winner duque rodrogues - farmacia.alegre.ufes.br
TRANSCRIPT
WINNER DUQUE RODROGUES
BÁRBARA PIZETTA
JULIANA APARECIDA SEVERI
MARIA DAS GRAÇAS ZANARDO
MARIA PAULA DEBONA VIEIRA
Organizadores
ANAIS DA 4ª SEMANA DE CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Inovação na prática farmacêutica
-Especial de 10 anos-
Alegre - ES
Editora CAUFES
2019
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Setorial Sul da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
A532 Anais da 4ª Semana de Ciências Farmacêuticas: inovação na
prática farmacêutica, especial de 10 anos [recurso eletrônico]
organizadores, Winner Duque Rodrigues… [et al]. - Dados
eletrônicos. Alegre, ES : CAUFES, 2019.
154 p. : il.
Inclui bibliografia.
ISBN: 978-85-54343-23-1
Modo de acesso: http://farmacia.alegre.ufes.br/anais-da-semana-de-ciencias-
farmaceuticas
1. Farmácia - Pesquisa. 2. Indústria farmacêutica – Inovações tecnológicas .
3. Farmácias, drogarias, etc. I. Rodrigues, Winner Duque, 1981 - .
CDU: 615
APRESENTAÇÃO
A Semana de Ciências Farmacêuticas é um evento bianual do curso de Farmácia do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo,
campus de Alegre. O evento ocorreu de 2 a 5 de outubro de 2019, promovido pelo Centro
Acadêmico de Farmácia, em parceria com Empresa Júnior i9-Pharma, na 4ª edição comemorou
os 10 anos de criação do curso, trazendo o tema “Inovação na Prática Farmacêutica”.
O presente e-Book reúne os trabalhos completos selecionados pelos pareceristas para
apresentação oral durante o evento, representativos de diferentes áreas de conhecimento e que
mostram a diversidade de caminhos que Farmacêuticos podem trilhar, para consolidação da sua
formação. Em consonância com as novas Diretrizes Curriculares de Graduação em Farmácia,
instituídas em 2017 e que entraram em vigor recentemente, o cuidado em saúde foi o foco de
todos os trabalhos, que abordaram temas relacionados à biologia molecular, compostos bioativos
naturais, políticas de saúde, saúde coletiva, epidemiologia, doenças infecto-parasitárias e,
desenvolvimento e avaliação de moléculas e produtos.
Os Anais encerram um evento que foi cuidadosamente organizado para atender as
expectativas de todos os participantes e oportunizam o compartilhamento com o leitor, do
excelente conteúdo científico discutido durante a SeCFar.
A Comissão Científica, em nome dos pareceristas e avaliadores, agradece a participação
de todos.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
REINALDO CENTODUCATTE – REITOR
ETHEL LEONOR NOIA MACIEL – VICE-REITORA
DIRETORIA DO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS, NATURAIS E DA SAÚDE
NEUZA MARIA BRUNORO COSTA – DIRETORA
SIMONE APARECIDA FERNANDES ANASTÁCIO – VICE-DIRETORA
COORDENAÇÃO DO CURSO DE FARMÁCIA
EDUARDO FRIZZERA MEIRA – COORDENADOR
HEBERTH DE PAULA - SUBCOORDENADOR
PRESIDENTE DA COMISSÃO ORGANIZADORA
ALICE CRISTINA MORGADO CASSA
EDITORAÇÃO DE TEXTO
WINNER DUQUE RODRIGUES
ILUSTRADOR DA CAPA E CORPO
LUDIMILA MOURA DE OLIVEIRA RAMOS
COMISSÃO DE ALIMENTAÇÃO
Alessandro de Oliveira Gomes Junior
Elder de Oliveira Caetano
COMISSÃO DE DIVULGAÇÃO
Amanda Queiroz de Oliveira
Ludimila Moura de Oliveira Ramos
Rodolfo Moreira Baptista
COMISSÃO CIENTÍFICA
Bárbara Pizetta
Juliana Aparecida Severi
Maria das Graças Zanardo
Maria Paula Debona Vieira
Winner Duque Rodrigues
COMISSÃO DE INSCRIÇÕES
Bruna Canzian Guarino
Carlos Marchiorio Lacerda
Iara Souza Moreira
Natanael Roque da Silva
Nycolli Soares Ferreira
COMISSÃO DE PATROCÍNIO
Gabriel Mendes da Cunha
Sanderson Vieira Batista
COMISSÃO DE PALESTRANTES
Janaína Cecília Oliveira Villanova
Júlia de Almeida Pedro
Márian de Jesus Pereira
COMISSÃO FINANCEIRA
Letycia Fernandes Franklin Ávila
Nubya Nascimento Costa
COMISSÃO DE SORTEIOS
Mayara de Souza Seixas
COMISSÃO DE TECNOLOGIA E
INFORMAÇÃO
Nayara Gambarini Portugal
LISTA DOS AUTORES
Adriana Madeira Alvares da Silva: Professora Associada ao Departamento de Biologia da
Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Adriano Azevedo Merson: Graduado em Gestão Ambiental pela Universidade do Norte do
Paraná. [email protected]
Aldino Neto Venâncio: Licenciado em Química e mestre em Agroquímica pela Universidade
Federal do Espírito Santo. [email protected]
Alessandro de Oliveira Gomes Junior: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências
Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Alice Cristina Morgado Cassa: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Aline Ribeiro Borçoi: Farmacêutica pela Universidade Federal de Juiz de Fora e doutora em
Biotecnologia pela Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Amanda Sgrancio Olinda: Graduanda em Ciências Biológicas (Bacharel) pelo Centro de
Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Anderson Barros Archanjo: Farmacêutico e doutor em Biotecnologia pela Universidade
Federal do Espírito Santo. [email protected]
Arícia Leone Evangelista Monteiro de Assis: Bacharel em Ciências Biológicas e doutora
em Biotecnologia pela Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Bárbara Risse-Quaioto: Licenciada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário São
Camilo. [email protected]
Breno Valentim Nogueira: [email protected]
Bruna Aparecida Borges Dutra: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Bruna Canzian Guarino: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais
e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Bruna Vieira da Rocha: Graduanda em Medicina Veterinária pelo Departamento de
Medicina Veterinária do Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal
do Espírito Santo. [email protected]
Carlos Marchiorio Lacerda: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Christiano Jorge Gomes Pinheiro: Professor Associado do Departamento de Engenharia
Rural da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Daniele Ewald do Nascimento: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Eduardo Frizzera Meira: Professor Adjunto do Departamento de Farmácia e Nutrição do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Eduardo Medeiros Damasceno: Licenciado em Ciências Biológicas pela Universidade
Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul e doutor em Biologia Celular e
Estrutural pela Universidade Federal de Viçosa. [email protected]
Elder de Oliveira Caetano: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Elias Terra Werner: Professor Adjunto no Departamento de Biologia do Centro de Ciências
Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Elisa Santos Pinheiro Coelho: Enfermeira pela Faculdades Integradas São Pedro.
Elisabeth Maria Lopez de Prado: Farmacêutica pela Universidade Federal de Minas Gerais.
Elizabeth Regina Carvalho: Médica veterinária pela Universidade Federal do Paraná e
doutora em Medicina veterinária pela Universidade Estadual Paulista.
Fabiana Dayse Magalhães Siman Meira: Professora Adjunta do Departamento de Farmácia
e Nutrição do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do
Espírito Santo. [email protected]
Fabio Daumas Nunes: Professor titular da Universidade de São Paulo. [email protected]
Fernanda Carolina Ribeiro Dias: Bióloga e doutora em Biologia Celular e Estrutural pela
Universidade Federal de Viçosa. [email protected]
Flávia Vitorino Freitas: Professora Adjunta do Departamento de Farmácia e Nutrição do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Francisco de Paula Careta: Professor Adjunto do Departamento de Farmácia e Nutrição do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Gabriela Kristyna Santos Nogueira: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências
Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Gabriela Tonini Peterle: Bióloga e doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal do
Espírito Santo. [email protected]
Geanne Aparecida de Paula: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Greiciane Gaburro Paneto: Professora Associada do Departamento de Farmácia e Nutrição
do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Gustavo Rodrigues de Souza: Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do
Espírito Santo. [email protected]
Heberth de Paula: Professor Adjunto ao Departamento de Farmácia e Nutrição do Centro de
Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Iara Souza Moreira: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e
da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Isabella Vilhena Freire Martins: Professora Associada ao Departamento de Medicina
Veterinária do Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito
Santo. [email protected]
Ivana Alece Arantes Moreno: Bióloga pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Jacyelli Sgranci Angelos: Graduanda em Ciências Biológicas (Licenciatura) pelo Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo. [email protected]
Janaína Cecília Oliveira Villanova: Professora Adjunta ao Departamento de Farmácia e
Nutrição do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do
Espírito Santo. [email protected]
Janaina Silva: Licenciada em Ciências Biológicas pelo Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia Sul de Minas Gerais. [email protected]
João Victor Matos e Moreira: Farmacêutico pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Joaquim Gasparini dos Santos: Biólogo pela Universidade Federal do Espirito Santo.
Julia Assis Pinheiro: Farmacêutica e mestre em Ciências Veterinárias pela Universidade
Federal do Espírito Santo. [email protected]
Juliana Alves Resende: Professora Adjunta ao Departamento de Farmácia e Nutrição do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Juliana Aparecida Severi: Professora Adjunta ao Departamento de Farmácia e Nutrição do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Juliana Augusto da Silva Nali: Farmacêutica pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Juliana Castro Monteiro Pirovani: Professora Associada ao Departamento de Ciências
Agrárias e Biológicas da Universidade Federal do Espírito Santo.
Juliana Kruger Arpini: Bióloga pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Kamila Arêas Bastos: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e
da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Karolinni Bianchi Britto: Farmacêutica e mestre em Ciências Farmacêuticas pela
Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Kassia Vidal Menezes: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e
da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Kellen Barelo Corrêa: Licenciada em Química pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Klésia Pirola Madeira: Professora Adjunta ao Departamento de Farmácia e Nutrição do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Laisa Savergnini Poleze: Graduanda em Medicina Veterinária pelo Centro de Ciências
Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Lara Dutra Gava: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e da
Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Leonardo Oliveira Trivilin: Professor Adjunto ao Departamento de Medicina Veterinária do
Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo.
Leonardo Soares Morgado: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Leticia Bremide Leal: Licenciada em Ciências Biológicas pelo Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo. [email protected]
Lilian dos Santos Rebonato: Graduanda em Medicina Veterinária Centro de Ciências
Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo.
Lucas Amorim de Sousa Furtado: Farmacêutico pela Universidade Federal do Espírito
Santo. [email protected]
Lucas Antônio Martins Rocha: Graduando em Farmácia pelo Departamento de Ciências
Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Lucas Cunha Dias Rezende: Professor Adjunto ao Departamento de Ciências Naturais do
Centro Universitário Norte do Espírito Santo da Universidade Federal do Espírito Santo.
Luciano Menini: Professor efetivo do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia
do Espírito Santo. [email protected]
Luiz Carlos Maia Ladeira: Nutricionista e discente do Programa de Pós-graduação em
Biologia Estrutural da Universidade Federal de Viçosa. [email protected]
Luiza Laura de Souza Oliveira: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Magda Delorence Lugon: Bióloga e mestre em Biociências e Biotecnologia pela
Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro.
Marcelo dos Santos: Professor Efetivo na Escola Multicampi de Ciências Médicas -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. [email protected]
Marcos Santos Zanini: Professor Titular do Departamento de Medicina Veterinária do
Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo.
Maria das Graças Zanardo: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Maria Paula Debona Vieira: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Márian de Jesus Pereira: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais
e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Mariana Drummond Costa Ignacchiti: Professora Adjunta ao Departamento de Farmácia e
Nutrição do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do
Espírito Santo. [email protected]
Matheus Pimentel Chiconeli: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Mayara Mota de Oliveira: Bióloga e discente do Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia. [email protected]
Maysa do Vale Oliveira: Professora Adjunta do Departamento de Ciências da Saúde do
Centro Universitário Norte do Espírito Santo da Universidade Federal do Espírito Santo.
Meiriane Peixoto: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e da
Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Mikaela Vieira Beloni: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e
da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Mikaelle Alves Silva: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e da
Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Milenna Machado Pirovani: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Natan Silva Matos: Farmacêutico pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Nicolly Soares Ferreira: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais
e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Nubya Nascimento Costa: Farmacêutica pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Paloma Moura Fagundes: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais
e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Paola Cerbino Doblas: Licenciada em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do
Espírito Santo. [email protected]
Patrícia Fontes Pinheiro: Professora Associada ao Departamento de Química e Física do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Pedro Alves Bezerra Morais: Professor Adjunto ao Departamento de Química e Física do
Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Rafael de Cicco: Chefe do Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Instituto de
Câncer Doutor Arnaldo Vieira de Carvalho. [email protected]
Rafael P. Souza: Biomédico e membro do Comitê de Ética do Instituto de Câncer Doutor
Arnaldo Vieira de Carvalho. [email protected]
Renato Almeida Brambati: Farmacêutico pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Ricardo Nascimento Junger: Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do
Espírito Santo. [email protected]
Rodolfo Moreira Baptista: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Rosângela Neves Dias: Graduanda em Ciências Biológicas (Licenciatura) pelo Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito [email protected]
Sanderson Vieira Batista: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais
e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Sara Lúcia Leal Pollastrelli: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Sérgio Luis Pinto Matta: Professor Titular do Departamento de Biologia Geral da
Universidade Federal de Viçosa. [email protected]
Shaira Grulke Ribeiro: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais e
da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Sthefany Brito Salomão: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas, Naturais
e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Suzanny Oliveira Mendes: Bióloga e doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal
do Espírito Santo. [email protected]
Taiana de Alencar: Farmacêutica pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Talita de Cássia Pena Pastore: Graduanda em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Tamires dos Santos Vieira: Nutricionista pela Universidade Federal do Espírito Santo.
Thaís Martins da Silva: Farmacêutica e discente do Programa de Pós-graduação em
Medicina Veterinária da Universidade Federal do Espírito Santo.
Thays de Carvalho Amorim Bolzan: Médica veterinária pela Universidade Federal do
Espírito Santo. [email protected]
Vanessa Sessa Dian: Licenciada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário São
Camilo. [email protected]
Vívian Caiafa Ferreira Paiva: Graduanda em Ciências Biológicas pelo Centro de Ciências
Exatas, Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo.
Viviane Gorete Silveira Mouro: Professora do curso de Farmácia da Faculdade Vértice.
Warley de Souza Borges: Professor Associado ao Departamento de Química do Centro de
Ciências Exatas da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
Wilker Marques Farias: Graduando em Ciências Biológicas pelo Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo. [email protected]
Winner Duque Rodrigues: Graduando em Farmácia pelo Centro de Ciências Exatas,
Naturais e da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo. [email protected]
SUMÁRIO
ÁREA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Análise da atividade antifúngica do óleo essencial de cravo-da-índia sobre Fusarium solani
................................................................................................................................................ 16
Atividade leishmanicida de Punica granatum frente às formas promastigotas de Leishmania
amazonensis ........................................................................................................................... 20
Avaliação do corpo hídrico do trecho do Córrego Horizonte que recebe resíduos de atividades
agropecuárias e urbanas ......................................................................................................... 26
Avaliação in vivo e in vitro da atividade antioxidante do extrato hidroalcoólico das folhas de
Eugenia uniflora L. (Myrtaceae). ........................................................................................... 30
Caracterização de Indivíduos Tabagistas Usuários da Atenção Básica do SUS no Município
de Alegre, ES .......................................................................................................................... 37
Comparação e padronização de três protocolos de extração do DNA da polpa de açaí ........ 42
Efeito do Zingiber officinale sobre a liberação basal de ânion superóxido por neutrófilos
humanos ................................................................................................................................. 48
Isolamento de neutrófilos humanos por sedimentação em gradiente de gelatina .................. 54
Uso do óleo essencial de Copaifera officinalis L. como possível agente moluscicida sobre
moluscos do gênero Biomphalaria ......................................................................................... 60
ÁREA DE CIÊNCIAS DOS ALIMENTOS, EXATAS E VETERINÁRIAS
Associação de valores de pressão arterial com parâmetros socioeconômicos de usuários do
SUS na cidade de Alegre, ES ................................................................................................. 66
Síntese de novas N-fenil-2fenoxacetamida a partir de um fenol natural ................................ 70
Displasia de valva tricúspide em cão da raça Samoieda – relato de caso .............................. 75
ÁREA DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Associação da proteína Ref-1 com a via de estresse oxidativo, elementos-traço e hábitos de
vida em pacientes com câncer oral ......................................................................................... 79
Avaliação antimicrobiana in vitro de orabase contendo extrato hidroalcóolico de cascas de
romã ........................................................................................................................................ 85
Avaliação da atividade herbicida de novos triazóis derivados de isatina .............................. 89
Avaliação farmacoterapêutica em idosos diabéticos e hipertensos atendidos em uma drogaria
de Carangola – MG ................................................................................................................ 97
Caracterização preliminar e atividade antimicrobiana de filmes poliméricos contendo extrato
de romã ................................................................................................................................. 103
Carcinoma de células escamosas da cavidade oral: Associação do hábito tabagista nas
concentrações dos elementos químicos ................................................................................ 109
Controle de qualidade físico-químico de cápsulas de carbonato de cálcio manipuladas no sul
do estado do espírito santo ................................................................................................... 115
Efeito do extrato alcoólico de cipó-cravo sobre enzimas antioxidantes em testículos de
camundongos ........................................................................................................................ 121
Ginseng-brasileiro: ensaios de avaliação físico-química da qualidade de amostras comerciais
.............................................................................................................................................. 126
Óleos essenciais das folhas de Eugenia uniflora e Myrciaria cauliflora: composição química
e efeito antileishmania .......................................................................................................... 132
Pesquisa da estabilidade física preliminar em creme com e sem ureia ................................ 139
Preparo de xampu contendo digluconato de clorexidina para uso veterinário ..................... 146
Taxa de detecção de sífilis adquirida em cidade universitária do sul do espírito santo supera
em 290% a média nacional ................................................................................................... 151
16
Análise da atividade antifúngica do óleo essencial de cravo-da-índia sobre
Fusarium solani
Vanessa Sessa Dian; Leticia Bremide Leal; Aldino Neto Venâncio; Gustavo Rodrigues de Souza; Jacyelli Sgranci Angelos; Luciano Menini
Palavras-Chave: Cravo-da-índia; Fusariose; Óleo essencial; Antifúngico.
INTRODUÇÃO
Os fungos são conhecidos por constituírem um grupo de microrganismos amplamente
distribuídos em diversos ambientes terrestres, estando presentes no ar, na água e no solo
(SILVEIRA, 1995). Segundo Ritter (2007), parte destacada desse grupo são os fungos
filamentosos, que são pluricelulares e disseminam-se com facilidade por possuírem estruturas
reprodutivas conhecidas como esporos. Como determinaram Mallozi e Corrêa (1998), tal
capacidade é expressada devido a ampla faixa de condições toleradas durante seu período de
crescimento, que abrangem variações de umidade, pH, temperatura e nutrientes disponíveis
para serem degradados. Buscando alternativas eficientes e ao mesmo tempo menos
prejudiciais à saúde humana e ao equilíbrio ambiental, diversos métodos que visam controlar
a deterioração em plantios e evitar a criação de resistência pelos microrganismos vêm sendo
testados. Desse modo, de acordo com Daferera et al. (2003) destacam-se os produtos naturais
e a crescente utilização de óleos essenciais, visto que são facilmente encontrados na natureza
e suas aplicações oferecem baixa toxidade. Tal alternativa tem potencial para beneficiar
diretamente o pequeno produtor rural, visto que este poderia realizar o plantio em sua
propriedade de espécies vegetais que apresentam atividade para determinadas infecções que
seus plantios venham a sofrer, podendo extrair seus óleos essenciais ou preparar seus extratos
e aplicá-los, reduzindo significativamente os custos da produção e o impacto ambiental. A
partir do exposto, o presente estudo teve como objetivo analisar o potencial antifúngico do
óleo essencial de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum L. Merrill & Perry) sobre Fusarium
solani em condições de laboratório.
METODOLOGIA
Os experimentos foram realizados no segundo semestre de 2019 nas dependências do
Laboratório de Química Aplicada e do Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal do
Espírito Santos (Ifes) – Campus de Alegre, localizado em Rive, distrito de Alegre – ES.
Inicialmente foram realizadas as extrações do óleo essencial dos botões florais de cravo-da-
índia, fragmentando todas as partes vegetais em partes menores. A técnica empregada foi a de
hidrodestilação, fazendo o uso do aparelho de Clevenger adaptado. Para extração foram
colocadas 100 gramas de material vegetal e 1100 mL de água destilada em um balão de
destilação de 2000 mL, finalizando o processo 4 horas depois. A mistura de óleo essencial e
água denominada hidrolato foi coletada com auxílio de micropipeta de 100 e 1000 μl, que
posteriormente foi separada por centrifugação, permitindo que apenas o óleo essencial fosse
armazenado em freezer à 0ºC. Para verificar o efeito dos óleos essenciais sobre o
desenvolvimento micelial, foram definidas as concentrações de 3 μl, 5 μl, 7 μl, 8 μl, 9 μl, 10
17
μl e 11 μl para os testes realizados. Para cada concentração foram feitas três repetições em
placas de Petri (5,5 cm de diâmetro) contendo meio de cultura PDA (Potato Dextrose Ágar).
Foi utilizado o isolado de Fusarium solani IOC 2163, doado pelo Departamento de Ciências
Biológicas da Universidade de Taubaté (UNITAU) – São Paulo, já com suas cepas
identificadas. Fragmentos das colônias foram adicionados a um Erlenmeyer contendo água
destilada e autoclavada, com finalidade de fazer soluções estoques para os testes. Células
fúngicas destas soluções foram crescidas em meio PDA por 6 dias a 25ºC em estufa
incubadora BOD, para serem utilizadas nos testes. A viabilidade celular da solução estoque
foi determinada a partir da contagem de células em câmara de Neubauer, com adição do
corante azul de metileno e com auxílio de microscópio óptico. As concentrações celulares das
suspensões fúngicas foram de 4,8x104/mL para F. solani. Para verificar a atividade do óleo
essencial sobre o fungo testado, utilizou-se o método de difusão em disco, que consistiu em
adicionar 1 mL de suspensão fúngica ao meio de cultura fundente e após duas horas
acrescentar ao centro das placas as concentrações estabelecidas sobre um disco de papel de 5
mm. Em seguida as placas foram vedadas com plástico filme, identificadas e incubadas em
estufa BOD por 6 dias sob fotoperíodo de 12 horas à 25°C (Salgado et al., 2003). No sexto
dia após a incubação, os halos de inibição do crescimento fúngico foram analisados com
auxílio de régua graduada em centímetros. Cada medição correspondeu à média de duas
medições diametralmente opostas da mesma colônia fúngica. Esse procedimento foi feito para
as três repetições de cada concentração e o valor final foi dividido por 3, resultando na média
de cada triplicata. Para análise estatística dos dados foi utilizado o software R versão 3.5.2,
com a realização do Teste de Tukey a 5% de grau de significância, do teste Bartlett e ANAVA.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Tabela 1 relaciona as concentrações de óleo essencial de cravo-da-índia utilizadas no teste
com a média dos valores inibitórios obtidos nas triplicatas de cada concentração. Ao analisá-
la, percebe-se que há aumento da porcentagem do halo de inibição e, consequentemente, nota-
se a redução do crescimento micelial de F. solani em função das alíquotas crescentes de óleo
essencial adicionadas. O controle negativo não apresentou efeito sobre o crescimento fúngico,
ao contrário do fungicida comercial, que demonstrou atividade semelhante à alíquota de 3 μl.
Tabela 1. Efeito dos diferentes tratamentos com óleo essencial de cravo-da-índia. Médias seguidas de letras
iguais são semelhantes pelo teste de Tukey a 5% de significância.
Concentração(μl) Halo de inibição (cm)
3 1,28 ± 0,20ª
5 2,15 ± 0,62b
7 2,55 ± 0,10bc
8 2,75 ± 0,20cd
9 3,00 ± 0,46cd
10 3,08 ± 0,10d
11 3,70 ± 0,13e
Controle negativo 0
Controle positivo 1
A Tabela 1 expõe o percentual de inibição do crescimento micelial de F. solani em diferentes
concentrações de óleo essencial de cravo-da-índia em condições de laboratório. Observa-se
pelo teste de Tukey que a concentração do óleo essencial de Cravo da Índia11 μl difere
significativamente das demais, sendo considerado a melhor concentração com atividade
18
antifúngica. O cravo-da-índia é representante de uma das mais ricas fontes de compostos
fenólicos, como o eugenol, o acetato de eugenol e o ácido gálico. É conhecido por possuir
propriedades antioxidantes, antimicrobiana e antifúngica, ressaltando sua grande
potencialidade para composição de produtos farmacêuticos, alimentícios e aplicações
agrícolas. (COSTÉS-ROJAS; DE SOUZA; OLIVEIRA, 2014). A partir da aplicação das
concentrações crescentes do óleo essencial de cravo-da-índia, notou-se que o crescimento
micelial de F. solani foi reduzido devido a maior toxicidade apresentada, o que mostra que
este isolado é sensível ao óleo aplicado. O gráfico 1 mostra a variação dos tratamentos, bem
como a diferença observada entre os mesmos.
Gráfico 1: Zonas médias de inibição do óleo essencial de cravo-da-índia.
Dentre os resultados observados, nota-se que a concentração de 11 μl foi a mais eficiente. O
mesmo não pode ser percebido nas concentrações de 3 μl, 8 μl e 10 μl, que demonstram
significativas variações nos seus resultados. O uso de óleos essenciais como fungicidas
naturais apresenta inúmeras vantagens: podem conter compostos que os fungos não
conseguem inativar, são menos agressivos ao Meio Ambiente, podem sofrer biodegradação e
possuem múltiplos modos de ação, o que amplia o espectro de ação ao mesmo tempo em que
age de maneira seletiva (FERRAZ; FREITAS, 2004). A atividade antifúngica dos óleos
essenciais, segundo Bakkali et al. (2008) e Costa et al. (2011), pode estar relacionada com sua
propriedade hidrofóbica, o que significa que ao entrar em contato com o fungo, os
componentes do óleo interagem com a mitocôndria e os lipídeos da membrana plasmática,
alterando a sua permeabilidade e causam distúrbios estruturais, o que pode promover a
exposição do conteúdo celular, inclusive do núcleo. Ascenção e Mouchrek Filho, (2013)
encontrou atividade antifúngica do óleo essencial de cravo-da-índia em várias espécies de
fungos. Outros trabalhos mais recentes como de Da Silva Oliveira et al., (2019) também
relatam sobre o potencial antifúngico do óleo essencial do cravo-da-índia sobre
Colletotrichum theobromicola. O teste ANAVA mostra que as concentrações do óleo
essencial de cravo-da-índia apresentam efeitos diferentes na atividade antifúngica.
Tabela 2. Análise de variância. GL: grau de liberdade; SQ: soma de quadrados; QM: quadrado médio, F: fator
tabelado; p-valor: fator calculado. GL SQ QM F p-valor
Tratamento 6 10.6512 1.7752 53.639 7.3123-09
Resíduo 14 0.4633 0.0331
Total 20 11.1145
19
CONCLUSÕES
Em síntese, os resultados obtidos possibilitaram confirmar o potencial antifúngico do óleo
essencial de cravo-da-índia, destacando os bons resultados com o aumento das alíquotas
utilizadas e a significativa atividade quando comparado ao fungicida comercial Cercobin 700
WP ® sobre F. solani.
AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório de Química Aplicada e ao Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal
de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo – Campus de Alegre pelo apoio durante
a realização desta pesquisa.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ASCENÇÃO, V. L.; MOUCHREK FILHO, V. E. Extração, caracterização química e atividade antifúngica de
óleo essencial Syzygium aromaticum (cravo da índia). Cadernos de Pesquisa, 2013.
BAKKALI, F.; AVERBECK, S.; AVERBECK, D.; IDAOMAR, M. Biological effects of essential oils—A
review. Food and chemical toxicology, v. 46, n.4, p. 446-475, 2008.
COSTA, A. R. T.; et al. Ação do óleo essencial de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M.Perry sobre as hifas
de alguns fungos fitopatogênicos. Revista brasileira de Plantas Medicinais, v. 13 n. 2, 2011.
DAFERERA, D.J.; ZIOGAS, B.N.; POLISSIOU, M.G. The effectiveness of plant essential oils on the growth
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FERRAZ S., FREITAS L. G. de. O controle de fitonematóides por plantas antagonistas e produtos naturais.
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essencial de Zingiber officinale Roscoe sobre Colletotrichum theobromicola, causador da antracnose da
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RITTER, A. C. Potencial toxogênico de Aspergillus flavus testado em diferentes meios e condições. Dissertação
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SILVEIRA, V. D. Micologia. Rio de Janeiro: Âmbito Cultural. 5. ed. Rio de Janeiro: Ed. Universidade. 1995.
20
Atividade leishmanicida de Punica granatum frente às formas promastigotas
de Leishmania amazonensis
Kássia Vidal Menezes; Winner Duque Rodrigues; Vívian Caiafa Ferreira Paiva; Juliana
Aparecida Severi; Francisco de Paula Careta
Palavras-Chave: Leishmaniose, Punica granatum, cultivo celular, plantas medicinais, Leishmania amzonensis.
INTRODUÇÃO
A leishmaniose é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, caracterizada
por uma doença crônica infecciosa, não contagiosa, parasitária, causada por protozoários do
gênero Leishmania, transmitidas pelo vetor Lutzomya. Apresenta alta endemia, morbidade e
mortalidade em regiões equatoriais (BEZERRA et al., 2006). A doença abrange desde formas
inaparentes, lesões discretas de pele que podem evoluir espontaneamente para cura,
ulcerações múltiplas, lesões de mucosas até formas com tendência às metástases e recidivas,
de curso lento e tratamento difícil (SILVEIRA et al., 1996), considerada pela Organização
Mundial da Saúde como uma das seis mais importantes doenças infecciosas, pelo seu alto
coeficiente de detecção e a capacidade de produzir deformidades (BRASIL, 2017). O
tratamento das leishmanioses é feito por antimoniais pentavalentes, anfotericina B e
pentamidinas, sendo estas as drogas leishmanicidas mais potentes disponíveis
comercialmente, com ação nas formas promastigotas e amastigotas, tanto in vitro quanto in
vivo, porém são tóxicas, de custo elevado, difícil administração e podem causar resistência
ao parasito (BEZERRA et al., 2006). Diante do exposto, a busca por novas formas de
tratamentos e fármacos são indispensáveis para uma terapêutica com maior segurança e
eficácia. Desta maneira, os produtos naturais se destacam devido a facilidade de obtenção,
baixo custo e potencial farmacológico diverso. A atividade farmacológica das plantas
medicinais está relacionada com a produção compostos químicos denominados metabólitos
secundários, os estudos etnofarmacológicos evidenciam o uso popular de plantas no
tratamento das leishmanioses tanto por via oral e/ou via tópica sobre as lesões cutâneas
(BEZERRA, et al., 2006; JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). A espécie Punica granatum
(romãzeira) é amplamente utilizada na medicina popular para diversas finalidades, como por
exemplo, atividade antibacteriana, antifúngica e antiparasitária das cascas de seu fruto frente
a diversos microorganismos incluindo protozoários como Leishmania spp., Trypanosoma
spp., Thichomonas spp. (LUIZE et al., 2005; MAHDI et al., 2006). O sumo da romã
demonstrou alta atividade antioxidante, favorecendo a cicatrização da leishmaniose
tegumentar quando comparada com Pentostam®, medicamento padrão utilizado para
tratamento desta enfermidade (ALKATHIRI et al., 2017). Com base no exposto, o presente
estudo busca avaliar o potencial leishmanicida das folhas de romãzeira como uma nova
alternativa de tratamento.
METODOLOGIA
As formas promastigotas de L. amazonensis (WHOM/BR/76/Josefa) foram cedidas
gentilmente ao laboratório de cultivo celular do Departamento de Farmácia e Nutrição da
21
Universidade Federal do Espirito Santo, cultivadas em garrafa de cultivo de 25 cm² com tampa
sem filtro em meio Schneider (Sigma-Aldrich®) com 10% de soro bovino fetal e 3% de urina
humana em estufa BOD a 26º C. Para o preparo do extrato vegetal, folhas foram coletadas e
secas. A extração foi feita com álcool etílico por percolação até o esgotamento do material
vegetal. A solução extrativa resultante foi concentrada a 40º C em rotaevaporador
(Heidolph®, laborota 4000), acoplado com uma bomba a vácuo (Prismatec®, modelo 121).
Depois, os extratos foram liofilizados (Liotop®, L101) e transferidos para frascos de vidro e
armazenados ao abrigo de luz, calor e umidade. As concentrações utilizadas foram 15,62
g/mL; 31,25 g/mL; 62,5 g/mL; 125 g/mL 250 g/mL; 500 g/mL e 1000 g/mL. A caracterização
fitoquímica do extrato seguiu os ensaios propostos por Matos (2009) e Wagner (1984). As
atividades contra as formas promastigotas foram realizadas em fase exponencial de
crescimento celular baseado na curva de crescimento parasitária obtida a partir da contagem
diária de parasitos em cultivo durante 7 dias, em Câmara de Neubauer, ajustando-se a
concentração dos parasitos para 2x106 parasitos/mL. Em microplacas contendo 96 poços,
foram adicionadas a cada poço as concentrações estabelecidas para o extrato, seguido da
adição de 100 L de promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária, ressuspensas em
meio Schneider® para 2x106células/mL. Como controle negativo 1 (CN1) apenas foram
mantidas em meio Schneider sem adição de outro composto e no controle negativo 2 (CN2)
foi utilizado o DMSO 0,4%. As placas contendo os parasitas em presença dos fármacos foram
mantidas em estufa a 25 °C por 24 h. A viabilidade celular foi analisada após 48 horas de
tratamento utilizando o reagente MTT (3-[4,5- dimethyl-2- thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-
tetrazolium bromide), onde 10 μL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados a cada poço da
placa, que foi incubada por 4 h a 26 °C, aguardando para a leitura da porcentagem de inibição
em leitor de microplacas (Multiskan GO Thermo Fisher Scientific) a fim de se obter os valores
de absorbâncias no comprimento de onda 570 nm. Para obtenção da % de viabilidade em
ensaios de proliferação utilizou-se a seguinte equação: % viabilidade celular = (absorvância
amostra – absorvância branco) / (absorvância controle – absorvância branco) x 100. Os
resultados foram avaliados através de análises estatísticas como análise de variância
(ANOVA) e teste de Tukey para comparação das médias com o software GraphPad Prism
7.0® e Origin 8®. Valores de p<0,05 foram considerados significativos. A partir dos valores
de viabilidade celular, os valores da concentração inibitória 50% (IC50) foram determinados
por análise de regressão.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Ao avaliar o efeito do extrato foliar de P. granatum sobre formas promastigotas de Leishmania
spp, observou-se que existe atividade leishmanicida contra essas formas de vida do parasito.
Para a espécie L. amazonensis houve diferença significativa (p<0,05) de promastigotas
expostas ao extrato quando comparadas com os controles negativos CN1 – controle somente
em meio Schneider e no CN2 teve acréscimo de DMSO 0,4%, o valor de p obtido foi de 0,05.
22
Figura 1: Curva de viabilidade celular, células viáveis de L. amazonensis em relação ao extrato de P. granatum.
Fonte: O autor.
Verificamos que a diminuição da viabilidade celular se manteve estável nas concentrações de
15,62 g/mL; 31,25 g/mL; 62,5 62 g/mL e caiu para 60% na concentração de 125 g/mL, ficando
abaixo de 40% nas concentrações de 250 g/mL; 500 g/mL e 1000 g/mL (Figura 1). A análise
de regressão não-linear encontrou o valor de IC50 de 70,7 g/mL (Figura 2).
Figura 2: Valor de IC50 (µM) do extrato foliar de P. granatum sobre formas promastigotas de L. amazonensis
obtido por regressão não-linear, expresso pela porcentagem de células viáveis (%CV) frente as diferentes
concentrações do extrato de P. granatum. Fonte: O autor.
Figura 3: a) Contagem de células em câmara de Neubauer 48h após a adição do extrato em µg.mL-1. Número
de células expressos em N.106 e b) a viabilidade celular através do ensaio com reagente MTT. Fonte: O autor.
23
Tabela 1. Análise fitoquímica proposta por Matos (2009) e Wagner (1984) do extrato etanólico das folhas de
romã. Fonte: O autor.
Produtos naturais têm um grande potencial na pesquisa por novos fármacos para o tratamento
de importantes doenças causadas por protozoários (NAKAMURA et al., 2006). Os ensaios de
caracterização fitoquímica das folhas de romãzeira foram positivos para compostos fenólicos
e seus derivados, como flavonoides, terpenos, cumarinas, taninos hidrolisáveis e condensados.
As saponinas presentes nas folhas, não possuem ação hemolítica em ágar-sangue (Tabela 1).
Oliveira e colaboradores (2017) realizaram uma análise fitoquímica das folhas de romãzeira
através de cromatografia em camada delgada e verificaram a presença de taninos condensados
e hidrolisáveis, flavonoides, derivados cinâmicos, saponinas, terpenos e esteroides que
corroboram com os achados até o momento (DAS; BARMAN, 2012; HUSSEIN et al., 2017;
KHAN et al., 2017). Alkathiri e colaboradores (2017) realizaram testes in vivo, com sumo de
romã, que demonstrou ação anti-inflamatória e atividade antioxidante, beneficiaram o
hospedeiro infectado tanto no decréscimo da infecção quanto na reparação tecidual causado
por leishmaniose tegumentar. Os valores obtidos de IC50 e coeficiente de determinação (R²)
mostraram-se satisfatórios como 70,7 μM. e 0,99541, respectivamente. O valor de R² próximo
de 1 mostra que as variáveis analisadas, no caso a concentração do extrato e o teor de células
viáveis, estão estreitamente correlacionadas (BEZERRA et al., 2006). Através da análise
estatística ANOVA com teste de Tukey foi encontrado o valor de p de 0,058729, considerado
significante onde quanto menor o valor de p, mais evidências são identificadas. Na figura 2 é
possível observar que a medida que a concentração do extrato foi aumentada, a viabilidade
das células decresceram assim como a quantidade das mesmas observadas em câmara de
Neubauer. As concentrações encontradas para IC50 demonstram que a atividade
leishmanicida do extrato etanólico foliar de P. granatum pode ser comprovada juntamente
com a viabilidade celular onde são expressas a quantidade de células mortas e a redução do
número de células (Figura 3), onde a mesma concentração de 125 µg/mL também reduziu
cerca de 50% a quantidade de células comparadas ao controle negativo. As concentrações de
500µg/mL e 1000 µg/mL obtiveram melhores resultados, reduzindo a quantidade de células
viáveis em cerca de 40% (Figura 1).
Testes Fitoquímicos Resultados
Compostos Fenólicos (FeCl3 5%) +
Flavonoides (AlCl3 5%; Taubouk; Pew; Pacheco) +
(Shinoda) -
Taninos (Gelatina 2%; FeCl3 1%; Pb(CH3COO)2) +
(Cu(CH3COO)2) -
Antraquinonas (Borträeger) -
Cumarinas (KOH 10%) -
Terpenos (Liebermann-Buchard) +
Glicosídeos cardioativo (Pesez; Kedde; Keller-Killiani) -
Saponinas (Afrosimétrico) +
(Teste de Hemólise) -
Alcaloides (Dragendorff, Bertrand, Bouchadart, Mayer e Hager) -
24
CONCLUSÕES
A utilização de extrato de plantas naturais tem gerado interesse para o desenvolvimento de
novas alternativas terapêuticas promissoras a serem empregadas no tratamento da
leishmaniose. Nosso estudo fornece novas evidências sobre o desenvolvimento de
farmacoterapia utilizando, além das cascas e o sumo do fruto, o uso de extrato das folhas de
P. granatum na resposta leishmanicida in vitro contra formas promastigotas de Leishmania
amazonensis. Estudos posteriores, como a comparação de diferentes farmacógenos da espécie
frente a atividade leishmanicida e o doseamento de compostos fenólicos totais, poderão
subsidiar alternativas de terapias seguras e eficazes frente a esta doença parasitária.
AGRADECIMENTOS
FAPES, CNPq e UFES
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALKATHIRI, B. et al. Pomegranate (Punica granatum) juice shows antioxidant activity
against cutaneous leishmaniasis-induced oxidative stress in female BALB/c mice.
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LUIZE, P. S. et al. Efeito de extratos de plantas medicinais no crescimento de Leishmania
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NAKAMURA, C. V. et al. Atividade antileishmania do extrato hidroalcoólico e de frações
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WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKY, E. Plant drug analysis: a thin layer
chromatography atlas. Berlin: Springer Verlag, p. 320, 1984.
26
Avaliação do corpo hídrico do trecho do Córrego Horizonte que recebe
resíduos de atividades agropecuárias e urbanas
Wilker M. Farias; Adriano A. Merson; Vanessa S. Dian; Aldino N. Venâncio; Ricardo N.
Junger; Rosângela N. Dias
Palavras-Chave: Microbiologia, análise hídrica; poluição ambiental, recursos hídricos.
INTRODUÇÃO
Sabe-se que a água, assim como a radiação solar, é um recurso natural indispensável para vida
na Terra. Possui um enorme valor econômico, ambiental e social, essencial para a
sobrevivência do ser humano e dos ecossistemas mundiais (BEZERRA et al., 2013). A
atividade agropecuária brasileira tem aumentado muito nos últimos anos, com isso, vem
expandindo a contaminação do solo e da água por agrotóxicos e fertilizantes. O Conselho
Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) é o órgão que determina os parâmetros físico-
químicos e microbiológicos da água, bem como define a qualidade que as águas superficiais
e subterrâneas devem ter para serem consumidas pelos animais. Com a realização deste
trabalho será possível conhecer e identificar os problemas que influenciam na qualidade da
água do córrego Horizonte que atravessa o Distrito de Rive, como a degradação do ambiente
e os impactos que o afetam direta e indiretamente. Muito se discute sobre que atividades
causam mais impactos em cursos hídricos, por um lado tem-se as atividades agropecuárias de
criação de suínos e por outro a atividade urbana, que independente do grau de contribuição à
sociedade, são potenciais poluidores que provocam a alteração das propriedades físicas,
químicas e biológicas do ambiente. De acordo com Carvalho et al. (2015), os esgotos
domésticos e as águas residuais originárias de criatórios de animais e agroindústrias
contribuem com o aumento de cargas orgânicas, as indústrias com uma série de compostos
sintéticos e elementos químico potencialmente tóxicos e as atividades agrícolas com a
contaminação por pesticidas e fertilizantes na água. Segundo o Ministério do Meio Ambiente
(2013), o descarte de resíduos sólidos em cursos d’água é feito por pessoas que, em geral,
ignoram o seu impacto no ambiente. Os resíduos se acumulam às margens ou no fundo dos
rios e demais mananciais. Quando ocorrem as precipitações, dificultam os cursos das águas
ocasionando tragédias, além disso, podem ser ingeridos por animais. A água, quando
contaminada por agrotóxicos, ocasiona efeitos prejudiciais diretos na fauna e flora aquática.
Alguns destes agroquímicos podem ser absorvidos pelo organismo, por exemplo, nos peixes,
quando consumidos tornam-se uma ameaça à saúde humana, uma vez que serão ingeridas
substâncias tóxicas e cumulativas (TIECHER, 2017). Diante deste contexto, o presente
trabalho tem como objetivo avaliar o corpo hídrico do Córrego Horizonte, situado no trecho
onde recebem dejetos oriundos de atividade agropecuária e atividade urbana, com base em
análises microbiológicas e físico-químicas.
METODOLOGIA
O presente estudo foi realizado no ano de 2018 ao longo do Córrego Horizonte, que se
encontra localizado em Rive, distrito do município de Alegre – ES. É um dos principais corpos
27
hídricos do distrito e nasce no Alto Horizonte, percorrendo grande área rural e passa pela área
urbana do distrito por aproximadamente 12 km. Em seu percurso, passa por várias
propriedades rurais (pequenos agricultores) tendo aproximadamente 8 km de extensão em área
rural, até chegar ao trecho onde há a prática de criação de suínos (suinocultura), com
aproximadamente 1km de extensão e logo em seguida o córrego passa sob a ponte na BR 482
e entra no perímetro urbano com aproximadamente 2km, ao sair do perímetro urbano quando
percorre mais 1Km até sua foz, desaguando no rio Itapemirim, rio este que pertence à bacia
Itapemirim. Foram coletadas uma amostra em quatro pontos distintos identificados com suas
respectivas localizações geográficas: P1 (Latitude 20°46'15.35"S, Longitude 41°27'53.66"O),
P2 (Latitude 20°45'51.82"S, Longitude 41°27'32.64"O), P3 (Latitude 20°45'38.18"S,
Longitude 41°27'31.47"O) e P4 (Latitude 20°45'22.04"S, Longitude 41°27'13.12"). Sendo
que a amostra P1 foi coletada em um ponto onde recebe pouca influência das atividades
agropecuárias, a amostra P2 foi coletada na entrada de um local onde as atividades
agropecuárias são mais intensas, já a amostra P3 foi coletada logo após a atividade de
agropecuária e antes da zona urbana e a amostra P4 foi coletada depois da zona urbana e antes
de desaguar no rio Itapemirim, conforme ilustrado na Figura 1 abaixo:
Figura 1. Localização dos pontos de coleta no trecho do córrego. Fonte: Google Earth Pro
As coletas foram realizadas em frascos de vidro âmbar, previamente esterilizados em
autoclave a 121°C e encaminhados para o Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal
do Espírito Santo – Campus de Alegre, para realização do processo de análise de coliformes
totais. coliformes termotolerantes, turbidez, condutividade, pH, temperatura, Oxigênio
dissolvido, Resíduo Sólido Total, Demanda Bioquímica e Nitrogênio total.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os resultados analíticos vieram a confirmar o que através dos aspectos visuais já estavam
dizendo, o despejamento do esgoto urbano no córrego é a principal fonte impactante na
qualidade da água. A coleta de quatro amostras de água ao longo do córrego procedeu a má
qualidade da água. Os critérios utilizados na escolha dos pontos de coleta foram estratégicos,
para definir qual das atividades tem maior ou menor potencial contaminante, conforme a
tabela abaixo:
28
Tabela 1. Analise de água do Côrrego Horizonte. Fonte: O autor.
PARÂMETROS P1 P2 P3 P4
Coliformes Totais (NMP/100mL) 15 20 43 >1.100
Coliformes Termotolerantes (NMP/100mL) 15 20 43 >1.100
Turbidez (NTU) 0,3 0,99 1,50 17,7
Ph 5,7 7,1 7,2 7,8
Condutividade (uS/cma25ºC) 103,5 132,4 149,6 128,10
Temperatura (ºC) 20,2 21,6 23,0 23,9
Oxigênio Dissolvido (mL-1) 3,16 3,29 4,89 7,9
Resíduo Sólido Total (mg L-1) 0,01218 0,03229 0,03713 0,04833
DBO (mg L-1) 2,39 2,86 5,01 13,90
Dureza - - - -
Nitrogênio Total (mg L-1) 0,601 0,729 1,421 2,353
As análises da qualidade da água foram realizadas pelos próprios autores, com investigação
das seguintes variáveis: coliformes termotolerantes, turbidez, condutividade, pH, temperatura,
oxigênio dissolvido, resíduo solido total, demanda bioquímica e nitrogênio total. Para o
padrão de turbidez, o P4 apresentou valor muito alto em relação aos outros pontos, o que
caracteriza matérias sólidas em suspensão, matéria orgânica oriunda de esgoto doméstico ou
aditivos lançados no manancial sem tratamento. Dentro dos parâmetros considerados normais,
os valores de pH e temperatura estão dentro de uma faixa considerada normal, com pouca
variação entre os pontos, o que expõe que não existe nenhum fator influenciando a alteração
no pH e temperatura da água no percurso do córrego, independentemente de estar em área
rural ou urbana. Com relação à quantidade de coliformes totais, pode-se constatar que em
todos os pontos coletados há contaminação, porém os pontos P1, P2 e P3 estão dentro da
margem aceitável, mas o P4 está com nível de contaminação muito alto, acima de 1.100
(NMP), indicando alteração na qualidade da água, isto também se repete para coliformes
fecais, pois a presença de bactérias dos grupos fecais indica poluição, pois a quantidade
máxima permitida é de no máximo 1.000 coliformes fecais por 100 mililitros ou 5.000
coliformes totais por 100 mililitros por amostra. Para os parâmetros oxigênio dissolvido,
resíduo sólido total, demanda bioquímica oxigênio e Nitrogênio Total apenas o P4 apresentou
resultados altíssimos, que advém do alto teor de matéria orgânica presente na água, a ausência
de oxigênio dissolvido dá espaço para o desenvolvimento de espécies anaeróbicas, que
sobrevivem na ausência de oxigênio, causando mal cheiro, liberação de aminas, amônias e
sulfato de hidrogênio, sedimentos lançados, ausência de matas ciliares, também são outros
fatores que influenciam na qualidade da água.
CONCLUSÕES
Diante dos dados obtidos, conclui-se que análises de água dessa natureza são de extrema
importância para obtenção de dados. Nota-se claramente que quanto mais a jusante do
córrego, maior é o nível de contaminação, em todos os pontos de coleta. Porém como é a
proposta deste trabalho, buscar fazer um diagnóstico dos impactos causados pela utilização
das margens do córrego e do curso d’água e fazer um comparativo das potenciais atividades
poluidoras, vamos destacar os pontos P3 e P4, atividade agropecuária e atividade humana
(zana urbana), respectivamente. Fazendo um comparativo dos P3 e P4, observa-se que em
praticamente todos os parâmetros o P4 teve resultados mais expressivos, demonstrando que
29
as atividades urbanas exercem grande influência na degradação do meio ambiente,
mostrando que o principal problema ambiental que ocorre no córrego Horizonte é o despejo
de esgoto doméstico sem tratamento, devido à falta de saneamento básico. Não se pode
deixar de mensurar que as atividades agropecuárias, também têm a sua parcela de culpa, e
que os resultados encontrados mostraram que o manejo inadequado das atividades
agropecuárias modifica o ecossistema aquático. Desta forma, o estado em que se encontra
um corpo hídrico, faz-se necessário viabilizar ações necessárias à sua recuperação para
manutenção da qualidade da água, bem como da saúde pública. Esta pesquisa torna-se um
instrumento importante para ser usado em ações educativas com o fim de conscientização
do perigo que correm com atividades no córrego. Através dos resultados apresentados,
considera-se a água do córrego na área considerada como zona urbana imprópria para o
consumo e qualquer tipo de atividade. Entretanto, é necessário realizar mais análises com
intuito de monitorar por um período mais abrangente os resultados das análises obtidos neste
local, afim de eliminar possíveis variáveis que venham a ocorrer.
AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório de Química Aplicada e ao Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal
de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo – Campus de Alegre por todo o suporte
oferecido durante a execução desta pesquisa.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BEZERRA, J. M.; SILVA, P. C. M.; BATISTA, R. O.; PINTO, C. H. C.; FEITOSA, A. P. Análise dos
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Impacto das atividades agropecuárias na contaminação do solo e da água. Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Missões Frederico Westphalen. 2017.
30
Avaliação in vivo e in vitro da atividade antioxidante do extrato
hidroalcoólico das folhas de Eugenia uniflora L. (Myrtaceae).
Meiriane Peixoto; João Victor M. Moreira; Eduardo Frizzera Meira; Juliana Aparecida Severi; Fabiana Dayse Magalhães Siman
Palavras-Chave: Atividade Antioxidante, Eugenia uniflora, Ratos Espontaneamente Hipertensos.
INTRODUÇÃO
A Eugenia uniflora conhecida popularmente como pitangueira é uma planta amplamente
distribuída pelo Brasil e tem sido utilizada para tratar uma série de desordens (PIO CORREA,
1984; SIMÕES et al., 1986). Acredita-se que E. uniflora tenha sido introduzida na medicina
empírica pelos índios Guaranis no século XV (ALONSO, 1998). O chá de suas folhas é usado
popularmente em diversas regiões da América do Sul para o tratamento de febre, hipertensão
arterial e problemas digestivos (LORENZI; MATOS, 2008; SIMÕES et al., 2017). Estudos
preliminares realizados in vivo e in vitro sugerem que extratos, obtidos a partir das folhas
dessa espécie, apresentam efeito hipotensor e diurético (CONSOLINI; BALDINI; AMAT,
1999; MORIOKA et al., 2000), hipoglicêmico (ARAI et al., 1999), anti-inflamatório
(SCHAPOVAL et al., 1994), dentre outros. Sabe-se que as doenças cardiovasculares são as
principais causas de morte em mulheres e homens no Brasil, permanecendo como a primeira
causa de mortalidade proporcional, responsável por 20% dos óbitos ocorridos (MANSUR et
al., 2012). E a hipertensão arterial constitui-se no fator de risco mais prevalente na população
brasileira, além do tabagismo, diabetes e dislipidemia (PASSOS et al., 2006; CIPULLO et al.,
2010). Um dos fatores intimamente ligado à progressão de doenças cardiovasculares é o
estresse oxidativo. Estudos demonstram que os níveis elevados de espécies reativas de
oxigênio (ROS) pode induzir a oxidação de proteínas, lipídios e DNA, acarretando em
alterações das suas funções normais (CUNHA et al., 2016). Os danos provocados pelas ROS
contribuem para a progressão de muitas doenças como doenças inflamatórias,
cardiovasculares e neurológicas. As células possuem sistemas de regulação antioxidantes
sofisticados para manter o equilíbrio adequado de ROS, no entanto, a interrupção da
homeostase pode ocasionar o estresse oxidativo e lesão aos tecidos (CUNHA et al., 2016).
Tem sido demonstrada a presença de diversas substâncias antioxidantes na constituição
fitoquímica da E. uniflora (CUNHA et al., 2016). Hipóteses sugerem que substâncias
antioxidantes presentes em vegetais podem ajudar a prevenir e/ou reduzir diversas condições
clínicas associadas ao aumento de radicais livres, como a aterosclerose, câncer, diabetes e
transtornos neurodegenerativos (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2014; PRIOR; CAO,
2000; SIMÕES et al., 2017). Avaliar a capacidade antioxidante de substâncias químicas e
extratos é importante devido ao potencial que apresentam para a prevenção e tratamento de
doenças importantes. Para se estimar a eficiência de extratos como antioxidantes, existem
atualmente diversos métodos in vitro (CHANDA; DAVE, 2009). Entretanto, a grande
variedade de métodos existente e a falta de padronização dos mesmos podem resultar em
interpretações incorretas e resultados inconsistentes. Além disso, os resultados podem ser
expressos em diversas formas e unidades, dificultando a comparação com a literatura. Dessa
forma, para obter-se uma estimativa mais acurada da capacidade antioxidante de um extrato,
é importante utilizar mais de um método (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005; TAN; LIM, 2015).
31
Sendo assim, considerando que extratos com propriedades antioxidantes podem ser úteis no
tratamento de condições clínicas relacionadas ao estresse oxidativo, o presente trabalho teve
como objetivo avaliar a capacidade antioxidante in vitro e in vivo do extrato hidroalcoólico
das folhas de E. uniflora por diversos ensaios.
METODOLOGIA
Para a obtenção do extrato, selecionou-se o campo de coleta das folhas de E. uniflora, e
colheram-se as mesmas de árvores carregadas e frutíferas na cidade de Alegre (ES). Após a
coleta, as folhas viáveis foram submetidas à secagem em estufa de circulação de ar a 450 C.
Posteriormente, o material desidratado foi pulverizado em moinhos de facas para a obtenção
do pó, que foi submetido ao processo de remaceração em etanol a 95% e em seguida à
rotaevaporação. A solução extrativa foi congelada e liofilizada obtendo o extrato seco para as
análises in vitro e in vivo. Para as análises in vivo, o extrato seco foi diluído em solução salina
e tween (1%) para o tratamento dos animais. Para o ensaio de Fenóis Totais, inicialmente
construiu-se uma curva de calibração com substância fenólica padrão (ácido gálico). Em
diferentes poços da microplaca, adicionou-se ácido gálico com concentração final variando
de 0,00128 a 100 μg/mL. Posteriormente, adicionou-se 12,5 μL do reagente de Folin-
Ciocalteau (2N) e, após 5 minutos, acrescentou-se 125 μL de carbonato de sódio 7%. Após
90 minutos, mediu-se a absorbância a 750 nm, a 27º C. Os pontos das curvas foram gerados a
partir das médias entre as triplicatas das absorbâncias registradas, em função das
concentrações do padrão fenólico. O teor de fenóis foi calculado através da seguinte fórmula:
FT = 1000x[F]/[A], onde FT: teor de fenóis totais, expresso como mg de equivalente de ácido
gálico (EAG) por g de amostra; [F]: concentração equivalente de fenóis (µg/mL) obtida por
interpolação da absorbância da amostra na equação de dispersão linear do ácido gálico; [A]:
concentração da amostra (µg/mL). A estimativa da concentração de substâncias fenólicas
presentes no extrato foi realizada a partir da interpolação das absorbâncias registradas das
soluções do extrato (0,0128 a 1000 μg/mL) na curva de calibração, as quais foram submetidas
ao mesmo procedimento acima. Para a realização do método de captura do radical DPPH,
adicionou-se na microplaca, em triplicata, 100 μL de diferentes concentrações de ácido gálico
ou extrato e misturou-se com 200 μL de radical DPPH (100 μM). As concentrações finais de
ácido gálico variaram de 0,045 a 2,86 μg/mL, enquanto as de extrato foram de 2,6 a 166,67
μg/mL. Após incubação ao abrigo de luz por 30 minutos, efetuou-se a leitura em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm. No ensaio de captura do radical
ABTS, preparou-se o radical pela mistura de quantidades iguais de ABTS 7mM e persulfato
de potássio 2,45 mM. A mistura reagiu por 16 horas no escuro e depois teve absorvância
ajustada a aproximadamente 0,700 em 734 nm. Adicionou-se 25 μL de diferentes
concentrações de trolox, ácido gálico e extrato (em triplicata) e misturou-se com 175 μL de
radical ABTS ajustado. As concentrações finais de trolox foram de 0,93 a 4,06 μg/mL, de
ácido gálico de 0,014 a 56,5 μ/L e de extrato de 0,48 a 62,5 μ/mL. Incubou-se por 6 minutos
no escuro e leu-se em 734 nm no espectrofotômetro. Calculou-se a porcentagem de captura
de radical DPPH e ABTS (%CRL) a partir da seguinte fórmula: CRL = 100 x [[(A0 – A1)/A0],
onde CRL: porcentagem de captura de radicais livres; A0: média da absorvância do DPPH
sozinho; A1: média da absorvância do DPPH com extrato/padrão. Os resultados foram
expressos como concentração eficiente para reduzir a concentração inicial dos radicais em
50% (CE50), calculados por regressão linear óptico)] x diluição. Os valores foram corrigidos
pela dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford. No ensaio
dos níveis dos produtos de oxidação proteica (AOPP) presente no plasma, pipetou-se
32
diretamente na placa de Elisa 160 μL de PBS seguidos de 10 μL de iodeto de potássio (KI) e
40 μL da amostra do plasma. Após o término da primeira etapa do protocolo foram
adicionados 20 μL de ácido acético glacial (ultrapuro) e em seguida a placa foi submetida à
agitação com velocidade de 90 rpm durante 6 minutos. Ao final, foi realizada a leitura no
comprimento de onda de 340 nm. A curva padrão para quantificar os níveis de AOPP foi feita
com o uso de cloramina-T (0 a 100 μM). Todas as amostras foram feitas em triplicata e o
resultado final expresso em μmol/L. Os valores foram corrigidos pela dosagem de proteína
feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford. Os dados obtidos das análises de
TBARS e AOPP foram apresentados pela média ± erro padrão da média. O teste t de Student
foi utilizado para comparação de duas médias. Foram adotados valores de P< 0,05 como
estatisticamente significantes. As análises estatísticas foram conduzidas com o auxílio do
programa Graphpad Prism 6. Para as análises in vivo, foram utilizados ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), jovens, com peso entre 200 a 250 g cedidos pelo biotério da Universidade
Federal do Espírito Santo. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa com Animais Experimentais (CEUA/UFES- Protocolo no 28/2015). Os animais
foram divididos em dois grupos: grupo controle, que recebeu apenas o veículo e grupo E.
uniflora, que recebeu o extrato de E. uniflora na dose de 200 mg/Kg/dia. O tratamento foi
realizado através de gavagem, diariamente, durante quatro semanas. Ao final do tratamento,
os animais foram submetidos à eutanásia com sobredose de tiopental sódico (100mg/kg) por
via intraperitoneal e realizou-se uma coleta de sangue, por punção cardíaca. O plasma foi
armazenado em freezer a -80o C para as análises. Para o ensaio de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS), foram colocadas em um eppendorf 75 μl de água destilada, 50
μl de plasma, 125 μl de ácido tricloroacético 17,5% e 125 μl ácido tiobarbitúrico 0,6% e
rapidamente misturados em um vortex. As amostras foram colocadas em banho seco a 100oC
por 20 minutos. Posteriormente, as amostras foram esfriadas em gelo e em seguida,
acrescentados 125 μl de ácido tricloroacético 70% e novamente misturado em vortex. As
amostras foram novamente resfriadas por 20 minutos. Em seguida, foram centrifugadas a
3.000 rpm por 15 minutos a 4ºC. Ao final, 100 μl do sobrenadante foram coletados e colocados
em triplicata em placa de Elisa e lida em comprimento de onda a 532 nm. Para o cálculo da
concentração de MDA de cada amostra utilizou-se a seguinte fórmula: Concentração de MDA
(nmol) = [Absorbância a 532 nm/ (coeficiente de extinção molar do MDA x caminho óptico)]
x diluição. Os valores foram corrigidos pela dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras
pelo método de Bradford. No ensaio dos níveis dos produtos de oxidação proteica (AOPP)
presente no plasma, pipetou-se diretamente na placa de Elisa 160 μL de PBS seguidos de 10
μL de iodeto de potássio (KI) e 40 μL da amostra do plasma. Após o término da primeira etapa
do protocolo foram adicionados 20 μL de ácido acético glacial (ultrapuro) e em seguida a
placa foi submetida à agitação com velocidade de 90 rpm durante 6 minutos. Ao final, foi
realizada a leitura no comprimento de onda de 340 nm. A curva padrão para quantificar os
níveis de AOPP foi feita com o uso de cloramina-T (0 a 100 μM). Todas as amostras foram
feitas em triplicata e o resultado final expresso em μmol/L. Os valores foram corrigidos pela
dosagem de proteína feitos nas mesmas amostras pelo método de Bradford. Os dados obtidos
das análises de TBARS e AOPP foram apresentados pela média ± erro padrão da média. O
teste t de Student foi utilizado para comparação de duas médias. Foram adotados valores de
P< 0,05 como estatisticamente significantes. As análises estatísticas foram conduzidas com o
auxílio do programa Graphpad Prism 6.
33
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na avaliação do teor de fenóis do extrato bruto hidroalcoólico das folhas de E. uniflora,
inicialmente montou-se uma curva de dispersão linear, a partir da qual obteve-se a equação
de regressão linear e coeficiente de determinação (R2) superior a 0,99. Dentre as
concentrações de extrato testadas no ensaio, escolheu-se a de 200 µg/mL. Após substituição
da absorvância dessa concentração na equação de regressão linear do ácido gálico, obteve-se
um valor de 20,813 µg/mL. A partir dos resultados obtidos, o teor de fenóis do extrato bruto
hidroalcoólico das folhas de E. uniflora foi estimado em 104 mg EAG/g ou 10,4%. Esse
resultado sugere que as folhas de E. uniflora possuem uma quantidade considerável de
compostos fenólicos. Apesar de não ser uma regra, plantas que possuem grande teor de fenóis
tendem a apresentar boa atividade antioxidante (CHANDA; DAVE, 2009). Em outros estudos
observam-se resultados semelhantes. Garmus et al. (2014) encontraram valores de 151 mg
EAG/g e 108,7 mg EAG/g para os extratos etanólico e aquoso das folhas de E. uniflora,
respectivamente. No ensaio de captura do radical DPPH, observou-se uma rápida mudança de
coloração do roxo ao amarelo após a mistura das maiores concentrações de E. uniflora e ácido
gálico com o radical DPPH.
Figura 1. Mudança de coloração observada após mistura de DPPH com diferentes concentrações de amostra
(extrato hidroalcoólico das folhas de E. uniflora) e padrão (ácido gálico) em triplicata. A concentração de amostra
e padrão reduz gradativamente da esquerda para a direita.
No ensaio de captura do radical ABTS também foi observada uma rápida redução da coloração
azul-esverdeada do radical após a adição da amostra e dos padrões.
Figura 2. Mudança de coloração observada após mistura do radical ABTS com diferentes concentrações de
amostra (extrato bruto hidroalcoólico das folhas de E. uniflora) e padrão (trolox) em triplicata. A concentração
de amostra e padrão reduz gradativamente da esquerda para a direita.
Em ambos os casos, a mudança na coloração indicou qualitativamente que o extrato bruto hidroalcoólico das folhas de E. uniflora possui, em sua constituição fitoquímica, substâncias antioxidantes. A partir das absorvâncias obtidas nos ensaios de DPPH e ABTS, montaram-se gráficos de dispersão linear para o extrato e para os padrões, que apresentaram R2 superior a 0,99. As CE50 obtidas por regressão linear estão representadas na Tabela 1.
34
Tabela 1- CE50 (µg/mL) do extrato hidroalcoólico das folhas de E. uniflora, ácido gálico e trolox obtidas nos
ensaios de DPPH e ABTS.
Amostra DPPH ABTS
Extrato 14,19 19,75
Ácido gálico 0,133 0,944
Trolox – 3,61
Reynertson, Basile e Kennelly (2005) propuseram que uma CE50 menor que 50 µg/mL
representam uma alta atividade antioxidante. Seguindo-se essa classificação, pode-se
considerar que o extrato bruto hidroalcoólico das folhas de E. uniflora apresenta boa atividade
antioxidante. Outros autores também encontraram valores de CE50 menores que 50 µg/mL no
ensaio DPPH. Martinez-Correa et al. (2011) observaram CE50 de 15 µg/mL para o extrato
aquoso, enquanto Garmus et al. (2014) encontraram um valor de 12,71 µg/mL para o extrato
etanólico das folhas de E. uniflora. Os resultados obtidos com os ensaios in vivo TBARS e
AOPP, demonstram que o tratamento por quatro semanas com o extrato de E. uniflora
proporcionou a redução do estresse oxidativo no plasma dos animais tratados quando
comparado ao grupo controle, destacando a atividade antioxidante do extrato, como podemos
observar nos gráficos (A e B) abaixo.
Gráficos: Efeitos do extrato de E.uniflora sobre o estresse oxidativo no plasma de ratos espontaneamente
hipertensos tratados com o extrato - grupo E. uniflora 200mg/kg/dia - comparado com o grupo controle (veículo).
(A) Avaliação da peroxidação lipídica pelo ensaio de TBARS. (B) Avaliação da oxidação proteica pelo ensaio
de AOPP. Os dados são expressos pela média ± erro padrão da média (EPM). Teste t student. *p<0,05 vs
Controle.
Um dos fatores intimamente ligado à progressão de doenças cardiovasculares é o estresse
oxidativo. Estudos demonstram que os níveis elevados de espécies reativas de oxigênio (ROS)
pode induzir a oxidação de proteínas, lipídios e DNA, acarretando em alterações das suas
funções normais (CUNHA et al., 2016). Assim, a busca por substancias com propriedades
antioxidantes, é de fundamental importância. Um estudo in vitro realizado por Schmeda-
Hirshmann e colaboradores (1987) revelou que o extrato hidroalcoólico das folhas de E.
uniflora apresenta atividade inibitória sobre a enzima xantina oxidase, que é uma importante
fonte endógena de espécies reativas de oxigênio. Visto que essa enzima produz peróxido de
hidrogênio e radical superóxido, sua inibição pode ser uma importante estratégia defensiva
35
contra danos oxidativos (FAIS et al., 2018).Ademais, vários trabalhos demonstraram que a E.
uniflora pode ser útil no tratamento de condições clínicas relevantes na atualidade, como a
hipertensão arterial e diabetes (ARAI et al., 1999; CONSOLINI; BALDINI; AMAT, 1999).
Sendo assim, os resultados observados em todos os ensaios se complementam e revelam que
o extrato hidroalcoólico das folhas de E. uniflora pode ser uma fonte natural de substâncias
antioxidantes apresentando potencial no tratamento de doenças relacionadas com o estresse
oxidativo.
CONCLUSÕES
Conclui-se que, nas condições estudadas, o extrato hidroalcoólico das folhas de Eugenia
uniflora apresenta atividade antioxidante tanto in vitro como in vivo, sugerindo que a E.
uniflora é uma fonte natural de antioxidantes com potencial para aplicação terapêutica.
AGRADECIMENTOS
PRPPG/ UFES–Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UFES / Edital FAP e a FAPES –Fundação de
Amparo à Pesquisa do Espírito Santo.
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37
Caracterização de Indivíduos Tabagistas Usuários da Atenção Básica do
SUS no Município de Alegre, ES
Suzanny Oliveira Mendes; Ivana A. A. Moreno1; Tamires S. Vieira1; Bruna A. B. Dutra;
Paola C. Dobla; Amanda S. Olinda; Aline R. Borçoi; Flávia V. Freitas; Júlia A. Pinheiro;
Juliana K. Arpini; Adriana M. A. Silva
Palavras-Chave: Álcool, Etilismo, Perfil Sociodemográfico, Perfil Socioeconômico, Tabaco, Tabagismo
INTRODUÇÃO.
O tabagismo é considerado pela Organização Mundial de Saúde – World Health Organization
(WHO) como a principal causa de morte evitável em todo o mundo (WHO, 2015). Mais da
metade dos usuários vão a óbito e não há forma segura de exposição. Estima-se que um terço
da população mundial adulta, representada por mais de um bilhão de pessoas, sejam tabagistas
(WHO, 2015). O risco de morte apresentado por indivíduos tabagistas ocorre em virtude de
suas várias doenças decorrentes como: isquemia, enfisema pulmonar, doenças
cardiovasculares, acidente vascular cerebral, pneumonia, alterações na resposta imunológica
e câncer (INCA, 2010; OMS, 2007; WHO, 2015). O tabagismo pode influenciar o surgimento
de tumores de diversas formas, e a relação positiva entre o consumo de tabaco e o surgimento
de diferentes tipos de câncer já é bem estabelecida (INCA, 2010), pois a fumaça do cigarro
contém mais de 7.000 substâncias, muitas carcinogênicas, co-carcinogênicas e outras que
podem auxiliar no processo tumorigênico (FOWLES e DYBING, 2003; SALNIKOW et al.,
2000). Ainda sobre o efeito desta substância nas doenças, estudos mostram que o consumo de
tabaco pode influenciar em vários aspectos do indivíduo tanto em nível de fenótipo quanto a
nível genômico por meio de regulação epigenética (DOGAN et al., 2014; JOUBERT et al.,
2012; MONICK et al., 2012; PHILIBERT et al., 2014). Fatores epigenéticos são relatados na
literatura como um potencial mecanismo envolvido na patogênese de várias doenças
relacionadas ao consumo de tabaco e álcool (DOGAN et al., 2016, JOUBERT et al., 2012,
BRIONES e WOODS, 2014). Neste sentido, é de grande importância o estudo do perfil de
usuários do SUS em relação ao consumo de tabaco, pois este é um dos fatores cruciais para o
desenvolvimento de uma série de doenças. O conhecimento do perfil populacional dos
indivíduos atendidos pelo SUS em regiões especificas é importante no enfrentamento dos
problemas regionais e para a confecção de planos específicos de atendimento ao usuário. Para
que possam ser traçadas metas específicas na solução de problemas principais e urgentes em
relação à saúde populacional, se faz necessário conhecer o perfil populacional a fim de que as
ações da atenção à saúde sejam eficazes. Assim, o objetivo do presente trabalho foi
caracterizar o perfil de indivíduos atendidos pelo SUS quanto ao consumo de tabaco em
relação aos aspectos socioeconômicos e demográficos desta população.
METODOLOGIA
Trata-se de um estudo transversal realizado com usuários no Sistema Único de Saúde (SUS)
brasileiro, na população urbana e rural do município de Alegre, ES. A participação dos
indivíduos foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos, do Centro de
Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Espírito Santo (CEP/CCS/UFES), sob número
1.574.160, de 03/06/2016. Os indivíduos participantes do estudo assinaram o termo de
38
consentimento livre e esclarecido (TCLE). O estudo incluiu 385 indivíduos entre 20 e 59 anos
de idade de ambos os sexos, selecionados a partir do registro nas Unidades de Atenção
Primária à Saúde. Para todos s indivíduos estudados, foram aplicados questionários, por meio
de entrevista individual, para o levantamento das condições socioeconômicas, saúde e estilo
de vida. Em relação aos hábitos tabagista, foram avaliados indivíduos que nunca consumiram,
consumiram apenas no passado e que consumem tabaco atualmente. Além disso foram
coletados dados de sexo, idade, localização (urbana ou rural), escolaridade acima ou abaixo
de 11 anos de estudo (considerando que em 11 anos o indivíduo possui ensino médio
completo), situação conjugal (considerando se possui ou não parceiro fixo), situação no
trabalho (atuante e não atuante). Em relação à renda pessoal, foram considerados indivíduos
de baixa renda aqueles que possuíam rendimento per capita/dia menor que 5 dólares
americanos (Neri, 2008). Quanto à prática de atividade física e de lazer, foram considerados
indivíduos que praticam a atividade pelo menos 1 vez por mês. O Teste Qui-Quadrado de
Independência foi utilizado para análise de associação das característias sociodemográficas
em relação ao consumo de tabaco. Os dados foram dispostos em número e porcentagem de
dados em relação ao número total de pacientes avaliados. Para todas as análises, foi adotado
o valor de significância de 5%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se os
softwares SPSS® (versão 13.0 for Windows).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Nossos dados mostraram que a população atendida pela atenção básica de saúde do SUS no
município de Alegre (ES) é majoritariamente do sexo feminino (80,6%), com maior faixa
etária atendida entre 50 e 59 anos (29,8%), de localidade urbana (173%), com parceiro fixo
(62,1%), escolaridade menor do que 11 anos (80,5%), atuante na situação de trabalho (61,3
%), com 57,9% dos indivíduos que possuem renda >5dólares/dia, e que a maioria dos
indivíduos realizam alguma atividade de lazer (68,05%) mas não realiza atividade física
(61,8%) (Tabela 1). Os dados obtidos através da aplicação dos questionários não estão
dispostos em sua totalidade visto que trata-se de um estudo transversal. Desta forma, algumas
perguntas não foram respondidas pelos indivíduos, portanto, os números retratam apenas as
perguntas respondidas pelos indivíduos. O perfil socioeconômico também foi traçado de
acordo com o uso de tabaco em 3 modalidades: nunca consumiu, consumiu apenas no passado
e consome atualmente. Sobre as características avaliadas, observa-se uma prevalência do
consumo de tabaco por indivíduos do sexo masculino (p=0,007). O hábito tabagista também
esteve significativamente associado à localidade do paciente (p=0,017) em que houve uma
prevalência no consumo de tabaco em indivíduos da localidade urbana. Em relação à idade,
também houve associação ao hábito do tabagista (p<0,0001) visto que a maior parte dos
indivíduos que consomem a substância está na faixa etária entre 40 a 49 anos. Também foi
observado que a idade com maior quantidade de indivíduos que nunca fumou foi a faixa etária
de 20 a 29 anos com 90,5%. Além disso, outro dado mostra que na faixa etária de 50 a 59
anos foi a que houve mais indivíduos que pararam de fumar (31,3%). Por fim, as demais
características que estiveram relacionadas ao hábito tabagista foi a escolaridade e a situação
conjugal, ambas com p=0,009. Sobre a escolaridade, foi observado que indivíduos com mais
de 11 anos de estudo não fumam atualmente. E, indivíduos com parceiro fixo são os que
apresentam menor número de tabagistas atualmente (2,6%). As demais características
estudadas como situação no trabalho, renda pessoal, atividade de lazer e atividade física, não
apresentaram associação com o hábito tabagista.
39
Tabela 1. Características da amostra em relação ao consumo de tabaco.
CONSUMO DE TABACO
TOTAL Nunca Passado Atualmente Valor p
n % n % N % n %
Sexo 0,007 *
Masculino 75 19,4 44 58,7 24 32 7 9,3
Feminino 308 80,6 239 77,6 47 15,3 22 7,1
Idade <0,0001*
20 a 29 anos 63 16,3 57 90,5 4 6,3 2 3,2
30 a 39 anos 94 24,4 76 80,9 10 10,6 8 8,5
40 a 49 anos 110 28,5 80 72,1 21 18,9 10 9
50 a 59 anos 115 29,8 70 60,9 36 31,3 9 7,8
Localização 0,0017*
Rural 133 34,5 110 82,7 15 11,3 8 6
Urbana 248 65,5 173 69,5 55 22,1 21 8,4
Escolaridade 0,009*
≤ 11 anos de
estudo 310 80,5 223 71,9 58 18,7 29 9,4
> 11 anos de
estudo 65 19,5 55 84,6 10 15,4 0 0
Situação Conjugal 0,009*
Sem parceiro
fixo 146 37,9 104 71,2 20 13,7 22 15,1
Com parceiro
fixo 227 62,1 172 75,8 49 21,6 6 2,6
Situação no Trabalho 0,192
Atuante 236 61,3 179 75,8 42 17,8 15 6,4
Não Atuante 138 38,7 98 71 26 18,8 14 10,1
Renda Pessoal
<5 dólares/dia 158 41 117 74,1 28 17,7 13 8,2 0,895
≥5 dólares/dia 223 57,9 164 73,9 42 18,9 16 7,2
Atividade de Lazer 0,525
Não 116 30,1 192 73,3 48 18,3 22 8,4
Sim 262 68,0
5 88 75,2 22 18,8 7 6
Atividade Física 0,309
Não 238 61,8 104 75,4 28 20,3 6 4,3
Sim 138 38,2 175 73,2 43 18 21 8,8
Total 385 100 283 73,5 71 18,4 29 7,5 *Valor-p de Qui quadrado a nível de 5% de significância (p<0,05)
Nossos dados mostram a caracterização dos indivíduos usuários da atenção básica do SUS no
município de Alegre (ES) quanto ao hábito tabagista considerando que nunca consumiram a
40
substância, que consumiram no passado e que consomem atualmente a substância. É
importante frisar que a população estudada é constituída por indivíduos que usam com
frequência o sistema de saúde, e composta principalmente por indivíduos de baixa
escolaridade. Este panorama observado pode elucidar perguntar relacionadas ao surgimento
de doenças na população em questão, bem como no auxílio da formulação de medidas de
prevenção e proteção dos indivíduos, de modo que novas estratégias para de planos
específicos de atendimento ao usuário podem ser traçadas, trazendo uma melhora na saúde do
município e do sul do estado do Espírito Santo, bem como solução de problemas relacionados
à saúde.
CONCLUSÕES
Foi possível verificar o perfil de usuários quanto ao uso do tabaco, mostrando que indivíduos
apresentam uma prevalência no consumo do tabaco podendo estes dados serem utilizados e
aplicados para a prevenção de saúde e estratégias no município de Alegre, ES.
AGRADECIMENTOS
Financiamento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);
Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo (FAPES); Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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42
Comparação e padronização de três protocolos de extração do DNA da
polpa de açaí
Carlos Marchiorio Lacerda; Milenna Machado Pirovani; Magda Delorence Lugon; Greiciane
Gaburro Paneto
Palavras-Chave: Açaí. Euterpe edulis. Euterpe oleracea. Extração de DNA. CTAB.
INTRODUÇÃO
A flora brasileira comparada a outros países, possui uma riqueza enorme, as espécies
brasileiras correspondem a 22% da flora mundial. No Jardim Botânico encontrado no estado
do Rio de Janeiro, são reconhecidas 43.448 espécies. O Espírito Santo é considerado o estado
mais rico em reserva natural no Brasil. Com interesse da descoberta de novos fármacos que
possa atender as necessidades da população o desenvolvimento de pesquisas é de extrema
importância. O açaí, fruto mundialmente conhecido devido às suas propriedades nutricionais,
é amplamente exportado e comercializado pelo mercado brasileiro como sobremesas e sucos.
Isso se dá ao fato do açaizeiro (Euterpe oleracea) - pertencente à família das Arecaceae - ser
característico da região norte do Brasil, principalmente das áreas amazônica e paranaense, e
apresentar altos valores energéticos sendo extremamente rico em proteínas, lipídios, fibras,
carboidratos, dentre outros nutrientes como as antocianinas. Além disso, nos últimos anos
ganhou importância devido aos benefícios à saúde, associados à sua composição fitoquímica
e a capacidade antioxidante (MENEZES, 2008, apud PORTINHO, 2012; LUNZ et al., 2014),
sobretudo, estudos recentes permitiram observar efeitos farmacológicos benéficos à saúde,
como melhora no sistema imunológico, anti-inflamatório e antioxidante (JANSEN et al.,
2008; MENEZES et al., 2008). Segundo a ANVISA, antioxidante é a substância que retarda
o aparecimento de alteração oxidativa no alimento. A capacidade antioxidante do açaí está
relacionada com a presença de antocianinas que além de ser responsável pelo efeito
antioxidante do açaí é responsável pela coloração do mesmo, sendo assim, quando o açaí está
verde, os níveis de antocianinas estão relativamente baixo quando comparados com o fruto
maduro. A polpa do açaí possui vários antioxidantes, mas as antocianinas, proantocianidina e
outros flavonoides são os fitoquímicos predominantes. Além desses pigmentos, o açaí também
possui em sua composição compostos fenólicos, dentre outros, que também são componentes
antioxidantes. (SANTOS, et al, 2008). Por esses efeitos benéficos terem sidos comprovados,
a procura por esse fruto tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas, e com esse
aumento, algumas fraudes na comercialização do produto do açaí puderam ser observadas.
Uma das mais ocorrentes é a comercialização de frutos que apresentam características
morfológicas semelhantes do açaizeiro Euterpe oleracea, contudo são de outras espécies de
palmeiras, como: açaí-juçara (Euterpe edulis), açaí-touceira (Euterpe oleracea) e açaí-solteiro
(Euterpe precatoria). Embora ambas as espécies sejam comercializadas como açaí, somente
a espécie Euterpe oleracea é reconhecida oficialmente como açaí (EMBRAPA, 2016). Como
a comercialização dessas espécies é industrializada e o produto apresentado ao consumidor é
a fruta após o processamento, a diferenciação morfologicamente delas torna-se irrealizável.
Com os avanços tecnológicos na última década, a biologia molecular sofreu grandes
descobertas relacionadas ao genoma, o que possibilitou a realização de diversos estudos, tais
quais, identificação de espécies, diagnósticos de doenças, compatibilidade genética, dentre
outros. Atualmente, na literatura já é possível encontrar estudos relacionados à extração de
43
DNA. Esses estudos tornaram possível observar diferentes protocolos para extração do
material genético, uma vez que as diferenças encontradas são adaptações para adequação do
método para cada tipo de tecido, tanto vegetal ou microbiológico quanto animal. Uma das
técnicas mais utilizadas e modificadas foi descrita por Doyle e Doyle, em 1987, que utiliza o
Brometo de Cetil Trimetil Amônio (CTAB). Uma vez que na literatura não existe protocolo
descrito para extração de DNA de polpa de açaí e que tais frutos contem grandes
concentrações de polifenóis e polissacarídeos – contaminantes que comprometem a qualidade
do DNA - é imprescindível a padronização de um protocolo ideal para extração de alta
qualidade, possibilitando estudos futuros, como identificação a nível molecular das espécies
por sequenciamento e mapeamento genético, analise de expressões gênicas, dentre outros.
Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo geral padronizar e comparar três
protocolos de extração de DNA, sendo um deles descrito por Doyle e Doyle e dois outros
protocolos adaptados na extração de DNA de polpa de açaí.
METODOLOGIA
Amostragem
Para realização deste projeto, foram adquiridas 6 amostras de polpa de açaí comercializadas
em supermercados das marcas Q-Polpa, Brasfruit, Vita Nat, Summer Fruit, Vitale e Mais
Fruta. As amostras foram aliquotadas em microtubos contendo 1 ml de polpa. Em seguida,
foram centrifugadas para remoção de sobrenadantes, deixando as amostras mais concentradas
(100mg de precipitado).
Extração e Quantificação do DNA
O DNA foi obtido por três diferentes metodologias de extração, CTAB descrita por Doyle e
Doyle em 1987 e duas adaptações desse protocolo, utilizando as mesmas quantidades de polpa
(100mg). Posteriormente, sua concentração (ng/μL) foi estimada em espectrofotômetro
(NanoDrop Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA, USA). A qualidade também foi
determinada no mesmo, através do quociente de absorbância 260/280 nm (ideal entre 1,8 e
2,0).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os procedimentos de isolamento de ácidos nucleicos podem ser julgados pela quantidade,
qualidade e integridade dos ácidos nucleicos obtidos. Este método foi comparado com três
protocolos de isolamento de DNA diferentes usando polpas do fruto de açaí (tecidos que
contêm níveis muito elevados de polissacarídeos e compostos polifenóicos). Todas as seis
amostras tiveram seu DNA extraído e quantificadas. A quantificação no espectrofotômetro
NanoDrop Thermo Fischer Scientific Inc. demonstrou que cada marca de polpa apresentou
em média concentrações e proporções diferentes entre os protocolos (Tabelas 1, 2 e 3). A fim
de determinar diferenças significativas entre os diferentes tratamentos, a análise de variância
(ANOVA) foi aplicada no software GraphPad Prism. Para aprovar a significância estatística
de todos os dados, os valores de média ± desvio padrão (DP) foram relatados.
Tabela 1: Média das concentrações (ng/μl) e razão obtida através do protocolo Doyle e Doyle, (1987). Fonte: O
autor.
44
Marca Concentração
(ng/µl)
Razão
(260/280)
Razão
(260/230)
Q-Polpa 732,80 2,02±0,14 1,56±0,28
Brasfruit 1034,56 1,95±0,14 1,6±0,28
Vita Nat 828,47 2,00±0,14 1,75±0,28
Summer Fruit 319,20 1,85±0,14 0,97±0,28
Vitale 2248,50 1,86±0,14 1,3±0,28
Mais Fruta 1489,50 1,95±0,13 1,51±0,28
Média 1108,84 1,94 1,45
Tabela 2: Média das concentrações (ng/µl) e razão obtida através do protocolo Japelaghi et al., (2011). Fonte:
O autor.
Marca
Concentração Razão
(260/280)
Razão
(ng/µl) (260/230)
Q-Polpa 496,80 1,97±0,18 1,35±0,29
Brasfruit 543,72 1,73±0,18 1,09±0,29
Vita Nat 1061,70 1,99±0,18 1,55±0,29
Summer Fruit 787,92 1,86±0,18 1,01±0,29
Vitale 2620,85 1,50±0,18 0,71±0,29
Mais Fruta 1517,65 1,84±0,18 1,3±0,29
Média 1171,44 1,81 1,17
Tabela 3: Média das concentrações (ng/µl) e razão obtida através do protocolo adaptado de Doyle e Doyle
(1990). Fonte: O autor.
Marca Concentração
(ng/µl)
Razão
(260/280) Razão (260/230)
Q-Polpa 76,88 1,98±0,17 1,99±0,30 Brasfruit 54,93 1,51±0,17 1,1±0,30
Vita Nat 14,5 1,61±0,17 1,67±0,30
Summer Fruit 30,25 1,56±0,17 1,65±0,30
Vitale 42,28 1,63±0,17 1,6±0,30
Mais Fruta 28,575 1,57±0,17 1,35±0,30 Média 41,24 1,65 1,56
A qualidade do DNA também foi medida por razões espectrofotométricas que relacionam
diferenças nos espectros máximos de absorção de ácidos nucléicos puros (Absorbância
máxima = 260 nm), proteínas (Absorbância máxima = 280 nm) e polissacarídeos
(Absorbância máxima = 230 nm). As amostras apresentaram variação da razão da faixa
aceitável de 1,8 e 2,0 (LEHNINGER et al., 2004) e concentração altas em dois protocolos,
que permitem que estudos futuros de amplificação de DNA sejam realizados, por outro lado,
no terceiro protocolo as concentrações obtidas e a razão apresentaram-se baixas. A
concentração de DNA obtido do material extraído com o protocolo de Doyle e Doyle, (1987)
apresentou média de 1108,84 ng/µl com razão entre as leituras das absorbâncias A260/A280
entre 1,85 e 2,02 com desvio padrão de 0,13. Para as amostras extraídas com o protocolo
Japelaghi et al., (2011), o rendimento médio foi de 1171,44 ng/µl, com a razão entre as leituras
260/280 variando entre 1,50 e 1,99 e desvio padrão 0,18, indicando que ambos protocolos
apresentaram uma baixa contaminação proteica. As amostras de DNA obtidas pela extração
45
utilizando o protocolo adaptado de Doyle e Doyle (1990) apresentaram média de
concentração e razão 41,24 ng/µl e 1,65, respectivamente, o que indica a possibilidade de
contaminantes. Em contraste, a razão A260 / A230 para todas as amostras de DNA preparadas
pelos protocolos foram inferiores a 1,56. Isto indicou que as amostras de DNA apresentaram
contaminação por polifenóis e polissacarídeos (JAPELAGHI et al., 2011).
Gráfico 1. Representação comparativa das concentrações obtidas de cada amostra utilizando os diferentes
protocolos. Fonte: O autor.
Como pode ser observado no gráfico 1, a amostra Vitale apresentou maior concentração – de
2620,85 ng/µl - com a utilização do protocolo descrito por Japelaghi, 2011, entretanto, a razão
A260/A280 mostrou-se abaixo da faixa ideal, com valor de 1,50±0,18 (gráfico 2), em
contraste, apresentou razão A260/A230 com absorbância de 0,71±0,29 indicando impureza
nas amostras, devido a possível presença de polifenóis. Enquanto que a mesma amostra cujo
DNA foi extraído pelo protocolo de Doyle e Doyle, apresentou bom rendimento e razões
A260/A280 e A260/A230, 2248,50 ng/µl; 1,86±0,13 e 1,3±0,28, respectivamente. Em
contrapartida, as amostras obtidas pelo protocolo adaptado de Doyle e Doyle, 1990, a que
apresentou melhor rendimento e razão pertencia a marca Q-polpa cuja concentração obtida
foi de 76,88 ng/µl e razões A260/A280 e A260/A230 dentro da faixa aceitável, com valores
de 1,98±0,17 e 1,99±0,30 (gráfico 3).
Gráfico 2. Gráfico representativo das médias das razões A260/A280 obtidas com desvio padrão. As amostras
obtidas pelo protocolo Doyle e Doyle (1987) apresentaram DP ± 0,14, enquanto os protocolos Japelaghi et al.
(2011) e a adaptação do protocolo de Doyle e Doyle (1990) apresentaram DP ± 0,18 e DP ± 0,17,
respectivamente. Fonte: O autor.
46
Gráfico 3. Gráfico representativo das médias das razões A260/A230 obtidas com desvio padrão. As amostras
obtidas pelo protocolo Doyle e Doyle (1987) apresentaram DP ± 0,28, enquanto os protocolos Japelaghi et al.
(2011) e a adaptação do protocolo de Doyle e Doyle (1990) apresentaram DP ± 0,29 e DP ± 0,30,
respectivamente.
De acordo com os dados das tabelas 1, 2 e 3, o DNA gnômico mais puro foi obtido utilizando
o protocolo descrito por Japelaghi et al, 2011. Em outras palavras, a razão A260 / A280 nm
das soluções de DNA extraídas por este método foram significativamente maiores do que nos
outros métodos (P = 0,0438), com média geralmente acima de 1,8 para DNA de açaí,
indicando que os extratos de DNA obtidos em este procedimento era relativamente puro e
continha pequenas quantidades de proteínas, RNA ou outros contaminantes. Por outro lado, a
razão A260 / A230 nm das amostras de DNA extraídas pelos métodos não apresentaram
variação significativamente (P = 0,0572), com média geralmente acima de 1,17 para DNA de
açaí.
CONCLUSÕES
Com base nos dados que foram obtidos no estudo, observou-se que, as técnicas aplicadas para
extração descritas por Doyle e Doyle (1987) e Japelaghi et al. (2011) foram eficientemente
capaz de fornecer os resultados desejados para análise do DNA das amostras, enquanto o
protocolo adaptado de Doyle e Doyle (1990) apresentou baixa concentração de DNA e
contaminação por proteínas e polifenóis. As diferenças observadas do resultado obtido das
polpas podem ter sido influenciadas por diversos fatores, tais como, as diferenças entre os
protocolos – reagentes e metodologia –, o processamento do fruto nas industrias,
armazenamento em supermercados, a relação entre água e fruto presente. Esses fatores podem
contribuir para a concentração da amostra, nível de degradação do DNA. Diante disso, além
da obtenção de uma amostra livre de contaminantes, é necessário que o material genético
obtido apresente integridade já que o processo de produção de frutos processados pode
danificar as cadeias de DNA (ABDOLMALEKI, 2014), podendo ser verificado através de gel
de agarose, para avaliar a viabilidade do DNA para estudos futuros, como amplificação
utilizando PCR, e sequenciamento a nível molecular.
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48
Efeito do Zingiber officinale sobre a liberação basal de ânion superóxido por
neutrófilos humanos Maria G. Zanardo; Paloma M. Fagundes; Juliana Aparecida Severi; Mariana D. C. Ignacchiti
Palavras-Chaves: fagócitos, gengibre, leucócitos, metabolismo oxidativo
INTRODUÇÃO
Os neutrófilos juntamente com os macrófagos são considerados fagócitos profissionais
componentes da primeira linha de defesa da imunidade inata em humanos (KANTARI et al.,
2008; SEGAL, 2005). Os neutrófilos representam a célula imune mais abundante na
circulação sanguínea periférica, constituindo 50 a 70% dos leucócitos totais (DAVIS E
GALLIN, 1981). Evidências experimentais e clínicas indicam um importante papel desta
célula imune através do metabolismo oxidativo (geração de espécies reativas de oxigênio-
ROS) e da liberação de enzimas lisossomais (metabolismo enzimático) nos mecanismos
causadores de lesão tecidual nas doenças inflamatórias de imunocomplexo. Sob um estímulo
apropriado os neutrófilos são recrutados da medula óssea para a circulação sanguínea. No
ambiente intravascular os neutrófilos, sob influência de substâncias quimiotáticas
(quimiocinas, citocinas, componentes do sistema complemento, produtos derivados do
patógeno, dentre outros) que estimulam sua agregação e aderência na superfície endotelial,
podem emigrar da circulação. Esta migração do endotélio para sítios de infecção é
denominada de diapedese (DIMASI et al., 2013). Essa migração pode ser via vasos
sanguíneos através de vênulas endoteliais altas ou vasos linfáticos aferentes, dependente de
integrinas como MAC-1 e LFA-1 e do receptor CXCR4 (LELIEFELD et al. 2015). Uma vez
que o neutrófilo alcança o sitio da infecção, começa uma série de eventos que se iniciam com
alteração do citoesqueleto para eliminar a partícula invasora através de fagocitose.
Concomitante ao processo de fagocitose é observado um aumento do consumo de oxigênio e
a estimulação da via Pentose-Fosfato. Estas alterações no metabolismo do neutrófilo são
referidas como surto respiratório ou explosão metabólica (LEE et al. 2002). Outro evento
associado à fagocitose é a desgranulação dos fagócitos. Juntos estes processos promovem a
destruição da partícula fagocitada com o desenvolvimento de uma resposta inflamatória
(NAUSEEf, 2007). Estudos recentes têm sugerido que o uso de substâncias com propriedade
anti-inflamatória e antioxidante pode ser uma estratégia terapêuticas promissora para o
tratamento de doenças inflamatórias. Neste contexto, espécies vegetais comestíveis ricas em
compostos fenólicos podem ser promissoras para exercer tal função (PAULA et al., 2009). O
gengibre ou Zingiber officinale (família: Zingiberaceae) é uma planta cujo rizoma é
tradicionalmente utilizado como um condimento comum para vários alimentos e bebidas.
Além da importância alimentícia, seu uso tem sido associado a múltiplos benefícios para a
saúde. Entre as propriedades potenciais do gengibre pode-se citar: efeito antioxidante,
propriedades anti-inflamatórias, antiparasitária, antimicrobiana, anti-diabético e radioprotetor
(BARDI et al., 2013). Suas propriedades anti-inflamatória e antioxidante têm se mostrado
efetivas em estudos com modelos de lesão do tecido renal, nefrotoxixidade (RODRIGUES et
al., 2014; UZ et al., 2009; HAMED et al., 2013), cirrose hepática (BARDI et al., 2013) e
doenças cardiovasculares (NICOLL e HENEIN, 2009). Devido suas propriedades anti-
inflamatória e antioxidante, é provável que ele atue modulando o metabolismo oxidativo,
interferindo na liberação de ânion superóxido e das demais espécies reativas de oxigênio.
49
Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do extrato de gengibre sobre a
liberação basal de ânion superóxido por neutrófilos humanos.
METODOLOGIA
Aspectos éticos
O projeto está em conformidade com a Resolução do CNS 466/12, tendo a aprovação no
CEP/CCENS UFES/CONEP (CAAE 03587718.0.0000.8151).
Delineamento amostral
Foram avaliados homens e mulheres com idade entre 18 e 38 anos. Foram excluídos do estudo
voluntários imunossuprimidos, com distúrbios endócrinos, doenças auto-imunes, doenças
inflamatórias, portadores de alergia, voluntários que estejam sob administração de
medicamentos, à exceção de contraceptivo oral no caso das mulheres, fumantes, usuários de
drogas, gestantes e lactantes. Voluntários que nas duas semanas anteriores ao estudo
apresentaram infecção, alergia ou resposta inflamatória também foram excluídos. A coleta das
amostras de sangue periférico dos voluntários foi realizada por um profissional capacitado e
experiente, no laboratório de Análises Clínicas da Universidade Federal do Espirito Santo
(UFES), campus Alegre. O Termo de consentimento foi autorizado por cada voluntário antes
da coleta. Foram coletados 10 ml de sangue periférico por punção venosa de cada voluntário.
Isolamento de neutrófilos humanos
O isolamento de neutrófilos foi realizado por sedimentação em gradiente de gelatina,
conforme metodologia de Henson (1971), com modificações descritas a seguir. O sangue foi
coletado em tubos contendo Fluoreto de Sódio + Heparina de Sódio. Após a coleta de sangue,
o volume total coletado (10 mL de sangue) foi centrifugado a 755 g por 30 minutos a
temperatura ambiente. O plasma foi descartado juntamente com o buffy coat (anel de
coloração branca formado entre as fases de plasma e sedimento celular), composto
principalmente de células mononucleares. Ao sedimento celular foi adicionado uma solução
de gelatina 2,5% (p/v) em PBS (tampão salina fosfato), quantidade equivalente a duas vezes
o volume do sedimento celular. A mistura foi incubada por trinta minutos a 37 ºC para
sedimentar os eritrócitos. Depois deste período, pode-se notar uma solução bifásica, contendo
eritrócitos na fase mais precipitada e granulócitos na fase superior, esta última foi recolhida,
lavada com PBS a pH 7,2 e centrifugada a uma velocidade de 550 g durante 10 minutos. O
pellet celular foi ressuspendido em uma solução de lise [NH4Cl 0,83 % (p/v) a pH 7,2] e
incubado por 5 minutos em temperatura ambiente para lisar as hemácias. As células foram
novamente lavadas em PBS a pH 7,2, centrifugadas a uma velocidade de 550 g durante 5
minutos. Finalmente, as células foram lavadas com PBS a pH 7,2 e centrifugadas a 550 g
durante 10 minutos. As células foram suspensas em 500 μL de Hank’s Hepes (HBSS) com
0,1% de gelatina, pH 7,2.
Contagem de neutrófilos
Após cada procedimento de isolamento, a suspensão celular obtida foi manipulada e testada
da mesma forma. O pellet celular foi ressuspendido em 500 μL de Hank’s Hepes (HBSS) com
0,1% de gelatina, pH 7,2, e o número total de neutrófilos foi determinado por contagem
manual em microscópio óptico utilizando o hemocitometro de Neubauer. Para isso 10 μL da
suspensão celular foi diluída em 190 μL de líquido Turk. A classificação como neutrófilo foi
50
através das características morfológicas da célula. Foi contabilizado o número de células em
4 quadrantes laterais da câmara de Neubauer. O número de neutrófilos encontrado foi
corrigido com o fator 5x104 para obter o número de Neu/mL (Neutrófilo/mL) e a concentração
celular foi ajustada para 5x105 Neu/mL.
Viabilidade celular
O teste de viabilidade celular foi realizado por exclusão do corante Azul de Tripan. Para isso
10 μL da suspensão celular juntamente com uma gota de solução corante Azul de Tripan 0,4%
(p/v). A mistura foi deixada em repouso por 5 minutos. Em seguida foi realizada a avaliação
em lâmina através da microscopia óptica. Foram contadas aleatoriamente 100 células, as
células que ficaram com coloração azulada foram consideradas mortas e as células vivas
permaneceram incolores. A partir desta contagem foi obtida a porcentagem das células viáveis
de acordo com a equação abaixo:
Viabilidade Celular (%) = [total de células incolores]/[ total de células (coradas e incolores)]
X 100
Efeito in vitro do gengibre na liberação de ânion superóxido
Neste estudo a liberação extracelular de O2- foi determinada pelo método de redução do
ferrocitocromo C, levando-se em conta apenas a redução inibível pela superóxido dismutase
(SOD), conforme descrito por JOHNSTON E LEHMEYER (1976). O ensaio foi realizado em
microplaca de 96 poços. A um poço da microplaca foi adicionado 20 μL de ferrocitocromo C
(800μM), 90μL de HBSS gelatina 0,1% e 100 μL da suspensão celular a 5X105 Neu\mL. A
mesma distribuição da mistura foi feita para todos os poços. Nos controles do experimento
foram acrescentados 2 μL de (SOD) (1500 μg/mL) para inibir a produção de ânion superóxido
e garantir a especificidade do experimento. Para investigar o possível efeito modulador do
gengibre na liberação de ânion superóxido por neutrófilos, as células foram expostas in vitro
ao extrato hidro-alcóolico de gengibre, para isso, 10 μL de extrato (20 mg/mL) foi adicionado
nos poços, a concentração final de gengibre no ensaio foi de 1000 μg/mL. Nestes
experimentos o extrato de gengibre foi inicialmente dissolvido em DMSO 5% (veículo),
portanto, foi feito um controle negativo, nas mesmas condições de cultivo. Em seguida a
mistura foi homogeneizada e a microplaca foi vedada e incubada em câmara úmida na
temperatura de 35± 2ºC por 60 minutos. A leitura foi feita em espectrofotômetro no
comprimento de onda de 550 nm e a D.O. resultante convertida para nanomoles de
ferrocitocromo C reduzido, utilizando-se o coeficiente de extinção ΔE 550 nm = 2,1 X 104
M-1.cm-1 (MASSEY, 1959).
Análise estatística
Para a comparação entre médias dos resultados de dois grupos foi utilizado o teste t-student
pareado. Os testes foram realizados com o auxílio do programa Prism6. As comparações
foram consideradas significativas ao nível de p<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
É notória a importância das funções imunes exercidas pelos neutrófilos para a defesa do
organismo, mas estas funções devem ser reguladas. Está bem documentado, tanto para
modelos animais como em humanos, que o aumento na produção e liberação de produtos
derivados de leucócitos, tais como ROS, enzimas e mediadores pro-inflamatórios podem
contribuir para o agravamento de quadros inflamatórios (WRIGHT et al. 2010, FERNANDES
51
et al., 2014; FIGUEIRO-RINHEL et al., 2017; MARCHI et al., 2018). Com base nisso, este
trabalho investigou o efeito do extrato de gengibre sobre o metabolismo oxidativo de
neutrófilos humanos. Após o tratamento in vitro com o extrato de gengibre (1000 μg\mL)
pode-se observar um aumento significativo da liberação basal de ânion superóxido quando
comparado com as células imunes não tratadas (p= 0,035) (Figura 1). Não foi observado
alteração na liberação de ânion superóxido por neutrófilos nos ensaios com o veículo DMSO
(dados não mostrados). A viabilidade celular após o isolamento dos neutrófilos foi avaliada e
constatou-se o valor de 98% de viabilidade.
Figura 1: Efeito do tratamento in vitro com extrato de gengibre sobre a liberação de ânion superóxido por
neutrófilos não imuno-estimulados (liberação basal). Os dados representam a média + DPM, n=5. Para a análise
estatística da liberação de superóxido foi utilizado o teste T pareado.
Esse resultado poderia ser associado a um agravamento do processo inflamatório, no caso de
doenças inflamatórias. Entretanto, esse aumento do metabolismo oxidativo pode ser benéfico
no caso de quadros infecciosos, pois aumenta os mecanismos microbicidas dos neutrófilos,
podendo ser utilizado em terapia para patologias infecciosas. Resultado semelhante do
presente estudo foi relatado por GOMES (2018) ao avaliar extrato hidro-alcóolico de
Dysphania ambrosidides sobre neutrófilos humanos. Foi observado um aumento dose-
dependente na liberação basal de ânion superóxido, bem como aumento da degranulação por
neutrófilos tratados com extrato nas concentrações 50-125 μg\mL. Entretanto foi observado
uma redução significativa na liberação de ânion superóxido por neutrófilos imuno-
estimulados com PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) e tratado com extrato hidro-
alcóolico de Dysphania ambrosidides na concentração de 125 μg\mL. Segundo estudo feito
por PAULA et al. (2009) o tratamento de neutrófilo humanos com o extrato de Tamarindus
indica L. nas concentrações de (100-1000 μg\mL) e imunoestimulados com PMA e fMLP,
promove uma inibição concentração-dependente na liberação de ROS. O extrato também
inibiu a degranulação e atividade de elastase, se mostrando um potencial modulador de
doenças inflamatórias mediadas por neutrófilos. Estes autores não avaliaram a liberação basal
de ânion superóxido frente ao tratamento com T. indica. FIGUEIRO-RINHEL et al. (2017)
demonstraram que o extrato hidro-alcoolico de Baccharis dracunculifolia modula
seletivamente as atividades efetoras dos neutrófilos humanos imunoestimulados, não afetando
a degranulação e fagocitose, porém reduz a ativação da NADPH oxidase e atividade da
mieloperoxidase, reduzindo assim liberação de ROS. Estes resultados divergentes podem ser
devido a diferenças no estado fisiológico dos neutrófilos, visto que no presente estudo foi
avaliado a liberação basal de superóxido ou seja, metabolismo oxidativo de neutrófilos não-
imunoestimulados. A divergência também pode ser atribuída às propriedades
farmacodinâmicas do vegetal utilizado para a elaboração do extrato testado.
52
CONCLUSÕES
O tratamento de neutrófilos humanos com extrato de gengibre (1000 μg/mL) promoveu
alteração no metabolismo oxidativo dos neutrófilos, causando um aumento na liberação basal
de ânion superóxido. Esse resultado pode ser associado a um agravamento do processo
inflamatório, no caso de doenças inflamatórias. Entretanto, esse aumento do metabolismo
oxidativo pode ser benéfico no caso de quadros infecciosos, pois aumenta os mecanismos
microbicidas dos neutrófilos, podendo ser utilizado para terapias infecciosas. Este resultado
caracteriza-se como um passo inicial para o desenvolvimento de pesquisas em humanos,
mesmo que em modelos in vitro, e apresenta novas perspectivas para terapias envolvendo o
uso de gengibre. Nossos resultados direcionam para novos estudos que serão conduzidos para
determinar a toxicidade do extrato de gengibre para este tipo celular, bem como avaliar a
liberação de ânion superóxido por neutrófilos imunoestimulados com PMA e fMLP e tratados
com extrato de gengibre.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a PRPPG-UFES por conceder o auxílio financeiro através da FAP para
a execução desta pesquisa, ao Prof. Dr. Bernardo Mantovani da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo (FMRP-USP), pela doação de reagentes e a
especialista em laboratório Silvana Chedraoui Silva, da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, da Universidade de São Paulo (FMRP-USP), pelo apoio técnico.
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54
Isolamento de neutrófilos humanos por sedimentação em gradiente de
gelatina
Maria G. Zanardo; Paloma M. Fagundes; Mariana D. C. Ignacchiti
Palavras-Chaves: fagócitos, leucócitos, purificação celular, viabilidade celular
INTRODUÇÃO
O conceito de células fagocíticas foi criado em 1880 a partir dos estudos do cientista russo
Elie Metchnikoff (prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1908), após espetar uma larva
de estrela-do-mar com um espinho de uma roseira. Metchnikoff verificou um acúmulo de
células especializadas ao redor da ponta afiada. Uma resposta ativa do organismo foi então
proposta, a fagocitose (termo cunhado pelo próprio Metchnikoff). Esta atividade seria
fundamental na manutenção da integridade dos organismos multicelulares (HAMPTON et al.,
1998). Os neutrófilos juntamente com macrófagos são considerados fagócitos profissionais
componentes da primeira linha de defesa da resposta imune inata em humanos (KANTARI et
al., 2008). Neutrófilos representam a célula mais abundante na circulação sanguínea
periférica, constituindo 50 a 70% dos leucócitos totais (DAVIS E GALLIN, 1981). Este tipo
celular foi primeiramente descrito pelo bacteriologista alemão Paul Ehrlich (1879). Quando
visualizado no sangue periférico através de um esfregaço sanguíneo, os neutrófilos
apresentam-se como uma célula de diâmetro entre 12-15 μm, têm um núcleo polimórfico, que
em geral apresenta três lóbulos ligados por filamentos finos de cromatina, seu citoplasma é
abundante e altamente granulado, característica que justifica a denominação de granulócito
(CLINE, 1975). Sob um estímulo apropriado os neutrófilos são recrutados da medula óssea
para a circulação sanguínea. No ambiente intravascular os neutrófilos, sob influência de
substâncias quimiotáticas (quimiocinas, citocinas, componentes do sistema complemento,
produtos derivados do patógeno, dentre outros) que estimulam sua agregação e aderência na
superfície endotelial, podem emigrar da circulação. Esta migração do endotélio para sítios de
infecção é denominada de diapedese (DIMASI et al., 2013). Uma vez que o neutrófilo alcança
o tecido afetado, uma complexa série de eventos se inicia e culmina na eliminação da partícula
invasora através do processo de fagocitose (FREITAS et al. 2008). A fagocitose é associada
a alterações no metabolismo do neutrófilo que culminam em um surto respiratório e no
processo de desgranulação. Juntos estes processos promovem a destruição da partícula
fagocitada com o desenvolvimento de uma resposta inflamatória (NAUSEEF, 2007). Apesar
do seu papel fundamental na defesa do organismo, o recrutamento de neutrófilo e a ativação
destes pode ter implicações na patogênese de doenças autoimunes e inflamatória (BABIOR,
2000; MARZOCCHI-MACHADO et al., 2002; JANCAR & CRESPO, 2005). O isolamento
de neutrófilos humanos é uma importante técnica para estudar as características fisiológicas
desta célula e para modelos experimentais de doenças inflamatórias, auto-imunes e
infecciosas que envolvam a participação de neutrófilos. Os métodos atualmente disponíveis
para isolamento de neutrófilos humanos não combinam a rapidez, garantia de pureza,
confiabilidade e metodologia de baixo custo financeiro. Assim, o objetivo deste estudo é
estabelecer um protocolo de isolamento de neutrófilo humanos através da técnica de
sedimentação em gradiente de gelatina. A eficiência do protocolo proposto foi determinada
através do tempo de manipulação, viabilidade celular e pureza das células separadas.
55
METODOLOGIA
Aspectos éticos
O projeto está em conformidade com as Resolução do CNS 466/12 e está aprovado no
CEP/CCS/UFES/CONEP (CAAE 49091615.6.0000.5060).
Coleta das amostras
Foram avaliados um total de 12 voluntários (homens e mulheres), com idade entre 18 e 40
anos. Os voluntaries não estavam sob administração de medicamentos ou efeito de drogas,
com exceção de contraceptivo oral no caso das mulheres. A coleta das amostras de sangue
periférico dos voluntários foi realizada por um profissional capacitado e experiente, no
laboratório de Análises Clínicas da Universidade Federal do Espirito Santo (UFES), campus
Alegre. O Termo de consentimento foi autorizado por cada voluntário antes da coleta. Foram
coletados 10 mL de sangue periférico por punção venosa de cada voluntário.
Procedimento de isolamento
Foram avaliadas duas metodologias: protocolo de sedimentação em gradiente de gelatina
proposto por de Henson (1971) (idealizado para o isolamento de neutrófilos de coelhos),
denominado neste estudo de grupo P.H; e protocolo de Henson modificado, proposto pelos
autores para isolamento de neutrófilos de humanos, denominado neste estudo de grupo P.HM.
A metodologia usada para isolamento de neutrófilos no grupo P.H está descrita a seguir. 10
mL do sangue foi coletado em tubos contendo Fluoreto de Sódio + Heparina de Sódio. Após
a coleta de sangue, ao volume total coletado (10 mL de sangue) foi adicionado igual volume
de PBS (tampão salina fosfato) e centrifugado a 550 g por 20 minutos a temperatura ambiente.
O plasma foi descartado juntamente com o buffy coat (anel de coloração branca formado entre
as fases de plasma e sedimento celular), composto principalmente de células mononucleares.
Ao sedimento celular foi adicionado uma solução de gelatina 2,5% (p/v) em PBS, quantidade
equivalente a uma vez o volume do sedimento celular. A mistura foi incubada por trinta
minutos a 37 ºC para sedimentar os eritrócitos. Depois deste período, pode-se notar uma
solução bifásica, contendo eritrócitos na fase mais precipitada e granulócitos na fase superior,
esta última foi recolhida, lavada com PBS a pH 7,2 e centrifugada a uma velocidade de 400 g
durante 10 minutos. O pellet celular foi ressuspendido em uma solução de lise [NH4Cl 0,83
% (p/v) a pH 7,2] e incubado por 5 minutos em temperatura ambiente para lisar as hemácias.
As células foram novamente lavadas em PBS a pH 7,2, centrifugadas a uma velocidade de
200 g durante 10 minutos a 4ºC. Finalmente, as células foram lavadas com PBS a pH 7,2 e
centrifugadas a 200 g durante 10 minutos. As células foram suspensas em 500 μL de Hank’s
Hepes (HBSS) com 0,1% de gelatina, pH 7,2 e em seguida avaliadas quanto a pureza e
viabilidade celular. O isolamento de neutrófilos no grupo P.HM segue a metodologia proposta
pelos autores e está descrita a seguir. 10 mL do sangue foi coletado em tubos contendo
Fluoreto de Sódio + Heparina de Sódio. Após a coleta de sangue, o volume total coletado (10
mL de sangue) foi centrifugado a 755 g por 30 minutos a temperatura ambiente. O plasma foi
descartado juntamente com o buffy coat (anel de coloração branca formado entre as fases de
plasma e sedimento celular), composto principalmente de células mononucleares. Ao
sedimento celular foi adicionado uma solução de gelatina 2,5% (p/v) em PBS (tampão salina
fosfato), quantidade equivalente a duas vezes o volume do sedimento celular. A mistura foi
incubada por trinta minutos a 37 ºC para sedimentar os eritrócitos. Depois deste período, pode-
se notar uma solução bifásica, contendo eritrócitos na fase mais precipitada e granulócitos na
fase superior; esta última foi recolhida, lavada com PBS a pH 7,2 e centrifugada a uma
56
velocidade de 550 g durante 10 minutos. O pellet celular foi ressuspendido em uma solução
de lise [NH4Cl 0,83 % (p/v) a pH 7,2] e incubado por 5 minutos em temperatura ambiente
para lisar as hemácias. As células foram novamente lavadas em PBS a pH 7,2, centrifugadas
a uma velocidade de 550 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, as células
foram lavadas com PBS a pH 7,2 e centrifugadas a 550 g durante 10 minutos. As células foram
suspensas em 500 μL de Hank’s Hepes (HBSS) com 0,1% de gelatina, pH 7,2 e em seguida
avaliadas quanto a pureza e viabilidade celular.
Viabilidade celular
O teste de viabilidade celular foi realizado por exclusão do corante Azul de Tripan. Para isso
10 μL da suspensão celular juntamente com uma gota de solução corante Azul de Tripan 0,4%
(p/v). A mistura foi deixada em repouso por 5 minutos. Em seguida foi realizada a avaliação
em lâmina através da microscopia óptica. Foram contadas aleatoriamente 100 células, as
células que ficaram com coloração azulada foram consideradas mortas e as células vivas
permaneceram incolores. A partir desta contagem foi obtida a porcentagem das células viáveis
de acordo com a equação abaixo:
Viabilidade Celular (%) = [total de células incolores]/[ total de células (coradas e incolores)]
X 100
Pureza celular
Após cada procedimento de isolamento, a suspensão celular obtida foi manipulada e testada
da mesma forma. O pellet celular foi ressuspendido em 500 μL de Hank’s Hepes (HBSS) com
0,1% de gelatina, pH 7,2, e o número total de células foi determinado por contagem manual
em microscópio óptico utilizando o hemocitômetro de Neubauer. Para isso 10 μL da
suspensão celular foi diluída em 190 μL de líquido Turk. A classificação da célula como
neutrófilo foi através das características morfológicas. A pureza celular foi determinada de
acordo com a equação abaixo:
Pureza Celular (%) = [total de neutrófilos]/[ total de células] X 100
Análise estatística
Para a comparação entre médias dos resultados de dois grupos foi utilizado o teste t-student.
Os testes foram realizados com o auxílio do programa Prism6. As comparações foram
consideradas significativas ao nível de p<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Estudos in vitro avaliando as funções de neutrófilos humanos têm crescido e se tornado
importante para o conhecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos nas doenças
inflamatórias, autoimune e infecciosas. A aplicação de metodologias para isolar neutrófilos
humanos tem tido grande destaque e importância em pesquisa na área imunológica e de
patologia. Desta forma, existe um grande interesse em obter um método confiável, rápido,
com bom índice de pureza, que preserve a capacidade funcional da célula e de baixo custo
para o isolamento de neutrófilos do sangue total de humanos. Métodos diferentes têm sido
usados por numerosos laboratórios para o isolamento de neutrófilos humanos. No entanto, a
maioria são dispendiosos de tempo e de alto custo financeiro. Com base nisso, esse trabalho
propôs estabelecer uma metodologia rápida, de fácil execução, de bom índice de pureza e de
57
custo baixo para o isolamento de neutrófilos humanos, através da adaptação do protocolo
originalmente descrito por Henson (1971), delineado para o isolamento de neutrófilos do
sangue total de coelhos. Neste estudo, a purificação de neutrófilos humanos inicialmente foi
realizada conforme protocolo original de Henson (1971), grupo P.H. Pode-se observar uma
baixa pureza das amostras no grupo P.H (37,97% ± 5,62) (Figura 1). A metodologia descrita
por Henson (1971) é uma técnica empregada para o isolamento de neutrófilos a partir de
sangue total de coelho, sendo descrita, originalmente, uma pureza de 98% para isolamento de
neutrófilos de coelho. Para melhorar a pureza da técnica de sedimentação por gradiente de
gelatina e adequá-la para o isolamento de neutrófilos humanos foram feitas modificações no
protocolo original de Henson, grupo P.HM. Pode-se observar um aumento na recuperação de
neutrófilos a partir da modificação do protocolo, grupo P.HM (65,37% ± 3,43) (Figura 1). Ao
analisar os grupos P.H e P.HM foi observado um aumento significativo na recuperação de
neutrófilos após a modificação do protocolo de Henson (p=0,0014). Isso significa que as
modificações propostas neste estudo podem ser válidas para utilização desta técnica para a
purificação de neutrófilos do sangue total de humanos.
Figura 1: Purificação de neutrófilo por sedimentação em gradiente de gelatina, porcentagem de pureza celular.
P.H= protocolo original de Henson; P.HM= protocolo de Henson com modificação. Os dados são apresentados
como média + DPM, n=12. Para a análise estatística foi utilizado o teste T.
RUSSO CARBOLANTE et al. (2002) avaliaram quatro metodologias para isolar neutrófilos
a partir do sangue total de ratos e demonstraram que a técnica de sedimentação em gradiente
de gelatina, segundo protocolo de Henson (1971), promove uma pureza de 45% de neutrófilos.
MARCHI et al. (2014) também avaliaram quatro metodologias para purificação de neutrófilos
a partir do sangue total de camundongos e demonstraram que o protocolo de Henson (1971)
promoveu uma pureza de 53,6% de neutrófilos. Outra vantagem da técnica de purificação de
neutrófilos utilizando a sedimentação em gradiente de gelatina é a boa viabilidade celular,
pois são utilizados agentes químicos inertes. Neste estudo foi observado uma alta viabilidade
celular nos dois protocolos, e que as modificações propostas no grupo P.HM não interferem
na viabilidade (p= 0,3931) (Figura 2). Demonstrando que este método é seguro para
isolamento de neutrófilos humanos e não prejudica a viabilidade celular.
58
Figura 2: Viabilidade celular após a purificação de neutrófilo por gradiente em sedimentação de gelatina. P.H=
protocolo original de Henson; P.HM= protocolo de Henson com modificação. Os dados são apresentados como
média + DPM, n=9. Para a análise estatística foi utilizado o teste T.
O tempo de execução dos protocolos P.H e P.HM foram de 120 min e 125 min,
respectivamente. Esta diferença de 5 minutos não é considerada significante. Existem outras
técnicas para realizar o isolamento de neutrófilos humanos, podendo ser citado a técnica de
gradiente de Histopaque, Ficoll, Percoll. Estes métodos apresentam uma pureza maior,
próxima de 90%; entretanto, o rendimento celular (número total de células recuperadas) é
menor, apresentam uma maior custo, cerca de US$ 2 a 4 para as técnicas de Histopaque e
Ficoll, em comparação à gelatina que custa US$ 0,5 (RUSSO CARBOLANTE et al.,2002) e
demandam tempo similar para a realização do procedimento experimental.
CONCLUSÕES
A técnica de isolamento de neutrófilo a partir da sedimentação em gradiente de gelatina é
eficaz para purificação de neutrófilo do sangue humano, é uma técnica que utiliza agentes
químicos inertes, e não danificam as células estudadas, apresentam uma boa pureza, além de
ser um método de baixo custo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a PRPPG-UFES por conceder o auxílio financeiro através da FAP para
a execução desta pesquisa, ao Prof. Dr. Bernardo Mantovani da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo (FMRP-USP) pela doação de reagentes.
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60
Uso do óleo essencial de Copaifera officinalis L. como possível agente
moluscicida sobre moluscos do gênero Biomphalaria
Lara Dutra Gava; Mikaelle Alves Silva; Isabella Vilhena Freire Martins; Mariana Drummond
Costa Ignacchiti
Palavras-Chave: caramujo, controle biológico, copaíba, esquistossomose.
INTRODUÇÃO
A esquitossomose mânsonica é causada pelo parasito trematódeo do gênero Schistosoma
mansoni que tem como hospedeiro intermediário os caramujos do gênero Biomphalaria. Essa
enfermidade ocorre em muitos lugares do Brasil sendo em principal os locais onde o
saneamento básico é precário (COSTA et al., 2015). No Brasil, ela está distribuída,
intensamente ao longo de quase toda a costa litorânea da região Nordeste, a partir do Rio
Grande do Norte, incluído os estados da Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia, onde
se interioriza alcançando Minas Gerais, além do Espírito Santo, na região Sudeste, seguindo
o trajeto de importantes bacias hidrográficas (BRASIL, 2011). Estima-se que cerca de 25
milhões de pessoas vivem em áreas sob o risco de contrair a doença (BRASIL, 2005).
Programas de controle da esquistossomose limitam-se, na maioria dos casos, ao tratamento
quimioterápico dos indivíduos doentes e no impedimento da disseminação dos ovos do
parasito, ações comprovadamente paliativa e repetitiva (BARBOSA et al, 1996). Programas
de controle integrado de moluscos fazem-se essenciais, sendo recomendados como medidas
estratégicas, associado ao tratamento de pessoas doentes e à melhoria das condições
socioeconômicas e de saneamento básico. Atualmente, o uso de substâncias moluscicidas são
considerados cruciais para o controle da esquistossomose. Essas substâncias são uma
estratégia promissora, uma vez que o foco para o combate da esquistossomose não está apenas
na eliminação do parasito, bem como no controle do vetor, interrompendo-se o ciclo evolutivo
do parasito e consequentemente, o aparecimento de novos casos (CANTANHEDE et al.,
2010). Até 2005, foi estimado que aproximadamente 7.000 produtos químicos foram testados
com esta finalidade, mas poucos obtiveram sucesso. Entre eles os principais são: sulfato de
cobre, Gramaxone, hidróxido de cálcio, N-tritilmorfolina (Frescon) e Niclosamida
(Bayluscid) (NEVES, 2005). O mais utilizado é a substância sintética Niclosamida (N-(2'-
cloro-4'nitrofenil) - 5 clorosalicilanilida) que é o moluscicida comercialmente disponível e é
indicado pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Porém, o seu uso tem gerado
preocupação em relação a fatores como: toxicidade para outras espécies, devido à sua baixa
seletividade; podendo acarretar sérios problemas de ordem ambiental (CANTANHEDE et al.,
2010) e também a seleção de caramujos resistentes ao produto (GASPAROTTO et al., 2005).
O uso de substâncias biodegradáveis, derivadas de plantas, tem sido estimulado para controle
de hospedeiros intermediários de várias parasitoses de interesse médico e veterinário (COSTA
et al., 2015; PINHEIRO et al. 2017). A biodiversidade brasileira é um dos maiores bens que
o país possui, existindo diversos ecossistemas como, por exemplo, Amazônia, Cerrado, Mata
Atlântica, Caatinga, Pantanal, entre outros. O Brasil possui a flora mais diversa do mundo,
com mais de 55 mil espécies de plantas ou 22% do total mundial. Também encontra-se no
País a maior riqueza de espécies de palmeiras (390 espécies) e de orquídeas (2.300), além de
algas, gimnospermas (como o pinheiro), pteridófitas (samambaias) e briófitas (BRASIL,
2019). Os óleos essenciais (OE) são derivados do metabolismo secundário das plantas. Eles
têm uma composição complexa e diversa, sendo compostos por: terpenos, alcaloides, fenóis,
cumarinas, cetonas, aldeídos entre outros. Diversos pesquisadores têm investigado as
61
atividades biológicas destas misturas complexas de substâncias, sendo descritas propriedades
antimicrobianas, repelentes de insetos, antiparasitárias, antifúngicas, antiproliferativas, anti-
inflamatórias (BUCKLE, 2003). O gênero Copaifera é constituído de espécies de elevado
valor econômico e ecológico, não somente na Amazônia, mas em todo o continente Sul-
Americano. A Copaifera officinalis L., conhecida vulgarmente como copaíba, são árvores
comuns na América Latina e África Ocidental, sendo encontradas no Brasil, nas regiões
Sudeste, Centro-Oeste e Amazônica (FRANCISCO, 2005). Para essa espécie são descritas
propriedades terapêuticas: antiinflamatória, ação cicatrizante, potencial anti-séptico,
antitumoral, antibacteriano, expectorante, diurético, a ação antiviral, distúrbios intestinais
(revisado por PIERI et al., 2009). Também é descrito seu uso na indústria de cosméticos para
a fabricação de cremes, sabonetes, xampus, amaciantes de cabelos e como fixador de odores
(VEIGA JUNIOR & PINTO, 2002; CASCON, 2004). A utilização de substâncias
moluscicidas de origem vegetal é uma estratégia promissora, uma vez que o uso de plantas
medicinais, sob a forma de óleos essenciais, pode representar uma alternativa econômica,
além de evitar a poluição do meio ambiente, por serem biodegradáveis. Diante das
propriedades já descritas para o OE de Copaifera officinalis L. este trabalho tem como
objetivo avaliar a propriedade moluscicidas do OE de Copaifera officinalis L. para ser
utilizado no controle de população de moluscos do gênero Biomphalaria, hospedeiros
intermediários para o parasito S. mansoni.
METODOLOGIA
Obtenções dos óleos essenciais
O OE da espécie vegetal Copaifera officinalis L. (Copaíba) foi obtido por doação da By
Samia, empresa especializada em aromaterapia (http://www.bysamia.com.br/; CNPJ:
03.671.985/0001-75). Para a obtenção do OE de copaíba (n º lote 061604B) foram utilizadas
cascas do tronco da arvore e o óleo extraído por destilação a vapor.
Obtenções dos moluscos
Os caramujos do gênero Biomphalaria utilizados nos testes moluscicida são derivados da
colônia de Biomphalaria, do laboratório de Parasitologia do Hospital Veterinário do Centro
de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCAE-
UFES). Os animais foram mantidos em temperatura média de 24°C, com ciclo escuro de 10
horas e acondicionados em aquários de vidro, contendo água previamente declorada com
aeração artificial contínua, no Laboratório de Malacologia do CCENS-UFES. A alimentação
foi baseada na oferta de folhas de alface (Lactuca sativa) ad libitum e oferta semanal de ração
de pássaro triturada, com fonte de proteína e cálcio.
Testes moluscicidas
Foram avaliadas as concentrações de 100, 80, 60, 40 e 20 ppm (μg.mL-1) do OE dissolvido
em DMSO 0,5 % (v/v). Foram usados 15 moluscos (com aproximadamente 8 a 12mm de
diâmetro da concha) para cada concentração testada. Para cada experimento foi elaborado um
controle do veículo, constando de cinco moluscos imersos em solução de DMSO 0,5 % e
controle positivo realizado com sulfato de cobre 2 ppm. Como controle negativo foi utilizado
a água. Para iniciar o teste, cada molusco foi acondicionado individualmente em poços da
placa de poliestireno (placa de cultura de 24 poços) contendo 2,0 mL da solução teste. O
monitoramento da motilidade e viabilidade dos moluscos foram realizados no período de duas,
quatro, seis, doze e vinte e quatro horas pós- tratamento, conforme recomendações da
62
Organização Mundial da Saúde (WHO, 1983). Após vinte e quatro horas os animais que ainda
permaneciam vivos foram acondicionados em um aquário com água limpa, declarada e com
comida para observar se morreriam durante um tempo de quarenta e oito horas totais. A
mortalidade foi caracterizada por liberação de hemolinfa, criação de bolhas, encolhimento do
animal totalmente para dentro da concha ou ausência de estímulo após contato com agulha,
sendo observados por lupas, conforme descrito por MCCULLOUGH et al. (1980). A DL100
foi caracterizada nos ensaios moluscicidas como a menor concentração que mata 100% dos
moluscos.
Análises estatísticas
Foi usado o teste estatístico de análise de variância de Two-Way ANOVA para dois fatores
(tempo e concentração), seguido de análise post-hoc Turkey. Os testes foram realizados com
o auxílio do programa estatístico GraphPad Prism5. As comparações foram consideradas
significativas ao nível de p<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A principal dificuldade do controle da esquitossomose é a deficiência no cuidado com
saneamento básico e o crescimento acelerado dos centros urbanos, levando ao
estabelecimento de comunidades marginais desprovidas de infraestrutura sanitária mínima,
criando condições para a manutenção do caramujo hospedeiro e consequentemente a
transmissão da parasitose. Segundo WHO (2013), em alguns países, a transmissão da
esquistossomose pode ser reduzida por meio de programas de controle ativo e/ou mudança
das condições socioeconômicas. Novas estimativas mostram que o número de pessoas
exigindo quimioterapia preventiva para esquistossomose é de cerca de 237.216.451 em 51
países no ano de 2010, inclusive o Brasil (WHO, 2013). Uma das formas de controle da
esquistossomose é através do uso de moluscicidas. De acordo com WHO (1983), uma
substância é viável para uso como moluscicida se apresentar efeito tóxico em caramujos
adultos em concentrações menores ou igual a 100 ppm do extrato bruto ou mistura complexa
de substâncias (como é o caso do OE); já para composto isolado (substância pura) a toxicidade
deve ser em concentrações menores ou iguais a 20 ppm. O OE de C. officinalis L. na
concentração de 100ppm foi letal para o molusco do gênero Biomphalaria, sendo a taxa de
mortalidade igual a 100% após 12 horas de exposição ( Tabela 1). Os moluscos incubados
com solução de DMSO 0,5% (v/v) não apresentaram alteração na motilidade, permanecendo
com comportamento similar ao dos moluscos incubados em água potável declorada,
demonstrando que o solvente utilizado na preparação das soluções não interfere na viabilidade
dos moluscos (Tabela 01). Portanto, as propriedades moluscicidas do OE de C. officinalis L.
pode ser atribuída a componentes presentes no óleo e não á toxicidade do DMSO.
Tabela 1: Atividade moluscicida do óleo essenciail de C. officinalis L. na concentração de 100 ppm sobre
moluscos do gênero Biomphalaria
Solução teste Mortalidade (%)*
2h 4h 6h 12h 24h
OE C. officinalis (100ppm) 0% 20% 40% 100% 100%
Sulfato de Cu (2 ppm) 100% 100% 100% 100% 100%
DMSO 0,5% 0% 0% 0% 0% 0%
Controle negativo 0% 0% 0% 0% 0% *Taxa de mortalidade nas concentrações de 100 ppm, n=15 moluscos por tratamento.
63
O OE C. officinalis L. não teve atividade moluscicidas nas concentrações menores que
100ppm (Tabela 2). Após a finalização das 24h os moluscos foram transferidos para um
aquário com água declorada e avaliados por mais 24 horas (totalizando 48 horas), não sendo
observada morte neste período. A análise estatística revelou que o tempo de exposição não
influência na atividade moluscicida deste óleo (p=0,44), mas a concentração do OE exerce
influência na atividade moluscicida (p=0,0003), visto que o oleo foi letal na maior
concentração avaliada. Também foi observado o comportamento dos moluscos durante as
primeiras seis horas de contato com as soluções testes. Foram avaliados os seguintes
parâmetros: aumento de movimentação, liberação de hemolinfa, ausência de resposta a
estímulo com agulha, liberação de bolhas, retração da massa cefalopoidal para interior da
concha e projeção da massa cefalopoidal para fora da concha. Os moluscos tratados com OE
de C. officinalis L. na concentração de 100ppm, na primeira hora de exposição, apresentaram
um aumento na frequência de movimentação e tentativa de escape da solução. Após 4horas
de exposição foi observado o início da mortalidade. A morte foi caracterizada por projeção da
massa cefalopoidal para fora da concha, não sendo observado a liberação de hemolinfa e de
bolhas para nenhum dos animais avaliados (Figura 1). Os animais tratados com o sulfato de
cobre 2 ppm apresentaram projeção da massa cefalopoidal para fora da concha ou liberação
de hemolinfa, as alterações foram observadas após 10 min de exposição (Figura 1). Nenhuma
alteração comportamental foi observada nos moluscos expostos ao DMSO 0,5%, sendo
semelhante ao comportamento dos animais do controle negative (Figura 1).
Tabela 2: Atividade moluscicida do óleo C. officinalis L. sobre moluscos do gênero Biomphalaria.
OE de C. officinalis L.
(ppm)
Mortalidade (%)*
2h 4h 6h 12h 24h
20 0 % 0% 0% 0% 0%
40 0% 0% 0% 0% 0%
60 0% 0% 0% 0% 0%
80 0% 0% 0% 0% 0%
DMSO 0,5% 0% 0% 0% 0% 0% *Taxa de mortalidade nas concentrações de 20, 40, 60 e 80 ppm, n=15 moluscos por tratamento. Para a análise estatística foi utilizado o teste Two-Way ANOVA post-hoc Turkey.
1 2 3 4
Figura 1: Comportamento dos animais após 4 horas de exposição às soluções teste. 1- Controle negativo, 2- Sulfato de cobre 2 ppm, 3-DMSO 0,5%, 4- OE de C. officinalis L. 100 ppm.
Os estudos sobre a potencialidade de produtos naturais com propriedade moluscicidas têm
crescido consideravelmente. De um modo geral, os trabalhos pesquisados avaliam o efeito
moluscicida de extratos vegetais (revisado por CANTANHEDE et al., 2010). Em estudo
realizado por MENDES et al. (1990) o hidrolato de Eucalyptus citriodora foi ativo contra
caramujos e desovas de B. glabrata, mas o óleo essencial apresentou-se inativo. TREYVAUD
et al. (2000) relaciona a atividade moluscicida de Phytolacca icosandra às saponinas isoladas
do extrato metanólico e aquoso das bagas desse vegetal, as quais apresentaram atividade para
B. glabrata em concentrações de 200 e 25 ppm. GARDIOLI et al. (2017) observou que os
extratos hidroalcoólico de Davilla nitida e D. elliptica apresentaram atividade moluscicida
em um período de 24 horas de exposição sobre dos moluscos Lymnaea columela, hospedeiro
64
intermediário para a Fasciola hepatica. O extrato de D. nitida apresentou DL100 na
concentração de 100 ppm em 24 horas. Já o extrato de D. elliptica a DL100 foi observada na
concentração de 100 ppm, após 6 horas de exposição. De acordo com COSTA (2015) os
moluscos L. columella e B. tenagophila apresentam sensibilidade ao OE de Cymbopongon
winterianus Jowitt. A maior sensibilidade foi apresentada pelos moluscos da espécie L.
columela com a DL100 de 60 ppm e DL50 de 40 ppm, quando comparado aos moluscos da
espécie B. tenagophila, cuja DL100 foi 80 ppm e DL50 de 60 ppm. O efeito moluscicida de OE
derivados de 11 espécies de eucaliptos também foi demonstrado sobre caramujos adultos e
desovas de B. glabrata, sendo observado atividade moluscicida e sobre as desovas nas
concentrações de 20ppm (p/V) (MENDES, et al. 1990). PINHEIRO et al (2017) avaliaram o
potencial moluscicida do OE de Eugenia uniflora L. sobre L. columella e B. tenagophila. Os
autores descrevem DL100 de 100 ppm para L. columela e DL100 de 60 ppm para B. tenagophila.
A concentração de 20 ppm inibiu a ovoposição para as duas espécies. De acordo com
diretrizes da Organização Mundial da Saúde (WHO, 1983), a planta com propriedade
moluscicida só deve ser considerada ativa quando promover mortalidade de 90% (DL90) ou
superior nas concentrações de 20 ppm para a substância isolada ativa. Em se tratando de óleos
essenciais (mistura de substâncias), a dosagem máxima permitida é de 100 ppm para o período
de 24 horas. Neste sentido, o OE de C. officinalis L. apresenta-se como uma alternativa para
o controle do vetor da esquistossomose, pois além de sua eficácia dentro dos parâmetros
preconizados pela OMS (WHO, 1983), apresenta baixa toxicidade a humanos, devido seu uso
já ser difundido e pode ser um composto natural que e extraído de forma relativamente
simples. Segundo COSTA et al. (2015) para a utilização de uma substância como moluscicida
efetivo deve ser considerado o seu mecanismo de ação. No caso de moluscicida de origem
vegetal, a elucidação deste mecanismo necessita de estudos que revelem o perfil fitoquímico
do material vegetal utilizado e a resposta fisiológica do molusco frente aos seus constituintes
químicos isolados. Entretanto, SOUZA et al. (2005) enfatizam que devido à complexidade da
composição química de um OE não se deve associar sua atividade biológica com substâncias
isoladas que se encontram presentes nos OE. Geralmente, a ação atribuída a um composto
químico testado de forma isolada pode não ser exata, devido a possíveis interações
sinergéticas e antagônicas que podem ocorrer entre os compostos presentes no OE.
CONCLUSÕES
Os óleos de Copaíba demostraram propriedade mosluscicida de acordo com os parâmetros
estabelecidos pela WHO, tendo a DL100 na concentração 100 ppm após uma incubação de 12
horas.
AGRADECIMENTOS
À By Samya pela doação do óleo essencial de Copaíba; ao aluno de medicina veterinária Ygor
Henrique da Silva e a mestranda em Ciências Veterinárias Maria Larissa Bitencourt Vidal por
transmitirem os conhecimentos para a manutenção dos animais em cativeiro.
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66
Associação de valores de pressão arterial com parâmetros socioeconômicos
de usuários do SUS na cidade de Alegre, ES
Tamires dos Santos Vieira; Suzanny Oliveira Mendes; Ivana Alece Arantes Moreno; Amanda
Sgrancio Olinda; Paola Cerbino Doblas; Bruna A. Borges Dutra; Flávia Vitorino Freitas; Julia
Assis Pinheiro; Adriana Madeira Alvares da Silva
Palavras-Chave: renda, faixa etária, urbano e rural.
INTRODUÇÃO
A Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS), possui causa multifatorial e multicausal sendo
caracterizada por níveis pressóricos aumentados e sustentáveis (OLIVEIRA NETO et al.,
2014). Dentre as doenças cardiovasculares, a HAS, abrange uma patologia que é capaz de
afetar os indivíduos fisicamente e psicossocialmente (SBC, 2010). Essa doença possui
diversos fatores de risco, não modificáveis como: história familiar de doença coronariana;
idade avançada; sexo masculino e raça negra. Quanto modificáveis que incluem: dislipidemia;
tabagismo; etilismo, nível sanguíneo de glicose elevada; obesidade; sedentarismo; estresse,
má alimentação e uso de contraceptivos (CUSTÓDIO et al., 2011; MAGNABOSCO et al.,
2017). De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de, cerca de 7
milhões de pessoas morrem a cada ano e 1,5 bilhão adoecem por causa da HAS (WHO, 2016).
A Diabetes de Melitus (DM) e a HAS são doenças com elevado custo para o serviço de saúde
(UNASUS,2017). Segundo a Sociedade Brasileira de Hipertensão (2016), doenças
cardiovasculares são a primeira causa de morte no Brasil, apresentando aproximadamente 17
milhões de pessoas que sofrem de hipertensão, atingindo em média 30% da população
brasileira, chegando a mais de 50% na terceira idade sendo responsável por 40% dos infartos,
80% dos acidentes vascular cerebral (AVC) e 25% dos casos de insuficiência renal terminal.
A HAS compreende uma doença de alta prevalência tanto nacionalmente quanto
mundialmente, seus valores limítrofes para hipertensos (acima de 18 anos) são definidos pela
Pressão Arterial Sistólica (PAS) entre 130 e 139 mmhg e Pressão Arterial Diastólica (PAD)
entre 85 e 89 mmhg (CHAGAS et al., 2016). Diante do exposto, o presente estudo buscou
associação entre os valores de pressão arterial com parâmetros socioeconômicos de usuários
do SUS na cidade de Alegre, ES.
METODOLOGIA
Casuística
Este projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa (Parecer CEP CCS UFES
1574160). A casuística do estudo foi composta de cerca de 370 usuários do Sistema Único de
Saúde (SUS) da região do Caparaó Capixaba, que foram abordados através das Unidades
Básicas de Saúde (UBSs e PSFs). Os indivíduos assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE), segundo os protocolos éticos da legislação em vigor.
Aferição da pressão arterial
Para a aferição da pressão arterial foi utilizado um esfigmomanômetro aneroide com
estetoscópio, marca G-TECH®, modelo Premium. A classificação da pressão arterial será
67
realizada com base nas VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão – classificação de acordo com
a medida casual no consultório. Foram realizados coleta de sangue para avaliação bioquímica
medindo-se glicose e colesterol total. A estatística descritiva de Qui-quadrado foi utilizada
para avaliar a associação entres os valores de pressão e as variáveis de estudo relacionados a
parâmetros de saúde. Os dados foram tabulados na planilha do Excel Microsoft ® e
posteriormente para análise estatística foi realizado o teste qui-quadrado no programa SPSS
Statistics.
RESULTADOS E DOSCUSSÕES
Participaram do estudo 370 indivíduos, sendo 76 homens e 294 mulheres, correspondendo a
20,5% e 79,5%, respectivamente. A idade dos participantes variou de 20 a 59 anos, sendo
mais representativos a faixa etária de 40 a 59 anos (n=222). Em vários estudos observa-se a
mesma tendência encontrada no presente estudo, em que as mulheres são maioria na busca
pelos serviços de saúde. Levorato et al. (2014), observaram que as mulheres buscaram os
serviços de saúde 1,9 vezes mais em relação aos homens. De acordo com dados IBGE em
2009, a cada 100 mulheres, 95 homens procuravam a atenção básica (IBGE, 2010). As
variáveis sociodemográficas (sexo e renda familiar) não apresentaram relação com pressão
arterial (Tabela 1). No entanto observa-se que as variáveis categóricas Idade e localização
apresentaram relação significativa (p<0,05) com a pressão arterial. Na Tabela 1 são
apresentados os resultados da caracterização sociodemográfica dos usuários do SUS da cidade
de Alegre, ES.
Tabela 1. Caracterização das variáveis.
Pressão arterial
Variáveis Total Normal Elevado p
N (%) N (%) N (%)
Idade
20 a 39 anos 148 40 130 35,1 18 4,9 0,002
40 a 59 anos 222 60 166 44,9 56 222
Sexo
Feminino 294 79,5 237 64,1 57 79,5 0,563
Masculino 76 20,5 59 15,9 17 20,5
Localização
Rural 130 35,3 115 31,3 15 4,1 0,003
Urbana 238 64,7 180 48,9 58 15,8 0,003
Renda familiar
< 1 salário 302 83,7 242 67 60 16,6 0,502
> 1 salário 59 16,3 45 12,5 14 3,9 * Variáveis categóricas apresentadas em frequências relativas (%) e absolutas (n). Qui-quadrado, com
significância de 5% (p <0,05).
Em dados divulgados pela Sociedade Brasileira de Cardiologia (SBC) (SBC, 2010), a
hipertensão arterial possui prevalência entre 22,3% e 43,9% (média de 32,5%) na população
atingindo em sua maior parte a faixa etária entre 60 e 69 anos e idosos com idade acima de
70 anos. A idade é uma variável que independentemente de fatores éticos, sociais e culturais
68
intrínsecos de cada população, está associado a maior incidência de doenças crônicas não-
transmissíveis (DCNT), como a hipertensão arterial, dislipidemias e diabetes de melitus
(OLIVEIRA NETO et al., 2014; MAGNABOSCO et. al. 2017). Doenças que acarretam
aumento dos custos com saúde no país e no mundo. Outro fator muito importante que ainda
precisa ser elucidado visto a diferenças encontrada na literatura é a relação da hipertensão
arterial com os aspectos socioeconômicos como escolaridade, renda, cargos de chefia ou
subalternos, empregado ou não, relacionam-se com o risco cardiovascular com redução da
expectativa de vida (MARTINS et al., 2014). Para Levorato et al. (2014) existe uma influência
do perfil socioeconômico no controle da hipertensão, indicando que pessoas com condições
socioeconômicas menos favorecidas apresentam níveis pressóricos mais elevados. No
entanto, no presente estudo essa relação não foi observada. E possível encontrar na literatura
associações entre o tipo de trabalho e as doenças cardiovasculares e a elevação da pressão
arterial (CUSTODIO et al., 2011.), e esse fator pode estar relacionado a localização. No
estudo realizado com indivíduos usuário da atenção básica de Alegre, foi encontrado
associação entre a localidade (rural ou urbana) e níveis de pressão arterial (p<0,005).
(OLIVEIRA NETO et al., 2014) ao pesquisar a população na China verificou prevalência de
hipertensão arterial de 26,6% na área urbana, significativamente maior do que área rural.
CONCLUSÕES
Nesse contexto, os aspectos socioeconômicos e sua associação com pressão arterial abrem
margem para estudos mais aprofundados e ainda mais encorpados a fim de investigar as
possíveis associações e o peso dessas associações nessa patologia, bem como e em outras
variáveis relacionadas a Doenças Crônicas não Transmissíveis.
AGRADECIMENTOS
Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo (FAPES). Ao grupo de
pesquisa NUPESAn e NPES.
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70
Síntese de novas N-fenil-2fenoxacetamida a partir de um fenol natural
Kellen Barelo Corrêa, Patrícia Fontes Pinheiro
Palavras-Chave: Fenóis naturais, síntese, semi-sintético
INTRODUÇÃO
Após a descoberta da penicilina (1928), novos antibióticos foram obtidos de outras fontes
naturais ou de forma sintética (GOODMAN E GILMAN, 2010). Com o uso frequente de
antibióticos, diversas bactérias passaram a desenvolver resistência a esses fármacos. Esse
problema vem sendo relatado desde a década de 90 até os dias atuais. Uma das grandes
preocupações da OMS (Organização Mundial da Saúde) tem sido o aparecimento das
"superbactérias", que são micro-organismos patogênicos resistentes a diversos antibióticos,
principalmente aos mais tradicionais (PAIVA et al., 2013). Com o avanço do problema da
resistência das bactérias aos antibióticos convencionais, existe uma grande demanda na busca
de novos agentes antimicrobianos, que apresentem diferenciados mecanismos de ação. Uma
classe de compostos que tem potencial antimicrobiano é a dos fenóis, sendo que a partir dessas
substâncias é possível obter uma outra classe, chamada de N-fenil-2-fenoxiacetamidas, que
apresenta uma gama de atividades biológicas, dentre elas atividade antimicrobiana (RAFFA
et al., 2001). Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi sintetizar novas N-fenil-2-
fenoxiacetamidas a partir do timol, um fenol natural.
METODOLOGIA
Para a obtenção das N-fenil-2-fenoxacetimidas foi usado o timol na forma pura, que foi obtido
da empresa Sigma Aldrich. A rota de síntese foi realizada em duas etapas (Esquema 1).
Esquema 1. Rota sintética para o preparo da N-fenil-2-fenoxacetamida.
Na primeira etapa, inicialmente, preparou-se uma solução de cloroacetato de sódio (220
mmol; 38,0 g), dissolvendo o ácido 2-cloroacético (400 mmol; 38,0 g) em água destilada (20
mL), e seguidamente resfriou-se a solução em banho de gelo. Posteriormente, adicionou-se
hidróxido de sódio (NaOH), até o pH ser ajustado em 9-10. Em seguida, usando um balão
bitubulado de fundo redondo, preparou-se uma mistura de NaOH (220 mmol; 8,8 g), água
71
destilada (110 mL) acetona (46 mL) e timol (200 mmol; 30 g). A referida mistura foi agitada
por vinte minutos sob aquecimento a 100 oC. Após o aquecimento, o cloroacetato de sódio
preparado previamente foi adicionado gota a gota à mistura. A solução reagente foi mantida
sob aquecimento e deixada sob refluxo por 24 h. Após o resfriamento à temperatura ambiente,
o valor de pH da mistura foi acidificado para 1-2 com ácido clorídrico (HCl) concentrado, sob
banho de gelo. Após essa etapa, o material obtido foi purificado por extração líquido-líquido
com solventes quimicamente ativos. O material foi dissolvido em 30 mL de éter etílico, em
seguida, colocado em um béquer, resfriado em banho de gelo e então, adicionou-se uma
solução saturada de bicarbonato de sódio (NaHCO3) até pH alcalino. Essa mistura foi
transferida para um funil de separação, onde foram separadas as fases orgânica e aquosa. A
fase orgânica foi devidamente descartada e a fase aquosa coletada em um erleynmeyer, que
foi colocado sob banho de gelo e, em seguida acidificada com HCl concentrado até pH~1-2.
O material obtido foi novamente levado para um funil de separação onde foi extraído 2 x 20
mL com éter etílico. A fase aquosa foi descartada e a fase orgânica obtida foi secada com
sulfato de sódio anidro, filtrada e o solvente foi evaporado. Posteriormente, em um balão
bitubulado, foi adicionado o ácido timoxiacético (0,96 mmol, 0,200g) e 2 mL de
diclorometano (DCM) anidro, a mistura foi deixada sob agitação magnética à temperatura
ambiente, até completa dissolução do ácido. Em um béquer, dissolveu-se DCC (N,N-
dicicloexilcarbodiimida) (1,248 mmol, 0,257 g) em 2 mL de DCM (anidro), sob banho de
gelo. Em seguida, a solução do DCC foi adicionada gota a gota ao balão bitubulado contendo
o ácido timoxacético. Essa mistura foi mantida sob agitação por 20 minutos. Em outro béquer,
adicionou-se DMAP (4-dimetilaminopiridina) (0,192 mmol, 0,0234 g), anilina (0,48 mmol,
0,0447 g) em 2 mL de DCM (anidro). Essa mistura foi adicionada ao balão bitubulado onde
continha a mistura reagente. Após essa etapa, a reação foi mantida sob agitação magnética, a
temperatura ambiente por 24 h. O material obtido foi purificado por meio de cromatografia
em coluna usando como eluente uma mistura de hexano e acetato de etila (3:1). Os demais
compostos foram sintetizados por um procedimento similar ao descrito. Todos os compostos
sintetizados foram caracterizados por métodos espectroscópicos e espectrométricos
(espectrometria de massas, RMN de 1H e de 13C).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
O ácido timoxiacético foi obtido como um sólido branco e cristalino com rendimento de 68%.
Na Figura 1 foi apresentado o espectro de massas do referido ácido.
Figura 1. Espectro de massas do ácido timoxiacético.
A confirmação estrutural do ácido foi possível pela análise do espectro de RMN de 1H (300
MHz, CDCl3), apresentado na Figura 2, devido à presença de um simpleto em δ/ppm: 4,64
(2H) referente aos hidrogênios do grupo CH2-COOH.
72
Figura 2. Espectro de RMN de 1H do ácido timoxiacético.
O composto 2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)-N-fenilacetamida (1) foi obtido com 91% de
rendimento. Pelo espectro de RMN de 13C do composto (1) foi possível observar os sinais de
todos os carbonos, o que corrobora com a sua caracterização. Vale ressaltar, a presença dos
sinais dos carbonos C1'-C4' que são referentes aos carbonos do anel aromático (fenil) ligado
ao grupo NH.
Figura 3. Espectro de RMN de 13C da 2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)-N-fenilacetamida (1).
A caracterização do composto N-(2-clorofenil)-2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)acetamida (2)
obtido com 96% foi realizada pela análise do espectro de RMN de 13C onde houve o
aparecimento dos sinais dos carbonos dos dois anéis aromáticos, dos grupos CH3 e de todos
os outros carbonos dessa molécula (Figura 4).
Figura 4. Espectro de RMN de 13C N-(2-clorofenil)-2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)acetamida (2).
73
Os sinais observados no espectro de RMN de 1H para o composto N-(3-clorofenil)-2-(2-
isopropil-5-metilfenoxi)acetamida (3) obtido com 92% de rendimento, corroboram para a
caracterização da referida substância, houve o aparecimento de sete sinais (H3, H4, H6, H2',
H4', H5' e H6') na região de hidrogênio ligado a anel aromático (Ar-H), conforme mostrado na
Figura 5.
Figura 5. Espectro de RMN de 1H N-(3-clorofenil)-2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)acetamida (3).
A N-(4-clorofenil)-2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)acetamida (4) foi obtida com 96% de
rendimento e sua caracterização foi possível através dos espectros de RMN de 1H. Os sinais
de todos os hidrogênios foram detectados, em destaque os sinais do anel aromático ligado ao
NH. Os sinais dos hidrogênios H2’ e H3’ são quimicamente equivalentes e por isso apresentam
mesmo acoplamento (Figura 6).
Figura 6. Espectro de RMN de 1H N-(4-clorofenil)-2-(2-isopropil-5-metilfenoxi)acetamida (4).
A classe conhecida como N-fenil-2-fenoxiacetamida tem atraído considerável interesse de
pesquisa, pois têm demonstrado uma variedade de atividades biológicas, tais como anti-
inflamatória (KHANUM et al., 2004), efeito analgésico (RANI et al., 2014) e antimicrobiano
(RAFFA et al., 2001). Na literatura são relatadas algumas metodologias, porém existem
poucos trabalhos sobre esses compostos (ANG et al., 2012) (TAKAHASHI et al.,2013).
Contudo, as estruturas das moléculas sintetizados no presente trabalho não foram encontradas
na literatura.
CONCLUSÕES
Os quatros compostos sintetizados a partir do timol, pertencentes à classe das N-fenil-2-
fenoxiacetamidas, foram obtidos com altos rendimentos a partir do ácido timoxiacético e das
74
respectivas anilinas, usando o DCC e DMAP. Tais rendimentos para os referidos compostos
variaram de 91-96%. Os compostos obtidos foram caracterizados e suas estruturas
confirmadas pelas análises dos espectros de massas e de RMN de 1H e de 13C. Esses
compostos poderão resultar em compostos com maior atividade antimicrobiana do que o
próprio material de partida (timol) e, assim poderão servir de estruturas-modelo para novos
fármacos.
AGRADECIMENTOS
CNPq e PRPPG-UFES
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75
Displasia de valva tricúspide em cão da raça Samoieda – relato de caso
Bruna Vieira da Rocha; Elizabeth Regina Carvalho
Palavras-Chave: cães, cardiopatias, anormalidades congênitas, ecocardiografia, insuficiência cardíaca
INTRODUÇÃO
A displasia de valva tricúspide (DVT) nos cães é uma cardiopatia congênita incomum,
caracterizada por má formação da valva tricúspide, que pode levar à insuficiência cardíaca
congestiva direita (ICC) (FAVRIL et al., 2018; LUCINA, 2018; CUBAS et al., 2017)
RELATO DE CASO
Este relato refere-se à um cão jovem, da raça Samoieda, com histórico de ascite, efusão
pleural, cansaço e cianose, diagnosticado com DVT e grave disfunção sistólica ventricular
esquerda através de exames complementares como ecocardiografia, doppler colorido e
eletrocardiografia. A prescrição realizada foi enalapril 5mg, furosemida 40mg, pimobendan
3,8mg, taurine, l-carnitina, sotalol 15 mg, ômega 3 1000mg.
Figura 1. Ecocardiografia do paciente canino macho, raça Samoieda, de um ano de idade com DVT. Imagem
apical das quatro câmaras cardíacas. Observa-se o tamanho desigual dos folhetos da valva tricúspide, com o
folheto septal demasiadamente curto em relação ao folheto parietal, gerando má coaptação.
76
Tabela 1. Parâmetros ecocardiográficos obtidos em Modo-M do VE em corte transversal em janela paraesternal
direita, para avaliação do remodelamento ventricular e função sistólica radial do cão Samoieda de 1 ano de idade
com displasia de tricúspide e importante disfunção sistólica, em dois momentos distintos.
Parâmetro (cm) Valor obtido (cm)
1ª avaliação Após 2 meses
Referência (cm)
(BOON, 2011)
SIV d 1,15 1,25 0,83-0,93
VE d 4,53 4,42 3,09-3,36
PLVE d 1,20 1,46 0,67-0,75
SIV s 1,22 1,61 1,25-1,36
VE s 3,75 3,95 1,85-2,05
PLVE s 1,72 1,77 1,08-1,19
FEJ (%) 36 23 >75
FEC (%) 17,2 10,6 33,3-45,9
VEdn 2,03 1,98 < 1,7 (CORNELL, 2004)
SSPE 0,78 0,99 0,17-0,57 * SIV: septo interventricular; VE: ventrículo esquerdo; PLVE: parede livre do VE; d: diástole; s: sístole; FEJ:
fração de ejeção; FEC: fração de encurtamento; VEdn: VE em diástole normalizado para o peso; SSPE:
separação septal do ponto E.
Figura 2. Ecocardiografia com doppler colorido em paciente canino macho, raça Samoieda, de um ano de idade,
em corte apical de quatro câmaras. Nota-se insuficiência moderada de valva mitral, observada através do mosaico de cores entre o AE e VE (fluxo turbulento). O refluxo possui velocidade de 5,80 m/s, gradiente de
pressão de 134,6 mmHg.
77
Figura 3. Ecocardiografia com doppler colorido em cão Samoieda macho, de um ano de idade. Imagem apical
de quatro câmaras, na qual mensura-se o dPdT, variável de função miocárdica sistólica, por meio do refluxo
mitral. Neste paciente nota-se importante disfunção sistólica do VE (dPdT= 711,1 mmHg).
Figura 4. Ecocardiografia com doppler colorido em paciente canino macho, raça Samoieda, de um ano de
idade, com insuficiência severa de valva tricúspide, secundária à displasia de tricúspide, em corte apical de
quatro câmaras. Observa-se a insuficiência por meio da formação do mosaico de cores (fluxo turbulento)
presente entre o AD e VD. O refluxo sanguíneo ocupa mais de setenta por cento da área do AD, velocidade de
4,19 m/s e gradiente de pressão de 70,5 mmHg.
Figura 5. Eletrocardiografia de sete derivações em paciente canino macho, raça Samoieda, de um ano de idade
com displasia de tricúspide e importante disfunção sistólica. Observa-se fibrilação atrial (ausência de ondas P, intervalos RR irregulares, frequência cardíaca de 174 bpm), além de complexos ventriculares prematuros
polimórficos e com padrões repetidos.
78
DISCUSSÕES
A DVT representa cerca de 2,7% das cardiopatias congênitas em cães, e já foi descrita em
diversas raças, porém este é o primeiro relato na raça Samoieda (LUCINA, 2018; CID et al.,
2019; FAVRIL et al., 2018). O tratamento sintomático foi instituído, utilizando taurina e l-
carnitina que auxilia no manejo das cardiomiopatias, pimobendam devido ao efeito inotrópico
positivo e vasodilatador venoso e arterial, diurético furosemida para controlar a formação de
edema e efusões, enalapril por inibir e reduzir os efeitos negativos que a angiotensina II causa
em ICC, ômega 3 e sotalol por seus efeitos antiarrítmicos (TAKEMURA et al., 2003;
JÚNIOR, MELO, WISCHRAL, 2007; MADDISON, PAGE, CHURCH, 2010; BAUER,
2011; MCAULAY et al., 2018; VISSER et al., 2018). Com isso, obteve-se boa resposta
clínica, porém curta sobrevida do animal.
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79
Associação da proteína Ref-1 com a via de estresse oxidativo, elementos-
traço e hábitos de vida em pacientes com câncer oral
Arícia L. E. M. de Assis; Anderson B. Archanjo; Mayara M. de Oliveira; Joaquim G. dos
Santos; Suzanny O. Mendes; Gabriela T. Peterle; Aline R. Borçoi; Bárbara Risse-Quaioto;
Ivana A. A. Moreno; Rafael P. Souza; Rafael de Cicco; Leonardo O. Trivilin; Christiano J.
G. Pinheiro; Marcelo dos Santos; Fabio D. Nunes; Breno V. Nogueira; Adriana M. Álvares-
da-Silva
Palavras-Chave: Câncer oral, tabagismo, µ-XRF
INTRODUÇÃO
Está comprovada a relação entre o ato de fumar e o desenvolvimento de neoplasias na
cavidade oral e laringe, bem como em locais mais distantes, a saber, estômago, pâncreas,
bexiga urinária e intestino (SAMET; WANG, 2000). Existem entre 60 e 70 substâncias
cancerígenas na fumaça liberada dos derivados do tabaco, dentre elas estão os metais e os
semimetais, tais como: arsênico, níquel, cádmio e polônio 210 e outros (Sociedade Brasileira
de Pneumoligia e Tisiologia, 2010). Essas substâncias são as principais causadoras do
desbalanço celular, gerando o estresse oxidativo, que é o mecanismo mais documentado da
utilização do tabaco (BANDEIRA et al., 2018). Para minimizar os impactos causados pelo
estresse oxidativo, as células possuem proteínas específicas, dentre elas destaca-se a
endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE-1), também conhecida como fator efetor redox
(Ref-1), que é uma proteína que exerce duas funções, a atividade redox e a de reparo por
excisão de base (BER), determinadas em regiões completamente independentes
(XANTHOUDAKIS et al., 1994). Fleck e Nielsen (2004) afirmam que, na via BER, a proteína
é responsável pelo reparo de danos oxidativos e de alquilação, favorecendo a proteção contra
efeitos tóxicos de agentes endógenos e exógenos. Isso inclui também os quimioterápicos. Nos
mamíferos, a principal AP-endonuclease é a APE1/REF-1, que se liga de forma rígida ao
DNA, favorecendo a estabilidade e a conformação necessárias para formar os sítios apurinicos
e apirimidinicos (AP) gerados pela excisão da guanina modificada, os quais, a partir do
momento que são gerados, se não forem adequadamente processados, podem levar à quebra
da fita de DNA, apoptose e aumento da citotoxicidade (GORMAN et al, 1997; LOEB;
PRESTON, 1986). Nesse contexto, a APE1/REF-1 é uma enzima indispensável na
manutenção da via BER. Destaque-se que deficiências nessa via estão sendo associadas a
diversos tipos de cânceres e doenças neurodegenerativas (PARSONS; DIANOV, 2004).
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão de Ref-1 e sua
associação com elementos traços, proteínas da via de estresse oxidativo em especial SOD-1,
OGG1/2 e Trx e hábitos de vida em tumores de células escamosas da cavidade oral.
METODOLOGIA
Casuística e amostras
80
Neste estudo, foram obtidas 78 amostras de tecido tumoral de pacientes com carcinoma de
células escamosas da cavidade oral, atendidas no Instituto do Câncer Arnaldo Vieira de
Carvalho (ICAVC), São Paulo, Brasil, durante o período de janeiro/2012 a maio/2015. As
amostras foram categorizadas de acordo com o hábito tabagista, sendo: nunca fumou, parou
de fumar e fuma atualmente.
Tissue microarrays
Os tissuemicroarrays (TMA) foram confeccionados conforme Cajaiba et al. (2006), a partir
de 78 amostras de carcinomas epidermoides primários de cavidade oral. As seleções das duas
áreas tumorais foram realizadas por dois patologistas, mediante análise de lâminas coradas
com Hematoxilina e Eosina. Dois cilindros de 1,5 mm de diâmetro foram perfurados de cada
amostra do bloco doador e reintroduzidos em blocos de parafina receptores, usando um tissue
microarrayer (Beecher Instruments®, Silver Spring, MD, EUA). Posteriormente, foram
confeccionadas as lâminas histológicas.
Caracterização elementar
Para a caracterização elementar, as amostras, com espessura média de 450 μm e densidade de
0,54 g/cm3, foram dispostas em suporte com filme de Ultralene®na linha de luz D09-XRF.
Para aquisição dos espectros, um feixe branco com faixa de energia de 4 a 24 keV e dimensões
de 2 mm2 incidia nas amostras durante 20 segundos e excitava os elétrons. Os raios X
fluorescentes emitidos foram detectados por meio de um espectrômetro de alta resolução,
baseado em um detector Silicon Drifft com janela de berílio de 8 μm de espessura e área ativa
de 7 mm2. No feixe, foi utilizado um filtro de alumínio de 45 mm e o suporte contendo a
amostra foi posicionado a uma distância de 21 mm e ângulo de 45º em relação ao detector.
Todas as medidas foram realizadas em temperatura ambiente e pressão normal. Nove
medidas, em uma matriz de 3x3, foram realizadas e, posteriormente, uma média das medidas
para a obtenção do espectro final utilizado nas análises. Para o ajuste dos espectros dos raios
X característicos e a determinação dos elementos e suas respectivas intensidades
fluorescentes, foi realizada uma análise de uma amostra de referência certificada, a Standard
Reference Material®1577b ―Bovine Liver‖, produzida pelo National Institute of Standards
and Technology (NIST), sob as mesmas condições das amostras de teste. O programa
computacional PyMca 5.0.0 foi a base para as análises. As medidas de μXRF foram realizadas
na linha de luz de Fluorescência de Raios-X D09-XRF, no Laboratório Nacional de Luz
Síncrotron, Campinas, São Paulo, Brasil.
Reação de imuno-histoquímica
As lâminas de TMA foram submetidas à reação de imuno-histoquímica, na qual foi utilizado
kit comercial (Spring Bioscience®, California, Estados Unidos, PMB1-250). O anticorpo
anti-SOD-1, diluição 1:400 (SC-11407, Santa Cruz), anticorpo anti-Ref-1, diluição 1:400
(SC-17774, Santa Cruz), anticorpo anti-OGG1/2, diluição 1:100 (SC- 376935, Santa Cruz) e
anti-Trx, diluição 1:100 (SC-166393, Santa Cruz) foram utilizados na reação. Controles
negativos (ausência de anticorpo primário) foram usados para padronizar as reações. A
expressão das proteínas nos tecidos foi analisada, independentemente, por dois analisadores
avaliadores. A análise da expressão das proteínas foi realizada de acordo com dois parâmetros,
isto é, análise das expressões nuclear e citoplasmática. A análise para cada proteína foi
semiquantitativa, sendo as amostras classificadas segundo o percentual de células coradas x
intensidade de coloração, informações tanto para o núcleo quanto para o citoplasma.
Posteriormente, com base no escore final, cada amostra foi categorizada como expressão
81
negativa (0), positiva fraca (1 ≤ 3) ou positiva forte (>3), segundo a metodologia utilizada por
trabalhos que fizeram análises semelhantes à do presente estudo (SANTOS et al., 2012).
Análise Estatística
Para os testes de associação, foram utilizados o teste Qui-quadrado em análise bivariada e,
quando necessário, o teste exato de Fisher, com margem de erro de 5% e com correção de
Bonferroni. A regressão logística multivariada por modelagem foi utilizada para ajustar os
valores do odds ratio (OR) e o intervalo de confiança (IC 95%). As variáveis previsoras que
obtiveram valor p inferior a 20% (p<0,20) foram inseridas pelo método backward no modelo
multivariado de Regressão logística, permanecendo, no modelo final, a cada etapa, as
variáveis significativas (p<0,05). Os cálculos matemáticos foram realizados com a utilização
do programa IBM SPSS STATISTICS® v. 20, 2011.
Aspectos éticos
O estudo possui aprovação nos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos sob os
pareceres 1.359.363 e 1.422.077.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
As proteínas SOD-1, Trx,OGG 1/2 e Ref-1 apresentaram padrão de expressão positivo tanto
para núcleo quanto para citoplasma em todas as amostras, sendo observada a diferença no
padrão de intensidade de expressão entre o citoplasma e o núcleo (Figura 1).
Figura 1: Imunomarcação de um spot, onde é possível observar a intensidade de marcação forte nos núcleos e
intensidade fraca de marcação no citoplasma da proteína Ref-1 (A). Imunomarcação citoplasmática de
intensidade fraca SOD-1 (B). Imunomarcação citoplasmática e nuclear de intensidade forte da proteína Trx (C).
Imunomarcação nuclear forte da proteína OGG1/2 em carcinoma epidermoide de cavidade oral (D).
Magnificações originais de 100x (A) e 400x (B, C e D).
82
A avaliação dos metais em relação à expressão nuclear forte de Ref-1, demonstrou que a
presença do elemento cromo aumenta em 13 vezes a expressão forte da proteína (OR= 13.
320; IC=1. 270-139.688). No entanto, a presença do elemento níquel, atua reduzindo em 20
vezes a expressão nuclear forte de Ref-1 (OR= 0.048; IC=0.004-0.533). A expressão
citoplasmática forte de Ref-1 atua aumentando em 16 vezes a expressão nuclear forte de Ref-
1 (OR= 16.053; IC=1.086-237.200). (Tabela 1).
Tabela 1: Análise multivariada da expressão da proteína Ref-1 em relação ao estilo de vida, caracterização
elementar e proteínas da via do estresse oxidativo e reparo celular em carcinoma epidermoide de cavidade oral
de pacientes tratados cirurgicamente.
Análise multivariada
Característica Ref-1 nuclear forte Ref-1citoplasmática forte
OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P
Elemento Cromo
Ausente 1
Presente 13.320 (1. 270-139.688) 0.031
Elemento Niquel
Ausente 1
Presente 0.048 (0.004-0.533) 0.014
Ref-1 citoplasmática
Fraca 1
Forte 16.053(1,086-237.200) 0.043
SOD-1 citoplasmática
Fraca 1
Forte 2.484(0.629-9.810) 0.194
Elemento Arsênio
Ausente 1
Presente 2.375(0.758-7.437) 0.138
Além de entender os possíveis mecanismos das interações proteína-proteína e associações
com hábitos de vida, nosso estudo destaca a caracterização elementar nos pacientes com
carcinoma epidermoide de cavidade oral. A caracterização possibilita detectar os elementos
químicos presentes no tumor e posteriormente elucidar possíveis mecanismos moleculares de
interações com a expressão das proteínas. O elemento cromo está associado ao histórico de
consumo de tabaco. Estudos demonstram que o cromo é responsável pela indução do estresse
oxidativo ou oxidação do DNA na presença de concentrações suprafisiológicas (O’BRIEN;
CERYAK; PATIERNO, 2003; ZHITKOVICH, 2005; SUN; BROCATO; COSTA, 2015).
Mediante a isso, é possível entender o aumento da expressão Ref-1, que atua evitando os danos
causados por EROs no cancer oral. O elemento níquel em nosso estudo foi responsável por
reduzir a expressão nuclear da proteína de Ref-1. A presença do níquel pode contribuir para a
carcinogênese por meio de alvos trasncricionais de resposta a hipóxia que promovem a
angiogênese, a reprogramação metabólica e o crescimento do tumor (SCANLON et al. 2017).
Scanlon e Glazer (2015), demonstram que a repressão das vias de reparo de DNA é um
mecanismo adicional pelo qual a hipoxia contribui para a tumorigênese.
83
Chan e colaboradores (2014), revelaram que a hipóxia em câncer colorretal, pode controlar a
expressão de genes de reparo do DNA através das mudanças específicas na eficiência da
tradução dos transcritos de mRNA, mais especificamente APE1 e OGG1. O mecanismo
proposto pelos autores pode explicar a interação do níquel na diminuição de Ref-1 em tumores
orais. As deficiências de reparo de DNA induzidas por hipóxia geram instabilidade genômica,
o que leva a um comportamento mais agressivo do câncer (CHAN et al., 2014).
CONCLUSÕES
O presente estudo reforça a associação do hábito tabagista, tradicionalmente conhecido por
sua relação com o câncer de cavidade oral, na expressão de proteína Ref-1, os achados quanto
à presença de elementos químicos abrem perspectivas para melhor entendimento da biologia
tumoral e sua associação com as proteínas do estudo.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo – FAPES, pelo apoio
financeiro (Edital:124/2014).
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85
Avaliação antimicrobiana in vitro de orabase contendo extrato
hidroalcóolico de cascas de romã
Thais Martins da Silva; Nubya Nascimento Costa; Thays de Carvalho Amorim Bolzan; Taiana Alencar; Juliana Aparecida Severi; Marcos Santos Zanini; Juliana Alves Resende; Janaina Cecilia Oliveira Villanova
Palavras-Chave: Extrato de Punica granatum, orabase, atividade antimicrobiana
INTRODUÇÃO
A doença periodontal é a patologia mais comum da cavidade oral de cães e, se inicia pelo
acúmulo de micro-organismos na superfície dos dentes, podendo progredir até os tecidos de
sustentação que formam o periodonto. Esta doença pode apresentar diversos graus de
inflamação e de infecção dos tecidos bucais, causando dor, sendo a halitose, o principal
sintoma clínico da doença. Eventualmente, pode haver perda do dente ou fratura da mandíbula
ou maxila, além do surgimento de efeitos sistêmicos, com comprometimento cardíaco,
hepático e urinário (GARCIA et al. 2008; GORREL, 2010; SANTOS, CARLOS,
ALBUQUERQUE, 2012). O tratamento da doença periondotal se baseia na eliminação da
placa bacteriana, consistindo em impedir a progressão da doença. Entre as principais medidas
preventivas da formação da placa, destacam-se a remoção física do biofilme associada à
higienização bucal dos animais empregando agentes de limpeza contendo antissépticos, tais
como colutórios e dentifrícios. Formulações contendo digluconato de clorexidina a 0,12%
estão disponíveis comercialmente e podem ser utilizadas na higienização bucal de cães.
Porém, seu uso é limitado, uma vez que o fármaco possui efeitos adversos indesejados como
alteração da coloração dos dentes e perda da sensibilidade e do sabor a longo prazo (FERRO,
CORREA, VENTURINI, 2008; GORREL, 2010; SANTOS, CARLOS, ALBUQUERQUE,
2012). Uma tendência que vem gerando grandes oportunidades em diversos setores de
negócios no país é a que envolve o uso de produtos oriundos de fontes naturais. Nos últimos
anos, tem sido observado, entre os médicos veterinários, um aumento no número de clientes
que solicitam aos prescritores, protocolos clínicos baseados em fitoterapia, por acreditarem
que estes são menos agressivos e com menos efeitos colaterais ou, porque também os
proprietários já fazem uso de fitoterápicos (CAPANEMA, 2007). Neste contexto, o objetivo
do presente projeto foi pesquisar a susceptibilidade antimicrobiana de micro-organismos
coletados da cavidade oral de cães, frente à orabases contendo três concentrações de extrato
hidroalcoólico das cascas de romã. O presente estudo foi realizado no Laboratório de
Produção Farmacêutica do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde (CCENS) e no
Laboratório de Microbiologia Veterinária e Zoonoses do Departamento de Medicina
Veterinária do Centro de Ciências Agrárias e Engenharias (CCAE) da Universidade Federal
do Espírito Santo, campus Alegre.
METODOLOGIA
Preparo das formulações
As formulações foram preparadas em pequena escala, no Laboratório de Produção
Farmacêutica do CCENS/UFES. Para o preparo da orabase, na fase 1, os conservantes foram
solubilizados em propilenoglicol e à esta solução, foi adicionada a água purificada. Em
86
seguida, a pectina foi incorporada e dispersa sob agitação mecânica (agitador mecânico
FISATOM, modelo 713D), sob aquecimento à 60º C. em banho-maria (ETHIK
TECHNOLOGY, modelo 208-1D). Após a total dispersão da pectina, foram adicionadas
incorporadas a celulose microcristalina (CMC) e a gelatina, mantendo a agitação e o
aquecimento até completa dispersão e isenção de grumos. A fase 2 foi preparada mediante
mistura dos polietilenoglicóis e o petrolato líquido em agitador mecânico, sob aquecimento
(60o C) em banho-maria. Em seguida, as fases 1 e 2 foram misturadas na proporção de 80:40,
sendo a fase 2 vertida sobre a 1 sob agitação mecânica a 600 rpm, até completa
homogeneização e resfriamento. O flavorizante sabor bacon foi incorporado na base pronta,
na proporção de 0,5% p/p. A incorporação do extrato bruto seco foi feita diretamente sobre a
base, empregando gral e pistilo, nas proporções de 12,5%, 25% e 37,5% p/p que que foram
nomeadas ORA1, ORA2 e ORA3, respectivamente. A orabase pura contendo conservante foi
denominada OPCC e, na ausência de conservante, OPSC. As preparações foram armazenadas
em potes opacos, sob refrigeração.
Avaliação susceptibilidade antimicrobiana pelo método de disco-difusão
Foram utilizados swab estéreis para a coleta da microbiota oral da cavidade oral de 12 cães
labradores retriviers, em triplicata. Os animais se apresentavam com peso médio de 28 kg,
com idade de um ano, com alimentação padronizada (todos animais recebem a mesma ração
e ao mesmo tempo). Os swabs coletados foram semeados nas placas de ágar Mueller-Hinton,
com intervalo inferior a uma hora entre coleta e semeadura. Os ensaios envolvendo a coleta
da microbiota bucal dos animais foram realizados mediante aprovação prévia pelo Comitê de
Ética em Pesquisas Animais da UFES (número de registro: 046/2015). Para avaliação
preliminiar in vitro da suscepitibilidade dos micro-organismos frente à orabase, foi utilizado
o método de disco-difusão adaptado de Kirby e Bauer (1966) empregando meio ágar Mueller-
Hinton. Nas placas semeadas com a microbiota coletada foram feitos 5 poços em cada placa,
com diâmetro interno de 6 mm, empregando ponteiras para micropipetas de 1 mL previamente
esterilizadas. Os poços foram então preenchidos com cada amostra das formulações (ORA1,
ORA2, ORA3) e com os controles (orabase pura - ORA e, orabase pura sem conservante).
Discos contendo clorexidina a 0,12% como padrão foram colocados em todos as placas. Em
seguida, as placas foram incubadas em estufa a 37° C por 12 horas. A orabase pura com
conservante e sem conservante foram utilizadas como controles negativos. As zonas de
inibição do crescimento em torno de cada amostra foram medidas e representam a média e o
desvio padrão encontrados para 3 réplicas. A zona inibitória foi considerada a menor distância
(mm) da margem externa do poço para o ponto inicial do crescimento microbiano. A Figura
1 mostra uma imagem representativa do teste.
Figura 1. Imagem representativa do ensaio de disco-difusão. Legenda: Representação do método de difusão em
poço: placa de Petri semeada com microbiota oral de cães labradores e poços preenchidos com as formulações
(A e B) ORA (orabase pura com conservante e sem conservante, respectivamente); (C) ORA1; (D) ORA2; (E)
ORA3; e, (F) controle positivo (clorexidina 0,12%). Fonte: O Autor.
87
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Foram preparadas formulações de orabases com aspecto agradável, de coloração amarelo clara, homogênea, sem efeito marmorizante, com aspecto liso, brilhante e isentas de grumos.
Após a adição do extrato, a coloração mudou para marrom acastanhada, característica do extrato. O aumento da concentração do extrato reduziu a consistência da orabase. Na Tabela 1 são dados os valores obtidos para os halos de inibição, medidos em milímetros.
Tabela 1. Valores dos halos de inibição (mm) obtidos no teste de disco-difusão. Fonte: O autor.
OPCC OPSC ORA1 ORA2 ORA3 C+
Halo de inibição Média (mm)
0,0 0,0 29,8 31,9 32,6 10,0
Desvio padrão (±0,0) (±0,0) (±3,4) (±3,9) (±4,9) (±0,0) OPCC = Pasta pura com conservante; OPSC = Pasta pura sem conservante; C+ = controle positivo: solução de
clorexidina a 0,12%.
Como pode ser visto na Tabela 1, o crescimento microbiano e a sensibilidade antimicrobiana
foram comprovados pela presença de halo de inibição para o controle positivo utilizado. Por
outro lado, observa-se que os componentes da orabase não influenciaramnos resultados, uma
vez que a proliferação não foi inibida pela orabse pura,com e sem conservante. Pela avaliação
dos resultados é possível inferior que a microbiota dos cães estudados apresentou
sensibilidade frente à presença do extrato nas formulações, para todas as concentrações
estudadas. Ainda, o aumento da concentração do extrato na orabase levou a um pequeno
aumento nos halos de inibição. A presença de atividade observada para a clorexidina,
corrobora com a afirmação da existência da atividade antisséptica das formulações contendo
o extrato de romã. Tais achados estão em conformidade com a literatura. Pereira e
colaboradores (2005), prepararam dentifrícios contendo extrato hidroalcoolico de cascas de
romã e testaram a sensibilidade in vitro sobre microrganismos formadores de biofilme dental
em humanos, que foi ativo sobre cepas de Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. Para todas as linhagens
testadas houve inibição do crescimento. Outro estudo realizado por Anesini e Perez (1993),
afirmaram que a Punica granatum possui ação antimicrobiana específica sobre bactérias
presentes no biofilme supragengival, produzindo uma interferência na síntese de poliglicanos,
agindo, então, no mecanismo de aderência das bactérias sobre as superfícies dos dentes. Entre
os microorganimos formadores de biofilme dental em cães estão o Streptococcus mutans, S.
mitis e S. sanguis, no quale em um estudo realizado por Pereira (1998), demonstro que essas
cepas têm grande sensibilidade ao extrato da romã (Punica granatum) no que se refere ao
crescimento e à capacidade de aderência sobre a superfície dental. Pesquisas demonstram que
extratos de romã podem ser utilizados como uma forma natural de tratar diversas infecções
bacterianas e virais devido ao seu efeito antimicrobiano (FERRAZZANO et al., 2017).
Estudos indicam que a atividade antimicrobiana se deve à presença de taninos, uma vez que
estes possuem a capacidade de se complexar com proteínas e inativar enzimas dos micro-
organismos (MACHADO et al., 2003; MOORTHY et al., 2013).
CONCLUSÕES
Verificou-se, através da realização de ensaios de disco-difusão modificados, a existência de
sensibilidade dos micro-organismos coletados da mucosa oral de cães frente a formulações
de orabases contendo diferentes concentrações do extrato hidroalcóolica das cascas de romã
88
e que o aumento da concentração do extrato provocou aumento da atividade. Tais resultados
sugerem que a orabase contendo extrato de romã pode ser promissora na redução do biofilme
dentário, quando empregadas na higienização bucal de cães.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à UFES, FAPES, CNPq pela concessão de bolsas e, à CAPES
(modalidade de financiamento – 001).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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antimicrobial activity. Jornal Ethnopharmacol. N.39: p.119-128, 1993.
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de Estimação. Revista Científica de Medicina Veterinária; v.10, n.32, p.1-637, 2012.
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Avaliação da atividade herbicida de novos triazóis derivados de isatina
Karolinni B. Britto; Elias T. Werner; Heberth de Paula; Warley de S. Borges; Pedro A. B.
Morais
Palavras-chaves: Isatina; 1,2,3-Triazóis; Click chemistry; CuAAC: Atividade Herbicida
INTRODUÇÃO
A isatina (1H-indol-2,3-diona) é um composto que possui em sua estrutura um núcleo
indólico, um anel aromático, carbonilas cetônica e amídica com reatividade distintas e um
grupamento N-H que pode sofrer reações de N-alquilação ou N-acilação1. Essas
características fazem com que esse composto seja muito utilizado em síntese orgânica2, uma
vez que permite a formação de novos compostos heterocíclicos com diferentes atividades3. É
um alcaloide encontrado em plantas4, fungos3, animais5 e humanos6. Estudos têm
demonstrado que a isatina, assim como seus derivados, possuem um amplo espectro de
atividade, entre elas, a atividade herbicida7,8. O anel triazólico também apresenta grande
relevância para a química medicinal, pois não se limita a atuar apenas como grupo
farmacofórico, tem atuação também como ponte entre biomoléculas de interesse para
formação de híbridos e funciona, ainda, melhorando as propriedades farmacológicas e
farmacocinéticas dos fármacos9,10. Os 1,2,3-triazóis e seus derivados são descritos na
literatura com uma série de propriedades biológicas, entre elas, a atividade herbicida9,11.
Considerando a importância da isatina e dos triazóis, conhecidamente na literatura por
diversas atividades, o trabalho foi direcionado para a síntese de híbridos de isatina pela
preparação de novos derivados triazólicos substituídos em N-1 da isatina via estratégia de
click chemistry por reação de cicloadição azido-alcino catalisada por Cu(I) (CuAAC),
preparação de derivados de isatina por N-alquilação, bem como avaliação in vivo, pelo teste
de germinação e desenvolvimento inicial frente a cultura de sementes de plantas modelo.
METODOLOGIA
Síntese de derivados N-alquilados de isatina (2-7)
90
Esquema 1. Síntese dos derivados N-alquilados 2-7 da isatina via SN2.
Em um balão de 50 mL sob agitação, a uma solução de isatina (0,05 g, 0,35 mmol) em DMF
(4 mL), na presença de carbonato de potássio (K2CO3) (0,05 g, 0,35 mmol), após 20 minutos
a 0ºC, foi adicionado o brometo correspondente (0,51 mmol) e a reação mantida sob agitação
constante e à temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi acompanhada por cromatografia
de camada delgada (CCD) e, após o consumo de todo material de partida, a fase orgânica foi
co-evaporada com tolueno em evaporador rotatório. Por fim, uma coluna cromatográfica foi
realizada em sílica comum (63-200 μm) utilizando como fase móvel uma mistura de
hexano/acetato para purificação dos produtos (Esquema 1).
Síntese de derivados triazólicos de isatina (8-20)
Esquema 2. Síntese dos derivados triazólicos da isatina 8-20 via cicloadição azido-alcino catalisada por Cu(I),
(CuAAC).
Em um tubo para micro-ondas, contendo N-Alquinil isatina (7) (0,1 g; 0,5 mmoL) em 1 mL
de DMF, adicionou-se o azido funcionalizado correspondente (2,1 mmoL), ascorbato de sódio
(10 mg; 0,05 mmoL) e 150 µL de uma solução de CuSO4 0,1 M (2,4 mg; 0,015 mmoL). O
tubo foi selado e a mistura reacional foi irradiada por micro-ondas a 70°C durante 10-15
minutos e a 150W. Posteriormente, a mistura reacional foi concentrada utilizando tolueno
com o auxílio de um evaporador rotatório. A purificação do produto foi feita em coluna
cromatográfica contendo sílica comum (63-200 μm) com fase móvel hexano/acetato
(Esquema 2). As análises de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN de 1H) e
Carbono (RMN de 13C), Espectroscopia Heteronuclear de Correlação Simples (HSQC),
Espectroscopia Heteronuclear de Correlação Múltipla (HMBC), Espectroscopia de
Correlação (COSY), Infravermelho (IV) e Espectrometria de Massas de Alta Resolução
(HRESIMS), confirmaram a obtenção de todos os compostos.
Atividade herbicida
Em sementes de alface (Lactuca sativa) e cebola (Allium cepa) obtidas comercialmente, foram
testados 16 compostos derivados de isatina, todos diluídos em soluções a 0,1% DMSO na
91
concentração de 100 mg.L-1. Além dos compostos de isatina foi inserido um controle negativo
(água destilada) e controle positivo (Trifluralina 100 mg.L-1). As variáveis avaliadas após sete
dias de inoculação das sementes foram: porcentagem de germinação (%G), índice de
velocidade de germinação (IVG), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz
(CR) e massa fresca (MF). O experimento foi conduzido com delineamento inteiramente
casualizado (DIC), com três repetições por tratamento, sendo constituída de uma placa de
petri com 25 sementes (%G e IVG) ou 25 plântulas (CPA, CR e MF). Os resultados foram
inicialmente verificados quanto à normalidade dos desvios e homogeneidade das variâncias,
após submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Dunnet (p ≤
0,05), tomando como tratamento referência o controle positivo, utilizando-se software
Assistat versão 7.712. Para análise de variância, os dados em porcentagem de germinação foram transformados em arco-seno √(x/100) e os dados do IVG em √(x+0,5).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Síntese de derivados N-alquilados de isatina
Os compostos 1-((9,10-dioxo-9,10-diidroantracen-2-il)metil)indolina-2,3-diona (2), 2-((3-
hidroxi-2-oxo-3-(2-oxopropil)indolin-1-il)metil)isoindolina-1,3-diona (3), 1-(4-
nitrobenzil)indolina-2,3-diona (4), 1-(4-fluorobenzil)indolina-2,3-diona (5), 1-(2-
((fenilsulfonil)metil)benzil)indolina-2,3-diona (6) e 1-(prop-2-in-1-il)indolina-2,3-diona (7),
foram obtidos por estratégia de N-alquilação, via Substituição Nucleofílica Bimolecular
(SN2), com os respectivos rendimentos: 70,29 %, 10,40 %, 29,35 %, 55,13 %, rendimento
quantitativo e rendimento quantitativo. Esta reação é classificada como SN2, pois ao ter o
ataque do nucleófilo (N-) da molécula de isatina sobre o carbono eletrofílico presente na
estrutura do brometo de arila, promove a quebra da ligação entre o carbono e grupo
abandonador (Br-). É um processo de segunda ordem, no qual a velocidade é proporcional à
concentração de ambos reagentes e, além disso, o ataque do nucleófilo ocorre pelo lado
oposto13. Os dados de RMN de todos os compostos obtidos relacionados a porção da isatina
foram praticamente os mesmos. Observou-se quatro sinais relacionados aos hidrogênios
aromáticos (H-4, H-5, H-6 e H-7) no espectro de RMN de 1H para todos os compostos, sendo
que para o H-4 os sinais apareceram na região de deslocamento químico (δ) 7,60-7,66 ppm,
para o H-5 em região δ 7,10-7,16 ppm, para o H-6 em δ 7,50-7,56 ppm e para o H-7 em δ
6,71-6,80 ppm. Além disso, os hidrogênios metilênicos (H-CH21’) aparecerem em região de
δ 4,90-5,10 ppm. Os espectros de RMN de 13C para todos os compostos mostram dois sinais
a aproximadamente δ 158 e 182 ppm relacionados aos carbonos das funções cetona e amida
da isatina. E o grupo metilênico (C-1’) foi observado na região de δ 41,1-43,4 ppm. Quanto
aos dados de análise no IV, similarmente, em todos os espectros, em aproximadamente 3100
cm-1 observa-se a banda de deformação axial de C-H de aromáticos; entre 2960 e 2850 cm-1
bandas de deformação axial de C-H de alifáticos, no caso o CH2; na região de 1700 cm-1
bandas referentes às carbonilas de cetona e amida; entre 1600-1585 cm-1 e 1500-1400 cm-1
bandas da deformação axial de C═C de anel aromático; entre 1300-1000 cm-1 bandas de
deformação angular no plano de C-H de aromáticos e entre 900-675 cm-1 bandas de
deformação angular fora do plano de C-H de aromáticos. Os compostos 4 e 5 são conhecidos
e as estruturas foram confirmados comparando os dados obtidos com os resultados relatados
na literatura. Além disso, o composto 7, também conhecido, foi preparado como material de
92
partida para produzir os derivados de triazólicos de isatina. É importante destacar que os
derivados N-alquilados de isatina 2, 3 e 6 são inéditos na literatura.
Síntese de derivados triazólicos de isatina
A cicloadição azido-alcino catalisada por Cu(I) realizada em micro-ondas, forneceu os seguintes compostos triazólicos com seus rendimentos: 1-((1-(4-(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (8) 70,38 %; 1-((1-(2-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (9) 17,66 %; 1-((1-(4-bromofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (10) 24,12 %; 1-((1-(2-((fenilsulfonil)metil)benzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (11) 19,46 %, 4-((4-((2,3-dioxoindolina-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil) ácido benzoico (12) 51,44 %; 1-((1-(3-(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (13) 84,20 %; 1-((1-(2-(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (14) 87,20 %; 1-((1-(2-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (15) 48,66 %; 1-((1-(3-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (16) 18,55 %; 1-((1-(3-bromofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (17) 40,88 %; 1-((1-(2-nitrobenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (18) rendimento quantitativo; 1-((1-(3-nitrobenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (19) rendimento quantitativo; 1-((1-(2-bromofenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (20) 20,10 %. A cicloadição 1,3-dipolar é uma reação que envolve um dipolarófilo, neste caso, o alcino terminal, com um composto 1,3-dipolar, grupo azido, que resulta num heterociclo de 5-membros. O mecanismo desta reação envolve a participação de 2 elétrons π do grupo alcino e 4 elétrons do azido em um periciclo concertado. Sendo assim, esta reação de adição é dita uma cicloadição [2s+4s], quando se relaciona com o número de elétrons envolvidos, ou [2+3], quando o número de átomos participantes. O mecanismo desta reação envolve a coordenação do Cu(I) ao alcino, com posterior ligação do grupo azido ao cobre, formando um metalociclo de seis membros. A contração do anel a um derivado Cu-triazolila é seguida por uma protonólise que libera o produto triazol completando o ciclo catalítico14. Além dos quatro sinais similares descritos para a porção da isatina em todos os compostos nos espectros de RMN de 1H, os derivados triazólicos apresentaram um singleto de hidrogênio na faixa δ 8,00-8,98 ppm correlacionado com o hidrogênio do anel triazol. Sinais relacionados ao grupo metileno ligado ao anel pirrol-2,3-diona foi observado na faixa de δ 4,94-5,12 ppm. O espectro de RMN de 13C desses compostos mostraram sinais na faixa de δ 121,9-126,8 ppm e 141,3-143,5 ppm relacionados aos carbonos do anel triazol. É importante destacar que os derivados triazólicos de isatina 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18 e 20, são inéditos na literatura. Entretanto, apesar dos compostos 10, 15 e 19 terem sido descritos na literatura, foram sintetizados por métodos diferentes do descrito no presente trabalho e testados para outras atividades.
Atividade herbicida
Alface (Lactuca sativa)
A atividade dos compostos derivados de isatina, em relação à germinação de sementes de L.
sativa, não apresentou diferença significativa quando comparados com o controle positivo
(Tabela 1) nas variáveis %G, IVG e MF.
93
Tabela 1. Médias da porcentagem de germinação (%G), índice de velocidade de germinação (IVG), comprimento de parte aérea (CPA), comprimento de raiz (CR) e massa fresca total (MF) das sementes de L.
sativa tratadas com os derivados de isatina sintetizados 4-6, 8-20.
Composto %G IVG CPA (mm) CR (mm) MF (g) Controle negativo 90.66 a 4.7202 a 5.3168 a 25.5392 a 0.0183 a Controle positivo 84.00 a 4.4607 a 6.1220 a 3.9396 b 0.0146 a
4 94.66 a 4.7202 a 4.9628 a 31.7908 a 0.0176 a 5 93.33 a 4.7665 a 4.2220 b 41.0820 a 0.0150 a 6 92.00 a 4.6469 a 4.5444 a 33.6096 a 0.0176 a 8 86.66 a 4.5300 a 4.5924 a 39.2216 a 0.0170 a 9 90.66 a 4.5049 a 6.4572 a 28.9468 a 0.0156 a
10 90.66 a 4.6004 a 6.2440 a 29.9480 a 0.0186 a 11 93.33 a 4.6515 a 3.4256 b 30.7368 a 0.0180 a 12 93.33 a 4.7835 a 4.5980 a 30.4012 a 0.0180 a 13 92.00 a 4.5354 a 3.7336 b 28.6800 a 0.0193 a 14 88.00 a 4.5769 a 4.5936 a 8.8552 b 0.0133 a 15 86.66 a 4.4049 a 4.7472 a 32.5100 a 0.0170 a 16 88.00 a 4.5763 a 8.5148 b 26.8124 a 0.0160 a 17 84.00 a 4.1806 a 4.9140 a 26.8152 a 0.0180 a 18 92.00 a 4.5697 a 5.0284 a 28.0108 a 0.0196 a 19 90.66 a 4.6866 a 8.1324 b 26.0020 a 0.0180 a
20 92.00 a 4.5719 a 4.4148 a 22.3100 a 0.0170 a
*Médias seguidas pela mesma letra não diferem do tratamento referência (controle positivo) pelo teste de
Dunnet, em nível de 5% de probabilidade.
Na avaliação do comprimento da parte aérea (CPA), considerando o composto 1-((1-(2-((fenilsulfonil)metil)benzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona, 11, um dos mais
ativos apresentando 35,57% (3.42 mm) de inibição, uma possível relação estrutura-atividade
que justifique tal ação deste derivado, permite afirmar que o grupo sulfonil presente na sua estrutura, e conhecidamente nos herbicidas da classe das sulfonilureias, mostrou-se de grande
interesse na direção de um maior potencial herbicida dentre os compostos ensaiados. As sulfonilureias tem como mecanismo de ação a inibição irreversível da enzima acetolactato
sintase (ALS), impedindo assim a síntese de aminoácidos ramificados (valina, leucina e isoleucina) que são componentes essenciais em proteínas e necessários para produção de
novas células15. Desta forma, pode-se extrapolar um possível mecanismo de ação para o composto 11 em consequência do melhor resultado obtido frente ao crescimento da parte de
aérea de L. sativa relacionado a presença do grupo sulfonil em sua estrutura. Adicionalmente,
esse composto 11 foi mais ativo como inibidor do comprimento da parte aérea do que o composto 1-(2-((fenilsulfonil)metil)benzil)indolina-2,3-diona (6) (14,52 % de inibição do
CPA), podendo a maior atividade para 11 estar relacionada a presença do anel triazólico, o qual se trata da única diferença estrutural entre ambos. Na literatura é amplamente descrito a
importância da presença do anel triazólico frente a potencial atividade herbicida de compostos orgânicos, atuando na inibição de enzimas essenciais para o desenvolvimento da planta16. Já
em relação à análise do comprimento da raiz, o composto 1-((1-(2-(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)indolina-2,3-diona (14) foi estatisticamente similar ao controle
positivo. Apresentando uma atividade de inibição do crescimento da raiz de 65,33% (8.85
mm), enquanto o controle positivo 84,61% (3.93 mm), comparados ao controle negativo. Uma possível explicação para este resultado obtido com a análise do comprimento da raiz é a
relação estrutura-atividade, em que, tanto a trifluralina, usada como controle positivo no
94
presente trabalho, quanto o composto 14, derivado de isatina mais ativo frente a inibição do
crescimento da raiz, possuem 3 átomos de flúor em sua estrutura, o que pode estar relacionado a tal atividade. De acordo com Jeschke17, foi observado um crescente interesse na pesquisa e
desenvolvimento de agroquímicos halogenados. Desta forma, este autor descreve em seu
trabalho que compostos contendo um ou mais átomos de flúor foram potencialmente eficazes como herbicidas, principalmente os que contem 3 átomos. Em virtude do pequeno tamanho
total da ligação C–F e um raio de van der Waals semelhante ao dos grupos C=O e C– O, o flúor pode mimetizar tanto exigências estéricas de moléculas bioativas quanto influenciar no
reconhecimento da enzima pelo substrato ou sítio receptor18. Em estudo realizado por Wang e colaboradores8, no teste de inibição do crescimento da raiz, 8 dos compostos derivados de
isatina avaliados apresentaram de 80 a 95% de inibição do crescimento a uma concentração também de 100 mg.L-1, valores melhores que os observados para o herbicida controle,
monossulforon, com 78,0%. Vale destacar que 75,0% desses compostos apresentavam
halogênios em sua estrutura, e o composto que se destacou com 93,0% de inibição possuía o grupo CF3, semelhante ao composto 14 do presente trabalho.
Cebola (Allium cepa)
Em relação à inibição da germinação (%G), IVG e MF, semelhantemente ao descrito para o
ensaio em L. sativa, os derivados de isatina testados, bem como o controle positivo, não
apresentaram diferenças significativas (Tabela 2).
Tabela 2. Médias da porcentagem de germinação (%G), índice de velocidade de germinação (IVG),
comprimento de parte aérea (CPA), comprimento de raiz (CR) e massa fresca total (MF) das sementes de A.
cepa tratadas com os derivados de isatina sintetizados 4-6, 8-20.
Composto %G IVG CPA (mm) CR (mm) MF (g) Controle negativo 85.33 a 3.0285 a 19.3444 a 13.2240 a 0.0190 a Controle positivo 85.33 a 2.8667 a 4.9468 b 5.5468 b 0.0153 a
4 89.33 a 2.9851 a 17.7328 a 11.8988 a 0.0183 a
5 76.00 a 2.7345 a 10.6536 a 6.6256 b 0.0156 a
6 89.33 a 3.0131 a 15.5376 a 12.5656 a 0.0186 a
8 92.00 a 3.0554 a 16.0000 a 11.4904 a 0.0190 a
9 92.00 a 2.9411 a 12.4696 a 9.1496 a 0.0156 a
10 84.00 a 2.8871 a 15.1964 a 10.2764 a 0.0170 a 11 84.00 a 2.8826 a 16.3244 a 11.4232 a 0.0190 a
12 81.33 a 2.8063 a 12.0688 a 9.2748 a 0.0143 a
13 89.33 a 3.0103 a 10.7940 a 6.7784 b 0.0160 a
14 93.33 a 3.0103 a 9.6108 a 9.7060 a 0.0186 a
15 93.33 a 2.9951 a 12.5184 a 9.6064 a 0.0223 a
16 94.66 a 3.0532 a 11.8476 a 9.3424 a 0.0170 a 17 81.33 a 2.7241 a 10.9620 a 6.1944 b 0.0153 a
18 86.66 a 2.8881 a 13.0192 a 8.0232 b 0.0163 a
19 88.00 a 3.0061 a 11.1152 a 6.9428 b 0.0153 a
20 80.00 a 2.8050 a 8.8780 a 6.4740 b 0.0140 a *Médias seguidas pela mesma letra não diferem do tratamento referência (controle positivo) pelo teste de
Dunnet, em nível de 5% de probabilidade.
Quanto a análise de inibição do comprimento da raiz, os compostos 5, 13, 17, 18, 19 e 20
foram estatisticamente similares ao controle positivo, porcentagem de inibição de 58,09%
(5.54 mm), sendo os valores de inibição desses derivados da isatina de 49,92% (6.62 mm),
95
48,78% (6.77 mm), 53,17% (6.19 mm), 39,33 % (8.02 mm), 47,50% (6.94 mm) e 51,05%
(6.47 mm), respectivamente. Conforme estudo citado anteriormente estes resultados obtidos
tem relação também com o fator importante, para moléculas promissoras frente a atividade
herbicida, a presença de um ou mais átomos de halogênio em sua estrutura. Tanto na inibição
do comprimento da parte aérea quanto da raiz, os derivados de isatina mais eficazes
apresentam átomos de F, 5 e 13, e Br, 17 e 20, em sua estrutura. Em trabalho realizado por
Shang e colaboradores7, 2 compostos derivados de isatina foram sintetizados e testados para
o crescimento da raiz de Brassica campestres, porém, apenas um dos compostos apresentou
inibição do crescimento de 25,9% na concentração de 100 mg.L-1, vale destacar que esse
composto não possuía halogênio e nem anel triazólico em sua estrutura.
CONCLUSÕES
O trabalho permitiu a síntese e elucidação estrutural de dezoito derivados de isatina, sendo 13
inéditos na literatura. Destaca-se que a reação de ciclo-adição 1,3-dipolar catalisada por Cu(I)
foi conveniente para gerar treze análogos com diversidade estrutural e regiosseletividade
contendo núcleo triazol 1,4-dissubstituído. Quanto ao ensaio de atividade dos derivados de
isatina na germinação e desenvolvimento inicial de alface e cebola, nota-se que existe um
efeito no desenvolvimento e crescimento inicial das plântulas, demostrado pelo comprimento
da parte aérea de alface e, do comprimento da raiz de cebola, avaliado principalmente pelos
derivados de isatina 11 e 17, respectivamente. Assim, alguns compostos avaliados exibiram
propriedades sugerindo sua potencial utilidade como herbicidas, entretanto, testes posteriores
e mais aprofundados são necessários para que essa ação seja de fato comprovada, além
também da otimização estrutural destes derivados na direção da descoberta de novos
inibidores mais potentes.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi apoiado pela UFES, CAPES e FAPES.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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97
Avaliação farmacoterapêutica em idosos diabéticos e hipertensos atendidos
em uma drogaria de Carangola – MG
Gabriela Kristyna Santos Nogueira; Lucas Amorim de Souza Furtado; Eduardo Frizzera
Meira; Fabiana Dayse Magalhães Siman Meira
Palavras-chave: Atenção Farmacêutica, Hipertensão, Diabetes Mellitus, Interação medicamentosa.
INTRODUÇÃO
Doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são um grande problema para a saúde pública
atual, e estão vinculadas a fatores variados, relacionados ao novo modo de vida globalizado e
industrializado, levando a alterações na alimentação, na locomoção, comunicação e sobretudo
na saúde física e mental da população. Exemplos dessas doenças são a hipertensão arterial e
a Diabetes Mellitus Tipo II, que têm grande incidência não só na fase adulta, mas em crianças
e adolescentes o que é um fator preocupante na garantia de uma melhor qualidade de vida da
população (LONGO; MARTELLI; ZIMMERMANN, 2011). Ambas as doenças são
problemas de saúde pública, e estão entre as principais causas de morte no Brasil. De acordo
com o Ministério da Saúde em 2016, as DCNT apresentaram 56% das causas de morte, de
forma direta ou indireta. E, como esperado, a população idosa acaba sofrendo ainda mais com
as consequências dessas doenças. Assim, um controle da pressão arterial, juntamente com o
controle glicêmico é uma prioridade para esses pacientes (BRASIL, 2016). As diferentes
patologias enfrentadas pelos idosos levam à administração de diversos medicamentos,
fazendo com que a suscetibilidade de interações medicamentosas seja muito incidente, em
consequência da polifarmácia, prática comum no Brasil. Assim, faz-se cada vez mais
importante a presença do profissional farmacêutico como aliado para garantia da eficácia do
tratamento, por meio de artifícios que melhoram a comunicação do paciente com o
profissional da saúde, e auxiliam na garantia da prática da atenção farmacêutica podendo
acompanhar de forma documentada e sistematizada seu tratamento, por meio do seguimento
farmacoterapêutico (CAPUCHO,2016). O seguimento farmacoterapêutico mais empregado é
o Dáder, um modelo espanhol que estabelece os Problemas Relacionados a Medicamentos
(PRM) como qualquer evento negativo que envolva a farmacoterapia e que atrapalhe os
resultados clínicos do paciente. Este método se baseia na obtenção dos problemas de saúde
apresentados pelo paciente e nos medicamentos utilizados, além da avaliação de seu estado
de situação em uma data determinada a fim de identificar e resolver os possíveis PRMs
apresentados pelo paciente. Os PRMs são problemas de saúde, entendidos como resultados
clínicos negativos, derivados do tratamento farmacológico que, produzidos por diversas
causas tem como consequência, o não alcance do objetivo terapêutico desejado ou o
aparecimento de efeitos indesejáveis. Estes PRMs podem ser de três tipos: relacionados com
a necessidade de medicamentos por parte do paciente,com sua efetividade ou segurança. Após
esta identificação, intervenções farmacêuticas necessárias são realizadas para resolver os
PRMs e posteriormente os resultados obtidos são avaliados. Assim, esses pacientes são
assistidos de perto, com orientação, identificação e avaliação da farmacoterapia, diminuindo
a morbimortalidade relacionada aos medicamentos e prevenindo as doenças (MACHUCA;
LLIMÓS; FAUS, 2004). Dessa forma, o serviço farmacêutico a partir da atividade clínica,
98
pode guiar o paciente para uma farmacoterapia acertada. Isso é muito importante,
especialmente com os idosos, devido às doenças crônico degenerativas. Diante disso, o
presente trabalho teve como objetivo realizar a avaliação farmacoterapêutica, em pacientes
hipertensos e diabéticos, atendidos em uma drogaria na cidade de Carangola, MG.
METODOLOGIA
Trata-se de um estudo descritivo, exploratório com abordagem quantitativa por meio de
questionário, baseado na metodologia Dáder. Foi realizado em uma drogaria na cidade de
Carangola, interior de Minas Gerais, na Zona da Mata mineira. Todos os encontros foram
realizados nesta drogaria, com o consentimento do farmacêutico e proprietário. Foram
entrevistados 9 pacientes idosos acima de 60 anos, sem distinção de sexo que concordaram
em participar da pesquisa e assinaram o termo de compromisso e consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE). Na coleta de dados foi aplicado um questionário face-a-face aos
pacientes, no qual se abordou basicamente as variáveis: dados pessoais; problemas de saúde,
medicamentos utilizados, medidas antropométricas, dados laboratoriais e hábitos de vida. Na
realização da anamnese foi verificada a pressão arterial, índice glicêmico, peso corporal e
altura, assim como o cálculo do IMC e classificação. Além disso, foi avaliada a percepção do
doente acerca de seu problema de saúde, com base no questionário aplicado. Já na avaliação
dos riscos de interações medicamentosas potenciais foram utilizados dados da literatura
científica como os livros “Interações Medicamentosas” e “Farmacologia Básica e Clínica”.
De acordo com essa base de dados, as interações foram classificadas de acordo com o índice
de risco (A, B, C, D ou X) (FONSECA, 2008; KATZUNG,2014). A análise estatística foi
descritiva, visando caracterizar o perfil farmacoterapêutico dos idosos avaliados. As variáveis
são apresentadas como média ± desvio padrão. As variáveis categóricas são apresentadas
como proporções (%) e quantidades. Para análises estatísticas, elaboração de banco de dados
e tabelas, foi utilizado o programa Microsoft Excel.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
No estudo exposto foram entrevistados 9 idosos clientes da drogaria, com média de idade de
76,3 anos. A tabela 1 descreve o perfil dos pacientes em relação às suas características de
acordo com sexo, idade, IMC e medicamentos utilizados por cada um.
Tabela 1. Características gerais dos idosos e seus medicamentos. Carangola/MG 2018.
Paciente Sexo IMC Idade Medicamentos Utilizados Total
Paciente 1 F 28,73 72 anos HTZ, Losartana, Levotiroxina, Clobetazol,
Alprazolam, Aciclovir, Sinvastatina, Celecoxibe 8
Paciente 2 M 24,60 90 anos Metoprolol, Losartana, AAS, Cilostazol, Gingko
Biloba. 5
Paciente 3 F 33,79 76 anos Insulina NPH, Metformina, Furosemida, HTZ,
Losartana, Nimesulida, AAS, Sinvastatina. 9
Paciente 4 F 27,81 73 anos
Dipirona, Omeprazol, Sertralina, Levotiroxina,
Bromazepam, Losartana, Indapamida, Cloreto
de Potássio, diosmina/hesperidina, Betaistina,
Glicolato de Mg/Piridoxina
11
99
Paciente 5 F 36,33 69 anos
Omeprazol, Sinvastatina, AAS, Glibenclamida,
Enalapril, Metformina/Sitagliptina,
diosmina/hesperidina, paracetamol/codeína
8
Paciente 6 F 22,89 78 anos Losartana, Dipirona, Furosemida, Bromoprida,
Meloxicam, Loratadina. 6
Paciente 7 F 29,5 78 anos
Clonazepam, Metformina, Sinvastatina,
Propatilnitrato, Losartana, Glibenclamida,
Omeprazol, AAS, Hidroclorotiazida, Anlodipino.
10
Paciente 8 M 26,85 71 anos Memantina, divalproato de sódio,
Carbamazepina, Clonazepam, Metformina. 5
Paciente 9 M 31,25 80 anos Metformina, AAS, Glibenclamida,
Hidroclorotiazida, Losartana. 5
Dentre os idosos avaliados, o sexo feminino predominou com 77%. 55% dos entrevistados
praticam atividade física e 33% consomem álcool, sendo que nenhum é fumante. Em relação
aos medicamentos utilizados, foram encontrados um total de 67 medicamentos. Destes, 16%
são anti-hipertensivos, 10,5% diuréticos, 15 % hipoglicemiantes orais, 6% antiulcerosos, 6%
antilipêmicos, 10,5% anti-inflamatórios não esteroides e 7,5% antiplaquetários. Quanto ao
quadro clínico, observam-se além de Diabetes Mellitus e Hipertensão Arterial Sistêmica,
outros distúrbios como hipotireoidismo, depressão, ansiedade, dores estomacais e dores
articulares. Dentre as informações sobre o tratamento, não houveram pontos negativos
relacionados sobre esquecer de administrar os medicamentos, mas a maioria relatou
problemas como o modo de administrar. Com relação aos medicamentos, dados de Silva et al
mostram idosos polimedicados com 1.737 medicamentos, sendo 743 (42,8%) pertencentes
aos cardiovasculares, 23,7% trato alimentar e 18,2% sistema nervoso. Já Reinhardt et al, vai
além no estudo, mostrando uma predominância das classes dos IECA (71%), tiazídicos
(41,9%) e diuréticos de alça (25%). Ainda indica que 61,3% dos idosos fazem o tratamento
farmacológico em associação com dois ou mais fármacos anti-hipertensivos e 38,7% fazem o
tratamento isolado. Esses dados corroboram os resultados do presente estudo, que também
observou um predomínio de anti-hipertensivos, diuréticos e hipoglicemiantes. Quando foi
avaliada as possíveis interações medicamentosas, foram identificados 11 tipos de interações
potenciais, como pode-se observar na tabela 2. Mesmo com todas as interações identificadas,
apenas duas apresentaram um risco maior a saúde dos pacientes.
Tabela 2. Interações Medicamentosas observadas nos idosos. Carangola/MG, 2018
Interação Evento Índice de
Risco
Frequência
nos idosos
Interação
N %
Ácido acetilsalicílico
+ Hidroclorotiazida
Redução do efeito
Diurético
C 1
Ácido acetilsalicílico
+ Cilostazol
Risco de sangramento C 1
Ácido acetilsalicílico
+ Ginkgo Biloba
Risco de sangramento D 1
100
Sais de Potássio +
Losartana
Risco de Hipercalemia C 1
Omeprazol +
Sertralina
Aumento dos efeitos
da sertralina
D 1
Clonazepam +
Carbamazepina
Diminuição da meia
Vida
C 1
Ácido acetilsalicílico
+ Enalapril
Diminuição do efeito
anti-hipertensivo
C 1
Ácido acetilsalicílico
+ Sulfoniluréias
Aumento dos efeitos
Hipoglicemiantes
C 1
Tiazídicos + IECA Risco de efeitos
Hipotensores
C 1
Omeprazol +
Clonazepam
Aumento da
concentração de
clonazepam
C 1
Furosemida + AINE Antagonismo do efeito
Diurético
C 1
TOTAL 11 100% A= Nenhuma Interação Conhecida; B= Nenhuma ação Necessária; C=Monitorizar a Terapia; D=Considerar a Modificação da Terapia.
Como observado na Tabela 2, apenas duas interações apresentaram risco D (Ácido
acetilsalicílico/Ginkgo Biloba) e (Omeprazol/Sertralina), indicando considerar a modificação
da terapia. Esse tipo de interação é classificada como interação farmacocinética, onde um dos
fármacos é capaz de modificar a absorção, distribuição, biotransformação e eliminação do
outro, causando um prejuízo no resultado esperado (SANTOS; ALMEIDA,2010). Na
primeira interação o Ginkgo Biloba administrado simultaneamente com o AAS, provoca
aumento do efeito do mesmo, com risco severo de sangramento. Já o omeprazol administrado
com a sertralina pode acarretar em aumento dos efeitos adversos como tontura, náuseas,
tremores e insônia. As outras interações encontradas também são farmacocinéticas, porém, de
risco C,indicando a monitorização da terapia, como furosemida e AINE, omeprazol e
clonazepam, AAS com sulfoniluréias, enalapril, cilostazol, hidroclorotiazida, além de,
tiazídicos e IECA, clonazepam e carbamazepina, sais de potássio e losartana. Quando se
avaliou os Problemas relacionados aos medicamentos, foram detectados 2 RNM (Tabela 3).
O RNM detectado está relacionado à seguridade, ou seja, devido às interações
medicamentosas, os medicamentos tornam-se inseguros, prejudicando a adesão e qualidade
de vida do paciente.
Tabela 3. Problemas relacionados aos medicamentos identificados nos idosos. Carangola/MG, 2018.
Tipo de RNM N % Tipo de RNM N % Tipo de RNM N %
Necessidade Efetividade Segurança
Problema de
saúde não
Tratado
- -
Inefetividade
não
quantitativa
- - Inseguridade não
quantitativa 2 100
Efeito de
medicamento
não
necessário
- - Inefetividade
Quantitativa - - Inseguridade quantitativa 2 100
Total 100
101
Contudo, além da polimedicação, outros fatores podem influenciar a qualidade de vida desses
doentes, fatores que também foram coletados na entrevista. Dentre esses, o fator que se
mostrou mais influente, foi o IMC. Dos 9 idosos avaliados, 6 foram identificados como
obesos, ou seja, com IMC ≥ 27 e 4 idosos se encontraram com IMC adequado. Já foi
relacionado dados de IMC com o diabetes e hipertensão por Pereira et al e Maccarone, Lima
e Ferreira, respectivamente, onde correlacionaram por meio de um estudo transversal, a
obesidade com o número de pacientes diabéticos e hipertensos. Dessa forma, o trabalho
proposto, também identificou o excesso de peso como fator de risco entre as doenças Diabetes
Mellitus e Hipertensão, além de identificar uma maior prevalência dos idosos com IMC ≥ 27.
Como podemos observar, essa polimedicação leva a interações medicamentosas que geram
os problemas relacionados a medicamentos (PRM), classificados pelo método Dáder. De
acordo com essa metodologia, o presente trabalho encontrou dois PRM, classificados como
inseguridade não quantitativa, onde o doente sofre ou poderá sofrer um problema de saúde
associado a uma inseguridade não quantitativa e quantitativa de um medicamento. E, desta
forma o profissional farmacêutico pode atuar melhorando e corrigindo a farmacoterapia
proposta, garantindo a eficácia do tratamento e qualidade de vida dos pacientes.
CONCLUSÕES
O trabalho possibilitou avaliar o perfil farmacoterapêutico dos idosos diabéticos e/ou
hipertensos atendidos em uma drogaria em Carangola-MG. Devido à polifarmácia
apresentada pelos pacientes, foram encontrados dois PRM relacionados às interações
medicamentosas, avaliados como modificação da terapia (risco D). Apesar de poucos PRM,
um número grande de interações foi encontrado o que demonstra a importância que o
profissional deve dispor no cuidado com a farmacoterapia, levando informação e preservando
a segurança, saúde e bem-estar do idoso.
AGRADECIMENTOS
Ao proprietário e pacientes da Drogaria, pela valiosa colaboração para a realização deste
estudo.
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Caracterização preliminar e atividade antimicrobiana de filmes poliméricos
contendo extrato de romã
Nubya N. Costa; Geanne A. de Paula; Alice C. M. Cassa; Sanderson V. Batista; Nicolly S.
Ferreira; Kamila A. Bastos; Alessandro O. G. Junior; Elder O. Caetano; Juliana A. Resende;
Juliana A. Severi; Janaina C. O. Villanova
Palavras Chave: Punica granatum, coberturas bioativas, análise microbiológica.
INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de produtos que otimizem a eficácia de tratamento de feridas,
principalmente crônicas, que não causem toxicidade, alergia ou aderência, e que contribua
tanto para cicatrização quanto para o conforto do paciente, é alvo de grande interesse para as
áreas farmacêuticas, médica e de materiais, uma vez que as feridas crônicas são consideradas
um problema de saúde pública. A utilização de coberturas bioativas traz inúmeras vantagens
para o manejo das lesões, pois, além de atuarem como barreira, protegendo-as, se comportam
como reservatório de fármacos e auxiliam na regeneração tecidual (SHARMA, DUA &
MALIK, 2014; BOATENG & CATANZANO, 2015). Uma estratégia que vem ganhando
destaque na atualidade, é o preparo de coberturas bioativas contendo compostos bioativos,
obtidos de plantas medicinais, em substituição aos fármacos sintéticos (LIAKOS, et al. 2015).
Entre as plantas medicinais para as quais há relatos de atividade cicatrizante se destaca a
espécie Punica granatum, popularmente conhecida como romãzeira. Os diferentes tipos de
extratos obtidos das cascas de romã são ricos em compostos fenólicos, taninos hidrolisáveis,
elagitaninos e ácido elágico, além de antocianinas e flavonoides, metabólitos relacionados às
atividades antimicrobiana e cicatrizante, o que favorece a cicatrização e a reparação tecidual
(WANG, et al. 2018; FLECK, et al. 2016). Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi
preparar filmes visando seu uso no preparo de coberturas bioativas, baseados nos polímeros
poli(álcool vinílico) e alginato de sódio, em diferentes proporções, contendo extrato de romã
em concentrações variadas. Após preparo dos filmes e caracterização preliminar, a atividade
antimicrobiana in vitro frente a diferentes linhagens de bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas, foi pesquisada.
METODOLOGIA
O presente trabalho foi realizado nos Laboratórios de Produção Farmacêutica e de
Microbiologia Farmacêutica, do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da UFES.
No estudo, foi empregado extrato hidroetanólico das cascas de romã obtido por percolação
seguida de rotaevaporação e secagem por liofilização. Para tal, foram coletados frutos adultos
maduros e sadios, em diferentes municípios do Espírito Santo, que foram processados em
conjunto, dando origem a um pool das cascas. Inicialmente, foram preparadas dispersões
poliméricas aquosas dos polímeros poli(álcool vinílico) (PVA) a 5 % p/v e alginato de sódio
a 4 % p/v, mediante agitação mecânica (agitador FISATOM, modelo 713D) a 450 rpm e,
aquecimento. Após resfriamento das dispersões, a glicerina foi incorporada na proporção de
1,5 % v/v como plastificante em ambas as dispersões. Após o preparo das blendas, diferentes
104
proporções das dispersões poliméricas foram misturadas sob agitação magnética (agitador
FISATOM, modelo 752A), durante 1 hora. Soluções aquosas de extrato de romã, nas
concentrações de 0,125 %, 0,250 %, 0,375 % e 0,5 % p/V foram incorporadas diretamente
nas blendas, mediante agitação magnética por 30 minutos. Para preparo dos filmes foi
utilizado o método de moldagem e evaporação do solvente (casting solvent): 10 mL de cada
blenda foi depositada em placa de petri, com diâmetro padronizado de 6,5 cm, que foram
deixadas expostas ao ar por 72 h, até a completa evaporação do solvente. A composição
qualitativa e quantitativa de PVA e alginato de sódio das blendas é dada na Tabela 1.
Tabela 1. Proporção das dispersões poliméricas nas blendas. Fonte: O autor.
PVA Alginato de sódio
(5% p/v) (4% p/v)
(% v/v)
PVA:ALG 1 90,0 10,0
PVA:ALG 2 80,0 20,0
PVA:ALG 3 70,0 30,0
PVA:ALG 4 60,0 40,0
PVA:ALG 5 10,0 90,0
PVA:ALG 6 20,0 80,0
PVA:ALG 7 30,0 70,0
PVA:ALG 8 40,0 60,0
Análise visual dos filmes e determinação da espessura
A avaliação preliminar consistiu na determinação da descrição dos filmes em: aspecto
(formação de domínios e continuidade), coloração, textura, brilho e facilidade de remoção dos
moldes (manutenção da integridade). A espessura dos filmes foi medida em 10 pontos
selecionados aleatoriamente, sendo considerados pontos centrais e periféricos empregando
micrômetro digital Mitutoyo (modelo MDC-25PX).
Avaliação da atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana dos filmes foi avaliada empregando método de disco-difusão, de
acordo com protocolo CLSI (2015), empregando como padrão as linhagens Gram-positivas
de Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e a
Gram-negativa Escherichia coli (ATCC 25922). Para a realização deste experimento, os
micro-organismos foram previamente cultivados em caldo BHI à 35,5º C, por 24 h e a
concentração da suspensão bacteriana foi ajustada pela escala 0,5 McFarland para 1,5 x 108
UFC/mL, utilizando solução salina estéril (0,85% de NaCl). As placas foram preparadas
utilizando o meio ágar Mueller-Hinton (MHA), e, com auxílio de swab, as linhagens foram
semeadas pela técnica de semeadura em superfície. Discos dos filmes (6 mm) contendo o
extrato e, filmes sem os extratos (controle negativo), foram colocados sobre a superfície das
placas. Discos contendo ampicilina (controle positivo) foram utilizados como padrão para
comparação entre as réplicas, conforme protocolo CLSI (Figura 1). As placas foram incubadas
a 37º C, durante 24 h. O diâmetro das zonas de inibição foi medido em milímetros (mm). Os
testes foram realizados em triplicata. Os resultados foram expressos como média.
105
1- Controle positivo
2- Filme contendo 0,125 %
3- Filme contendo 0,250 %
4- Filme contendo 0,375 %
5- Filme contendo 0,500 %
6- Controle negativo
Figura 1. Esquema da placa para os testes de difusão de disco para avaliação da atividade antimicrobiana dos
filmes de PVA:alginato de sódio preparados em diferentes proporções. Fonte: O autor.
A preparação dos filmes foi realizada seguindo o método de moldagem e evaporação do
solvente, técnica simples e rápida com reprodutibilidade em grande escala e em ambiente
asséptico, permitindo a preparação de filmes estéreis quando necessário (DUTRA et al.,
2017). Ao avaliarmos visualmente os filmes puros, foi possível observar que os mesmos se
mostraram transparentes, brilhantes, lisos e isentos de domínios, sem separação de fases.
Filmes com maior proporção de PVA demonstraram maior facilidade de remoção dos moldes,
mantendo-se íntegros e apresentando-se resistentes, flexíveis e macios. Por outro lado, filmes
com maior proporção de alginato de sódio se mostraram pouco resistentes, sendo a remoção
dos moldes dificultada, ocorrendo quebra em alguns casos. Ainda, estes filmes apresentaram
coloração opaca e se mostraram ásperos. Tais observações estão em conformidade com a
literatura, pois, há relatos que filmes preparados a partir de polímeros naturais não possuem
boa capacidade de formar filmes quando sozinhos ou em proporções elevadas, motivo pelo
qual são preparadas blendas entre estes e polímeros sintéticos, como o PVA (NHO, PARK,
LIM, 2014). Na avaliação dos filmes contendo o extrato nas concentrações estudadas,
observou-se a formação de filmes amarelos, coloração característica do extrato de romã. As
demais características dos filmes se mostraram inalteradas. Cabe destacar que, concentrações
de extratos superiores a 0,5% p/v nas blendas originou a separação de fases (Figura 2), o que
pode ser atribuído à existência de interações entre o extrato de romã, rico em taninos, e o
polissacarídeo (SIMÕES, 2001). Portanto, as concentrações consideradas para o estudo
variaram de 0,125 a 0,375% p/v.
Figura 2. Imagem representativa da separação de fases após adição do extrato na blenda PVA:alginato de sódio.
O autor.
Um dos parâmetros que interferem na função de barreira dos filmes é sua espessura, podendo
influenciar os resultados dos testes de inchamento e permeabilidade ao vapor d’água, por essa razão se faz necessária a pesquisa da espessura dos filmes (HU et al., 2001; GALDEANO et al., 2013). Os valores encontrados na sua determinação são dados na Tabela 2.
Tabela 2. Espessura dos filmes, medidas em (mm). Fonte: O autor.
106
(%p/V) PVA:
ALG 1
PVA:
ALG 2
PVA:
ALG 3
PVA:
ALG 4
PVA:
ALG 5
PVA:
ALG 6
PVA:
ALG 7
PVA:
ALG 8
0,125 0,0707
(±0,02)
0,0707
(±0,02)
0,0777
(±0,01)
0,0858
(±0,009)
0,0627
(±0,01)
0,0649
(±0,008)
0,0872
(±0,01)
0,0851
(±0,01)
0,250 0,0947
(±0,02)
0,0883
(±0,02)
0,0923
(±0,01)
0,0821
(±0,007)
0,0586
(±0,01)
0,0678
(±0,01)
0,0682
(±0,008)
0,0603
(±0,01)
0,375 0,0620
(±0,009)
0,0684
(±0,01)
0,0904
(±0,01)
0,0885
(±0,008)
0,0642
(±0,004)
0,0682
(±0,004)
0,0748
(±0,005)
0,0869
(±0,01)
0,5 0,0750
(±0,01)
0,0711
(±0,02)
0,0920
(±0,02)
0,0780
(±0,006)
0,0419
(±0,005)
0,0665
(±0,01)
0,0810
(±0,02)
0,0846
(±0,02)
- 0,0962
(±0,03)
0,0925
(±0,04)
0,0601
(±0,01)
0,0669
(±0,01)
0,0791
(±0,01)
0,0698
(±0,008)
0,0957
(±0,02)
0,0867
(±0,01)
Foi possível observar que filmes contendo maior proporção de PVA (PVA:ALG1,
PVA:ALG2) apresentaram espessura aumentada quando comparados aos demais e, que a
adição de extrato de romã provocou uma redução nestes valores. O teste de disco-difusão foi
empregado para avaliar a atividade antimicrobiana nos filmes contendo diferentes proporções
do extrato e auxiliar na definição da concentração de interesse. No teste, os halos observados
para a ampicilina estavam de acordo com o padrão recomendado para a realização dos ensaios
(CLSI, 2015). Na Tabela 3. É possível observar que nenhum halo foi observado no controle
negativo, sugerindo que cepas de E. coli não são sensíveis ao extrato estudado. Tais achados
estão de acordo com o observado por PAULA et al. (2019). Ao contrário, para as linhagens
de bactérias Gram positivas estudadas (S. epidermidis e S. aureus), foi observada inibição do
crescimento na presença dos filmes contendo o extrato nas diferentes concentrações testadas.
Tabela 3. Médias dos halos de inibição formados (mm) no teste de difusão em Agar frente as diferentes linhagens
testadas.
Extrato Filmes
(% p/v)
PVA:ALG1 PVA:ALG2 PVA:ALG3 PVA:ALG4
A B C A B C A B C A B C
0,125 0 10 10 0 0 10,4 0 0 9,4 0 9 0
0,250 0 12,3 12,4 0 13,4 15,6 0 16 15,7 0 13,4 15,3
0,375 0 15 12,4 0 15 17,3 0 15 17,6 0 18,6 16,6
0,500 0 16 15,7 0 15 16,6 0 16 14 0 15 18,3
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(% p/v) PVA:ALG5 PVA:ALG6 PVA:ALG7 PVA:ALG8
A B C A B C A B C A B C
0,125 0 0 10 0 0 0 0 0 11 0 0 0
0,250 0 15 15,3 0 14,5 11 0 15 11 0 12 14,7
0,375 0 0 15 0 14,8 10,7 0 16,7 15,4 0 0 18,4
0,500 0 15 14,4 0 15,4 11,7 0 18,4 16 0 14,5 17
- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Legenda: Escherichia coli (A); Staphylococcus aureus (B); e, Staphylococcus epidermidis (C).
Na avaliação da atividade antimicrobiana através do teste de difusão em ágar, ocorre a difusão
do extrato a partir do filme para o meio de cultura solidificado, podendo resultar na formação
107
de uma zona de inibição do crescimento microbiano, denominado halo de inibição, quando o
micro-organismo é sensível ao agente estudado (CAGRI et al., 2001; PRANOTO et al., 2005;
LI et al., 2006; PIRES et al., 2008). Os resultados obtidos no presente trabalho se mostram
coerentes com o observado em literatura, onde afirmam que os extratos das cascas de romã
possuem efeito inibitório sobre linhagens de bactérias Gram positivas, que pode ser atribuído
à eficácia aos polifenóis solúveis em água, antocianinas e taninos hidrolisáveis que são
encontrados no extrato. Estes componentes, são capazes de degradar a parede celular, romper
a membrana citoplasmática e danificar as proteínas da membrana dos micro-organismos,
interferindo com enzimas integradas na membrana e causando morte celular (MACHADO et
al., 2003; TRINDADE et al., 2009; LEE e MOONEY, 2012). Dahaam e colaboradores (2010)
selecionaram em seu estudo culturas bacterianas e fúngicas e avaliaram o extrato de romã e
registraram uma maior atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus. Ainda, pode-
se observar que para as cepas de S. aureus, a sensibilidade antimicrobiana foi dependente da
concentração do extrato dos filmes, não sendo observada atividade na presença de filmes
contendo 0,12% p/v de extrato.
CONCLUSÕES
Foi possível obter filmes com características organolépticas adequadas, com as diferentes
proporções de extrato estudadas. Os filmes apresentaram atividade contra cepas Gram-
positivas, o que está de acordo com relatos da literatura. Novos ensaios serão realizados para
seleção da concentração de extrato a ser empregado no preparo dos filmes, para a continuidade
do estudo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à UFES, FAPES, CNPq pela concessão de bolsas e, à CAPES
(modalidade de financiamento – 001).
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WANG, D. et al. Vasculoprotective effects of pomegranate (Punica granatum L.). Frontiers in Pharmacology,
v. 9, 2018.
109
Carcinoma de células escamosas da cavidade oral: Associação do hábito
tabagista nas concentrações dos elementos químicos Anderson B. Archanjo; Arícia L. E. M. de Assis; Mayara M. de Oliveira; Joaquim G. dos
Santos; Suzanny O. Mendes; Aline R. Borçoi; Ivana A. A. Moreno; Bárbara Risse-Quaioto;
Gabriela T. Peterle; Júlia de A. Pinheiro; Rafael P. Souza; Rafael de Cicco; Leonardo O.
Trivilin; Christiano J. G. Pinheiro; Marcelo dos Santos; Fabio D. Nunes; Breno V. Nogueira;
Adriana M. Álvares da Silva
Palavras-Chave: Câncer oral, tabagismo, µ-XRF
INTRODUÇÃO
O câncer é um grande problema na saúde pública mundial (SIEGEL et al., 2017), dentre os
diversos tipos tumorais frequentes na população mundial, o carcinoma de cabeça e pescoço
éum tipo altamente maligno e agressivo e apresenta uma elevada taxa de morbidade e
mortalidade (JOU; HESS 2017). O carcinoma de células escamosas é a principal variante
histológica e corresponde a cerca de 90% dos casos de tumores da cavidade oral, faringe e
laringe (LEEMANS et al, 2011; PFISTER et al, 2017), sua etiologia é complexa e
multifatorial, atinge principalmente indivíduos com faixa etária entre 50 e 70 anos e que
possuam histórico de consumo de tabaco e álcool, além de suscetibilidade genética e infecção
por HPV, no casos de câncer de orofaringe (GILLISON et al., 2007; HAN et al., 2010;
LEEMANS et al, 2011; PFISTER et al, 2017). Como exposto, o consumo, individual ou
combinado, de tabaco e álcool são apontados como os principais fatores associados ao risco
de câncer oral. Sozinha a fumaça do tabaco contém centenas de moléculas cancerígenas
conhecidas (SINGH et al., 2011), que são capazes de atuar provocando possíveis danos ao
DNA, que caso não seja reparado pela maquinaria molecular, leva ao aumento das mutações
e uma maior suscetibilidade a mutações em genes relacionados ao processo de
carcinogênese(HECHT, 2003). A presença de elementos químicos, que podem estar
associados ao hábito tabagista, nesses tumores pode ser associada a progressão e possível
prognóstico através da elucidação de mecanismos moleculares de atuação desses elementos
em vias malignidada tumoral. Em tumores de mama diversos trabalhos reportam a o papel de
elementos na gênese e progressão tumoral. Majewska et al., (1997), por exemplo, relatam
diferenças nas concentrações dos elementos P, S, K, Ca, Mn, Fe, Se e Rb, quando comparados
tumores benignos e malignos. Geraki et al., (2004), destacam que as concentrações dos
elementos potássio e zinco foram maiores em tumores da mama. Silva et al., (2012) relataram
ainda que a quantificação de elementos traços é um potencial marcador em tumores mamários
e destacam que pacientes com a presença do elemento cromo apresentaram uma menor
sobrevida. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a relação dos
níveis elementares de S, Cl, Cu, Zn e Br com o tabagismo, prognóstico e sobrevida de
pacientes com câncer de células escamosas da cavidade oral.
METODOLOGIA
Casuística e amostras
Neste estudo, foram obtidas 78 amostras de tecido tumoral de pacientes com carcinoma de
células escamosas da cavidade oral, atendidas no Instituto do Câncer Arnaldo Vieira de
110
Carvalho (ICAVC), São Paulo, Brasil, durante o período de janeiro/2012 a maio/2015.As
amostras foram categorizadas de acordo com o hábito tabagista, sendo: nunca fumou, parou
de fumar e fuma atualmente.
Determinação da Concentração Elementar
As amostras de tecido tumoral foram dispostas em suporte plásticos com filme de Ultralene®
e levadas aos equipamentos da linha de luz D09-XRF, para medição pela técnica de µ-XRF.
O suporte foi posicionado em 45º em relação ao detector e o feixe incidente. Para excitar as
amostras um feixe branco com dimensões de 2 mm2 foi usado em nove pontos dispostos em
uma matriz 3x3e posteriormente captados e medidos. A incidência do feixe em cada ponto foi
por 20 segundos. Para a determinação dos níveis elementares de enxofre, cloro, cobre, zinco
e bromo utilizou-se o Standard Reference Material®1577b “Bovine Liver”, produzida pelo
National Institute of Standards and Technology (NIST). Os espectros foram obtidos pela
média dos nove pontos medidos e as análises foram feitos utilizando o programa PyMca 5.0.0.
A análise foi realizada no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, Campinas-SP, Brasil.
Para melhor visualização dos resultados, foi utilizado um fator de correção (FC)nos valores
de concentrações obtidos para cada elemento, onde: o FC foi de 1000x para os elementos S e
Cl e de 1000000x para os elementos Cu, Zn e Br. Os valores de concentrações foram
categorizados de acordo como nível de concentração de cada elemento, onde aqueles com
valores de concentração abaixo da mediana foram categorizados como BAIXO e os com
valores de concentração acima da mediana foram categorizados como ALTO.
Análise estatística
Foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney, com margem de erro de
5%. Para as análises de sobrevidas livre de doença foi calculado utilizando como ponto final
a data de recidiva ou a data do último retorno nos casos assintomáticos. As curvas de
sobrevidas foram avaliadas segundo o modelo Kaplan-Meier e o valor de p de Wilcoxon. Os
cálculos matemáticos foram realizados com a utilização do programa IBM SPSS
STATISTICS® v. 20, 2011.
Aspectos éticos
O estudo possui aprovação nos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos sob os
pareceres 1.359.363 e 1.422.077.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Organização Mundial da Saúde (WHO, 1996), separa os elementos traços em função de sua
importância nutricional em humanos, sendo: 1) os elementos essenciais: I, Zn, Se, Cu, Mo,
Cr, Fe e Co; 2) elementos provavelmente essenciais: Mn, Si, Ni, B, V; e 3) elementos
potencialmente tóxicos, em que alguns, em níveis baixos podem apresentar algumas funções
essenciais: F, Pb, Cd, Hg, As, Al, Li, Sn. Em nossa amostra, foi possível determinar a
concentração dos elementos essenciais Cu e Zn, além de outros elementos não listados pela
OMS. Tais elementos e seus valores medianos podem ser observados na tabela 1.
111
Tabela 1. Caracterização das concentrações dos elementos nas amostras tumorais de pacientes com carcinoma
de células escamosas da cavidade oral.
Elemento Concentração (FM)*
Enxofre
Mediana 8,76
IIQ 12,80
Cloro
Mediana 3,11
IIQ 3,96
Cobre
Mediana 0,82
IIQ 2,40
Zinco
Mediana 1,68
IIQ 24,97
Bromo
Mediana 6,30
IIQ 10,43 *FM: Fração de massa; IIQ: Intervalo interquartil
Conforme apresentado na tabela 2, ao estratificarmos a amostra pelo hábito tabagista
categorizado em: nunca fumou, parou de fumar e fuma atualmente, foi possível observar, uma
associação da concentração dos elementos S, Cl, Cu e Br com o hábito tabagista, onde as
maiores concentrações foram encontradas nas amostras de pacientes que nunca fumaram.
Esperava-se um padrão diferente, com as maiores concentrações nos que tinham o hábito
tabagista, já que a fumaça do cigarro contém milhares de substâncias químicas (SINGH et al.,
2011). No entanto, acredita-se que os próprios elementos interfiram na bioabsorção uns dos
outros, justificando o resultado encontrado.
Tabela 2. Caracterização das concentrações, em fração de massa, dos elementos nas amostras tumorais de
pacientes com carcinoma de células escamosas da cavidade oral, estratificado pelo hábito tabagista.
Elemento Hábito tabagista
Pvalue Nunca Parou Atual
Enxofre
Mediana 16,51 9,83 4,49 0,021
IIQ 18,61 12,55 11,29 Cloro
Mediana 16,57 2,91 2,29 0,025
IIQ - 3,19 4,06
Cobre
Mediana 2,16 0,78 0,61 0,046 IIQ 25,73 9,72 1,41
Zinco
Mediana 12,72 1,13 2,76 0,361
IIQ 50,04 4,23 28,97
Bromo
Mediana 15,53 3,95 6,82 0,015 IIQ 26,74 7,60 10,22
*FM: Fração de massa; IIQ: Intervalo interquartil.
112
Em câncer de mama, alguns trabalhos demostram a contribuição da concentração elementar
na gênese e progressão do câncer. Majewska et al., (1997) em seu estudo sobre a correlação
das concentrações de oligoelementos em câncer de mama benigno e maligno, verificaram
mudanças nas concentrações de P, S, K, Ca, Mn, Fe, Se e Rb nos tumores malignos e que
aparentemente todos esses elementos são vitais para processos biológicos e enzimáticos.
Kolmogorov et al., (2000) e Pasha et al., (2007), analisaram pela técnica de fluorescência de
raio-X a concentração de oligoelementos no bulbo capilar de pacientes com câncer de mama
e doadores normais. Kolmogorov et al., (2000), encontraram uma diminuição da concentração
de selênio e zinco e um aumento na concentração de cromo em pacientes com câncer de
mama. Já Pasha et al., (2007), encontraram a maiores concentrações de Ca, Cd, Co, Cr, Fe,
K, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Sb, Sr e Zn em cabelos de pacientes com câncer em comparação com
doadores normais, o que pode levar a uma série de distúrbios fisiológicos. As concentrações
elementares, em nossos estudos, estiveram relacionadas com a recidiva e óbito.
Especificamente o elemento cobre associou-se com a recidiva e, revelou que o maior valor de
mediana da concentração de cobre esteve associado aos indivíduos que não apresentaram
recidiva (p=0,045), apresentado valor 3 vezes superior quando comparados aos que
apresentaram recidiva local (Tabela 3). Em relação à concentração do elemento zinco, foi
possível verificar a associação dos valores de concentração com a recidiva (p=0,007), onde o
valor de mediana dos indivíduos que não tiveram recidiva foi cerca de 9 vezes maior do que
nos que recidivaram (Tabela 3). Silva et al., (2012) relataram que a quantificação de elementos
traços tem grande potencial como marcador em tumores mamários sendo encontradas relações
com os marcadores prognósticos clássicos para este tipo de tumor. Além disto, esses autores
mostraram que os pacientes com a presença do elemento cobre apresentaram uma menor
sobrevida. Em estudo realizado por Geraki et al., (2004), foi verificado que o nível das
concentrações dos elementos ferro, cobre, potássio e zinco são mais elevados em tecidos
mamário tumorais, sendo que os dois últimos os com os níveis mais elevados.
Tabela 3. Caracterização das concentrações, em fração de massa, dos elementos nas amostras tumorais de
pacientes com carcinoma de células escamosas da cavidade oral, estratificado pela ocorrência de recidiva e óbito.
Elemento
Recidiva
P value Não Sim
Enxofre
Mediana 8,13 10,44 0,841
IIQ 12,41 25,14
Cloro
Mediana 2,62 4,82 0,296
IIQ 3,81 -
Cobre
Mediana 1,06 0,29 0,045
IIQ 3,51 0,47
Zinco
Mediana 2,80 0,33 0,007
IIQ 27,67 0,34
Bromo
Mediana 6,30 5,90 0,612
IIQ 10,92 15,21 *FM: Fração de massa; IIQ: Intervalo interquartil.
113
Em relação à sobrevida livre de doença, nota-se que o nível do elemento cobre possui
associação significativa (Wilcoxon p=0,005). Observa-se que nos 24 meses após o tratamento cirúrgico 25% dos pacientes com baixo nível de cobre apresentaram recidiva
local, enquanto 0% dos pacientes com alto nível de cobre recidivaram localmente (Figura
1A). Para o nível do elemento zinco, verifica-se uma associação com a sobrevida doença específica (Wilcoxon p=0,015). Nota-se que 20% dos pacientes com concentração baixa de
zinco foram ao óbito nos primeiros 24 meses após o seguimento cirúrgico e no mesmo período 50% dos pacientes com alto nível de zinco foram ao óbito pelo câncer (Figura 1B).
A alta concentração de zinco se mostrou como fator de proteção para o surgimento de recidiva, enquanto teve relação com uma pior sobrevida doença específica. Sugerindo uma
melhor investigação nos mecanismos envolvidos, já que o zinco é um elemento essencial em vários processos biológicos.
Figura 1. (A) Curva de sobrevida livre de doença de pacientes com carcinoma de células escamosas de cavidade oral segundo o nível de cobre. (B) Curva de sobrevida doença específica de pacientes com carcinoma de células
escamosas de cavidade oral, segundo o nível de zinco.
CONCLUSÕES
Verificou-se a associação da concentração dos elementos S, Cl, Cu e Br com o hábito
tabagista. Quanto a análise de fatores prognósticos constatou-se que a alta concentração de
cobre e zinco foi apontada como fator de proteção para a recidiva. No entanto, nas sobrevidas
o cobre atua melhorando a sobrevida livre de doença enquanto o zinco contribuiu para uma
pior sobrevida doença específica.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo – FAPES, pelo apoio
financeiro (EDITAIS: 03/2017 – Universal, TO: 204/2017; 10/2018 – Profix 2018, TO:
390/2018).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
114
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diffraction for the quantification of elemental concentrations in breast tissue. Physics in medicine and biology,
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Health Organization, 1996. 343 p.
115
Controle de qualidade físico-químico de cápsulas de carbonato de cálcio
manipuladas no sul do estado do espírito santo
Mikaela Vieira Beloni; Matheus Pimentel Chiconeli; Carlos Marchiorio Lacerda; Maria Paula
Debona Vieira; Daniele Ewald do Nascimento; Iara Souza Moreira; Kassia Vidal Menezes;
Leonardo Soares Morgado; Juliana Aparecida Severi
Palavras-Chave: antiácido, alopático, farmacopeia
INTRODUÇÃO
As doenças ácido-pépticas são distúrbios causados pela liberação exacerbada de ácido
clorídrico pelas células parietais do estômago e com consequente diminuição do pH (aumento
do nível de acidez) no local. Dentre as doenças de maior relevância, destacam-se a úlcera
péptica, a doença de refluxo gastroesofágico (DRGE) e muitas formas de gastrite. O
tratamento farmacológico pode ser feito por meio do bloqueio da liberação de HCl, por
aumento do pH estomacal ou protegendo o órgão dos efeitos de sua própria secreção. Para
isso, utilizam-se inibidores da enzima H+,K+/ATPase, inibidores competitivos da histamina
nos receptores H2, prostaglandinas e/ou antiácidos. Estes últimos, são empregados em
tratamentos de episódios curtos e autolimitados de acidez estomacal provenientes da má
ingestão de excesso de alimentos e bebidas. Também são empregados como auxílio no
tratamento em longo prazo de úlceras pépticas e de refluxo gastresofágico (RANG, 2012).
Agem interagindo com o ácido estomacal, elevando o pH de 2,0 (em média) para valores entre
3,5 e 5,0. Quimicamente, os antiácidos são bases fracas na forma de sais de magnésio, sais de
alumínio, bicarbonato de sódio ou carbonato de cálcio. Estes são classificados como
sistêmicos e não sistêmicos, onde os sistêmicos sofrem absorção da parte catiônica da
molécula e os não sistêmicos reagem no local com o HCl e não são absorvidos. Diferem entre
si também quanto à potência, taxa de absorção, tempo de ação, efeitos secundários,
complicações sistêmicas e interações medicamentosas. Neste contexto, o carbonato de cálcio,
potente antiácido, tem sido utilizado por muito tempo como o principal fármaco deste grupo.
Atua de forma rápida, com tempo relativamente prolongado comparado aos outros.
Entretanto, apesar de ser também uma fonte de cálcio, apresenta riscos por superdosagem,
causando danos renais devido ao excesso de cálcio. Por consequência, sua administração
diária não deve exceder 2 gramas diárias (Katzung, 2014). Neste contexto, os antiácidos
representam uma classe farmacológica importante, uma vez que são fármacos de venda livre
altamente difundidos nas práticas de automedicação. No mercado farmacêutico estão
disponíveis formas variadas de apresentação do antiácido carbonato de cálcio, seja no âmbito
industrial ou magistral. Devido à melhor aceitabilidade dos pacientes e estabilidade dos
medicamentos, as formas farmacêuticas sólidas são as mais prescritas. Com o aumento da
produção de medicamentos nos últimos anos, decorreu a necessidade de melhoria da sua
qualidade, principalmente nos medicamentos manipulados. Segundo Gil (2007), garantir a
qualidade do medicamento produzido não é apenas um predicado comercial, mas também,
ético, moral e sanitário. É um requisito obrigatório segundo a legislação brasileira atual e o
não cumprimento pode acarretar em sanções jurídicas para o estabelecimento farmacêutico.
O principal referencial teórico a ser atendido pelas farmácias de manipulação, visando a
qualidade das preparações comercializadas, é a RDC nº 67/2007 (Brasil, 2007). Os parâmetros
116
de análise variam conforme a natureza do produto, a forma de apresentação e a finalidade do
uso. No caso de formas farmacêuticas sólidas manipuladas em cápsulas duras gelatinosas, a
RDC 67/2007 estabelece a necessidade de realização de no mínimo os seguintes ensaios:
descrição, aspecto, caracteres organolépticos e peso médio. Diante deste contexto, uma
pesquisa bibliográfica realizada em diversas fontes revelou não haver estudos de avaliação da
qualidade de cápsulas de carbonato de cálcio manipuladas em farmácias de uma cidade do sul
do estado do Espírito Santo. Isso motivou a elaboração do presente trabalho, na medida que
poderá gerar informações úteis à saúde da população capixaba no sul do estado.
METODOLOGIA
Amostras comerciais de carbonato de cálcio (cápsulas de 500 mg) foram adquiridas de três
farmácias de manipulação localizadas em um município da macrorregião sul do estado do
Espírito Santo. Para preservar o anonimato dos estabelecimentos, foi feita a identificação dos
mesmos apenas por siglas (A, B, C). As análises realizadas seguiram principalmente as
normativas da Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) e da Resolução da RDC 67/2007
(Brasil, 2007). A primeira avaliação realizada foi da conformidade da embalagem e rotulagem
das preparações. Foram observados os seguintes aspectos: nome do prescritor, nome do
paciente, número do registro da formulação no livro de receituário, data da manipulação,
prazo de validade, componentes da formulação (quantidade, número de unidades, peso
contido, posologia), identificação da farmácia (CNPJ, endereço completo, nome do
farmacêutico responsável técnico com respectivo número de registro no conselho de
farmácia), rótulos ou etiquetas com advertências complementares (“uso externo”, “uso
interno”, “não deixe ao alcance de crianças”), adequabilidade de embalagem (tipo de material,
proteção contra a luz, presença de lacre, de chumaço de algodão e de agente secante). Em
seguida, realizou-se a avaliação dos caracteres organolépticos, no qual as cápsulas foram
abertas e alíquotas do conteúdo interno foram depositadas sobre papel branco não poroso e
observadas a olho nu em ambiente com luz difusa para avaliação dos caracteres organolépticos
(aspecto, cor, odor e sabor). Ainda na etapa de descrição, realizou-se o teste de solubilidade
em água, em solução ácida (ácido acético 1 M e clorídrico 3 M) e também para a presença de
íons cálcio. O teor de umidade foi avaliado a partir do ensaio de perda por dessecação,
empregando-se uma alíquota de 1 g, a 200º C, por 4 horas. Para o doseamento, realizou-se o
ensaio com alíquotas de 0,1 g de carbonato de cálcio, empregando-se a titulometria de
complexação com edetatodissódico 0,05M SV como titulante e azul de hidroxinaftol como
indicador. Cada mililitro de edetato dissódico 0,05 M SV foi equivalente a 5,004 miligramas
de CaCO3. Para a avaliação do peso médio, foram utilizadas 20 cápsulas. O peso do conteúdo
de cada cápsula foi calculado pela diferença de peso entre a cápsula cheia e a vazia, em balança
analítica, sendo o limite de variação máxima aceitável de 7,5%. Por fim, avaliou-se a
desintegração das cápsulas (n=6) em meio aquoso a 37º C, sendo 30 minutos o tempo máximo
para observação da desintegração completa das cápsulas no aparato do equipamento.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na avaliação dos rótulos dos medicamentos manipulados de carbonato de cálcio, verificou-se
que as três amostras apresentaram todas informações requeridas, exceto “o nome do
prescritor”, como é mostrado na tabela 1. Isto se explica pelo fato de que as amostras foram
adquiridas sem apresentação de receita médica, por ser isento de prescrição. No que diz
respeito às embalagens, as três amostras apresentaram a embalagem secundária de material
117
plástico, leitoso, cujas tampas apresentaram lacre de segurança. A única diferença encontrada
foi quanto à apresentação do agente dessecante, onde 2 farmácias utilizaram um agente
dessecante na forma de sachês de sílica gel (“A” e “B”) e outra farmácia utilizou uma tampa
com encaixe para a sílica gel (“C”). Este último recurso é valorizado, pois minimiza o risco
de ingestão acidental por parte do paciente. Destaca-se também a importância do
preenchimento do espaço vazio das embalagens quando acondicionamento das cápsulas for
feito em frasco, o qual foi feito com um chumaço de algodão nas amostras investigadas. Este
terá a função minimizar o efeito de vibração ou choques (Ferreira, 2008), contribuindo
também com a qualidade do produto final destinado ao paciente.
Tabela 1. Avaliação do rótulo e embalagens contendo cápsulas de Carbonato de Cálcio manipuladas em farmácias da região sul capixaba. “X” indica a presença da informação e “-“ a ausência da mesma.
Informação requerida Farmácia
Total de amostras em
A B C Conformidade
Nome do prescritor - - - 0% Nome do paciente X X X 100% Número de registro da formulação no livro de receituário
X X X 100%
Data da manipulação X X X 100%
Prazo de validade X X X 100%
Componentes da formulação com respectivas
quantidades X X X 100%
Número de unidades X X X 100%
Peso ou volume contidos X X X 100% Posologia X X X 100% Identificação da farmácia X X X 100%
C.N.P.J. X X X 100% Endereço completo X X X 100% Nome do farmacêutico responsável técnico com o
respectivo número no Conselho Regional de
Farmácia.
X X X 100%
Rótulos ou etiquetas com advertências
complementares (“uso externo”, “uso interno”, “não
deixe ao alcance de crianças”)
X X X 100%
Adequabilidade de embalagem (tipo de material,
proteção contra a luz, presença de lacre, de chumaço
de algodão e de agente secante).
X X X 100%
Na etapa de descrição das características organolépticas (tabela 2) todas as amostras apresentaram o aspecto de pó fino, amorfo e higroscópico. Este resultado divergiu das especificações farmacopeicas do carbonato de cálcio, estabelecido como pó microcristalino. As cores das amostras apresentaram-se em conformidade com as especificações, assim como o sabor. Quanto ao odor, as amostras “B” e “C” estavam em conformidade, porém a amostra “A” apresentou um odor leve. Com relação a solubilidade, todas as amostras foram aprovadas, sendo que foram praticamente insolúveis em água e dissolveram-se com efervescência em ácido clorídrico 3M.
Tabela 2. Avaliação das características organolépticas das cápsulas de Carbonato de Cálcio manipuladas em
farmácias da região sul capixaba.
118
Parâmetro Especificações Farmácia
A B C
Aspecto
Pó fino,
microcristalino
Pó fino, amorfo e Pó fino, amorfo e Pó fino, amorfo e
higroscópico higroscópico Higroscópico
Cor Branco Branco Branco Branco
Odor Inodoro Odor leve Inodoro Inodoro
Sabor Insípido Insípido Insípido Insípido
Na etapa de identificação, todas as amostras estavam em conformidade com as especificações
farmacopeicas. A presença do grupo carbonato foi evidenciada após o emprego de ácido
acético 2 M, onde observou-se a liberação de CO2 por efervescência. A identificação do íon
cálcio nas três amostras se deu pela formação de um precipitado branco de oxalato de cálcio
na solução, o qual foi insolúvel em ácido acético 6 M, mas solúvel em ácido clorídrico SR,
como especificado na farmacopeia. Na análise de pureza, foi empregado o teste de perda por
dessecação. Como critério de aceitação, as amostras deveriam apresentar uma perda menor
ou igual a 2% (p/p). As amostras “A” e “B” foram reprovadas nesta análise, com valores de
perda por dessecação iguais a 2,91% e 4,8% respectivamente. A única amostra aprovada foi
a “C”, com perda de 1,8%. Como dito anteriormente, as amostras “A” e “B” se divergiam da
amostra “C” quanto à forma de apresentação do agente dessecante. Está é uma possível
explicação para esse resultado, uma vez que as duas amostras que possuíam sílica em gel na
forma de sache foram reprovadas no teste de dessecação e a amostra que utilizou a tampa com
sílica estava em conformidade. Estes resultados sugerem uma disparidade de eficácia das
diferentes apresentações do agente dessecante. Segundo Ferreira (2008), a umidade
relativamente alta aumenta o potencial para a hidrólise de fármacos susceptíveis e,
frequentemente, causa alterações de ordem física em matérias-primas e formas farmacêuticas
sólidas. Estes efeitos indesejáveis podem ser reduzidos com o emprego adequado de um
dessecante e com métodos apropriados de manipulação e controle da matéria-prima. Na
análise do peso médio (tabela 3), foram aplicados os critérios descritos na farmacopeia para
cápsulas duras, segundo a qual, cápsulas duras acima de 300 mg podem apresentar um limite
de ±7,5%. Pode-se tolerar, no máximo, duas unidades fora dos limites especificados, porém
nenhuma poderá estar acima ou abaixo do dobro das porcentagens indicadas. Considerando
os critérios adotados, as amostras “A” e “B” foram aprovadas neste aspecto. Porém a amostra
“C” foi reprovada por apresentar cinco unidades fora dos limites especificados. As cápsulas
representam a forma farmacêutica sólida mais utilizada pelas farmácias magistrais, tendo
como maior desafio o preenchimento adequado das mesmas para que atendam aos parâmetros
de eficácia terapêutica e segurança do paciente. A pesagem dos insumos (ativos e inativos)
uma etapa de grande relevância neste processo, pois a segurança do manipulado depende da
exatidão da dose. Após, a operação de mistura de pós deve possibilitar a obtenção de um
produto com distribuição homogênea dos constituintes da formulação, o que também é de
grande importância para a obtenção de doses uniformes. Já na etapa de preenchimento das
cápsulas o mercado dispõe de variados modelos de encapsuladoras manuais, semi-
automáticas e as automáticas, sendo que os manuais, na maioria das vezes são as mais
encontradas nas farmácias magistrais. Seu uso adequado depende de capacitação adequada da
equipe técnica e do bom estado de conservação do aparato, na maioria ds vezes feito de
material plástico (DUTRA, 2012). Portanto, o ensaio de peso médio é um indicador que reflete
a eficiência da técnica de preparação.
119
Tabela 3. Avaliação do peso médio de cápsulas de Carbonato de Cálcio manipuladas em farmácias da região
sul capixaba.
Farmácia Peso médio Variação
encontrada
Total de unidades acima
do limite de variação Conformidade
A 0,5303 g 0,489g - 0,557g 1 Sim
B 0,5520 g 0,533g - 0,580g 0 Sim
C 0,5467 g 0,499g - 0,594g 5 Não
Na análise de doseamento, todas as amostras estavam em conformidade com especificações,
em que “A”, “B” e “C”, apresentaram o teor de 104,97%, 115% e 109,01% respectivamente.
Por fim, o ensaio de desintegração realizado demonstrou que todas as cápsulas desintegraram
completamente em menos de 45 minutos (A: 3 minutos, B: 5 minutos, C: 11 minutos).
Portanto, todas as foram aprovadas. Dado o exposto as alterações encontradas sugerem falhas
ou falta de condições adequadas de armazenamento e controle de processo. É importante
ressaltar que os testes de controle de qualidade podem ser terceirizados em laboratórios
capacitados (habilitados e certificados pela ANVISA) que prestam serviços confiáveis e
responsáveis em caso de recursos materiais insuficientes nos estabelecimentos farmacêuticos.
O medicamento magistral de qualidade é aquele manipulado corretamente, qualquer que seja
a forma de apresentação do medicamento, de longo, médio e curto prazo de validade, que
atenda a finalidade pretendida e seja incapaz de produzir efeitos indesejáveis e, dessa maneira,
fornece um produto útil à saúde da população.
CONCLUSÕES
Os dados obtidos neste estudo sugerem que as cápsulas de Carbonato de Cálcio manipuladas
em farmácias de manipulação do sul do estado do Espírito Santo, necessitam de uma
intensificação do controle de qualidade do produto acabado, do controle em processo e das
condições de armazenamento e conservação destas. Assim também como a qualificação dos
manipuladores, de modo a garantir que o produto final esteja totalmente em conformidade
com as especificações estabelecidas na legislação em vigor.
AGRADECIMENTOS
Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo (FAPES), Universidade
Federal do Espírito Santo – Centro de Ciências Exatas Naturais e da Saúde (UFES-CCENS)
e o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ)
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DUTRA, V. C. Manipulação de cápsulas. Serviço Brasileiro de Respostas Técnicas; dossiê técnico. Rio de
Janeiro, 2012
120
FERREIRA, A. O Guia Prático da Farmácia Magistral. 3. ed. São Paulo: Pharmabooks, 2008.
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RANG, P.H. et al. Farmacologia. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012.
121
Efeito do extrato alcoólico de cipó-cravo sobre enzimas antioxidantes em
testículos de camundongos
Lucas Antônio Martins Rocha; Eduardo Medeiros Damasceno; Fernanda Carolina Ribeiro
Dias; Viviane Gorete Mouro; Janaina Silva; Luiz Carlos Maia Ladeira; Juliana Castro
Monteiro Pirovani; Maysa do Vale Oliveira; Sérgio Luis Pinto Matta
Palavras-Chave: Afrodisíaco, peroxidação lipídica
INTRODUÇÃO
A utilização de plantas sempre foi empregada na cultura popular para os mais diversos fins
terapêuticos, desde o tratamento de doenças até melhora do desempenho sexual, no caso de
afrodisíacos. O uso indiscriminado de drogas vegetais ou alopáticas com finalidades
afrodisíacas é extremamente temerário, como são vistos como uma solução rápida e de fácil
acesso são largamente consumidos, porém, muitas delas apresentam substâncias que podem
desencadear reações adversas, seja por seus próprios componentes, seja pela presença de
contaminantes ou adulterantes presentes em suas preparações (TUROLLA; NASCIMENTO,
2006). Algumas plantas utilizadas popularmente como afrodisíacas agem aumentando a
produção espermática e trazem benefícios para os parâmetros testiculares, como comprovado
em Fadogia agrestis (YAKUBU et al., 2005; MALVIYA et al., 2011) e Lepidium meyenii
(ZHENG et al, 2000; CICERO et al., 2001; CICERO et al, 2002). O Tynanthus fasciculatus,
popularmente conhecido como cipó-cravo, tem sido utilizada na medicina popular para
combater à indigestão, dores de estômago, tratamento de diarreia, controle de vermes e como
afrodisíaco e estimulante sexual em preparações alcoólicas. Apesar de bastante utilizada pela
população há pouco embasamento científico. Assim sendo, o presente trabalho visa abordar
aspectos de respostas antioxidantes sob influência do extrato alcoólico obtido da espécie
vegetal T. fasciculatus.
METODOLOGIA
Coleta e processamento do material botânico
A coleta do cipó-cravo (T. fasciculatus) foi realizada no mês de setembro de 2014, no setor
de Dendrologia do Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Viçosa.
No preparo do extrato alcoólico do caule de T. fasciculatus (EATF) fragmentos do caule de
cipó-cravo foram secos em estufa em temperatura de 40 °C, seguido de maceração do material
seco e imerso em álcool etílico 99% por 24h, em seguida, submetida à percolação com o
mesmo solvente. Após extração, o extrato foi encaminhado ao evaporador rotativo com
pressão reduzida e, por fim, liofilizado afim de apresentar uma completa remoção do solvente,
apresentando um rendimento de 8,3%.
Prospecção fitoquímica
Para a prospecção fitoquímica, aproximadamente 25 mg do extrato foi transferido para frasco
de vidro (capacidade 5 mL) e solubilizado em etanol 99%. Com o auxílio de capilares de
vidro, o extrato foi aplicado em placas de vidro recobertas com sílica (sílica gel 60,
MACHEREY-NAGEL®, espessura de 0,25 mm) ou em cromatofolhas em alumínio (com
indicador fluorescente 254 nm, SIGMA ALDRICH®).
122
Detalhamento experimental
Foram utilizados 40 camundongos Swiss (Mus musculus) machos, pesando entre 35 e 45g,
em idade reprodutiva (80 dias). Os animais permaneceram em ambiente de temperatura (22 ±
2ºC), umidade (60 - 70%) e luz controladas, em ciclo claro-escuro (12/12 h), tendo acesso ao
alimento e água ad libitum. Os animais foram colocados em gaiolas individuais e distribuídos
de maneira aleatória em quatro grupos experimentais (n=10): Grupo 1 - controle (água);
Grupo 2 - EATF 100, extrato alcoólico do caule de T. fasciculatus na dosagem de 100mg/Kg
de peso corporal (PC); Grupo 3 - EATF 200, extrato alcoólico do caule de T. fasciculatus na
dosagem de 200 mg/Kg de PC; Grupo 4 - EATF 300, extrato alcoólico do caule T. fasciculatus
na dosagem de 300 mg/Kg de PC. As dosagens utilizadas neste ensaio foram baseadas em
estudo prévio realizado por Melo et al. (2010). Os animais foram expostos aos tratamentos
por um período de 42 dias, sendo todos os tratamentos administrados por gavagem, através
de cânula de metal orofaríngea.
Coleta de amostras
Após 24h da última gavagem, os animais foram anestesiados utilizando-se cloridrato de
xilazina (2mg/kg/IP) e cloridrato de quetamina (10mg/kg/IP). Consecutivamente, foram
removidos os órgãos do aparelho reprodutor masculino, o testículo direito foi congelado em
nitrogênio líquido e armazenado em freezer para análises das enzimas. O sangue foi obtido
via punção cardíaca, sendo posteriormente centrifugado e o soro armazenado em ultrafreezer.
Atividade das enzimas antioxidantes e determinação de malondialdeído
Fragmentos de testículo (100 mg) foram homogeneizados em tampão fosfato de potássio (pH
7.4) 0.2 M com 1M Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético (EDTA) e a suspensão centrifugada
a 13,8 g por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante resultante foi utilizado para as análises de
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e determinação da concentração de
malondialdeído (MDA). Seguindo a ordem, os homogenatos foram submetidos a leitor de
microplacas, baseado na capacidade desta enzima em catalisar a reação do superóxido O2- ,
CAT mensurada segundo Aebi (1984) e MDA foi estimada conforme descrito por Wallin et
al. (1993).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Prospecção fitoquímica
Ainda que se saiba a constituição fitoquímica básica de T. fasciculatus, é de suma importância
a confirmação desses componentes no extrato utilizado (Tabela 1).
Tabela 1. Prospecção fitoquímica do extrato alcoólico de T. fasciculatus
Composto Presença (+) ou Ausência (-)
Alcaloides (-) Antraquinonas (-)
Cumarinas (+) Taninos (+)
Saponinas (+) Esteróides (+)
Flavonóides (+)
123
Atividade das enzimas de metabolismo antioxidante e determinação de malondialdeído
(MDA)
Os resultados da atividade das enzimas de metabolismo antioxidante, SOD e CAT, e
determinação do malandialdeido estão dispostos na Figura 1, 2 e 3, respectivamente. Não
houve alteração na atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) entre
os animais dos grupos tratados e controle. O malondialdeído (MDA), produto da peroxidação
lipídica aumentou no grupo EATF300 em relação aos outros grupos.
Figura 1. Atividade da enzima de metabolismo antioxidantes superóxido dismutase em testículo de
camundongos Swiss adultos expostos a diferentes concentrações de EATF. SOD = Superóxido Dismutase,
EATF = extrato alcoólico de T. fasciculatus nas concentrações 100, 200 e 300mg/kg. Letras diferentes nas
colunas, entre tratamentos, diferem significativamente entre si (p ≤ 0,05).
Figura 2. Atividade da enzima de metabolismo antioxidante catalase em testículo de camundongos Swiss adultos
expostos a diferentes concentrações de EATF. CAT = catalase, EATF = extrato alcoólico de T. fasciculatus nas
concentrações 100, 200 e 300mg/kg. Letras diferentes nas colunas, entre tratamentos, diferem significativamente
entre si (p ≤ 0,05).
124
Figura 3. Determinação do malandialdeido em testículo de camundongos Swiss adultos expostos a diferentes
concentrações de EATF. MDA = Malondialdeído, EATF = extrato alcoólico de T. fasciculatus nas concentrações
100, 200 e 300mg/kg. Letras diferentes nas colunas, entre tratamentos, diferem significativamente entre si (p ≤
0,05).
As enzimas SOD e CAT convertem enzimaticamente o radical superóxido (O2-*) em peróxido
de hidrogênio (H2O2) (DROGE, 2002), enquanto a CAT é responsável pela decomposição de
H2O2 em H2O e O2 (AEBI, 1984). O estresse oxidativo surge quando as células não
conseguem destruir adequadamente o excesso de radicais livres formados, resultado do
desequilíbrio entre formação e neutralização de espécies reativas de oxigênio e espécies
reativas de nitrogênio (ROS/RNS). Esses radicais livres em excesso podem danificar as
membranas celulares e as lipoproteínas por um processo chamado peroxidação lipídica.
Possivelmente, a peroxidação lipídica nas células testiculares, marcadas pelo aumento de
MDA, esteja relacionada com o excesso de metabólitos secundários no EATF 300, o que
pode ter sido responsável pelas alterações qualiquantitativas observadas em dados prévios do
presente estudo. Diante de tal situação, é preciso salientar que, as saponinas, taninos,
flavonoides e alcaloides são os principais responsáveis pelos efeitos tóxicos das plantas
(CANSIAN 2014), sendo os três primeiros metabólitos encontrados no extrato de T.
fasciculatus. Conforme Halliwell e Chirico (1993), a determinação do MDA tem atraído
interesse por oferecer um meio de avaliar a peroxidação lipídica em membranas biológicas.
O aumento de MDA demonstra que possivelmente, SOD e CAT atuaram, mas não foram
efetivas o suficiente para proteger as células testiculares contra a formação de ROS.
CONCLUSÕES
Findados todos os testes com o tratamento com extrato alcoólico do cipó-cravo, T.
fasciculatus, observamos que as taxas de atividade enzimática, SOD e CAT, não
demonstraram variações significativas, entretanto, a dosagem de 300mg promoveu
peroxidação lipídica, como comprovado pelos dados de malondialdeído sem, no entanto,
comprometer a produção espermática durante o período de tratamento (dados prévios do
presente estudo). O uso prolongado do produto em altas dosagens pode levar à diminuição da
produção, uma vez que houve danos às membranas plasmáticas. Desta forma, este trabalho
contribuiu para demonstrar o potencial de Tynanthus fasciculatus, corroborando as evidências
para sua indicação como planta afrodisíaca, conforme sua utilização pela população, embora
com certo cuidado nas dosagens, assim como outras espécies do gênero Tynanthus.
125
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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126
Ginseng-brasileiro: ensaios de avaliação físico-química da qualidade de
amostras comerciais
Winner Duque Rodrigues; Elisabeth Maria Lopez de Prado; Rodolfo Moreira Baptista;
Greiciane Gaburro Paneto; Juliana Aparecida Severi
Palavras-Chave: Controle de qualidade, Ginseng-brasileiro, Pfaffia glomerata, Pfaffia paniculata
INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais é uma prática terapêutica milenar que perdura devido à
tradicionalidade e ao baixo custo de aquisição destes recursos quando comparado às
especialidades farmacêuticas convencionais. Além disso, justifica-se devido ao fácil acesso por
serem cultivadas em ambiente doméstico, ou pela comercialização em feiras populares e
ervarias (JUNIOR, 2005). No Brasil, as raízes de Pfaffia glomerata e P. paniculata são
utilizadas em substituição ao Panax ginseng, por demonstrarem propriedades terapêuticas
semelhantes às da espécie asiática. Por isso, são conhecidas popularmente como Ginseng-
brasileiro. O uso das raízes de Pfaffia tornou-se uma panaceia, sendo indicado como tônico e
revigorante geral, no tratamento de fadiga física, esgotamento mental, falta de memória, como
auxiliar no tratamento de distúrbios circulatórios, como antidiabético, anti-inflamatório,
imunoestimulante, dentre outros (GOSMANN et al., 2003; OLIVEIRA; AKISUE, G.;
AKISUE, M. K, 1980). Por se tratar de espécies cultivadas no próprio país, a comercialização
de Fáfias tem sido expressiva no Brasil. P. paniculata já alcançou o maior volume de vendas
na indústria nacional de fitoterápicos há alguns anos atrás (SINDUSFARM, 1995). A maior
parte da comercialização de Ginseng brasileiro é feita em lojas especializadas em plantas
medicinais, sem no entanto, apresentar certificados de análise quanto à qualidade físico-química
destes insumos vegetais (JUNIOR, 2005). Além disso, apesar da importância, ainda não há
nenhuma monografia farmacopeica para o controle de qualidade do Ginseng brasileiro
(RATES; GOSMANN, 2002) e escassas são as investigações científicas publicadas na
literatura. De acordo com Vigo (2004), a inexistência de especificações botânicas oficiais para
diferenciar as espécies de Fáfias, bem como de parâmetros físico-químicos oficiais de análise
para este produto, têm inviabilizado o controle de qualidade dos lotes e levado à
comercialização de uma espécie vegetal por outra, caracterizando uma situação de confusão
entre as plantas e até mesmo de fraude, o que pode colocar em risco a saúde da população.
Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a qualidade físico-química de 60
amostras comercializadas como Ginseng brasileiro.
METODOLOGIA
Amostras de referência de P. glomerata e P. paniculata foram obtidas junto ao
CPQBA/UNICAMP-SP. Em seguida, 60 amostras comercializadas como Ginseng-brasileiro
foram adquiridas de estabelecimentos especializados do mercado brasileiro. Os ensaios de
controle de qualidade foram conduzidos de acordo com as especificações gerais da Farmacopeia
Brasileira (BRASIL, 2010). Alíquotas foram devidamente pesadas e depositadas sobre papel
branco, em ambiente iluminado para avaliação dos caracteres organolépticos (aspecto, cor e
127
odor). A análise da pureza foi feita incialmente por meio da pesquisa de matéria estranha a olho
nu e com auxílio de lente de aumento quando necessário. Cada amostra foi analisada e separada,
onde a porcentagem de elementos estranhos não deveria ser superior a 2% (p/p). Na
determinação do teor de umidade foi transferido 2 g de cada amostra para o pesa-filtro tarado e
dessecado. Em seguida, as amostras foram dessecadas a 100-105ºC até adquirirem peso
constante para cálculo do percentual de umidade no material vegetal. A determinação de teor
de cinzas totais foi feita a partir de 3 g das amostras pulverizadas, transferidas para cadinhos
previamente tarados e incineradas gradativamente até 600 ± 25ºC. Após resfriar no dessecador,
seguiu para cálculo da porcentagem de cinzas totais em relação à droga seca ao ar. Para
determinação de cinzas insolúveis em ácido, o resíduo do teste anterior foi fervido durante
5minutos com 25 mL de ácido clorídrico a 7% (p/v) em cadinho tampado. Recolheu-se o
resíduo insolúvel sobre papel de filtro, onde o mesmo foi incinerado a 500ºC até peso constante
para cálculo da porcentagem de cinzas insolúveis em ácido em relação à droga seca ao ar. Na
determinação de cinzas sulfatadas, pesou-se separadamente 1g das amostras e transferiu-se para
cadinhos previamente calcinados, em que as alíquotas foram umedecidas com ácido sulfúrico
concentrado e carbonizadas(aquecimento gradativo até 800ºC). A avaliação química foi feita
por meio da combinação de cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC). Para isso, alíquotas de 5 g das amostras de referência e comerciais
foram igualmente submetidas à extração por maceração, utilizando-se a mistura água/metanol
(80:20, v/v) como líquido extrator. A mistura foi mantida em repouso, ao abrigo da luz e calor
durante um período de 48 horas. Após, a mistura foi filtrada em papel de filtro qualitativo
(Nalgon®) e o resíduo vegetal foi remacerado por mais 2 vezes. As três soluções extrativas
resultantes foram combinadas e concentradas a 40º C em rotaevaporador (Heidolph®, laborota
4000), acoplado com uma bomba a vácuo (Prismatec®, modelo 121). Para secagem completa,
os extratos foram liofilizados (Liotop®, L101), transferidos para frascos de vidro e
armazenados ao abrigo de luz, calor e umidade. Em seguida, os extratos foram
convenientemente solubilizados a 10 mg/mL em álcool etílico comercial 96º GL e aplicados
sobre cromatoplacas de sílica gel 60G (0,22 µm, F254, Macherey-Nagel), com auxílio de
capilar de vidro. Após preparação das cromatoplacas, realizou-se a otimização da fase móvel
com diferentes combinações de solventes orgânicos e água, a fim de evidenciar
preferencialmente o marcador β-ecdisona, considerado marcador para o controle de qualidade
das raízes de Pfaffia. O sistema foi mantido em câmara de saturação com os solventes n-butanol,
acetato de etila, ácido fórmico e água (4:1:0,6:0,5, v/v/v/v) e a eluição foi feita no modo
ascendente, unidirecional. Após eluição, as placas foram secas em capela de exaustão e
nebulizadas com anisaldeído sulfúrico, com posterior aquecimento em chapa a 100º C até o
aparecimento de cor nas bandas. Após revelação, as placas foram secas em capela de exaustão
e analisadas sobre luz visível e luz ultravioleta de 254 e 360 nm (Boitton,BOIT-LUB01). Todas
as cromatoplacas foram fotografadas com a finalidade de determinar o Fator de Retenção (Rf)
das principais bandas identificadas. Para o doseamento do marcador β-ecdisona, alíquotas de
40 mg dos extratos secos de todas as amostras foram igualmente submetidas ao procedimento
de extração em fase sólida (SPE), utilizando cartuchos de octadecilsilano (Chromabond, 3
mL/500 mg, 45 µm, 60 Å), previamente ativados com metanol (3 mL), condicionados (3 mL)
e posteriormente eluídos (2 mL) com metanol/água 90:10 (v/v). As soluções resultantes foram
filtradas em membranas de politetrafluoroetileno (PTFE) (Flowsupply, 0,45 µm, 13 mm),
acondicionadas em vials de borossilicato tipo I (Analítica, 2 mL, tampa rosqueável, 9 mm d.i.
da boca, polipropileno c/septo de PTFE/silicone) e injetadas (5 µL) no Cromatógrafo líquido
Waters Acquity H. A separação foi realizada em coluna analítica Waters ACQUITY (C18, 1,7
µm, 2,1 x 5 0mm). Como fase móvel utilizou-se acetonitrila (J. T. Baker) e água ultrapura
128
(purificador Thermo Scientific Easypure II, acoplado ao purificador por osmose reversa Tecnal
TE-4007-20), ambos acidificados com 0,05% de ácido trifluoracético (Sigma-Aldrich) e
previamente filtrados em membrana Waters GHP (0,2 µm, 47 mm). A condição de eluição foi
ajustada a partir do método validado por Serra e colaboradores (2012). Monitorou-se a
separação a 242 nm. O padrão de β-ecdisterona (Sigma, 93% de pureza) foi utilizado como
marcador analítico e utilizado para construção da curva de calibração (50-300 µg/mL) na etapa
de estudo quantitativo.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na avaliação organoléptica observou-se heterogeneidade das amostras, já que apenas 28,3%
apresentaram aspecto, cor e odor semelhantes ao controle. Para a pesquisa de material estranho,
retirou-se todo o elemento pertencente a outra natureza que não fosse de origem vegetal, como
insetos, fungos e outras partes não relacionadas ao farmacógeno (raízes). Neste ensaio 5% das
amostras demonstraram teor de matéria estranha acima de 2%. O teor de umidade entre as
amostras mostrou-se também diversificado, pois em 31 amostras o valor encontrado estava
entre 0,1% e 0,5%, o que é semelhante aos achados de P. paniculata e P. glomerata (0,4% e
0,5%, respectivamente). As demais amostras obtiveram teor superior a 0,5%, sendo que em 6
amostras o teor foi 10 vezes maior que o encontrado nos controles. Portanto, o excesso de
umidade encontrado em parte das amostras comerciais pode colocar comprometer a integridade
química da droga vegetal, propiciando o crescimento de bactérias, fungos e também a ação de
enzimas, acarretando na degradação dos princípios ativos presentes(VON HERTWIG, 1991;
CORREA, 1994; MATOS, 2000).Quando determinado o teor de cinzas totais, 16 amostras
continham níveis iguais ou menor que 4,0% e 23 amostras tiveram teor inferior a 2,0%. Apenas
8 amostras obtiveram a mesma proporção de cinzas totais que a P. paniculata e P. glomerata
(5,9% e 4,5%, respectivamente). As demais apresentaram níveis superiores, chegando a valores
superiores a 8% de cinzas totais. Nesta determinação, se leva em conta as cinzas fisiológicas e
não fisiológicas, ou seja, produtos formados pela degradação térmica dos constituintes
orgânicos do material e os inorgânicos (CECCHI, 1999).Diferente das cinzas totais, a
determinação das cinzas insolúveis é importante para a verificação de adição de material
mineral nas amostras, como por exemplo, sujidades. Nesta análise 62,2% das amostras tiveram
cinzas insolúveis maior que a P. glomerata e P. paniculata, sendo 0,05% e 0,1%
respectivamente. Destas, 59,4% das amostras tiveram teor 20 vezes superior ao dos materiais
de referência. Esta análise visa determinar óxidos, sulfatos, cloretos, fosfatos e silicatos
(CECCHI, 1999). Por se tratar de uma análise feita com raízes, a higienização das amostras
durante o processamento do material deve ser ainda mais cautelosa devido a grade quantidade
de terra que pode ser encontrada se não bem higienizados. Neste trabalho 11 amostras revelaram
teor de cinzas sulfatadas inferior a 2%, como em P. paniculata (1,10%) e P. glomerata (2,0%).
O teor nas demais amostras mostrou-se variado, por serem de locais diferentes. Esse panorama
já era esperado, visto que, pela falta de padronização, o processamento das amostras ocorre de
maneira diferente entre os produtores rurais. Desta forma, 22 amostras tiveram teores de 2% a
4% de cinzas sulfatadas, 13 amostras de 4% a 8% e 14 com níveis superiores a 8%,chegando a
13,3%.Constatando assim, uma heterogeneidade entre as amostras. A análise por CCD das
amostras de referência utilizadas neste estudo mostraram a presença de banda verde de Rf ~0,7
o que confirma a presença do marcador β-ecdisona em P. glomerata, e sua ausência em P.
paniculata. Quando comparado com o perfil cromatográfico das amostras comerciais, verifica-
se a mesma bandado marcador em boa parte das amostras, o que sugere a identidade de P.
129
glomerata nestas amostras comerciais. No entanto, comparando a região de Rf 0,5-0,3 das
amostras comerciais e de referência, verifica-se a presença de bandas de colorações e Rfs
distintos das amostras de referência, o que novamente sugere que pode ser devido a variações
no metabolismo secundário vegetal, variações nas condições de processamento da droga
vegetal, ou mesmo se tratar de adulteração. Por fim, as análises por HPLC-UV revelaram que
51% dos produtos comercializados como Ginseng-brasileiro exibiram cromatogramas similares
ao de P. glomerata, enquanto cerca de 25% das amostras eram similares à P. paniculata. O
restante das amostras comerciais (24%) forneceu cromatogramas incompatíveis com os das
amostras de referência. Os resultados da CCD mostraram ausência do marcador na maior parte
das amostras comerciais, o que corrobora com os achados anteriores de má qualidade dos
produtos avaliados. Além disso, mostra a heterogeneidade química das amostras que são
comercializadas como ginseng-brasileiro. Para a quantificação de β-ecdisona nas amostras,
construiu-se uma curva analítica a partir da determinação das áreas dos picos do padrão em
função da sua concentração conhecida injetada no sistema cromatográfico. A partir destes dados
plotados em planilha do Microsoft Excel®, realizou-se a regressão linear, obtendo-se uma
equação do tipo y = 6964,9x –395363, cujo coeficiente de correlação (r²) foi 0,9995. Estas
análises revelaram uma variação de 0,08 a 2,67% no teor deste marcador nas amostras
comerciais analisadas. Nas amostras de referência o teor do marcador foi de 1,66% em P.
glomerata e 0,82% P. paniculata. Um estudo de controle de qualidade feito por TOBIAS, et al.
(2007), analisou drogas vegetais oriundas de farmácias de manipulação de Maringá-PR, onde
contatou-se que as amostras discriminadas Pfaffia paniculata foram quimicamente
correspondente a P. glomerata quando co-eluídas com material de referência botanicamente
identificado, e ainda os laudos das drogas vegetais traziam a informação de que estavam
conforme a farmacopeia brasileira, o que já verificado a ausência de qualquer espécie deste
gênero no compêndio oficial (RATES & GOSMANN, 2002).
Figura 1:Cromatogramas registrados por HPLC-UV das amostras de referência de P. paniculata(A), de P.
glomerata (B) e do marcador (C) β-ecdisona.
Dentre os dados apresentados, é possível notar que, a maioria das amostras comerciais
analisadas (65,3%) não obteve nem a metade do teor da amostra referência de P. glomerata,
que foi de 1,66%. Além disso, 5 amostras comerciais investigadas possuíam teores acima de
2%. Essas variações podem ser devido à variabilidade no metabolismo vegetal causada por
fatores bióticos e/ou abióticos das populações coletadas; às condições de coleta, de
processamento e/ou armazenamento do material. Ou podem também ser oriundas de fraude
e/ou substituição equivocada de uma espécie por outra, como a mistura com drogas vegetais de
130
menor valor agregado, evidenciando assim, problemas quanto à qualidade destas drogas
vegetais comerciais (VIGO et al., 2004; GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Um estudo de
controle de qualidade feito por Tobias e colaboradores (2007) analisou drogas vegetais oriundas
de farmácias de manipulação do sul do país e constatou-se que as amostras discriminadas como
P. paniculata foram quimicamente correspondente a P. glomerata quando co-eluídas com
material de referência botanicamente identificado, e ainda os laudos das drogas vegetais traziam
a informação de que estavam conforme a farmacopeia brasileira, o que já verificado a ausência
de qualquer espécie deste gênero no compêndio oficial (RATES & GOSMANN, 2002). Santos
e colaboradores (1987) também ao realizarem a análise de amostras de ginseng, verificaram
que apenas 30% das amostras estavam de acordo com o declarado na embalagem original, as
demais havia contaminação com outros vegetais. Alguns trabalhos propuseram a determinação
do teor de β-ecdisona em P. glomerata, porém nenhum abrange as amostras comerciais
(KAMADA et al., 2006; ZIMMER et al., 2006; FLORES et al., 2009; SERRA; FELIPE;
CORTEZ, 2012; FELIPE et al., 2014).
CONCLUSÕES
Com base no exposto, verificou-se a qualidade inadequada das amostras que estão sendo
comercializadas como Ginseng brasileiro a partir dos ensaios de controle de qualidade
realizados. Isso pode levar à prejuízos na saúde da população ou mesmo ineficácia terapêutica
pretendida com o seu uso. Pesquisas nesta natureza também são úteis para a compreensão dos
desvios de qualidade ocorrentes no Ginseng-brasileiro e poderão contribuir com a elaboração
de novos métodos oficiais de análise.
AGRADECIMENTOS
CNPq, Fapes e UFES
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132
Óleos essenciais das folhas de Eugenia uniflora e Myrciaria cauliflora:
composição química e efeito antileishmania
Rodolfo Moreira Baptista; Winner Duque Rodrigues; Juliana Aparecida Severi; Elisabeth
Maria Lopez de Prado; Laisa Savergnini Poleze; Lilian dos Santos Rebonato; Marcos Santos
Zanini
Palavras-Chave: Óleo essencial, Leishmania, Jabuticabeira, Pitangueira
INTRODUÇÃO
A leishmaniose é uma doença parasitária transmitida pela picada do mosquito vetor
flebotomíneo, conhecido como “mosquito palha” ou “cangalhinha”, infectado por protozoários
do gênero Leishmania. A contaminação do mosquito se dá através do contato do sangue de
pessoas e animais que apresentam a doença, onde o inseto passa a contaminar seres humanos e
outros animais sadios. A leishmaniose e classificada em dois grandes grupos: a leishmaniose
tegumentar ou cutânea, causada por Leishmania mexicana, L. brasiliensis e L. tropica e a
leishmaniose visceral (LV), conhecida popularmente como “calazar”, ocasionada por
protozoários como L. chagasi, espécie encontrada no Brasil (FOGANHOLI e ZAPPA, 2011).
Nas regiões do país a LV vem atingindo uma maior amplitude, apresentando números de casos
em humanos e elevados casos em cães nas áreas urbanas. Portanto, o ciclo de transmissão não
ocorre somente no setor rural atualmente, mas em regiões urbanizadas, classificando o cão
doméstico como principal reservatório do protozoário (SILVA, 2001). O tratamento da doença
e baseado em fármacos antimoniais e a anfotericina B. No entanto, os mesmos apresentam
efeitos colaterais que oferecem alto risco a do paciente, por seu efeito tóxico ao coração e ao
fígado, por exemplo, o que resulta na interrupção do tratamento do indivíduo infectado, em sua
maioria. Além disso, estudos vem demonstrando resistência do parasito a esses fármacos. Logo,
os estudos a respeito de alternativas de tratamentos mais eficazes para a leishmaniose se
revelam de extrema necessidade (PELISSARI et al., 2011). Os óleos essenciais são misturas de
substancias voláteis presentes em plantas como a Myrciaria cauliflora (Jabuticabeira) e
Eugenia uniflora (Pitangueira) adquirido por meio da hidrodestilação ou expressão do pericarpo
de frutas cítricas (CASCAES et al., 2015). Alguns óleos já estudados comprovaram atividade
antiprotozoária. Logo, a caracterização química e atividade antiprotozoária dos óleos das folhas
de pitangueira e jabuticabeira frente aos protozoários do gênero Leishmania torna se promissora
(UEDA-NAKAMURA, 2006). Os óleos essenciais das folhas da Jabuticabeira e Pitangueira,
mesmo já estudados por técnicas cromatográficas convencionais, a ação antileishmania frente
a L. chagasi, foi pouco avaliada. Portanto, a bioprospeccao de novos agentes com atividade
antileishmania a partir dos óleos essenciais de M. cauliflora e E. uniflora se justifica como uma
abordagem oportuna e inovadora, uma vez que estudos de mesma natureza são inexistentes na
literatura até o momento e poderão proporcionar a descoberta de novos compostos bioativos.
METODOLOGIA
A coleta das folhas se deu pelo método manual. As espécies E. Uniflora e M. cauliflora foram
selecionadas em Alegre-ES. Para obtenção de uma amostra representativa, as folhas foram
133
coletadas em diversos pontos de ambas as espécies. Após a coleta, os materiais foram pesados
e devidamente limpos em água corrente. Em seguida, foram transferidos para balões de
destilação e submetidos a extração por hidrodestilação, utilizando aparato do tipo Clevenger.
Após a extração, os óleos foram recolhidos do extrator e armazenados sob refrigeração até o
momento da avaliação antileishmania. A caracterização química dos óleos foi realizada em
cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massas (GC/MS). A caracterização química
dos óleos foi realizada em cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massas (GC/MS)
Shimadzu QP-PLUS-2010. Utilizou-se coluna capilar de sílica fundida Rtx-5MS (30 m x 0,25
mm de diâmetro x 0,25 μm de espessura do filme) e hélio (0,8 mL/min) como gás de arraste. A
temperatura do injetor e detector foram 220ºC e 300ºC, respectivamente. Injetou-se cada uma
das amostras no modo splitless (5 μL). Aqueceu-se a coluna inicialmente a 60o C, com aumento
de 3º C/min, até 240o C. A identificação dos picos foi feita por comparação com a biblioteca
disponível no equipamento, juntamente com os dados dos espectros de massas, com o cálculo
do de Kovats (relativo a uma mistura padrão de hidrocarbonetos de C9-C26, Sigma) e
comparação com a literatura (Moura et al, 2018; Borges et al., 2014). Para avaliação in vitro do
efeito antileishmania dos óleos, os protozoários foram transferidos para tubos de vidro com
capacidade para 15 mL e incorporados ao meio de cultura Schneider’s Inseet Medium Sigma®
sob as formas promastigotas. Uma alíquota de 2,4 g do meio liofilizado foi adicionada em 100
mL de água destilada, sob agitação, além de 0,04 g de bicarbonato de sódio e 1N de NaOH para
estabilizar o pH do meio em aproximadamente 9,0. Após 10 minutos, adicionou se ácido
clorídrico (HCl) 1 N até pH 7,0. Em seguida, foi acrescentado 5 mL de cloreto de cálcio a 1,2%,
sob constante observação e correção de oscilações no pH. A suplementação do meio foi
efetuada com 15% de Soro Fetal Bovino e antibiótico (200UI de Penicilina e 200 μg de
Estreptomicina por mL de meio de cultura). Posteriormente, as culturas foram mantidas em
estufa B.O.D, na temperatura de 25°C, até a fase estacionaria, por volta de 107 parasitas/mL.
Além disso, todos os tubos receberam adição de 2 mL de meio de cultura a cada 2 dias. A
medida com que a concentração de Leishmania e o volume foram aumentando, as amostras
passaram por alíquotas para novos tubos estéreis de vidro, totalizando em média 5 passagens e
ao final 10 tubos contendo de 5 a 10mL cada, sob mesma condição. As concentrações dos óleos
essenciais se deram por diluições de 200, 100 e 50 μg/mL, em triplicata. O controle foi realizado
com os mesmos parâmetros utilizados para o tratamento, porém sem aplicação dos óleos. As
amostras cultivadas foram transferidas para tubo cônico de 50 mL e centrifugadas a 3000
rotações por minuto, durante 10 minutos, para posterior ressuspensão da massa sedimentada no
meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI) estéril. Após, foram redistribuídos em novos tubos
de vidro. Foi estabelecido para os tubos controles e os tubos em tratamento o volume final de 5
mL, de forma que o volume fosse o suficiente para manter a integridade da amostra em relação
aos nutrientes e saturação do meio de cultura. Concomitante a isso, foi preparada uma solução
mãe contendo 50 mL de meio de cultura BHI estéril, onde foi adicionado o óleo essencial
testado (solução mãe de 400 μg/mL). Na contagem dos protozoários foi usado 19 μL da cultura
e 1 μL de solução de formol 5%, ou seja, uma diluição de 1:20, homogeneizados em microtubos
de 1,5 mL. A partir disso, foram adicionados 10 μL em hemocitometro (Camara de Neubauer).
Em cada amostra os protozoários foram contabilizados por contador manual, nos quatro
quadrados das extremidades, além do quadrante central. O mesmo processo foi repetido no
segundo compartimento. Foi feito a média simples da contagem dos dois espaços, sendo que a
diferença entre um espaço e outro não variou mais de 10%. O valor do parasito encontrado foi
aplicado a formula de conversão da câmara, adquirindo se assim o total de células/mL de
cultura. Para estipular a concentração de protozoários foram executadas várias contagens, como
relatado acima, que se iniciaram no momento 0 horas, sendo essa a primeira contagem e
134
correspondente ao momento após homogeneização e redistribuição das culturas. Logo, espera-
se que no momento 0 horas todas as culturas apresentem a mesma concentração. A partir da
contagem em 0 horas foram realizadas outras duas contagens, sendo elas 24 horas e 48 horas
após a primeira contagem, respectivamente. O número final de protozoários contados na câmara
por amostra foi realizado por meio de média simples das análises em triplicata. Os dados obtidos
foram aplicados ao pacote estatístico GraphPad Prism 6.0 (Graph Prism Inc., San Diego,
California), determinou-se os valores de IC50 para cada tratamento. O teste de normalidade de
Kolmogorov-Smirnov foi conduzido para testar a hipótese nula de que os dados são amostrados
a partir de uma distribuição gaussiana assim como o teste de F para testar a homogeneidade de
variâncias. Quando os dados não se desviaram da distribuição gaussiana (p >0,05) e
apresentaram homogeneidade de variâncias eles foram analisados pelo teste de T de Student
Indepedente. Quando os dados não se
desviaram da distribuição gaussiana (p >0,05) mas apresentaram heterogeneidade de variâncias
eles foram analisados pelo teste de T de Student Indepedente com correção de Welch. Todos
os testes foram realizados em um nível de significância de 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A coleta das folhas resultou em um rendimento de extração dos óleos essenciais em 0,015%
(p/v) e 0,005% (p/v) para as folhas de E. uniflora e M. cauliflora, respectivamente. Com relação
a caracterização química feita por CG/MS, os principais picos presentes em ambos os
cromatogramas (Figura 1) dos óleos estudados foram tabulados quanto ao tempo de retenção e
abundancia relativa (porcentagem na amostra), conforme tabelas 1 e 2.
Figura 1. Perfis cromatográficos dos óleos essenciais das folhas de E. uniflora (A) e M. cauliflora (B) por GC/MS.
Fonte: O autor.
Tabela 1. Composição química do óleo essencial das folhas de M. cauliflora registrado por GC/MS e obtido
utilizando aparato do tipo Clevenger. Fonte: O autor.
Pico
Tempo de
retenção
(min)
Composto
Identificado*
% na
amostra
Pico
Tempo de
retenção
(min)
Composto
Identificado*
% na
Amostra
1 8,75 α-pineno 3,18 24 34,48 β-selineno 5,93
2 10,57 beta-pineno 2,08 25 34,89 α-selineno 7,42
3 11,76 undecano 0,77 26 35,16 β-elemeno 0,90
4 13,05 d-limoneno 0,54 27 35,25 β-patchouleno 0,15
5 13,17 1,8-cineol 2,52 28 35,53 -cadineno 1,35
6 14,09 cis-ortocimeno 0,68 29 35,94 -cadineno 2,55
7 16,60 l-linalool 0,67 30 36,24 α-cubebeno 0,44
135
8 20,96 α-terpineol 1,07 33 38,35 espatulenol 13,57
9 27,81 delta-elemeno 1,31 34 38,72 guaiol 3,04
10 29,46 α-copaeno 2,20 35 39,13 viridiflorol 4,06
11 29,89 beta-
bourboneno 0,21 36 39,39
óxido de
cariofileno 2,31
12 30,28 germacreno-A 0,63 37 39,54 junipercanfor 0,89
13 31,02 α-gurjuneno 0,92 38 39,69 epiglubulol 0,70
14 31,67 trans-
cariofileno 15,08 39 39,92 rosifoliol 1,33
15 31,88 germacreno 0,54 40 40,86 torreiol 0,55
16 32,00 calareno 0,45 41 41,20 junipeno 1,99
17 32,31 aromadendreno 2,99 42 41,32 valerenol 0,80
18 32,48 α-guaieno 0,38 43 41,80 ledeno 1,21
19 32,95 α-humuleno 3,56 44 42,12 cembreno 1,17
20 33,25 allo-
aromadendreno 2,16 46 44,90 valenceno 0,31
21 33,59 α-amorfeno 0,63 47 52,19 ácido
pentadecanóico 0,51
22 33,95 -selineno 0,88 48 56,85 neo-ftadieno 2,37
23 34,20 germacreno-D 3,02 * De acordo com a consulta às bibliotecas NIST, Wiley e dados da literatura: Adams
Tabela 2. Composição química do óleo essencial das folhas de E. uniflora registrado por GC/MS e obtido
utilizando aparato do tipo Clevenger.
Pico
Tempo de
retenção
(min)
Composto
Identificado*
% na
amostra Pico
Tempo de
retenção
(min)
Composto
Identificado*
% na
Amostra
1 5,83 2-hexenal 0,33 16 34,15 germacreno-D 3,30
2 7,44 nonano 0,58 17 34,35 β-selineno 1,44
3 11,39 beta-mirceno 2,35 18 34,88 β-humuleno 7,72
4 11,77 decano 0,83 19 35,21 β-elemeno 3,86
5 13,66 cis-cimeno 3,07 20 35,63 -gurjuneno 0,49
6 14,19 1,3,6-octatrieno 5,33 21 35,93 -cadineno 1,28
7 16,59 α-terpinoleno 0,58 22 37,43 -elemeno 10,38
8 27,82 -elemeno 1,94 23 38,36 β-humuleno 1,04
9 30,36 β-elemeno 5,80 24 38,74 guaiol 2,43
10 31,02 α-gurjuneno 0,77 25 40,65 curzerene 21,41
11 31,43 trans-cariofileno 2,69 26 41,21 ledeno 1,36
12 32,09 germacreno B 1,98 27 42,78 germacrona 3,10
13 32,26 neo-allo-ocimeno 1,21 28 43,19 espatulenol 0,73
14 33,20 α-amorfeno 1,43 29 44,79 valenceno 10,75
15 33,92 -selineno 1,81 * De acordo com a consulta às bibliotecas NIST, Wiley e dados da literatura: Adams
A avaliação do efeito antileishmania dos óleos baseou-se na observação da redução da
concentração de protozoários nos meios frente a três diferentes concentrações testadas (200,
136
100 e 50 µg/mL) de cada óleo, monitorados após 24 e 48 horas de tratamento (Tabelas 3 e 4).
Estes ensaios; demonstraram que a maior eficácia antiparasitária dos dois óleos foi observada
na concentração de 200 µL, em relação às demais concentrações testadas. Também demonstrou
que a maior redução percentual de protozoários foi encontrada no óleo de E. uniflora (55,55%).
Além disso, por meio da ferramenta Excel 2013, foi encontrado para cada concentração testada
uma equação polinominal pela qual foram obtidos os valores de IC50 de cada tratamento, em
relação às suas respectivas amostras controle (Tabela 5). Neste caso, o IC50 do óleo de M.
cauliflora mostrou-se numericamente reduzido (85,62 µg/mL), o que sugere maior eficácia
antiparasitária (Tabela 5).
Tabela 3. Média ± EPM para as diferentes concentrações, por mL de parasito durante as 24 e 48 horas de avalição
leishmanicida do óleo essencial de Eugenia uniflora*.
Concentração
do óleo
essencial
Concentração de Protozoários (107)
0 horas 24 horas Teste-t Valor de p 48 horas Teste-t Valor de p
Controle 530 539,7±4,33 - - 593,70±3,61 - -
200 µg/ mL 530 298,0±2,65 47,60 <0,0001 264,0±2,08 24,02 0,0014
100 µg/ mL 530 380,0±4,93 24,32 <0,0001 327,0±1,15 19,58 0,0024
50 µg/ mL 530 554,7±1,86 2,85 0,1001 501,0±3,05 7,29 0,0019 *A comparação estatística foi realizada utilizando-se o Teste-t student indepentente. Valores menores que 0,05
demonstram diferença significativa do controle com relação aos diferentes momentos (24 e 48h).
Tabela 4. Média ± EPM para as diferentes concentrações, por mL de parasito durante as 24 e 48 horas de avalição
leishmanicida do óleo essencial de Myrciaria cauliflora*.
Concentração
do óleo
essencial
Concentração de Protozoários (107)
0 horas 24 horas Teste-t Valor de p 48 horas Teste- t Valor de p
Controle 530 539,7±4,33 - - 594,0±3,61 - -
200 µg/ mL 530 304,0±1,0 77,51 <0,0001 269,0±14,98 17,04 <0,0001
100 µg/ mL 530 446,0±2,52 33,66 <0,0001 289,7±1,2 70,03 <0,0001
50 µg/ mL 530 485,0±4,58 18,69 <0,0001 362,0±2,65 40,35 <0,0001 *A comparação estatística foi realizada utilizando-se o Teste-t student indepentente. Valores menores que 0,05
demonstram diferença significativa do controle com relação aos diferentes momentos (24 e 48h).
Tabela 5. Percentual de redução da concentração de parasito para diferentes concentrações de óleos essenciais de
Eugenia uniflora e Myrciaria cauliflora após 24 e 48 horas.
Tempo de
ensaio
Concentração do
óleo essencial E. uniflora IC50 (µg/mL) M. cauliflora IC50 (µg/mL)
24 horas
200 µg/mL 44,81%
235,58
43,70%
229,96 100 µg/mL 29,63% 17,41%
50 µg/mL 7,41% 10,37%
48 horas
200 µg/mL 55,55%
154,75
54,71%
85,62 100 µg/mL 45,05% 51,35%
50 µg/mL 6,73% 39,05%
A espécie M. cauliflora apresentou menor resultado de achados literários a respeito de relatos
leishmanicidas, sendo encontrado, em sua maioria, relacionados apenas ao gênero. O trans-β-
cariofileno e espatulenol revelaram se como constituintes de maior proporção no óleo essencial
137
de M. cauliflora. O primeiro possui atividade leishmanicida demonstrada em estudos de Soares
et al. (2013) frente às culturas de Leishmania amazonensis. O espatulenol foi encontrado em
outros óleos essenciais com ação antileishmania. Porém, sua atividade frente ao protozoário
ainda não foi confirmada pela literatura quando testado isoladamente (COSSOLOSSO, 2013).
Quanto ao óleo essencial de E. uniflora, o curzerene demonstrou maior proporção na amostra.
Em estudos de Rodrigues e colaboradores (2013), também verificou ação contra cepas de
Leishmania amazonensis em macrófagos tratadas com o óleo, relacionando uma diminuição
dos macrófagos infectados pelo protozoário e aumento da atividade das células fagocíticas. De
forma semelhante Sarges et al. (2017) obteve 57% e 59% de inibição das formas promastigotas
do gênero Leishmania para concentrações de 50 e 100 µg/mL, respectivamente, além de IC50
de 117,35 µg/mL após 96 horas de tratamento com um composto isolado
(Dimethylxanthoxylin). Segundo Braga et al. (2007), em extratos metanólicos de partes secas
de E. uniflora o coeficiente de inibição em 50% (IC50) foi obtido em concentrações superiores
a 250 µg/mL depois de 72 horas de tratamento, também sob formas promastigotas de L.
chagasi, o que pode indicar maior aplicabilidade do óleo essencial quando comparado ao
extrato metanólico. Além do mais, em estudos de Rodrigues et al. (2013) o óleo essencial de
pitangueira apresentou absoluta inibição do crescimento de formas promastigostas também de
L. amazonensis sob as concentrações de 400, 200 e 100 µg/mL. Santos et al. (2013) avaliaram
a atividade leishmanicida de óleos essenciais de E. uniflora sob formas promastigotas de L.
braziliensis e concluiram que este demonstrou-se ativo em concentrações acima de 500 µg/mL,
com inibição superior a 50% sob a concentrações de 100 µg/mL, o que evidencia o potencial
leishmanicida da pitangueira para diferentes espécies de Leishmania sp., corroborando com os
resultados deste estudo.
CONCLUSÕES
Com base nos resultados apresentados neste projeto verificou-se o potencial notável dos óleos
essenciais de E. uniflora e M. cauliflora para a descoberta de novos compostos bioativos frente
às cepas de Leishmania chagasi, causadora da leishmaniose visceral.
AGRADECIMENTOS
Fundação de Amparo a Pesquisa e Inovação do Espírito Santo (FAPES), Universidade Federal
do Espírito Santo – Centro de Ciências Exatas Naturais e da Saúde (UFES-CCENS) e o
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ)
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Pesquisa da estabilidade física preliminar em creme com e sem ureia
Carlos Marchiorio Lacerda; Maria Paula Debona Vieira; Daniele Ewald Do Nascimento;
Matheus Pimentel Chiconeli; Natan Silva Matos; Nubya Nascimento Costa; Kamila Areas
Bastos; Mikaela Vieira Beloni; Juliana Augusto Da Silva Nali; Janaina Cecilia Oliveira
Villanova
Palavras-chave: desenvolvimento farmacotécnico, alterações, estabilidade física
INTRODUÇÃO
A indústria de cosméticos apresenta crescimento vertiginoso e desenvolver produtos voltados
para o cuidado pessoal e a beleza, se torna uma atividade cada vez mais promissora. Segundo a
revista Veja, em matéria publicada em 2018, a preocupação com a estética e a beleza experimenta
aumento significativo na sociedade moderna (BARBADOBULOS, 2018). Entre as formas
farmacêuticas empregadas no preparo de produtos de cuidados pessoais, se destacam os cremes
e loções, sistemas emulsionados usados nas formulações de produtos de uso facial, corporal e de
cabelo. Cremes podem ser definidos como sistemas emulsionados, compostos de uma fase oleosa
e uma aquosa, estabilizadas por emulsificantes, de consistência mole e toque macio, nos quais
podem ser incorporadas substâncias emolientes e umectantes, que atuarão, entre outras
finalidades, como hidratantes (OLIVEIRA, 2009; GARBOSSA, CAMPOS e MERCÚRIO,
2014). Diferentes tipos de instabilidades podem ocorrer em produtos farmacêuticos, sendo
ocasionadas por diversas influencias do meio externo como temperatura, a umidade, a luz,
oxigênio e estresse mecânico. Além disso, fatores intrínsecos também estão relacionados a
instabilidade que ocorre nessas formulações, como, separação de fase, precipitação,
cristalização, entre outras, por esse motivo se faz necessário o controle de qualidade das
formulações preparadas (BRASIL, 2004). Nos cremes, os principais problemas de instabilidade
observados são a agregação, a cremagem ou formação de nata e a coalescência (ALLEN,
POPOVICH, ANSEL, 2013). No entanto, não existem parâmetros oficiais, pré-estabelecidos,
para o desenvolvimento farmacotécnico de cremes para uso cosmético e, cada empresa, deve
estabelecer seus protocolos, que devem ser rígidos e contemplarem a avaliação da qualidade e
da estabilidade das formulações, a fim de garantir a segurança, eficácia e qualidade do produto
até o fim do prazo de validade. Com o intuito de estabelecer normas a serem atendidas pelas
indústrias cosméticas, com vistas a favorecer a comercialização dos seus produtos no Mercosul,
a Agência Nacional de Vigilância Sanitária coordenou o desenvolvimento do “Guia de
Estabilidade de Produtos Cosméticos” e do "Guia de controle de qualidade de produtos
cosméticos – uma abordagem sobre os ensaios físicos e químicos. Em ambos, são elencados
ensaios organolépticos, físico-químicos e químicos, a serem realizados em formas farmacêuticas
cosméticas, para avaliação da qualidade das mesmas. Outro objetivo dos guias é fornecer
subsídios e as diretrizes para a realização dos estudos de estabilidade de produtos cosméticos
(BRASIL, 2004; BRASIL, 2007). Neste contexto, o objetivo do presente trabalho proposto com
o objetivo de preparar duas formulações de creme não-iônico, empregando a cera
autoemulsionante Polawax®, com e sem a adição de ureia (2% p/p), que foram submetidas a
análises descritas nos guias. Amostras das formulações armazenadas em condições ambiente e
sob refrigeração (4º C) foram avaliadas nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, mediante a realização de
ensaios de espalhabilidade, texturometria, determinação da emulsão e avaliação das
características organolépticas.
140
METODOLOGIA
Todas as etapas do trabalho foram realizadas no Laboratório de Produção Farmacêutica do curso
de Farmácia do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde da UFES. Foi proposta a formulação de um creme-base não-iônico, no qual a ureia foi posteriormente incorporada na
proporção de 2% p/p. A descrição quantitativa e qualitativa das preparações, denominadas CB1 e CB2, é dada na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição qualitativa e quantitativa das formulações e função dos componentes.
Preparo das formulações
Todos os componentes foram pesados individualmente em balança analítica (MARTE, modelo
AY220). As fases foram levadas ao aquecimento em chapa aquecedora (NOVA ÉTICA, modelo
208D). Ao atingir a temperatura de 70º C, verteu-se a fase aquosa na oleosa e, com auxílio de
um misturador vertical (Black & Decker) as fases foram agitadas até completo resfriamento e
formação da emulsão. Foram preparados 500 g de creme-base. Em 250 g, a ureia previamente
triturada em gral, foi incorporada, mediante trituração, até total ausência de grumos. As
formulações foram acondicionadas em potes opacos, com tampas herméticas e armazenados em
condições ambientes e sob refrigeração.
Determinação do tipo de emulsão
Para observação da formação da emulsão, a presença de gotículas foi pesquisada com auxílio de
microscópio óptico (OPTON, modelo TNB-01B-INF). A determinação do tipo de emulsão
formada foi feita empregando duas metodologias: 1. pelo método de diluição, para o qual pesou-
se 1,0 g do creme-base, que foi colocado em becker, adicionando-se água purificada na proporção
1:1. Depois de homogeneizada a mistura, observou-se a ocorrência ou não de separação de fases;
2. pelo método de coloração com azul de metileno, no qual foi adicionado, sobre 1,0 g de amostra,
colocada em vidro relógio, 2 gotas de uma solução aquosa de azul de metileno (2% p/v). Após
mistura, observou-se a presença ou ausência de gotículas do corante visualmente.
Descrição e avaliação sensorial
141
A descrição foi realizada a olho nu, para verificação da aparência do produto acabado, sendo
observada a cor, a homogeneidade da cor, a presença de brilho ou opacidade, e, a consistência.
Foi pesquisado também, após espalhamento de uma pequena quantidade sobre a pele, a presença
de grumos, o toque (macio, pegajoso, seco, molhado, oleoso), a capacidade de espalhamento, a
formação de cor.
Pesquisa de alterações e estabilidade preliminar
Para pesquisa da estabilidade preliminar, foram estudados nas formulações, os seguintes
parâmetros: pH, espalhabilidade, consistência por texturometria e estabilidade frente ao estresse
térmico e mecânico. As análises foram feitas nos dias 0, 30, 60 e 90. Para determinação do
potencial de hidrogênio, pesou-se 1,0 g da amostra em Becker e procedeu-se sua diluição com
água isenta de CO2 (1:10). O pH foi determinado pelo método de imersão direta do eletrodo na
amostra utilizando aparelho de bancada (DIGIMED, modelo DM22). A espalhabilidade foi
pesquisada pelo método das placas paralelas. O teste foi realizado pesando-se 0,15 g de cada
amostra, que foi depositada no centro de uma placa de vidro, colocada sobre um papel
milimetrado. Em seguida, colocou-se, cuidadosamente, outra placa de vidro do mesmo tamanho
e peso conhecido, sobre a amostra, registrando o diâmetro da circunferência formada pela
amostra. O procedimento foi repetido com outras 9 placas. Os diâmetros foram anotados
individualmente e, a partir destes, o índice de espalhabilidade foi calculado pela Equação 1, onde:
Ei representa a espalhabilidade da amostra (mm²); D = diâmetro circunferência da amostra (mm);
= 3,14.
(Equação 1)
Os parâmetros de coesividade, consistência e firmeza das formulações foram pesquisadas em
texturômetro (BROOKFIELD, modelo CT3), conforme método adaptado de Tai e colaboradores
(2014). As análises foram realizadas no modo compressão em ciclo único, mediante a medida da
resistência à penetração e remoção de uma sonda tipo cilindro acrílico com 2,54 cm de diâmetro
e sensibilidade de força de 10 g. A sonda foi inseria na amostra com uma profundidade de 30
mm com alvo a 8 mm e a uma velocidade de 2 mm.s-1 em temperatura ambiente (25ºC). Foram
obtidos gráficos da força máxima do primeiro ciclo, que representa a força necessária para
comprimir a amostra (força de compressão). O teste de estresse mecânico foi realizado pesando-
se 5,0 g das formulações, que foram colocadas em tubos Falcon e submetidas à centrifugação
(centrífuga BL 320H, modelo 80-2B), sob diferentes ciclos de velocidade (1000, 2500 e 3500
rpm), com duração de 15 minutos cada. Para o teste de estresse térmico, pesou-se 5,0 g das
amostras que foram colocadas em tubos Falcon. Estes foram colocados em banho-maria
(MARCONI, modelo N1040) e submetidos a aquecimento às temperaturas de 40º, 50º, 55º e 60º
C, durante 15 minutos em cada ciclo. Em ambos os casos foi verificada a existência de alterações
nas amostras, quando submetidas às diferentes condições do estudo.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Nos testes para pesquisa do tipo de emulsão formada, observou-se que a homogeneidade na
distribuição do corante e a ausência de separação de fases após diluição da amostra em água,
indicam que o sistema de emulsão formado foi do óleo em água (O/A), ou seja, a fase interna
oleosa dispersou-se na externa, aquosa. Tal achado está de acordo com a literatura, uma vez que
o Polawax® forma emulsões deste tipo (ZANIN et al., 2001; LOPES et al., 2018). A imagem
142
obtida pela microscopia óptica mostra a formação de um sistema no qual houve a formação de
gotículas de uma fase dispersa em outra, o que é característico de sistemas emulsionados. Imagem
dos testes para pesquisa do tipo de emulsão formada e da avaliação microscópica são dadas na
Figura 1.
Figura 1- Imagem representativa das amostras durante os testes de determinação do tipo de emulsão formada, pelo
método do corante (A), da diluição (B) e análise por microscopia óptica (C). Fonte: O autor.
Segundo Allen, Ansel e Popovich (2013), é possível detectar a presença de instabilidades nas
formulações através da percepção de alterações físicas no aspecto, cor e odor das formulações.
O creme-base obtido apresentou cor branco-leitosa, aspecto brilhante, com coloração
homogênea, sem grumos. A adição de ureia originou um produto opaco, sem alterar os demais
parâmetros. Bases preparadas com Polawax® apresentam um bom sensorial, com toque seco,
boa aderência à pele, com formação de fina camada de produto sobre o local de aplicação
(BRASIL, 2010a; BRASIL, 2012b). Na Tabela 2 são apresentados os resultados observados na
avaliação sensorial dos produtos. Na análise dos produtos sobre a pele, cabe destacar que, as
amostras armazenadas sob refrigeração se mostraram mais duras, nos tempos analisados, com
aumento na capacidade de cobertura. A adição de ureia diminuiu a capacidade de cobertura do
creme-base e tornou-o mais pegajoso ao toque.
Tabela 2- Características das formulações
143
A cera Polawax® é uma cera auto-emulsionante não iônica, pouco afetada pelo calor e que
suporta variações de pH entre 2 e 11. O pH das amostras do creme-base (CB1) variou entre 4,4
(T0) e 5,2 (T90), não havendo influência da condição de armazenagem. No entanto, na
formulação contendo ureia (CB2), o pH passou de 4,5 (T0) para 7,06 (T90), na amostra
armazenada nas condições ambientais. Para a amostra armazenada sob refrigeração, o valor do
pH após 90 dias, foi próximo de 5,9. Tais resultados sugerem que a condição de armazenagem
pode influenciar na estabilidade da formulação. Souza e Ferreira (2010) preparam um creme
contendo Polawax® (11% p/p) e o pH encontrado para a formulação foi de cerca de 5,6 a 5,8,
sem variação ao longo do estudo, durante 60 dias. Após este prazo, o valor do pH de todas as
amostras começou a diminuir, nas duas condições avaliadas. Em casos nos quais ocorre variação
do pH em formulações contendo ureia, ensaios de estabilidade devem ser realizados (CATEC,
2005). Na Figura 2 são apresentados, graficamente, o índice de espalhabilidade das amostras em
função do tempo de armazenagem e na Tabela 3, são apresentados os dados obtidos no ensaio de
textura.
Figura 2- Variação da espalhabilidade ao longo do tempo de armazenagem.
Tabela 3- Resultado dos parâmetros obtidos no teste de textura.
A espalhabilidade de formas farmacêuticas cosméticas sobre a pele é um fator importante para a
aceitação de produtos de uso tópico, que devem apresentar características sensoriais agradáveis,
144
para os consumidores, proporcionando o bem-estar e a continuidade do uso (SHIRATA,
CAMPOS, 2016). A análise da espalhabilidade pelo método das pacas paralelas mostra que, no
T0, houve uma diminuição deste parâmetro com a adição de ureia no creme-base, o que pode ser
corroborado pelos resultados encontrados na texturometria: a incorporação do fármaco aumentou
a consistência do produto, o que se refletiu em uma maior dureza e maior adesão para CB2,
quando comparado a CB1. Ainda, foi possível observar que nas amostras armazenadas sob
refrigeração, a espalhabilidade das amostras diminuiu em função do tempo de estudo. No que diz
respeito aos ensaios de estresse, foram observadas alterações nas amostras, em todos os tempos
de análise, quando estas foram submetidas às temperaturas de 55 e 60o C. Já é bem estabelecido
na literatura que emulsões podem permanecer perfeitamente estáveis entre 40 e 45º C, passando
a sofrerem alterações em temperaturas superiores a 50º C (CADWALLADER, 1989; IDSON,
1993). Nenhuma amostra sofreu alteração depois de submetidas ao estresse mecânico. Tais
achados estão de acordo com aqueles observados por Friedcrich e colaboradores (2007), Barzotto
e colaboradores (2009) e, Borghetti e Knorst (2006).
CONCLUSÕES
As análises dos resultados sugerem que, ao longo do tempo, as formulações mantidas em
condições ambientes sofreram alterações de pH. Por outro lado, naquelas mantidas sob
refrigeração, ocorreram alterações na consistência e na espalhabilidade do produto. Estes
resultados mostram que as condições de armazenamento influenciaram nos parâmetros de
qualidade dos produtos. A presença de alterações, indicativas de problemas de instabilidade, pode
ser corretamente acompanhada ao longo do tempo, empregando os ensaios preconizados nos
guidelines da ANVISA, sendo que os testes preconizados foram de fácil execução.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à UFES, FAPES, CNPq pela concessão de bolsas e, à CAPES (modalidade
de financiamento – 001).
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146
Preparo de xampu contendo digluconato de clorexidina para uso veterinário
Renato A. Brambati; Sthefany B. Salomão; Nubya N. Costa; Elder O. Caetano; Bruna Canzian
Guarino; Carlos M. Lacerda; Maria Paula D. Vieira; Thaís Martins da Silva; Janaina C. O.
Villanova
Palavras-Chave: Antisséptico, produtos de higiene, uso veterinário
INTRODUÇÃO
O xampu é um produto de higiene desenvolvido a partir de substâncias tensoativas, que são
responsáveis por promover a limpeza da pele e dos pelos, eliminando suor, poeira, micro-
organismos, dentre outros tipos de sujidades. Além de limpar, os xampus são destinados ao
embelezamento dos animais, fornecendo brilho e maleabilidade aos pelos(FARIA et al., 2012;
MAPA, 2016).Os Xampus podem ser apresentados sob diferentes formas farmacêuticas, tais
como solução, gel ou até mesmo em pó e têm, como componente principal da formulação, um
ou mais tensoativos, que são os agentes responsáveis pela lavagem (AMIRALIAN,
FERNANDES, 2018). Quando acrescidos de determinadas substâncias, os xampus são
denominados medicamentosos e, além de limpar, podem apresentar outras atividades, como a
antisséptica. Substâncias ativas como o cetoconazol, irgasan, triclosan e gluconato de
clorexidina, são exemplos de antimicrobianos usualmente utilizados em xampus de uso
veterinário, com vistas à obtenção de atividade terapêutica ou profilática. Entre estas, se destaca
o gluconato de clorexidina, um antimicrobiano persistente, com rápida ação contra uma vasta
variedade de bactérias Gram positivas e negativas como: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
intermedius, Proteus vulgaris e Pseudomonas aeruginosa (BERTI et al., 2007;SABA-CHUJFI
et al., 1998; MONFRIN; RIBEIRO, 2000). Segundo Carvalho e colaboradores (2018), ainda não
existe regulamento a ser seguido no que diz respeito à avaliação da qualidade dos xampus
destinados ao uso veterinário, ficando a critério dos fabricantes a definição dos padrões bem
como da composição qualitativa e quantitativas das formulações a serem comercializadas,
assegurando que os componentes utilizados não interfiram na fisiologia da pele do animal,
evitando alergias e reações tóxicas. O objetivo do presente trabalho foi realizar o
desenvolvimento farmacotécnico de um xampu antisséptico, destinado ao uso veterinário,
contendo gluconato de clorexidina. Depois de preparado, parâmetros de qualidade do xampu
foram avaliados, a saber, aspecto, pH, viscosidade aparente, densidade relativa, sedimentação e
formação de espuma.
METODOLOGIA
Todas as etapas do presente trabalho foram realizadas no Laboratório de Produção Farmacêutica
do curso de Farmácia do Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde, da Universidade
Federal do Espírito Santo. A formulação foi preparada em pequena escala, tendo sido manipulado
o volume final de 500 mL.
Preparo do xampu
147
Para o preparo da formulação, todos os componentes foram pesados, separadamente, em balança
analítica (Marte, modelo AUY220). O metilparabeno e o propilparabeno foram solubilizados em
propilenoglicol, sob leve aquecimento, em seguida foi adicionado o polímero Jr e a solução
germal 115. O EDTA, previamente solubilizado em quantidade suficiente de água, foi
incorporado a esta mistura. O Plantarem®1200 e a lanolina etoxilada foram aquecidos,
separadamente, para fusão e foram vertidos na fase anterior, agitando lentamente. Em seguida, o
Plantarem®2000, o Tween®80, o Glucan®E 20 e o Glutamate® doe, foram adicionados uma a
um, sob homogeneização lenta. O gluconato de clorexidina foi acrescentado e o volume foi
completado com água purificada. Por fim, essência Dove foi adicionada na formulação. O pH da
formulação foi corrigido com uma solução de ácido cítrico a 20%para o valor de entre 6,0 a 6,5.
A composição qualitativa e quantitativa da formulação é dada na Tabela 1.
Tabela 1- Descrição qualitativa e quantitativa da formulação do xampu. Fonte: O autor.
Componente Proporção (%p/V) Função
farmacotécnica
EDTA dissódico 0,1 Complexante
Metilparabeno 0,15 Conservante
Propilparabeno 0,05 Conservante
Propilenoglicol 3,0 Cossolvente
Polímero JR 2,0 Espessante
Solução de Germal® 115 0,3 Conservante
Plantarem® 1200 10 Tensoativo
Plantarem® 200 26,0 Tensoativo
Tween® 20 2,0 Tensoativo
Lanolina etoxilada 2,0 Emoliente
Glucan® E 20 3,0 Umectante
Glutamate doe 10,0 Espessante
Gluconato de clorexidina 2,0 Fármaco
Essência Dove q.s Flavorizante
Água purificada q.s.p Veículo
Avaliação preliminar da qualidade da formulação
Após o preparo, foi realizado ensaio organoléptico e análise visual da formulação, para
determinação do aspecto, cor, odor, verificação da presença de matéria sólida ou sujidade, como
descrito na Farmacopeia Brasileira 6ª edição (2019). O pH foi analisado pelo método
potenciométrico, utilizando equipamento digital de bancada (Digimed, modelo DM-22),
mediante inserção do eletrodo diretamente nas amostras, em temperatura ambiente. O
procedimento foi realizado em triplicata, calculando a média e o desvio padrão. A persistência
da formação de espuma foi avaliada a partir do preparo de uma solução do xampu a 1,0% em
água, que foi transferida para proveta de vidro. A proveta foi agitada, girando-a 5 vezes e, o
volume de espuma formado foi anotado. Após 5 minutos de repouso, o volume de espuma foi
anotado novamente. Verificou-se a formação ou não de espuma persistente. A densidade relativa
do xampu foi determinada em triplicata, utilizando picnômetro de vidro, de acordo com a
metodologia descrita no Guia de estabilidade de produtos cosméticos (BRASIL, 2004), sendo
148
calculada pela razão entre as massas, conforme Equação 1, onde: D = densidade relativa; Mo =
massa do picnômetro vazio, em gramas; M1 = massa do picnômetro com a amostra, em gramas;
V = volume declarado no picnômetro em mL.
A viscosidade aparente foi avaliada com a utilização de um viscosímetro rotacional digital
(Brookfield, modelo DV2T), empregando spindle 62 e taxa de cisalhamento de 10 rpm, com
torque maior que 10%. Para a pesquisa de sedimentação e separação de fases, foi realizado o
teste de estresse mecânico, empregando centrífuga (BL 320H, modelo 80-2B). Tubos Falcon
contendo 5 mL de amostra foram submetidos a centrifugação a 3.000 rpm por 30 minutos, em
temperatura ambiente. Ao final do teste a amostra foi analisada macroscopicamente a fim de
avaliar qualquer instabilidade. A análise foi feita em triplicata, sendo calculada a média e o desvio
padrão.
(Equação 1)
A viscosidade aparente foi avaliada com a utilização de um viscosímetro rotacional digital
(Brookfield, modelo DV2T), empregando spindle62 e taxa de cisalhamento de 10 rpm, com
torque maior que 10%. Para a pesquisa de sedimentação e separação de fases, foi realizado o
teste de estresse mecânico, empregando centrífuga (BL 320H, modelo 80-2B). Tubos Falcon
contendo 5 mL de amostra foram submetidos a centrifugação a 3.000 rpm por 30 minutos, em
temperatura ambiente. Ao final do teste a amostra foi analisada macroscopicamente a fim de
avaliar qualquer instabilidade. A análise foi feita em triplicata, sendo calculada a média e o desvio
padrão.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Foi obtido um xampu de cor amarelo claro, com aspecto viscoso, translúcido, onde não foram
notadas a presença de impurezas e sujidades, nem separação de fases. O odor observado foi
característico dos componentes utilizados, especialmente da essência. A coloração natural se deu
pela ausência de corante na preparação, assim como o encontrado por Vieira, Moreira e Frizzo
(2009) em seus estudos, uma vez que há uma tendência a preparar cosméticos isentos de corantes,
potencialmente alergênicos. Durante o teste de espuma, a amostra se apresentou estável com
decaimento lento no volume de espuma formado, indicando uma densidade alta da espuma, que
persistiu. Apesar de muitos consumidores atribuírem, erroneamente, a capacidade de limpeza à
quantidade de espuma formada, tal parâmetro interfere na aceitabilidade do produto
(CARVALHO et al., 2005). Os valores encontrados para pH, densidade e viscosidade podem ser
observado na Tabela 2.
Tabela 2. Valor médio e desvio padrão da determinação do pH e densidade das amostras.
Ph Densidade Viscosidade aparente
Média 6,3 1,013 g/cm3 2348 cP
DP 0,0131 0,0211 -
149
Ferreira (2010) relatou em seus estudo que sabonetes líquidos e xampus tem densidade relativa
entre 1,010 e 1,020 g/cm³, valor condizente com o encontrado no presente estudo, onde a
densidade relativa apresentou valou de 1,013 g/cm³. Estudos mostram que o valor do pH é um
fator importante quando se trata de formulações utilizadas na pele dos animais, uma vez que
formulações com pH considerados baixos, entre 3 e 4, podem afetar a fisiologia da pele e causar
reações alérgicas aos animais, por isso é recomendado o uso de xampus com finalidade cosmética
ou terapêutica com valor de pH ligeiramente ácido ou neutro, dentro da faixa de 5,5 e 7,7
(DLUJNEWSKY; JAVIER, 2014; MAKINO et al., 2014). Além disto o pH alcalino reduz a
atividade antimicrobiana (WELLER, 2005). O valor obtido durante o ensaio está de acordo com
as recomendações e o observado por Mattos e Lima (2015) que encontraram em seu estudo
valores de pH entre 6,1 e 7,7 em xampus contendo clorexidina. A viscosidade do xampu está
diretamente relacionada com o escoamento do produto durante o envase, cabendo a cada
fabricante estabelecer uma faixa de viscosidade adequada para seus produtos, levando em
consideração a preferência de seus consumidores por uma viscosidade maior ou menor no
momento da aplicação, bem como a permanência do produto. Oliveira e colaboradores (2013)
pesquisaram a viscosidade de diferentes xampus disponíveis no mercado e observaram durante
seu estudo que a maioria das amostras por eles avaliadas apresentaram viscosidade entre 2000 e
5000 cP, quando utilizado o método de viscosidade pelo método copo Ford, valor semelhante ao
encontrado neste estudo. Contudo não existe especificações a serem seguidas para a
determinação da viscosidade de formas farmacêuticas, uma vez que inúmeros fatores afetam a
viscosidade do produto final, inclusive, o tipo de equipamento utilizado e os parâmetros dos
testes. O teste de centrifugação é um ensaio realizado com a finalidade de avalição da
estabilidade, sendo possível determinar o comportamento de uma formulação em condições
extrema, tal ensaio permite avaliar a necessidade de alteração de componentes do produto. Após
o teste a amostra permaneceu estável não havendo separação de fases, grumos, sedimentação de
partículas ou formação de caking, todavia a não ocorrência de separação de fases somente
garante que o produto pode ser submetido a esse teste, não garantindo a estabilidade do produto.
CONCLUSÕES
Os resultados dos testes realizados demonstraram que o xampu obtido apresentou parâmetros de
qualidade aceitáveis. No entanto, para e que a formulação proposta seja padronizada para o
preparo em escala magistral, ensaios de estabilidade de prateleira e a longo prazo devem ser
realizados.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à UFES, FAPES, CNPq pela concessão de bolsas e, à CAPES (modalidade de financiamento – 001).
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Taxa de detecção de sífilis adquirida em cidade universitária do sul do espírito
santo supera em 290% a média nacional
Sara L. L. Pollastrelli; Elisa S. P Coelho; Matheus P. Chiconeli; Lucas C. D. Rezende; Heberth
de Paula; Klesia P. Madeira
Palavras-Chave: Alegre, Taxa de detecção, Sífilis
INTRODUÇÃO
A sífilis é uma Infecção Sexualmente Transmissível (IST) causada pela bactéria Treponema
pallidum em forma de espiroqueta, e tem como principal via de transmissão o contato sexual,
seguido pela transmissão vertical para o feto durante o período de gestação de uma mãe com
sífilis não tratada ou tratada inadequadamente. No Brasil, nos últimos cinco anos, foi observado
um aumento constante no número de casos de sífilis. No ano de 2016, foram notificados 87.593
casos de sífilis adquirida, sendo desses, 3.494 casos no estado do Espírito Santo (ES),
representando uma taxa de detecção de 85,2 casos para cada 100.000 habitantes, comparada a
uma taxa nacional de 42,5 casos para cada 100.000 habitantes. Vale salientar que o ES possui a
2ª maior taxa de detecção de sífilis adquirida e a 3ª maior de sífilis na gestação no cenário
nacional. O município de Alegre- ES, que não possui dados epidemiológicos de sífilis adquirida
e gestacional, está localizado ao sul do ES, fica a 50 km da divisa com Minas Gerais e a 60 km
da divisa com o Rio de Janeiro, e possui uma população estimada em 30.768 pessoas (BRASIL,
2010). Destes, um pouco mais de 18.000 residem na sede, e os demais em 7 distritos: Araraí,
Café, Rive, Celina, Santa Angélica, Anutiba e São João do Norte. O município se destaca nas
atividades agropecuárias, referentes ao setor primário. Um fato que merece destaque é que Alegre
torna-se aporte de três instituições de Ensino, duas Federais e uma Autarquia Municipal, a citar:
um campus do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo (IFES),
um campus da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) e a Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Alegre (FAFIA).A presença dos estudantes destes estabelecimentos de
ensino confere à vida noturna de Alegre um aspecto movimentado e festivo, pois ocupam até
tarde as praças e os diversos bares da cidade. Além disso, muitos estudantes são de outros
municípios ou estados, e precisam se alojar na cidade durante o período de formação escolar e
acadêmica.
METODOLOGIA
Considerando que o ES é o 2º estado com maior taxa de detecção da Sífilis adquirida e o 3º estado
com maior taxa de incidência de sífilis em gestantes, que Alegre é uma cidade onde instalam-se
estudantes de outros municípios e Estados do País e que há subnotificação dos casos da doença
no município, o objetivo do trabalho é fazer um levantamento do número de casos de sífilis
adquirida e gestacional diagnosticados pelo SUS no município de Alegre. Com autorização da
Secretaria municipal de Saúde, está sendo feito o levantamento do número de casos dos anos de
2016 a 2018, juntamente com a enfermeira responsável pelo Centro de Testagem e
Aconselhamento de Infecções Sexualmente Transmissíveis/Aids (CTA). Nessa análise de
registros, quem os acessa é exclusivamente a responsável pelo setor, que repassa as informações
à equipe, respeitando o sigilo dos pacientes. Nesse setor ocorre a realização dos testes rápidos
imunocromatográficosde sífilis por meio do kit Alere Sífilis (Abott). Todos os pacientes que
apresentam resultado positivo no teste rápido são encaminhados para fazer o VDRL no
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laboratório da Casa de Caridade São José, onde se insere o Laboratório de Análises Clínicas que
faz os exames pelo SUS. Uma vez que o paciente apresente positividade no teste rápido e no
VDRL, é encaminhado para o tratamento.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Até o momento já compilamos os dados referentes ao ano de 2016, que apontam que foram
realizados 1548 testes rápidos de sífilis no CTA neste ano. Desses, 52 foram positivos no teste
rápido e encaminhados para o teste de VDRL no Laboratório de Análises Clínicas do hospital,
onde foram confirmados 42 casos pelo teste de floculação. Desses 42 casos, 4 eram em gestantes.
Nesse cenário, considerando os pacientes atendidos pelo SUS, podemos estimar que a taxa de
detecção da sífilis adquirida em Alegre no ano de 2016 foi de 123,5 casos para cada 100.000
habitantes. Analisando esse dado e fazendo um paralelo com os dados estaduais e nacionais,
percebe-se que as taxas de incidência por 100 mil habitantes no Brasil, no ES e em Alegre são
de 42,5; 85,2 e 123,5 casos respectivamente, evidenciando no município uma taxa de detecção2,9
vezes maior que a taxa nacional e 1,4 vezes maior que a taxa Estadual (SESA, 2018). No que
tange à taxa de incidência de sífilis em gestantes, a do município é de 12,1 casos por 1.000
nascidos vivos. Ao compararmos essa taxa municipal com a nacional, que é de 12,4/1.000
nascidos vivos, observamos uma similaridade de padrão, diferentemente do que se observa na
taxa Estadual, que é de 19,3/1000 nascidos vivos (BRASIL, 2017).Segundo a Organização Pan
- Americana de Saúde, a taxa de incidência que significaria eliminação da doença seria de
0,5/1.000 nascidos vivos, cenário bem distante da realidade capixaba.
CONCLUSÕES
Esses dados apontam a discrepância dos dados de Alegre frente aos estaduais e nacionais no que
tange à sífilis adquirida. Conclui-se que, na cidade de Alegre, a taxa de incidência de sífilis
adquirida é extremamente elevada e supera a taxa estadual em 140% e a nacional em 290%,
cenário que urge pela implementação de atividades de orientação para a população, buscando
esclarecer e informar sobre essa IST, que possui rápido diagnóstico, tratamento simples e
gratuito.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Secretaria Municipal de Saúde de Alegre que autorizou o levantamento
epidemiológico dos casos de Sífilis e a Enfermeira Elisa, responsável pelo CTA de Alegre, que
colaborou para a coleta dos dados.
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