Universidade Estadual de Campinas

Instituto de Física “Gleb Wataghin”

Vitor Bianchin Pelegati

Microscopias Ópticas de Processos

Coerentes

Campinas

2016

Vitor Bianchin Pelegati

Microscopias Ópticas de Processos Coerentes

Tese apresentada ao Instituto de Física “Gleb

Wataghin” da Universidade Estadual de Campinas

como parte dos requisitos exigidos para a obtenção

do título de Doutor em Ciências

Orientador: Carlos Lenz Cesar

Este exemplar corresponde à versão final de tese

defendida pelo aluno Vitor Bianchin Pelegati e

orientada pelo Prof. Dr. Carlos Lenz Cesar.

Campinas

2016

Agradecimentos

Especialmente ao Prof. Lenz pela oportunidade e orientação.

A todos do grupo de biofotônica e do Infabic, Hernandes, André, Mariana, Diogo, Javier,

Ariane, Wagner e Gislaine.

À Dayana e ao Henrique pelo enorme apoio.

Ao Bernardo pela contribuição com a automação da varredura, e ao Rodrigo pela ajuda com

informações biológicas sobre os tecidos.

À Juliete, à Hanan, e ao Danilo pelo auxílio com amostras biológicas.

Resumo

Técnicas de microscopias ópticas são as principais ferramentas capazes de observar

células e tecidos biológicos em tempo real e com mínimo dano. Essa área foi revolucionada

recentemente através das microscopias confocais de varredura a laser e as microscopias de óptica não

linear, naturalmente confocais. Entre os processos não lineares temos, a fluorescência excitada por

dois ou mais fótons, geração de segundo harmônico [Second Harmonic Generation - SHG] e terceiro

harmônico [Third Harmonic Generation - THG]. SHG e THG são técnicas de óptica não linear coerentes,

não necessitam de marcadores exógenos e permitem reconstrução de imagens em três dimensões

com resolução espacial subcelular.

As técnicas de fluorescência permitem visualizar estruturas específicas no espaço, mas

não permitem discriminar as substâncias químicas nas estruturas celulares, e as técnicas de SHG e THG

não possuem especificidade química. Espectroscopia Raman possui especificidade química através das

propriedades vibracionais das moléculas e pode ser usada como mecanismo de contraste na aquisição

de imagens. Comparada com a espectroscopia/microscopia infravermelho, a microscopia Raman traz

a informação das vibrações moleculares do infravermelho para o visível, eliminando os problemas da

baixa resolução espacial e opacidade das amostras. Entretanto a baixa sensibilidade dessa técnica

implica em tempos de aquisição de imagens muito longos, da ordem de horas, inviabilizando

acompanhar a dinâmica de processos celulares em tempo real. Como solução para essa baixa

sensibilidade do espalhamento Raman espontâneo, surgiu a microscopia por espalhamento Raman

Coerente anti-Stokes [Coherent Anti-Stokes Raman Scattering - CARS]. Comparado com Raman

espontâneo, a microscopia CARS representa aumento de 4 a 5 ordens de grandeza na sensitividade da

técnica, diminuindo os tempos de aquisição ao ponto de viabilizar a aquisição em taxas de vídeos (mais

rápido do que 30 quadros por segundo) e estudos em tempo real.

Essa tese é dedicada ao estudo experimental e teórico, assim como de algumas

aplicações, das técnicas de óptica não linear, com destaque para processos de óptica não linear

coerentes. Apresentamos de forma detalhada três sistemas experimentais para a aquisição de imagens

de Raman coerente e um sistema integrado com várias técnicas de óptica não linear. Mostramos as

primeiras imagens de CARS realizadas no Brasil. Além do CARS convencional, trabalhamos com outra

técnica de CARS de ordem mais alta, o CARS cascata [cascade CARS - CCARS], e, no melhor do nosso

conhecimento, apresentamos as primeiras imagens internacionais obtidas com essa metodologia.

CCARS aumenta o contraste da técnica CARS, diminuindo o fundo não ressonante, um problema que

aflige a comunidade científica dedicada ao uso dessa técnica. Além da diminuição do fundo não

ressonante, a emissão do CCARS acontece em um comprimento de onda diferente de qualquer outro

efeito não linear coerente, significando um acréscimo de complexidade mínimo para sua detecção

quando comparado com o CARS.

Por último mostramos algumas aplicações realizadas com o sistema experimental

desenvolvido para integrar diversas modalidades ópticas em paralelo, especialmente da geração de

harmônicos com a fluorescência excitada por dois fótons e suas variantes, como microscopia de tempo

de vida de fluorescência [Fluorescence Lifetime Imaging – FLIM].

Abstract

Optical microscopies techniques are the main tools capable of observing cell and

biological tissues in real time and with minimum damage. This area have recently been revolutionized

by confocal laser scanning microscopies and non-linear microscopies, naturally confocal. Among the

non-linear process we have, the two or more photons excited fluorescence, second harmonic

generation [SHG] and third harmonic generation [THG]. SHG and THG are coherent nonlinear

techniques, they do not require exogenous markers and allow three dimension imaging reconstruction

with subcellular resolution.

The fluorescence techniques allow visualizing specific structures in space, but do not allow

discriminating the chemical substances in cellular structures, SHG and THG techniques do not have

chemical specificity. Raman spectroscopy has chemical specificity through the vibrational properties

of the molecules and can be used as a contrast mechanism for imaging acquisition. Compared to

infrared spectroscopy/microscopy, Raman microscopy brings information about molecular vibration

from infrared to visible, eliminating the low resolution and sample opacity problems. However, this

technique low sensibility implies in very long imaging acquisition times, order of hours, making it not

viable for following cellular process dynamics in real time. As an answer for the spontaneous Raman

scattering low sensibility, the coherent anti-Stokes Raman scattering [CARS] emerged. Compared to

spontaneous Raman, CARS microscopy presents an increase of 4 to 5 orders of magnitude in the

sensitivity of the technique, lowering the acquisition times to the point of making video acquisition

(faster than 30 frames per second) and real time studies possible.

This thesis is dedicated to the experimental and theoretical study, as well as some

applications, of the non-linear techniques, with emphasis on coherent non-linear optical processes.

We present in detailed form three experimental systems for the acquisition of coherent Raman images,

and a system with the integration of various non-linear techniques. We show the first CARS images

acquired in Brazil. In addition to conventional CARS, we worked with other higher order CARS

technique, the cascade CARS [CCARS], and, in the best of our knowledge, we present the first

international image acquired with this methodology. CCARS increases the contrast from CARS

technique, decreasing the non-resonant background, a problem that afflicts the scientific community

dedicated to the use of this technique. Besides the decrease of the non-resonant background, the

CCARS emission occurs in a different wavelength from any other non-linear coherent effect, meaning

a minimum complexity increase for its detection when compared with CARS.

Finally we show some applications performed with the experimental system developed

to integrate several optical modalities in parallel, especially the generation of harmonics with two

photons excitation fluorescence and their variants such as Fluorescence Lifetime Imaging [FLIM].

Sumário Capítulo 1 .................................................................................................................................. 12

Introdução ................................................................................................................................ 12

Capítulo 2 .................................................................................................................................. 27

Teoria ........................................................................................................................................ 27

2.1 - Fundamentos de Óptica ............................................................................................................ 27

2.2 - Introduções do eletromagnetismo e suas expansões............................................................... 40

2.3 - Cálculos de (2) e

(3) com modelo clássico .......................................................................... 54

2.4 - CARS .......................................................................................................................................... 63

2.5 - CARS por mistura de seis ondas ................................................................................................ 66

2.6 - Limiar de detecção para as duas técnicas ................................................................................. 69

2.7 - Conclusão .................................................................................................................................. 75

Capítulo 3 .................................................................................................................................. 76

Sistemas Experimentais para aquisição de imagens. ............................................................... 76

3.1 - Sistemas de Lasers .................................................................................................................... 84

3.1.1 - Osciladores Paramétricos Ópticos e Laser de Ti:Safira ...................................................... 84

3.1.2 - Amplificador Regenerativo e OPA ...................................................................................... 89

3.1.3 - Spirit NOPA SHG e bombeio Spirit 1040 ............................................................................ 96

3.2 - Sistema de Varredura e Microscópios .................................................................................... 101

3.2.1 - FV300 e IX-81 da Olympus ............................................................................................... 101

3.2.2 - LSM780 e Axio.Observer da Zeiss .................................................................................... 102

3.3 - Detecção ................................................................................................................................. 102

3.3.1 - Fotodiodo e Fotomultiplicadora ...................................................................................... 103

3.3.2 - Monocromador ................................................................................................................ 104

3.3.3 - Detecção de fótons individuais correlacionados no tempo ............................................. 105

3.4 - Alinhamento e sistema experimental CARS ............................................................................ 108

3.5 - Alinhamento e sistema experimental CCARS I ........................................................................ 109

3.6 - Alinhamento e sistema experimental CCARS II ....................................................................... 114

3.7 - Alinhamento e sistema experimental técnicas NLO ............................................................... 116

3.8 - Resumo das montagens e Conclusão ...................................................................................... 118

Capítulo 4 ................................................................................................................................ 119

Resultados .............................................................................................................................. 119

4.1 - Resultados do sistema CARS ................................................................................................... 119

4.2 - Resultados preliminares sistema CCARS I ............................................................................... 126

4.3 - Resultados preliminares sistema CCARS II .............................................................................. 130

4.4 - Imagens CCARS e CARS ........................................................................................................... 131

4.5 - Conclusão ................................................................................................................................ 137

Capítulo 5 ................................................................................................................................ 138

Aplicações biológicas para microscopias de óptica não linear. ............................................. 138

5.1 - Desenvolvimento Embrionário: .............................................................................................. 141

5.2 - Aplicações em cortes histológicos de tecidos biológicos corados com H&E. ......................... 145

5.3 - Conclusão ................................................................................................................................ 158

Capítulo 6 ................................................................................................................................ 159

Conclusões e Perspectivas ...................................................................................................... 159

Referências Bibliográficas ....................................................................................................... 161

12

Capítulo 1

Introdução

Contexto Internacional da Física Biológica: Na opinião de muitos analistas a

próxima revolução científica-tecnológica viria da capacidade do controle da biologia celular e

molecular sem precedentes na história. Essa capacidade abriria a possibilidade para a criação

de vários produtos de biologia sintética e tratamentos médicos inovadores1.

Em Junho de 2016, o Massachusetts Institute of Technology [MIT] publicou um

relatório intitulado “Convergence: The Future of Health”2 onde eles enfatizam a importância

da convergência de várias áreas do conhecimento para a área da saúde. Nele, a convergência

aplicada à área da saúde, ou somente convergência, é explicada como “uma abordagem para

solução de problemas que integra expertise das ciências da vida com física, matemática, e

ciências computacionais, bem como engenharia, para formar estruturas compreensivas para

unir áreas de conhecimento de múltiplos campos...” (tradução nossa). Dessa forma a

convergência vai além de estudos multidisciplinares e é uma mudança cultural na forma como

1 http://www.cimit.org/images/about/MIT-White-Paper-on-Convergence.pdf 2 http://www.convergencerevolution.net/

13

as pesquisas científicas são conduzidas, e que novas integrações devem ser “amplamente

repensadas a fim de capitalizar uma ampla base de conhecimento” (tradução nossa).

Os físicos devem se questionar qual será seu papel na convergência. É de se

esperar que a convergência traga novos desafios de física pura, além de auxiliar os

profissionais da ciência da vida a resolverem seus problemas. O fato de que o prêmio Nobel

de química de 2014 foi concedido a dois físicos e um físico-químico pelo desenvolvimento de

microscopia de fluorescência super-resolvida, reforça a ideia de convergência das áreas do

conhecimento com aplicação nas áreas biológicas. No comunicado à imprensa3 do anúncio na

primeira linha já fica clara a aplicação das técnicas de microscopia óptica para estudos

celulares: “No que ficou conhecido como nanoscopia, cientistas visualizam o caminho de

moléculas individuais dentro de células vivas” (tradução nossa).

Células são as unidades básicas dos organismos vivos, e o seu estudo, Citologia,

pode ser considerado uma das áreas mais importantes das pesquisas biológicas. Entender o

funcionamento das células saudáveis e doentes permite aos pesquisadores desenvolver novas

vacinas, medicamentos mais eficazes, plantas com qualidades melhoradas, etc.

Muito do que se sabe hoje sobre o funcionamento celular vem de técnicas de

biologia molecular e bioquímica4, como western blotting [1] e cromatografia. Essas técnicas

não são aplicadas a uma célula, mas a um conjunto de células, e o que é analisado é a

quantidade de uma substância através de interações químicas. Outras técnicas para análise

bioquímica incluem espectroscopia de massa e ressonância magnética nuclear. Em relação ao

estudo morfológico de tecidos, o chamado padrão ouro da patologia é a coloração por

Hematoxilina e Eosina [H&E], incluindo tecidos de biópsias para avaliação patológica. Esses

tecidos passam por fixação em formalina tamponada e não seria exagero dizer que toda

informação química é perdida durante o processo, ficando somente os resultados estruturais

dos processos químicos celulares.

Importância da Óptica nesse Contexto: Por essas técnicas, os conhecimentos da

composição química e de sua morfologia são mutuamente excludentes. Permitir a observação

de processos celulares nos aspectos bioquímicos e biomecânicos, não destrutivamente, em

3 https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/press.html 4 http://www.imperial.ac.uk/photonics/research/biophotonics/biomedical-applications/cell-biology-studies/

14

tempo real, com resolução subcelular é o grande desafio para entender a bioquímica

mantendo a forma do sistema.

Técnicas de microscopias ópticas são as principais ferramentas capazes de

observar esses processos celulares com mínimo dano biológico. Elas se baseiam na interação

de fótons com a matéria, na qual a informação é transportada através de ondas pouco

destrutivas em profundidades relevantes para biologia celular. A sensibilidade da óptica

permite a detecção de um único fóton, que pode ser devido à fluorescência de uma única

molécula. Uma molécula fluorescente emite a uma taxa de 1 bilhão de fótons por segundo, o

que em uma taxa de emissão constante permite facilmente a observação de eventos em

tempo real e bem abaixo dos tempos típicos de difusão molecular.

Um grande passo proporcionado pelas microscopias ópticas foi através do

princípio da confocalidade. Ele surge como uma solução para um problema comum na

microscopia óptica por fluorescência que é aquisição de imagens em 3 dimensões de amostras

espessas, detectando somente a fluorescência proveniente do foco da objetiva. Na

microscopia confocal, um orifício micrométrico, pinhole, é usado para rejeitar qualquer luz

proveniente de regiões que não estejam no plano focal, sendo possível adquirir imagens em

diferentes profundidades. Os primeiros microscópios confocais adquiriam imagens movendo

a amostra e mantendo o feixe de luz estático. Essa configuração se mostrou incompleta devido

à perda de precisão ao mover a amostra. Nos confocais modernos o feixe de um laser é varrido

sobre a amostra que é mantida estática. Como o pinhole é fixo no espaço é necessário realizar

um descanning antes de passar pelo mesmo. O caminho óptico da fluorescência é o mesmo

do feixe de excitação, garantindo que, ao passar de volta pelos dois espelhos de varredura

(scanning) o feixe de fluorescência se torna colinear com o feixe de excitação. A microscopia

confocal permite a reconstrução em três dimensões de estruturas a partir de imagens em duas

dimensões de diferentes profundidades.

Vantagens da Óptica Não Linear: Além da microscopia confocal surgiram as

microscopias de óptica não linear. Processos não lineares ocorrem na presença de um ou mais

fótons e, para isso, é necessário que esses fótons coincidam no tempo e no espaço, com a

excitação da fluorescência ocorrendo apenas no volume focal. Dessa forma não é necessário

rejeitar luz advinda das camadas acima e abaixo da região focal e as imagens adquiridas com

15

processos não lineares são naturalmente confocais, não necessitando do uso de pinhole. Nos

processos não lineares podemos usar a detecção NDD [Non Descanned Detection]. Além disso,

os processos de óptica não linear não ressonantes, no qual o elétron é excitado para um nível

virtual, é praticamente instantâneo, pois o elétron excitado só permanece no nível virtual pelo

período de tempo dado pelo princípio da incerteza, e será inversamente proporcional a

diferença entre o nível virtual e o nível real mais próximo.

Conseguir efeitos não lineares com lasers contínuos necessitaria de potências altas

demais, o que causaria danos térmicos nas amostras. A utilização de lasers pulsados com

duração de picossegundos ou femtossegundos, conhecidos como pulsos ultracurtos, nos quais

a potência de pico é muito mais alta do que a potência média, facilitou imensamente a

exploração desses efeitos para microscopia. Como exemplo vamos usar um laser com 3W de

potência média pulsado com 100 fs de duração e taxa de repetição de 80 MHz. Nesse caso, a

potência de pico será de 375 kW, impensável para um laser de emissão contínua e que

evaporaria qualquer material a ser analisado, incluindo aço.

Os processos não lineares incluem a fluorescência excitada por dois ou mais

fótons, que tem espectro e direção de emissão igual à fluorescência por um fóton, mas é

naturalmente confocal. Outros processos não lineares aplicáveis à biologia celular são

processos coerentes, que incluem a geração de harmônicos. As microscopias de segundo

harmônico [SHG] e terceiro harmônico [THG] não utilizam marcadores exógenos e permitem

reconstrução de imagens em 3 dimensões com resolução espacial sub-celular,

aproximadamente 300 nm lateral e 500 nm axial. Em amostras animais a microscopia SHG

visualiza a matriz de colágeno, enquanto a microscopia THG visualiza heterogeneidades com

contraste advindo da variação da susceptibilidade de terceira ordem, 3 , que varia por

ordens de grandeza em diferentes materiais.

Como cada emissão não linear coerente é devido a um processo particular que

não ocorre em qualquer estrutura elas não necessitam de marcadores exógenos, por isso são

adequadas para estudo de tecidos in vivo ou de processos celulares, onde a adição de um

marcador significa modificar o meio a ser estudado. A janela mais interessante para os

comprimentos de ondas serem detectados é no visível, onde a maioria dos detectores tem

boa eficiência. Para efeitos multifótons isso significa o uso de lasers no infravermelho, que

16

proporcionam maior penetração em meios espalhadores. Devido a essas características, nos

últimos anos as ferramentas de microscopias de óptica não linear se consolidaram como uma

poderosa fonte de informações para estudos biológicos.

Importância do Raman e suas variantes: Em amostras biológicas sem

autofluorescência, ou que não suportam marcação exógena, a microscopia Raman e

infravermelha podem ser usadas como mecanismo de contraste baseado em propriedades

vibracionais das moléculas. Entretanto, a microscopia infravermelha convencional está

limitada a uma baixa resolução espacial, pois é realizada com grandes comprimentos de onda.

Além disso, todo sistema biológico vivo está imerso em água, que significa uma absorção

muito alta do infravermelho após 2500 nm, onde começam as vibrações do hidrogênio,

tornando as amostras opacas. O Raman traz a informação das vibrações moleculares do

infravermelho para o visível, eliminando os problemas da baixa resolução espacial e opacidade

das amostras. Além disso, a microcopia Raman pode ser utilizada em conjunto com sistemas

confocais de varredura para adquirir imagens com seletividade química. O problema em

utilizar Raman para imagens está em sua baixa sensibilidade, que força a utilização de grande

tempo de aquisição, e é um entrave para aplicação em células e tecidos vivos.

Como solução para a baixa sensibilidade do espalhamento Raman espontâneo,

surge a microscopia por espalhamento Raman Coerente anti-Stokes [CARS] [2]. Comparado

com Raman espontâneo, a microscopia CARS oferece aumento na sensitividade, sem a

necessidade de grandes tempos de aquisição, possibilitando taxas de aquisição necessárias

para criação de vídeos e estudos em tempo real.

No CARS dois campos eletromagnéticos, com frequências s e p , criam um

batimento entre eles, de frequência p s , frequência essa em que há resposta molecular.

Quando esse batimento, em p s , está em ressonância com uma frequência vibracional de

uma molécula do meio, a vibração é forçada de forma ressoante. Essa vibração forçada é

coerente, e gera um sinal forte na frequência 2 p s , que está na frequência anti-Stokes

com relação ao campo p , esse sinal emitido em um comprimento de onda menor (blue-

shifted) do que o campo de frequência p , é o CARS [3], [4].

17

CARS é um efeito de mistura de quatro ondas, a polarização gerada pelas

moléculas é proporcional à susceptibilidade de terceira ordem, 3 , e sua intensidade à

2

3 . A susceptibilidade de terceira ordem, 3

tem componentes ressonantes com níveis

vibracionais moleculares e termos não ressonantes, esses termos não ressonantes não

oferecem informação química sobre o meio [5]. As vibrações não ressonantes não dependem

de qualquer linha Raman e são um obstáculo para aquisição de imagens de CARS. Entre CARS

e Raman há uma troca de sensibilidade por seletividade.

Desde que Zumbusch et al. [2] em 1999 demonstrou imagens de CARS por

varredura em 3D, outras técnicas de Raman coerente utilizadas em espectroscopia, que

apresentam menor sinal não ressonante, foram aplicadas na aquisição de imagens com

seletividade vibracional. Cada uma dessas técnicas traz vantagens particulares, algumas

conseguem suprimir inteiramente o sinal não ressonante, mas suas aplicações apresentam

novas dificuldades e aumento na complexidade dos sistemas de aquisição de imagens.

Vamos citar como exemplo, CARS polarizado [P-CARS] [6], CARS resolvido no

tempo [T-CARS] [7] e microscopia por espalhamento Raman estimulado [SRS] [8]. No CARS

polarizado [P-CARS], escolhendo a polarização de detecção do CARS e, selecionando a

polarização dos feixes de excitação, é possível reduzir o fundo não ressonante à zero, mas o

sinal não ressonante também é reduzido. Apesar de teoricamente nenhum sinal ser emitido

na polarização selecionada, quando o feixe entra no microscópio e interage com os elementos

ópticos desse e do alinhamento, sua polarização é alterada, acrescentando fundo não

ressonante. Para o CARS resolvido no tempo, são utilizados três feixes, pump-1, Stokes e

pump-2. O pump-2 é atrasado em relação aos dois primeiros, que são os responsáveis por

induzir vibração molecular no meio. Essa técnica suprime o sinal não ressonante pelo fato de

que a vibração não ressonante não permanece após os pulsos dos lasers, mas a vibração

ressonante sim. O Raman estimulado é medido através do ganho (Raman Gain) ou a perda

(Raman Loss) na intensidade dos feixes de pump ou Stokes. Raman estimulado também não

apresenta fundo não ressonante. No trabalho realizado por Freudiger et al. [8] o feixe de

Stokes é modulado e a perda de intensidade no feixe de pump é medida com um fotodiodo e

filtrado por uso de lock-in. O uso do lock-in é necessário, pois o sinal está no mesmo

comprimento de onda da onda de excitação. Isso representa um custo em relação ao tempo

18

de aquisição do sinal, pois o lock-in filtra as outras frequências após uma integração em torno

de 10 a 100 períodos do feixe modulado. Um feixe com 100 MHz deveria ser modulado no

máximo com 10 MHz, exigindo um tempo de integração mínimo de 1 s, dependendo do ruído

do sinal de fundo. O tempo de aquisição de 1 s significa 1 segundo para a aquisição de uma

imagem de 1 MPixel, ou seja, 1 quadro por segundo, bem abaixo da taxa de vídeo de 30

quadros por segundo. Dos exemplos citados a microscopia SRS tem apresentado os melhores

resultados [5], como exemplo, é possível: monitorar a degeneração do nervo periférico em

camundongos com Esclerose Lateral Amiotrófica[9], construção de imagens de DNA in vivo

em camundongos [10], monitorar variação de biomassa em palha de milho [11]. SRS é também

uma das técnicas que apresenta maior complexidade para aplicação.

A microscopia CARS tem sido usada para: monitoramento dinâmico de

metabolismo e armazenamento de lipídios [12], adquirir imagem estrutural de cérebro de rato

com seletividade vibracional [13], acompanhar as tendências na distribuição de lignina através

do monitoramento de imagens de diferentes paredes celulares de alfafa quase

simultaneamente [14], e principalmente para adquirir imagens de lipídios em amostras

biológicas com velocidade para construção de vídeos [15], entre outros. Cirurgia de tumores

do cérebro tem sido uma das aplicações do CARS que mais tem exigido a aquisição de imagens

em tempo real e que possa ser realizada via um sistema de fibras ópticas ou braço articulados.

Nesse caso a ideia é acompanhar a cirurgia do tumor delimitando suas margens com a

microscopia CARS durante o procedimento [16].

Diminuindo o Non-Resonant Background: Nos perguntamos que outras técnicas

que apresentem seletividade química gerariam melhoras em relação às microscopias já

conhecidas e poderiam ser utilizadas para aquisição de imagens. Ou, quais outras técnicas que

apresentam ressonância com vibrações moleculares química podem ser aplicadas à aquisição

de imagens de amostras biológicas. O que encontramos foi um processo por mistura de seis

ondas com intensidade proporcional à 4

3 , que é resultado do efeito cascata do CARS [17].

Até onde sabemos esse foi o primeiro trabalho internacional de aquisição de imagens através

do efeito cascata do CARS.

19

A emissão desse efeito ocorre em um comprimento de onda igual5 ao de uma

polarização de quinta ordem proporcional a 5 , e, devido ao seu sinal ser mais intenso, é

por vezes visto com problema para detecção de efeitos de ordem superiores. Nesse trabalho

mostramos as características que fazem o efeito cascata de CARS uma ótima técnica para

microscopia.

Histórico do Grupo na área de Microscopias Biofotônicas: O histórico do grupo

em biofotônica se inicia em 1990 após retorno do pós-doutorado do Prof. Lenz onde descobriu

as pinças ópticas com seu pioneiro, Dr. Arthur Ashkin. O foco principal do trabalho na época

era o de fotônica para comunicações ópticas e quantum dots semicondutores para

dispositivos ópticos, incluindo um convênio do grupo com CPqD-Telebrás, enquanto a pinça

óptica se tornou um projeto paralelo, quase um hobby. De 1986 até 1998 o grupo, na época

denominado Grupo de Fibras Ópticas, contou com financiamento do CPqD-Telebrás, dois

projetos grandes do PADCT em 1992 e 1995 e um temático da FAPESP. Em 2000 conseguiu a

aprovação de um CEPID (Centro de Pesquisa Inovação e Difusão) da FAPESP chamado CEPOF

(Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica) que perdurou até 2014, e que foi a principal fonte

de financiamento para os lasers de pulsos ultracurtos utilizados nessa tese, e responsável por

grande parte do suporte no meu mestrado e doutorado. Em 2009 foi aprovado nosso Instituto

Nacional de Ciência e Tecnologia denominado INFABIC (Instituto Nacional de Fotônica

Aplicada à Biologia Celular) em conjunto, principalmente, com a Biologia, Medicina e

Engenharia de Alimentos da UNICAMP, o qual está em vigência até hoje, renovado em 2016,

com o qual completou a aquisição dos microscópios mais modernos.

A primeira pinça óptica do Brasil foi montada em 1990 e aperfeiçoada em 1991,

após financiamento do PADCT. Em 1995 se inicia uma colaboração da física com o

Hemocentro, ambos da UNICAMP, para estudos de reologia de hemácias e em 1999 o grupo

inicia o trabalho com quantum coloidais, que são usados como marcadores celulares, entre

outras possíveis aplicações. Esse foi o ponto de partida que re-orientou os trabalhos do grupo

da área de fotônica para comunicações para a área de biofotônica. As duas áreas

compartilham muito fortemente os conhecimentos de materiais, quantum dots, óptica não

linear e lasers de pulsos ultracurtos. A percepção dessa proximidade levou o grupo a integrar

5 A emissão é em um comprimento de onda infimamente diferente, mas não ao ponto de poder ser separada por elementos ópticos simples.

20

a óptica não linear com as microscopias biofotônicas em 2000 quando uma reforma nos

laboratórios permitiu colocar na mesma mesa óptica os lasers de femtossegundos com o

microscópio. Infelizmente, o primeiro microscópio confocal por varredura a laser que deveria

ter chegado em 2003, só foi adquirido em 2005 devido à crise da taxa de câmbio de 2002-

2003. Foi um Olympus FV300, hoje fora de linha, que adaptamos para a realização de

microscopias multifótons, e que foi fundamental para boa parte dos trabalhos dessa tese.

Desde então o grupo publicou 54 trabalhos em revistas internacionais nessa área

de biofotônica, sem contar os trabalhos na área de fotônica em si que continuam até hoje,

dos quais 9 se referem a estudos de quantum dots coloidais usados como marcadores

celulares. Em termos de teses foram orientados 7 doutoramentos, com 2 teses defendidas

pela Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP, e 9 mestrados, com 2 da FCM e 2 em

quantum dots coloidais.

Dessas teses, 5 doutorados foram importantes para o desenvolvimento das

técnicas de microscopia e manipulações fotônicas. A primeira foi da Dra. Adriana Fontes que

integrou as pinças ópticas com sistemas de óptica não linear e Raman em 2002, obtendo o

primeiro espectro Raman de partículas capturadas em pinça ópticas do Brasil. Em 2003

publicamos o que pode ser considerado a primeira imagem de microscopia multifóton e

espectroscopia Raman, Hiper Raman e SHG do Brasil, mas de baixa qualidade, pois foi

adquirida varrendo a amostra e não o laser. Além disso, foram observadas ressonâncias de

Mie nas fluorescências de microesferas, o que exigia um tratamento teórico para descrição

dos campos eletromagnéticos em feixes de laser de alta abertura numérica. Antônio Neves

continuou experimentalmente e teoricamente o trabalho sobre a descrição dos campos

eletromagnéticos, realizando um tratamento exato para feixes focalizados com alta abertura

numérica. Esse trabalho teórico foi utilizado tanto na minha tese de mestrado quanto na do

Alexandre de Thomaz. Nesse mesmo tópico, Wendel Moreira, durante seu doutorado,

generalizou o tratamento teórico da expansão em vetores harmônicos esféricos para qualquer

tipo de feixe. A chegada do microscópio da Olympus em 2005 coincidiu com o período do

mestrado de André de Thomaz que deu continuidade ao trabalho de aquisição de imagens de

alta qualidade obtendo a primeira imagem de SHG do Brasil por varredura laser. No seu

doutorado montou uma plataforma integrada no confocal com pinças ópticas, FLIM e FCS,

obtendo também a primeira imagem de FLIM, assim como as primeiras medidas de FCS, no

21

Brasil. Diogo Almeida, no seu doutorado, demonstrou que a plataforma biofotônica integrada

se tornaria também uma plataforma analítica, permitindo a realização de espectroscopias de

óptica não linear inclusive em baixa temperaturas.

Histórico do meu trabalho no Grupo (2008-2016): Durante meus primeiros anos

de trabalho no grupo de biofotônica desenvolvi um sistema de imagens que uniu três

importantes técnicas de microscopia de óptica não linear, a fluorescência excitada por dois

fótons, o segundo harmônico e o terceiro harmônico. Esse sistema está descrito na minha

dissertação de mestrado, com o título “Microscopias de Óptica Não Linear: Fluorescência

Excitada por Absorção de Dois Fótons, Geração de Segundo Harmônico e Geração de Terceiro

Harmônico”. Com esse sistema realizamos a primeira imagem de terceiro harmônico do Brasil.

O terceiro harmônico com lasers pulsados no infravermelho próximo se mostrou um grande

desafio, pois sua emissão é no ultravioleta. Para conseguir detectar esse sinal e para viabilizar

a construção de imagens foi necessário conhecimento detalhado de todos os elementos

ópticos necessários para o alinhamento e para detecção. A primeira imagem de THG foi obtida

em um sistema espectral da Olympus FV1000 que ficou 3 meses no laboratório para

demonstração. Logo a seguir melhoramos o sinal por ordens de grandeza no FV300 colocando

o detector logo após a objetiva para evitar perdas do UV nos elementos ópticos. Infelizmente

a óptica do sistema Zeiss não transmite nada abaixo de 350 nm, justamente a região do THG

para o laser de Ti:safira, e não permitia a detecção externa realizada com o Olympus. Essa

nova plataforma permitiu integrar as técnicas de TPEF, SHG, THG e FLIM que se mostrou capaz

de responder a um grande número de perguntas biológicas. Meu mestrado foi dedicado

totalmente à montagem da plataforma multimodal, mas a otimização e utilização dessa

plataforma para estudos de biologia celular foram realizados no meu trabalho de doutorado.

Dessa forma, logo após a defesa do meu mestrado passamos a utilizar essa

plataforma para responder a questões relevantes na área biológica. As imagens adquiridas

nesse sistema são de ótima qualidade e com elas conseguimos seis publicações. Cada técnica

mostra diferentes estruturas, e as imagens das técnicas conjuntas possibilitaram a análise

computacional da organização do tecido sem a necessidade do fator humano, que pode

incorrer em erros. No caso o terceiro harmônico foi principalmente utilizado para estudo

morfológico dos núcleos de células epiteliais e para contagem dessas células.

22

Desde o início do meu doutoramento houve a necessidade de uma forte interação

com pesquisadores da área de ciências da vida. Após desenvolver uma metodologia, a vontade

de vê-la utilizada para responder questões biológicas é muito alta. Entretanto, como físicos,

nos faltava conhecimento de biologia para manipular as amostras e, mesmo, escolher o

melhor sistema para demonstrar a importância da nossa metodologia. Em muitas

circunstâncias nós procuramos os biólogos e médicos com questões relevantes adequadas às

nossas técnicas. Em outros casos, esses profissionais batiam na nossa porta procurando

respostas para uma determinada questão, que rapidamente percebíamos que se encaixavam

na nossa metodologia. Vale salientar que a comunidade de ciências da vida nunca tinha ouvido

falar de terceiro harmônico, raramente de segundo harmônico, ou FLIM e FCS. Nesse caso,

rapidamente os convencíamos a usarem essas técnicas para responderem suas perguntas.

Claramente que para o uso de THG, SHG, FLIM ou FCS é necessário fazer uma otimização

amostra-metodologia para obtenção de bons resultados, o que exigia da nossa parte, como

desenvolvedores da metodologia, um trabalho de adaptação da mesma à pergunta específica.

Para tanto foi necessário, também, adquirir um conhecimento grande sobre a biologia do

problema e esclarecer que respostas importantes trariam as grandezas que podíamos medir,

além de como medi-las. Um trabalho com desenvolvimento de embriões, por exemplo, exigiu

muito da metodologia para fazer a aquisição de imagens por dias em 3D usando fluorescência

excitada por 2 fótons, FLIM e terceiro harmônico. Sem a nossa participação nenhuma das

publicações nas aplicações teria ocorrido. Entretanto, claro, os primeiros autores nessas

publicações foram os profissionais das ciências da vida responsáveis pelas amostras e

questões biológicas.

No meio do meu doutorado, em 2012, fui contratado como técnico no INFABIC,

que conta com mais de 30 pesquisadores e com 20 subprojetos6. No meu trabalho como

técnico, onde sou responsável, além de operar, acompanhar e ensinar os pesquisadores no

uso dos equipamentos, montar e manter novos sistemas de microscopias e lasers. Essa missão

só pode ser cumprida se estiver em contato próximo com as questões dos pesquisadores

interessados na potencialidade das técnicas para ajudar responder importantes questões dos

processos celulares e químicos.

6 http://inct-infabic.net.br/

23

Parte importante do meu trabalho de doutorado foi a microscopia CARS. Nessa

tese vamos mostrar as primeiras imagens de CARS realizadas no Brasil e os detalhes sobre a

montagem experimental para realizá-la. Em sintonia com os principais estudos sobre a

metodologia da microscopia CARS, que concentram-se na diminuição do fundo não

ressonante, nós iremos demonstrar a primeira imagem por varredura laser de efeito cascata

de CARS. O CARS cascata [cascade CARS – CCARS] apresenta menor fundo não ressonante, sua

emissão é em um comprimento de onda diferente de qualquer outro efeito não linear

coerente, isso significou um acréscimo de complexidade mínimo para sua detecção quando

comparado com o CARS.

Descrição e Resumo dessa Tese: No capítulo dois faremos uma introdução à teoria

necessária para entendimento dos processos de óptica não linear, com o modelo de dipolo

oscilante forçado por um ou mais campos elétricos. No final do capítulo faremos uma

comparação do limiar de detecção entre as técnicas de Raman coerentes desenvolvidas nesse

trabalho. No capítulo três apresentaremos de forma detalhada três sistemas experimentais

para a aquisição de imagens de Raman coerente e de união de técnicas de óptica não linear,

serão demonstrados os principais detalhes e as dificuldades superadas. Os resultados

originados de microscopia Raman coerente serão apresentados no capítulo quatro, os

principais resultados são as imagens adquiridas, mas também mostraremos resultados que

comprovam a mistura de seis ondas do efeito cascata através da dependência com a

intensidade dos feixes de excitação. O capitulo cinco mostrará as aplicações realizadas com

um sistema experimental desenvolvido com objetivo de integrar a geração de segundo e

terceiro harmônicos com a fluorescência excitada por dois fótons. Mostraremos as imagens e

os resultados obtidos com a análise das imagens para estudo de tecidos, com especial atenção

à análise de núcleos celulares e à organização das fibras de colágeno. Por último, o capítulo

seis apresentará a conclusão e perspectivas desse trabalho.

A seguir, listo os trabalhos publicados no período do meu doutorado, dentre os

quais os trabalhos em que minha participação foi fundamental, e não apenas coadjuvante,

fazem parte dessa tese.

[1] J. Adur, G. O. Barbosa, V. B. Pelegati, M. O. Baratti, C. L. Cesar, V. H. Casco, and H. F. Carvalho, “Multimodal and Non-Linear Optical Microscopy Applications in

24

Reproductive Biology,” Microsc. Res. Tech., vol. 79, no. 7, pp. 567–582, DOI 10.1002/jemt.22684, Jul. 2016.

[2] A. F. Oliveira, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, C. L. Cesar, R. G. Bastos, and L. G. de la Torre, “Cultivation of yeast in diffusion-based microfluidic device,” Biochem. Eng. J., vol. 105, no. A, pp. 288–295, DOI 10.1016/j.bej.2015.09.015, Jan. 2016.

[3] L. C. Machado, V. B. Pelegati, and A. L. Oliveira, “Study of simple microparticles formation of limonene in modified starch using PGSS - Particles from gas-saturated suspensions,” J. Supercrit. Fluids, vol. 107, pp. 260–269, DOI 10.1016/j.supflu.2015.09.023 , Jan. 2016.

[4] M. Ericson, G. Viera-Damiani, M. N. da Silva, K. Gupta, T. Soares, M. Cintra, A. de Almeida, V. Pelegati, A. de Thomaz, M. Baratti, H. Carvalho, C. L. Cesar, and P. Velho, “Bartonella Henselae Initial Infection of Mature Human Erythrocytes Observed in Real Time Using Bacterial Endogenous Fluorescence,” J. Invest. Dermatol., vol. 135, no. 1, p. S90, DOI 10.4172/2329-891X.1000207, 2015.

[5] A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Measurement of the Hydrodynamic Radius of Quantum Dots by Fluorescence Correlation Spectroscopy Excluding Blinking,” J. Phys. Chem. B, vol. 119, no. 11, pp. 4294–4299, Mar.DOI 10.1021/jp512214p, 2015.

[6] R. de A. Natal, V. B. Pelegati, C. Bondarik, G. R. Mendonca, S. F. Derchain, C. P. Lima, C. L. Cesar, L. O. Sarian, and J. Vassallo, “Increased metabolic activity detected by FLIM in human breast cancer cells with desmoplastic reaction: a pilot study,” in ADVANCED MICROSCOPY TECHNIQUES IV; AND NEUROPHOTONICS II, Proceedings of SPIE,DOI 10.1117/12.2183442, 2015, vol. 9536.

[7] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, M. O. Baratti, L. A. L. A. Andrade, H. F. Carvalho, F. Bottcher-Luiz, and C. L. Cesar, “Second harmonic generation microscopy as a powerful diagnostic imaging modality for human ovarian cancer,” J. Biophotonics, vol. 7, no. 1–2, pp. 37–48,DOI 10.1002/jbio.201200108, 2014.

[8] J. Adur, L. DSouza-Li, M. V. Pedroni, C. E. Steiner, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “The Severity of Osteogenesis Imperfecta and Type I Collagen Pattern in Human Skin as Determined by Nonlinear Microscopy: Proof of Principle of a Diagnostic Method,” PLoS One, vol. 8, no. 7,DOI 10.1371/journal.pone.0069186, Jul. 2013.

[9] J. Adur, A. M. Herrera Torres, A. Masedunskas, M. O. Baratti, A. A. de Thomaz, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Multiphoton intravital microscopy setup to visualize the mouse mammary gland,” in ADVANCED MICROSCOPY TECHNIQUES III, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.2032439 , 2013, vol. 8797.

[10] J. Adur, V. B. Pelegati, M. Bianchi, A. A. de Thomaz, M. O. Baratti, H. F. Carvalho, V. H. Casco, and C. L. Cesar, “Multimodal Nonlinear Optical Microscopy used to Discriminate Human Colon Cancer,” in MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE

25

BIOMEDICAL SCIENCES XIII, Proceedings of SPIE, DOI 10.1117/12.2001708 , 2013, vol. 8588.

[11] Adur J, Pelegati VB, de Thomaz AA, et al; “Quantitative changes in human epithelial cancers and osteogenesis imperfecta disease detected using nonlinear multicontrast microscopy.” J. Biomed. Opt. 0001;17(8):081407-1-081407-10. doi:10.1117/1.JBO.17.8.081407.

[12] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, M. O. Baratti, D. B. Almeida, L. A. L. A. Andrade, F. Bottcher-Luiz, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Optical Biomarkers of Serous and Mucinous Human Ovarian Tumor Assessed with Nonlinear Optics Microscopies,” PLoS One, vol. 7, no. 10, DOI 10.1371/journal.pone.0047007 , 2012.

[13] V. B. Pelegati, J. Adur, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, M. O. Baratti, L. A. L. A. Andrade, F. Bottcher-Luiz, and C. L. Cesar, “Harmonic optical microscopy and fluorescence lifetime imaging platform for multimodal imaging,” Microsc. Res. Tech., vol. 75, no. 10, pp. 1383–1394, DOI 10.1002/jemt.22078 , 2012.

[14] K. Metze, G. Vieira-Damiani, R. L. Adam, D. P. Ferro, A. A. de Thomaz, V. Pelegati, and C. L. Cesar, “Why is a blood channel located in the external part of the media layer in aortas with acute dissection?,” Histopathology, vol. 61, no. 1, SI, p. 40, 2012.

[15] V. B. Pelegati, J. Adur, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, M. O. Baratti, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Multimodal optical setup for nonlinear and fluorescence lifetime imaging microscopies: improvement on a commercial confocal inverted microscope,” in IMAGING, MANIPULATION, AND ANALYSIS OF BIOMOLECULES, CELLS, AND TISSUES X, DOI 10.1117/12.909358 , Proceedings of SPIE , 2012, vol. 8225.

[16] J. Adur, A. E. Ferreira, L. D’Souza-Li, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, M. O. Baratti, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Quantitative Second Harmonic Generation Imaging to Detect Osteogenesis Imperfecta in Human Skin Samples,” in MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE, DOI 10.1117/12.907320 , 2012, vol. 8226.

[17] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, F. Bottcher-Luiz, L. A. L. A. Andrade, D. B. Almeida, H. F. Carvalho, and C. L. Cesar, “Combined nonlinear laser imaging (two-photon excitation fluorescence, second and third harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging microscopies) in ovarian tumors,” in MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE ,DOI 10.1117/12.906945 2012, vol. 8226.

[18] M. F. Andreoli-Risso, A. S. S. Duarte, T. B. Ribeiro, P. Bordeaux-Rego, A. Luzo, M. O. Baratti, J. Adur, A. A. de Thomaz, V. B. Pelegati, H. F. Carvalho, C. L. Cesar, P. Kharmadayan, F. F. Costa, and S. T. Olalla-Saad, “Second Harmonic Generation Microscopy Used to Evaluate the Effect of the Dimethyl Sulfoxide Cryopreservation Process in Collagen Fibers of Differentiated Chondrocytes,” in MULTIPHOTON

26

MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.909284 , 2012, vol. 8226.

[19] P. Bordeaux-Rego, M. O. Baratti, A. S. S. Duarte, T. B. Ribeiro, M. F. Andreoli-Risso, B. Vidal, J. B. Miranda, J. Adur, A. A. de Thomaz, V. B. Pelegati, F. F. Costa, H. F. Carvalho, C. L. Cesar, A. Luzo, and S. T. Olalla Saad, “Use of the second harmonic generation microscopy to evaluate chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells for cartilage repair,” in MULTIPHOTON MICROSCOPY IN THE BIOMEDICAL SCIENCES XII, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.909185 , 2012, vol. 8226.

[20] J. Adur, V. B. Pelegati, L. F. L. Costa, L. Pietro, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, F. Bottcher-Luiz, L. A. L. A. Andrade, and C. L. Cesar, “Recognition of serous ovarian tumors in human samples by multimodal nonlinear optical microscopy,” Journal of Biomedical Optics, vol. 16, no. 9. p. 96017, DOI 10.1117/1.3626575 , 2011.

[21] G. Vieira-Damiani, D. P. Ferro, R. L. Adam, A. A. de Thomaz, V. Pelegati, C. L. Cesar, and K. Metze, “Elastic fibers and collagen distribution in human aorta,” in Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XI, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.874695 , 2011, p. 79030B–79030B–8.

[22] M. O. dos Santos, V. B. Pelegati, C. L. Cesar, P. R. Correa, T. M. T. Zorn, and D. M. Zezell, “Characterization of third-degree burned skin by nonlinear microscopy technique,” Sci. York, vol. 7903, p. 79032Y–79032Y–5, Proceedings of SPIE , DOI 10.1117/12.878763 , 2011.

[23] J. Adur, V. B. Pelegati, A. A. de Thomaz, D. B. Almeida, F. Bottcher-Luiz, L. A. L. A. Andrade, and C. L. Cesar, “Multimodal nonlinear optical microscopy used to discriminate epithelial ovarian cancer,” Adv. Microsc. Tech. Ii, vol. 8086, DOI 10.1117/12.889554 , 2011.

27

Capítulo 2

Teoria

Nesse capítulo desenvolvemos a teoria necessária para o entendimento dos

processos de óptica não linear, incluindo CARS e o six-wave mixing CARS. A forma escolhida é

partir da radiação de um dipolo fazendo a expansão tanto nas coordenadas eletrônicas quanto

nucleares e comparando com a expansão típica em termos dos campos eletromagnéticos da

óptica não linear. Também explicitamos os significados de termos como processos coerentes

e espontâneos, paramétrico/elástico e inelástico, entre outros.

2.1 - Fundamentos de Óptica

Espalhamento

Quando a luz interage com objetos homogêneos grandes valem as leis da óptica

geométrica, como ângulo de incidência igual ao de reflexão e a lei de Snell. Para uma superfície

plana a luz refletida e refratada tem uma direção bem definida. Entretanto quando os objetos

28

no caminho do feixe se tornam da ordem ou menores do que o comprimento de onda da luz

incidente o fenômeno de difração aparece e a direcionalidade da luz é perdida. Chamamos

espalhamento os processos ópticos em que as partículas que interagem com a luz são

menores, tipicamente bem menores, do que o comprimento de onda. Estamos no limite,

então, do espalhamento Rayleigh.

Os centros espalhadores são regiões onde existem descontinuidades do índice de

refração do meio e que se comportam como dipolos que re-irradiam a luz incidente. Esses

dipolos podem ser espacialmente organizados, que vai dar origem a um processo coerente,

como veremos a seguir, ou posicionados aleatoriamente no espaço, que vai originar um

processo incoerente. Vale notar que a reflexão difusa não é um espalhamento, pois se tratam

de objetos grandes (comparados ao comprimento de onda), mas com superfícies que variam

no espaço, nas quais a luz é refletida em muitas direções.

Como afirmamos, iniciamos nosso estudo com a radiação de um dipolo.

Radiação de Dipolo

Os campos magnéticos e elétricos de um dipolo e seu correspondente vetor de

Poynting (Intensidade) são dados por [18] (onder

nr

é o vetor radial unitário):

24

oB r pcr

(2.1.1)

c

E r Br

(2.1.2)

2

2 3 4

1 1

16 o

rS r p n

c r r (2.1.3)

Considerando um dipolo na direção z da forma i t

o zp p e e para o qual

2 i t

o zp p e e temos que:

4 4

4 2 2 2 2

2 3 2 2 4 2

1 1 2 1 1sin sin

16 16o o

o o

cS p n p n

c r r

(2.1.4)

29

2

2 2

4 2

1 1sino

o

cS p n

r

(2.1.5)

A figura 2.1.1 mostra o padrão de uma irradiação que segue a lei 2sinI .

Notamos que esse dipolo oscilante só não irradia na direção ao longo do próprio dipolo.

Figura 2.1.1: Padrão de radiação de um dipolo oscilante.

No caso em que o dipolo é induzido pelo campo incidente em uma esfera de

dimensões muito menor do que o comprimento de onda incidente, vale o eletromagnetismo

na região próxima, near field, equivalente ao caso eletrostático, apenas incorporando as

variações temporais. O momento de dipolo do caso estático é dado pela equação (2.1.6)

retirada do livro de Eletrodinâmica Clássica por J. D. Jackson [19] equação 4.56:

2

3

2

14

2

ro inc z

r

np a E e

n

(2.1.6)

Dessa forma, 2

3

2

14

2

ro o inc

r

np a E

n

e

22

22 6 2

2

14

2

ro o inc

r

np a E

n

.

Podemos reescrever esse resultado em termos da intensidade da luz incidente

usando o fato de que qualquer fluxo pode ser escrito como vJ . No caso eletromagnético

a densidade de energia é dada por 21

2ou E e a velocidade é a velocidade da luz c , então

21

2oI E c . Nesse caso temos:

30

2 2

5 22 222 6 2 6

2 2

21 12 14

2 2 2

or ro o o inc inc

o r r

n np a E c a I

c n c n

(2.1.6)

Levando de volta à equação 2.1.5 obtemos:

2 25 2 2 22 6

6 2 4 2

4 2 2 2 4 2

2 1 11 1 1sin 32 sin

2 2

o r rinc inc

o r r

n nc aS a I n I n

c n r n r

(2.1.7)

A irradiação é, naturalmente, radial com uma intensidade dada por:

22 6 2

4

2 4 2

1 sin32

2

rirrad inc

r

n aI I

n r

(2.1.8)

O fato de que a intensidade cai com 2

1I

r só expressa a conservação da energia,

pois 2

24

aIA r cte

r

, como deveria ser para a radiação eletromagnética em um meio

não absorvedor. O termo angular vai mudar nos casos de luz polarizada ou não polarizada, ao

fazer uma média sobre os dipolos, mas a feição básica da irradiação do dipolo é que ela

depende do comprimento de onda na forma 41

e da sexta potência do tamanho do dipolo

induzido. Além disso, é necessário que o índice de refração do centro espalhador seja

diferente do meio em sua volta, pois quando 2 1 0rn não existe uma re-irradiação devido

ao meio.

Somando dipolos, processos Coerentes e Não Coerentes.

O que acontece com a intensidade emitida por um conjunto de N dipolos?

Depende da coerência do processo. Sabemos que a intensidade de feixe depende do

quadrado do campo elétrico, na forma 21

2oI cu c E . Agora suponha o caso em que

temos uma adição de vários campos na forma: 1 2 nE E E E . Que operação devemos

fazer primeiro, (1) somar antes os campos e depois elevar ao quadrado na forma

2

1 2

1

2o nI c E E E , ou (2) primeiro elevar ao quadrado e depois somar as

31

intensidades na forma 2 2 2

1 2

1

2o nI c E E E ? Suponha que todos os campos sejam

iguais à oE . Na operação (1) a soma será 1 2 n oE E E NE , e a intensidade será

proporcional ao quadrado do número de dipolos, 2 2

oI N E . Na operação (2) a intensidade é

proporcional apenas ao número de dipolos 2

oI NE .

Sabemos que a operação adição deve ser feita primeiro, o que poderia nos induzir

à conclusão errada de que a operação (2) não existe na realidade. O fato é que ambas podem

existir e teremos o resultado da operação (1) ou (2) dependendo da relação de fase entre os

dipolos.

Para entender como isso ocorre considere o j-ésimo campo dado por

ji t i

j z oE e E e

. A intensidade será dada pelo quadrado da soma dos campos na forma

*I EE :

2 2* jj

ii t i i t i

z o z o o

j j

E e E e e E e E e

(2.1.9)

Agora suponha o caso coerente em que todas as fases são iguais, ou seja, j

. O processo em que as fases mantêm uma relação fixa determinística é chamado de processo

coerente. Nesse caso 0j j e a somatória dupla 21

j

N é dada pelo

quadrado do número de dipolos. Assim, a intensidade, 2 22

coerente oI E N E , é proporcional

ao quadrado do número de dipolos. Agora suponha o caso de um processo incoerente, no

qual as fasesj são aleatórias. A relação não é mais verdadeira. Na somatória

dupla separamos dois casos, j e j , na forma:

j j ji i i

j j j j j

e e e

(2.1.10)

Agora

,

1ji

j j j

e N

, mas

,

0ji

j j

e

por conta da aleatoriedade das

fases. Assim caímos no caso (2) em que os termos cruzados da somatória se anulam e a

intensidade é proporcional ao número de dipolos:

0j j

32

2 2

incoerente oI E N E (2.1.11)

No processo incoerente, então, podemos analisar apenas o caso de um centro

espalhador e multiplicar o resultado pelo número dos mesmos.

A coerência das fases em dipolos que respondem instantaneamente é dada pela

coerência da localização espacial dos mesmos. Cada dipolo idêntico vê um campo com uma

fase diferente dependendo da sua posição na forma jikxj i t

inc oE e E e . Se os dipolos são

organizados espacialmente as fases mantém uma relação entre si e o processo é coerente.

Quando um feixe incide em uma superfície plana todos os dipolos oscilam na mesma

frequência da luz incidente e o resultado é uma reflexão bem direcionada com ângulo de

incidência igual ao de reflexão. Por outro lado, se os centros espalhadores estão

aleatoriamente posicionados no espaço, como um gás, ou impurezas em um sólido, as fases

são aleatórias e o processo é incoerente. Outra fonte de incoerência é um atraso individual

em cada dipolo. Exemplo típico é a fluorescência, pois os elétrons excitados decaem

aleatoriamente dentro de um tempo de vida de fluorescência. Como veremos a seguir o

movimento dos elétrons é instantâneo acompanhando o campo elétrico incidente, mas o

dipolo depende também das coordenadas nucleares, e elas variam de dipolo a dipolo, gerando

uma incoerência no sistema.

O quadrado no número de dipolos tende a amplificar fortemente os processos

coerentes em comparação com os processos incoerentes. Exemplos das duas situações,

coerente versus não coerente, são o espalhamento hiper-Rayleigh, um espalhamento

incoerente de luz reemitida no dobro da frequência da luz incidente, versus a geração de

segundo harmônico, SHG, coerente. No SHG os centros espalhadores são coerentemente

excitados pela luz incidente e o feixe emitido possui alguma, ou total, direcionalidade.

Colágeno é uma molécula que gera o dobro da frequência, se essas moléculas estão dispersas

no meio aleatoriamente teremos o espalhamento hiper-Rayleigh, já quando estão

organizadas espacialmente na forma de fibrilas numa escala comparável ao volume focal,

teremos o SHG, muito mais intenso do que o espalhamento hiper-Rayleigh. Por outro lado no

processo de SHG em cristais grandes o feixe tem uma direcionalidade bem definida e o

processo exige a condição de casamento de fase (phase-matching) para ocorrer. Essa condição

é relaxada para amostras microscópicas, mas ainda mantém resquícios, com alguma

33

direcionalidade nos feixes reemitidos. Esse mesmo argumento sobre coerência é válido para

qualquer processo óptico que depende da irradiação de vários dipolos.

Outros termos usados no contexto de processos de óptica não linear são:

Processos de Óptica Não Linear

Os processos de óptica não linear ocorrem na presença de mais de um fóton.

Fazendo uma analogia dos processos de óptica não linear com a velocidade de reações

químicas. Quando temos a reação A B C a velocidade da reação é dada pelo produto das

concentrações de A e B , ou seja, V A B , que no fundo é uma lei de probabilidade, ou

seja, a probabilidade de encontrar A no mesmo volume que B é a multiplicação das

probabilidades de encontrar A e B no volume dado. A velocidade de uma reação do tipo

nA C ou A A A C é dada por n

V A . A analogia com os fótons é que, se

n fótons são necessários para excitar um elétron, excf f f e . A concentração de

fótons, no caso, é dada pela intensidade do feixe incidente, logo a velocidade dessa reação

será proporcional a nV I . Dessa forma, um processo de 1 fóton é linear com a intensidade,

e um processo de 2 fótons vai com a intensidade ao quadrado, de 3 fótons, com a intensidade

ao cubo, e de n fótons com a enésima potência da Intensidade do feixe incidente. Com mais

de um fóton envolvido estamos no regime da óptica não linear. Uma consideração importante

é que, com algumas exceções, como a probabilidade de um processo não linear ocorrer é

baixa, com baixa quantidade de fótons absorvidos, o número de fótons das fontes pode ser

considerado constante.

Em processos lineares, para um feixe com potência constante, caso a área de

incidência desse feixe em um meio absorvedor seja diminuída, conseguimos aumentar sua

intensidade e assim gerar mais fótons, mas a área onde esses fótons são gerados também

diminui na mesma proporção, fazendo com que a emissão fique constante. Isso por que a

intensidade da emissão será proporcional à potência, com o número de fótons emitidos iguais

à ev

PN AI A P

A .

34

Para processos não lineares a quantidade de fótons gerados não permanece

constante quando da área é modificada. Se diminuirmos o diâmetro de um feixe em 10 vezes,

o número de fótons gerados por um processo não linear de segunda ordem (proporcional ao

quadrado da intensidade do feixe incidente) aumentará de 10 vezes. No caso de um processo

não linear de terceira ordem, o aumento é de 100 vezes e assim por diante. Com expressão

genérica dada por ev 1

n nn

n n

P PN AI A

A A

. Essa característica é responsável pela

confocalidade dos processos não lineares, não sendo necessário o uso de pinhole como na

microscopia confocal convencional.

Seguindo o mesmo raciocínio, quando o efeito não linear for gerado por laser que,

ao invés de emitirem luz constante, emitirem pulsos de luz, que concentram toda a potência

emitida em um pequeno espaço de tempo, o efeito não linear também será aumentado.

Suponha um laser pulsado com duração temporal do pulso dada por que se repete a cada

rep . A energia do pulso será dada por p pE P onde

pP é a potência de pico do pulso. Essa

será a única energia presente até a chegada do próximo pulso, então a potência média é dada

por: p

p

rep rep

EP P

, a relação entre a potência de pico e a potência média é dada então

por: rep

pP P

.

Vamos usar o exemplo do laser com pulsos de 100 fs com taxa de repetição de 100

MHz, ou 10rep ns . Nesse caso 9

5

15

10 1010

100 10pP P P

. Ou seja, para uma potência média

de 1 W a potência de pico será de 100 kW. Os processos de óptica não linear dependem da

potência de pico, e não da potência média. Por outro lado, os processos térmicos, lentos,

dependem da potência média. Assim aumentar a potência do laser em um laser contínuo para

gerar um efeito de óptica não linear pode simplesmente levar a danos térmicos da amostra.

Nos lasers pulsados pequenas potências médias se transformam em altas potências de pico,

evitando danos térmicos na amostra e gerando os fenômenos de óptica não linear.

35

Figura 2.1.2: Diferença entre excitação por um e dois fótons

Outros termos importantes para nosso trabalho utilizados no contexto de

processos de óptica não linear são:

Paramétrico versus Não-Paramétricos.

Nos processos paramétricos o estado quântico final do sistema é igual ao estado

inicial. Só há uma remoção do estado fundamental durante a interação com o pulso de luz.

Em um caso em que a polarização é escrita como 2

oP n in E , os processos

paramétricos só modificam a parte real n do índice de refração. O meio material só opera

para promover a transferência de energia entre os feixes de luz, sem qualquer modificação do

mesmo. Já nos processos não paramétricos, a parte imaginária n é modificada. Os processos

paramétricos são elásticos e instantâneos, conservam a energia, e coincidem temporalmente

com o pulso incidente. Os processos não paramétricos são inelásticos, não conservam a

energia, e podem sofrer um atraso em relação ao feixe incidente de excitação do processo.

Linear Não-Linear

Mei

o

Ab

sorv

edo

r

Mei

o

Ab

sorv

edo

r

Lase

r C

W

Lase

r p

uls

ado

36

Estimulado versus espontâneo.

Nos processos ópticos estimulados o sinal óptico gerado tem a mesma direção,

fase, polarização e frequência do campo eletromagnético incidente. No espontâneo o sinal é

gerado sem relação com qualquer outro campo pré-existente.

Processos Coerentes. Equações de Maxwell:

Para os processos coerentes precisamos resolver a equação da onda frente a uma

interação dos campos eletromagnéticos com um meio não linear. Vamos considerar o caso de

ausência de cargas 0 e correntes 0J . Nas frequências ópticas em questão a

permeabilidade magnética é a do vácuo, ou seja, oB H , e podemos esquecer qualquer

contribuição magnética. No entanto, os dipolos estão presentes e a relação oD E P pode

ser reescrita considerando os termos lineares e não lineares:

o L NL NLD E P P E P (2.1.12)

As equações de Maxwell são dadas por:

0

0

BD E

t

DB H

t

(2.1.13)

Sabemos que 2F F F .

2

2

2o o

DE E E H

t t

(2.1.14)

2

2

2o NLE E E Pt

(2.1.15)

2 22 2 2

2

2 2 2 2 2 2

1

1

o o o o NL NLo

o o o o

P PE n EE E

t t c t c t

(2.1.16)

37

22 2

2

2 2 2 2

1 NL

o

Pn EE E

c t c t

(2.1.17)

O fato de que 0D não implica necessariamente que 0E . Entretanto,

esse termo ou é nulo ou muito pequeno nas situações de interesse, de modo que pode ser

desprezado. Assim ficamos com a equação da onda da óptica não linear:

22 2

2

2 2 2 2

1 NL

o

Pn EE

c t c t

(2.1.18)

Em princípio trata-se de uma equação não homogênea em que o termo

2

2 2

1 NL

o

P

c t

atua como fonte e/ou sumidouro de campos eletromagnéticos. Com as ondas

propagando em z, vamos expressar o laplaciano da seguinte forma 2

2 2

2 Tz

, com

2 22

2 2Tx y

. O campo e a polarização serão descritos como uma amplitude e o termo

oscilante, ( )n ni t k z

nE A e

e j j j j

j j

i z tk

NL nP p e

, onde para um meio isotrópico

( )

1

nn

i

i

np A

, e vamos definir ' j j

j

k k

e ' j j

j

. Aqui a amplitude dos

campos iA também pode ser o complexo conjugado, dependendo se o fóton está sendo

absorvido, iA com contribuição 1j positiva do vetor de onda, ou emitido, *

iA com

contribuição 1j negativa do vetor de onda, durante o processo. A equação (2.1.18) fica:

'2

'( )2 2

022 n n

i z ti k z tn nn T n

k

n

A Aik A e pe

z z

(2.1.19)

Como a polarização no meio é gerada por um feixe com pulsos de femtossegundos

nas frequências ópticas vamos usar a aproximação de variação de amplitude lenta (slow-

varying amplitude approximation) [20], nesse caso 2

2

n nn

A Ak

z z

e

2

2

n nn

A A

t t

. Para

que essa aproximação seja aplicável, a oscilação da onda deve ser em um período

extremamente menor quando comparado com a variação da amplitude devido ao pulso do

38

feixe. No caso 150 fs é o período do pulso e a duração da onda em 650 nm é de

aproximadamente 2 fs, assim a duração do pulso é de duas ordens de grandeza maior que do

período da onda. Com essa aproximação temos:

2 2

02 i kznn T n n n

Aik A p e

z

(2.1.20)

No fundo trata-se de um processo de transferência de energia do feixe com '

para o feixe com n . Esse processo, entretanto, pode não ser eficiente uma vez que o

processo inverso também é possível. Existe uma condição a ser satisfeita para o processo ser

eficiente, o casamento de fases, ou phase matching condition, na qual ´ nk k k é a

condição de casamento de fase, que garante conservação de momento.

Se considerarmos uma onda plana longitudinal na coordenada z podemos

desconsiderar o laplaciano transversal. Simplificando a equação acima e reescrevendo para

uma polarização de ordem n da equação 2.1.20 como:

2

( )

212

nn i kzn n

i

in

A iA e

z c k

(2.1.21)

Resolvendo a equação acima para um 0 0z e z L .

2 2

( ) ( )

2 21 10

2 2

1L i kLn n

n i kz nn nn i i

i in n

i i e

iA A e dz A

c k c k k

(2.1.22)

A intensidade para o sinal de gerado da mistura de quatro ondas nA será

proporcional a:

2 22

22 ( )0 0

212 2 2

1i kLnnn

n n i

in

cn cn eI A

c ik k

(2.1.23)

Onde 2

i i iA I .

2

2( )

1

sin 2

2

nn

n i

i

kLI

kL

(2.1.24)

39

No caso do CARS.

2

2(3) 2 *

1 2

sin 2

2CARS

kLI

kL

(2.1.25)

O resultado da equação acima revela que a intensidade do campo gerado pela

polarização no meio será proporcional a 2

( )n , essa dependência do módulo da

susceptibilidade não linear não sofrerá alteração se, ao invés de considerarmos ondas

longitudinais em z , utilizarmos um feixe fortemente focalizado. A equação acima também

prevê grande eficiência para o perfeito casamento de fase, 0k , para objetos grandes, com

L grande. Já para objetos muito pequenos, 0L , as condições de casamento de fase são

relaxadas, pois 0kL mesmo com 0k . Outro fator que facilita o casamento de fase é a

forte focalização dos feixes no foco das objetivas utilizadas para microscopia de óptica não

linear. As várias direções dos raios de luz no foco fornecem vetores de onda para casamento

de fase com grande ângulo entre si.

Nos processos SFG, Sum Frequency Generation, ou DFG, Difference Frequency

Generation, as condições de phase matching são dadas por:

1 1 2 2 1 2 0k k k k (2.1.26)

Para SHG 1 2 . No caso do THG, Third Harmonic Generation, a condição se

torna:

3 3 0k k k (2.1.27)

No caso do CARS, Coherent AntiStokes Raman Scattering, a condição é que:

1 1 2 2 1 22 2 0k k k k (2.1.28)

Quando L é muito pequeno, da ordem de grandeza de um comprimento de onda,

os dipolos oscilantes do material irradiam com o mesmo padrão de um dipolo oscilante, com

intensidade igual para frente e para trás. Para um volume grande, os dipolos na direção do

feixe oscilam coerentemente, e nessa direção ocorre o casamento de fase com interferência

construtiva entre os campos. Na direção oposta ao deslocamento dos feixes ocorre o

40

contrário. Como consequência, a intensidade da luz gerada em objetos grandes é maior para

frente (forward), mesma direção do campo, e pequena para trás (backward). Mas para objetos

pequenos a intensidade tende a ser a mesma nas duas direções. Na microscopia de óptica não

linear essa consequência é explorada, as imagens com sinal detectado para frente mostram

estruturas grandes, e para trás estruturas pequenas. É, inclusive, possível caracterizar o

tamanho dos objetos pela razão backward/forward.

2.2 - Introduções do eletromagnetismo e suas expansões

Definida a diferença entre os processos coerentes e incoerentes, podemos extrair

grande parte das propriedades de óptica não linear estudando o comportamento de um

dipolo apenas, situação típica dos processos incoerentes. No caso de processos coerentes é

necessário também considerar as condições de casamento de fase.

Podemos estudar os processos incoerentes via uma expansão nos dipolos com

uma força de restauração não harmônica. Para os processos coerentes é bom usar uma fonte

de radiação na equação da onda eletromagnética advinda das equações de Maxwell. O

processo de casamento de fase sai naturalmente dessa formulação dos processos coerentes.

Vamos tentar nos restringir aos casos de uma dimensão para evitar ao máximo as

complicações vetoriais e tensoriais que contribuem pouco para a intuição dos processos de

óptica não linear. A resposta não linear da matéria para um feixe de luz incidente é escrita da

forma de uma expansão em série da densidade de polarização

(1) (2) (3)P P P P (2.2.1)

Onde ( )nP representa o n-ésimo termo da qual a resposta da amplitude para o

campo incidente é da forma[21]:

(1) (2) (3)( ) : : :o o o oP E P E EE EEE (2.2.2)

Onde as suscetibilidades de primeira, (1) , segunda, (2) e terceira ordem, (3) ,

são tensores que dependem da frequência final do sinal gerado e dos campos incidentes.

41

O Próximo passo é considerar as moléculas como um dipolo oscilante devido aos

movimentos de oscilação das mesmas. Esse é o modelo de Lorentz.

Oscilador Harmônico Amortecido

Uma boa descrição para as propriedades ópticas de sólidos é fornecida pelo

modelo de um oscilador harmônico amortecido[21]–[23]. Vamos começar com a equação de

movimento de um elétron na coordenada x para um meio com resposta linear ao campo.

2

2

02/

d x dxx qE t m

dt dt (2.2.3)

Onde o

k

m é a frequência de ressonância do oscilador e

b

m é o seu

amortecimento. A solução dessa equação é dada por:

2 2

o

o

qE

mxi

(2.2.4)

Aqui vale notar que esse sistema responde para frequências abaixo da

ressonância, o na forma 2

1o o

o

qx E qE

m k , ou seja, como uma mola estática onde

F kx . Já para frequências altas, o , o deslocamento cai com 2

1

. Ou seja, o oscilador

responde como uma mola estática em frequências bem abaixo da ressonância, e não

responde mais para frequências bem acima da ressonância. As ressonâncias dos elétrons, com

massa muito menor do que a dos núcleos ocorre em frequências muito mais altas do que as

ressonâncias das vibrações dos núcleos. A menor massa dos elementos é do hidrogênio que

apresenta absorção no infravermelho na região de 2500 nm a 2800 nm, ou seja, nas

vizinhanças de 4000 cm-1. Elementos mais pesados possuem ressonâncias no infravermelho

mais longínquo. O CO2, por exemplo, utilizado em lasers de CO2, emite na região entre 9 a 10

m.

42

Quando nos referimos à óptica estamos, usualmente, nos referindo à região do

visível e do infravermelho próximo. Detectores de silício respondem até 1000 nm, então a

região do UV até 1000 nm está bem no escopo da óptica. Detectores de Germânio chegam a

1700 nm cobrindo as duas janelas das comunicações ópticas de 1300 nm e 1500 nm. Podemos

então delimitar o escopo da óptica até 2000 nm, abaixo das ressonâncias dos núcleos. Isso

significa que os núcleos, em princípio, se nada for feito, não respondem aos campos

eletromagnéticos aplicados. Já as ressonâncias eletrônicas tendem a cair no ultravioleta para

os materiais transparentes.

Uma situação típica é aquela em que utilizamos feixe de laser, cujo campo é dado

por i k x t

oE E e

, nas frequências ópticas onde vale a desigualdade e n . Nesse

caso os núcleos não respondem ao campo externo, mas os elétrons seguem os campos

eletromagnéticos aplicados, ou seja, i k x t

e ox t E e

. Os núcleos vibram por conta

própria, incoerentemente, na sua frequência natural de vibração, ou seja, n ji t

n nx t x e

.

Expansão da Polarização:

A polarização é dada pela distância elétron-núcleo, ou seja, trata-se de uma função

de duas variáveis ex e nx , dada por ,e np x x . O oscilador harmônico que obedece a lei de

Hooke, em que F k x , é apenas uma aproximação da realidade válida par deslocamentos

muito pequenos em torno da posição de equilíbrio. Para deslocamentos maiores sempre

aparecem não harmonicidades, exigindo que a expansão vá além da primeira ordem.

Influência da simetria de inversão na expansão:

A força 2

2

d xF m

dt é uma grandeza antissimétrica, ou seja, se trocamos x x

então F F . Considere uma expansão da força em série de potências do tipo:

2 3 2 2 1

1 2 3 2 2 1

n n

n nF x x x x x

(2.2.5)

43

Se uma molécula possui simetria de inversão então a operação nada

modifica. Não haverá qualquer restrição, entretanto, se não existir a simetria. Na molécula

com simetria de inversão temos:

Pela operação na expansão:

2 3 2 2 1

1 2 3 2 2 1

n n

n nF x x x x x x

(2.2.6)

Pela simetria da molécula

F x F x (2.2.7)

Isso significa que:

2 3 2 2 1 2 3 2 2 1

1 2 3 2 2 1 1 2 3 2 2 1

n n n n

n n n nx x x x x x x x x x

(2.2.8)

A igualdade só será possível se todos os termos que trocam sinal forem nulos, ou

seja:

2 2 2 0n n n (2.2.9)

Conclusão, então, é que em moléculas com simetria de inversão só as potências

ímpares existirão na expansão da força, ou apenas as potências pares existirão na expansão

do potencial. Se a molécula não possuir simetria de inversão todos os termos podem existir.

Considerando então a possível influência da simetria de inversão que anularia os

termos de potências pares, a expansão em série de Taylor da polarização em qualquer ordem

é dada por:

2 2 2

2 2

2 2

3 3 3 33 2 2 3

3 2 2 3

4 4 44 3

4 3 2 2

1, 2

2

13 2

3!

14 6

4!

e n o e n e n e n

e n e n e n

e e n e n n

e n e n e n

e e n

e n e n e

p p p p pp x x p x x x x x x

x x x x x x

p p p px x x x x x

x x x x x x

p p px x x

x x x x x

4 42 2 3 4

3 44e n e n n

n e n

p px x x x x

x x x

(2.2.10)

x x

x x

44

Assim, como a dependência dos campos só vem através dos elétrons, é

interessante separar a nossa expansão por ordem crescente no ex :

2 32 3

2 3

2 3 412 3

2 3

2 3 42

2 2 2 2

1 10

2 3!

1 11

3 3!

1 1 1

2 3 4

o n n n

n n n

n n n e

e n e n e n e

n n

e n e n e

p p pp x x x ordem

x x x

p p p px x x x ordem

x x x x x x x

p p px x

x x x x x

22

3 433

3 3

444

4

2

1 13

3! 3!

14

4!

e

n e

e n e

e

e

x ordem

p px x ordem

x x x

px ordem

x

(2.2.11)

Esses termos na expansão vão gerar os sinais da óptica linear e não linear.

O termo linear está relacionado com o índice de refração como 2 (1)

0

1n

[24], e com a polarizabilidade de uma molécula da forma (1)

o

P

E

. Quando uma onda

eletromagnética interage com um meio material, a energia do campo é armazenada

transitoriamente no meio com o alinhamento temporário dos dipolos do material com o

campo. Esse fenômeno é nomeado como a polarização P , ou densidade de dipolo. Essa

energia armazenada é irradiada e a velocidade do feixe é diminuída por interações com o

meio. Voltando para a solução do oscilador harmônico amortecido para o movimento do

elétron 2 2

oe

o

E qx

i m

, o que dá uma densidade de dipolo de

2

2 2

o

o

Nq E mP

i

com

2(1) 0

2 2

o

Nq m

i

. A consequência dessa equação é que a susceptibilidade de primeira

ordem tem dois termos, que representam dois efeitos gerados por uma onda eletromagnética

em um material, absorção e dispersão. Como 2 (1)1n , o índice de refração também tem

dois termos, sendo 2 (1)1real realn e 2 (1)

im imn , ficamos com ' ''n n in .

45

Quando incluímos a parte imaginária do índice de refração na equação de uma

onda plana em um meio temos: exp ' ''E i t n c z n c z , o primeiro termo da

exponencial indica a variação na velocidade de propagação da onda e no seu comprimento, já

que a frequência continua a mesma, e o segundo mostra que o campo decai

exponencialmente ao longo de z.

Figura 2.2.1 – (A) Gráfico de (1)1 real e (B) (1)

im .

Pela figura 2.2.1 à esquerda podemos ver a variação do índice de refração de um

meio perto de uma ressonância. Nota-se que para 0 o valor de 'n se aproxima de 1 com

' 1n , e quando 0 , 'n se aproxima com ' 1n . Quando 0 , 1n , e é o máximo de

absorção, gráfico à direita. Na vizinhança de 0 o comportamento de 'n varia

abruptamente entre positivo e negativo. Pelos gráficos podemos ver que, longe da

ressonância, n aumenta com o aumento de , esse comportamento é chamado dispersão

normal.

Considerando que um material tem várias ressonâncias então

22 0

2 21

i i

Nq mn

i

, quando é menor do que uma ressonância, o valor somado

será positivo, aumentando o n . Assim, para baixas frequências, com menor do que vários

0 , o índice de refração bastante elevado.

(A) (B) (1)1 real (1)

im

46

Continuando na expansão usando ni t

n nx t x e

e i k x t

e ox t E e

percebemos quais serão as frequências envolvidas. Nos termos de ordem zero, por exemplo,

temos as absorções/emissões no infravermelho e seus overtones. Só haverá interação com

radiação eletromagnética se a frequência da mesma acontecer no infravermelho. Mas nesse

caso o termo deixaria de ser de ordem zero.

2 32 32 3

2 3

1 1

2 3!

1 2 2 3

n n ni t i t i t

n n n

n n n

o o

n n

p p px e x e x e

x x x

fundamental overtone overtone

(2.2.12)

Para frequências no infravermelho podemos pensar nesses termos em um quadro

de absorção de fótons, transformando-os em fônons, através dos esquemas da figura 2.2.2.

Figura 2.2.2: (A) Absorção na frequência n . (B) Absorção do primeiro overtone na frequência

2 n . (C) Absorção do segundo overtone na frequência 3 n .

Em princípio as ressonâncias das vibrações moleculares ficam todas acima de 2,5

m em comprimento de onda, mas a absorção dos overtones pode trazer essa informação

para o infravermelho próximo (1 a 2 m), near infrared (NIR), às vezes com sensibilidade até

o 4º ou 5º overtone. Por isso a absorção NIR, mais confortável do ponto de vista tecnológico,

também é muito usada na caracterização de materiais.

(A) (B) (C)

47

Os termos de ordem um na nossa expansão são termos da óptica linear, pois são

proporcionais à intensidade do feixe incidente 2

oE , mas podem gerar frequências diferentes

da luz incidente quando interagem com os fônons.

2 322

2

433

3

1

3

Rayleigh Raman Stokes/AntiStokes Raman 1 overtone

1

3!

Raman 2 overtone

n n

n

i t i ti t

o n o n o

e n e n e

o

i i t

n o

n e

o

p p pE e x E e x E e

x x x x x

px E e

x x

(2.2.13)

O primeiro termo dá origem ao espalhamento Rayleigh, na mesma frequência do

feixe incidente. Já os termos que misturam as frequências do laser com as das vibrações dos

núcleos dão origem aos espalhamentos inelásticos Raman. Nesse espalhamento a energia da

luz não se conserva. Notamos que as combinações dos termos com i te e seus complexos

conjugados nos permitem misturar as frequências através da soma ou subtração.

Em diagramas de fótons e fônons podemos visualizar esses processos como

mostrado na figura 2.2.3:

Figura 2.2.3: (A) Espalhamento Rayleigh na frequência . Energia conservada, espalhamento

elástico. (B) Raman Stokes na frequência n . Geração de calor, aquecedor, espalhamento

inelástico. (C) Raman anti-Stokes na frequência n . Absorção de calor, refrigerador,

espalhamento inelástico.

(A) (B) (C)Virtual VirtualVirtual

48

Uma das medidas da qualidade de um sistema de detecção Raman é sua

sensibilidade para detectar até o 4º ou 5º overtone do Raman. Silício tem um fônon em torno

de 500 cm-1 e fabricantes de sistemas comerciais mostram linhas de fônons até 2500 cm-1.

O efeito Raman espontâneo foi descoberto por C. V. Raman em 1928 [25]. As

novas componentes com frequências menores do que a frequência incidente são chamadas

de componentes Stokes M , e as componentes com frequências maiores M são

chamadas de componentes Anti-Stokes.

Raman espontâneo é um efeito tipicamente pouco intenso. Por exemplo, em um

meio de 1 cm de espessura, aproximadamente 1 em 106 fótons da luz incidente serão

espalhados na frequência Stokes [26]. As linhas anti-Stokes são ainda mais fracas do que a

componente Stokes, isso por que, quando em equilíbrio térmico a população do excitado é

menor do que a do nível fundamental pelo fator de Boltzmann /ng kTe

. Raman possui

capacidade analítica muito superior à fluorescência por que as linhas são muito mais estreitas,

permitindo discriminar padrões com muito mais precisão. Raman traz a informação da

vibração molecular do infravermelho para o visível, com os seguintes ganhos – ganho alto de

resolução espacial devido ao comprimento de onda muito menor, evita absorção da água

sempre presente nos materiais biológicos, detectores na região do visível são muito mais

eficientes do que os detectores no infravermelho.

Os termos de ordem 2 são de óptica não linear:

2 3 42 2 22 2 2 2 2 2 2

2 2 2 2

1 1 1

2 3 4

hiper-Rayleigh/retificação Hiper-Raman Hiper-Raman overtone

n ni t i ti t

o n o n o

e n e n e

p p pE e x E e x E e

x x x x x

(2.2.14)

O primeiro termo de ordem 2 gera o espalhamento hiper-Rayleigh, na frequência

do segundo harmônico, e a retificação óptica. Basicamente ele eleva ao quadrado o ex .

Claramente, portanto, esse termo só existe em materiais sem simetria de inversão. Esse termo

com 2 é responsável por vários fenômenos de óptica não linear. Se apenas uma frequência

incide no dipolo esse poderá gerar o segundo harmônico, 2 2 2i t

e ox E e ou a retificação óptica.

Uma forma intuitiva de apresentar a retificação óptica é considerar o feixe harmônico como

49

uma onda cosseno, cose ox x t . Logo 2 2 2 2 2 21cos 1 cos 2

2e o ox E t E t . O

termo com o dobro da frequência surge naturalmente, assim como o termo independente da

frequência, que é a retificação óptica. Nesse caso a luz incidente faz surgir uma voltagem no

material. Um bom gerador de SHG na biologia é o colágeno, que possui moléculas quirais,

sem simetria de inversão. Além disso, o colágeno se arranja em hélices triplas que formam

fibrilas, figura 2.2.5, mantendo uma organização dos dipolos que favorece o sinal de SHG, em

comparação com espalhamento hiper-Rayleigh [27]. A figura 2.2.4 mostra diagramas de

fótons e fônons os overtones de Raman e o hiper Raman.

Figura 2.2.4: (A) Primeiro overtone Raman, espalhamento Stokes na frequência 2 n . (B)

Primeiro overtone Raman, espalhamento Stokes na frequência 3 n . (C) Hiper-Raman,

espalhamento Stokes na frequência 2 n .

(A) (B)VirtualVirtual Virtual

(C)

50

Figura 2.2.5: Representação de uma hélice tripla de colágeno7. Três cadeias polipeptídicas enroladas uma em torno das outras em forma de hélice para direita [28].

Além disso, existem ainda muitas outras possibilidades de uso desse primeiro

termo utilizando mais de um feixe. Vamos considerar a onda incidente composta por duas

frequências na forma:

1 2

1 2

i t i tE E e E e

(2.2.15)

Note-se que o conforto gerado pela álgebra dos números complexos, na forma

i te , tem um preço a pagar, que é a inclusão dos complexos conjugados para garantir o

resultado final real. Assim, onde existir i te também precisamos considerar o i te . Isso pode

ser tratado facilmente incluindo um nos termos adequados. Vamos supor 1 2 então

podemos colocar o campo elétrico na forma:

1 2

1 2

i t i tE E e E e

(2.2.16)

O termo de ordem 2 eleva esse campo ao quadrado, logo:

1 2 1 22 22

1 2 1 2

i t i t i t i tE E e E e E e E e

(2.2.17)

1 21 22 2 2 22 22 2 2

1 1 2 22i ti t i tE E e E E e E e

(2.2.18)

7 CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=379964

51

Assim temos os dois segundos harmônicos nas frequências 12 e 22 , mas

também a geração da soma de frequência na frequência 1 2 e a geração da diferença de

frequência. No caso degenerado 1 2 a soma de frequência será o segundo harmônico e a

diferença a retificação óptica. Em termos de fótons podemos ilustrar esses processos como

na figura 2.2.6.

Figura 2.2.6: (A) Segundo Harmônico de 1 . (B) Soma de frequência de 1 e 2 . (C) Segundo

Harmônico de 2 .

Vale notar que processos inversos também são possíveis – consideramos aqui dois

feixes incidentes nas frequências1 e

2 , que geraram um feixe na frequência soma 1 2 .

No processo inverso incidimos um feixe na frequência 1 2 e dois feixes são gerados

nas frequências 1 e

2 . O feixe de frequência mais alta chama-se Signal e o de mais baixa

chama-se Idler. Esse é um processo usado para, a partir de um feixe de frequência definida,

gerar outros comprimentos de onda. Os OPO´s [Optical Parametric Oscillator] e OPA´s [Optical

Parametric Amplifier] fazem exatamente isso. A escolha das frequências se dá através de um

processo de phase-matching. No OPO o processo é realizado em uma cavidade em que o feixe

gerado retorna sobre mesmo para coincidir temporalmente com o pulso de bombeio seguinte,

extraindo energia do mesmo a cada passagem pela cavidade. No OPA o pulso de bombeio tem

(A) (B) (C)

Virtual

Virtual

Virtual

52

tanta energia que uma passagem pelo meio amplificador é suficiente para gerar signal/idler

com energia suficiente.

O segundo termo da expansão dá origem ao hiper Raman, que seria

correspondente ao Raman do segundo harmônico na frequência 2 n . Tanto o Raman

como o hiper Raman trazem informações sobre os fônons das amostras, entretanto vale

salientar uma diferença importante entre os dois. O Raman depende do coeficiente

2

n e n e

p p

x x x x

, um operador par frente à operação inversão, e o hiper Raman do

coeficiente 2 3

2 2

n e n e

p p

x x x x

, um operador ímpar. Assim em uma amostra com simetria

de inversão os modos proibidos em uma das técnicas, serão permitidos na outra, e vice-versa.

As informações das duas técnicas, portanto, são complementares. O terceiro termo dá origem

ao overtone do hiper Raman e não é tão interessante.

Vamos agora aos termos de ordem 3, o primeiro deles, com 3 3

ex E permite a

gerar o terceiro harmônico simplesmente pelo fato de que 3

3i t i te e . Agora misturando

três ondas incidentes podemos gerar diversas frequências diferentes. Com

31 23

1 2 3

i ti t i tE e E e E e

, podemos gerar o terceiro harmônico das frequências 1, 2 e 3, ou

a soma das três 1 2 3 , ou ainda 1 2 3 e todas as combinações das 3 com valores

finais positivos. A condição de casamento de fase continua valendo para todos os processos.

Por exemplo, no caso da soma das 3 temos que 1 2 3 1 2 3k k k k , a

não ser no caso especial de amostras microscópicas. Um termo muito interessante é o termo

que mistura com os fônons.

43

3

1

3!n e

n e

px x

x x

(2.2.19)

Isso porque ele dá origem ao CARS [Coherent AntiStokes Raman Scattering] e o

CSRS [Coherent Stokes Raman Scattering]. Basicamente usamos 3 fótons incidentes com 2

frequências diferentes de tal forma que a diferença entre as duas seja exatamente a

frequência do fônon. O batimento entre os dois feixes na frequência do fônon agora é capaz

53

de forçar a vibração nuclear e amplificar o Raman espontâneo. Também coloca todos os

osciladores em fase gerando um sinal coerente. Assim 1 2 n podemos ter então

1 22 n .

Sendo um tensor de quarto rank, dependente de quatro frequências e quatro

polarizações, (3) permite o estudo da quarta onda gerada que carrega informação a respeito

da frequência, polarização, fase e intensidade da interação descrita por (3) .

O processo não linear que descreve espalhamento Raman anti-Stokes coerente,

CARS, é um processo de mistura de quatro ondas, ilustrado pela figura 2.2.7.

Figura 2.2.7: (A) Esquema de níveis de energia para processo CARS. B – Condição de casamento de fase.

Um feixe de bombeio (pump beam) na frequência p e um feixe Stokes na

frequência s p s incidem e devem estar sobrepostos espacialmente e temporalmente

na amostra. Isso cria um batimento do campo elétrico na frequência p s . Quando a

frequência do batimento iguala uma frequência vibracional das moléculas R , é produzido

um forte sinal de frequência anti-Stokes 4 4 p s p que é coerente na fase em

relação aos feixes de entrada.

CARSk

Pumpk

Stokesk

Pumpk

(B)Virtual

Virtual

CARS

p

um

p p

um

p

St

oke

s

(A)

R

54

Como esse é um processo de excitação forçada, a natureza coerente do processo

resulta na geração de um campo que propaga em uma direção específica com um vetor de

onda 4k definido pela relação:

4 p s pk k k k (2.2.20)

Onde 2n n nk n . A equação acima descreve a condição de casamento de fase,

que é uma consequência da geração coerente do sinal, e dependente da dispersão no índice

de difração do material. Essa equação é importante quando a dispersão do material é

significante, os feixes devem incidir em ângulos específicos para que a equação seja satisfeita,

a figura 2.2.7-B ilustra essa situação.

2.3 - Cálculos de (2) e (3) com modelo clássico

Uma boa descrição para as propriedades ópticas de sólidos é fornecida pelo

modelo de um oscilador harmônico. Vamos estender esse modelo permitindo a possibilidade

de não linearidades na força de restauração exercida no elétron. Vamos começar com a

equação de movimento de um elétron em x para um meio com resposta linear ao campo.

2

2 2

02/

d x dxx ax qE t m

dt dt (2.3.1)

E vamos misturar duas frequências 1 e 2 .

1 2

1 2 1 2. .i t i tE E E E e cc E e cc

(2.3.2)

Nessa equação assumimos que o campo elétrico é dado por E t , a carga do

elétron é q e sua massa é m . Há uma força de restauração dado por

2 2

0restauraçãoF m x max , que são os dois primeiros termos da série de Taylor para a força

restauradora. O potencial tem a forma de:

2 2 3

0

1 1

2 3restauraçãoU F dx m x max (2.3.3)

55

O primeiro termo da equação (2.3.3) corresponde ao potencial harmônico e o

segundo termo corresponde ao termo de correção anarmônica. Como 2x x nesse primeiro

momento vamos desconsiderar o termo com 2x .

Uma solução geral para (2.3.1) com o campo elétrico de (2.3.2) não é conhecida.

Entretanto, para um campo suficientemente fraco, o termo 2ax em (2.3.1) é muito menor do

que o linear, 2 2

0 x ax . Sob essas circunstâncias a equação (2.3.1) pode ser resolvida por

uma expansão tipo perturbação, vamos substituir E t por E t , onde é o parâmetro

com extensão contínua entre zero e um e que será estabelecida como um no final do cálculo

[22]. O parâmetro caracteriza a força da perturbação. A equação (2.3.1) Torna-se:

2

2 2

02/

d x dxx ax qE t m

dt dt (2.3.4)

Procuramos soluções para a equação (2.3.4) na forma de uma série de potências

em da forma.

2 3

1 2 3x x x x (2.3.5)

Para que a equação acima seja solução para a eq. (2.3.4) é necessário que os

termos proporcionais com que satisfaçam a equação separadamente. Encontramos as

seguintes equações.

2

21 10 12

/d x dx

x qE t mdt dt

(2.3.6)

2

2 22 20 2 12

0d x dx

x axdt dt

(2.3.7)

2

23 30 3 1 22

2 0d x dx

x ax xdt dt

(2.3.8)

E etc.

A solução para (2.3.6) com os campos de (2.3.2).

56

1 2

1 2

1

1 2

. .i t i t

q qE E

m mx e e c c

D D

(2.3.9)

Com 2 2

i i iD i . Queremos o termo da força que vai com 2x e o

termo que gera a onda na frequência diferença, abaixo temos todos os termos:

1 2 1 2 2 1 1 2

2 2 2 2

* * * *

1 2 1 2 1 2 1 22

1 * * * *

1 2 1 2 1 2 1 2

i t i t i t i t

q q q qE E E E E E E E

m m m mx e e e e

D D D D D D D D

(2.3.10)

Note que o o presente nos D nesse caso se refere à ressonância eletrônica

no UV. Mas agora, na equação da força, temos que considerar as vibrações nucleares [29].

Antes elas não respondiam por conta da frequência muito alta. Mas a diferença de frequência

agora cai no mesmo intervalo da vibração nuclear. Vamos considerar agora a equação de

movimento de (2.3.7) e considerando a força restauradora com o termo 2x considerando

apenas o termo com 1 2 . Então a nova equação (2.3.7) é dada por:

1 2

2*

1 2222 2

22 *

1 2

i t

n n

n

qa E E

md x dxx e

dt dt M D D

(2.3.11)

Cuja solução é dada por:

1 2

2*

1 2

2 2* 21 2 1 2 1 2

1 i t

n n n

qa E E

mx e

M D D i

(2.3.12)

Onde 22

1 2 1 2 1 2n n nD i .

1 2 1 2

2 2* *

1 2 1 2

* * *

1 2 1 2 1 2 1 2

i t i t

n

n n n n

q qa E E a E E

m mx e e

M D D D M D D D

(2.3.13)

57

Se ao invés de nx calcularmos para ex novamente, com os dois campos oscilando

na mesma frequência, encontraremos o deslocamento responsável pelo hiper Rayleigh.

2

2

2

2. .

2

i t

H Rayleigh

qa E

mx e c c

D D

(2.3.14)

Esse termo mostra que o segundo harmônico terá ressonância com níveis

eletrônicos com energia e 2 . No caso do terceiro harmônico, fazemos mais uma

operação com o deslocamento do elétron.

3

3

3

3 3. .

3

i t

qE

mx e c c

D D

(2.3.15)

O termo com 3x leva a 3 3 1cos cos cos 3

4 4t t gerando um sinal na

mesma frequência e outra no terceiro harmônico. O terceiro harmônico terá ressonância com

níveis eletrônicos com energia e 3 .

Voltando para a equação (2.3.13), a polarização vai depender também da vibração

nuclear. Pegando apenas o termo do CARS.

2

,n e n e

n e

PP x x x x

x x

(2.3.16)

Agora é combinar o nx e ex com as conjugações certas:

1 2 1 2

1 1 2 2

2 2* *

1 2 1 2

1 * * *

1 2 1 2 1 2 1 2

* *

1 1 2 2

* *

1 1 2 2

i t i t

n

n n n n

i t i t i t i t

q qa E E a E E

m mx x e e

M D D D M D D D

q q q qE E E E

m m m me e e e

D D D D

(2.3.17)

58

São oito combinações, sendo quatro pares de complexos conjugados. Estamos

interessados apenas nas duas frequências que geram o CARS e o CSRS. Mas podemos ver

todas:

1 2 2 12 1

2

2* * *

1 2 1 1 2 22 2

1 * * *

1 2 1 2 1 1 2 2

2*

1 2 1

* *

1 2 1 2 1

i t i ti t i t

n

n n

i t

n n

q q q q qa E E E E E E

m m m m mx x e e e e

M D D D D D D D

q q qa E E E

m m me

M D D D D

1 2 2 1 1

* *

1 2 22 2

* *

1 2 2

i t i t i t

q qE E E

m me e e

D D D

(2.3.18)

Vemos então que o dipolo induzido oscila com as frequências 1 22 , 2 12 ,

1 e 2 . Pegando os termos que interessam, nas frequências do CARS 1 22 e do CSRS

2 12 temos:

1 2

2 1

32 *

1 222

1 2 *

1 2 1 2

3* 2

1 222

* 2 *

1 2 1 2

i t

n

n n

i t

n n

qa E E

mx x e cc

M D D D

qa E E

me cc

M D D D

(2.3.19)

1 2

32 *

1 2222

2 *

1 2 1 2

i t

CARS

n e n n

qa E E

mpp e

x x M D D D

(2.3.20)

Logo:

1 2

322 *

1 2 1 2222

2 *

1 2 1 2

2i t

CARS

n e n n

qa E E

mpp e

x x M D D D

(2.3.21)

Na zona de radiação o campo é dado segundo a equação 2.1.2 no início do

capítulo. No caso eletromagnético a densidade de energia é dada por 21

2ou E e a

59

velocidade é a velocidade da luz c , então 21

2oI E c . O módulo quadrático do campo

irradiado agora vale:

2 2 22

20

2 6 2 3 6

0

1 1sin

2 32 32

oo

cI E c r r p r p

r c r

(2.3.22)

4 2 2

2 3 6

0

sin

32

r pI

c r

(2.3.23)

44 2 26 2 2 21 2 1 2

2 2 222 3 4 2 2 *

0 1 2 1 2

2 sin

32 n en n

q a E E pI

x x rc m M D D D

(2.3.24)

4 26 2 2 21 2 2

1 22 2 3 3 222 3 4 2 2 *00 1 2 1 2

2 8 sin

32 n en n

q a pI I I

x x c rc m M D D D

(2.3.25)

Note agora que em termos da varredura em frequência em torno da ressonância

no infravermelho, o comportamento é dado por:

22 2 22 2

1 2 1 2 1 2n n nD

(2.3..26)

4

1 2

22 22 2

1 2 1 2

2CARS

n n

I

(2.3.27)

Considerando

1 2

32 *

1 2222

2 *

1 2 1 2

i t

CARS

n e n n

qaN E E

mpP e

x x M D D D

(2.3.28)

E

1 22(3) 2 *

0 1 2

i t

CARSP E E e

(2.3.29)

Encontramos

60

2 23 3

(3)

2 2 * 22 2 * 20 1 2 1 2 0 1 2 1 2 1 2

n e n e

n n n n n

p paq N aq N

x x x x

M m D D D M m D D i

(2.3.30)

Checando a dimensionalidade de (3) , com 0

[ ]

[ ]

F

m , 2[ ]D s , 3[ ]N m ,

2

0 1

2 2

2

[ ][ ] 1

[ ] [ ][ ]

xa

x m s

.

8 3 2

(3)

3 2 3 2

[ ][ ][ ][ ][ ] [ ]

[ ][ ][ ][ ][ ][ ][ ] [ ]

C m s C m m

m m m m s kg F V (2.3.31)

Próximo da ressonância a susceptibilidade pode ser aproximada por

23

(3)

2 2 *

0 1 2 1 22 2

n e

n n n n

paq N

x x

M m D D i

(2.3.32)

Vamos estudar o comportamento de (3) separando a parte real da parte

imaginária, como a frequência de vibração eletrônica está muito acima da frequência dos

feixes incidentes, vamos considerar iD constante e real. (3) (3) (3)Re Imi ,

onde:

23

1 2(3)

2 2 * 2 20 1 2

1 2

Re2 4

n e n

n nn n

paq N

x x

M m D D

(2.3.33)

23

(3)

2 2 * 2 20 1 2

1 2

2Im

2 4

n e n

n nn n

paq N

x x

M m D D

(2.3.34)

Para 1 2 n e substituindo 2n a figura 2.3.1 mostra a relação da

susceptibilidade com .

61

Figura 2.3.1: Relação entre e a susceptibilidade, com 1 .

Combinando esse resultado com o encontrado em 2.1, 2

(3)

CARSI temos que a

intensidade do sinal de CARS será proporcional a:

2(3)

2 2

1 2

1

2n n

(2.3.35)

Esse resultado mostra que o sinal de CARS ressonante tem uma dependência com

igual à (3)Im , mostrado na figura 2.3.1. Veremos na próxima seção que a curva do sinal

de CARS é bem diferente da figura 2.3.1, pois devemos considerar o sinal gerado pela

contribuição não ressonante de (3) , figura 2.3.2.

4 2 0 2 4

0.4

0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(3)Re

(3)Im

a.u

.

62

Figura 2.3.2: Contribuições para o sinal de CARS - (A) Ressonante. (B) Não ressonante devido a linhas Raman fora de ressonância. (C) Não ressonante devido à absorção de dois fótons.

O termo não ressonante de (3) , que vamos escrever como (3)

NR é de particular

importância, ele é integrado pelas contribuições de transições eletrônicas de níveis virtuais,

envolvendo linhas Raman fora de ressonância e absorção de um e dois fótons. Esse termo

sempre contribuí para o sinal, mesmo quando longe da ressonância, e flutuações nesse sinal,

devido à flutuação na intensidade dos lasers, limita seriamente sensibilidade do CARS.

Geração de Terceiro Harmônico por um feixe Focalizado

Sabemos que (3) é não nulo para todos os materiais. Mas quando o terceiro

harmônico é gerado por um feixe focalizado a variação de fase do feixe devido à focalização

interfere na geração do sinal. Esta anomalia de fase, que leva o nome de mudança de fase de

Gouy (1890), tem consequências importantes para a óptica não linear. A polarização de

terceira ordem sofre uma mudança de fase três vezes maior do que o feixe fundamental, essa

mudança impossibilita o acoplamento correto da polarização com o campo. Resultado que foi

Virtual

Virtual

CARS

p

um

p p

um

p

St

oke

s

(A)

R

Virtual

Virtual

CARS

pu

mp

pu

mp

St

oke

s

(B)

R

Virtual

p

um

p

pu

mp

St

oke

s

R

CARS

(C)

63

primeiro demonstrado por Boyd[23] e precedeu a primeira microscopia[30] por geração de

terceiro harmônico realizada por Barad.

Para uma interface de dois meios com diferentes valores de (3) perpendicular à

direção de propagação do campo, o sinal de terceiro harmônico gerado por um feixe

gaussiano será[31].

2

(3)

12

2

021THG

iz

kI

(2.3.36)

Onde 0 é a cintura do feixe, iz é à distância à interface dos dois meios e

(3) (3) (3)

1 2 é a diferença de (3) para os dois meios.

No caso de uma interface paralela à direção de propagação do feixe, Cheng[32]

demonstrou numericamente que também terá geração de terceiro harmônico. Podemos

concluir que desde que haja variação de (3) dentro do volume focal teremos algum sinal de

terceiro harmônico.

2.4 - CARS

Espalhamento Raman anti-Stokes coerente ou CARS é uma das técnicas de Raman

coerente mais utilizadas. O primeiro estudo de processos Raman não linear foi realizado por

Maker e Terhune [3], trabalho desenvolvido na companhia automotiva Ford. Curiosamente, o

nome CARS, apareceu nove anos depois [4]. A primeira demonstração de microscopia CARS

remonta a 1982 [33], em 1999 imagens 3D, com alta sensibilidade, de células vivas foi

demonstrada [2].

Conforme explicado no início deste capítulo, os sinais de Raman espontâneo são

tão fracos (10-16 da fluorescência) que o uso desse processo para produção de imagens requer

alta potências (~100mW) de excitação e longos tempos de aquisição (horas para uma

imagem). Para imagem de células vivas com potência moderada (~10mW) em tempo real

(>1fps), a técnica deveria produzir sinais de quatro a cinco ordens de magnitude maiores.

64

Vamos supor um exemplo onde uma imagem de 1 Mpixel (1000 x 1000 pixels),

onde seja necessário 10 ms/pixel para aquisição do sinal Raman. O tempo total para

construção da imagem seria de 3 6 410 10 10 10 segundo, ou seja, 2,8 horas, quase 3 horas

de aquisição. Para a mesma imagem com o CARS seria necessário apenas aproximadamente

1 segundo.

O sinal resultante (na frequência Anti-Stokes 2 p s ) é várias ordens de

grandeza maior do que o sinal de Raman espontâneo. Quando p s é ajustado para fora

das vibrações ressonantes, uma polarização pode ser induzida na frequência anti-Stokes

devido à resposta eletrônica do material. Assim, quando p e s estão longe das

ressonâncias, temos uma contribuição vibracional não ressonante para o sinal de CARS.

Quando p s é ajustado para uma frequência vibracional particular, o sinal anti-Stokes é

aumentada. Sendo assim, para o sinal de CARS, o (3) tem dois termos, um ressonante

(3)

(3) RR

i

e outro não ressonante (3)

NR .

(3)

(3) (3) RNR

i

(2.4.1)

Onde é a dissintonia dada por p s R (Deslocamento Raman), onde

R é o centro da frequência da linha Raman Homogênea com largura de banda .

Como o sinal de CARS é proporcional a 2

(3) , a intensidade do sinal anti-Stokes

pode ser escrito como:

2 2

(3) (3) (3) (3)( ) ( ) 2 Re ( )CARS NR R NR RI (2.4.2)

O primeiro termo é independente do deslocamento Raman, e é conhecido como

nonresonant background (fundo não-ressonante). O segundo termo contém apenas sinais

ressonantes, e é a contribuição dominante quando analisando espalhamentos ressonantes. O

terceiro termo é criado com uma mistura entre as contribuições ressonantes e não

ressonantes que contém a parte real da resposta vibracional. O somatório dos três termos cria

um deslocamento para o vermelho (red shift) no espectro de CARS no pico de máximo sinal e

65

uma depressão do sinal para o azul (blue shift), figura 2.4.1. O sinal não ressonante acrescenta

às imagens de microscopia CARS um fundo (background).

Figura 2.4.1: (A) As três componentes do sinal de CARS em função da dessintonia . (B) Sinal total de CARS. Com 1 , (3) 1NR e (3) 1R .

Quando a técnica CARS é empregada para a construção de imagens microscópicas

as condições de casamento de fase são facilmente obedecidas, pois se utilizam objetivas com

aberturas numéricas consideráveis, sendo assim no foco da objetiva há raios de luz em várias

direções para os dois feixes, isso minimiza o termo kz e aumenta o sinal. O tamanho do foco

do laser e o tamanho dos objetos também influenciam na facilidade de obedecer à condição

de casamento de fase.

Apresentamos abaixo um resumo das principais características que fizeram a

microscopia CARS uma técnica popular [34], são elas:

Contraste vibracional intrínseco, contornando a necessidade de marcadores

exógenos. A acumulação de sinal coerente no processo CARS produz um sinal direcional forte,

fazendo a microscopia CARS mais sensível do que microscopias vibracionais convencionais.

Microscopia CARS requer potências moderadas que são toleradas por amostras biológicas. O

sinal é gerado somente no foco, onde a intensidade de excitação é maior. O que leva a

possibilidade de imagens 3D, essencial para imagens de tecidos e estruturas celulares. O sinal

possui frequência mais alta do que a fluorescência por um fóton, permitindo a fácil detecção

mesmo na presença de forte sinal de fluorescência.

4 2 0 2 4

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4 2 0 2 4

1.0

0.5

0.0

0.5

1.0

(A) (B)

2(3)

NR2(3) ( )R

(3) (3)2 Re ( )NR R

2(3)

2(3)

NR

66

2.5 - CARS por mistura de seis ondas

O sinal de CARS por mistura de seis ondas possui comprimento de onda de

3 2SWMC p s , sendo dependente com o cubo da intensidade do feixe de pump, 3

pI , e

com o quadrado da intensidade do feixe de Stokes, 2

sI . Nesse comprimento de onda há a

contribuição de três tipos de efeito não lineares, o CARS de segunda ordem [17], e o efeito

cascata do CARS paralelo e o sequencial [35]. A figura 2.5.1 mostra o esquema de energia

desses três processos.

Figura 2.5.1: Mistura de seis ondas por: (A) processo direto com dois níveis Raman, (B)

processo cascata paralelo, (C) processo cascata sequencial.

O CARS de segunda ordem é proporcional à susceptibilidade não linear de quinta

ordem 5

SOCARSP , figura 2.5.1-A. Nos processos em cascata, o fóton gerado por um

primeiro processo CARS irá alimentar um segundo processo junto com mais um fóton de cada

feixe, esse processo é proporcional à (3) (3)

( ) ( )carsCCARS p s p p sP . No processo cascata

paralelo o fóton de CARS é absorvido por uma molécula em um nível vibracional excitado

devido aos feixes de pum e Stokes, figura 2.5.1-B. No processo sequencial o fóton de CARS é

absorvido junto com um fóton do Stokes e excita a molécula para um overtone da vibração

p

p

p

s

s'SWM

(A)

(B) (C)

p

s

p CARS

s

CARS

SWM

p

p

s'SWMCARS

'

Raman

Raman

Raman

Raman

'

Raman

Raman

p

s

p CARS

Raman

Mo

lecu

le1

Mo

lecu

le1

Mo

lecu

le2

Mo

lecu

le2

0

0

0

1

2

1

1

0

1

0

1

2

67

molecular, figura 2.5.1-C. O processo cascata paralelo é dominante, e o processo de quinta

ordem direto chega ao máximo de 2% do sinal cascata [36]–[38].

Como (3) (3)

( ) ( )carsp s p p s então como visto na seção 2.2.1 à intensidade do

sinal cascata será proporcional 2

2(3)

CCARSI , de forma expandida temos:

4 34(3) (3) (3) (3)

22 2 2(3) (3) (3) (3) (3) (3)

( ) 4 Re ( )

2 ( ) 2 Re ( ) 4 ( ) Re ( )

CCARS NR R NR R

NR R R NR R R

I

(2.5.1)

O primeiro termo da equação é puramente não ressonante, e não é dependente

do deslocamento Raman. O segundo termo é fortemente dependente do deslocamento

Raman, os outros termos todos tem misturas ressonantes e não ressonantes entre eles. Os

termos da equação acima estão traçados nos gráficos da figura 2.5.2.

Figura 2.5.2 – Gráfico com as componentes do sinal de CARS cascata em função da dissintonia . Os números representam os termos da equação 2.5.1. Com 1 , (3) 1NR e (3) 1R

A figura 2.5.3 compara o sinal de CARS com o sinal de CARS cascata.

4 2 0 2 4

2

1

0

1

2

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

68

Figura 2.5.3: Gráfico com o sinal resultante de CARS e CARS cascata em função da dessintonia . Em (A), CCARS em vermelho, CARS em preto e (3)

NR em verde. Em (B) temos os dois sinais

normalizados em comparação com o sinal não ressonante, CCARS em vermelho, CARS em preto e (3)

NR normalizado pelo máximo de CARS em verde, e pelo máximo de CCARS em verde

escuro tracejado. Com 1 , (3) 1NR e (3) 1R .

Pelo gráfico da figura 2.5.3 podemos ver que a influência do termo não ressonante

será menor no efeito cascata. Pela equação.

2

(3) 2 *

1 22

1

2

i kL

nn

n

i eA A A

c

L

kik

(2.5.2)

2 2 2

2(3) * (3) 3 *2

1 2 1 22 4

2

2

1 1 1

4

n Cni k L i k Li kL

Cn Cn nCn n

Cn Cn n n Cn

i L L

i

e e eA A A A A A

c k k c k ik k ki

(2.5.3)

Na condição de casamento de fase:

22 2

2(3) 3 *2

1 244

Cn nCn

Cn n

A A Ac k

L

k

(2.5.4)

Com:

2

22 2

42 (3) 3 20 05 1 242 2 4

Cn nCn

Cn n

cn cnI A

c k

L

k

(2.5.5)

O sinal cascata do CARS apresentará uma dependência ao cubo da potência do

feixe de bombeio e ao quadrado com o feixe Stokes.

4 2 0 2 40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4 2 0 2 40

1

2

3

4

5

6

7

(A) (B)a.

u.

a.u

.

69

2.6 - Limiar de detecção para as duas técnicas

Faremos a seguir uma análise da relação sinal/ruído para as duas técnicas,

discussão equivalente foram feitas por Yariv [39] e Eesley [40]. Vamos começar definindo os

tipos de ruídos que interferem nas medidas, tanto da média da resposta do detector para a

intensidade do sinal quanto do valor quadrático médio da resposta devido a flutuações de

potência dos lasers.

Com relação à detecção de sinais ópticos, ruído é uma flutuação aleatória na

medida, que limita a precisão com que conseguimos detectar intensidades muito baixas ou

pequenos incrementos na intensidade de um sinal. Vamos considerar três tipos de ruídos que

interferem nas medidas, o primeiro é o ruído de Johnson, que é devido à flutuação na

voltagem em um elemento dissipativo do circuito, essas flutuações são causadas pelo

movimento térmico dos portadores de carga. No caso das fotomultiplicadoras, o ganho pode

chegar a 610 , o que minimiza o ruído térmico, nos nossos cálculos iremos desconsiderá-lo. O

segundo é o shot noise, resultado da incerteza em determinar a magnitude da resposta

absoluta do detector em um tempo finito. E por último temos o ruído na potência dos pulsos

dos lasers.

A taxa de fótons incidente em um fotocatodo é , onde é a potência de um

sinal interceptado pelo detector. Considerando que são necessários 1 fótons para gerar

um elétron, a corrente é dada por.

q

i t t

(2.6.1)

Agora vamos definir K .

,G q

K i t K t

(2.6.2)

Com A

t I t dA , onde G é o ganho do detector, sua eficiência quântica,

q a carga do elétron e A é a área ativa do detector.

70

O tempo de resposta T finito do detector e a média temporal da potência

fotocorrente pode ser escrita como:

2

2 2 2

2

1 T

Ti t i t dt i

T

(2.6.3)

Devemos multiplicar esse valor por R para termos a potência no detector, como a

resistência vai aparecer tanto no termo do sinal quanto no termo do ruído, iremos suprimi-la.

Como o sinal responde não linearmente com a intensidade de dois lasers vamos

definir 2

como a propagação das incertezas da amplitude dos lasers

2 2

2 2 2 2 2 2

pump Pump Stokes Stokes

pump Stokes

i ii P P

P P

(2.6.4)

Onde Pump é a variação da potência do feixe de pump, Stokes é a variação da

potência do feixe de Stokes. No nosso caso teremos:

2 2 24 Pump Stokes (2.6.5)

Uma equação comum para o shot noise em corrente elétrica é

2 ( )2 S

S d di t qG i i K i i (2.6.6)

Onde é a largura de banda do detector, que escala com 1 T , onde T é o

tempo de resposta do detector, G o ganho, q a carga do elétron, di é a corrente escura. Onde

( )SK é a corrente de um elétron emitido por tempo de resposta T .

Vamos considerar o caso quando o sinal dominante no CARS for resultado de

processos não ressonantes, nesse caso 2 2

(3) (3)

R NR , isso pode ser devido às linhas

Raman fracas, ou no caso de baixa concentração de moléculas ressonantes em uma alta

concentração de solvente. O sinal será majoritariamente devido à (3) (3)2 Re ( )NR R ,

enquanto o ruído resultante do shot noise e da variação da potência dos lasers será devido à

2(3)

NR .

71

Com

22

2 2(3) 2 (3) 20

1 2 1 222 2

nCARS CARS

n

cnI B

c k

L

(2.6.7)

E

22 2

4 4(3) 3 2 (3) 3 20

1 2 1 24

2

2 4

Cn nCCARS CCARS

Cn n

cnI C

c k k

L

(2.6.8)

A corrente gerada no detector devido a esse sinal será

2

2 2 2 2 (3) (3) 22 Re ( )CARS CARS NR R C pARS si K K B A

(2.6.9)

E

2

222 2 2 (3) 2

CARSNR CARS NR p si K K B A

(2.6.10)

A corrente gerada pelo shot noise será dada por

2 ( )S

S d CARSi K i K (2.6.11)

Aqui a corrente devido ao sinal é muito maior do que a corrente escura,

CARS di K i . Vamos desconsiderar o shot noise da corrente escura.

2

2 ( ) (3) 2

CARS

S

S NR p sBi K K A

(2.6.12)

O Ruído devido ao sinal não ressonante será gerado pela variação na corrente

gerada pelo sinal não ressonante.

2

22 2 2 2 2 (3) 24NR NR Pump Stokes NR pC sARSBi K A

(2.6.13)

Obtemos agora a relação de sinal/ruído

72

22 (3) (3) 2

22 2

2 2 2 (3) 2 ( ) (3) 2

2 Re ( )

4

CARS NR R p s

SCARSPump Stokes CARS NR p s CA

CARS

CARS CARS NR pR sS

K AS

NK A K K B A

B

B

(2.6.14)

Para o CARS cascata faremos de forma análoga, mas dessa vez vamos considerar

o termo 3

(3) (3)4 Re ( )NR R como responsável pelo sinal detectado e o ruído será devido ao

sinal não ressonante, proporcional à 4

(3)

NR . Temos então as seguintes equações para a

corrente no detector, o ruído devido à variação dos lasers e ao shot noise.

2

32 2 2 2 (3) (3) 3 24 Re ( )CCARS CCARS NR R pCCARS sCi K P K A

(2.6.15)

2

42 2 2 2 2 (3) 3 29 4NR NR CCPump S ARStokes NR p sCi K A

(2.6.16)

4

2 ( ) (3) 3 2

CC

S

S NR p sARSCi K K A

(2.6.17)

E chegamos à

23

2 (3) (3) 3 2

24 4

2 2 2 (3) 3 2 ( ) (3) 3 2

4 Re ( )

9 4

CCARS NR R p s

SCCARSPump Stokes CCARS NR p s CCARS CCARS NR

CCARS

CCARS p sCCARS

K AS

NK A K A

C

C CK

(2.6.18)

Para o caso de pouco variação dos lasers, considerando apenas o shot noise temos.

2(3)

2(3) 2

Re ( )

22 Re ( )

RR CARS p s

CARS

B AS

N

(2.6.19)

2(3) (3)

2(3) (3) 3 2

Re ( )

88 Re ( )

NR RNR R CCARS p s

CCARS

C AS

N

(2.6.20)

73

Onde

2(3)

Re ( )R

é equivalente a potência de um sinal gerado somente pelo

quadrado do termo real de (3)

R , e

2(3) (3)

Re ( )NR R

é equivalente à potência gerada pelo

quadrado do termo real de (3)

R multiplicado pelo (3)

NR . Para encontrarmos o mínimo sinal

detectável precisamos de uma razão sinal ruído de um.

2

(3)Re ( ) 2R

(2.6.21)

2

(3) (3)Re ( ) 8NR R

(2.6.22)

As equações acima correspondem ao limite quântico da detecção do sinal de CARS

e CARS cascata, indicam que para que o ruído do shot noise seja superado é necessário que

seja detectado um fóton, respectivamente a cada dois e oito segundo, com energia .

Como a eficiência quântica é dependente da energia do fóton podemos comparar

os valores de

2 2(3) (3) (3)

Re ( ) Re ( )

4NR R R

temos então

2

2(3)

2

2

22 2

2 22 2

4

2 1

4

2

44

n

n Cn

CnCn n

NR

p s

p

Cn n

s

c k c k

c k k

L

LL

(2.6.23)

(3)

NR

p Cs nL

c

(2.6.24)

(3)

s

n

p NR

C

cA A

L (2.6.25)

Se (3)

Cnp s NRA A c L então o sinal do CARS cascata terá uma relação sinal ruído

maior do que a do CARS quando o ruído for majoritariamente dependente do shot noise.

Vamos considerar a distância L com o mesmo valor da resolução para a

microscopia multifóton para um feixe focalizado. Para uma resolução de 21.4n NA , onde

74

NA é a abertura numérica da objetiva, no nosso caso usamos objetivas com 0.3 e 0.5 NA ,

1,33n ( n da água) e comprimento de onda de aproximadamente 1000 nm. Usaremos o

diâmetro do feixe focalizado como 0.46 NA , que nos dá uma área de

2

120.46 1.84 102

Area mNA

, e potência média de cada feixe como 20 W potência

de pico 51.33 10AVp

p rep

PP W

t , essa potência média foi usada para as imagens de

tecidos, mas pode ser aumentada. Calculamos então o valor mínimo de (3)

NR para que a razão

sinal-ruído do CARS cascata seja maior.

22

(3)

1.4 1.4

1NR

Cn

p sCn s p

NANA

n

c

A A A A

(2.6.26)

com 0 0

22 pnnn

n

PIA

cn cn A .

(3) 22 2 27.8 10NR m V (2.6.27)

Em amostras biológicas o sinal não ressonante é gerado majoritariamente por

água, pela literatura[23] encontramos (3) 22 2 22.5 10 m V para a água. Valor bastante

próximo e aproximadamente 3 vezes menor do que o limiar. Esse valor não é dependente da

abertura numérica da objetiva, sendo dependente somente da potência de pico dos feixes. Se

aumentarmos a potência de pico por um fator de três, totalizando 60 W, já seria suficiente

para igualar o valor mínimo de (3)

NR .

No caso do shot noise ser desprezível quando comparado com o ruído devido à

variância da potência dos feixes teremos:

2(3)

22 2 (3)

4 Re ( )

4

R

CARSPump Stokes NR

S

N

(2.6.28)

2(3)

22 2 (3)

16 Re ( )

9 4

R

CCARSPump Stokes NR

S

N

(2.6.29)

75

Para Pump Stokes , então:

1,538CCARS

CARS

S N

S N (2.6.30)

Nesse caso em que só consideramos somente variação de cada laser, a razão sinal

ruído de CCARS será sempre maior do que para o CARS, independente de outros fatores. Esses

dois resultados para o cálculo do limite de detecção para as duas técnicas mostra a eficácia da

técnica proposta. A única limitação está na potência do sinal emitido, que será menor do que

o CARS, e o aumento da intensidade dos feixes de pump e Stokes podem causar danos às

amostras.

2.7 - Conclusão

Nesse capítulo revisamos os aspectos teóricos dos processos coerentes e não

lineares. Como vimos, o modelo de dipolo oscilante fornece informação sobre a geração de

harmônicos e explica a ressonância do sinal de CARS com as vibrações moleculares. Para o

CCARS, comparamos o background não ressonante em relação ao CARS e mostramos que

apresenta melhor contraste sinal/background. Estudamos o limiar de detecção entre as duas

técnicas, e mostramos que o sinal de CCARS apresenta melhor relação sinal/ruído em relação

ao CARS para um ruído devido à variação dos lasers.

76

Capítulo 3

Sistemas Experimentais para aquisição de

imagens.

Neste capítulo vamos descrever os equipamentos e como é feito o alinhamento

óptico para a aquisição de dados e imagens. Vamos mostrar os sistemas experimentais com

dois pontos de vista: (1) do macro para o micro, com uma visão do sistema como um todo, via

diagrama de blocos, descendo a seguir para os seus componentes importantes; (2) dos

circuitos ópticos de excitação dos sinais ópticos e (3) dos circuitos de coleta (detecção) dos

sinais ópticos e seu processamento, para microscopia e ou espectroscopia.

Dessa forma, vamos dividir o sistema experimental em quatro partes como mostra

a figura 3.1: lasers de excitação, sistema de varredura, microscópio e detecção.

Figura 3.1: Diagrama de blocos do sistema experimental

Lasers Varredura DetecçãoMicroscópio

77

Vamos iniciar nossa descrição pela interconexão entre os blocos, que exigem

elementos específicos e devem ser feitas pelo operador do sistema. Nós montamos um

sistema que permite a aquisição simultânea de imagens por diferentes técnicas. Isso requer o

alinhamento de mais de um feixe de excitação garantindo suas superposições no espaço. Além

disso, temos as técnicas de CARS e CCARS em que mais de um feixe com a mesma frequência

de repetição são usados na excitação da amostra. Nesse caso, além da superposição no espaço

é necessário garantir a superposição temporal dos feixes. No nosso sistema podemos

combinar as técnicas de óptica não linear com as de óptica linear. Para a óptica linear

utilizamos lasers CW acoplados com fibras ópticas. Não utilizamos fibras ópticas com os lasers

pulsados porque as fibras distorcem os pulsos no tempo. Assim, temos os lasers CW para

aquisição de imagens via fluorescência excitada por 1 fóton, um laser de femtossegundos para

excitação de fluorescência por 2 fótons (TPEF – Two Photon Excited Fluorescence), SHG e THG,

e sistemas de OPO/OPA para excitação de CARS e CCARS, que devem ser combinados para a

aquisição de imagens em paralelo, simultaneamente.

Para garantir essa aquisição simultânea é necessário que todos os feixes sejam

colineares, ou seja, se propagem no mesmo eixo, e que exista uma superposição espacial no

mesmo volume focal. Além disso, é preciso controlar a potência dos feixes através de

atenuadores no caminho óptico, e, em alguns casos, a polarização dos feixes no volume focal.

Combinando e separando feixes:

Para combinar colinearmente dois feixes de 2 direções diferentes precisamos de

um elemento óptico que transmita um deles e reflita o outro. Podemos fazer isso de duas

maneiras, através de um Polarizer Beam Splitter 8 (PBS) ou de espelhos dicroicos. No PBS uma

polarização é transmitida e a outra refletida, a discriminação entre os feixes é dada pela

polarização e pode ser usada mesmo com feixes de mesmo comprimento de onda. Na

combinação de lasers sintonizáveis na mesma faixa, é a combinação ideal, pois é

8 Usaremos o termo em Inglês sempre que nos referirmos a elementos ópticos padrão encontrados nos catálogos, manuais e nos

esquemas de publicações internacionais.

78

independente do comprimento de onda. Já nos espelhos dicroicos a discriminação é feita pelo

comprimento de onda, com uma banda sendo transmitida e outra refletida. Usualmente são

produzidos pela interferência em filmes finos depositados em material vítreo. Na geometria

em 45o permitem combinar 2 feixes perpendiculares em um único feixe colinear. Espelhos

dicroicos para separação da emissão podem ser usados tanto para emissões na mesma

direção de propagação dos feixes (forward), como na direção oposta (backward), dependendo

do que desejamos detectar. Temos várias possibilidades de dicroicos – LP (Long Pass); SP

(Short Pass); BP (Band Pass); NOTCH; e Múltiplas bandas.

A figura 3.2 mostra a transmissão de um espelho dicroico com múltiplas bandas

usado para refletir feixes de excitação em 405, 488 e 568 nm e transmitir a fluorescência

excitada por cada um desses comprimentos de onda.

Figura 3.2: Gráfico de transmissão de um espelho dicroico comercial da Semrock9, o que não é transmitido é refletido.

Pela figura 3.2 vemos que os dicroicos ainda deixam passar da ordem de 1%

(OD=2, Optical Density – OD = x significa que 10-x é transmitido) da luz de excitação muito mais

9 https://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=Di03-R405/488/532/635-t1-25x36

79

intensa do que os sinais ópticos desejados, por isto utilizamos filtros de bloqueio para uma

banda de comprimentos de onda em até 10-6 (OD=6).

Garantindo superposição espacial:

Garantimos a superposição espacial na profundidade de focalização com a

utilização de um colimador, também chamado de telescópio. Além disso, o telescópio é

importante para colimar o feixe, que é ejetado com divergência relevante, e para mudar seu

tamanho, para que tenha o tamanho correto para preencher a abertura da objetiva. O

alinhamento correto do telescópio é crucial para que a geração das imagens tenha boa

qualidade e para que as imagens adquiridas com diferentes lasers mostrem a mesma região,

figura 3.3.

Figura 3.3: Mudando a posição das lentes pode-se fazer com que um feixe convergente fique paralelo (a). Usando duas lentes com distâncias focais diferentes fazemos o ajuste do tamanho do laser (b).

Controlando a potência:

A potência é um parâmetro que não deve ser modificado na maioria dos lasers

para manter a estabilidade dos mesmos. Variar a potência do próprio laser significa mudar as

condições térmicas do mesmo que tende a mudar muitos parâmetros do feixe. Para controlar

a potência que incide na amostra nós utilizamos um conjunto de uma placa de meia onda (

2 ) e um polarizador, que pode ser um PBS. A placa de meia onda é um cristal birrefringente

(A) (B)

80

(índices de refração diferentes para seus dois eixos) com comprimento L para atrasar em

meio comprimento de onda a polarização incidente no eixo lento (slow), em relação ao eixo

rápido (fast). Ela é montada em um estágio giratório e modifica a polarização do feixe

incidente em duas vezes o ângulo do eixo rápido em relação à polarização do feixe. O PBS

transmite uma polarização e o conjunto dos dois dá controle sobre a potência transmitida.

Outra forma de controle de potência é com um modulador acusto-óptico (Acoustic

Optic Modulator) AOM. O AOM controla a potência a partir de um sinal elétrico. O principal

componente do AOM é um cristal transparente acoplado a um transdutor piezo elétrico. O

sinal elétrico aplicado no transdutor cria ondas acústicas no cristal que criam uma modulação

no seu índice de refração a qual atua como uma grade de difração. Os feixes de luz que passam

por esse cristal serão submetidos a essa modulação do índice de refração tendo seu caminho

alterado. A intensidade da luz difratada depende da intensidade da onda acústica.

Figura 3.4: Esquema de um modulador acusto-óptico.

Nosso AOM atua no regime de Bragg. Para um ângulo de incidência do feixe ,

figura 3.4, apenas uma ordem de difração deixa o cristal com ângulo 2 , as outras têm

intensidade nula por interferência destrutiva, como mostra.

2

Ordem 1

Ordem 0

81

Garantindo a superposição temporal – Linhas de atraso:

Como é necessário que os dois pulsos de excitação cheguem na amostra ao

mesmo tempo (coincidência temporal) precisamos incluir uma linha de atraso, que serve para

modificar o tamanho do caminho de um dos pulsos. Uma linha de atraso é feita com um

translador micrométrico e dois espelhos à 45o com o eixo de translação, formando 90o entre

si, garantindo que os feixes de saída sejam paralelos aos feixes de entrada. Se o feixe de

entrada estiver paralelo ao eixo de translação o feixe de saída não muda de direção sofrendo

apenas um atraso temporal. O alinhamento é feito da seguinte forma, empregando duas írises

e sem nenhum espelho, alinhamos o feixe para que fique paralelo ao eixo de movimento do

translador, o feixe alinhado deve manter uma mesma altura por uma distância longa.

Colocamos o primeiro espelho e alinhamos para que o feixe continue mantendo uma mesma

altura. Uma segunda íris é colocada na direção da saída do feixe com a mesma altura da

entrada. Colocamos o segundo espelho e acertamos a direção do feixe para que fique imóvel

sob movimento do translador. O atraso temporal é dado por 2 x

c

, onde c é a velocidade

da luz no vácuo e x o deslocamento do translador. Notamos então, que para um

deslocamento de 0,1x m , tamanho de um passo típico dos transladores, teremos

7

8

2 100,67

3 10s fs

de resolução temporal na linha de atraso. O comprimento total do

translador definirá o atraso máximo desse dispositivo. Com 30 cm podemos chegar até

2000 ps de atraso. No alinhamento já garantimos que a diferença dos caminhos ópticos

dos 2 feixes não seja maior do que 1 cm, um translador de 10 cm é mais do que suficiente para

garantir a superposição temporal dos 2 feixes. Para garantir essa diferença entre os caminhos

ópticos usamos as medidas dos 2 pulsos em um fotodiodo com resposta de nanossegundos

conectado a um osciloscópio. Para lasers com pulsos de picossegundos utilizamos

transladores que são compostos de um micrômetro, com 1 cm de translado, sobre uma trilho

longo, com aproximadamente meio metro. Para lasers com pulsos de femtossegundos,

empregamos transladores específicos para pulsos ultracurtos, com 10 cm de translado total e

deslocamento mínimo de 1 nm. Sempre podemos usar um feixe de referência, sem qualquer

linha de atraso, e garantir que os outros feixes envolvidos cheguem ao mesmo tempo com

uma linha de atraso para cada um deles.

82

Varredura

As imagens são adquiridas em 2D fazendo uma varredura no plano focal. As

varreduras em X e Y são feitas por dois espelhos independentes. Quando o espelho

responsável pela direção X termina de varrer uma linha, ele volta à posição inicial enquanto o

espelho responsável pela varredura em Y muda para uma nova posição. A figura 3.5 mostra o

princípio de funcionamento dos espelhos de varredura.

Figura 3.5: (A) Os espelhos de varredura são colocados no foco da lente de entrada, que tem mesma distância focal de uma segunda lente que direciona o feixe para a entrada da objetiva, que vai incidir não perpendicularmente à entrada da objetiva. Um feixe entrando inclinado na objetiva irá focalizar no mesmo plano de um feixe perpendicular tento um deslocamento proporcional a inclinação (B).

Enquanto o laser varre a amostra, o sinal de cada ponto é detectado pela

fotomultiplicadora, que está conectada ao computador. Esse sinal é convertido em uma

imagem digital onde cada pixel representa um ponto varrido na amostra. A intensidade do

pixel será proporcional à intensidade do sinal detectado.

Atualizando a figura 3.1 o sistema fica da seguinte forma, figura 3.6

f1 f1 f2 f2

(A)

(B)

Feixe Perpendicular Feixe Inclinado

83

Figura 3.6: Exemplo de um sistema experimental para detecção de sinais ópticos por varredura. Os feixes de luz são representados por uma seta colorida que indica a direção de propagação. Os dicroicos e espelhos são representados por uma linha preta a 45°, e filtros a 0° dos feixes. TL – Telescópios; PBS – Polarizing beam splitter; 2 - Placa de meia onda.

Em suma, a montagem experimental se dá da seguinte forma, primeiro devemos

ajustar os lasers para que funcionem no comprimento de onda desejado com duração de pulso

capaz de gerar efeito de óptica não linear. Em seguida os feixes de lasers são alinhados no

sistema de varredura, eles devem estar coincidentes espacialmente e sobrepostos

temporalmente através de uma linha de atraso. Após o sistema de varredura os feixes são

focalizados na amostra por uma objetiva, o feixe, junto com os efeitos gerados na amostra, é

filtrado, e os sinais desejados são detectados.

No decorrer desse capítulo iremos explicar em detalhes o funcionamento e a

importância de cada parte do sistema experimental para aquisição de imagens de processos

coerente.

Laser 1

Varredura

Detecção sinal 1

Microscópio

Laser 2 Detecção sinal 2

Linha de atraso

2

2

Detecção sinal 3

PBSFiltro Filtro

LasersCWFibras

Ópticas

Telescópio

84

3.1 - Sistemas de Lasers

Nessa seção iremos descrever as principais fontes de luz utilizadas nas montagens

experimentais. Separamos os sistemas de acordo com suas aplicações. Como veremos no

decorrer desse capítulo, utilizamos lasers com pulsos de 7 picossegundo, 350

femtossegundos, 150 femtossegundos e 30 femtossegundos. Com respectivas larguras

espectrais de aproximadamente 2 cm-1 (0,13 nm), 42 cm-1 (4,55 nm), 100 cm-1 (6,2 nm) e 500

cm-1 (32 nm). Para aquisição de imagens de CARS, pulsos de picossegundos oferecem largura

de banda menor, da mesma grandeza de uma linha Raman, por esse motivo geram menos

background não ressonante e podem ser utilizados na região do fingerprint, onde há várias

linhas Raman próximas. Por outro lado, entregam menos potência de pico e geram menos

sinal ressonante. No caso da utilização de pulsos de femtossegundos, espera-se um

background não ressonante mais intenso, apesar de que, para o nível vibracional em 2847

cm-1 sejam tão eficientes quanto pulsos de picossegundos. Pulsos de femtossegundos também

possibilitam a aquisição simultânea de sinais de outros processos não lineares além do CARS,

como a geração de harmônicos e TPEF.

3.1.1 - Osciladores Paramétricos Ópticos e Laser de Ti:Safira

Na primeira montagem experimental trabalhamos com um sistema de dois OPOs,

para imagens de CARS, unidos a um laser de Ti:Safira pulsado de femtossegundos, para SHG,

TPEF e THG. Os feixes foram unidos com um PBS com modificação da polarização dos OPOs e

do bombeio, figura 3.1.1. O objetivo aqui foi acrescentar o CARS às técnicas já utilizadas e

conseguir imagens dos processos simultaneamente.

85

Figura 3.1.1: Esquema experimental com dois OPOs e um laser de Ti:Safira.

OPOs - Levante Emerald

Diferente de que ocorre em um laser, em que existe inversão de população no

meio de ganho, em um amplificador paramétrico, ocorre um processo paramétrico, onde o

estado quântico final e inicial do sistema é o mesmo [23]. Há vários tipos diferentes de

osciladores e amplificadores paramétricos que variam principalmente na forma que são

alimentados. A forma mais simples possui somente um feixe de bombeio, e é chamada de

optical parametric generation [OPG]. Com a adição de uma semente (seed), que aumenta

consideravelmente o sinal comparado com o OPG, tem-se um amplificado óptico paramétrico

[Optical parametric amplifier – OPA]. Há ainda o oscilador paramétrico óptico [Optical

parametric oscilator – OPO] que utiliza de uma cavidade ressonante deixando que o processo

se retroalimente.

O Levante Emerald da APE Berlin é um OPO, oscilador paramétrico óptico

sincronizado, com cavidade em anel, o meio de ganho é um cristal LBO com casamento de

fase colinear não crítico, é bombeado por pulsos de aproximadamente 7 ps (2 cm-1 em 800

nm) em 532 nm com taxa de repetição de 80 MHz. A emissão do signal vai de 700 a 980 nm e

o idler de 1150 a 2200 nm, os comprimentos de onda do processo paramétrico são

determinados pela temperatura do cristal, na cavidade os comprimentos de onda serão

determinados pelo filtro de Lyot e pelo comprimento da cavidade, que deve estar sincronizado

com a taxa de repetição do laser de bombeio. Um esquema do interior do laser está na figura

3.1.2.

Ti:SafiraOPO

OPO

Bombeio

PBS2

2

2Pump

Stokes

Pump

SHG + TPEF +THG

Varredura

86

Figura 3.1.2: (A) Processo paramétrico. (B) Esquema da cavidade em anel do OPO.

O feixe de bombeio entra pela seta verde à esquerda, focaliza no cristal. O cristal

tem controle de temperatura e parafusos para ajuste de altura inclinação e ângulo em relação

ao feixe de bombeio, o cristal deve ser alinhado para que o laser incida normalmente sobre

sua face. O controle do comprimento de onda do signal é feito através da temperatura do

cristal, como em uma mesma temperatura há dois comprimentos de onda possível, figura

3.1.3, o ajuste fino é feito pelo filtro.

Figura 3.1.3: (A) Curva típica do comprimento de onda para o signal em relação a temperatura. (B) Posição relativa do piezo para o comprimento de onda do signal na cavidade.

O ajuste do tamanho da cavidade é feito pelo espelho Mz, figura 3.1.2-B, está

sobre uma plataforma, transladada pelo micrômetro, combinado com um piezo para

Bombeio

OP

O

OCCristal

Mz - Controle de posição

Controle de Temperatura

Filtro

Pump

Idler

Signal

(A) (B)

100

110

120

130

140

150

650 700 750 800 850 900 950 1000

0

500

1000

1500

2000

650 700 750 800 850 900 950 1000

(A) (B)

( )nm ( )nm

T(°C

)

Re

lati

veP

iexz

oP

osi

tio

nC

han

ge

87

alinhamento fino. As emissões do signal e idler ocorrem na mesma direção e podem ser

usados em conjunto ou em separado com a inclusão de espelho dicroico para tal.

O bombeio para os OPOs é o Picotrain fabricado pela HighQ, é um laser pulsado

com 7 ps, taxa de repetição de 80 MHz e dois comprimentos de onda de saída, em 1064 com

2 W e em 532 nm com 8 W. O meio de ganho é um cristal de Neodímio Vanadato (Nd:VAN).

A figura 3.1.4 mostra o esquema interno do laser.

Figura 3.1.4: (A) esquema interno do picotrain. (B) Foto do laser.

Nele há um laser de picossegundos que emite em 1064 (IR) com 10 W e 5 ps, esse

feixe passa por um amplificador que dobra a potência de saída, por último há um módulo

gerador de SHG. Nesse módulo parte (2 W) saí sem sofrer alterações e pode ser usado na

microscopia, o restante passa por um cristal que gera segundo harmônico, esse feixe com 532

nm (verde) tem pulsos de 7 ps e 8 W de potência é utilizado para bombear dois OPO’s. Uma

1064 10W8

0M

Hz

Amplifier1064 20W

(A)

(B)

Oscilator Amplifier SHG

88

placa de meia onda posicionada na saída do amplificador ajusta a potência do feixe verde e

do IR.

Laser de Ti:Safira - MaiTai HP

O laser desse sistema foi um MaiTai HP [Specra-Physics], que gera pulsos

ultracurtos menores que 100 fs, com potência máxima de 3 W e taxa de repetição de 80 MHz.

Ele pode ser sintonizável de 690 a 1040 nm e entrega potência de pico, 1

pico média

rep

P P

,

máxima em torno de 500 kW. O MaiTai foi descrito em detalhes na minha dissertação de

mestrado [31] e está mostrado na foto abaixo. O controle da potência é feito com um AOM.

Figura 3.1.5: Foto do MaiTai

89

3.1.2 - Amplificador Regenerativo e OPA

Na primeira montagem experimental que utilizamos para detectar CCARS usamos

feixes de um amplificador regenerativo e de um OPA. O amplificador regenerativo emite

pulsos com taxa de repetição de 1 kHz, ele é bombeado por um laser de pulsos de

nanossegundos e amplifica pulsos de um laser de ti:safira, que por sua vez é bombeado por

um laser contínuo. A saída desse amplificador é dividida em uma pequena parte que será

alinhada no microscópio, e outra parte que será usada como bombeio para um amplificado

paramétrico, figura 3.1.6.

Figura 3.1.6: Esquema dos lasers para a montagem I

Laser de Ti:Safira - Mira Seed Laser

O laser de Ti:Safira que fornece os pulsos de semente para amplificação é um Mira

Seed [Coherent], o cristal de Titânio:Safira (Safira dopado com Titânio) é capaz de gerar pulsos

ultrarrápidos, aproximadamente 30 fs, com grande largura de banda funcionando de 780 a

840 nm. O Mira é bombeado pelo Verdi em 532 nm, e o cristal de Ti:Safira emite em qualquer

comprimento de onda desde 680 nm a 1100 nm. O cristal tem alta dopagem e apenas 5 mm,

AmplificadorRegenerativo

OPA

Bombeio

Bombeio

Ti:S

afir

a

Pump

Stokes

90

o que permite o uso de prismas de sílica fundida de baixa dispersão que equilibram a dispersão

gerada pelo cristal, isso possibilita ao laser suportar uma grande largura de banda.

O Verdi [Coherent – Verdi V-5]10 é um laser utilizado como bombeio para o Mira,

ele tem uma cavidade em anel e, assim como o Evolution, com dobrador, cristal de LBO

(triborato de Lítio), de frequência intra cavidade, que emite um feixe contínuo em 532 nm, 5

W de potência, e com modo TEM00. O meio de ganho é um cristal de Vanadato [Nd:YVO4]

bombeado por lasers de diodo através de fibras ópticas e localizados na fonte, que funciona a

1064 nm e é o comprimento de onda chamado de fundamental do Verdi.

A cavidade do Mira é desenvolvida considerando o efeito de lente de Kerr gerado

no cristal. Além disso, é posicionada após o cristal uma fenda que não influencia o pulso, mas

que bloqueia parte do feixe contínuo, que não sofre focalização no cristal, isso aumenta ainda

mais as perdas para o funcionamento CW favorecendo a formação de pulsos. Essa fenda

funciona como um absorvedor saturado e seu funcionamento é mostrado na figura 3.1.7.

Figura 3.1.7: Sistema de absorvedor saturado do laser Mira.

Sendo um laser de Ti:Safira pulsado, o funcionamento do mira é análogo ao do

laser MaiTai [Spectra-Physics] descrito na minha dissertação de mestrado [31], sendo assim

não descreveremos o funcionamento do laser em detalhes.

10 Operator’s Manual Verdi V-3,V-5,V-10 Diodo pumped Laser

Feixe pulsadoFeixe contínuo

Fenda abertaSem perda para

pulsos ou contínuo

Fenda fechadaPerda para feixe

contínuo

91

Amplificador Regenerativo - Legend - F

O Legend-F11 [Coherent] é um amplificador de Ti:Safira regenerativo capaz de

produzir pulsos com energia média maior do que 1 mJ em 800 nm com duração entre 100 fs

e 200 fs a uma taxa de repetição de 1 kHz. O Legend possui três partes distintas, figura 3.1.8,

um alargador [strecher] de pulsos, um amplificador regenerativo [RGA], e um compressor

[compressor] de pulsos. Nessa tese iremos descrever os principais pontos de cada parte.

Figura 3.1.8: Esquema mostrando os elementos ópticos do Legend-F.

O Evolution-15 [Coherent] é usado como lasers de bombeio para o amplificador

regenerativo, nele há um laser de Nd:YLF dobrado intracavidade por um cristal de Triborato

de Lítio [LBO]. Os pulsos são gerados pela técnica de Q-switched entre 100 e 350 ns, com

energia maior que 12 mJ em 527 nm polarizados horizontalmente e com taxas de repetição

de 1 kHz. O Q-switched é através de um AOM.

Os amplificadores de estado sólidos têm alta densidade de energia de saturação,

sendo possível extrair altas energias de sistemas relativamente simples, os cristais de Ti:Safira

também têm uma largura de banda de emissão grande o suficiente para amplificar pulsos com

duração de dezenas de femtossegundos. Uma limitação vem da tendência de lasers com muita

11 Legend laser system kilohertz diode-pumped ultrafast ti:saphire amplifier Operator’s manual.

Amplificador Compressor

BombeioQ-Switch

300 ns

Alargador

SementeTi:Safira

50 fs

Legend

800 nm1 kHz150 fs

Pu

lso

u

ltra

curt

o

Pulso alargado

Pulso alargado

amplificado

Pulso ultracurto

amplificado

92

intensidade de focalizarem de forma destrutiva (resultado o efeito Kerr), o que limita a

intensidade presente nesses amplificadores para menos de 10 GW/cm2.

A técnica de alargamento/compressão do pulso remove essa limitação. De forma

resumida a ideia é utilizar um pulso ultracurto de outro laser, no nosso caso são os pulsos do

Mira, realizar o alargamento desses pulsos, o que diminui a potência de pico, realizar sua

amplificação, e depois comprimi-lo para sua duração inicial.

Há várias formas de comprimir ou alargar um pulso, entretanto no caso de

amplificadores de Ti:Safira os pulsos 100 fs precisam ser alargados para duração de algumas

centenas de picossegundos. Uma das formas de conseguir isso é empregando grades de

difração. Um exemplo de um alargador de pulso pode ser visto na figura 3.1.9.

Figura 3.1.9: Exemplo de um alargador de pulso por grade de difração.

Em um alargador de pulso com o da figura 3.1.9 os comprimentos de onda

menores, (Azul) percorrem um caminho maior do que os comprimentos de onda maiores

(Vermelho) alargando o pulso.

Um compressor de pulso funciona de forma análoga, mas fazendo com que os

comprimentos de onda maiores percorram um espaço maior, e que e os comprimentos de

onda menores percorram um espaço menor, figura 3.1.10.

93

Figura 3.1.10: Exemplo de compressor de pulso por grade de difração.

Esses dois exemplos das figuras 3.1.9 e 3.1.10 não são representações exatas dos

dispositivos ópticos encontrados no Legend, mas seu funcionamento é parecido. Para o caso

específico do Legend, o pulso passa pela grade quatro vezes para que seja espacialmente

reconstruído.

Após ter seu pulso alargado ele passa pelo amplificador regenerativo, que é onde

ocorre a amplificação do pulso, alimentado por pulsos de baixa energia. Amplificadores de

Ti:Safira são extremamente eficientes e conseguem amplificar um pulso de poucos nano

joules para mais de 1 mJ. A amplificação ocorre quando o pulso passa pelo bastão de Ti:Safira,

excitado por um pulso do Evolution, que tem 300 ns de duração. Normalmente a amplificação

não passa de 3 a 4 vezes para cada vez que o pulso passa pelo cristal, entretanto em um

amplificador regenerativo, o pulso passa várias vezes resultando em um ganho considerável,

possivelmente maior que 106. Um esquema com os elementos ópticos da cavidade do

amplificador regenerativo pode ser visto na figura 3.1.11.

94

Figura 3.1.11: Detalhe do Amplificador Regenerativo do Legend-F.

O funcionamento se dá da seguinte forma. Pulsos proveniente do alargador

(polarizados verticalmente, polarização S) são alinhados na cavidade de amplificação através

da reflexão na superfície do cristal de Ti:Safira. Enquanto a célula de Pockels (PC1) está ativa

o pulso passa pela cavidade só uma vez e sai, recebendo amplificação pouca ou nula, isso

porque os efeitos de, girar a polarização em um quarto de onda da PC1, e da placa de um

quarto de onda (/4), se cancelam. Células de Pockels nessa cavidade são placas de meia onda

controladas por campos elétricos, o efeito eletro-óptico de Pockels produz birrefringência em

um meio óptico quando sob efeito de um campo elétrico constante ou variante.

O Evolution é então ativado, fornecendo um pulso para o cristal, logo após o pico

no pulso do Evolution, o ganho no cristal é máximo, e é quando o processo de amplificação

começa. Outro pulso, do alargador, de polarização vertical entra na cavidade e reflete no

cristal, só que dessa vez, a PC1 está desativada, o pulso passa pela placa de um quarto de onda

fazendo a polarização ir de vertical para circular. Após ser refletido pelo espelho ele passa

novamente pela 4 , sofrendo uma rotação de polarização total equivalente a uma placa de

meia onda ( 2 ) e mudando o a polarização de circular para horizontal (polarização P), esse

pulso é transmitido pelo cristal e pelos outros elementos ópticos do amplificador.

Tão logo o pulso passe pela PC1, é aplicado voltagem para que ela funcione como

uma placa de um quarto de onda. A PC1 é novamente uma placa de meia onda e cancela o

efeito da 4 . O pulso está preso na cavidade e nenhum outro pulso consegue ser

transmitidos pelo cristal. Após passar pelo cristal entre 10 e 15 vezes, a célula de Pockels 2 é

PC 1

PC 2

Ti:Safira

Entrada da Semente

Bombeio

4

PBS

95

ativada, funcionando como uma placa de um quarto de onda, que faz com que o pulso mude

novamente para polarização vertical após passar pela PC2 duas vezes depois de ser refletido

pelo espelho. O pulso é então ejetado do amplificador pelo polarizador, sofrendo um ganho

maior que 106.

Amplificador Óptico Paramétrico - OPerA

O OPerA [Coherent] é um OPA, nele a interação paramétrica transfere energia do

feixe de bombeio ( 1 ) para duas ondas de saída ( 2 ), chamado de signal, e ( 3 ) chamado de

idler, com o signal possuindo maior energia ( 2 3 ) e ( 1 2 3 ). Dentro do OperA o

feixe de bombeio, proveniente do Legend, é parcialmente refletido (apenas 1%) para a

geração de luz branca através do efeito de automodulação de fase e de mistura de quatro

ondas. Essa luz branca é usada como semente para a amplificação paramétrica, e em conjunto

com a alteração do ângulo em um cristal de beta-bário borato [BBO] com ampla transparência,

e do atraso do feixe de bombeio em relação à semente, é possível escolher o comprimento de

onda do signal. O primeiro estágio (pre amp) de amplificação tem como objetivo produzir

pulsos estáveis e que sirvam como semente para o segundo estágio de amplificação (power

amp). A figura 3.1.12 mostra um esquema interno do OPerA.

O OPerA possui três feixes de saída, o resíduo ou resto do bombeio, o signal, entre

1150 e 1600 nm, e o idler, entre 1600 e 2630 nm. Acoplado a essa saída há um modulo de

geração de harmônicos, que possibilita o uso do segundo harmônico do signal e do idler, e do

quarto harmônico do idler. Sendo assim o OperA pode ser usado de 400 a 2630 nm com feixes

de 150 fs e potências de até 80mW para o signal. No nosso caso usamos o segundo harmônico

do Idler em 1036 nm e em 1080 nm com potência de saída de aproximadamente 2 mW.

96

Figura 3.1.12 : Esquema interno do OPerA, WLG – White light generation, gerador de luz branca.

3.1.3 - Spirit NOPA SHG e bombeio Spirit 1040

O segundo sistema de lasers utilizados para imagens de CCARS é composto por um

NOPA, que é um amplificador paramétrico (OPA) bombeado por um amplificador

regenerativo. Parte do bombeio foi utilizada como o feixe de Stokes, figura 3.1.13.

WLG

Linha de atraso

Cristal

Linha de atraso

Modulo SHG - 4HG

4HGIdler

SHGIdler

SHGSignal

SignalIdler

800 nm150 fs1 kHz

97

Figura 3.1.13: Esquema com um NOPA e um bombeio usado na segunda montagem.

O bombeio para o spirit NOPA12 [Spectra-Physics] é o Spirit 1040 [Spectra-Physics]

que, assim como o Legend, é um amplificador regenerativo que emite pulsos de 350 fs em

1040 nm e 8 W. A taxa de repetição do Spirit 1040 pode ser ajustada para 200 kHz, 400 kHz e

1 MHz, a potência média de saída é a mesma para todas as taxas de repetições. Nós

escolhemos trabalhar com a menor taxa de repetição para termos a maior potência de pico

em cada pulso. Uma vez que as condições necessárias para a aquisição de imagens é

obedecida, ou seja, que conseguimos pelo menos um pulso por pixel nas velocidades

disponíveis no sistema de varredura. É preferível maior potência de pico para efeitos não

lineares do que uma maior taxa de repetição como mostrado no capítulo 2.

Assim como o OPerA, o spirit NOPA também é um Amplificador paramétrico, a

diferença é que ele é um amplificador paramétrico não-colinear [NOPA]. Isso significa que ao

invés dos feixes branco e do pump, durante a fase de pré-amplificação, incidirem no cristal na

mesma direção, eles incidem com um ângulo entre si [41]. O mesmo ocorre com os feixes do

pump e do signal durante a fase de amplificação. Por causa desse ângulo entre os feixes, um

12 Spirit-NOPA user’s Manual Rev. AV20141103.

Bombeio

NOPA

Pump

Stokes

Amp. Regenerativo

98

NOPA consegue gerar amplificação em uma extensão de comprimentos de onda maior do que

um OPA, e assim gerar pulsos mais curtos, chegando a 20 fs.

Em um OPA os fótons do signal e do idler são colineares ao bombeio. Para

aumentar a eficiência da conversão, as velocidades de fase são combinadas pela correta

orientação do cristal. Isso resulta em um casamento de fase dos feixes de signal, idler e

bombeio. Entretanto, o casamento de fase não assegura simultaneamente o casamento de

velocidade de grupo dos três feixes. Portanto os três feixes propagam com velocidades

diferentes no cristal. Como resultado as amplificações do signal e idler são alargados

temporalmente.

A figura 3.1.14 ilustra essa situação, um pulso de semente de signal muito curto é

inserido em um cristal e gera o feixe de idler. O pulso do idler propaga mais rápido do que o

signal ( idler signal ). Os feixes de signal e idlers são amplificados conforme eles atravessam

o cristal, adicionalmente o signal gera mais idler e o idler gera mais signal. Devido à diferença

de velocidade, esses novos fótons são adicionados nas bordas dos feixes, portanto o

alongamento dos feixes não pode ser evitado em um OPA colinear por casamento de fase no

visível[42]. Gale et al [41] demonstrou que o problema de alongamento de pulso em

casamento de fase colinear fazendo um arranjo não-colinear e produzindo pulsos sub-20 fs. O

objetivo dessa geometria é obter uma amplificação com casamento de fase em uma largura

de banda bastante ampla, largura essa necessária para suportar pulsos extremamente curtos.

Figura 3.1.14: (A) As velocidades de grupo para o signal, em verde, e idler, em vermelho, são diferentes entre si, e diferentes da velocidade de grupo do bombeio, em azul. Dentro do cristal há a separação dos pulsos. Os pulsos do signal e idler são alongados pois são continuamente gerados entre si. (B) Com uma geometria não linear esse alongamento não ocorre uma vez que as velocidades estão casadas.

(A) (B)

vp

vi

vs

vp

vi

vs

99

O spirit-NOPA é um amplificador óptico paramétrico não colinear em dois estágios

de luz branca que gera pulsos entre 650 e 900 nm, duração do pulso entre 60 e 20 fs e potência

entre 280 e 400 mW. Seu funcionamento é parecido com o do OperA com a amplificação

acontecendo em dois estágios, como pode ser visto na figura 3.1.15. O feixe do bombeio é

dividido sendo que a maioria é desviada para a geração de segundo harmônico e somente

uma pequena parte será utilizada para geração de luz branca. Um espelho reflete o segundo

harmônico para o primeiro estágio de amplificação e transmite a luz residual do feixe

fundamental, esse resíduo do feixe fundamental é direcionado a uma porta de saída e um

bloqueador. Nesse trabalho, retiramos o bloqueador de laser e utilizamos o feixe fundamental

residual como o feixe de Stokes para o CARS e o CARS cascata.

Para gerar a luz branca, o feixe é focalizado em um cristal gerador de

supercontínuo (WLG – white ligh generaion), a largura de pulso da luz branca é

aproximadamente a mesma do pulso inicial. A luz branca passa então por um elemento

dispersivo (WLD – white light dispersion) para aumentar o tamanho do pulso e fazer com que

os comprimentos de onda maiores cheguem antes do que os comprimentos de ondas

menores. A luz branca é sobreposta com o segundo harmônico no cristal não linear,

controlando a linha de atraso, pode-se escolher qual região espectral da luz branca será

sobreposta temporalmente com o feixe do segundo harmônico, o que proporciona selecionar

a semente para o processo de amplificação. O feixe de luz branca é então direcionado para o

primeiro estágio de amplificação.

O primeiro estágio de amplificação, ou pré-amplificação, tem como objetivo

produzir pulsos estáveis e que sirvam como semente para o segundo estágio de amplificação.

O ângulo entre os feixes de bombeio e a luz branca é aperfeiçoado para amplificar pulsos com

grande largura espectral, o casamento de fase é ajustado através do ângulo do cristal

controlado por um estágio rotacional.

100

Figura 3.1.15: Esquema do spirit-NOPA utilizado nessa tese; WLG – gerador de luz branca; WLD – Dispersor de luz branca; SHG – Cristal gerador de SHG.

A luz amplificada no primeiro estágio passa então pelo segundo estágio de

amplificação, a sobreposição temporal é feita pela linha de atraso. O casamento de fase é feito

ajustando o ângulo do cristal, o ângulo entre os feixes no segundo estágio é o mesmo do

primeiro. Após o segundo estágio de amplificação o pulso passa pelo compressor de pulsos,

na entrada do compressor o pulso é espectralmente largo mas não está o mais curto possível.

A compressão é realizada com um compressor de dois prismas clássicos conforme

mostrado na figura 3.1.16.

Figura 3.1.16 : Esquema de um compressor de pulsos com dois prismas.

A compressão é determinada pela distância entre os primas e pela inserção dos

prismas no caminho do feixe.

WLGLinha de atraso

Linha de atraso

Cristal 2Compressor

WLD Cristal 1

1040 nm200 kHz350 fs

690-900 nm200 kHz

~30 fs

1040 nm200 kHz

350 fs

SHG

Espelho

101

3.2 - Sistema de Varredura e Microscópios

3.2.1 - FV300 e IX-81 da Olympus

A varredura é feita pelo FV300 da Olympus, apesar das técnicas de óptica não

linear já serem confocais, o FV300 possui tanto o sistema de varredura, quanto o pinhole,

utilizado para a microscopia confocal.

O sistema de varredura, também conhecido como “scan-head” ou “scanner”, faz

a varredura dos feixes na amostra. O FV300 tem uma entrada para laser de infravermelho,

entrada para o laser de Argônio, filtros para fluorescência, espelhos dicroicos, espelhos

galvanômetros para a varredura do laser, cinco tamanhos de pinhole e duas

fotomultiplicadoras internas. A figura 3.2.1 mostra o FV300 que já foi descrito

detalhadamente na minha dissertação de mestrado[31], nessa tese somente irei detalhar os

pontos relevantes para o trabalho.

Figura 3.2.1: O FV300 da Olympus

102

3.2.2 - LSM780 e Axio.Observer da Zeiss

O sistema de varredura da Zeiss tem um funcionamento próximo ao do sistema

FV300. A figura 3.1-A mostra um esquema interno do LSM780.

Figura 3.2.2: (A) Esquema interno do sistema de varredura LSM780. (B) Foto do sistema de varredura acoplado ao microscópio.

O LSM 780 tem duas fotomultiplicadoras (CH1 e CH2) internas e uma matriz em

linha de detectores GaAsP de 32 canais com resolução espectral de 2.9 nm (ChS1), chamado

de detector espectral. Antes de a luz ser detectada ela incide sobre uma grade, a espectro

resultante pode ser desviado para uma das fotomultiplicadoras usando-se um prisma, ou ela

é detectada pelo detector espectral. O LSM780 tem a opção de trocar o espelho que reflete o

sinal para os detectores por uma placa, isso deixa o sinal sair, onde podemos acoplar um

monocromador.

3.3 - Detecção

Depois que os lasers estão alinhados no microscópio e o sinal é gerado na amostra

é importante detectar o sinal desejado separando com filtros e dicroicos para o comprimento

103

de onda correto, que pode ser de CARS ou do CCARS. Utilizamos uma fotomultiplicadora

colocada na direção de detecção para frente para as imagens, um monocromador para

detecção espectral e um fotodiodo para detecção de sinal sem aquisição de imagem.

3.3.1 - Fotodiodo e Fotomultiplicadora

Fotodiodo (PD) é um dispositivo semicondutor que gera corrente em uma carga

através do efeito-elétrico. O fotodiodo utilizado foi um PDA100A de silício amplificado com

ganho ajustável da Thorlabs. Ele detecta de 320 a 1100 nm com ganho máximo de 70 dB e

incremento de 10 dB.

O detector utilizado para aquisição das imagens foi uma fotomultiplicadora (PMT).

Em uma fotomultiplicadora, o primeiro elétron é emitido por um fotocatodo após interagir

com um fóton através do efeito fotoelétrico, esse elétron é acelerado por uma diferença de

potencial e se choca com uma segunda placa e mais elétrons são emitidos, esses elétrons são

acelerados novamente, repetindo o processo várias vezes. No final, esses elétrons geram uma

corrente no catodo, figura 3.3.1 mostra um esquema de uma fotomultiplicadora.

Figura 3.3.1: Configuração de uma fotomultiplicadora.

104

Para que um elétron foto excitado seja emitido é necessária uma energia mínima

para ultrapassar a função trabalho da superfície dos metais e a reposta espectral das

fotomultiplicadoras tende a ser nula na região do infravermelho. Tratamentos da interface

como GaAs podem ampliar a região de resposta espectral, até pouco tempo limitada em torno

de 900‐1000 nm.

Como as fotomultiplicadoras são muito sensíveis, é importante evitar o excesso

de luz, que geraria um excesso de corrente, podendo danificá-las. Nós realizamos as imagens

com uma fotomultiplicadora Hamamatsu R3896, com tempos de resposta da ordem de ns e

resposta espectral entre 185‐900 nm conforme podemos ver na figura 3.3.2

Figura 3.3.2: Resposta espectral da fotomultiplicadora.

3.3.2 - Monocromador

Os espetros foram detectados com na direção para trás com um monocromador

de 30 cm da Acton Research modelo Spectra-Pro 300i em conjunto da CCD “back-illuminated”

da Princeton Instruments de 1340 x 100 pixels. Esse sinal é separado do caminho do laser com

um filtro passa alta 776 nm (776LP). Na entrada do monocromador colocamos os mesmos

filtros usados para as imagens em conjunto com uma lente de 5 cm.

105

Figura 3.3.3: Vista superior do monocromador, com uma ilustração do caminho óptico.

O monocromador está equipado com grades de 1200 e 300 groves/mm com blaze

de 500 nm. A luz que entra pela fenda de entrada é direcionada por um espelho côncavo até

a grade de difração que abre o feixe em suas componentes espectrais. Outro espelho côncavo

reflete o feixe para uma CCD que registra todo o espectro de uma vez só, figura 3.3.3. Para o

máximo de eficiência do monocromador é importante escolher a grade com blaze para o

comprimento de onda correto e número de linhas por mm adequada à resolução desejada.

3.3.3 - Detecção de fótons individuais correlacionados no tempo

Temos a opção de acoplar aos microscópios um sistema de contagem de fótons

correlacionados no tempo (time-correlated single photon counting – TCPSPC). Ela se baseia no

fato de que para sinais com alta taxa de repetição a intensidade da luz é tão baixa que a

probabilidade de detectar mais de um fóton em um período do sinal é muito baixa. Com essa

técnica construímos imagens de tempo de vida da fluorescência (Fluorescence-lifetime

imaging microscopy – FLIM), conhecido como FLIM. Para o FLIM é necessário o uso de lasers

pulsados, pode-se usar um laser CW com uma modulação rápida por AOM para gerar pulsos

de ps, o importante é ter um trem de pulsos com o qual o fóton detectado será correlacionado.

Grade de difração

EspelhosCôncavos

CCD

Entrada da Luz

106

O FLIM constrói imagens recebendo informação da varredura do laser sobre a posição x-y em

que o laser está focalizado.

Para uma taxa de repetição de 80 MHz, cada pulso estará separado de 12,5 ns,

nesse período há a excitação e emissão da fluorescência. A fluorescência é uma

fotoluminescência caracterizada por ter suas emissões em tempos curtos, da ordem de 10 ns.

A emissão de uma fluorescência tem um decaimento exponencial do tipo t

oI I e . Nem

todos os fótons emitidos são detectados, mas o detector do FLIM detecta os fótons

individualmente, figura 3.3.4. A figura 3.3.4-b mostra a curva de decaimento da fluorescência

após cada pulso, mas o que é detectado dão os pulsos mostrados na figura 3.3.4-c,

independente da intensidade do pico cada evento é considerado um fóton detectado.

Figura 3.3.4: (A) Sequência de pulsos laser operando em 80 Mhz. (B) Fluorescência esperada emitida para cada pulso de excitação. (C) Sinal detectado como sequência de pulsos curtos [43].

Depois de detectado o fóton conta-se o tempo para a chegada do sinal do próximo

pulso do laser. O sistema grava os fótons detectados com informação sobre a correlação do

momento detectado com o pulso do laser para criar uma curva como a da figura 3.3.5 para

cada pixel da imagem. Por isso as imagens de FLIM são de demorada aquisição, podendo levar

vários minutos e com menor resolução do que uma imagem de SHG ou CARS.

107

Figura 3.3.5 – Construção da curva de decaimento da fluorescência a partir da detecção de fótons individuais [43].

A emissão pode ter diferentes origens, assim a curva fica mais bem ajustada para

mais de um decaimento, 1 2 3

1 2 3

t t tI I e I e I e C . O software SPCImage da

Becker & Hickl faz o ajusta da curva para até três componentes para cada pixel da imagem. Na

imagem final, o tempo de vida é mostrado em escala de cor, figura 3.3.6.

Figura 3.3.6: Tela do software do FLIM.

108

3.4 - Alinhamento e sistema experimental CARS

O sistema para imagens de CARS utiliza dois OPOs Levante Emerald bombeados

pelo feixe de 1064 nm do Picotrain. Cada feixe passa por um conjunto de uma placa de meia

onda e um polarizador para controle de potência, onde a polarização vertical será transmitida,

os feixes do signal do OPO passam por um telescópio e por uma linha de atraso.

Os feixes do OPOs são unidos através de uma roda de filtros com três filtros, 805

passa baixo (805SP), 900 passa alto (900LP) e um 775 passa alto (775LP). Um filtro Notch 1064

nm reflete o feixe fundamental do bombeio e transmite os feixes dos OPOs. Assim

conseguimos unir os três feixes. Para utilizarmos o CARS em conjunto com o laser de Ti:Safira

(MaiTai) e como os comprimentos de onda dos OPOs e do MaiTai podem ser o mesmo

utilizamos um polarizador para refletir a polarização vertical e transmitir a polarização

horizontal do MaiTai. O resultado final é mostrado na figura 3.4.1.

109

Figura 3.4.1: HPL – Placa de meia onda e polarizador; TL – Telescópio; DL – linha de atraso; FW – roda de filtros; NT – Filtro Notch 1064 nm; PL – Polarizador; PMT fotomultiplicadora; AOM – Modulador acusto-óptico; 1 – Amostras.

O CARS pode ser detectado com os detectores internos do LSM780, ou com a

fotomultiplicadora externa, utilizamos um filtro passa baixa 690 (690SP) para bloquear os

lasers no infravermelho e um filtro para separar o CARS de qualquer outro sinal emitido no

foco da objetiva, no nosso caso usamos um passa alta 650 (650LP).

3.5 - Alinhamento e sistema experimental CCARS I

Para a primeira montagem experimental de CCARS utilizamos o Legend e o OperA,

que tem taxa de repetição de 1 kHz, a velocidade mínima possível da varredura feito pelo

software da Olympus é muito alta, e não conseguimos nem um pulso por pixel. Para resolver

esse problema controlamos os scanners com um programa no LabView, desenvolvido em

conjunto com o Doutor Bernardo Kyotoku, e com um dispositivo para aquisição de dados

[DAQ] [National Instruments – NI USB-6356]. A figura 3.5.1 mostra a tela do programa de

Labview [National Instruments]. No programa é possível escolher a voltagem aplicada nos

LSM780

Axio Observer

PMT

MaiTai

AO

M

Ch2

Ch1

CH

S1

OPO2

OPO1

PicoTrain532 nm1064 nm

TL

TL

TL

DL

DL

FW NT PL

1

2

2

2

FibrasÓpticas

Lasers CW

690 – 1040 nm

700 – 900 nm

700 – 900 nm

TL

110

motores que controlam os espelhos de varredura (máx 6 V), a quantidade de pixels em x e y,

e os valores máximos e mínimos para a conversão das voltagens da fotomultiplicadora em

intensidade de sinal de cada pixel.

Figura 3.5.1: Tela do programa em Labview responsável pela varredura e aquisição.

O alinhamento dos Lasers para o microscópio pode ser visualizado na figura 3.5.2,

os dois feixes usados para gerar CARS e CCARS na amostra são originados no Legend e no

OperA, como o Legend também é utilizado para bombear o OperA, usamos um beamsplitter,

que separa 10% da potência do laser que será usado como o feixe de pump do CARS. Após o

beamsplitter o feixe do Legend é alinhado por um telescópio composto por duas lentes com

grande distância focal. O feixe é então alinhado para um conjunto de placa de meia onda e

um polarizador, que controlam a potência do feixe. Depois o feixe passa por uma linha de

atraso, composta de dois espelhos alinhados em um ângulo de 90o montado sobre uma

plataforma deslizante motorizada [Newport - XMS100] com precisão de 1 nm e extensão

máxima de 100 mm. O objetivo da linha de atraso é fazer com que os feixes sejam

temporalmente coincidentes.

111

Figura 3.5.2: Montagem experimental I, mostrando em: 1 - beamsplitter; TL - telescópio; HPL - Placa de meia onda e polarizador; DL - Linha de atraso; L - lente para 1 m; 805SP - Espelho dicroico passa baixa 805SP ; 776LP - Espelho dicroico passa longo 776LP ; 2- Amostra e filtros. Modificação de montagem trocando elementos ópticos no quadrado tracejado preto pelos elementos no quadrado tracejado verde.

O feixe do OperA também passa por um conjunto de placa de meia onda e

polarizador, e por uma lente de 1 m, antes de ser unido ao feixe do Legend por um

beamsplitter. Diferente do feixe do Legend, constatamos que não seria necessário um

telescópio para o segundo feixe, uma lente de 1 m conseguiu fazer com que o feixe chegasse

com tamanho suficiente nos espelhos de varredura, e no caso os feixes não estejam

focalizando na mesma posição, ajustamos o telescópio do primeiro.

Os dois feixes são então alinhados nos espelhos de varredura do FV300. Esse é um

detalhe importante da nossa montagem, para garantir que não haja mais nenhum elemento

óptico no caminho dos feixes, fizemos o alinhamento dos feixes diretamente nos espelhos de

varredura, para isso utilizamos um orifício no FV300 que pode ser acessado ao abrir sua tampa

lateral, figura 3.5.3. Após esse alinhamento é possível ver os feixes na saída da objetiva.

FV300

IX-81

PMTSpectrometerLegend

Opera

Evolution

VerdiM

ira

PD

Spectrometer

1

TL

HPL

HPL

DL

L

805SP 776LP2

2

805SP

112

Figura 3.5.3: Foto mostrando a modificações na lateral FV300 e o caminho do feixe em vermelho.

O condensador coleta a luz gerada no foco da objetiva, e para escolhermos os

comprimentos de onda corretos para o CARS e o CCARS, colocamos os filtros sobre ele. Acima

dos filtros colocamos um tubo oco de aproximadamente 3 cm para garantir que nenhuma luz

que não passou pelo filtro seja detectada.

Também detectamos o sinal refletido com um monocromador. Esse sinal é

separado do caminho do laser com um filtro passa alta 776 nm (776LP). Na entrada do

monocromador colocamos os mesmos filtros usados para as imagens em conjunto com uma

lente de 5 cm.

Para fazermos medidas em volumes líquidos (água e etanol), e em grandes

quantidades de cristais de ureia, e durante a realização do alinhamento inicial do laser,

utilizamos uma montagem sem o microscópio, figura 3.5.2 – área delineada pelo quadrado

tracejado verde. Nesse caso, alinhamos o laser em uma objetiva de 10X e coletamos o sinal

gerado na amostra com um objetiva de 5 cm, a luz proveniente do foco é alinhada para a

entrada do monocromador passando antes pelos filtros necessários para separar o sinal

desejado.

Entrada dos feixes

Entrada para lasers externos original

Dicróico foi removido

Espelhos de varredura

113

Tanto o CARS quanto o CCARS e outros efeitos de óptica não linear, como SHG e

TPEF, ocorrem simultaneamente na amostra. Esses sinais devem ser separados e devemos

tomar cuidado para que os lasers sejam bloqueados totalmente e que nenhum ruído não

desejado proveniente do laser alcance os detectores. Como os dois sinais serão detectados

para frente, forward detection, o bloqueio dos lasers de bombeio é crítico. Outro ponto crítico

para a detecção do sinal é a separação do sinal de CARS, que aparece no vermelho, e do

CCARS, que aparece no verde. Como o sinal do CARS é expressivamente maior do que o sinal

do CCARS o esquema de filtros utilizado nesse trabalho garante que nenhum sinal de CARS

consiga interferir nas medidas de CCARS. Na figura 3.5.4 temos os filtros utilizados.

Figura 3.5.4: (A) - Comprimento de onda para os feixes e as emissões de cada efeito de óptica não linear; (B)-(D) - Esquema de filtros utilizados para cada tipo de imagem. Barra azul mostra onde cada filtro permite a passagem de luz. Barra vermelha é o resultado de cada arranjo de filtros.

114

Como o CARS é o sinal de óptica não linear mais forte os filtros utilizados são um

710 nm passa baixo (710SP), para bloquear os lasers, e um 555 nm passa alta (555LP) para

garantir que nenhum outro sinal atrapalhe a detecção do CARS. Para o CCARS usamos um 680

passa baixo (680SP) para bloquear os lasers, um 610 passa baixo (619SP) para impedir que

qualquer sinal de CARS chegasse ao detector e um 525-560 passa banda (525-560BP) para

selecionar o comprimento de onda do CCARS.

Quando realizamos as medidas de CCARS dentro e fora da ressonância trocamos

o filtro passa banda por um 500 passa alto (500LP) para conseguirmos fazer as imagens em

comprimentos de onda diferentes. Essa troca de filtros não significou problema para a

obtenção das imagens apesar de permitir a passagem de segundo harmônico, para tal

escolhemos uma região do tecido com pouco colágeno (fonte de segundo harmônico em

tecidos biológicos) e verificamos a dependência do sinal gerado com cada laser, garantimos

assim uma imagem somente de CCARS.

3.6 - Alinhamento e sistema experimental CCARS II

A segunda montagem compartilha vários elementos com a primeira, as mudanças

estão no sistema de lasers e na utilização do sistema de varredura comercial da Olympus, sem

a necessidade de alteração no tempo máximo permanecido em cada pixel.

Com o objetivo de conseguirmos imagens que apresentassem melhor qualidade e

pudessem demonstrar claramente a vantagem da técnica CARS cascata, idealizamos uma

segunda montagem, figura 3.6.1, utilizando um laser de bombeio com taxa de repetição

compatível com a velocidade de varredura e com o tempo de aquisição de cada pixel (pixel

dwell time) do sistema de varredura comercial da Olympus.

115

Figura 3.6.1: Montagem experimental II mostrando em: TL - telescópio; HPL - Placa de meia onda e polarizador; DL - Linha de atraso; 900LP- Espelho dicróico passa alto 900LP; L - lente para 2 m; 776LP - Espelho dicroico passa alto 776LP; 1- Amostra e filtros. Modificação de montagem trocando elementos ópticos no quadrado tracejado preto pelos elementos no quadrado tracejado verde.

Utilizamos o signal proveniente do Spirit-NOPA, e o feixe fundamental residual do

bombeio proveniente do Spirit 1040 após passar pelo cristal para geração de segundo

harmônico. O feixe fundamental passa por um telescópio, com uma lente côncava e uma

convexa, que iguala seu tamanho ao feixe do NOPA, e por uma linha de atraso. Ambos os

feixes passam por uma placa de meia onda e um polarizador para ajuste de potência. Os feixes

são unidos por um espelho dicróico passa alta em 900 nm, logo após passam por uma lente

de 2 m para manter o tamanho dos feixes menor que os espelhos de varredura, isso garante

que não ocorra perda de potência nesses espelhos. Para detecção no monocromador,

colocamos um espelho dicróico passa alta 776 nm para refletir o sinal do CARS e CCARS e

transmitir os feixes. O alinhamento no sistema de varredura e no microscópio é o mesmo da

primeira montagem, inclusive a modificação para quando trabalhamos sem o microscópio.

FV300

IX-81

PMT

Spectrometer

Spirit

Spectrometer

TL

HPL

DL

900LP 776LP

900LP

1

1

L

SpiritNOPA

HPL

116

3.7 - Alinhamento e sistema experimental técnicas NLO

O sistema detalhado está descrito na minha dissertação de mestrado[31]. Aqui irei

tratar apenas dos pontos mais importantes, na figura 3.7.1 temos um esquema da montagem.

Foi acrescido à montagem o sistema de detecção TCSCP para aquisição de imagens de tempo

de vida de fluorescência. Como o sistema já foi construído com a possibilidade de detecção

de fluorescência excitada por absorção de dois fótons, ao acrescentar o FLIM não foi

necessário realizar modificações no sistema.

Figura 3.7.1: Montagem experimental para microscopia THG, SHG e TPEF. HPL – Placa de meia onda e Polarizador; TL – Telescópio; 1 – Filtors internos do FV300; 2 – Amostra; 3 – Filtros para THG e SHG.

O sistema é composto por um microscópio invertido IX-81, o sistema de varredura

confocal FV300, ambos da Olympus. Dentro do FV300 há duas fotomultiplicadoras (PMT)

Hamamatsu 3896, a emissão da amostra pode ser separada com um jogo de filtros internos

ao FV300. Uma PMT do mesmo modelo será utilizada para captar o sinal gerado para frente.

O laser é um Mai-Tai de Ti:Safira da Spectra-physics. Um estágio de translação da Prior

Scientific, modelo ProScan foi usado para movimentar as amostras na direção x-y, enquanto

o movimento na direção z é realizado pelo próprio IX-81.

Para detectarmos o sinal de THG usamos dois filtros coloridos Hoya U340 que

possui um pico de transmissão em 340. Para o SHG usaremos um filtro passa banda em 475,

IX81

PMT

FV300

3

PMT

PMT

MaiTai

HPL TL

1

2

FLIM

117

para transmitir o sinal de SHG e um filtro passa baixa 700 (700SP) para bloquear o laser. Na

frente da PMT do FV300 também colocaremos um filtro passa baixa 700 (700SP) para bloquear

a reflexão do laser. As imagens foram obtidas com uma objetiva Uplan FL N da Olympus de

40x e NA 1.3 de imersão a óleo.

Não utilizamos condensador para coletar a luz proveniente da amostra, pois

estamos trabalhando no UV e o vidro comum usado em microscópios não transmite no

comprimento de onda desejado. Nesse caso seria necessário o uso de um condensador

especial[44]. Por isso optamos por não usarmos mais o condensador. Para que

conseguíssemos coletar a maior quantidade de sinal, colocamos a PMT no lugar do

condensador, bem próxima à amostra com uma gaveta para troca de filtros, figura 3.7.2.

Figura 3.7.2: PMT e peça com gaveta para troca de filtros

Esse sistema é capaz de adquirir imagens de terceiro e segundo harmônicos (THG

e SHG), e de fluorescência excitada por dois fótons (TPEF) de uma mesma região.

118

3.8 - Resumo das montagens e Conclusão

Nesse capítulo descrevemos os detalhes relevantes dos equipamentos e dos

sistemas experimentais. Apresentamos os principais desafios e as soluções encontradas para

aquisição de imagens inéditas. Na tabela 1 fizemos um resumo dos equipamentos usados nas

montagens, em lasers só listamos as principais fontes de luz.

Tabela 1: Resumo das montagens experimentais.

Lasers Emissão Varredura Detecção

MaiTai 690-1040nm FV300

SHG - PMTTHG - PMTTPEF - PMTFLIM - TCSPC

Técn

icas

NLO

Spirit 800nm FV300 CARS - PMTSpirit NOPA 1040nm CCARS - PMT

Sist

ema

CC

AR

S II

Legend 800nm FV300 Modificado CARS - PMTOperA SHG idler 1036nm CCARS - PMT

Sist

ema

CC

AR

S I

OPOs ps signal 700-900nm LSM780 CARS - Espectral e PMTPicotrain 1064nm

Sist

ema

CA

RS

119

Capítulo 4

Resultados

Nesse capítulo apresentaremos os resultados obtidos com CARS e CCARS em

nossas montagens experimentais. Iniciaremos com os resultados para CARS realizado com os

OPOs integrado ao Ti:Safira. Para os sistemas de detecção de CCARS começaremos com

resultados preliminares que confirmam o sinal medido como CARS por mistura de seis ondas,

em seguida os resultados que confirmam que o efeito cascata pode ser usado para aquisição

de imagens com maior razão entre o sinal ressonante e não ressonante. As imagens para

CCARS nas duas montagens serão apresentadas no final do capítulo.

4.1 - Resultados do sistema CARS

Com a montagem da figura 3.4.1 do capítulo anterior adquirimos a primeira

imagem de CARS do Brasil em junho de 2011. Para as imagens de CARS e CCARS vamos

trabalhar com o deslocamento Raman de 2847 cm-1, nesse nível de energia vamos excitar as

vibrações moleculares de estiramento simétrico e assimétrico, devido à largura espectral dos

120

pulsos, da ligação CH2. [13]. Esse nível de energia vibracional terá ressonância principalmente

com lipídios, ricos em ligações CH2. Na figura 4.1.1 temos um gráfico de espalhamento Raman

para citoplasma em células HeLa vivas por Palonpon et al. (2013) [45].

Figura 4.1.1 – Espectro Raman de citosol.[45]

Vamos adquirir imagens de tecido fresco, nossa principal amostra foi um corte de

orelha de camundongo, figura 4.1.2. A orelha de camundongo tem uma camada de células de

gordura com acúmulo de lipídios na hipoderme, outra região da orelha que tem acúmulo de

lipídios são as glândulas sebáceas. A derme contém bastante colágeno que produz um sinal

forte de segundo harmônico.

121

Figura 4.1.2 – Corte coronal de uma orelha de camundongo corado com Hematoxilina e Eosina.

A figura 4.1.3 mostra CARS em orelha de camundongo em várias profundidades

com total de 28 m de profundidade mostrando as células adiposas do hipoderme.

200x Epitélio

Lâmina Basal

Derme

Glândulas Sebáceas

Celulas Adiposas

Epiderme

Derme

Hipoderme

Capilar

Plano da Imagem

122

Figura 4.1.3 – Imagens de CARS em orelha de camundongo, com separação entre cada imagem

de 1 m e penetração máxima de 28 m. Cada imagem tem 212x212 m

Outras partes do comundongo utilizados foram coração e pulmão, figura 4.1.4. As

imagens da figura 4.1.4 foram adquiridas com objetivo de testar o sistema em outras amostras

que não a orelha.

0m 1m 2m 3m 4m 5m

6m 7m 8m 9m 10m 11m

12m 13m 14m 15m 16m 17m

18m 19m 20m 21m 22m 23m

24m 25m 26m 27m 28m

123

Figura 4.1.4: (A) CARS de coraçao de camundongo com objetiva de 10X, 850x850 m. (B) CARS

em pulmão de camundongo com objetiva de 40X, 212x212 m.

Na figura 4.1.4 (A) podemos visualizar com bastante contraste as células do tecido

adiposo, ricas em lipídios, no coração do camundongo. Existe um acúmulo de tecido adiposo

na periferia do coração para seu abastecimento energético. Já na figura 4.1.4 (B) vemos

hemácias nos vasos do pulmão e o tecido adjacente. Nota-se o contraste menor pois a região

da imagem não contém tecido adiposo. Vale salientar que fomos capazes de fazer a aquisição

de imagens em tempo real de hemácias se movendo no tecido do pulmão dos camundongos.

Usando o detector espectral do scanhead conseguimos visualizar imagens de CARS

e soma de frequência entre os feixes de stokes, em 969 nm, e bombeio, em 760 nm, cada um

é um signal de um OPO. Nesse caso a soma de frequência (SFG) é em 425 nm, o SHG em 485

nm e o CARS em 625 nm. Na figura 4.1.5 podemos ver essas emissões, mostrando o SHG do

stokes mais fraco do que o SFG, e uma fluorescência excitada por dois fótons que aparece em

todos os canais. Para comprovar qual das imagens correspondia à SFG ou SHG, usamos o

seguinte procedimento. O SFG e o CARS dependem da presença dos dois feixes, logo devem

desaparecer quando bloqueamos qualquer um deles, já o SHG em 485 nm só desaparece

quando bloqueamos o laser de 969 nm, mas não o laser de 760 nm. Os sinais em 425 nm e

632 nm desapareceram com bloqueio de ambos os lasers, assim como ao mexer no atraso

temporal entre os dois feixes, já o sinal de 485 nm desapareceu apenas com o bloqueio do

feixe de 1064 nm e foi independente do atraso temporal.

(A) (B)

124

Figura 4.1.5 – Imagens do sinal sinal detectado pelo detector espectral do LSM780 de 414 nm (imagem canto superior direito) a 685 nm (imagem canto inferior esquerdo).

Pela figura 4.1.5 podemos ver que a intensidade do CARS nesse caso se mostrou

mais forte do que o segundo harmônico e a soma de frequência. Em princípio, para mesma

intensidade dos dois feixes, o SFG deve ter o dobro da intensidade do que os dois SHG´s de

cada sinal, pois 2 2 2

1 2 1 1 2 22I I I I I I . Além disso existe a possiblidade do termo cruzado

ter um aumento por estar mais próximo de ressonâncias com os níveis eletrônicos. O

surpreendente nesse caso foi a intensidade do SFG e SHG quando comparada ao sinal típico

de SHG obtido com pulsos de 100 fs. O pulso do OPO tem 7000 fs, levando a conclusão de que

SHG com OPO seria 70 vezes menor do que SHG com MaiTai. Mas a intensidade do SFG foi da

mesma ordem de grandeza do CARS mostrando que se trata de um sinal que pode ser

detectado com facilidade em um sistema de CARS convencional.

CARS

SFG

SHG Stokes

125

A grandeza envolvida tanto na geração do SHG quanto do SFG é basicamente a

mesma, o 2 , o que significa que o SFG deve visualizar basicamente as mesmas estruturas

do SHG, ou seja, fibrilas de colágeno. Assim, decidimos explorar essa possibilidade detectando

o SFG e o CARS, como mostra a figura 4.1.6.

Figura 4.1.6 – Bainha de mielina de nervo ciático de camundongo. Mostrando CARS em Vermelho e SFG em Verde.

A bainha de mielina é rica em lipídeos, e a matriz extracelular em sua volta é rica

nas fibras de colágeno. Conseguimos visualizar as duas estruturas claramente. Com essas

imagens, concluímos os resultados do sistema para CARS com os OPOs integrado ao MaiTai.

Infelizmente, devido à problemas no laser de bombeio, com vazamento de água do chiller

sobre o cristal do módulo amplificador, que exigiu a re-exportação do laser para conserto, e

não foi possível continuar com esse trabalho.

126

4.2 - Resultados preliminares sistema CCARS I

Antes de iniciarmos a construção das imagens adquirimos resultados preliminares

utilizando a montagem experimental I, figura 3.5.2, com montagem alternativa sem o

microscópio. Os feixes utilizados foram o segundo harmônico do idler em 1080 nm do OPA, e

o bombeio em 800 nm. Focalizando em uma cubeta com água no foco de uma objetiva de 10X

com abertura numérica de 0.3. Medimos a luz gerada com o monocromador os picos do CARS

e do CCARS, os resultados são mostrados na figura 4.2.1. Na figura 4.2.1-A tiramos uma foto

da luz gerada na água mostrando o CARS e o CCARS, para conseguir a separação da luz do

CARS e do CCARS modificamos o alinhamento consideravelmente até que conseguíssemos o

efeito desejado.

Figura 4.2.1: (A) - Foto mostrando a luz gerada na água com o sinal de CARS em vermelho e CCARS em verde; (B) - Espectro do sinal; (C) - Gráfico log-log da intensidade pela potência, a curva em azul (feixe Stokes) apresenta inclinação de 2.05 e a curva verde (feixe bombeio) apresenta inclinação de 3.01.

Variamos a potência do laser, e fizemos as mesmas medidas do gráfico da figura

4.2.1-B para o feixe de Stokes e pump. Depois fizemos uma integração da intensidade total de

CCARS gerado para cada curva. O resultado é visto na figura 4.2.1-C, que mostra um gráfico

log-log da intensidade de CCARS em função da potência do laser. O resultado concorda com a

dependência do CCARS com os feixes, 3 2

CCARS pump stokesI I I , e mostra que o efeito é uma mistura

de seis ondas.

127

A partir de então começamos a realizar medidas e adquirir dados com soluções no

microscópio. Primeiro utilizamos uma amostra de ureia sobre uma lamínula de vidro. Na

interface entre o vidro e o cristal de ureia podemos medir tanto o sinal de segundo harmônico,

que é forte na ureia, como o sinal de CARS e CCARS, de origem não ressonante no vidro. O

objetivo dessa medida é comparar a intensidade dos sinais.

Sabemos que o segundo harmônico em amostra biológica é gerado por colágeno,

principalmente do tipo I, e esse sinal é suficientemente forte para ser detectado pelas

fotomultiplicadoras, o sinal de SHG tem intensidade maior ou igual à autofluorescência dos

tecidos.

A figura 4.2.2 mostra o espectro detectado pelo monocromador para montagem

experimental I, segundo harmônico do idler do OPA ajustado para 1036 nm e bombeio em

800 nm.

Figura 4.2.2: Espectro da luz gerada no foca da objetiva de 10X focalizando cristais de ureia e lamínula de vidro, mostrando: o segundo harmônico do feixe de bombeio (400 nm), o segundo harmônico do feixe de Stokes (520 nm), a soma de frequência do feixe de bombeio e Stokes (453 nm), o CARS (645 nm) e o CCARS (544 nm).

A partir do gráfico da figura 4.2.2 verificamos que a intensidade do sinal de CCARS

é comparável com o sinal de segundo harmônico de um cristal de ureia. Parte do sinal de CARS

CARS2845cm-1

645nm

Cascade CARS5858cm-1

544nmSHG400nm

SFG453nm

SHG520nm

Filtro

128

foi bloqueado por um filtro passa baixo 650 nm (650SP), utilizamos esse filtro para que a

intensidade do sinal de CARS fosse comparável com os outros sinais gerados no foco.

Em seguida realizamos medidas para soluções de etanol no foco da objetiva.

Mantivemos os feixes em 1038 e 800 nm com ressonância para deslocamento Raman em 2847

cm-1 [46]. Nesse comprimento de onda e com pulsos de femtossegundos estaremos em

ressonância com os modos vibracionais de estiramento do CH2. O gráfico da figura 4.2.3.

Mostra a variação do sinal de CARS e CCARS para diferentes concentrações de etanol em

solução com água.

Figura 4.2.3: Comparação entre o sinal de CARS (Vermelho) e CCARS (Azul) para várias concentrações de etanol em água.

Para construirmos o gráfico, pipetamos as concentrações de água e etanol em uma

placa de cultura de célula com fundo de lamínula e medimos o sinal com um fotodiodo e os

filtros da figura 3.5.4. Nesse trabalho usamos etanol absoluto com 99,3% de etanol. Pelo

gráfico podemos ver que o sinal de CCARS apresenta um contraste maior entre as várias

concentrações de etanol. Comparando o sinal máximo de CARS para o etanol absoluto com o

sinal de somente 10% do etanol absoluto e 90% de água, temos uma variação de

299.3% 99.3% 00.1 0.9 3.75Ethanol Ethanol HI I I

, enquanto para CCARS temos

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

a.u

.

Ethanol Concentration

CCARS

CARS

129

299.3% 99.3% 00.1 0.9 10.3Ethanol Ethanol HI I I

. Um aumento de 2.7 vezes na diferença entre o

que consideramos ressonante e não ressonante.

Continuando com o trabalho com etanol na ressonância de 2847 cm-1, dessa vez

utilizamos um volume de etanol a 99,3% em uma placa de cultura de células com fundo de

lamínula, fazendo com que os feixes focalizassem no meio do volume, sem interferência de

efeitos que pudessem ser gerados na superfície do líquido ou na interface entre o líquido e o

vidro. Nesse caso serão gerados apenas CARS e CCARS e não precisamos de filtros para separar

o CCARS de segundo harmônico, trabalhamos então com um passa baixa 610 nm para

bloquear o sinal do CARS e um passa baixa 710 nm para bloquear o sinal dos feixes. Para o

CARS utilizamos apenas o filtro conforme a figura 3.5.4.

Sintonizamos o feixe do segundo harmônico do OPA, que será o feixe de Stokes

no processo CARS, entre 1022 e 1060 nm, e adquirimos os sinais de CARS e CCARS. Os

resultados são mostrados no gráfico da figura 4.2.4.

Figura 4.2.4 – Gráfico do sinal de CARS (vermelho) e CCARS (azul) para um volume de 99,3% de etanol no centro da objetiva. O deixe de Stokes foi sintonizado entre 1022 e 1060 nm.

O gráfico da figura 4.2.4 está normalizado e os dois sinais são máximos em (A) e

conforme a diferença entre os feixes se distancia da ressonância em 2847 cm-1 o sinal para

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1020 1030 1040 1050 1060

ccars

cars

Stokes beam (nm)

a.u

.

(A) Pico de ressonância- CH2 stretching

(B) Sinal menor fora da ressonância

Feixe stokes sintonizado de 1022 a 1060 nm

130

ambos fica mais fraco. O CCARS fica mais fraco do que o CARS, esse resultado concorda com

o nosso modelo, gráfico da figura2.5.3-B, e confirma que o CCARS apresenta menor sinal

quando fora da ressonância.

4.3 - Resultados preliminares sistema CCARS II

Para a montagem experimental II, mostrado na figura 3.6.1, sem o uso do

microscópio, medimos a intensidade do sinal em uma solução 99,3% de etanol. Como o NOPA

gera pulsos ultracurtos de aproximadamente 20 fs, a largura de banda é de aproximadamente

60 nm, o que é demasiadamente largo para as nossas medidas. Para modificarmos o pulso,

aumentando sua duração e diminuindo a largura de banda, modificamos o ângulo do cristal

no primeiro estágio e o atraso do pulso fundamental em relação à luz branca, dessa forma

conseguimos pulsos com 15 nm. Em seguida, modificando a distância entre os prismas do

compressor de pulsos, buscando o máximo de segundo harmônico gerado em um cristal de

ureia no foco da objetiva e detectado pelo monocromador, esses parâmetros foram gravados

para alguns comprimentos de onda do bombeio. Os resultados são mostrados na figura 4.3.1.

Figura 4.3.1: Gráfico do sinal de CARS (vermelho) e CCARS (azul) para um volume de 99,3% de etanol no foco da objetiva. O feixe de bombeio foi sintonizado entre 770 e 850 nm.

a.u

.

Pump (nm)

0

0.5

1

770 780 790 800 810 820 830 840 850

CCARS

CARS

131

O gráfico da figura 4.3.1 mostra o mesmo que foi observado no gráfico da figura

4.2.4, a razão entre o sinal do CCARS em ressonância e fora da ressonância é maior do que a

mesma razão para o CARS.

4.4 - Imagens CCARS e CARS

Para a montagem I primeiro colocamos os feixes parados no centro em uma região

com várias células adiposas, depois monitorávamos o sinal da PMT com um osciloscópio,

quando conseguíamos um sinal forte, começávamos a fazer as imagens. Fizemos dessa forma

para acelerar a focalização da região de interesse e não causar dano ao tecido, pois as imagens

foram adquiridas com 1 ms por posição (pixel dwell time), isso significa somente um pulso por

pixel. A figura 4.4.1-A mostra imagem adquirida para CARS e seu espectro na figura 4.4.1-B.

Figura 4.4.1: (A) Imagem de CARS de células adiposas de orelha de camundongo. (B) Espectro

da mesma área da imagem. A barra indica 100 m.

Em seguida mudamos os filtros e adquirimos imagem para CCARS, figura 4.4.2-A.

0

10

20

480 530 580 630 680

Co

un

ts x

10

3

nm

CARS

A B

132

Figura 4.4.2: (A) Imagem de CCARS de célula adiposa de orelha de camundongo. (B) Espectro

da mesma área da imagem. A barra indica 100 m.

Figura 4.4.3: (A) União das imagens de CCARS (verde) e CARS (Vermelho). (B) Imagem de

campo claro. A barra indica 100 m.

Quando unimos as imagens de CARS e CCARS podemos ver que as duas técnicas

mostram aproximadamente as mesmas estruturas, figura 4.4.3-A. Existindo somente algumas

pequenas diferenças, algumas áreas mostram sinal de CARS (vermelho) mais forte, enquanto

outras mostram mais sinal de CCARS (verde). Essas diferenças podem ser explicadas

considerando que a amostra pode ter se movido um pouco enquanto a imagem era adquirida.

Outra explicação é que a voltagem na fotomultiplicadora para detectar CARS, que incluí uma

0

10

20

480 530 580 630 680

Co

un

ts x

10

3

nm

CCARS

A B

A B

133

maior quantidade de sinal não ressonante, seja relativamente baixa para detectar áreas

somente com pouco sinal ressonante. Enquanto que para CCARS áreas com muito sinal não

ressonante não aparecem com tanta intensidade.

Na figura 4.4.3-B podemos verificar que a aquisição de várias imagens não causou

dano à amostra exceto por uma pequena região no centro que usamos para posicionamento

do foco.

Também utilizamos cortes de cérebro de rato congelado que mostram substância

branca do lobo parietal. A substância branca é marcada pela composição de oligodendrócitos

e axônios dos neurônios, onde há maior quantidade de mielina [47], [48]. As células presentes

são células da glia [49] (astrócitos e oligodendrócitos), células cujo tamanho não ultrapassam

25 m. Em geral, mesmo com marcação de HE são núcleos bem apagados e as células não tem

demarcações citoplasmáticas.

Figura 4.4.4: Imagens de corte do lobo pariental de rato. (A) CARS. (B) CCARS. (C) Campo claro.

A barra indica 100 m.

Nas imagens da figura 4.4.4 podemos ver como o CCARS consegue maior contraste

do que o CARS e igualmente não causa nenhum dano ao tecido.

Após conseguirmos boas imagens para CCARS, trabalhamos para adquirir e

comparar imagens de CARS e CCARS dentro e fora de ressonância para a amostra de orelha

de camundongo. Adquirimos imagens com dessintonia de aproximadamente 100 e 200 cm-1.

Para tal alteramos o comprimento de onda do feixe de Stokes, originário do OPA, para 1016

A B C

134

nm, que nos dá uma diferença de 2744 cm-1, e para 1025 nm, que nos dá uma diferença de

2657 cm-1. Tomamos o cuidado de escolhermos um comprimento de onda para o Stokes que

distanciasse o comprimento de onda do CCARS do seu segundo harmônico. Mantivemos a

voltagem na PMT constante entre as imagens dentro e fora de ressonância. As imagens foram

adquiridas com objetiva de 20X e NA de 0.5 estão na figura 4.4.5.

Figura 4.4.5 – (A), (B), (E), (F) - imagens em ressonância para CARS e CCARS; (C) - Imagem com pouca dessintonia de CARS (103 cm-1 fora de ressonância); (G) - Imagem com grande dessintonia de CARS (190 cm-1 fora de ressonância); (D) - Imagem com pouca dessintonia de CCARS (103 cm-1 fora de ressonância); (H) - Imagem com grande dessintonia de CCARS (190

cm-1 fora de ressonância). A barra indica 100 m.

Pela imagem, verificamos que com uma pequena diferença do feixe de Stokes, de

1038 nm para 1025 nm, a intensidade do background não ressonante do CCARS é inferior ao

do CARS, que concorda com o modelo teórico. Para uma grande dessintonia as duas técnicas

apresentam resultados semelhantes. As imagens das figuras 4.4.5-(A-D) e (E-H) mostram

regiões diferentes de uma mesma amostra de orelha de camundongo. Escolhemos regiões

diferentes devido ao tempo necessário para trocar o comprimento de onda dos lasers,

verificamos que, por causa dessa demora, ocorreu uma pequena mudança na focalização e na

posição da amostra.

Para a montagem II as imagens ficaram melhores, já que utilizamos o sistema de

varredura original da Olympus. Nosso tecido de amostra foi novamente orelha de

135

camundongo, e utilizamos objetiva de 10X e 0.3 NA. Para minimizar danos ao tecido causado

pelo laser utilizamos um pouco de água, duas gotas no máximo. Os feixes foram ajustados

para 800 nm para o Stokes (NOPA), e 1040 nm (fixo do fundamental) para o bombeio. Como

o feixe do NOPA tem 60 nm de largura de banda esperamos detectar bastante sinal não

ressonante, figura 4.4.6.

Figura 4.4.6 – (A), (B) CARS (vermelho). (C), (D) CCARS (verde) para duas regiões de orelha de camundongo.

B

C

A

D

136

Comparando as imagens podemos ver que a técnica de CCARS apresenta melhor

contraste, nas imagens de CARS não conseguimos distinguir as células adiposas das outras

partes do tecido ou da água.

Na imagem da figura 4.4.7-(B) e (D) aumentamos o ganho do detector

propositalmente para um valor maior do que o necessário, fazendo com que, em parte da

imagem de CCARS, o detector saturasse nas áreas com sinal mais intenso, mas mesmo assim,

a imagem não mostra o mesmo background da imagem de CARS na figura 4.4.7-B.

Figura 4.4.7: Imagens de CARS (A) e (C) e de CCARS (B) e (D). (C) e (D) mostram com aumento as respectivas áreas demarcadas por uma linha tracejada amarela em (A) e (B).

137

4.5 - Conclusão

Esse capítulo apresenta os resultados detalhados para os sistemas de CARS e

CCARS, com estudo e imagens para as duas técnicas na ressonância de 2847 cm-1 e fora de

ressonância. Adquirimos imagens de CARS com lasers de picossegundos integrando com

imagens de SHG e SFG, essas foram as primeiras imagens de CARS do Brasil. Os resultados

preliminares para o CCARS demonstram menor background não ressonante. O principal

resultado desse trabalho é mostrado pela figura 4.4.7, onde fica claro que a microscopia

CCARS pode ser aplicada para imagem em tecidos biológicos trazendo grandes ganhos em

relação à microscopia CARS.

138

Capítulo 5

Aplicações biológicas para microscopias de

óptica não linear.

Neste capítulo mostramos algumas das aplicações biológicas obtidas com a

plataforma integrada incluindo TPEF + FLIM + SHG + THG que desenvolvi ao longo de meu

trabalho de doutorado na continuação do trabalho de mestrado.

Nosso grupo foi pioneiro em demonstrar a aquisição de imagens de geração de

segundo harmônico e FLIM no Brasil e minha tese de mestrado foi a primeira a realizar a

aquisição de imagens por geração de terceiro harmônico. Ao final do meu trabalho de

mestrado em 2010 o grupo contava, então, com uma plataforma integrada que incluía as

seguintes técnicas: Fluorescência de 1 e 2 fótons incluindo FLIM, SHG e THG baseado no

microscópio confocal Olympus, cuja montagem foi descrita no final do capítulo 3, parte

experimental. Em 2012 publicamos trabalho na Microscopy Research and Techniques com a

descrição desse sistema e seus detalhes, do qual extraímos as figuras 5.1 e 5.2 a seguir [50].

Na figura 5.1 mostramos os resultados em células de cebola e batata da figura 5.1, com

aquisição simultânea de SHG + THG, sem qualquer processamento da amostra.

139

Figura 5.1: Imagem de SHG em vermelho e THG em magenta, de (A) Allium cepa, cebola e (B)

Solanum tuberosum, batata. Projeção máxima de 10 imagens com 5 m (A) e 60 imagens com

5 m em (B). N = núcleos, S = granulo de amido. Barra de escala = 50 m[50].

Na figura 5.2 mostramos o potencial dessa plataforma no estudo de câncer

através da aquisição simultânea de imagens via SHG + THG + TPEF + FLIM.

Figura 5.2: Imagens multimodais representativa de amostras fixadas com H&E para análise de SHG e THG (A-D), Não fixadas para imagens de FLIM (E-H). SHG (vermelho) e THG (magenta), e FLIM (azul, amarelo, verde). Imagens de tecido de ovário normal (A,E), cistoadenoma (B,F), borderline (C,G) e adenocarcinoma (D,H). St = Estroma, Ep = Epitélio, interface entre epitélio e estroma está indicado com linha tracejada branca. Conteúdo de mucina, está indicado em asterisco amarelo e branco, e células epiteliais estão indicadas com seta amarela. Barra de

escala = 20 m[50].

140

Os resultados preliminares mostraram o potencial dessa plataforma multimodal

para o estudo de diversos fenômenos biológicos, incluindo câncer. Essa montagem

experimental se mostrou uma ferramenta de fácil aplicação em vários tipos de amostras,

desde tecidos biológicos, como córnea, próstata e pele, a materiais não biológicos, como folha

de polycaprolactone (PCL), figura 5.3.

Figura 5.3: THG de PCL em vermelho, superposição de imagem em várias profundidades.

As técnicas da plataforma de 2010, juntas, fornecem informações

complementares a respeito da organização de células e tecidos. Enquanto a fluorescência

pode ser específica para algumas proteínas alvo, o segundo harmônico pode observar a rede

de colágeno da matriz extracelular e, o terceiro harmônico pode observar os núcleos, as

paredes das células, e gotículas de lipídios internas às células, e o FLIM fornece uma boa

quantidade de informação sobre o ambiente químico molecular nas vizinhanças dos

fluoróforos.

Logo após a divulgação desses resultados iniciamos colaborações com

pesquisadores das Ciências da Vida para aplicar essas técnicas em diversos problemas

biológicos e demonstrar mais fortemente o potencial das mesmas [51]–[56]. Essas medidas

foram realizadas por mim junto com pesquisadores colaboradores na plataforma que havia

terminado de montar no laboratório de biofotônica da UNICAMP. Em 2012, já no período do

141

meu doutorado, com a aprovação do INFABIC, remontamos a plataforma sobre o microscópio

confocal Zeiss LSM 780, exceto pelo THG porque a óptica da Zeiss não transmitia sinais abaixo

de 350 nm, e incorporamos as técnicas de Pinças Ópticas, Raman e CARS na atual plataforma.

Os resultados de CARS estão descritos em outros capítulos dessa tese.

A seguir descrevemos várias aplicações da plataforma multimodal.

5.1 - Desenvolvimento Embrionário:

Em colaboração com pesquisadores da FCA-UNICAMP, professora Gisela A.

Umbuzeiro e a aluna de Doutorado Mariana Artal, em Limeira desenvolvemos método de

fazer aquisição de imagens na forma de time-lapse em 3D (uma imagem 3D a cada 15 minutos)

por 3 dias seguidos usando as técnicas de TPEF, FLIM e THG (SHG foi muito pequeno). Com

isso foi possível montar um filme do desenvolvimento de um embrião de Paryhale hawaiensis

por todo esse período.

O interesse dos pesquisadores da FCA estava centrado no estudo do embrião em

si, utilizado como um indicador de poluição das águas marinhas. Entretanto, para nosso grupo

na física, o interesse estava centrado no fato de que embriões representam uma amostra com

a maior quantidade de células tronco, que evoluem de células tronco multipotentes para

células diferenciadas, especializadas no crescimento dos diversos órgãos [57]–[59]. Quando

uma célula diferencia ocorre processos epigenéticos, onde há metilação (CH3) nas ilhas CpG

ao longo da fita de DNA [60]. Após a diferenciação inicial cada célula precisará manter o

padrão de diferenciação da célula mãe no processo de divisão celular. As enzimas

metiltransferases DNMT3a e DNMT3b são responsáveis pela diferenciação de novo, enquanto

a enzima DNMT1 é responsável pela manutenção do padrão de metilação nas divisões

celulares subsequentes [61]. Não há modelo melhor do que o de um embrião para estudo

desses processos, e nosso interesse era o de criar marcadores ópticos para observação dos

mesmos. Para tanto a ferramenta de observação precisava ser não destrutiva, não era possível

usar qualquer marcador fluorescente exógeno, e ser capaz de acompanhar com diversas

técnicas os processos biológicos por um tempo razoavelmente longo, da ordem de dias. Já

havíamos tentado observar desenvolvimento embrionário em ovos de pássaros muito

142

pequenos, mas com a necessidade de quebrar a casca do ovo para expor o material

opticamente, só vimos a imediata proliferação de bactérias.

Nessa situação, a colaboração com FCA foi providencial. O Parhyale hawaiensis é

um crustáceo anfipodo que tem sido usado como modelo para análises evolucionárias,

genéticas e de desenvolvimento [62]–[65]. Seus ovos são transparentes e têm uma dimensão

de aproximadamente 200 m, que coincide com o campo de visão do nosso microscópio,

garantindo a aquisição da imagem de todo o embrião de uma vez [66]. Fechado dentro do ovo

o embrião está protegido contra bactérias e vírus e pode se desenvolver sem interferências.

Além disso, o processo de reprodução do Parhyale é translúcido garantindo que é possível

coletar os ovos desde os primeiros momentos da fecundação. Figuras 5.1.1 mostram o

acasalamento dos mesmos. Macho abraça a fêmea por 3 dias e quando a fecundação ocorre

é possível visualizar opticamente os ovos no corpo da fêmea.

Figura 5.1.1: (A) Parhyale hawaiensis: macho e fêmea; (B) acasalamento do par de Parhyale e (C) uma fêmea ovípara. Seta aponta os ovos.

Observando esse processo os ovos são coletados logo após a fecundação com uma

agulha sobre uma lupa e transferidos para o microscópio, como mostra a figura 5.1.2.

Mantivemos a temperatura em 26o, ideal para o desenvolvimento do embrião, por todo o

período de observação.

(A) (B) (C)

143

Figura 5.1.2. (A) remoção dos embriões com uma agulha; (B) ovos fertilizados unicelulares e (C) ovos fertilizados após a primeira divisão.

Para a aquisição das imagens usamos a objetiva 20X 0.5 NA Plan Neofluar da Zeiss

capaz de visualizar todo o embrião de 200 m, excitação com MaiTai no comprimento de onda

940 nm e toda emissão foi coletada com FLIM NDD. O FLIM foi realizado no sistema da

Becker&Hickl [BH] e não no sistema Zeiss. Assim para garantir o sincronismo do time-lapse

usamos o sinal do pixel clock da Zeiss para disparar a aquisição de imagem do BH. Isso funciona

bem para aquisição em 2D. Para 3D a Zeiss move a objetiva e recomeça a aquisição de outra

imagem na forma de z-stack. Criamos um comando para que o BH disparasse novamente

sempre que o Zeiss iniciasse seu procedimento – garantindo tanto a aquisição de imagens de

FLIM em 3D quanto acompanhasse a programação do time-lapse, com aquisição a cada 15

minutos. No final do processo geramos 3790 imagens de intensidade de fluorescência que

precisavam ser processadas para ajuste dos decaimentos com exponenciais duplas. Para

realizar esse processamento repetimos o processo da primeira imagem na forma de um batch,

e deixamos computador calculando durante toda uma noite. Cada imagem (quadro), tanto

para a formação da imagem 3D quanto para a montagem do filme, foi exportada para o

software ImageJ onde as imagens 3D foram reconstruídas e os filmes com evolução temporal

obtidos.

Figuras 5.1.3 mostram (A) superposição de TPEF e THG de um embrião de dois

dias; enquanto (B), (C) e (D) mostram as imagens de FLIM 3D do embrião após 11h30min, com

as cores fornecidas pelo tempo de vida médio, m , componente rápida, 1 , e a componente

lenta, 2 , de um ajuste com duas exponenciais.

(A) (B) (C)

144

Figura 5.1.3: (a) embrião de dois dias: THG (magenta) e TPEF (verde), (b) 3D FLIM 3D usando

m ; (c) idem usando 1 e (d) idem usando 2 ;

Já a figura 5.1.4 mostra uma sequência temporal de imagens FLIM colorido através

de m em um mesmo plano z durante o desenvolvimento embrionários desde o estágios de

uma única célula, primeira divisão até 21 horas.

(A) (B)

(C) (D)

145

Figure 5.1.4: Evolução temporal das imagens de FLIM do embrião, a escala de cor é a mesma para todas as imagens. Tempo de desenvolvimento, da esquerda para a direita, 3h27, 6h26, 9h40, 11h58, 15h58 e 21h09.

Nossos resultados mostram que o embrião suporta ser exposto por prolongado

período e que sequencias de imagens de FLIM podem ser obtidas.

5.2 - Aplicações em cortes histológicos de tecidos biológicos corados com H&E.

Uma das principais conclusões do trabalho da MRT foi que com essa plataforma

teríamos acesso à biblioteca de amostras marcadas com hematoxilina e eosina. A importância

desse fato é que poderíamos reavaliar uma biblioteca de décadas de biopsias coletadas e

estocadas em parafina, acompanhando retrospectivamente processos biológicos, como

câncer, que podem demorar anos de evolução. Os estudos iniciais foram para demonstrar a

viabilidade do método, mas, infelizmente, é difícil conseguir amostras de um mesmo paciente

ao longo do tempo, pois a coleta das biopsias é única e precede a cirurgia terapêutica.

146

Nessas amostras, as imagens de terceiro harmônico mostram com clareza os

núcleos, o segundo harmônico continua tendo forte sinal para as fibras de colágeno, e a

fluorescência excitada por dois fótons se origina da marcação por Hematoxilina e Eosina. A

figura abaixo é um exemplo de uma imagem de tecido fixado com H&E adquirida em nossa

plataforma.

Figura 5.2.1: Imagem de amostra de mama marcada com HE (superior a esquerda), em verde TPEF, em vermelho SHG e em magenta THG, com objetiva de 10X. [31]

A coloração de um tecido com solução ácida de hematoxilina faz com que uma

alta concentração de complexos carregados de hemalum migre para locais com DNA e RNA

carregados negativamente. Completando o procedimento de coloração o pH se torna básico

iniciando a conversão dos hemalums para sua forma neutra, HmAl0, induzindo a agregação

dos complexos, os quais exibem forte geração de terceiro harmônicos dentro das células. Em

amostras coradas com H&E, além do aumento de THG devido aos agregados, há crescimento

do sinal pela interação entre os complexos de hemalum e a eosina nas superfícies dos

precipitados de HmAl0. O sinal de THG observado em tecidos corados manualmente com H&E

147

é mais forte do que em precipitação seca, possivelmente devido a variações dos índices de

refração e nas susceptibilidades dos tecidos, e na interação dos corantes com cromatina[67].

O aumento de THG que observamos se deu quase exclusivamente nos núcleos o que concorda

com essas observações.

Em conjunto com o doutor Javier Adur, professor da faculdade de Engenharia da

Universidade Nacional de Entre Rios da Argentina, adquirimos imagens de tecidos de biópsias

fixados e marcados com H&E de intestino e de pele de pacientes com Osteogenesis Imperfecta

(OI). Com essas imagens fizemos análises e obtivemos informações complementares sobre a

interface epitélio e estroma, e sobre a organização das fibras de colágeno.

Assinatura de Colágeno associada a tumores (Tumor-associated collagen

signature - TACS)

A aquisição de imagens de SHG possibilita a classificação da assinatura de colágeno

associada ao tumor (TACS) através da medida do ângulo das fibras em relação à interface do

tumor. TACS é um parâmetro frequentemente usado para determinar a organização das fibras

de colágeno na fronteira do estroma tumoral [68]. Há três tipos de TACS, no tipo um as fibras

estão condensadas em torno de pequenos tumores durante o estágio inicial da doença. O tipo

dois mostra as fibras evolvendo o tumor e alinhadas em paralelo ao tumor (0°), e no tipo 3, as

fibras se alinham a 90° com fronteira do tumor, e é quando a doença se torna invasiva. Em

uma organização do tipo TACS-3 as fibras estão direcionadas na direção da invasão celular, a

figura 5.2.2 ilustra os três tipos de TACS. A sobrevivência dos pacientes está altamente

correlacionada à presença de TACS-3[69].

148

Figura 5.2.2: Ilustração dos estágios de TACS-1 a 3. Em azul estão representadas células epiteliais e em vermelhos as fibras de colágeno.

Análise das Imagens

Com as imagens de terceiro harmônico os núcleos foram contados e suas

características morfológicas foram quantificadas, área, circularidade e curtoses. Para o cálculo

do número de núcleos utilizamos o plug-in “Particle Analysis-Nucleus Counter” do ImageJ. O

ImageJ é um software livre de domínio público disponibilizado pela NIH13. No site é possível

baixar o software e vários plug-ins com várias aplicações, além de poder abrir e editar imagens

adquiridas nos softwares controladores dos sistemas de varreduras dos principais fabricantes

de microscópios. Ao menos 50 núcleos foram medidos em diferentes criptas intestinais de

cada imagem analisada. O plug-in faz um liminar da fluorescência automática e apresenta os

dados para cada núcleo. Para garantir a eficácia do plug-in comparamos seus resultados para

contagem de núcleos com a contagem manual de duas imagens de tecidos normais.

Para imagens de SHG, os níveis de intensidade e ângulo das fibras foram medidos.

No primeiro caso, um quadrado de uma região de interesse [ROI] 150x150 pixels foi

desenhada e posicionada na imagem. Essa ROI foi repetida 9 vezes em regiões sem

sobreposição. Essas regiões foram usadas juntas para avaliar a imagem de SHG inteira usando

o plug-in “multi-measure”. As nove regiões de interesse foram analisadas com a medida da

intensidade de SHG após a aplicação de um limiar mínimo [69]. Desses dados a fração de área

(a porcentagem da are do ROI que está acima do limiar, que é essencialmente uma medida da

predominância de SHG) foi quantificada. Os ângulos foram medidos em relação a tangente da

13 https://imagej.nih.gov/ij/

TACS-2TACS-1 TACS-3

149

interface entre o estroma e o epitélio usando o “angle tool” o ângulo é definido por três

pontos da seguinte forma [68], [69]: o primeiro ponto é escolhido ao longo da fibra, o segundo,

no extremo da fibra mais próximo do epitélio, e o terceiro em qualquer ponto que conectado

ao primeiro que forme uma linha paralela ao epitélio. Um total de 150 ângulos foi medido

para cada tipo de tumor.

Matriz de co-ocorrência de nível cinza - GLCM (Gray-lavel co-ocurrency matrix)

A GLCM [70] é uma matriz quadrada de duas dimensões, onde as linhas e colunas

correspondem a valores de intensidade. Cada elemento da matriz é um inteiro não negativo

correspondente ao número de par de pixels onde os valores de intensidade são i e j, figura

5.2.3. As linhas e colunas da matriz representam os níveis de cinza e a probabilidade ,dP i j

, do nível de cinza ocorrer entre os pixels. Normalmente é feita a média entre diferentes

orientações (0-180°, 45-225°, 90-270° e 135-315°) [71], [72][72]⁷². A partir dessa

matriz podemos calcular vários parâmetros como a correlação, o contraste, a energia e a

homogeneidade.

Figura 5.2.3: Exemplo de uma matriz GLCM.[73]

Os cálculos da foram realizados com o modulo GLCM-texture do Software ImageJ.

1 2 3 4 5 4 3 2 1 5

1 2 2 2 1 3 3 2 2 5

3 4 5 5 2 5 5 4 4 3

3 3 4 4 1 1 2 2 4 2

1 2 3 4 5 4 3 2 1 5

1 2 2 2 1 3 3 2 2 5

3 4 5 5 2 5 5 4 4 3

3 3 4 4 1 1 2 2 4 2

1 2 3 4 5

1 1 3 1 0 1

2 2 4 1 1 2

3 0 2 2 3 0

4 1 1 2 2 2

5 0 1 0 2 2

Exemplo de Imagem

Intensidades Correspondentes

Valor do Pixel Vizinho (i)

Val

or

do

pix

el d

e r

efe

rên

cia

(j)

GLCM

, 2,4 1g i j g

150

Como exemplo, o cálculo da energia é feito da seguinte forma:

2 ,d

i j

Energia d P i j (5.2.1)

Onde 0,1E d , a energia é uma medida do grau de ordem da imagem (i.e.

repetição dos pares de pixels). A energia é máxima em imagens com nível de cinza uniformes,

ou em diferenças uniformes entre níveis de cinza, e é mínima para grande variação dos níveis

de cinza.

Resultados – Adenocarcinoma de Cólon

Vamos mostrar os principais resultados de artigo publicado na Journal of Cancer

Therapy em 2014 [74], no qual utilizamos as técnicas de óptica não linear combinadas para

quantificar mudanças morfológicas no estroma e epitélio associadas à transformação de

câncer de cólon. As imagens fornecem informações complementares sobre as microestruturas

dos tecidos, mostrando a utilidade do emprego de tecido fixado em H&E para diagnóstico e

prognóstico.

As biópsias de cólon foram obtidas de tecidos fixados em formalina e embebidos

em parafina do laboratório de Patologia e Citologia de Silvia Viale (Paraná, ER, Argentina).

Esses blocos foram preparados previamente seguindo os procedimentos histológicos padrões.

Após isso as amostras foram seccionadas entre 4 e 30 m e montadas em lâminas e foram

avaliadas pelo mesmo patologista certificado para garantir homogeneidade na classificação

dos tumores. Adenocarcinoma de 7 biópsias e normal de 7 controles foram analisados. O

protocolo da pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética e todos os procedimentos estão de

acordo com a declaração de Helsinki e com os princípios éticos da comunidade médica.

As imagens de NLO demonstram claramente o arranjo em padrão circular de

criptas de cólon registradas de cortes, caracterizadas por coluna de células epiteliais e células

caliciformes intercaladas, figura 5.2.4. O sinal de TPEF corresponde a fluorescência da eosina

que é fraca em regiões nucleares, mas forte no citoplasma das células e nas fibras de colágeno

do estroma. SHG em vermelho, mostra as fibras de colágenos, figura 5.2.4-C e THG, em

magenta, destaca os núcleos das células da mucosa epitelial, figura 5.2.4-D. Esse é o primeiro

151

estudo mostrando a integração de técnicas de TPEF, SHG e THG em biópsia de cólon humano.

Informação estrutural de alto valor é revelada devido ao contraste de mecanismo da óptica

não linear, sendo que as imagens podem ser isoladas e analisadas separadamente, enquanto

sua superposição permite uma comparação melhor do entendimento da organização espacial

do tecido, figura 5.2.4-E.

Figura 5.2.4: (A) Imagem típica de histologia com H&E. (B)-(E) Tecido de cólon normal, e na direita uma cripta individual mostrado em aumento maior. (B)-(D) Imagens de TPEF, SHG e THG. (E) Superposição de imagens. Estruturas: L – Lúmen da cripta, g – célula caliciforme, n –

núcleo, c – fibras de colágeno. Barra de escala = 20 m.[74]

A avaliação de tecido de cólon por SHG, figura 5.2.5, e THG, figura 5.2.6, permite

diferenciação rápida e clara entre adenocarcinoma e normal. Onde as criptas individuais são

facilmente identificadas com TPEF, o tecido conectivo entre eles foi detectado via SHG de

colágeno, figuras 5.2.5-A e 5.2.5-B. Em tecido tumoral, SHG destaca mudanças nas fibras

envolvendo o estroma. A quantificação da prevalência de colágeno sobre tecido tumoral

resultando em uma diferença significante comparada com o normal, figura 5.2.5-C,

demonstrando um aumento da densidade de colágeno no estroma tumorais. Enquanto cólon

normal exibe acumulados de fibras de colágeno aproximadamente paralelos a interface

152

epitélio estroma, o tecido adenocarcinoma tem fibras de colágeno grossas e não paralelas

com certos ângulos em respeito a interface, figura 5.2.5-B.

Análise quantitativa mostra que os ângulos das fibras de colágeno em cólon

normal são menores do que 11°, enquanto em adenocarcinoma tem ângulos acima de 50°,

figura 5.2.5.

As imagens de THG permitem detectar somente os núcleos, tornando mais fácil a

digitalização do processo. Células de tumores alargados e com forma irregular exibem

aumento da razão núcleo/citoplasma, figura 5.2.6-A, área e circularidade são

significantemente maiores, e a distribuição de valores de cinza é maior (menor valor de

curtoses) em núcleos de células tumorais devido a considerável heterogeneidade, mostrando

áreas distintas com considerável brilho e escuridão, figura 5.2.6-B.

Adicionalmente um ponto muito importante que deve ser destacado em

comparação com a histologia clássica é o benefício potencial de imagens 3D. A figura 5.2.7

mostra uma representação 3D, que permite a visualização de característica indistinguíveis em

procedimentos clássicos em 2D. Com a projeção máxima em 3D usando imagens de THG figura

5.2.7-A e 5.2.7-B, demonstram claramente que mudança na arquitetura no adenocarcinoma,

na qual os arranjos circulares de cada cripta de cólon e o espaço entre as células foram

perdidos. Também há atenuação na densidade nas células de cálice/cripta e diminuição na

mucina foram facilmente distinguíveis, figura 5.2.7-A. Além disso, usando 3D SHG foi possível

observar a inclinação e invasão das fibras de colágeno no adenocarcinoma comparado com

normal, figura 5.2.7-C. Vale a pena notar que essas características (presença de ângulos em

fibras de colágeno) não são facilmente visualizadas em seção coradas com H&E.

153

Figura 5.2.5: Imagem representativa de TPEF, verde, e SHG, vermelho. (A) TPEF+SHG 512x512 pixels, Tecido normal mostrando 9 regiões em branco onde foi feita a quantificação de colágeno. Asterisco branco indica cripta individual selecionada para analisar os ângulos das

fibras. Barra de escala = 50 m. (B) Aumento em uma cripta individual, selecionada de (*(A)). Duas imagens de biópsias diferentes são mostradas. Ângulo das fibras de colágeno foram quantificadas nessas imagens. Fibras específicas (setas brancas) estão aumentadas para discriminar a morfologia das fibras. Estruturas, L – Lúmen da cripta, g – célula caliciforme, n – núcleo, c – fibras de colágeno. (C) Quantificação da Área com n=117 e n=81 (n=número de regiões de 150x150 pixels para tecidos normais e adenocarcinoma. (D) quantificação dos ângulos das fibras com n=150 e n=135 (n=número de fibras de colágeno) para normal e adenocarcinoma respectivamente. (*p<0,05).[74]

154

Figura 5.2.6: Imagem representativa de (A) TPEF (verde) +THG (magenta). Estruturas, L – Lúmen da cripta, g – célula caliciforme, n – núcleo, c – fibras de colágeno. Barra de escala = 50

m. (B) Área, circularidade e curtoses quantificados, com n=580 e n=560 para normal e adenocarcinoma respectivamente. *p<0,05 e **p<0,001.[74]

(A)

155

Figura 5.2.7: Projeção máxima de 60 imagens separadas por 0,5 mm cada (512x512x60). Tecidos de cólon (A) Normal e (B) adenocarcinoma. Na esquerda TPEF+THG, na direita somente THG mostrando os núcleos. (C) projeção máxima (TPEF+SHG) de cripta individual de

60 e 50 imagens separadas por 0,5 m cada para respectivamente tecido normal e adenocarcinoma. Interface entre epitélio e estroma é indicada pela linha tracejada branca. Estruturas, L – Lúmen da cripta, g – célula caliciforme, n – núcleo, c – fibras de colágeno. Barra

de escala = 50 m.[74]

Resultados - Oesteogenesis Imperfecta

Oesteogenesis Imperfecta é uma doença autossômica dominante rara (6–

7/100,000) [75] que causa defeito na síntese do colágeno tipo I fragilizando os ossos do

paciente, que fraturam muito facilmente. O diagnóstico dessa doença é razoavelmente

complicado, se iniciando pela clínica de pacientes com fraturas ósseas muito frequentes, e a

comprovação é dada pelo histórico familiar e múltiplas consultas, que por sua vez acarretam

um longo período de espera para concretizar o diagnóstico [76]. A doença apresenta quatro

tipos diferentes, de acordo com a severidade [77], [78], e a diferenciação entre os mesmos

requer exames bioquímicos e moleculares complicados. Desde o início dessa colaboração a

expectativa era que, dado que a falha genética atua na formação do colágeno como um todo,

com forte impacto nos ossos, também deveríamos detectar falha na formação do colágeno na

pele, muito mais acessível, e o método óptico poderia ser utilizado para um diagnóstico rápido

(A) (B)

(C)

156

e barato. Ao longo do trabalho demonstramos além disso, que a metodologia óptica pode até

diferenciar os quatro tipos da doença.

Assim as imagens foram adquiridas em amostras de derme de pacientes com OI.

É conhecido, de estudos de genética bioquímica e molecular, que a grande maioria de

indivíduos afetados com OI tipos I-IV, sendo os tipos III e IV os mais severos, tem mutação em

um dos genes COL1A1 ou COL1A2 [75] que afetam a estrutura primária da cadeia de colágeno.

O resultado final é que as fibras de colágeno são ou reduzidas em quantidade ou qualidade,

como organização anormal e curta, ou ambos [79]. Portanto, esperamos que pele com

estruturas desorganizadas gerassem menos SHG comparado com estruturas de colágeno

encontrada em pele normal. No melhor do nosso conhecimento esse trabalho foi o primeiro

a demonstrar a aplicação da microscopia SHG para quantificar e classificar as transformações

em derme humana de pacientes com OI tipos I, III e IV.

Os resultados mais importantes (mostrados na figura 5 do artigo) [51] mostram

que duas análises, densidade das fibras através da intensidade do sinal de SHG e energia pela

GLCM, figura 5.2.8, foram capazes de discriminar satisfatoriamente os diferentes pacientes de

OI de acordo com a severidade clínica. Usando biópsias frescas pode-se detectar uma redução

na densidade da rede das fibras de colágeno na reconstrução 3D das imagens de SHG de

pacientes com OI severa, figura 5.2.8-B (tipo III) e figura 5.2.8-C (tipo IV), quando comparada

com a representação 3D de imagens SHG de pele normal, figura 5.2.8-A. Isso foi confirmado

quantitativamente com o decaimento dependente da profundidade (depth-dependent decay

– DDD) do sinal de SHG avaliado em três posições das fatias, figura 5.2.8-D, confirmando que

OI severa é menos densamente acumulada. Além disso, os valores de energia de GLCM não

somente separam o tipo I e tipo III de tecido normal, figura 5.2.8-E, como podem diferencial,

com significância estatística, entre pacientes de vários tipos de OI, incluindo tipo IV, figura

5.2.8-F.

157

Figura 5.2.8: Melhores métodos para análise quantitativa de amostras de pele frescas e

fixadas. Representação 3D, 40 imagens em intervalos de 1 m de SHG de amostras de biópsias de pele à fresco. (A) pele normal. (B) OI Tipo III (Paciente E) e (C) OI tipo IV (Paciente D), (D) Decaimento dependente da profundidade [DDD] do SHG analisado para determinar a densidade em tecido normal (preto), e com OI severa (tipo III e IV – círculo vermelho). Cada ponto representa o valor médio e desvio padrão de três valores correspondentes das regiões selecionadas. (E)-(F) Análise de textura, usando o GLCM. Energia calculada versus distância

dos pixels, variando de 1 a 50 pixels, (0,35-17,30 m) nas direções de 0, 45, 90 e 135°. Em (E) Normal (n=12), OI moderada (n=3) e OI severa (n=12). Em (F) Normal (n=12), OI I (n=3), OI III (n=9) e OI IV (n=9). Pat=Paciente.[51]

Esses resultados reforçam a aplicação de imagens de SHG e TPEF como um método

limpo e rápido de diagnóstico para OI, especialmente com melhorias na automação no

procedimento de quantificação das características das imagens. Nossos na análise de pele de

OI humana mostram que a combinação do cálculo de energia e densidade medidos com a

GLCM para as imagens de SHG fornecem um método quantitativo para diferencia tecido

saudável de doente.

158

5.3 - Conclusão

Os resultados apresentados nesse capítulo mostram claramente como a

combinação de várias técnicas de microscopias coerentes fornecem informações

complementares na aquisição de imagens de uma mesma área. Em particular os resultados

para as imagens fixadas e coradas com H&E resultaram em informações inéditas decorrendo

em publicações. A aplicação da plataforma mutimodal em embriões vivos demonstrou a

capacidade de aplicação in vivo por longo tempo.

159

Capítulo 6

Conclusões e Perspectivas

No melhor do nosso conhecimento, essa tese mostrou a primeira imagem por

microscopia CCARS. O processo de CCARS apresenta uma menor quantidade de sinal não

ressonante quando comparado ao CARS, uma vantagem importante porque o fundo não

ressonante é a principal adversidade encontrada na aplicação da microscopia CARS. Os

resultados, da dependência do sinal com relação à ressonância vibracional molecular para

soluções de água e etanol, concordam com os cálculos teóricos para o modelo de um oscilador

amortecido.

A microscopia CCARS se mostrou uma ferramenta eficaz e sua aplicação não é mais

complexa do que as outras técnicas de óptica não linear que utilizam dois feixes pulsados

coincidentes no tempo. O fato da imagem ser construída detectando uma luz emitida no foco,

que não coincide com o comprimento de onda de nenhum feixe incidente, traz simplicidade

ao sistema quando comparado com a microscopia por espalhamento Raman estimulado.

A dificuldade encontrada por nós na primeira montagem está na necessidade de

potência de pico elevada, que pode causar danos às amostras e aos tecidos, e na necessidade

160

de adaptar a velocidade de varredura à taxa de repetição do laser. Mas, com a disponibilidade

de fontes de luz mais eficientes, como na segunda montagem, a única dificuldade encontrada

foi com relação à possibilidade do laser de causar danos às amostras.

Como continuidade do meu trabalho de mestrado, no qual desenvolvi um sistema

para imagens de óptica não linear, realizei colaboração com profissionais da área biológica.

Demonstramos quantitativamente que a integração das técnicas de segundo harmônico,

terceiro harmônico e fluorescência excitada por dois fótons, traz informação suficiente para

discernir entre tecido de cólon saudável e anormal. Com o terceiro harmônico, foi possível

quantizar características de núcleos, e verificar modificações morfológicas. O segundo

harmônico mostra colágeno, o que permite cálculos sobre a organização da matriz

extracelular.

Informações foram extraídas de lâminas de tecido fixadas em H&E. Isso possibilita

um estudo de longa escala temporal, desde que se tenha acesso a biópsias do mesmo paciente

em momentos diferentes.

Como próximo desafio, considero aplicar a microscopia CCARS, almejando o

mesmo sucesso obtido nas aplicações demonstradas no final dessa tese. Ademais, com a

experiência adquirida no desenvolvimento de uma técnica inédita, continuarei trabalhando

na pesquisa de imagem e espectroscopia por espalhamento Raman Coerente.

161

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