UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

VILMA MENEZES DE JESUS PRADO

Desenvolvimento de método por CLAE-DAD para discriminação de chás de genótipos de Lippia gracilis Schauer através de cromatogramas fingerprint combinados com análises quimiométricas

São Cristóvão – Sergipe

Fevereiro/2012

VILMA MENEZES DE JESUS PRADO

Desenvolvimento de método por CLAE-DAD para discriminação de chás de genótipos de Lippia gracilis Schauer através de cromatogramas fingerprint combinados com análises quimiométricas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Sergipe, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Química.

Orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes

São Cristóvão

2012

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTR AL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

P896d

Prado, Vilma Menezes de Jesus

Desenvolvimento de método por CLEA-DAD para discriminação de chás de genótipos de Lippia gracilis Schauer através de cromatogramas fingerprint combinados com análises quimimétricas / Vilma Menezes de Jesus Prado;

Orientadora: Valéria Regina de Souza Moraes. – São Cristóvão, 2012.

91 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2012.

1. Lippia gracilis. 2. Chá. 3. Quimiometria. 4. Cromatografia líquida. l. Moraes, Valéria Regina de Souza, orient. lI. Título.

CDU 543.544:582.929.3

i

“Cada sonho que você deixa pra trás é um

pedaço do seu futuro que deixa de existir”

Adler Rocha

ii

À Deus, por ter me dado forças nas horas mais difíceis, ajudando-me a não desistir.

Aos meus pais Antônio Evangelista de Jesus e Vivalda Maria Menezes de Jesus por trabalharem sacrificando

seus sonhos em favor dos meus. Por tudo, sou infinitivamente grata.

As minhas queridas irmãs, Ana Maria, Aline e Beatriz, Pela força, compreensão e constante torcida.

Ao meu esposo Eguinaldo, pelo carinho, força e paciência.

À toda a minha família, pela força, apoio e incentivo.

Dedico

iii

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Sergipe (UFS) através do Programa de Pós-Graduação

em Química (NPGQ) e do Departamento de Química (DQI) pela oportunidade de

realizar este trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela

concessão da bolsa de estudos.

À Prof.ª Dr.ª Valéria Regina de Souza Moraes, pela orientação, dedicação e amizade,

além da sua compreensão durante o decorrer deste trabalho.

Ao Prof.º Dr. Paulo César de Lima Nogueira pela colaboração no desenvolvimento

deste trabalho.

Ao Prof.º Dr. Sandro Navickiene pelas valiosas contribuições para o melhoramento

do meu trabalho, pelos ensinamentos, e pela disponibilização de equipamentos e

materiais do seu laboratório para execução deste trabalho.

Ao Prof.º Dr. Emmanoel Vilaça Costa pela contribuição na realização deste trabalho.

Ao Prof.º Dr. Arie Fitzgerald Blank pelo fornecimento das folhas da espécie Lippia

gracilis Schauer.

Ao Prof.º Dr. Edenir Rodrigues Pereira-Filho, do Departamento de Química da

UFSCar, pelas análises quimiométricas contidas neste trabalho.

À Prof.ª Dr.ª Lúcia Regina Rocha Martins pelas discussões e contribuições no início

deste trabalho.

Ao Prof.º Dr. Charles dos Santos Estevam pela colaboração e pela realização do teste

de atividade antioxidante; e aos seus alunos André Luiz Lima Menezes dos Santos

iv

(Farmácia), Rodolfo Alves Moreira (Farmácia) e Sabrina Zelice da Cruz de Moraes

(Biologia) agradeço pela grande ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus amigos do LABORGANICS, em especial Alan pela ajuda no HPLC, a

Aline, Marília e Susy pela ajuda na preparação dos chás e contribuição para o

desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus amigos Érica, Pedro Ernesto, Cristiane e Silvânio pelas conversas,

companheirismo e incentivo.

Aos amigos e funcionários do Departamento de Química (DQI), que direta ou

indiretamente, contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.

v

CURRICULUM VITAE 1. DADOS PESSOAIS Nome: Vilma Menezes de Jesus Prado Nome em citações bibliográficas: Prado, V. M. J. Naturalidade: Itabaiana –SE Data de Nascimento: 30/06/1982 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO Nível Superior: Química Licenciatura, Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de Conclusão: 2008 3. ÁREA DE ATUAÇÃO Química Orgânica, Química de Produtos Naturais 4. PRODUÇÃO CIENTÍFICA

1- COSTA, S. S. L.; PITANGA, A. F.; PRADO, V. M. J.; NASCIMENTO, C. C.

Química e agricultura. Contextualizando o ensino de ligações químicas. In: Colóquio

Internacional "Educação e Contemporaniedade", 2007, São Cristóvão. I Colóquio

Internacional "Educação e Contemporaniedade", 2007.

2- COSTA, S. S. L.; PITANGA, A. F.; PRADO, V. M. J.; NASCIMENTO, C. C. ;

PORFIRIO, L. O. Solo e agricultura como tema para discussão dos conceitos de ligações

químicas 2007 (Resumo Publicado em anais de Congresso).

3- PRADO, V. M. J.; MORAES, V. R. S.; NOGUEIRA, P. C. L. Determinação de um

método por CLAE-DAD para obtenção de cromatogramas fingerprint de chás de

vi

diferentes genótipos de Lippia gracilis Schauer. 7º Encontro de Pós-Graduação da UFS,

2011, São Cristóvão- SE.

4- PRADO, V. M. J.; MORAES, V. R. S.; NOGUEIRA, P. C. L.; MARTINS, L. R. R.;

BLANK, A. F. A LC–DAD fingerprint method for infusions of Lippia gracilis Schauer

genotypes. 3rd Brazilian Conference on Natural Products, 2011, Ouro Preto-MG.

vii

RESUMO

Para avaliar os efeitos do meio ambiente no conteúdo de metabólitos secundários em genótipos de Lippia gracilis Schauer, um método por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) foi desenvolvido para obter os perfis cromatográficos (fingerprint) de chás das folhas secas de sete genótipos desta espécie provenientes de duas localizações (Sergipe e Bahia) e coletadas em diferentes estações do ano: verão (com e sem irrigação) e inverno. Para comparar os cromatogramas fingerprints foi aplicado ferramentas quimiométricas de análise exploratória (ACP). Os resultados destas análises mostraram que os genótipos 108 e 202 coletados no verão e cultivados sem irrigação são significativamente diferentes dos demais genótipos da mesma coleta. Além disso, sabendo que esta espécie possui grande resistência à seca e a altas temperaturas, pode-se propor que os genótipos 107, 108 e 110 apresentaram maior resistência ao stress hídrico, pois não foi observada diferenciação entre as amostras coletadas no verão cultivadas com e sem irrigação. Os chás das amostras de L. gracilis foram também submetidos ao teste de atividade antioxidante pelo método DPPH (2,2 difenil-1-picril hidrazil). As amostras do genótipo 201, verão com irrigação e verão sem irrigação [(201 vc e 201 vs); 30 µg/mL; 60 min)] consumiram mais de 90% do radical DPPH, apresentando uma resposta similar ao controle positivo ácido gálico (92,06%, 30 µg/mL, 60 min). Palavras-chave: Lippia gracilis; chás; CLAE-DAD, quimiometria, antioxidante.

viii

ABSTRACT

To evaluate the effects of the environmental on the content of secondary metabolites in the genotypes of Lippia gracilis Schauer, a high-performance liquid chromatographic-photodiode array detection (HPLC-DAD) method was developed to obtain the chemical profiles (fingerprints) of infusions from leaves of seven genotypes of L. gracilis originated from two locations (Sergipe and Bahia state) and collected in different seasons: summer (with and without irrigation) and winter. In order to compare the fingerprints chromatograms, it was applied chemometric tools for exploratory analysis (PCA). The results of these analyses showed that 108 and 202 genotypes collected in summer and grown without irrigation are significantly different from other genotypes under the same conditions. Moreover, knowing that this species is drought-resistant and can withstand high temperatures, we can propose that the 107, 108 and 110 genotypes are more resistant to drought conditions because there were no differences between samples collected in summer and grown with or without irrigation. All samples was submitted to antioxidant activity by DPPH method (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). The samples of 201 genotype collected in summer with and without irrigation, 201vc and 201vs (30 µg/mL; 60 min), respectively, exhibited more than 90% DPPH scavenging activities, displaying similar response to the positive control, gallic acid (92.06%, 30 µg/mL, 60 min). Keywords: Lippia gracilis; infusions; LC-DAD, chemometry, antioxidant.

ix

SUMÁRIO

Resumo....................................................................................................... vii

Abstract...................................................................................................... viii

Lista de Figuras.......................................................................................... xi

Lista de Tabelas.......................................................................................... xiii

Lista de Abreviaturas, Siglas e Acrônimos................................................ xiv

CAPÍTULO 1

1. Introdução......................................................................................................... 02

1.1 Importância das Plantas Medicinais.................................................... 02

1.2 Perfil Cromatográfico.......................................................................... 05

1.3 Quimiometria....................................................................................... 06

1.4 Atividade Antioxidante........................................................................ 09

CAPÍTULO 2

2. Revisão da Literatura........................................................................................ 14

2.1 Família Verbenaceae............................................................................ 14

2.2 Gênero Lippia....................................................................................... 14

2.3 Espécie Lippia gracilis Schauer........................................................... 25

2.3.1 Classificação Taxonômica ................................................................... 26

CAPÍTULO 3

3. Objetivos........................................................................................................... 29

3.1 Objetivo Geral...................................................................................... 29

3.2 Objetivos Específicos........................................................................... 29

CAPÍTULO 4

4. Procedimento Experimental.............................................................................. 31

4.1 Material botânico: coleta e armazenamento......................................... 31

4.2 Equipamentos, Materiais e Reagentes.................................................. 32

4.3 Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência............................. 33

4.4 Preparação dos chás.............................................................................. 33

4.5 Condições cromatográficas de análise dos extratos aquosos

liofilizados de Lippia gracilis...............................................................

33

x

4.6 Análise quimiométrica.......................................................................... 34

4.7 Avaliação da atividade antioxidante..................................................... 34

4.7.1 Avaliação quantitativa da atividade antioxidante................................. 34

4.7.1.1 Curva de calibração do DPPH.............................................................. 35

4.7.1.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras............................... 35

4.7.2 Análise estatística................................................................................. 36

CAPÍTULO 5

5. Resultados e Discussão..................................................................................... 38

5.1 Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de Lippia gracilis........ 38

5.2 Otimização das condições cromatográficas de análise por CLAE-

DAD dos extratos aquosos liofilizados de Lippia gracilis..................

39

5.3 Aplicação da condição cromatográfica na análise de diferentes

genótipos de Lippia gracilis................................................................

48

5.4 Análise quimiométrica.......................................................................... 56

5.5 Atividade antioxidante: Teste do DPPH............................................... 62

CAPÍTULO 6

6. Conclusões........................................................................................................ 68

CAPÍTULO 7

7. Referências....................................................................................................... 70

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Exemplo hipotético de gráfico de scores, com projeção de

amostras em um espaço tridimensional PC1 x PC2 x PC3............... 08

Figura 02. Foto da espécie L. gracilis................................................................ 25

Figura 03. Folhas secas dos sete genótipos de L. gracilis dos três cultivos

(inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação)......................

32

Figura 04.

Cromatogramas do extrato aquoso liofilizado do genótipo 108

(inverno) de L. gracilis obtidos segundo as condições apresentadas

na Tabela 4........................................................................................

41

Figure 05. Cromatogramas obtidos pelas condições de análise testadas

apresentadas na Tabela 5................................................................... 46

Figure 06.

Análise Cromatográfica (λ = 254 nm) do extrato aquoso das folhas

secas do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis obtido com a

condição 20 (Tabela 5). Espectros de absorção no UV das bandas

cromatográficas assinaladas com os números de 1 a

5.........................................................................................................

47

Figure 07. Cromatograma 3D obtido por CLAE-DAD do extrato aquoso do

genótipo 108 (inverno) de L. gracilis................................................ 48

Figura 08.

Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos das

21 amostras obtidas de L. gracilis [sete genótipos (106-110, 201 e

202) das três coletas: inverno, verão com irrigação e verão sem

irrigação]...........................................................................................

50

Figure 09.

Comparação dos cromatogramas fingerprints (λ= 254 nm) dos sete

genótipos entre os três tipos de coletas: inverno, verão com

irrigação e verão sem irrigação.........................................................

51

Figura 10. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos

sete genótipos (inverno) de L. gracilis em quadruplicata................. 53

xii

Figura 11.

Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos

sete genótipos (verão com irrigação) de L. gracilis em

quadruplicata.....................................................................................

54

Figura 12.

Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos

sete genótipos (verão sem irrigação) de L. gracilis em

quadruplicata.....................................................................................

55

Figura 13.

Parte do cromatograma (λ= 254 nm) dos extratos aquosos de L.

gracilis: a) antes do alinhamento, b) após alinhamento utilizando

o algaritmo “Correlation Optimised Warping”

(COW)...............................................................................................

57

Figura 14. Gráfico de pré-processamento centrado na média............................ 58

Figura 15. Variância explicada (%) para cada componente principal

(CP’s)................................................................................................

59

Figura 16. Gráfico de escores (CP1 versus CP2)............................................... 59

Figura 17. Gráfico de loadings dos extratos aquosos liofilizados de L.

gracilis..............................................................................................

61

Figura 18.

Cinética comportamental dos extratos aquosos liofilizados de L.

gracilis (30 µg/mL) e ácido gálico (30 µg/mL), frente ao radical

livre DPPH (40 µg/mL).....................................................................

66

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Classificação taxonômica da espécie L. gracilis.............................. 27

Tabela 02. Dados dos genótipos da espécie L. gracilis..................................... 31

Tabela 03. Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis........... 38

Tabela 04. Variações analíticas de gradiente exploratório para otimização das

condições cromatográficas de separação da amostra 108 inv..........

40

Tabela 05.

Condições cromatográficas de análise para obtenção do perfil

cromatográfico, utilizando uma vazão de 1 mL/min e volume de

injeção de 25 µL...............................................................................

43

Tabela 06. Variância percentual das componentes principais calculadas para

os dados da matriz original centrados na média............................... 58

Tabela 07. Atividade antioxidante dos extratos aquosos liofilizados de L.

gracilis através da redução do radical livre DPPH.......................... 64

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E ACRÔNIMOS

AAH Análise de Agrupamentos Hierárquica ACN Acetonitrila ACP Análise dos Componentes Principais ANOVA Análise de Variância CG Cromatografia Gasosa CG-EM Cromatógrafo a gás acoplado a Espectrômetro de Massas CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE–DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de arranjo de diodos CI 50 Concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo máximo COW Correlation Optimised Warping CP Componente Principal ∆∆∆∆%B/min Variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente) Gen no. inv Genótipo coletado no inverno Gen no. vc Genótipo coletado no verão com irrigação Gen no. vs Genótipo coletado no verão sem irrigação IAA Índice de Atividade Antioxidante IP Percentual antioxidante MeOH Metanol RMN Ressonância Magnética Nuclear tR Tempo de retenção UV Ultravioleta V inj Volume de injeção

Capítulo 1

INTRODUÇÃO

- 2 -

1 INTRODUÇÃO

1.1 Importância das plantas medicinais

O uso de plantas medicinais com o intuito de tratar doenças desempenha um

importante papel na saúde mundial. Apesar dos grandes avanços observados na

Medicina nas últimas décadas, elas continuam sendo bastante utilizadas. Estima-se

que cerca de 25 a 30% de todos os fármacos avaliados como agentes terapêuticos são

derivados de produtos naturais (SOUSA et al., 2008).

A procura pelo alívio e cura de doenças através da ingestão de preparados de

ervas talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização das plantas

medicinais. No Brasil o uso de plantas medicinais foi disseminado principalmente

pela cultura indígena. A crescente busca da população por estas plantas incentivou os

pesquisadores e a indústria farmacêutica a investirem mais nas pesquisas de novos

fármacos (YUNES & CALIXTO, 2001; VIEGAS et al., 2006; SOUSA et al., 2008).

As observações populares sobre o uso de plantas medicinais e a sua eficácia

contribuem de forma relevante para a divulgação das “virtudes terapêuticas” dos

vegetais, considerando os efeitos benéficos à saúde. Muitas vezes, o conhecimento

sobre plantas medicinais simboliza o único recurso terapêutico de muitas

comunidades e grupos étnicos (MACIEL et al., 2002).

As pesquisas químicas e farmacêuticas ao longo das últimas décadas

possibilitaram o alívio para males que ainda assolam a humanidade, tais como:

tuberculose, sífilis, câncer e hanseníase, bem como para as endemias do mundo

moderno, como depressão, cardiopatias e síndrome da imunodeficiência adquirida

(SIDA) (MELO et al., 2007; MENDES et al., 2010).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), 65 a 80% da população

mundial, especialmente em países em desenvolvimento, utilizam as terapias

alternativas como principal forma de tratamento e as plantas medicinais como os

principais medicamentos. Vale ressaltar que no Brasil o uso de plantas medicinais é

promovido pelo difícil acesso da população à assistência médica e farmacêutica, e

pelo custo dos medicamentos industrializados (SILVEIRA et al., 2008).

- 3 -

Se a população dos países em desenvolvimento utiliza as plantas medicinais

por tradição e ausência de alternativas econômicas viáveis, nos países mais

desenvolvidos observa-se um maior uso de fitomedicamentos influenciado pelos

modismos no consumo de produtos naturais (VEIGA, 2008).

Um dos fatores mais preocupantes do consumo de fitomedicamentos é a

automedicação, a qual está associada à falta de informações adequadas sobre as

propriedades das plantas medicinais (principalmente das exóticas), ao seu consumo

concomitante com medicamentos tradicionais (alopáticos) e à perda do conhecimento

sobre os possíveis efeitos medicinais e tóxicos das plantas (VEIGA, 2008).

No Brasil, o principal órgão responsável pela regulamentação de plantas

medicinais e seus derivados é a Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA), autarquia do Ministério da Saúde, cuja função é proteger e promover a

saúde da população garantindo a segurança sanitária de produtos e serviços

(CARVALHO et al., 2008).

Fitoterápico, de acordo com a legislação sanitária brasileira, “é o

medicamento obtido exclusivamente de matérias-primas vegetais, o qual é

caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela

reprodutibilidade e constância de sua qualidade”. O setor de fitoterápicos movimenta

globalmente US$ 21,7 bilhões por ano. No Brasil, não existem dados oficiais

atualizados, porém, estima-se que esse mercado gire em torno de US$ 160 milhões

por ano (CARVALHO et al., 2008).

Segundo Barbosa et al. (2006a) a qualidade dos fitoterápicos depende de uma

série de fatores, que tem início na identificação correta da espécie e continua no

plantio, na colheita e no beneficiamento. Diversos fatores influenciam a qualidade

final do produto, tais como: variações climáticas, solo, época de colheita,

características genéticas da planta, condições de secagem e tempo de

armazenamento. Recomenda-se que as plantas sejam comercializadas, consumidas

ou secadas imediatamente após a colheita, de forma a minimizar as perdas das

substâncias ativas. Além disso, altos teores de água nas partes vegetais permitem a

ação enzimática, favorecendo o desenvolvimento de microorganismos, podendo

comprometer as qualidades terapêuticas.

- 4 -

A expansão da fitoterapia pode ser atribuída a diversos fatores, tais como:

efeitos adversos dos fármacos sintéticos, preferência dos consumidores por

tratamentos “naturais”, validação científica das propriedades farmacológicas de

espécies vegetais, desenvolvimento de métodos analíticos colocados à disposição do

controle de qualidade, e um melhor conhecimento químico, farmacológico e clínico

dos fármacos vegetais e seus derivados (MELO et al., 2007).

Os chás têm atraído muita atenção nos últimos anos devido a sua capacidade

antioxidante e seu crescimento na dieta de milhares de pessoas em todo o mundo. Os

chás ingeridos na forma de infusão contribuem para a extração dos compostos

fenólicos, considerados benéficos à saúde. Vários estudos relatam a presença de

antioxidantes em chás, mas a metodologia utiliza extratos obtidos por solventes

orgânicos das folhas secas. Assim como os chás, várias espécies de condimentos têm

despertado o interesse quanto à avaliação do potencial antioxidante devido ao seu

uso comum na culinária brasileira (MORAIS et al., 2009).

O chá obtido por infusão é a forma mais popular de uso, seguido do chá

obtido pela decocção. No entanto, com a utilização crescente do forno de microondas

para preparar chá, uma investigação sobre os extratos obtidos com essa técnica é

necessário (LACERDA et al., 2000).

O chá verde, preparado por infusão de folhas secas de Camellia sinensis, é

um produto bastante apreciado devido ao seu aroma atraente e sabor característico,

bem como pelos seus efeitos benéficos à saúde, o que gera um aumento do interesse

em seu real potencial (LACERDA et al., 2000; KOMES et al., 2010). Os polifenóis

presentes no chá verde previnem a coagulação sanguínea e os níveis de colesterol,

reduzindo, assim, o risco de desenvolver doenças cardiovasculares (VINSON et al.,

1995 apud SHIKANGA et al., 2010).

Nos chás preto e mate, são encontrados as metilxantinas (cafeína e

teobromina), substâncias que agem sobre o sistema nervoso central, produzindo

vários fenômenos psíquicos, como o aumento da capacidade de percepção. O chá

preto apresenta ainda propriedades bactericidas, principalmente contra bactérias do

trato bucal (LACERDA et al., 2000).

Com relação ao gênero Lippia, infusões de Lippia javanica (Burm f.) Spreng.

e Lippia scaberrima Sond. são usadas na África do Sul para fins medicinais e ambas

- 5 -

são comercializadas como chás naturais sem cafeína. Já as infusões de Lippia

rehmannii H. Pearson não são geralmente usadas, possivelmente devido à presença

dos compostos hepatotóxicos icterogenina e ácidos rehmannicos. Apesar de haver o

registro do uso de infusões de algumas espécies de Lippia para fins medicinais,

trabalhos científicos sobre as atividades de seus extratos polares são escassos

(MUCHUWETI et al., 2006; MUJOVO et al., 2008; SHIKANGA et al., 2010).

1.2 Perfil cromatográfico

Considerando o crescente uso de ervas medicinais pela população mundial,

torna-se necessário o desenvolvimento de métodos analíticos que garantam também a

autenticidade da matéria-prima vegetal (MARTINS et al., 2007).

A análise do perfil cromatográfico (ou fingerprint cromatográfico) representa

uma possibilidade para avaliação da qualidade das ervas medicinais, na qual são

utilizadas técnicas de separação, como eletroforese capilar (EC), cromatografia

gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), entre outras, para a

obtenção de padrões específicos que permitam o reconhecimento dos vários

componentes químicos presentes na amostra vegetal. Todo perfil cromatográfico

pode ser usado para determinar não só a ausência ou presença de marcadores

desejados, mas o conjunto completo de relações de todos os analitos detectáveis.

Além disso, com a ajuda de técnicas combinadas, tais como: CG-EM, CLAE-DAD,

CLAE-EM-EM e CLAE-RMN, auxiliadas por métodos de resolução em

quimiometria e técnicas de elucidação estrutural, é possível uma análise qualitativa e

quantitativa dos principais compostos detectados no fingerprint cromatográfico,

permitindo avaliar a autenticidade das plantas utilizadas com finalidade medicinal

(LIANG et al., 2010).

As técnicas de separação reduzem a complexidade da amostra,

“amplificando” a informação no domínio do tempo, por isso se tornam

particulamente valiosas para análises de fingerprint. No entanto, em amostras

biológicas é comum encontrar compostos polares, juntamente com apolares,

ionizáveis e não ionizáveis. Assim sendo, torna-se trabalhoso o desenvolvimento de

- 6 -

um método de análise que permita a detecção de todos esses compostos em uma

única corrida cromatográfica (CHEN et al., 2010).

Considerada uma das mais adequadas abordagens para a avaliação da

qualidade das ervas medicinais, a técnica de fingerprint cromatográfico fornece o

perfil de uma amostra extraída. Assim, métodos para análise dessas “impressões

digitais” químicas (fingerprint) têm sido desenvolvidos para avaliar a qualidade das

ervas comercializadas. A cromatografia líquida tem sido aceita pela OMS para a

avaliação da qualidade de medicamentos fitoterápicos (ZHOU et al., 2008; HOAI et

al., 2009).

Uma outra aplicação da análise de um perfil cromatográfico diz respeito ao

estabelecimento de parâmetros químicos que possibilitem avaliar, entre outras coisas,

a diferenciação entre espécies botanicamente semelhantes, os efeitos da

sazonalidade, a diferenciação de amostras por espécie ou origem geográfica e a

influência de diferentes condições de cultivo (MARTINS et al., 2011).

Sabendo que o conteúdo de metabólitos secundários em uma planta é afetado

pela sua relação com o meio ambiente, tais como: sazonalidade, temperatura,

disponibilidade hídrica, exposição à radiação ultravioleta, altitude, composição

atmosférica, solo, entre outras; e que esta variação pode afetar seus efeitos

terapêuticos, torna-se necessário, para uma caracterização completa da planta

estudada, uma análise total dos seus constituintes químicos (HAN et al., 2006;

GOBBO-NETO e LOPES, 2007; WANG et al., 2009; CHEN et al., 2009; ZHOU et

al., 2009; GARZA-JUÁREZ et al., 2011; LIU et al., 2011).

1.3 Quimiometria

A quimiometria pode ser definida como a utilização de métodos matemáticos

e estatísticos para o tratamento de dados químicos, de forma a extrair uma maior

quantidade de informações e melhores resultados analíticos. Ela iniciou formalmente

no Brasil na primeira metade da década de 70, mas só se firmou definitivamente

quando o computador se tornou mais acessível em laboratórios de química. Assim, a

quimiometria foi dividida em diversas frentes de pesquisa e aplicação: planejamento

- 7 -

e otimização de experimentos; reconhecimento de padrões e classificação de dados;

calibração multivariada e métodos de inteligência artificial (NETO et al., 2006;

VALDERRAMA, 2008).

O reconhecimento de padrões, que é uma das principais vertentes do uso da

estatística multivariada em química analítica, viabiliza a obtenção de mais

informações quando comparado com os procedimentos univariados que são

usualmente adotados. Os métodos de reconhecimento de padrões (RP) podem ser

aplicados com diferentes finalidades, entre elas a análise exploratória de dados, a

classificação de amostras e a resolução de curvas (CORREIA et al., 2007; NETO et

al., 2006).

Os métodos de análise exploratória mais usados são a Análise de

Componentes Principais (ACP) e a Análise de Agrupamentos Hierárquicos (AAH),

que permitem a visualização gráfica do conjunto de dados, mesmo quando o número

de amostras e variáveis é elevado. O uso desses algoritmos tem como principal

objetivo aumentar a compreensão do conjunto de dados, examinando a presença ou a

ausência de agrupamentos naturais entre as amostras. Ambos são classificados como

exploratórios ou não supervisionados, visto que nenhuma informação com relação à

identidade das amostras é levada em consideração (CORREIA et al., 2007; MATOS

et al. 2003).

A Análise de Componentes Principais (ACP) consiste numa transformação da

matriz de dados com o objetivo de representar as variações presentes em muitas

variáveis, através de um número menor de “fatores”. Constrói-se um novo sistema de

eixos (denominados rotineiramente de fatores, componentes principais, variáveis

latentes ou ainda autovetores) para representar as amostras, no qual a natureza

multivariada dos dados pode ser visualizada em poucas dimensões. Estas novas

variáveis são obtidas em ordem decrescente de quantidade de informação estatística

que descrevem, ou seja, a primeira componente principal aponta a direção de maior

variação dos dados, a segunda, que é ortogonal à primeira, aponta outra direção que

descreve a maior variação restante dos dados e assim por diante. Usando a notação

matricial, as componentes principais são obtidas por meio de transformações lineares

conforme a equação:

- 8 -

X P = T

em que X é a matriz original dos dados, T é a matriz de scores (Figura 1) que

contém as coordenadas das amostras no novo sistema de eixos e P é a matriz dos

loadings, onde os elementos de cada coluna correspondem aos coeficientes das

combinações lineares das variáveis originais (MORGANO et al., 1999).

A utilização da ACP visa reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados

original, preservando a maior quantidade de informação (variância) possível. Essa

redução é obtida por meio do estabelecimento de novas variáveis ortogonais entre si,

denominadas componentes principais (CPs). Desta forma, as principais vantagens da

ACP estão na simplificação, modelamento, detecção de amostras anômalas,

classificação e previsão.

Figura 1. Exemplo hipotético de gráfico de scores, com projeção de amostras em um espaço tridimensional PC1 x PC2 x PC3. Fonte: VALDERRAMA, 2008

Tanto a ACP quanto a AAH permitem a interpretação multivariada de

conjuntos de dados grandes e complexos por meio de gráficos bi ou tridimensionais.

Estes gráficos apresentam informações que expressam as inter-relações que podem

existir entre as variáveis, facilitando a interpretação multivariada do comportamento

das amostras (MORGANO et al., 1999; MATOS et al. 2003; CORREIA et al.,

2007).

Diversos trabalhos na literatura mencionam o uso de análises quimiométricas,

especialmente ACP e AAH, com o objetivo de extrair informações dos

- 9 -

cromatogramas fingerprint de amostras vegetais. Estes estudos descrevem, por

exemplo, a discriminação de ervas medicinais para avaliação de sua qualidade e

investigação da variação nos componentes químicos entre espécies vegetais coletadas

em diferentes localizações, usando ou não marcadores químicos nesta avaliação

(YANG et al., 2007; ZHOU et al., 2009; CHEN et al., 2009; WANG et al., 2009;

LIANG et al., 2010; ZHAO et al., 2011; LIU et al., 2011).

Chen et al. (2008) utilizaram cromatogramas fingerprint de extratos

metanólicos de Ganoderma lucidum, obtidos por CLAE-DAD, que combinados às

análises quimiométricas permitiram classificar e agrupar os cogumelos de acordo

com sua província de origem.

No trabalho desenvolvido por Peng et al. (2011), análises quimiométricas,

incluindo AS (Análise por similaridade), AAH e ACP, mostraram-se apropriadas

para a classificação de cromatogramas fingerprint na diferenciação da espécie

Artemisia selengensis Turcz coletadas em cinco diferentes províncias da China.

1.4 Atividade antioxidante

Compostos oxidantes são produzidos pelo metabolismo normal do corpo e, se

não controlados, podem provocar danos extensivos. O estresse oxidativo corresponde

a um desequilíbrio entre a taxa de produção de agentes oxidantes e sua degradação.

O estresse oxidativo tem sido associado ao desenvolvimento de muitas doenças

crônicas e degenerativas, incluindo câncer, doenças cardíacas, Alzheimer, bem como

está envolvido no processo de envelhecimento. Esse estresse ocorre quando a

produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) está acelerada ou quando os

mecanismos envolvidos na neutralização de ERO’s encontram-se deteriorados.

Predisposição genética, fatores ambientais como radiação UV e propriedades

intrínsecas específicas de grupos celulares podem exacerbar o dano oxidativo ou

diminuir a capacidade das células de degradar estes agentes agressores (ROESLER et

al., 2007; VICENTINO et al., 2007).

As ERO são produzidas nas mitocôndrias, como subprodutos do metabolismo

normal durante a produção de energia. Elas exercem ações na tradução, na

- 10 -

transcrição gênica e na regulação da atividade da guanilato ciclase nas células

(VICENTINO et al., 2007).

As espécies reativas de oxigênio, tais como: radical hidroxila (•OH), ânion

radical superóxido (O2•–) e hidroperoxila (ROO•) causam danos ao DNA ou podem

oxidar lipídios e proteínas. Além disso, atacam as cadeias de ácidos graxos

poliinsaturados dos fosfolipídios e do colesterol, abstraindo um hidrogênio do grupo

metileno bis-alílico, iniciando um processo de peroxidação lipídica nas membranas

celulares (ANDRADE et al., 2007; SOUSA et al., 2007).

A peroxidação lipídica é a principal conseqüência do estresse oxidativo,

resultando na danificação das membranas causada pela oxidação, acarretando em

aumento da fluidez da membrana, comprometimento da sua integridade e inativação

da interação entre membrana/receptor e membrana/enzima (VICENTINO et al.,

2007).

Os radicais de carbono formados podem reagir com oxigênio originando

radicais peroxila, que por sua vez podem atacar novas cadeias de ácidos graxos

poliinsaturados, propagando a reação. O resultado deste processo é a oxidação de

várias moléculas de ácidos graxos. Os hidroperóxidos formados na peroxidação

lipídica têm vida curta e, quando reagem com metais, formam aldeídos (isto é,

malonaldeído, acroleína, crotonaldeído) e epóxidos, os quais são reativos e causam

danos ao DNA (SOUSA et al., 2007).

A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos

compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena (por ex. superóxido

dismutase), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Quando há

limitação na disponibilidade de antioxidantes, podem ocorrer lesões oxidativas de

caráter cumulativo. Os antioxidantes são capazes de estabilizar ou desativar os

radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células (SOUSA et al.,

2007).

Antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação, através

de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e complexação de

metais. Eles podem ser sintéticos ou naturais e, para serem utilizados em alimentos,

devem ser seguros para a saúde. Alguns dos antioxidantes sintéticos mais

importantes são hidroxianisol de butila (BHA) e o hidroxitolueno de butila (BHT) e

- 11 -

entre os naturais destacam-se ácido ascórbico, vitamina E e β-caroteno (DUARTE-

ALMEIDA et al., 2006; ANDRADE et al., 2007).

Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural,

os compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos, sobretudo por

inibirem a peroxidação lipídica e a lipooxigenase in vitro. A atividade antioxidante

de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e

estrutura química (SOUSA et al., 2007).

No grande grupo dos compostos fenólicos, os flavonóides e os ácidos

fenólicos, são os que mais se destacam e são considerados os antioxidantes fenólicos

mais comuns de fontes naturais. Estas substâncias apresentam-se amplamente dis-

tribuídas no reino vegetal sendo, desta maneira, encontradas em todas as frutas e

outros vegetais (BROINIZI et al., 2007).

Diversas técnicas têm sido utilizadas para determinar a atividade antioxidante

in vitro, de forma a permitir uma rápida seleção de substâncias ou misturas

potencialmente interessantes na prevenção de doenças crônico-degenerativas. Dentre

estes métodos destacam-se o sistema de co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico e

o método de sequestro de radicais livres, DPPH• -2,2-difenil-1-picril hidrazil.

NO2

NO2O2N

N*N

DPPH

O método de oxidação do β-caroteno/ácido linoléico avalia a atividade de

inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico. O

método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração

(oxidação) do β-caroteno, induzida pelos produtos de degradação oxidativa do ácido

linoléico (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).

Por sua vez, o método de radicais livres está baseado no descoramento de

uma solução composta por radicais estáveis DPPH•, de cor violeta, quando da adição

de substâncias que podem ceder um átomo de hidrogênio. O radical estável DPPH

tem sido amplamente utilizado para avaliar a capacidade de antioxidantes naturais

- 12 -

em sequestrar radicais livres. Entretanto, o primeiro método determina a atividade de

uma amostra ou composto de proteger um substrato lipídico da oxidação, enquanto

que o método de inibição de radicais DPPH• baseia-se na transferência de elétrons de

um composto antioxidante para um oxidante. Estas metodologias utilizam

quantidades significativas de reagentes, padrões e amostras, e apresentam limitações

em relação ao número de análises simultâneas que podem ser realizadas (DUARTE-

ALMEIDA et al., 2006; ROESLER et al., 2007).

Assim, neste estudo foi desenvolvido um método por CLAE-DAD para

obtenção de cromatogramas fingerprint, associado à análise quimiométrica para

investigar e demonstrar a variação dos componentes químicos entre os extratos

aquosos liofilizados das folhas de sete genótipos de L. gracilis provenientes de

diferentes locais (Sergipe e Bahia), estações do ano (verão e inverno) e diferentes

formas de cultivo (verão com e sem irrigação) e avaliar a atividade antioxidante dos

amostras dos extratos aquosos liofilizados.

Capítulo 2

REVISÃO DA LITERATURA

- 14 -

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Família Verbenaceae

A família Verbenaceae J. St.-Hil ocorre em praticamente todos os

ecossistemas terrestres, compreendendo cerca de 100 gêneros e 2600 espécies

distribuídas em regiões tropicais e subtropicais principalmente nas zonas temperadas

do hemisfério sul (CAVALCANTI et al., 2010).

2.2 Gênero Lippia

O gênero Lippia inclui cerca de 200 espécies de ervas, arbustos e árvores

pequenas. Espécies deste gênero estão distribuídas por todos os países da América do

Sul e Central e pela África tropical e são comumente empregadas no tratamento de

doenças respiratórias, segundo alguns autores, devido ao fato de serem ricas em óleo

essencial (PASCUAL et al., 2001; MENDES et al., 2010).

Algumas espécies de Lippia demonstraram atividade antiviral, antimalárica e

citostática. Além disso, as folhas da maioria destas espécies são utilizadas como

tempero para as preparações alimentícias. Vale ressaltar a importância da espécie

Lippia dulcis Trev., no qual seu principal componente é mais de 1000 vezes mais

doce que a sacarose (PASCUAL et al., 2001).

A Lippia citriodora H.B.K. é explorada comercialmente na Europa para

produção de óleo essencial, conhecido como óleo de verbena, amplamente utilizado

em perfumaria. Além desta espécie, Lippia alba (Mill.) N.E. Br. também já foi

avaliada quanto ao seu potencial aromático, apresentando resultados interessantes em

termos do composto linalol, presente em elevadas concentrações no óleo essencial

(50,0-79,2%). O óleo essencial de L. alba também demonstrou potencial antioxidante

semelhante ao efeito da vitamina E (ROSSATO et al., 2006).

O gênero Lippia parece apresentar um perfil constante de composição

química, atividades farmacológicas e usos populares. No Brasil, o gênero está

- 15 -

representado por cerca de 120 espécies, com sua fragrância, em geral, forte e

agradável. Algumas espécies do gênero Lippia são caracterizadas pela presença de

óleos essenciais com atividade antimicrobiana com altos efeitos sobre vários

microorganismos devido à presença de monoterpenos fenólicos, timol e carvacrol.

Os componentes que foram encontrados com maior freqüência em óleos essenciais

de Lippia são: limoneno (1), β-cariofileno (2), γ- terpineno (3), p-cimeno (4), linalol

(5), timol (6), α-pineno (7) e cânfora (8) (MENDES et al., 2010; NETO et al., 2010).

H

H

(1) (2) (3) (4)

H3C CH3

OHH3C

OH

O

(5) (6) (7) (8)

Segundo Olivier et al. (2010) alguns iridóides glicosilados foram isolados a

partir do extrato metanólico de L. javanica e, consequentemente, foram consideradas

como marcadores quimiotaxonômicos para o gênero Lippia.

No trabalho desenvolvido por Shikanga et al. (2010) foi observada alta

atividade antioxidante dos chás de L. javanica e L. wilmsii, a qual foi atribuída ao

elevado nível de verbascosídeo (9) presente principalmente quando comparada a

baixa atividade antioxidante observada em L. scaberrima e L. rehmannii, que

apresentam menor quantidade deste metabólito.

- 16 -

HO

HOO

O

O

OOH

OH

O OH

OHCH3

HOHO

OH

(9)

A maioria dos estudos químicos de L. alba estão relacionados com a

composição do óleo essencial e pelo menos três quimiotipos têm sido propostos com

base na composição química volátil de suas folhas. Na parte aérea, foi encontrada a

presença de flavonóides, iridóides e feniletanóides glicosilados (FARIAS et al.,

2010).

Farias et al. (2010) isolaram duas novas saponinas, a lippiasaponina I (10) e

lippiasaponina II (11) das folhas de L. alba, conhecida popularmente como

“cidreira”. O chá das folhas de L. alba é amplamente utilizado como calmante na

medicina popular em todas as regiões do Brasil (TELES et al., 2012).

OH

HOH2C

O

O

OOHO

HOHO OH

OOH

O

HO

O

OHHO

OH3CO

OHHOO

O

OHHO

HOH3C

(10)

- 17 -

O

HO

O

OH

OH

HOH2C

O

O

OOHO

HOHO OH

O

OHHO

OH3CO

OHHOO

O

OHHO

HOH3C

(11)

As folhas e flores de L. sidoides Cham. constituem a parte medicinal desta

planta. Seu óleo essencial possui elevado valor comercial, tendo o timol (6) e o

carvacrol como constituintes principais, os quais apresentam propriedades

antisséptica, antimicrobiana, antifúngica, antioxidante, antiinflamatória e larvicida. O

chá desta espécie é também usado no tratamento de doenças da pele (ALMEIDA et

al., 2010).

Almeida et al. (2010) apresentam em seu trabalho o resultado obtido do

estudo fitoquímico do extrato etanólico dos talos, das raízes e das folhas da espécie

L. sidoides, descrevendo o isolamento e a identificação da naftoquinona

tecomaquinona (12), 4’,5,7-tri-hidroxiflavanona (13, naringenina), 3’,4’,5,7-tetra-

hidroxiflavanona (14) e 4’,5,7-tri-hidroxi-6-metoxiflavona (15), e da mistura de di-

hidrochalconas 2’-O-b-D-glicopiranosil-3,4,4’,6’-tetra-hidroxi-di-hidrochalcona (16)

e 2’-O-b-D-glicopiranosil-4,4’,6’-tri-hidroxi-di-hidrochalcona (17), além do β-

sitosterol e do carvacrol.

- 18 -

O

O

O

O

R2

OH

O

OOH

R1

HO

(14)2,3-di-hidro,R1= H,R2=OH

(13) 2,3-di-hidro, R1= R2= H

(15) 2,3, R1= OMe, R2= H A

(12)

OR1O

R1O

R1O

OR1

OR1

OO

R1O

R

OR1

(16) R=OH, R1=H

(17) R= R1= H

Hegde et al. (2004) isolaram e identificaram três novos compostos, 18, 19 e

20 do extrato metanólico aquoso de L. alva. Estes compostos mostraram ser

inibidores do receptor de quimiocinas CCR5, um dos principais co-receptores do

vírus tipo 1 da imunodeficiência humana (HIV-1), sendo importante na transmissão

viral.

OO

OH

H CH3

O

O

OH

H

H

OR

(18) R= CH3

(19) R= H

OCH3

CH3

O

O

OH

H HOO

OH

H

(20)

Das folhas de L. graveolens H.B.K., conhecida popularmente como orégano,

foram isolados e identificados do extrato metanólico 7 iridóides, o ácido

carioptosídico (21), lipiosídeo I (22), lipiosídeo II (23), loganina (24), ácido

loganínico (25), ácido 8-epi-loganínico (26) e carioptosídeo (27); e 3 secoiridóides

- 19 -

glicosilados, a secologanina (28), secoxiloganina (29) e dimetilsecologanosídeo (30)

(RASTRELLI et al., 1998).

O

COOH

O

HO

HOO

HOOH

OH

OR

(21)

(22)

R=H

R=

(23) R=

C

O

CH CH OH

OH

OH

CHCH

O

C

O

COOCH3

HO

O Glicose

O

COOH

HO

O Glicose

O

COOH

HO

O Glicose

O

COOCH3

HO

O GlicoseHO

(24) (25) (26) (27)

O

COOCH3

O Glicose

CHO

O

COOCH3

O Glicose

COOH

O

COOCH3

O Glicose

COOCH3

(28) (29) (30)

Costa et al. (2002) relataram o isolamento de vários constituintes químicos do

extrato etanólico das cascas e talos de L. sidoides, sendo eles: o acetato do ácido

oleanólico (31), metil-3,4-diidroxibenzoato (32), lapachenol (33), tecomaquinona

(12), tectoquinona (34), tectol (35), tectol acetilato (36), quercetina (37), luteolina

(38), glucoluteolina (39), lippisidoquinona (40), taxifolina (41) e isolariciresinol (42).

- 20 -

OCH3

O

HO

HO

OCH3

O

(31) (32) (33)

O

O

CH3

O

OH

OH

O

O

OAc

OAc

O

(34) (35) (36)

O

OH

OH

OH

OH

HO

O

O

OH

OH

OH

HO

O

O

OH

OH

OH

C6H12O6O

O

(37) (38) (39)

O

OH

HO

OO

H

O

OH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

HO

CH3O

OCH3

OH

(40) (41) (42)

Ono et al. (2005) isolaram do extrato metanólico das partes aéreas L. dulcis

Trev. dois novos sesquiterpenos, a lippidulcina A (43) e epilippidulcina A (44);

- 21 -

juntamente com cinco flavonóides, a cirsimaritina (45), salvigenina (46), eupatorina

(47), 5-hidroxi-6,7,3’,4’-metoxi flavona (48) e 5,3’-hidroxi-6,7,4’,5’-metoxi flavona

(49); três feniletanóides glicosilados, o decaffeoylverbascosídeo (50), acteosídeo (9)

e isoacteosídeo (51); e dois iridóides glicosilados, a 8-epiloganina (52) e lamiídeo

(53).

O OHOH

H

βO OH

OH

H

α

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

(43) (44) (45)

O

OOH

H3CO

H3CO

OCH3

O

OOH

H3CO

H3CO

OCH3

OH

(46) (47)

O

OOH

H3CO

H3CO

OCH3

OCH3

O

OOH

H3CO

H3CO

OCH3

OCH3

OH

(48) (49)

O

OHOHHO

CH3

O

OH

OH

HO

OOH

OH

O

O

OHOHHO

CH3

OH

OH

OO

O

OH

HO

O

O

HO

HO

(50) (51)

- 22 -

HO

O

HO

HO

OH

O

COOCH3H

HO

HO

H

HO

O

HO

HO

OH

O

COOCH3OH

HO

HO

HO

(52) (53)

A flavona salvigenina (46) também já havia sido isolada por Kanko et al.

(2004) do extrato etanólico das folhas secas de L. multiflora Moldenke. Os

feniletanóides glicosilados acteosídeo (9) e isoacteosídeo (51) também já haviam

sido isolados por Abe et al. (2002) do extrato metanólico das partes aéreas de L.

dulcis e L. canescens Kunth., enquanto que o decaffeoylverbascosídeo (50) também

foi isolado das folhas frescas de L. alba por Barbosa et al. (2006).

Do óleo essencial das folhas frescas de L. alba, além do

decaffeoylverbascosídeo (50), foram isolados também o isonuomiosídeo (54) e a

shanzhida (55) (BARBOSA et al., 2006).

H

OH

H

OH

OH

O

HO

HO O

H

OHO

O

H

OH

O

OH

OH

O

H

OHO

OHOH

H

HO

O

HO H

HO

CO2CH3

O

(54) (55)

Do extrato etanólico das folhas secas de L. multiflora, Kanko et al. (2004)

isolaram a salvigenina (46), o ácido ursólico (56) e o n-tritriacontano (57).

H3C CH3

HO

CH3 CH3 COOH

H3C

CH3

(56) (57)

CH3 - (CH2)31 - CH3

- 23 -

Do caule de L. graveolens foi isolado uma nova flavanona, a (-)(2S)

5,6,7,3’,5’-pentahidroxiflavanona-7-O-β-D-glicopiranosídeo (58), apresentando

atividades antiinflamatória e citotóxica relativamente baixas (GUËRECA et al.,

2010).

O

HO

O

OH O

OH

OH

O

HO OH

OH

HO

(58)

Em seu trabalho, Olivier et al. (2010) citaram o isolamento a partir do extrato

metanólico das partes aéreas de L. javanica dos iridóides glicosilados, verbascosídeo

(9) e isoverbascosídeo (51).

Do extrato metanólico das partes aéreas de L. dulcis e L. canescens, Abe et

al. (2002) isolaram três flavonóides: 6-hidroxiluteolina (59), eupafolina (60) e

desmetoxicentaureidina (61); três sesquiterpenos do tipo bisabolano, (+)-

hernandulcina (62), (-)-epihernandulcina (63) e (1)-anymol (64); quatro

feniletanóides glicosilados, acteosídeo (9), isoacteosídeo (51), martynosídeo (65) e

diacetylmartynosídeo (66). Os flavonóides eupafolina (60) e a

desmetoxicentaureidina (61) mostraram forte atividade inibitória contra o

crescimento de células de carcinoma de útero humano.

O

OH

OH

OH

HO

O

HO

O

OH

OH

OH

HO

O

CH3O

O

OH

OCH3

OH

HO

O

CH3O

(59) (60) (61)

- 24 -

RO OH

HO

CH3O

O

O

O

OH

OHO

O

OCH3

OH

O

OHOH

CH3

HO

(62) R= β-H (65) (63) R= α-H (64) R= β-H, 1- deoxo

HO

CH3O

O

O

O

OH

OHO

O

OCH3

OH

O

OCOCH3CH3OCO

CH3

HO

(66)

Maldonado et al. (2010) isolaram das partes aéreas de L. mexicana Grieve

três novos triterpenos: lippiolídeo (67), ácido lippiolidólico (68) e ácido lippiólico

(69).

O O

H

O

HOH

H

H

HO

O O

O

H

H

H

H

HO

O

H

H

H

H

OHβ

(67) (68) (69)

Rimpler et al. (1986) isolaram do extrato etanólico das folhas e raízes de L.

javanica e L. turbinata Griseb. iridóides glicosilados: thevesídeo de sódio (70) e

theviridosídeo (71).

- 25 -

OHO

OH

CH2OHOH

O

COONa

HOH2C

OH

HO

OHO

OH

CH2OHOH

O

COOCH3

HOH2C

OH

HO

(70) (71)

2.3 Espécie Lippia gracilis Schauer

Lippia gracilis Schauer é uma planta típica do nordeste brasileiro, encontrada

nos estados da Bahia, Sergipe e Piauí. No sertão nordestino, encontra-se a uma

altitude de 450 m, sendo popularmente conhecida como cidreira da serra. No

Agreste, encontra-se a uma altitude de 960 m, sendo conhecida popularmente como

alecrim-da-chapada ou alecrim-de-tabuleiro (MENDES et al., 2010; NEVES et al.,

2008)

A estrutura vegetativa podeser descrita como um arbusto ramificado com

folhas aromáticas e altura variando de 1,2 a 3,0 m (Figura 2). A planta possui grande

resistência à seca e altas temperaturas somente perdendo as folhas após um longo

período de estiagem (OLIVEIRA et al., 2008).

Figura 2. Foto da espécie L. gracilis Foto: Silvana V. F. Gomes

As folhas de L. gracilis são utilizadas para infecções de garganta, doenças

cutâneas, úlceras, afecções na vagina, acne, caspa, queimaduras, feridas, sinusite,

- 26 -

bronquite, congestão nasal, dor de cabeça, icterícia e paralisia pelas comunidades

tradicionais da Caatinga, região semi-árida do nordeste brasileiro. Há registros

também de seu uso externo para tratar doenças da pele, queimaduras, feridas e

úlceras. O óleo essencial da espécie apresenta atividade antimicrobiana e contém

como componentes principais os seguintes compostos: carvacrol, o-cimeno, γ-

terpineno (3) e β-cariofileno (2) (GOMES et al., 2010; MENDES et al., 2010;

MENDES et al., 2010; GUILHON et al., 2011).

NETO et al. (2010) demostraram em estudo in vitro, que a solução a 5% (v/v)

do óleo essencial das folhas de L. gracilis apresentou atividade antibacteriana para

Staphylococcus aureus isolado de úlcera infectada de paciente diabético.

GUILHON et al. (2011) avaliaram a possível participação dos opióides,

colinérgicos, e sistemas de óxido nítrico no efeito antinociceptivo do óleo essencial

de Lippia gracilis, e mostraram como resultado que o mesmo produz um efeito

antinociceptivo que poderia ser potencialmente mediado por receptores colinérgicos

via óxido nítrico. Os dados também sugerem que a atividade anti-inflamatória

causada pela exposição do óleo essencial ocorre através da inibição do óxido nítrico

e da produção de PGE2.

2.3.1 Classificação taxonômica

A espécie L. gracilis apresenta a seguinte classificação taxonômica mostrada

na Tabela 1.

- 27 -

Tabela 1. Classificação taxonômica da espécie L. gracilis

CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA REFERÊNCIA

CLASSE Equisetopsida a

SUBCLASSE Magnoliidae a

SUPERORDEM Asteranae a

ORDEM Lamiales a, b

FAMÍLIA Verbenaceae a, c

SUBFAMÍLIA Euverbeneae d

GÊNERO Lippia a, c

ESPÉCIE gracilis a, c

Fonte: a www.tropicos.org, bBARBOSA et al., (2006), cMENDES et al., (2010), d http://florabrasiliensis.cria.org.br/search?taxon_id= 16380.

Capítulo 3

OBJETIVOS

- 29 -

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

� Investigar diferenças químicas em amostras de genótipos de Lippia gracilis a

partir de perfil cromatográfico por CLAE-DAD associados à análise

quimiométrica e avaliar a atividade antioxidante da espécie.

3.2. Específicos

� Estabelecer o perfil cromatográfico por CLAE-DAD dos chás das folhas de sete

genótipos de Lippia gracilis Schauer provenientes de diferentes locais (Sergipe e

Bahia), estações (verão e inverno) e formas de cultivo (verão com e sem

irrigação);

� Submeter os cromatogramas fingerprint às análises quimiométricas;

� Submeter os extratos aquosos lifilizados a ensaios de atividade antioxidante;

� Verificar a relação entre a atividade antioxidante e as análises cromatográficas e

quimiométricas realizadas;

� Investigar a influência da irrigação e época de coleta sobre o perfil

cromatográfico e a atividade antioxidante;

Capítulo 4

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

- 31 -

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 Material botânico: coleta e armazenamento

Amostras de sete genótipos (106-110, 201 e 202) de L. gracilis foram

coletados nos municípios de Tomar do Geru (Estado de Sergipe) e Rio Real (Estado

da Bahia), sendo posteriormente cultivados no Campus Experimental da

Universidade Federal de Sergipe, sob a supervisão do Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank

do Laboratório de Culturas de Tecidos Vegetais e Melhoramento Vegetal do

Departamento de Engenharia Agronômica (DEA).

As folhas dos sete genótipos de L. gracilis foram coletadas no dia 21 de julho

de 2009 (Inverno) e no dia 26 de janeiro de 2010 (verão com e sem irrigação) no

Campus Experimental da Universidade Federal de Sergipe (UFS). A Tabela 2

mostra informações sobre estes genótipos, os quais tiveram suas exsicatas

depositadas no Herbário da UFS.

Tabela 2. Dados dos genótipos da espécie L. gracilis

Código Local de origem Dados geográficos No Voucher

Herbário UFS

LGRA-106 Tomar do Geru – SE 11° 19' 16,7'' S; 37° 55' 09,2'' W

14733

LGRA-107 Tomar do Geru – SE 11° 19' 20,1" S; 37° 55' 13,5" W

14737

LGRA-108 Tomar do Geru – SE 11° 19' 22,4" S; 37° 55' 12,6" W

14734

LGRA-109 Tomar do Geru – SE 11° 19' 20,7" S; 37° 55' 16,9" W

14735

LGRA-110 Tomar do Geru – SE 11° 19' 21,1" S; 37° 55' 14,9" W

14732

LGRA-201 Rio Real – BA 11° 23' 38,7" S; 38° 00' 54,1" W

14736

LGRA-202 Rio Real – BA 11° 23' 45,3" S; 38° 00' 51,3" W

14731

Após a coleta, a secagem das folhas foi feita por 5 dias em estufa de

circulação forçada a 40°C e acondicionadas em um frasco de vidro com tampa

rosqueável (Figura 3).

- 32 -

Figura 3. Folhas secas dos sete genótipos de L. gracilis dos três cultivos (inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação). Foto: Vilma M. J. Prado

4.2 Equipamentos, Materiais e Reagentes

� Estufa - modelo Marconi ML35 de circulação forçada.

� Balança analítica - modelo APX-200 da marca Denver Instrumet

Company.

� Microondas - modelo ME28S da marca Electrolux.

� Freezer - modelo FFE24 da marca Electrolux.

� Liofilizador - modelo L101 da marca Líotop.

� Membrana filtrante - marca MFS de nylon de 47 mm (diâmetro da

membrana) e 0,45 µm (diâmetro do poro).

� Solventes - acetonitrila (Tedia, Fairfield, OH, USA) e metanol (Tedia,

Fairfield, OH, USA) de pureza analítica e grau CLAE. Ácido fórmico

88% (v/v) (JT. Baker, Philipsburg, PA, EUA) de grau analítico. 2,2-

difenil-1-picril hidrazila (DPPH) Sigma de grau analítico. Metanol

(Impex, Labimpex, Brasil) grau analítico. Ácido gálico (Merck,

Brasil).

� Água deionizada - MILLI-Q (Millipore, São Paulo, SP, Brasil).

� Colunas Cromatográficas: coluna C18 LUNA® (5 µm, 25,0 x 0,46 cm,

Phenomenex) acoplada a uma coluna guarda e coluna hexil-fenil

LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex).

� Espectrofotômetro UV-VIS, bioespectro modelo SP-22.

- 33 -

4.3 Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência

Cromatógrafo a líquido da marca SHIMADZU (Quioto, Japão), modelo

Prominence, composto de duas bombas LC-6A, degaseificador DGU-20A3, auto

injetor SIL-10A, detector UV com arranjo de diodos SPD-M20Avp conectado a uma

interface CBM 20A. O equipamento foi gerenciado pelo software LC Solution.

Aparelho pertencente ao Departamento de Química da UFS.

4.4 Preparação dos Chás

O Chá de cada genótipo de L. gracilis (106-110, 201 e 202- dos três cultivos:

inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação) foi obtido pelo método de

infusão, adicionando-se a 200 mL de água destilada a uma temperatura de 94°C 2 g

das folhas. Em seguida, o chá foi deixado em repouso por 10 minutos, procedendo-

se, logo após, uma filtração e congelamento, para serem posteriormente liofilizados

por 24 hs (cada 100 mL de chá) sob as seguintes condições: temperatura -54°C e

pressão 79 µHg.

4.5 Condições cromatográficas de análise dos extratos aquosos liofilizados de L.

gracilis

Para as análises por cromatografia líquida de alta eficiência, 15 mg de cada

um dos extratos aquosos liofilizados foram dissolvidos em 1 mL da solução aquosa

de ácido fórmico 0,5% (v/v), obtendo uma solução com concentração de 15 mg/mL.

Foi utilizada uma coluna de fase estacionária C18 LUNA ® (5 µm, 25,0 x 0,46 cm,

Phenomenex) acoplada a uma coluna guarda de mesma fase e acompanhamento da

eluição por DAD em λ= 254 nm.

As amostras foram analisadas utilizando um sistema de eluição gradiente em

modo reverso, com fase móvel constituída por MeOH (B) e solução de ácido fórmico

0,5% (v/v) (A), com a seguinte inclinação: 5% a 28% (B) em 14 min, 28% a 35% (B)

- 34 -

em 28 min, 35% a 46% (B) em 33 min, 46% a 80% (B) em 20 min, 80% a 100% (B)

em 15 min e mantida isocrático em 100% (B) por 15 min. Ao término da corrida

cromatográfica foi feito um gradiente de volta de 100% a 5% em 35 min e o tempo

de espera para o recondicionamento da coluna foi de 75 min. A vazão da fase móvel

foi de 1 mL/min e em cada análise foram injetados 25 µL da solução, sendo que cada

uma das 21 amostras foi analisada em quadruplicata.

4.6 Análise quimiométrica

As análises quimiométricas foram realizadas pelo Prof. Dr. Edenir Rodrigues

Pereira Filho, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), empregando o

software PIROUETTE®, versão 4.0 (Informetrix). Antes, porém, foi necessário o

pré-tratamento (alinhamento dos picos) utilizando o algoritmo “Correlation

Optimised Warping” (COW) (SKOV, et al., 2006) e pré-processamento dos dados

originais que foram centrados na média.

4.7 Avaliação da atividade antioxidante

4.7.1 Avaliação quantitativa da atividade antioxidante

A avaliação quantitativa da atividade antioxidante foi feita seguindo a

metodologia descrita na literatura, com pequenas modificações, monitorando-se o

consumo do radical livre DPPH pelas amostras, através da medida do decréscimo da

absorbância de soluções de diferentes concentrações (BRAND-WILLIAMS et al.,

1995). Este ensaio quantitativo foi realizado em espectrofotômetro UV-Vis com

comprimento de onda 515 nm, utilizando como controle positivo o ácido gálico.

- 35 -

4.7.1.1 Curva de calibração do DPPH

Inicialmente preparou-se 75 mL de solução estoque de DPPH em metanol, na

concentração de 40 µg/mL, que foi mantida sob refrigeração e protegida da luz.

Foram feitas diluições para obtenção das concentrações finais de 5, 10, 15, 20, 25 e

30 µg/mL. A curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a

515 nm com todas as soluções medidas em cubetas de vidro, com percurso óptico de

1 cm e tendo como “branco” o metanol. As medidas de absorbância foram efetuadas

em triplicata e em intervalos de 1 min entre cada leitura.

4.7.1.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras

As soluções dos extratos aquosos liofilizados de todas as amostras de L.

gracilis foram diluídas nas concentrações de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 µg/mL. As

medidas das absorbâncias das misturas foram feitas a 515 nm, no 1º, 5º, 10º min e a

cada 10 min até completar 60 min (SOUSA, et al., 2007). A mistura de metanol e

amostra foi utilizada como branco. A partir da equação da curva de calibração e dos

valores de absorbância no tempo de 60 min para cada concentração testada, foram

determinados os percentuais de DPPH remanescentes, calculados de acordo com

Brand-Williams et al. (1995), conforme a equação:

%DPPHREM = [DPPH]T/[DPPH]T0 x100

onde [DPPH]T corresponde à concentração de DPPH no meio reacional, após

a reação com a amostra e [DPPH]T0 é a concentração inicial de DPPH. A quantidade

de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%

(IC50) foi calculada plotando-se o %DPPHREM no tempo de 60 min em oposição às

concentrações das amostras. Os resultados foram expressos em µg/mL ± desvio

padrão. Quanto maior o consumo de DPPH por amostra, menor será o seu CI50 e

maior será sua atividade antioxidante.

As absorbâncias nas concentrações testadas (30 µg/mL) no tempo de 60 min

foram convertidas em percentual de inibição (IP).

- 36 -

A atividade antioxidante foi também expressa pelo índice de atividade

antioxidante (IAA), calculado de acordo com Scherer e Godoy (2009), conforme a

equação: IAA = %DPPHREM (Final) (µg/mL)/IC50 (µg/mL). Deste modo, o IAA foi

calculado considerando a massa de DPPH e a massa das amostras testadas na reação,

resultando uma constante para cada amostra, independente das concentrações do

DPPH e amostras usadas. A atividade antioxidante é considerada insatisfatória

quando o valor do IAA for inferior a 0,5; moderada quando o IAA estiver entre 0,5 e

1,0; forte quando o IAA estiver entre 1,0 e 2,0; e muito forte quando o valor do IAA

for superior a 2,0.

4.7.2 Análise estatística

Os resultados da atividade antioxidante estão apresentados como média ±

desvio padrão da média (triplicata). A avaliação estatística dos dados foi realizada

usando a análise de variância (ANOVA) para múltiplas comparações, seguida do

teste de Tukey. Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.

O ensaio de atividade antioxidante foi realizado no Laboratório de

Bioquímica e Produtos Naturais do Departamento de Fisiologia DFS/UFS em

colaboração com o Professor Dr. Charles dos Santos Estevam.

Capítulo 5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

- 38 -

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis

A Tabela 3 apresenta as massas obtidas dos extratos aquosos liofilizados dos

sete genótipos de L. gracilis nos três cultivos (inverno, verão com irrigação e verão

sem irrigação).

Tabela 3. Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis

Genótipo

Massa (mg) (Coleta inverno)

Massa (mg) (Coleta verão com irrigação)

Massa (mg) (Coleta verão sem irrigação)

106 347,4 422,8 501,7 107 352,6 355,1 482,2 108 313,4 349,1 516,6 109 394,4 425,8 515,6 110 333,3 468,3 527,9 201 469,5 410,7 589,8 202 504,4 411,4 467,0

Na Tabela 3 é interessante observar um rendimento maior dos extratos

aquosos dos genótipos coletados no inverno proveniente da Bahia (201 e 202) em

relação aos demais da mesma coleta. Além disso, os extratos aquosos dos genótipos

coletados no verão e cultivados sem irrigação apresentaram, em sua maioria, massas

superiores aos seus respectivos de outras coletas.

A variação no conteúdo de metabólitos secundários presentes em um material

vegetal pode advir de vários fatores, tais como: sazonalidade, temperatura, altitude,

disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, composição atmosférica e invasão por

patógenos (GOBBO N. E LOPES, 2007). Desta forma, pode-se supor que a variação

no rendimento dos extratos aquosos liofilizados entre as amostras ocorreu devido ao

fato de serem genótipos provenientes de duas localidades diferentes, de terem sido

coletadas em diferentes estações do ano (inverno e verão) e de apresentarem

diferentes formas de cultivo (verão com e sem irrigação).

- 39 -

5.2 Otimização das condições cromatográficas de análise por CLAE-DAD dos

extratos aquosos liofilizados de L. gracilis

Segundo Snyder (1997), ao iniciar a análise de uma amostra desconhecida é

recomendável realizar uma análise cromatográfica utilizando gradiente exploratório

linear de 5 a 100% de ACN:H2O em 60 min em uma coluna de fase estacionária C18

e uma vazão de 2 mL/min.

A partir desta primeira análise, para posterior otimização das condições

cromatográficas, foram avaliados os seguintes fatores: natureza do modificador

orgânico (acetonitrila ou metanol), fase estacionária (C18 ou hexil-fenil) e vazão da

fase móvel de 1 ou 2 mL/min (Tabela 4). As colunas de fases estacionárias C18 e

hexil-fenil foram escolhidas para a otimização do método analítico por estarem

disponíveis em nosso laboratório. No entanto, a escolha não foi aleatória, pois sabe-

se que para promover a separação dos tipos de compostos provavelmente presentes

em nossas amostras (compostos fenólicos) estas colunas são consideradas adequadas.

A coluna de fase estacionária quimicamente ligada ao grupo octadecilsilano (C18) é

amplamente utilizada quando se deseja avaliar uma amostra vegetal desconhecida.

Por ser apolar, seu modo de separação baseia-se nas interações hidrofóbicas de suas

cadeias hidrocarbônicas com a parte apolar do soluto a ser analisado. Por outro lado,

considerando “seu potencial de seletividade cromatográfica diferenciada”, as colunas

de fase estacionária hexil-fenil têm se popularizado. Seu modo de separação baseia-

se nas interações do tipo π-π, o que as tornam mais seletivas para análises de

amostras contendo compostos aromáticos (MARTINS, 2008; MALDANER et al.,

2010).

- 40 -

Tabela 4. Variações analíticas de gradiente exploratório para otimização das condições cromatográficas de separação da amostra 108 inv

Análise Fase Movél Fase Estacionária

Vazão (mL/min)

1 ACN:H2O C18 2,0 2 MeOH:H2O C18 2,0 3 ACN:H2O Hexil-Fenil 2,0 4 MeOH:H2O Hexil-Fenil 2,0 5 ACN:H2O C18 1,0 6 MeOH:H2O C18 1,0 7 ACN:H2O Hexil-Fenil 1,0 8 MeOH:H2O Hexil-Fenil 1,0

O extrato aquoso do genótipo 108 (coleta de inverno) foi utilizado para estas

otimizações cromatográficas, pois estava disponível uma maior quantidade de suas

folhas.

Para selecionar o comprimento de onda capaz de detectar o maior número de

bandas cromatográficas, foram registrados cromatogramas em 200, 230, 254, 280,

300, 320 e 360 nm. A seleção destes comprimentos de onda foi baseada nos tipos de

compostos provavelmente presentes nos extratos polares desta espécie (vide item 2:

REVISÃO DA LITERATURA), os quais podem apresentar máximos de absorção,

no espectro ultravioleta entre os valores 214 a 380 nm (OLIVIER et al., 2010;

HEGDE et al., 2004). Os cromatogramas oriundos das análises relacionadas na

Tabela 4 encontram-se na Figura 4.

0 10 20 30 40 50 60 70

0

200

400

600

800

1000

1200

360nm 320nm

300nm

280nm

254nm

230nm

200nm

mA

U

Tempo (min)

v

0 10 20 30 40 50 60 700

1000

2000

3000

4000

360nm 320nm 300nm

280nm 254nm

230nm

200nm

mA

U

Tempo (min)

V

1 2

- 41 -

0 10 20 30 40 50 60 700

1000

2000

3000

4000

360nm 320nm 300nm

280nm 254nm

230nm 200nm

mA

U

Tempo (min)

V

0 10 20 30 40 50 60 700

500

1000

1500

2000

360nm 320nm 300nm

280nm 254nm

230nm

200nm

mA

U

Tempo (min)

V

Figura 4. Cromatogramas do extrato aquoso liofilizado do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis obtidos segundo as condições apresentadas na Tabela 4.

Analisando os cromatogramas da Figura 4, é possível propor que o uso da

acetonitrila como modificador orgânico na fase móvel seria o mais adequado para a

análise dos chás, pois, nos cromatogramas gerados pelas condições 1, 5 e 7, foi

0 10 20 30 40 50 60 700

500

1000

1500

2000

360nm 320nm 300nm 280nm 254nm

230nm 200nm

mA

U

Tempo (min)

V

0 10 20 30 40 50 60 700

500

1000

1500

2000

2500

360nm 320nm 300nm 280nm 254nm

230nm

200nm

mA

U

Tempo (min)

V

0 10 20 30 40 50 60 700

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

360nm 320nm 300nm 280nm 254nm

230nm

200nm

mA

U

Tempo (min)

V

0 10 20 30 40 50 60 700

200

400

600

800

1000

1200

1400

360nm 320nm 300nm 280nm

254nm

230nm

200nmm

AU

Tempo (min)

V

3 4

5 6

7

8

- 42 -

possível a detecção de um maior número de bandas cromatográficas com maior

intensidade quando comparados as demais condições. Além disso, utilizando uma

vazão de 1 mL/min para a fase móvel, coluna C18 e acetonitrila como modificador

orgânico (condição 5), pôde-se obter um cromatograma com melhor retenção e

separação entre as bandas cromatográficas quando comparado àqueles obtidos pelas

condições 1 e 7.

Com a condição preliminar selecionada, condição 5, foi possível iniciar o

estudo da influência de parâmetros do gradiente a ser utilizado, tais como as

concentrações inicial e final do modificador orgânico, inclinação (∆%B/min) e tempo

de análise objetivando a separação das bandas cromatográficas.

O levantamento bibliográfico evidenciou ser comum a presença de

flavonóides glicosilados, iridóides glicosilados e diversos outros compostos fenólicos

em extratos e chás de espécies do gênero Lippia (vide item 2. Revisão da literatura).

Sabendo-se que estes compostos em solução aquosa podem estar parcial ou

totalmente ionizados, torna-se importante suprimir esta ionização, ajustando-se o

valor do pH da fase móvel com a adição de ácido fraco (MARTINS, 2008).

Sendo assim, segundo Gomes et al. (2010) também foi testada a mudança da

água pura da fase móvel para uma solução de ácido fórmico (HCOOH) a 0,5% (v/v),

utilizando inicialmente as condições de gradiente exploratório linear [5-100% (B) em

60 min] nas duas colunas disponíveis (C18 e hexil-fenil) em dois modificadores

orgânicos (ACN e MeOH) (condições 5, 7, 9 e 10, Tabela 5). As diferentes

condições testadas estão relacionadas na Tabela 5 e os seus respectivos

cromatogramas apresentados na Figura 5.

- 43 -

Tabela 5. Condições cromatográficas de análise para obtenção do perfil cromatográfico, utilizando vazão de 1 mL/min e volume de injeção de 25 µL.

Análise Eluição Gradiente (B)

Fase Móvel Fase Estacionária

∆∆∆∆%B/ min

λ (nm)

1

1) 5%-40%- 25min; 2) 40%-75%- 35min

ACN:H2O

C18

1) 1,4 2) 1,0

200

2

1) 5%-25% - 5min 2) 25%- 55% - 50min; 3) 55%-75% - 15min

ACN:H2O

C18

1) 4,0 2) 0,6 3) 1,3

200

3 1) 15%-40% - 50min; 2) 40%- 60% - 20min

ACN:H2O

C18

1) 0,5 2) 1,0

200

4

1) 25-45% - 50min; 2) 45%- 75% - 10min

ACN:H2O

C18

1) 0,4 2) 3,0

200

5 5 – 100% - 60 min ACN:HCOOH (0,5%) C18 1,58 254 6 5-65%- 60min ACN:HCOOH (0,5%) C18 1,0 254 7 5 – 100% - 60 min MeOH:HCOOH (0,5%) C18 1,58 254 8

1) 5-30% - 15min; 2) 30-85% - 55min

MeOH:HCOOH (0,5%) C18 1) 1,6 2) 1,0

254

9 5 – 100% - 60 min ACN:HCOOH (0,5%) Hexil-Fenil 1,58 254 10 5 – 100% - 60 min MeOH:HCOOH (0,5%) Hexil-Fenil 1,58 254

11

1) 5%-20% - 10min; 2) 20%-50% - 50min; 3) 50-75% - 10min

ACN:HCOOH (0,5%)

C18

1) 1,5 2) 0,6 3) 2,5

254

12

1) 5%-20% - 6min; 2) 20%-40% - 50min; 3) 40-70% - 15min

ACN:HCOOH (0,5%)

C18

1) 2,5 2) 0,4 3) 2,0

254

13

1) 20%-40% - 50min; 2) 40-70% - 20min

ACN:HCOOH (0,5%)

C18

1) 0,4 2) 1,5

254

14 5%-65% - 60min MeOH:HCOOH (0,5%) C18 1,0 254

15 1) 5%-30% - 10min; 2) 30%-85% - 55min;

MeOH:HCOOH (0,5%)

C18

1) 2,5 2) 1,0

254

16

1) 8%-30% - 10min; 2) 30%-65% - 60min;

3) 65-75% - 5min

MeOH:HCOOH (0,5%)

C18

1) 2,2 2) 0,58 3) 2,0

254

17

1) 8%-30% - 10min; 2) 30%-60% - 65min;

3) 60-75% - 5min

MeOH:HCOOH (0,5%)

C18

1) 2,2 2) 0,46 3) 3,0

254

18

1) 5%-25% - 15min; 2) 25%-45% - 65min; 3) 45-75% - 12min

MeOH:HCOOH (0,5%)

C18

1) 1,33 2) 0,31 3) 2,5

254

19

1) 5%-28% - 13min; 2) 28%-35% - 24min; 3) 35%-46% - 33min 4) 46-75% - 15min

MeOH:HCOOH (0,5%)

C18

1) 1,77 2) 0,29 3) 0,33 4) 1,93

254

20

1) 5%-28% - 14min; 2) 28%-35% - 28min; 3) 35%-46% - 33min 4) 46-80% - 20min 5) 80-100% - 15min

MeOH:HCOOH (0,5%)

C18

1) 1,64 2) 0,25 3) 0,33 4) 1,7 5) 1,33

254

- 44 -

0 10 20 30 40 50 60 70

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80

0

500

1000

1500

2000

2500

mA

U

Abs

orbâ

ncia

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Tempo (min)

mA

U

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

1000

2000

3000

4000

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80

0

50

100

150

200

250

300

350

Tempo (min)

mA

U

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

100

200

300

400

500

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Tempo (min)

mA

U

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

50

100

150

200

250

mA

U

Tempo (min)

1 2

3 4

5 6

7 8

- 45 -

0 20 40 60 80

0

50

100

150

200

250

300

Tempo (min)

mA

U

0 20 40 60 80

0

50

100

150

200

250

300

mA

U

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

100

200

300

400

500

600

700

mA

U

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

50

100

150

200

250

300

350

Tempo (min)

mA

U

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

100

200

300

400

500

mA

U

Tempo (min)0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

100

200

300

400

500

Tempo (min)

mA

U

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0

200

400

600

800

1000

mA

U

Tempo (min)0 20 40 60 80

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Tempo (min)

mA

U

9 10

11 12

13 14

15 16

- 46 -

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

120

140

160

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Tempo (min)

mA

U

0 20 40 60 80

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Tempo (min)

mA

U

Figura 5. Cromatogramas obtidos pelas condições de análise testadas apresentadas na Tabela 5.

Um cromatograma fingerprint caracteriza-se por apresentar um perfil

cromatográfico, no qual se observa um maior número de bandas possíveis com boa

resolução e simetria e estabilidade da linha de base em um tempo de análise razoável.

O processo de otimização das condições analíticas para obtenção do

cromatograma fingerprint nem sempre é trivial, pois o que se tem neste caso,

geralmente, é um extrato muito complexo, dificultando a separação de todos os

constituintes químicos em uma única corrida (ZHOU et al. 2009). Assim, após várias

etapas de otimização das condições analíticas, o melhor cromatograma fingerprint foi

obtido com a condição 20 (Tabela 5): coluna de fase estacionária C18 LUNA® (5

µm, 25,0 x 0,46 cm, Phenomenex), acoplada a uma coluna guarda; vazão 1 mL/min;

volume de injeção 25 µL; eluição gradiente no modo reverso: 5-28% de MeOH por

14 min (∆%B/min = 1,64); 28-35% de MeOH por 28 min (∆%B/min = 0,25); 35-

46% de MeOH por 33 min (∆%B/min = 0,33); 46-80% de MeOH por 20 min

(∆%B/min = 1,7); 80-100% de MeOH por 15 min (∆%B/min = 1,33); isocrático em

100% de MeOH por 15 min; 100-5% de MeOH por 35 min (retorno do gradiente) e

17 18

19 20

- 47 -

5% de MeOH por 75 min (condicionamento da coluna). A Figura 6 mostra o

cromatograma obtido nesta condição e os espectros de absorção no UV das bandas

assinalas com os números 1 a 5.

0 20 40 60 80 100 120

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

54

3

2

1

mA

U

Tempo (min)

200 250 nm

0

250

500

750

1000mAU

204

234

200 250 nm

0

250

500

750

1000

mAU

204

238

200 250 nm

-50

0

50

100

150

mAU24

2

222

200 250 nm

0

500

1000

1500

mAU

207

267

256

291

200 250 nm

0

500

1000

mAU

206

269

257

Figura 6. Análise Cromatográfica (λ= 254 nm) do extrato aquoso das folhas secas do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis obtido com a condição 20 (Tabela 5). Espectros de absorção no UV das bandas cromatográficas assinaladas com os números de 1 a 5.

1 2 3

5 4

- 48 -

Após estas análises, fez-se a seleção do comprimento de onda apropriado a

ser usado nas análises de todas as demais amostras, de forma a obter a detecção de

um maior número de bandas cromatográficas através da projeção tridimensional

(comprimento de onda x absorbância x tempo de retenção) obtida por CLAE-DAD

do chá do genótipo 108 (inverno) (Figura 7). Assim, o comprimento de onda

selecionado foi 254 nm, o qual abrangeu um maior número de bandas detectáveis.

Figura 7. Cromatograma 3D obtido por CLAE-DAD do extrato aquoso do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis.

5.3 Aplicação da condição cromatográfica na análise de diferentes genótipos de

L. gracilis

Após a otimização do gradiente no qual se obteve a melhor condição

cromatográfica para separação dos compostos químicos presentes no extrato aquoso

do genótipo 108 (inverno) (vide item 5.2), foi realizada a análise cromatográfica nas

mesmas condições com os extratos das 21 amostras obtidas de L. gracilis [sete

genótipos (106-110, 201 e 202) das três coletas: inverno, verão com irrigação e verão

sem irrigação]. Os cromatogramas podem ser visualizados na Figura 8.

- 49 -

0 20 40 60 80 100 120

0

100

200

300

400

500

600

mA

UGen 202

Gen 201

Gen 110

Gen 109

Gen 108

Gen 106

Gen 107

Amostras coletadas no Inverno

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

mA

U

Gen 202

Gen 201

Gen 110

Gen 109

Gen 108

Gen 107

Gen 106

mA

U

Tempo (min)

Amostras coletadas no V. COM irrigação

- 50 -

0 20 40 60 80 100 120

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

mA

U

Gen 202

Gen 201

Gen 110

Gen 109

Gen 108

Gen 107

Gen 106

Amostras coletadas no V. SEM irrigaçãom

AU

Tempo (min)

Figura 8. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos das 21 amostras obtidas de L. gracilis [sete genótipos (106-110, 201 e 202) das três coletas: inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação]

Considerando a Figura 8, pode ser observado algumas diferenças entre os

cromatogramas fingerprint dos diferentes genótipos em cada tipo de coleta. Além

disso, também pode-se ver diferenças entre os cromatogramas do mesmo genótipo

nos três tipos de coleta (Figura 9).

- 51 -

0 20 40 60 80 100 120

020406080

100120140160180200220240260280300320340360

106 Vs 106 Vc106 inv

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

100

200

300

400

107 Vs107 Vc

107 inv

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

108 Vs

108 Vc

108 inv

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

100

200

300

400

500

600

109 Vs 109 Vc

109 inv

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

110 Vs

110 Vc 110 inv

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

201 Vs201 Vc

201 inv

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120

0

100

200

300

400

500

202 Vs 202 Vc

202 inv

mA

U

Tempo (min)

Figura 9. Comparação dos cromatogramas fingerprints (λ= 254 nm) dos sete genótipos entre os três tipos de coletas: inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação

- 52 -

Embora não seja o objetivo deste trabalho a validação do método analítico de

separação, sabe-se que uma das formas de melhorar a precisão é aumentar o número

de replicatas (RIBANI et al. 2004). Assim, a repetitividade das análises foi avaliada

pela preparação em quadruplicata de soluções (15 mg/mL) dos extratos aquosos das

21 amostras de L. gracilis (vide item 4.5 Condições cromatográficas de análise dos

chás de L. gracilis).

Nas Figuras 10, 11 e 12 estão apresentados as quadruplicatas dos

cromatogramas fingerprint dos sete genótipos das coletas de inverno (Figura 10),

verão com irrigação (Figura 11) e verão sem irrigação (Figura 12).

- 53 -

0 20 40 60 80 100 1200

20406080

100120140160180200220240260280300320340360

Tempo (min)

mA

U

Tempo (min)

Gen 106inv

0 20 40 60 80 100 1200

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240T em po ( m i n)

mA

U

Tempo (min)

Gen 107inv

0 20 40 60 80 100 1200

20

40

60

80

100

120

140

160

Tempo (min)

mA

U

Tempo (min)

Gen 108inv

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

600

Tempo (min)

mA

U

Tempo (min)

Gen 109inv

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

Tempo (min)

mA

U

Tempo (min)

Gen 110inv

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

350

400

Tempo (min)

Tempo (min)

mA

U

Gen 201inv

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

Tempo (min)

mA

U

Tempo (min)

Gen 202 inv

Figura 10. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos sete genótipos (inverno) de L. gracilis em quadruplicata.

- 54 -

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

350

400

mA

U

Tempo (min)

Gen 106 V. C/ Irrig

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

Gen 107 V. C/ Irrig

mA

U

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

mA

U

Tempo (min)

Gen 108 v. c/irrig

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

mA

U

Tempo (min)

Gen 109 v. c/irrig

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

350

400

450

mA

U

Tempo (min)

Gen 110 V. C/irrig

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

600

mA

U

tempo (min)

Gen 201 V. C/irrig

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

mA

U

Tempo (min)

Gen 202 V. C/irrig

Figura 11. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos sete genótipos (verão com irrigação) de L. gracilis em quadruplicata.

- 55 -

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

350

400

450

mA

U

Tempo (min)

Gen 106 V.S/ irrig

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

350

400

450

mA

U

Tempo (min)

Gen 107 V. S/ irrig

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

mA

U

Tempo (min)

Gen 108 V. S/ irrig

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

600

mA

U

tempo (min)

Gen 109 V. S/ irrig

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

mA

U

Tempo (min)

Gen 110 V. S/ irrig.

0 20 40 60 80 100 1200

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

mA

U

Tempo (min)

Gen 201 V. S/ irrig

0 20 40 60 80 100 1200

100

200

300

400

500

Gen 202 V. S/irrig

mA

U

Tempo (min)

Figura 12. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos sete genótipos (verão sem irrigação) de L. gracilis em quadruplicata.

- 56 -

5.4 Análise quimiométrica

É possível visualizar nas Figuras 8 e 9 algumas diferenças nos

cromatogramas das amostras analisadas, sendo difícil identificá-las e, até mesmo,

quantificá-las apenas por uma análise visual. Neste caso, a aplicação de técnicas

quimiométricas irá fornecer a interpretação dos dados com mais qualidade, pois

possibilitará a classificação e a discriminação entre os cromatogramas fingerprint(

(MOK et al., 2006; LI et al., 2004).

A Análise de Componentes Principais (ACP) é uma ferramenta

quimiométrica útil que permite a compressão dos dados n-dimensionais para um

sistema com, geralmente, duas variáveis, facilitando a visualização dos dados e a

melhor avaliação das correlações entre esses dois fatores. Assim, a ACP transforma

os dados cromatográficos a partir de um espaço n-dimensional variável em

componentes principais (CP), gerando um gráfico de escores que é usado para

classificar as amostras a partir de suas propriedades, podendo revelar um padrão que

pode ser correlacionado com as características gerais das amostras. O gráfico de

loadings, por outro lado, nos fornece informação sobre as variáveis, quantificando a

variação encontrada entre elas (GOMES et al., 2010; CHEN et al., 2009; ZHOU et

al., 2009; YANG et al., 2007).

Os cromatogramas obtidos foram organizados em uma matriz de dados,

contendo 84 linhas (amostras) e 10.314 variáveis (tempos de retenção, 110 min.),

sendo submetidos à Análise de Componentes Principais (ACP), após pré-tratamento

(alinhamento dos picos pela técnica do algoritmo “Correlation Optimised Warping”-

COW) (SKOV et al., 2006) e pré-processamento (centrados na média) dos dados

originais. A Figura 13 mostra uma parte do cromatograma antes (a) e após o

alinhamento (b), evidenciando a grande necessidade de se realizar o alinhamento dos

dados antes da aplicação da análise quimiométrica.

- 57 -

42 45 48

200

400

mA

U

Tempo (min)

42 45 48

200

400

600

mA

U

Tempo (min)

Figura 13. Parte do cromatograma (λ= 254 nm) dos extratos aquosos de L. gracilis: a) antes do alinhamento, b) após alinhamento utilizando o algaritmo “Correlation Optimised Warping” (COW)

Os cromatogramas foram tratados por ferramentas computacionais de análise

multivariada, utilizando-se a Análise por Componentes Principais (ACP) através do

programa computacional PIROUETTE®, versão 4.0 (Informetrix), visando verificar

o comportamento das amostras de L. gracilis.

Antes de empregar a ACP foi necessário um pré-processamento dos dados

originais. Os métodos de pré-processamento mais utilizados consistem basicamente

em centrar na média ou auto-escalar os dados. Neste caso, os dados foram centrados

na média, isto é, foi calculada a média dos valores experimentais para cada variável e

a

b

- 58 -

foi subtraído cada valor experimental do respectivo valor médio, o que está

representado no gráfico dos dados pré-processados na Figura 14.

Figura 14. Gráfico de pré-processamento centrado na média

Na Análise de Componentes Principais foi observado que 83,6% da variância

total dos dados foram explicados nas duas primeiras componentes principais (Tabela

6). A CP1 e CP2 correspondem, respectivamente, a 79,3% e 4,27% da variância dos

dados originais. As demais CP’s (de 3 a 10) não foram consideradas para a

interpretação de tendências dos dados.

Tabela 6. Variância percentual das componentes principais calculadas para os dados da matriz original centrados na média

Componente Principal % de Variância % de Variância Acumulada CP1 79,3 79,3 CP2 4,27 83,6 CP3 3,15 86,7 CP4 2,10 88,8 CP5 1,58 90,4 CP6 1,50 91,9 CP7 1,19 93,1 CP8 1,09 94,2 CP9 0,69 94,9 CP10 0,61 95,5

Na Figura 15 temos o gráfico da variância explicada em cada CP. Pode-se

observar que a variação da variância explicada entre a CP3 até a CP10 é menor do

que 15% do total das CP’s, ou seja, ao se aplicar a ACP, foi possível reduzir a

Pré

- pr o

c es s

a me n

to

Variáveis

- 59 -

dimensão dos dados de 10.314 para 2 (2CP’s). Assim, a CP1 descreve o máximo de

variabilidade das amostras, mais que qualquer uma das variáveis originais, como

apresentado na Tabela 6 e na Figura 15.

Figura 15. Variância explicada (%) para cada componente principal (CP’s)

Na Figura 16 é apresentado o gráfico de escores de CP1 versus CP2, o qual

traz informações sobre as amostras.

Figura 16. Gráfico de escores (CP1 versus CP2)

Componentes Principais

Va r

i ânc

ia E

x plic

a da

(%)

CP1 (79,3%)

CP

2 (4

,27 %

)

- 60 -

No gráfico da Figura 16 vê-se que a CP1 separa as amostras 109inv, 202inv,

201vc, 109vs, 110vc, 201vs e 202vs em valores de escores positivos, das amostras

106inv, 107inv, 108inv, 110inv, 108vc, 202vc e 108vs em valores de escores

negativos; e as amostras 201inv, 106vc, 107vc, 109vc, 106vs e 107vs em valores

próximos de zero. CP2, por sua vez, consegue separar as amostras 108inv, 108vc,

201vc, 202vc, 108vs e 202vs em valores de escores positivos, das amostras 106inv,

107inv, 201inv, 109vc, 110vc, 109vs, 110vs e 201vs em valores de escores

negativos; e as amostras 109inv, 110inv, 202inv, 106vc, 107vc, 106vs e 107vs em

valores próximos de zero. Vale mencionar que as amostras 106vc, 107vc, 106vs e

107vs apresentaram valores próximos de zero tanto no eixo da CP1 como na CP2.

Na Figura 16 pode-se observar a separação de amostras e formação de

alguns grupos. Um grupo foi formado pelas amostras 108inv, 108vc, 108vs e 202vc;

outro grupo é formado por 106vc e 109vc; um terceiro grupo apresenta as amostras

109inv, 202inv e 201vc; um quarto grupo apresenta 107vc, 110vc, 106vs, 107vs,

109vs, 110vs e 201vs; além de um quinto grupo contendo 106inv e 107inv.

É interessante observar que os genótipos 108 e 202 coletadas no verão

cultivadas sem irrigação mostraram ser significativamente diferentes dos demais

genótipos da mesma coleta, pois formaram grupos separados.

Além disso, os genótipos 107, 108 e 110 não se diferenciaram quanto ao tipo

de cultivo (verão com e sem irrigação), sendo que o genótipo 108, ainda não foi

capaz de se diferenciar pela época da coleta (verão e inverno).

A diferenciação entre as amostras pode ser explicada observando o gráfico de

loadings (Figura 17) que demonstra a importância (peso) que cada variável teve na

construção de cada componente principal e, consequentemente, na projeção das

amostras pelos escores.

- 61 -

Figura 17. Gráfico de loadings dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis

No gráfico de loadings (Figura 17) é possível perceber que na CP1 e CP2

algumas bandas cromatográficas se destacaram com valores de loadings positivos e

outras com valores de loadings negativos. Somente a CP2 apresentou valores de

loadings positivos e negativos, a CP1 só tem valores positivos.

Os loadings da CP1 apresentaram as bandas cromatográficas que contém

maior peso/influência na projeção das amostras, e só contém variáveis com valores

positivos. Sendo assim, as amostras 109inv, 202inv, 201vc, 109vs, 110vs, 201vs e

202vs que apresentaram valores positivos para CP1, estão correlacionadas com

tempos de retenção que apresentam valores positivos na CP1 no gráfico de loadings

(Figura 17). Os tempos de retenção, então, característicos destas amostras

correspondem a 41,8 e 43,8 minutos.

Os loadings da CP2 contêm variáveis com valores positivos e negativos.

Sendo assim, as amostras 106inv, 107inv, 201inv, 109vc, 110vc, 109vs, 110vs e

201vs que apresentaram valores negativos para CP2, estão correlacionadas com

tempos de retenção que apresentam valores negativos na CP2 no gráfico de loadings

(Figura 17). Os tempos de retenção, então, característicos destas amostras

correspondem a 19,3 e 41,8 minutos.

Os valores positivos de escores da CP2 estão relacionados aos tempos de

retenção que apresentaram valores positivos na CP2 no gráfico de loadings (Figura

17). As amostras 108inv, 108vc, 201vc, 202vc, 108vs e 202vs que possuem valores

CP1

CP2 17,0

19,3

41,8

41,8 43,8

- 62 -

de escores positivos para CP2 apresentaram como tempos de retenção característicos

17,0 minutos.

No gráfico de escores (Figura 16) percebe-se que, excetuando os genótipos

109 e 202, as demais amostras de inverno apresentam valores em CP1 negativos,

tendendo a valores positivos para as amostras coletadas no verão. Estes dados,

combinados com aqueles do gráfico de loadings (Figura 17), permitem-nos propor

que os metabólitos que eluem nos tempos de retenção 41,8 e 43,8 min são mais

característicos das amostras coletadas no verão (amostras 106 a 108; 110 e 201).

Comparando os respectivos espectros UV destas bandas (Figura 6) com os da

literatura e o relato da presença de flavonóides em extrato polar de folhas desta

espécie, sugere-se que estes sejam flavonóides glicosilados, o que corrobora com a

função destes metabólitos como protetores de radiação UV. Além disso, observou-se

também que a irrigação influencia significativamente o perfil cromatográfico nas

amostras 109 e 202, pois reduzem as bandas cromatográficas que definem a CP1

(DUCREY et al., 1995; SISA et al., 2010; GUIMARÃES et al., 2012).

Sabendo-se do interesse farmacológico nesta planta e das inúmeras atividades

biológicas que os flavonóides apresentam, a partir de nossos resultados, deve-se

considerar as condições de cultivo, época de coleta e seleção do melhor genótipo

para sua utilização (YAO et al., 2004; ATMANI et al., 2009; KELLER et al., 2009).

Desta forma, a análise quimiométrica possibilitou uma melhor avaliação das

diferenças e semelhanças entre os cromatogramas fingerprints dos chás das folhas

dos sete genótipos de L. gracilis, permitindo relacioná-las às suas procedências

(Sergipe ou Bahia), estação do ano da coleta (inverno ou verão) e tipo de cultivo

(verão com ou sem irrigação).

5.5 Atividade antioxidante: Teste do DPPH

As análises de atividade antioxidante foram realizadas em triplicata e os

resultados encontram-se na Tabela 7. A equação da curva de calibração do DPPH foi

C = 110,547 – 0,02804A, onde C corresponde à concentração de DPPH no meio

- 63 -

reacional, A é a absorbância medida no comprimento de onda de 515 nm. O

coeficiente de correlação foi de R = 0,9983.

O percentual antioxidante (IP) que reagiu com o genótipo 108inv foi muito

pequeno 0,010% (Tabela 7). Já o IP para os genótipos 106inv, 107inv, 108vc, 109vc,

110inv e 202vc foram de 40,27%, 37,75%, 39,51%, 40,11%, 46,57% e 48,79%,

respectivamente, os quais foram considerados de baixa atividade. Apenas as

amostras do genótipo 201vc e 201vs (30 µg/mL, 60 min) consumiram mais de 90%

do radical DPPH, apresentando uma resposta similar ao controle positivo ácido

gálico (92,06%, 30 µg/mL, 60 min) sendo consideradas com atividade antioxidante.

Na avaliação da atividade antioxidante, a solução metanólica de DPPH

inicialmente de coloração violeta torna-se amarela. O grau deste descoramento indica

a habilidade do antioxidante em sequestrar radicais livres. Uma forma usual de

expressar os resultados nesse ensaio é calcular a quantidade de antioxidante

necessária para diminuir em 50% a concentração inicial do radical DPPH. Esse

índice denomina-se CI50 e quanto menor o seu valor, maior será a atividade

antioxidante. Dessa forma, como o genótipo 108 inv apresentou um valor de CI50

muito alto, não apresentou atividade antioxidante. Por outro lado, os valores de CI50

para os genótipos 106vs, 107vs, 108vs, 109inv, 110vc, 201vc, 201vs, 202inv e 202vs

foram estatisticamente similares ao apresentado pelo ácido gálico, o controle positivo

(Tabela 7).

- 64 -

Tabela 7. Atividade antioxidante dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis pela redução do radical livre DPPH

Amostra CI50 (µg/mL) IAA (p/ 30 µg/mL) IP(%)(p/ 30 µg/mL)

Gen 106 inv 43,80±1,74a 0,68 40,27 Gen 106 vc 22,50±1,95b 1,33 62,26 Gen 106 vs 16,28±0,94c 1,84 81,77 Gen 107 inv 44,07±1,81a 0,68 37,75 Gen 107 vc 24,08±2,02b 1,24 60,20 Gen 107 vs 15,16±1,80c 1,97 84,77 Gen 108 inv 141,9±0,88d 0,17 0,010 Gen 108 vc 39,21±1,42a 0,76 39,51 Gen 108 vs 19,79±0,60b 1,51 81,19 Gen 109 inv 14,04±1,91c 2,13 89,34 Gen 109 vc 44,29±1,55a 0,67 40,11 Gen 109 vs 24,48±1,93b 1,22 60,88 Gen 110 inv 36,68±1,68e 0,81 46,57 Gen 110 vc 16,18±1,70c 1,85 78,26 Gen 110 vs 20,03±1,52b 1,49 77,39 Gen 201 inv 20,38±1,97b 1,47 70,39 Gen 201 vc 11,41±1,86c 2,62 94,43 Gen 201 vs 12,51±1,79c 2,39 93,90 Gen 202 inv 13,98±2,01c 1,78 86,56 Gen 202 vc 23,33±1,82b 1,28 48,79 Gen 202 vs 19,32±1,89bc 1,55 73,95 Ácido Gálico 1,05±0,20e 23,08 92,06

Valores (CI50) apresentados na Tabela 7 com letras diferentes são diferentes

estatisticamente; p < 0,05 em relação ao controle positivo ácido gálico.

Os dados encontrados a partir do IAA (Índice de Atividade Antioxidante)

classificaram o genótipo 108inv (0,17) como tendo atividade antioxidante

insatisfatória; os genótipos 106inv (0,68), 107inv (0,68), 108vc (0,76), 109vc (0,67)

e 110inv (0,81) com moderada atividade antioxidante; os genótipos 106vc (1,33),

106vs (1,84), 107 vc (1,24) 107vs (1,97), 108vs (1,51), 109vs (1,22), 110vc (1,85),

110vs (1,49), 201inv (1,47), 202inv (1,78), 202vc (1,28) e 202vs (1,55) com forte

atividade antioxidante e os genótipos 109inv (2,13), 201vc (2,62) e 201vs (2,39) com

atividade antioxidante muito forte, sendo similares ao controle positivo ácido gálico

(23,08), que apresenta atividade antioxidante muito forte (Tabela 7).

É interessante observar que os genótipos coletados no verão e cultivados sem

irrigação apresentaram atividade antioxidante de forte (106 a 110 e 202) a muito

forte (201). Neste caso, pode-se propor que a síntese de metabólitos secundários foi

afetada pelas condições ambientais de stress hídrico. Assim, para que a espécie

sobrevivesse deve ter havido um acúmulo de metabólitos secundários, os quais

- 65 -

podem ter sido os responsáveis pela intensa atividade antioxidante observada nestas

amostras. A partir do conhecimento químico de espécies deste gênero, pode-se ainda

propor que esta intensa atividade antioxidante se deve aos compostos fenólicos

presentes.

Pode-se observar que os genótipos que apresentaram atividade antioxidante

muito forte [109inv (2,13), 201vc (2,62) e 201vs (2,39)], encontraram-se em

grupamentos próximos no gráfico de escores (Figura 16).

Como mostrado na Figura 18, os genótipos da coleta verão sem irrigação

(codificados como “vs irri”) e os genótipos 109inv, 201inv, 202inv, 110vc e 201vc

apresentaram cinética comportamental rápida. O genótipo 108inv praticamente não

reagiu com o DPPH.

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100 Gen 106 invGen 107 invGen 108 invGen 109 invGen 110 invGen 201 invGen 202 invÁcido Gálilco

Tempo (min)

DP

PH

rem

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100 Gen 106 vs irriGen 107 vs irriGen 108 vs irriGen 109 vs irriGen 110 vs irriGen 201 vs irriGen 202 vs irriÁcido Gálilco

Tempo (min)

DPPH

rem

(%

)

- 66 -

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100 Gen 106 vc irriGen 107 vc irriGen 108 vc irriGen 109 vc irriGen 110 vc irriGen 201 vc irriGen 202 vc irriÁcido Gálilco

Tempo (min)

DPPH

rem

(%

)

Figura 18. Cinética comportamental dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis (30 µg/mL) e ácido gálico (30 µg/mL), frente ao radical livre DPPH (40 µg/mL).

Capítulo 6

CONCLUSÕES

- 68 -

6. CONCLUSÕES

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um método por CLAE-DAD

para a obtenção de cromatogramas fingerprints, que auxiliados por análise

quimiométrica de ACP, permitiu investigar e demonstrar a variação de componentes

químicos entre os chás de folhas de sete genótipos de L. gracilis procedente de

diferentes locais (Sergipe e Bahia), estações do ano (verão e inverno) e formas de

cultivo (verão com e sem irrigação).

Os resultados permitiram demonstrar que diferentes fatores ambientais, tais

como: sazonalidade e a disponibilidade hídrica podem provocar variação nos

constituintes químicos de uma amostra vegetal, podendo, inclusive afetar suas

propriedades antioxidantes. Além disso, pode-se observar diferenças químicas entre

os genótipos coletados a partir das duas localidades (Sergipe e Bahia).

O método proposto mostrou ser adequado e eficiente para determinar as

diferenças e semelhanças entre as amostras. Assim, é possível propor que os

genótipos 107, 108 e 110 apresentaram maior resistência ao stress hídrico, pois não

foi observada diferenciação entre as amostras coletadas no verão e cultivadas com e

sem irrigação. Além disso, o genótipo 108 apresentou pouca diferenciação entre a

amostra coletada no inverno e as correspondentes coletadas no verão sob as duas

formas de cultivo.

Os resultados obtidos pelo teste de atividade antioxidante mostraram que os

genótipos coletados no verão e cultivados sem irrigação apresentaram atividade

antioxidante entre forte (106 a 110 e 202) e muito forte (201). Esta intensa atividade

pode ter sido ocasionada pelo acúmulo dos compostos fenólicos comumente

encontrados em espécies deste gênero.

As amostras que apresentaram atividade antioxidante muito forte (109inv,

201vc e 201vs) apresentaram comportamento compatível com os resultados

cromatográficos e quimiométricos, comprovando suas similaridades.

Capítulo 7

REFERÊNCIAS

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