota var. sativus) / Д.К. Благова, Е.Р. Сарварова, Р.М.

Хайруллин // Вестник Оренбургского государственного университета. –

2014. - № 13. – С. 13-16.

11. Блинков Е. А. Экологическая оценка влияния абиотических факторов на

ассоциативный симбиоз Klebsiella planticola ТСХА-91 и Cucumis sativus L.:

автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.02.08, 03.02.03/ Блинков Евгений

Александрович. - М. - 2013 - 22с.

12. Бороздина, И. Б. Сравнительная характеристика бактерий рода Bacillus

семейства Берѐзовые (Betulacaea) при культивировании на искусственных

питательных средах / И. Б. Берездина // Вестник АГАУ. – 2011. - №2. –

С.43-48.

13. Боронин, А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие

росту и развитию растений / А.М. Боронин // Соросовский журнал. – 1998. –

№ 10. – С. 25–31.

14. Боронин, А.М. Биологические препараты на основе псевдомонад /А.М.ю

Боронин, В.В. Кочетков // АГРО XXI. - 2000. - №3. - С. 3-5.

15. Бурова, Ю.А. Исследование содержания биологически активных веществ в

культуральной жидкости бактерии Pseudomonas aureofaciens при хранении

/Ю.А. Бурова, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Вестник биотехнологии и

физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – М., 2012. – Т.8, №3.

– С. 26–30.

127

16. Бурова, Ю.А. Действие культуральной жидкости бактерии Pseudomonas

aureofaciens на развитие семян пшеницы и фитопатогенных грибов / Ю.А.

Бурова, В.В. Ибрагимова, В.В. Ревин // Известия ТулГУ. Естественные

науки. Вып. 3. – Тула: ТулГУ, 2012. – С. 198–206.

17. Бурова, Ю.А. Получение бактериальной суспензии Pseudomonas

aureofaciens 2006 на мелассе и изучение некоторых ее свойств / Ю.А.

Бурова, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Вестник Оренбургского

государственного университета, № 10 (146) ,- 2012. - С. 61–65.

18. Бурова Ю.А. Изучение свойств бактерии Pseudomonas aureofaciens

иполучение на ее основе биопрепарата для защиты растений : автореф. дис.

... канд. биол. наук: 03.01.06/ Бурова Юлия Александровна – М.– 2013. 19 с.

19. Бухарин, О.В. Ассоциативный симбиоз. / О.В. Бухарин, Е.С. Лобакова, Н.В.

Немцева, С.В. Черкасов // Екатеринбург: УрО РАН,- 2006. – 264 с.

20. Бухарина, И.Л. Физиология растений: метод. пос. / сост. И.Л. Бухарина,

О.В. Любимова. – Ижевск: ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА, 2009. – 59 с.

21. Волкогон В.В. Асоциативные азотфиксирующие микроорганизмы/ В.В.

Волкогон // Микробиол. журн. - 2001.- 62, №2. - С.51-68.

22. Воробейков, Г.А. Исследование эффективности штаммов ассоциативных

ризобактерий в посевах различных видов растений / Г.А. Воробейков //

Известия Российского государственного педагогического университета им.

А.И. Герцена. –2011. – № 141. – С. 114 – 123.

23. Воронина, Е.Ю. Влияние микоризосферы на видовой состав и структуру

сообщества почвенных микромицетов по сравнению с ризосферным и

гифосферным эффектами / Е.Ю. Воронина // Микология и фитопатология. –

2001. – Т. 45. – № 1. – С. 26-33

24. Гажеева, Т.П. Динамика численности и состава микроорганизмов

ризосферы некоторых злаковых растений в процессе их роста и развития /

Т.П.Гажеева, Т.Х. Гордеева, С.Н. Масленникова // Вестник ОГУ. – 2011. -

№12. – С.328-330

128

25. Гордеева, Т.Х. Формирование микробно - растительных сообществ

ризосферы в онтогенезе зерновых культур / Т. Х. Гордеева, С. Н.

Масленникова //Научный журнал КубГАУ. – 2012. - № 81. – С. 377-386.

26. Гостев, В. В. Бактериальные биопленки и инфекции / В. В. Гостев, С. В.

Сидоренко // Журнал инфектологии. 2010. – №2(3). – С. 4-15.

27. Гуревич, П. А. Антагонистическая активность некоторых штаммов рода

Bacillus против фитопатогенных микромицетов / П. А. Гуревич, В. М.

Крутьков, Б. П. Струнин // Вестник Казанского технологического

университета. – 2012. -№11. – С.137-139.

28. Добровольская, Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. – М.: ИКЦ

«Академ- книга», 2002. – 282 с.

29. Дунайцев, И.А. Солюбилизация фосфатов микроорганизмами-

супрессорами фитопатогенов / И.А. Дунайцев, С.К. Жиглецова, С.Г.

Бесаева, М.В. Клыкова, А.В. Ариповский, Т.Н. Кондрашенко, Л.В.

Коломбет. // Межд.Организация по биол. Борьбе с вредными животными и

растениями. – Bнф. Бюллетень 38. – СПб. – 2007. – C. 120-123.

30. Егоров, С.Ю. Регуляция жизнедеятельности микроорганизмов-

стимуляторов роста растений : пособие / С.Ю. Егоров– Казань: Изд-во

Казан. ун-та, 2003. - 97 с.

31. .Емцев, В. Т. Микробиология: учебник для вузов / В. Т. Емцев, Е. Н.

Мишустин.– М.: Дрофа, 2005. –445 с.

32. Захарченко, Н.С. Роль ассоциаций микроорганизмов с растениями в

решении экологических проблем / Н.С. Захарченко, С.В. Пиголева, А.А.

Лебедева, О.В. Фурс, М.А. Чепурнова, Л.С. Карнова, И.Ф. Пунтус, В.В.

Кочетков // Сб. "Экотоксикология-2009. Современные Биоаналитические

Системы, Методы и Технологии"- Пущино-Тула- 2009.- C. 92-93.

33. Зверев, А.О. Метагеномная характеристика ризосферного эффекта

при выращивании злаковых культур в черноземной и

дерново-подзолистой почве / А.О.Зверев, Е.В. Першина, Е.Е. Андронов,

129

Е.Н. Серикова // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т.51. - № 5. - С.

654-663.

34. Звягинцев, Д.Г. Биология почв / Д.Г. Звягинцев, И.Л. Бабьева, Г.М. Зенова–

М.: Изд-во Моск. ун-та, 2005. – 445 с

35. Зенова Г.М. Практикум по биологии почв / Г.М. Зенова, А.Л.Степанов,

А.А.Лихачев, Н.А. Манучарова. - М.: МГУ, 2002. – 120 с.

36. Злотников, А.К. Новый бактериальный эндофит сельскохозяйственных

культур / 3лотников А.К., Казакова М.Л., 3лотников К.М., Казаков А.В. //

С.-х. биол. – 2006. – № 3. – С. 62-66.

37. Иванова, Е.И. Элементы технологии производства, хранения,

транспортировки и переработки овощебахчевой продукции/ Е.И. Иванова,

В.В.Коринец, А.А. Жилкин. - Астрахань: «Нова», 2004. - 160 с.

38. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей

среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы

регуляции их развития /Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, A.JI. Гинцбург //

Генетика. – 2004. – Т.40. – №11. – С.1445–1456.

39. Ильина, Т.С. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности /

Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Молекулярная генетика,

микробиология и вирусология. - 2006. №3. - С. 22-29.

40. Иутинская, Г.А. Биорегуляция микробно-растительных систем:

Монография / Г.А. Иутинская, С.П. Пономаренко Андреюк Е.И. /Под ред.

Г.А. Иутинской, С. П. Пономаренко. - К.: "НІЧЛАВА", 2010. - 472 с.

41. Кабрера Фуентес, Э.А. Скрининг микроорганизмов, способных к

подавлению роста микромицетов рода Fusarium / Э.А. Кабрера Фуентес,

Р.Т. Мухаметшина, Р.А. Габитов, Н.Г. Захарова, Т.В. Багаева, Р.П.

Ибатуллина // Ученые записки Казанского государственного университета.

Естественные науки. – 2010. – Т. 152, кн.2. – С. 122-127.

42. Казарцев, И. А. Молекулярные методы исследования грибных сообществ/

И. А. Казарцев // Проблемы микологии и фитопатологии в ХХI веке.

Материалы международной научной конференции, посвященной 150-летию

130

со дня рождения члена-корреспондента АН СССР, профессора Артура

Артуровича Ячевского. - Национальная академия микологии, БГС, Дизайн-

студия "Дозор" - СПб.: ООО "КопиР Групп", 2013. – С. 75 – 78.

43. Казеев, К. Ш. Биологическая диагностика и индикация почв : методология и

методы исследований / К.Ш. Казеев, С. И. Колесников, В. Ф. Вальков. -

Ростов н/Д : Изд-во Ростов. гос. ун-та, 2003. - 350 с.

44. Калмыкова, Е.В. Влияние приемов возделывания озимой пшеницы на

плодородие каштановых почв волгоградской области /Е. В. Калмыкова //

Научный журнал КубГАУ. - 2012. - №75(01). - С.1-12

45. Кацы, Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на

ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Е.И.

Кацы, под ред. В.В. Игнатова. – Саратов: Сарат. ун-та, 2003. – С. 17.

46. Кириченко, О.В., Влияние растительно-бактериальной композиции на

продуктивность яровой пшеницы / О.В. Кириченко, А.В. Жемойда, С.Я.

Коць // Агрохимия. - 2005. - №10. - с. 41-47

47. Клыкова, М. В. Биологическое обоснование использования штамма

Рseudomonas chlororaphis vsk-26a3 в качестве продуцента антимикробных

препаратов: дис. ... канд. биол. наук: 03.02.03, 0.01.06/ Клыкова

МаринаВикторовна. - Оболенск, 2016. - 168с.

48. Клячина, С.Л. Предшественники, минеральное питание и урожайность

льна-долгунца сорта Т-18/ С.Л. Клячина, А.П. Крепков // Сб. Тр. преп. и

студ. НГАУ,посвящ. 5-лет. юбилею создания ТФ НГАУ. Томск: ЦНТИ,

1998. Вып. 1. С. 95–100.

49. Колесников, О. В. Влияние ксенобиотиков и тяжелых металлов на систему

микроорганизм – растение.: дис. ... канд. биол. наук: 03.02.03 / Олег

Васильевич Колесников. – М., 2012. – 119 с.

50. Коптева, Т. С. Ростостимулирующая активность некоторых представителей

рода Bacillus филлоплана древесных растений г. Ставрополя / Т. С. Коптева,

Н. В.Ерина // Научный журнал КубГАУ. – 2015. - № 114. – С. 1-10.

131

51. Корнев, К.П.Черная бактериальная пятнистость томатов в России / К.П.

Корнев, Е.В. Матвеева, Э.Ш. Пехтерева, В.А. Политыко, А.Н. Игнатов, Н.В.

Пунина // Защита и карантин растений. – 2010. – №5. – С. 48-49.

52. Коробова, Л.Н. Особенности сукцессии микробных сообществ в

черноземах Западной Сибири: дис. … д-ра биол. наук: 03.02.03/ Лариса

Николаевна Коробова – Новосибирск, 2007. - 304с.

53. Котляров, В.В. Бактериальные болезни культурных растений: учебное

пособие / В. В. Котляров. – Краснодар: КубГАУ, 2008. – 324 с.

54. Кравченко, Л.В. Выделение и фенотипическая характеристика

ростстимулирующих ризобактерий (PGPR) сочетающих высокую

активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов /

Л.В. Кравченко, Н.М. Макарова, Т.С.Азарова, Н.А. Проваров, И.А.

Тихонович // Микробиология. – 2002. – Т.71. – №4. – С.521–525.

55. Кравченко, Л.В. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и ан-

тифунгальную активность штаммов Pseudomonas / Л.В. Кравченко, Т.С.

Азарова, Е.И. Леонова-Ерко [и др.] // Микробиология. – 2003. – № 72 (1). –

С. 48-53.

56. Кравченко, Л.В. Видовые особенности состава корневых выделений

растений и его изменение в ризосфере под влиянием почвенной

микрофлоры/ Л.В. Кравченко, А.И.Шапошников, Н.М.Макарова, Т.С.

Азарова, К.А. Львова, И.И. Костюк, И.А.Тихонович //

Сельскохозяйственная биология, 2011, № 3, с. 71-75.

57. Криг, Н. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. / Н. Криг, П. Снит, С.

Уильямс, Э. Бок, Д. Хоулт, Р. Беркли, Д. Бун, Дж. Стейли, П. Стин: пер. с

англ. − М. : МАКС Пресс, 2007.

58. Круглова, Е.Д. Специфические стратегии клубеньковых и фитопатогенных

бактерий при инфицировании растений/ Е.Д. Круглова // Физиология и

биохимия культурных растений. - 2009 Т.41 №1. - С.3-15.

59. Кудоярова, Г.Р. Участие этилена в ростовой реакции растений на уровень

минерального питания// Агрохимия. 2011. - .№2. - С. 10-15.

132

60. Кудоярова, Г.Р. Образование фитогормонов почвенными ризобактериями

как фактор стимуляции роста растений/ Г.Р. Кудоярова, И.К. Курдиш, А.И.

Мелентьев. // Известия Уфимского научного центра РАН. 2011. - № 3-4. -

С. 5-16.

61. Леонтьевская, Е. А. Структура эпифитно-сапротрофных бактериальных

комплексов зерновых и овощных культур: дис. … канд. биол. наук: 03.02.03

/Леонтьевская Елена Алексеевна. – М., 2014. - 89 с.

62. Лобакова, Е. С. Ассоциативные микроорганизмы растительных симбиозов:

дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.12, 03.00.24 / Лобакова Елена Сергеевна. – М.,

2004. - 287 c.

63. Логинов, О.Н. Триглицеридпептиды – новая группа антигрибных

метаболитов псевдомонад (Pseudomonas) / О.Н. Логинов, С.П. Четвериков,

В.Н Гусаков // ДАН. 2003. - Т. 393. № 5. - С. 715-717.

64. Логинов, О.Н. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями

Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 / О.Н. Логинов, С.П. Четвериков

//Биотехнология. - 2003. - № 5. - С. 22-25.

65. Лукаткин, А. А. Исследование антифунгальных свойств Pseudomonas

aureofaciens 2006 / А. А. Лукаткин, С. А. Ибрагимова, В. В. Ревин / Вестник

ОГУ. – 2009. - №6 – С.211-213

66. Магданова, Л.А. Исследование видового разнообразия, мутационной и

биопленкообразующей активностей представителей микробного биоценоза

плавательного бассейна / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Современные

проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов:

Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием.

Москва, 2000. - С. 119.

67. Малинина, А.Ю. Состав микробных ценозов ризосферы и ризопланы

астрагала австрийского (Astragalus austriacus l.), произрастающего на

карбонатных почвах / А.Ю. Малинина, Т.А. Цуцупа //Актуальные проблемы

естественно-научного образования, защиты окружающей среды и здоровья

человека. 2016. Т. 2.- № 2. - С. 233-236.

133

68. Мальцев, С.В. Что такое биопленка? / С.В. Мальцев, Г.Ш. Мансурова //

Педиатрия. 2011. - №5 (11). - С. 86-89.

69. Масленникова, С. Н. Биоразнообразие ризосферных микроорганизмов

древесных пород / С. Н. Масленникова, А. И. Шургин, В. К. Чеботарь //

Вестник Казанского технологического университета. – 2014. - №4. – С.193-

197.

70. Мачулкина, В.В. Влияние способов уборки на качество плодов томата / В.В.

Мачулкина, Т.А. Санникова, В.В. Чаленко // Овощи России. – 2009. - №4. –

С. 60-63.

71. Медведев, С.С. Физиология растений / С.С. Медведев. – СПб.: БХВ-

Петербург, 2013. – 512 с.

72. Мелентьев, А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Coh. в

агроэкосистемах / А. И. Мелентьев.- М.: Наука, 2007. – 147 с.

73. Минаева, О. М. Антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и

стимулирующее влияние на рост и развитие растений

формальдегидутилизирующих бактерий Pseudomonas sp. B-6798 / О. М.

Минаева, Е. Е. Акимова, С. Ю. Семенов // Вестник Томского

государственного университета. Биология. – 2008. - №2. – С.28-42.

74. Моргун, В.В. Ростстимулирующие ризобактерии и их практическое

применение/ В.В. Моргун, С.Я. Коць, Е.В. Кириченко // Физиология и

биохимия культурных растений. – 2009. – Т. 41. - № 3. – С. 187–207.

75. Морецкая У. Ф. Формирование микробиоценозов в почве под озимой

пшеницей / У. Ф. Морецкая, М. М. Демченко // Земледелие. – 2008. – № 2. –

С. 12-13.

76. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов. – М.:

ACADEMA», 2005. - 603с.

77. Нетрусов, А.И. Экология микроорганизмов / Нетрусов А.И., Бонч-

Осмоловская Е.А., Горленко В.М., Иванов М.В., Каравайко Г.И., Кожевин

П.А. и др. Под ред. Нетрусова А.И. – М.: Академия, 2004. – 272 с.

134

78. Николаев, Ю.А. Микробные биопленки: перспективы использования при

очистке сточных вод/ Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов //Вода: химия и

экология. 2008. - № 2. - С.11-13.

79. НТП 10-95. Нормы технологического проектирования теплиц и

тепличныхкомбинатов для выращивания овощей и рассады [Текст].- Введ.

1996-07-01. – М.:Ротапринт Гипронисельпром, 1999.-84 с.

80. Олюнина, Л. Н. Изменения в спектре свободной и конъюгированных форм

индолил-3-уксусной кислоты при действии экзогенной иук на проростки

пшеницы / Л. Н. Олюнина, О. М. Лабынцева, А. Г. Куватова, Пильщикова

Н.В. // Физиология растений с основами микробиологии – М.: Мир, 2004. –

184 с.

81. Попкова, С.М. Микробная экология человека в условиях техногенного

прессинга промышленных городов Восточной Сибири: дис. ... докт. биол.

наук: 03.00.16/София Марковна Попкова. - Иркутск, 2004. - 301 с.

82. Приказ от 22 апреля 1985 г. № 535 об унификации микробиологических

(бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-

диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений

83. Проворов, Н.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология

симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными

грибами. / Н.А. Проворов, А.Ю. Борисов, И.А. Тихонович // Журнал

общейбиологии. – 2002. – № 63. – С. 451-472.

84. Проворов Н.А. Растительно-микробные симбиозы как эволюционно

целостные системы/ Н.А. Проворов, Н.И. Воробьев //Сельскохозяйственная

биология, 2011. - № 3. - С. 29-33.

85. Прунтова, О.В. Лабораторный практикум по общей микробиологии / О. В.

Прунтова, О. Н. Сахно. - Владим. гос. ун-т. - Владимир : Изд- во ВлГУ,

2005. - 76 с. - ISBN 5-89368-586-5.

86. Романенко, Н.Д. Перспективы использования бактерий-антагонистов

против наиболее фитопатогенных видов нематод, вирусов, грибов /

135

Н.Д.Романенко, И.О. Попов, С.Б. Таболин // АГРО XXI. – 2008. - № 3. – С.

23-27.

87. Романычева, А.А. Сравнительная оценка микробоценоза почвв ризосфере

Zea mays в условиях монокультуры и всевообороте на разных

агрохимических фонах : дис. ... канд. биол. наук: 06.01.04 /Анна

Александровна Романычева. М., 2014. - 128с.

88. Свешникова, Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas - антагонисты

фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной

практике: автореф. дис. канд. биол. наук. 03.00.07 / Свешникова Елена

Витальевна . Уфа. - 2007. - 23с.

89. Свешникова, Е. В. Новые бактерии рода Pseudomonas - антагонисты

фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной

практике: дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 / Свешникова Елена

Витальевна. -Уфа, 2003. - 189 c.

90. Селиверстова, О.М. Изменение микробного сообщества серой лесной почвы

под посевом злаковых культур при применении органических и

минеральных удобрений / О.М. Селиверстова, Н.В. Верховцева, А.Л.

Степанов, А.А. Корчагин // Агрохимия. – 2008. – № 8. – С. 1-9.

91. Селюк, М.П. Влияние сельскохозяйственных растений на микробиоценоз

почвы в технологии No-till / М.П. Селюк, Е.Ю. Торопова // Ботаника и

природное разнообразие растительного мира: материалы Всерос. науч.

интернет-конференции с междунар. участием. – Казань, 2013. − С. 191-193.

92. Смирнов, В.В Бактерии рода Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова

// Киев: Наукова думка - 1990. -264 с.

93. Снисаренко, Т.А. Влияние некоторых экологических факторов на

микробный состав ризосферы и ризопланы на примере овса посевного

(Avena sativa) / Т.А. Снисаренко, Н.В. Алесина // Вестник МГОУ. Серия

«Естественные науки». – 2014. - №3. – С. 46-51.

94. Сулейманова, Л.Р. Комплексообразование триглицеридпептидов бактерий

рода Pseudomonas c корневыми эксудатами растений / Л.Р.Сулейманова,

136

С.П. Четвериков, О.Н. Логинов // Башкирский химический журнал. - 2007. -

Т. 14, № 3. - С. 47-51.

95. Сулейманова, Л.Р. Комплексообразующая способность метаболитов

псевдомонад с ионами металлов / Л.Р. Сулейманова, С.П. Четвериков, О.Н.

Логинов // Аграрная Россия. – 2009. Специальный выпуск. – С. 130-131.

96. Сулейманова, Л.Р. Метаболиты бактерий рода Pseudomonas: экологичный

механизм взаимодействия с растениями / Л.Р. Сулейманова, С.П.

Четвериков, О.Н. Логинов // Вестник Оренбургского государственного

университета. - 2007. - Вып. № 75. - С. 338-340.

97. Сулейманова, Л.Р. Микроорганизм Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и

биопрепарат «Елена» / Л.Р. Сулейманова, Е.А. Асабина, О.Н. Дубинина,

О.Н. Логинов, С.П. Четвериков, Н.Ю. Черняева, Р.Ф. Хузнаризанова, Н.Н.

Силищев // Токсикологический вестник. - 2008. - № 3. - С. 39-41.

98. Тахмина Х.Ш. Микробные показатели почв территорий г. Астрахань / Х.Ш.

Тахмина // Естественные науки. - 2014. - №1 (46). - С.33-40.

99. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер. – М.: Дрофа,

2004.- 256 с.

100. Тихонович, И.А. Биопрепараты в сельском хозяйстве. Методология и

практика применения микроорганизмов в растениеводстве и

кормопроизводстве / И.А. Тихонович, А.П. Кожемяков, В.К. Чеботарь,

Ю.В. Круглов, Н.В. Кандыбин, Г.Ю. Лаптев - СПб.: ГНУ ВНИИСХМ, 2005.

– 154 с.

101. Тихонович, И.А. Сельскохозяйственная микробиология как основа

экологически устойчивого агропроизводства: фундаментальные и

прикладные аспекты / И.А. Тихонович, Н.А. Прохоров //

Сельскохозяйственная биология – СПб, -2011. - №3.- С. 3-9.

102. Тихонович, И.А. Корневые выделения как важный фактор

формирования наномолекулярных структур ризосферы / И.А. Тихонович,

Л.В. Кравченко, А.И. Шапошников // Доклады Российской академии

сельскохозяйственныхнаук. – 2011. – № 1. – С. 25-27.

137

103. Тихонович, И.А. Симбиозы растений и микроорганизмов:

молекулярная генетика агросистем будущего / И.А. Тихонович, Н. А.

Проворов. – СПб.: Изд-во С-Пб. Ун-та, 2009. – 210 с.

104. Третьяков, Н.Н. Практикум по физиологии растений / Третьяков Н.Н.,

Паничкин Л.А., Кондратьев М.Н. и др. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.:

КолосС, 2003. – 288 с.

105. Третьяков, Н.Н. Физиология и биохимия сельскохозяйственных

растений / Н.Н.Третьяков, Е.И. Кошкин, Н.М. Макрушин и др.; под ред.

Н.Н. Третьякова. – 2- е изд. – М.: КолосС, 2005. – 656 с.

106. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация / М.М. Умаров – М.: Изд-

во Моск. ун-та, 1986. – 133 с

107. Умаров М.М. Микробиологическая трансформация азота в почве /

М.М. Умаров, А.В. Кураков, А.Л. Степанов – М.: ГЕОС, 2007. – 137 с.

108. Феклистова, И.Н Гиббериллины бактерий Pseudomonas aurantiaca:

биологическая активность, подходы к получению и использованию

продуцентов фитогормонов / И.Н. Феклистова, Н.П. Максимова //

Белорусский государственный университет, Минск, - 2009.

109. Феклистова, И.Н. Бактерии Pseudomonas aurantiaca B-162 как основа

биопрепарата для защиты растений / И.Н. Феклистова, Н.П. Максимова //

Земляробства i ахова раслiн.– 2006– № 2– С. 42–44.

110. Феклистова, И.Н. Оптимизация условий синтеза феназина бактериями

Pseudomonas aurantiaca B-162 / И.Н. Феклистова, Н.П. Максимова // Вест.

Белорус. ун-та– Сер. 2: Химия. Биология. География–2005– № 3– С. 29–31.

111. Феклистова, И.Н. Применение синтезирующих антибиотики

феназинового ряда бактерий Pseudomonas aurantiaca для биологического

контроля заболеваний пшеницы / И.Н. Феклистова, Н.П. Максимова //

Вестник БГУ.- Минск. - 2009. - 2(3).- С. 32-36.

112. Феклистова, И.Н. Синтез феназиновых соединений бактериями

Pseudomonas aurantiaca B-162 / И.Н. Феклистова, Н.П. Максимова // Вест.

Белорус. ун-та– Сер. 2: Химия. Биология. География–2005– № 2– С. 66–69.

138

113. Феклистова, И.Н. Стимуляция роста растений бактериями

Pseudomonas aurantiaca B-162 / И.Н. Феклистова, Е.Г. Веремеенко //

Актуальные проблемыизучения фито- и микобиоты: Сб. статей / Под ред.

В.Д. Поликсеновой– Минск:2004– С. 203–205.

114. Феклистова, Н.П. Синтез пирролнитрина бактериями Pseudomonas

aurantiaca B-162 / Н.П. Феклистова, И.Н. Максимова //

Физиологические,биохимические и молекулярные основы

функционирования биосистем: ТрудыБелорусского государственного

университета. Т. 3. ч. 1 / под ред. В.М. Юрина.–Минск: 2008.– С. 148–155.

115. Феоктистова, Н. В. Ризосферные бактерии / Н. В. Феоктистова, А. М.

Марданова, Г. Ф. Хадиева, М. Р. Шарипова // Ученые записки

Казанскогоуниверситета. Серия: Естественные науки. – 2016. - №2. – С.

207-224.

116. Фунг, Т.М. Ассоциативные бактерии Agrobacterium tumefaciens

ризопланы овощных культур Вьетнама: дис. … канд. биол. наук: 03.02.03 /

Фунг Тхи Ми. –М., 2015. – 115 с.

117. Фундаментальная фитопатология / Под ред. Ю.Т. Дьякова. – М.:

Красанд. - 2012. - 512 с

118. Хархун, Е. В. Использование антагонизма Pseudomonas chlororaphis

subsp. aureofaciens при создании экспериментального биопрепарата и его

влияниена состояние микробиоценоза почвы : автореф. дис. канд. биол.

наук: 03.02.08/ Хархун Екатерина Викторовна. – Ростов-на-Дону, 2008. -

24с.

119. Хархун, Е.В. Состояние микробоценоза почвы после применения

биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp.

aureofaciens(Pseudomonas aureofaciens) / Е.В. Хархун, А.В. Полякова, В.В.

Внуков, Д.А. Ким // Фундаментальные исследования. - 2012 . - № 11. – С.

56-60.

139

120. Хмель И.А. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов:

фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий/

И.А. Хмель // Микробиология. 2006. Т.75 № 4. С. 457-464.

121. Храмцова Е.А. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными

бактериями Pseudomonas mendocina. Характеристика регуляторных

мутантов/ Е.А. Храмцова, С.С. Жардецкий, Н.П. Максимова//Вестник БГУ,

Сер.2. - 2006. - №2

122. Хуснетдинова, Л.З. Учебно-полевая практика по физиологии

растений: учебно-методическое пособие / Л.З. Хуснетдинова. – Казань:

Казанский университет, 2013. – 36 с.

123. Цавкелова, Е.А. Гормоны и гормоноподобные соединения

микроорганизмов: обзор / Е.А. Цавкелова, С. Ю. Климова, Т. А. Чердынцева

//Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – Т.42. - №3. – С. 133-143.

124. Цавкелова, Е. А. Микроорганизмы - продуценты стимуляторов роста

растений и их практическое применение / Е. А. Цавкелова, С. Ю. Климова,

Т. А. Чердынцева // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – Т. 42.

- №2. – С.133-143.

125. Чеботарь, И.В. Антибиотикорезистентпость биоплѐночпых бактерий /

И.В. Чеботарь, А.Н. Маянский, Е.Д. Кончакова, A.B. Лазарева, В.П.

Чистякова // Клин, мпкробиол. и антимикроб, хпмиотер. - 2012. - Т. 14, № 1.

- С. 51 - 58.

126. Чеботарь, И. В. Биопленки Staphylococcus aureus: структурно-

функциональные характеристики и взаимоотношения с нейтрофилами:

автореф. дис. ... канд.мед.наук: 03.02.03/ Чеботарь Игорь Викторович. - М.,

2015. - 43с.

127. Чеботарь, В.К. Эффективность применения биопрепарата экстрасол,

А.А.Завалин, Е.И. Кипрушкина / М.: ВНИИА, 2007. – 216 с.

128. Четвериков, С.П. Идентификация новых экзометаболитов некоторых

штаммов Pseudomonas spp. и технология биопрепаратов на их основе :

140

автореф. дис. ... докт. биол. наук: 03.01.06, 03.01.04 / Четвериков Сергей

Павлович. - Уфа, 2012. - 47с.

129. Четвериков, С.П. Комплексообразование триглицеридпептидов

псевдомонад с корневыми экссудатами растений как механизм воздействия

на фитопатогены / С.П. Четвериков, Л.Р. Сулейманова, О.Н. Логинов //

Прикладная биохимия и микробиология. -2009. Т. 45, №5. – С. 506-511.

130. Четвериков, С.П. Новые цитокининподобные метаболиты

Pseudomonas chlororaphis. / С.П. Четвериков, О.Н. Логинов // Известия

Самарского научногоцентра Российской академии наук. 2011. Т. 13. - №

5(3). – С. 218-220.

131. Четвериков, С.П. Оптимизация состава питательной среды для

промышленного производства биопрепарата "Елена" / С.П. Четвериков,

Е.А. Асабина, О.Н. Логинов // Башкирский химический журнал. - 2006. - Т.

13, №2. - С. 10-13.

132. Четвериков, С.П. Цитокининподобные вещества Pseudomonas

chlororaphis ИБ 6 / С.П. Четвериков, Е.А. Асабина // Вестник Оренбургского

государственного университета. – 2009.- №10 - С. 512-513.

133. Чудинова, Ю. В. Характеристика растительно-микробного

сообществаризосферы сорта льна Томской селекции Т-16 в льноводческих

хозяйствах Томской области / Ю. В. Чудинова // Вестник Томского

государственного университета. – 2007. - №300. – С.249-251.

134. Шапошников, А.И. Механизмы антагонистического действия

бактерий на фитопатогенные грибы в ризосфере овощных культур: дис….

канд. биол. наук: 03. 00. 07 / Шапошников Александр Иванович. – М.: РГБ,

2003. – 163 с.

135. Шелудько, А.В. Генетико-физиологические аспекты социального

поведения ассоциативных бактерий Аzospirillum brasilense.: автореф. дис.

док. биол. наук:03.02.03 / Шелудько Андрей Вячеславович. - Саратов., 2010.

– 49 C.

141

136. Шеховцова, Н.В. Образование ауксинов эндофитными бактериями

подземных органов Dactylorhiza maculate (L.) SooOrchidaceae/ Н.В.

Шеховцова,О.А. Маракаев, К.А. Первушина // Вестник ОГУ. – 2012. - №12.

– С. 366-368.

137. Шеуджен, А.Х. Микрофлора чернозема выщелоченного при длительном

применении минеральных удобрений / А.Х. Шеуджен, С.А. Кольцов, О.А.

Гуторова, И.А. Лебедовский, Л.М. Онищенко, М.А. Осипов, С.В. Есипенко

// Международный научно-исследовательский журнал. - 2017. - № 02 (56) ,

Часть 2. - С. 89-94.

138. Широких, А. А. Методические подходы к изучению микроорганизмов

прикорневой зоны растений / А. А. Широких, О. В. Мерзаева, И. Г.

Широких // Сельскохозяйственная биология. – 2007. - №1. – С. 43-55.

139. Широких, И.Г. Изменение структуры ризосферного комплекса

актиномицетов в онтогенезе озимой ржи / И.Г. Широких, О.В.

Мерзаева,Г.М. Зенова // Почвоведение. – 2006. – № 6. – С. 721-725.

140. Широких, И. Г. Изучение микробного потенциала агроценозов для

повышения продуктивности и стрессоустойчивости растений методами

биотехнологии / И. Г. Широких, А. А. Широких, Т. Я. Ашихмина //

Научные доклады / Коми науч. центр УрО РАН. Сыктывкар, 2007. Вып.

490. 28 с.

141. Штерншис, М.В. Биопрепараты в защите растений / М.В. Штерншис,

Ф.С. Джалилов, И.В.Андреева, О.Г. Томилова. - Новосибирск: Изд-во

НГАУ, 2000. - 128 с.

142. Щепитова, Н.Е. Биопленкообразование энтерококками кишечной

микрофлоры животных / Н.Е Щепитова // Известия Оренбургского

государственного аграрного университета. - 2015. - № 1 (51). - С.77-79.

143. Щербаков, А. В. Эндофитные сообщества сфагновых мхов как

источник бактерий - эффективных ассоциантов сельскохозяйственных

культур: автореф. дис. ...канд биол. наук: 03.02.03 / Щербаков Андрей

Васильевич . СПб, 2013. - 23с.

142

144. Юргина, В.С. Роль минерального азота и ассоциативных ризобактерий

в формировании продуктивности редьки масличной / В.С. Юргина //

АгроXXI. 2010. № 4−6. С. 20−21.

145. Achard, P. Ethylene regulates Arabidopsis development via the modulation

of DELLA protein growth repressor function / P. Achard, W.H. Vriezen, D.V.D.

Straeten, N.P. Harberd // Plant Cell. 2003. V. 15.P. 2816–2825.

146. Ali, B. Auxin production by plant associated bacteria: impact on

endogenous IAA content and growth of Triticum aestivum L./ B. Ali, A.N. Sabri,

K. Ljung, S. Hasnain // Letters in Applied Microbiology. 2009.V. 48. P. 542–547.

147. Akkoprii, A. Biological control of fusarium wilt in tomato caused by

Fusarium oxysporum F. sp. Lycopersici by AMF Glomus intraradices and some

rhizobacteria / A. Akkoprii, S. Deneir // J. Phytopathol. -2005. - 153, №9. -

P.544-550.

148. Anandaraj, B. Studies on influence of bioinoculants (Pseudomonas

fluorescens, Rhizobiumsp., Bacillus megaterium) in green gram. / B. Anandaraj,

A.Leema Rose Delapierre.// J. Biosci. Tech.- Vol 1 (2).- 2010.-Р. 95-99.

149. Aparna, M. S. Biofilms: microbes and disease / M. S. Aparna, S. Yadav //

Braz. J. Infect. Dis. – 2008. V. 6. – P. 526–530.

150. Arkhipova, T.N. Ability of bacterium Bacillus subtilis to proceed

cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of

lettuce plants / 98 Arkhipova T.N., Veselov S.U., Melentiev A.I. e.a // Plant and

Soil. – 2004. – Vol. 272. – P. 201-209.

151. Bacon, C.W. Bacterial endophytes: the endophytic niche, its occupants,

utility. In: Plant-associated bacteria. S.S. Gnanamanickam (ed.) / Bacon C.W.,

Hinton D.M. – Netherlands: Springer, 2006, Part 1. – P.: 155-194.

152. Bais, H. P. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis

roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin

production / H. P. Bais, R. Fall, J. M. Vivanco // Plant Physiol – 2004. - V. 134. –

P. 307-319.

143

153. Bais, H.P. The role of root exudates in rhizosphere interactions wit plants

and other organisms / H.P. Bais, L.W. Tiffany, G.P. Laura, S. Gilroy, J.M.

Vivanco // Annual Review of Plant Biology. – 2006. – № 57. – P. 233–266.

154. Barea, J.M Impact on arbuscular mycorrhiza formation of Pseudomonas

strains used as inoculants for biocontrol of soil-borne fungal plant pathogens /

J.M.Barea, G. Andrade, V. Bianciotto, D. Dowling, S. Lohrke, P. Bonfante, F.

O’Gara, C.Azcon-Aguilar // Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64(6): 2304-2307.

155. Bari R., Jones J.D.G. Role of plant hormones in plant defence responses //

Plant Mol. Biol. 2009. V. 69.P. 473–488.

156. Beneduzi, A. Plant-growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Their

potential as antagonists and biocontrol agents / A. Beneduzi, A. Ambrosini,

L.M.P. Passaglia // Genet. Mol. Biol. – 2012. – V. 35, Suppl. 4. – P. 1044–1051.

157. Benizri E., Baudoin E., Guckert A. (2001). Root colonization by inoculated

plant growth-promoting rhizobacteria. Biocontrol Science and Technology. 11(5).

557-574

158. Berg, G. Endophytic and ectophytic potato associated bacterial

communities differ in structure and antagonistic function against plant pathogenic

fungi / G. Berg, A.Krechel, M.Ditz / FEMS Microbiology Ecology. – 2005. – V.

51. – P. 215-229.

159. Bhattacharya, A. Siderophore mediated metal uptake by Рseudomonas

fluorescens and its comparison to iron (III) chelation / A. Bhattacharya // Cey. J.

Sci. (Bio. Sci.) 39 (2):147-155, 2010.

160. Boiero, L. Phytohormone production by three strains of Bradyrhizobium

japonicum and possible physiological and technological implica– tions / L.

Boiero, D. Perrig, O. Masciarelli, C. Penna, F. Cassan, V. Luna // Appl.

Microbiol. Biotechnol. – 2007. – No.74. – P.874–880.

161. Bulgarelli, D. Structure and function of bacterial microbiota of plants / D.

Bulgarelli, K. Schlaeppi, S. Spaepen, E. Ver Loren van Themaat, P. Schulze-

Lefert // Annu. Rev. Plant Biol. – 2013. – V. 64. – P. 807–838. – doi:

10.1146/annurev-arplant-050312-120106.

144

162. Busato, J.G. Changes in labile phosphorus forms during maturation of

vermicompost enriched with phosphorus– solubilizing and diazotrophic bacteria /

J.G.Busato, L.S.Lima, N.O.Aguiar, L.P.Canellas, F.L. Olivares // Bioresour

Technol. – 2012. – No.110. – P.390–395.

163. Chelins, M. K. Immunolocalization of dinitrogenase reductase produce by

Klebsiella pneumonia in accociation with Zea mays L. / M. K. Chelins, E.W.

Triplett // Appl. And Environ. Microbiol. – 2000. – vol. 66. - № 2. – p. 783 – 787

164. Chelius, M. K. The Diversity of Archaea and Bacteria in Association with

the Roots of Zea mays L / M. K. Chelius, E. W. Triplett // Microbial Ecology. –

2001.– № 41(3). – P. 252–263.

165. Chowdhury, S.P. Biocontrol mechanism by rootassociated Bacillus

amyloliquefaciens FZB42 – a review / S.P. Chowdhury, A. Hartmann, X-W.Gao,

R. Borriss // Front. Microbiol. – 2015. – V. 6. – Art. 780, P. 1–11. – doi:

10.3389/fmicb.2015.00780.

166. Czarny, J.C. Genetic modulation of ethylene biosynthesis and signaling in

plants / Czarny J.C., Grichko V.P., Glick B.R. // Biotech. Adv. – 2006. – Vol. 24.

– P. 410-419.

167. Crowley, D.E. Microbial siderophores in the plant rhizospheric / D.E.

Crowley, L.L. Barton, J.Abadia (eds.) // Iron nutrition in plants and rhizospheric

microorganisms. – Dordrecht: Springer, 2006. – P. 169–198.

168. Daniels, R. The cin quorum sensing locus of Rhizobium etli CNPAF 512

affects growth and symbiotic nitrogen fixation // R. Daniels, de Vos D.E., Desair

J. et al. // J. Biol. Chem. — 2002. — P. 462—468.

169. Davey, M.E. Microbial biofilms:from ecology moltcular genetics // M.E.

Davey, G.A. Otoole // Microbiol. Mol. Genet. 2000, 64: 847-867.

170. Dillewijn Pieter, van. Plant – dependent active biological containment

system for recombinant rhizobacteria / Dillewijn Pieter van, Vilchez Susana, A.

Paz Jose, L. Ramos Juan // Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 6.- № 1. – p 88 –

92

145

171. Dobbelaere, S. Plant growth-promoting effects of diazotrophs in the

rhizosphere/ S. Dobbelaere, J. Vanderleyden, Y.Okon // CRC Crit Rev Plant

Sci. 2003. - № 22: 107–149.

172. Dobbelaere, S. Responses of agronomically important crops to inoculation

with Azospirillum / S. Dobbelaere, A. Croonenborghs, A. Thys, D.Ptacek // Aust.

J. Plant. Physiol. – 2001. – No.28. – P.871–879.

173. Dobrovol’skaya, T. G. The Role of Microorganisms in the Ecological

Functions of Soils / T. G. Dobrovol’skaya, D. G. Zvyagintsev, I. Yu. Chernov, A.

V. Golovchenko, G. M. Zenova, L. V. Lysak, N. A. Manucharova, O. E.

Marfenina, L. M. Polyanskaya, A. L. Stepanov, M. M. Umarov// EURASIAN

SOIL SCIENCE, 2015 - №. 9 . - Vol. 48

174. Dodd, I.C. Rhizobacterial mediation of plant hormonestatus / I.C. Dodd,

N.Y. Zinovkina, V.I. Safronova, A.A. Belimov // Ann. Appl. Biol. 2010. V. 157.

P. 361–379.

175. Duca, D. Indole-3-acetic acid in plant-microbe interactions / D. Duca, J.

Lory, C.L. Patten, D. Rose, B.R. Glick // Antonie Van Leeuwenhoek. – 2014. –

V. 106, No 1. – P. 85–125. – doi: 10.1007/s10482-013-0095-y

176. Dwivedi, D. Antifungals from fluorescent pseudomonads: biosynthesis and

regulation / D. Dwivedi, B.N. Johri // Curr. Sci. – 2003. – No.12. – P.1693–1703.

177. Egamberdieva, D. Pseudomonas chlororaphis: a salt-tolerant bacterial

inoculant for plant growth stimulation under saline soil conditions /

D.Egamberdieva // Acta Physiol Plant.- 2012.

178. Erturk, Y. Effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on

rooting and root growth of kiwifruit (Actinidia deliciosa) stem cuttings / Y.

Erturk, S.Ercisli, A. Haznedar, R. Cakmakci // Biol. Res. – 2010. – No.43. –

P.91–98.

179. Figueiredo, M.V.B. Plant growth promoting rhizobacteria: fundamentals

and applications / M.V.B. Figueiredo, L. Seldin, F.F.de Araujo, R.D.L.R.

Mariano // In: Maheshwari D.K. (Ed.), Plant Growth and Health Promoting

Bacteria. Microbiology Monographs, 2010. - № 18: 21–43.

146

180. Fleming, H. C. The biofilm matrix / H. C. Fleming, J.Windender // Nature

Reviews Microbiology. 2010. - № 8. - Р. 623-633.

181. Gomes, N. C. M. Bacterial diversity of the rhizosphere of maize (Zea

mays) grown in tropical soil studied by temperature gradient gel electrophoresis /

N. C. M. Gomes, H. Heuer, J. Schonfeld, R. Costa, L. Mendonca–Hagler, K.

Smalla // Plant and Soil. – 2001. – Vol. 232. – № 1–2. – P. 167–180.

182. Ibekwea, A.M. Bacterial diversity in cucumber (Cucumis sativus)

rhizosphere in response to salinity, soil pH, and boron / A.M. Ibekwea, J.A.

Possa, S.R. Grattanb // Soil Biology and Biochemistry. - 2010. - V. 4. – P. 567–

575.

183. Jefwa, J.M. Diversity of glomale mycorhizal fungi in maize/sesbania

intercrops and maize monocrop systems in southern Malawi. / J.M. Jefwa, R.

Sinclair, J.A. Maghembe // Agroforestry Systems. – 2006. – № 67. – P. 107–114.

184. Jianbin, Liu Biocontrol of Fusarium crown and root rot of tomato and

growth-promoting effect of bacteria isolated from recycled substrates of soilless

crops / L. Jianbin, Gilardi Giovanna, Mattia Sanna, M. Lodovica Gullino and

Angelo Garibaldi //Phytopathol. Mediterr. - 2010. - № 49. - С.163–171.

185. Joshi, P. Diversity and function of plant growth promoting rhizobacteria

associated with wheat rhizosphere in North Himalayan region / P. Joshi, A.B.

Bhatt // International Journal of Environmental Sciences. – 2011. – V.1. –

P.1135-1143.

186. Haas, D. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent

pseudomonas / D. Haas, G.Defago // Nat. Rev. Microbiol. – 2005. – V. 3, No 4. –

P. 307–319.

187. Hammerschmidt, R. Myriad molecular resistance signals: conditial

endogenous and inorganic / R.Hammerschmidt // Physiol. and Mol. Plant Pathol.

— 2004. — № 4. — P. 165—167.

188. Hoang, H.H. The LuxR homolog ExpR in combination with the Sin

quorum sensing system plays a central role in Sinorhizobium meliloti gene

147

expression / H.H.Hoang, A. Becker, J.E. Gonzales // J. Bacteriol. — 2004. — P.

5460—5472.

189. Huang, C.J. Suppression of southern corn leaf blight by a plant growth–

promoting rhizobacterium Bacillus cereus C1L / C.J. Huang, K.H. Yang, Y.H.

Liu, Y.J. Lin, C.Y. Chen // Annals of Applied Biology. – 2010. – Vol. 157. – №

1. – P. 45–53.

190. Kang, S.H. Cluning, sequencing and characterizatijn of a novel

phosphotase gene, phoI, from soil bacterium Enterobacter sp.4// S.H. Kang, K.K.

Cho, J.D. Bok et al. // Curr. Microbiol. - 2006. - 52, № 4. - P.243-248.

191. Kannan, V. Synergistic effect of beneficial rhizosphere microflora in

biocontrol and plant growth promotion / V. Kannan, R.Sureendar // Journal of

Basic Microbiology, 2009. - V. 49. - P. 158–164.

192. Karadeniz, A. Auxin, gibberellin, cytokinin and abscisic acid production in

some bacteria / A. Karadeniz, S.F. Topcuoglu, S. Inan // World Journal of

Microbiology &Biotechnology. 2006. - V. 22. - P. 1061–1064.

193. Karlidag, H. Effects of root inoculation of plant growth promoting

rhizobacteria (PGPR) on yield, growth and nutrient element contents of leaves of

apple / H. A. Karlidag, Esitken, M.Turan, F.Sahin // Sci. Hort. – 2007. – Vol.114.

– No.1. – P.16–20.

194. Khalid, A. Screening plant growth promoting rhizobacteria for improving

growth and yield of wheat / A. Khalid, M. Arshad, Z.A. Zahir // J. Appl.

Microbiol. – 2004. – Vol. 96. – No.3. – P.473–480.

195. Kim, K. J. Characteristics of sophorolipid as an antimicrobial agent / K.J.

Kim, D. S. Yoo, Y. B. Kim // J. Microbiol. Biotechnol. -2002. - V. 12, N 2. - P.

235- 241.

196. Kloepper, J.W. Photoperiod regulates elicitation of growth promotion but

not induced resistance by plant growth–promoting rhizobacteria / J.W. Kloepper,

A. Gutierrez Estrada, J.A. Mclnroy // Can. J. Microbiol. – 2007. – Vol.53. – No.2.

– P.159–167.

148

197. Koul, V. Sphere of influence of indole acid and nitric oxide in bacteria /

V.Koul, A. Adholeya, M. Kochar // J. Basic Microbiol. – 2015. – V. 55, No 5. –

P. 543–553. – doi: 10.1002/jobm.201400224.

198. Kuske, C. R. Comparison of Soil Bacterial Communities in Rhizospheres

of Three Plant Species and the Interspaces in an Arid Grassland / C.R. Kuske,

L.O. Ticknor, M. E. Miller, J. M. Dunbar, J.A. Davis, S. M. Barns, J. Belnap //

Appliedand Environmental Microbiology. – 2002. – Vol. 68. – № 4. – P. 1854–

1863.

199. Liao, M. Implication of Arthrobacter and Enterobacter species for

polycarbonate degradation / M. Liao, X. Xie, A. Subhan, S. Klose // Plant

Physiology and Biochemistry. – 2002. – Vol. 12. – № 3. – P. 219–228.

200. Lioussannea, L. The bacterial community of tomato rhizosphere is

modified by inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi but unaffected by soil

enrichment with mycorrhizal root exudates or inoculation with Phytophthora

nicotianae / L. Lioussannea, F. Perreaulta, M. Jolicoeurb // Soil Biology and

Biochemistry. – 2010. - V. 42. – P. 473–483.

201. Lugtenberg, B. Plant–growth–promoting rhizobacteria / B. Lugtenberg, F.

Kamilova // Annu. Rev. Microbiol. – 2009. – No.63. – P.541–555.

202. Nascimento, F.X. New insights into 1-aminocyclopropane-1-carboxylate

(ACC) deaminase phylogeny, evolution and ecological significance / F.X.

Nascimento, M.J. Rossi, C.R.F.S. Soares, B.J. McConkey, B.R. Glick // PLoS

One. 2014. – V. 9, No 6. – Art. e99168, P. 1–17. – doi:

10.1371/journal.pone.0099168.

203. Naves, P. et al. Correlation between virulence factors and in vitro biofilm

formation by Escherichia coli strains / P. Naves, et al. // Microbiol. Pathogenesis.

2008. Vol. 45. P.86-91.

204. Neeraja, C. Biotechnological approaches to develop bacterial chitinases as

a bioshield against fungal diseases of plants / C. Neeraja, K. Anil, P.

149

Purushotham, K. Suma, P.Sarma, B.M. Moerschbacher, A.R. Podile // Crit. Rev.

Biotechnol. – 2010. – No.30. – P.231–241.

205. Madhu Sharma Pt. B. D. Biofilms: Microbes and Disease / Madhu Sharma

Pt.B.D. Sarita Yadav // The Brazilian Journal of Infectious Diseases. – 2008. – V.

12. – N. 6. – P. 526–530.

206. Mah T.F. et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm

antibiotic resistans // Nature. 2003. - T. 426. №6964. Р. 306-310.

207. Maksimov, I.V. Plant growth promoting rhizobacteria as alternative to

chemical crop protectors from pathogens (Review) / I.V. Maksimov, R.R.

Abizgildina, L.I. Pusenkova // Appl. Biochem. Microbiol. – 2011. – No.47. –

P.333–345.

208. Marketon, M.M. Quorum sensing controls exopolysaccharides production

in Sinorhizobium meliloti / M.M. Marketon, S.A.Glenn, A. Eberhard, J.E.

Gonzalez // J. Bacteriol. — 2003. — P. 325—331.

209. Mathimaran, N. Glomus intraradices dominates arbuscular mycorrhizal

communities in a heavy textured agricultural soil. / N. Mathimaran, R. Ruh, P.

Vullioud, E. Frossard, J. Jansa // Mycorrhiza. – 2005. – № 16. – P. 61–66.

210. O'Toogle G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A.

O'Toogle, H.B. Kaplan, R. Kolter //Annual Review of Microbiology. 2000. - №

54. Р. 49-79.

211. Peiffer, J.A. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome

under field conditions / J.A. Peiffer, A. Spor, O. Koren et al.. // PNAS. – 2013. –

Vol. 110. – № 16. – P. 6548–6553.

212. Picard, C. Frequency and biodiversity of 2,4–diacetylphloroglucinol–

producing bacteria isolated from the maize rhizosphere at different stages of plant

growth. / C. Picard, F. Di Cello, M. Ventura, R. Fani, A. Guckert // Applied and

Environmental Microbiology. – 2000. – № 66. – P. 948–955.

150

213. Phillips, D.A. Microbial products trigger amino acid exudation from plant

roots / D.A. Phillips, C.T. Fox, M.D. Kingea // Plant Physiol. – 2004. – Vol. 136.

– P. 2887-2894.

214. Phạm, Bích Hiên. Nghiên cứu tuyển chọn m t số chủng Azotobacter đa hoạt

tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh chức năng / Phạm Bích Hiên,

Phạm Văn Toản // Báo cáo h i nghị CNSH toàn quốc. – 2003. – 12 tr.

215. Quinones, B. Quorum sensing regulates exopolysaccharide production

motility and virulence in Pseudomonas syringae / B.Quinones, G. Dulla, S.E.

Lindow // Mol. Plant Microbe Interact. — 2005. — P. 681—693.

216. Ribaudo, C. Azospirillum sp. promotes root hair development in tomato

plants through a mechanism that involves ethylene / C. Ribaudo, E. Krumpholz,

F. Cassan, R. Bottini, M. Cantore, A. Cura // J. Plant. Growth Regul. – 2006. –

No.24. – P.175–185.

217. Sanon, A. Comparison of Soil Bacterial Communities in Rhizospheres of

Three Plant Species and the Interspaces in an Arid Grassland / A. Sanon, Z.N.

Andrianjaka, Y. Prin et al. // Plant and Soil. – 2009. – Vol. 321. – № 1–2. – P.

259–278.

218. Saravanakumar, D. ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens

mediated saline resistance in groundnut (Arachis hypogea) plants /

D.Saravanakumar, R. Samiyappan // J. Appl. Microbiol. – 2007. – Vol.102. –

No.5. – P.1283–1292.

219. Shahbaz-Mohammadi, H. Screening and characterization of proline

dehydrogenase flavoenzyme producing Pseudomonas entomophil / Shahbaz-

Mohammadi H., Omidinia E. et at // Iranian journal of mricrobiology. – 2011. –

Vol 3. – № 4. – P. 201-209.

220. Shakirova, F.M. Role of endogenous hormonal system in the realization of

the antistress action of plant growth regulators on plants / F.M. Shakirova, A.M.

Avalbaev, M.V. Bezrukova, G.R. Kudoyarova // Plant Stress. 2010. Global

Science Books. DOI 10.1007/s00425-010-1286-7.

151

221. Sharma, S.B. Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for

managing phoaphorus deficiency in agricultural soils / S.B. Sharma, R.Z.

Sayyed, M.H. Trivedi, T.A. Gobi // SpringerPlus. – 2013. – V. 2. – Art. 587, P.

1–14. – doi: 10.1186/2193-1801-2-587

222. Spaepen, S. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganismplant

signaling / S. Spaepen, J. Vanderleyden, R. Remans // FEMS Microbiol. Rev.

2007. V. 31.P. 425–448.

223. Swain, M.R. Indole–3–acetic acid production and effect on sprouting of

yam (Dioscorea rotundata L.) minisetts by Bacillus subtilis isolated from

culturable cowdung microflora / M.R. Swain, S.K. Naskar, R.C. Ray // Pol. J.

Microbiol. – 2007. – No.56. – P.103–110.

224. Söderberg, K. The microbial community in the rhizosphere determined by

community–level physiological profiles (CLPP) and direct soil– and cfu–PLFA

techniques / K. Söderberg, A. Probanza A. Jumpponen, E. Bååth // Applied Soil

Ecology. – 2004. – № 25(2). – P. 135–145.

225. Tian, Y. Bacterial diversity in the rhizosphere of cucumbers grown in soils

covering a wide range of cucumber cropping histories and environmental

conditions / Y. Tian, L. Gao // Microb Ecol. – 2014. – V. 68. – P. 794-806.

226. Turnbull, A. Isolation of Bacteria from the rhizosphere and rhizoplane of

potato (Solanum tuberosum) grown in two distinct soils using semi selective

media and characterization of their biological properties / A. Turnbull, Y. Liu, G.

Lazarovits / American Journal of Potato Research. – 2012. – V. 89. – P.294–305.

227. Turner, T.R. The plant microbiome / T.R. Turner, E.K. James, P.S. Poole

//Genome Biole. - 2013/ - V.14, No 6. - Art/209, P.1-10/- doi:10/1186/gb-2013-

14-6-209.

228. Yao, S.Y. Sinorhizobium meliloti ExoR and ExoS proteins regulate both

succinoglycan and flagellum production / S.Y. Yao, L. Luo, K.J. Har et al. // J.

Bacteriol. — 2004. — 186. — P. 6042—6049.

229. Ullah, A. Diazotrophsassisted phytoremediation of heavy metals: a novel

approach / A. Ullah, H. Mushtag, H. Ali, M.F. Munis, M.T. Javed, H.J.

152

Chaudhary // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. – 2015. – V. 22, No 4. – P. 2505–

2514. – doi: 10.1007/s11356-014-3699-5.

230. Van Loon, L. C. Plant responses to plant growthpromoting rhizobacteria /

L. C. Van Loon// Eur. J. Plant Pathol. 2007. - V. 119. P. 243–254.

231. Vargas-Garcia, M.C. Properties of polysaccharide produced by

Azotobacter vinelandii cultured on 4-hydroxybenzoic acid / M.C. Vargas-Garcia,

M.J. Lopez, M.A. Elorrieta et al. // J. Appl. Microbiol. — 2003. — 94, N 3. — P.

388—395.

232. Vestberg, M. Mycotrophy of crops in rotation and soil amendment with

peat influence the abundance and effectiveness of indigenous arbuscular

mycorrhizal fungi in field soil. / M. Vestberg, K. Saari, S. Kukkonen, T. Hurme //

Mycorrhiza. – 2005. – № 15. – P. 447–458.

233. Wilson, D.B. Three microbial strategies for plant cell wall degradation /

D.B. Wilson // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2008. – No.1125. – P.289–297.

234. Zaied K.A., El–Diasty Z.M., El–Rhman M.M.A., El–Sanossy A.S.O. Effect

of horizontal DNA transfer between Azotobacter strains on protein patterns of

Azotobacter transconjugants and biochemical traits in bioinoculated Okra

(Abelmoschus Esculentus, L.) // Aust. J. Basic. Appl. Sci. – 2009. – Vol.3. No.2.

– P.748–760.

235. Werner, T. Cytokinin deficient transgenic Arabidopsis plants show

multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in

the regulation of shoot and root meristem activity / T. Werner, V. Motyka, V.

Laucou, R. Smets, H.V. Onckelen, T. Schmulling // Plant Cell. – 2003. – No.15. –

P.2532–2550.

236. Khalid, A. Screening plant growth-promoting rhizobacteria for improving

growth and yield of wheat / A. Khalid, M. Arshad, Z.A. Zahir // J. Apll.

Microbiology. 2004.V. 96. P. 473–480.

237. Casson, S.A. Genes and signaling in root development / S.A. Casson, K.

Lindsey // New Phytol. 2003. V. 158. P. 11–38.

153

238. Wittenmayer, L. Plant responses to drought and phosphorus deficiency:

contribution of phytohormones in root-related processes / L. Wittenmayer, W.

Wolfgang Merbach //Plant Nutr. Soil Sci. 2005. V. 168. P. 531–540.

239. Teale, W.D. Auxin and the developing root of Arabidopsis thaliana / W.D.

Teale, I.A. Paponov, F. Ditengou, K. Palme // Physiologia Plantarum. 2005. V.

123. P. 130–138.

240. Stepanova, A.N. Multilevel interactions between ethylene and auxin in

Arabidopsis roots / A.N. Stepanova, J. Yun, A.V. Likhacheva, J.M. Alonso // The

Plant Cell. 2007. - V. 19. - P. 2169–2185.

241. Vandenkoornhuyse, P. The importance of the microbiome of plant

holobiont / P. Vandenkoornhuyse, A. Quaiser, M. Duhamel, A. Le Van, A.

Dufresne // New Phytol. –2015. –V. 206, No4. –P. 1196–1206. –doi:

10.1111/nph.13312. ).

242. Zilber-Rosenberg, I. Role of microorganisms in the evolution of animals

and plants: the hologenome theory of evolution / I. Zilber-Rosenberg, E.

Rosenberg // FEMS Microbiol. Rev. –2008. –V. 32, No5. –P. 723–735. –doi:

10.1111/j.1574-6976.2008.00123.x.