variabilidade genetica - mandacaia e jatai

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VARIABILIDADE GENTICA EM POPULAES DE Melipona quadrifasciata Lepeletier e Tetragonisca angustula Latreille (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae)DAVI SAID AIDAR Orientador: Prof. Warwick Estevam Kerr RIBEIRO PRETO SO PAULO - BRASIL Maro - 1999 DEDICATRIA A todos aqueles que trabalham para a preservao das abelhas nativas e ecossistemas a elas relacionados. AGRADECIMENTOS Ao meu orientador Dr. Warwick E. Kerr, que esteve sempre presente e disposto a tudo para a realizao deste trabalho. Dra. Eucleia P. B. Contel pela colaborao nos trabalhos das anlises enzimticas na populao de Melipona quadrifasciata. Tcnica Rubiane C. Pagotto, que sempre esteve ativa durante os experimentos, fornecendo apoio tcnico sem limites. Dra. Zil P.L. Simes que, na qualidade de Coordenadora do Curso de Ps Graduao em Entomologia da F.F.C.L.R.P., alm de proporcionar todas as medidas administrativas para dar suporte aos experimentos, muitas vezes participou como conselheira. Ao Dr. Carlos A. Garfalo, pelas orientaes e apoio administrativo que esclareceram dvidas importantes facilitando as atividades. Dra. Luci R. Bego, Dr. Espencer E. Soares, Dr. Paulo Nogueira-Neto que sempre esclareceram dvidas e ofereceram apoio cientfico. Secretria Valdete A. S. Silva, pela sua eficincia e pontualidade. Auxiliou muito no setor administrativo e nos processos burocrticos do curso de Doutorado. Ao Tcnico Jos A. Tavares, sua irm Rosana Tavares e ao Dr. Amilcar Tavares que cederam espao em suas residncias para abrigar parte das colmeias utilizadas nos experimentos aqui relatados e a todos que contribuiram para a execuo desta tese de doutorado, inclusive minha famlia que suportou minha ausncia nas atividades sociais para que houvesse mais dedicao na execuo do curso e experimentos relativos tese.

RESUMOA sobrevivncia de colnias de meliponneos dependente da variabilidade gentica da populao de cada espcie e muitas espcies esto sendo extintas devido consanginidade e a diminuio de alelos xo, porque habitam pequenas reas com poucas colnias. Quanto maior o nmero de colnias da mesma espcie na mesma rea de reproduo, maior as oportunidades de sobrevivncia. O estudo do nmero de alelos xo indica se a populao est sob o efeito Efeito Yokoyama e Nei e assim pode-se intervir, introduzindo novas rainhas ou colnias de outras regies para aumentar o nmero de alelos xo e manter a populao em equilbrio, evitando mortes de colnias com a produo de machos diplides. Para avaliar a variabilidade gentica das populaes de Melipona quadrifasciata Lep. e Tetragonisca angustula Lat., foram estudadas as populaes do Meliponrio-A. Foi estimado o nmero de alelos sexuais xo nas duas populaes usando o mtodo desenvolvido por KERR (1987). Foram contadas as propores de machos e fmeas nos primeiros favos de crias originados das colnias filhas resultantes de divises das colnias matrizes. As colnias filhas foram formadas de acordo com o Mtodo 2 para multiplicao artificial de colnias de mandaaias em orfandade (AIDAR, 1996a). Com a mesma populao de Melipona quadrifasciata Lep. foi estimado o nmero de alelos sexuais xo antes e depois da introduo de 10 colnias que tiveram suas rainhas acasaladas com zanges de populaes das regies de Domingos Martins e So Paulo de Arac, ES. O nmero

2de alelos sexuais antes e depois da introduo das colnias acasaladas no Esprito Santo foi 8 (s=3,36) e 17,33 (s=9,23), respectivamente. O nmero de alelos sexuais na populao de Tetragonisca angustula foi 56 (s=54,03). Com a mesma populao de Melipona quadrifasciata Lep., 8 operrias de 52 colnias foram submetidas a anlises eletroforticas em gel de amido para investigar variabilidade nos locos codificadores das enzimas EST, IDH, ME, PGM, SOD, PGD, MDH, LAP, HK e PGI. As enzimas IDH, ME, PGM, SOD, PGD, MDH e PGI no apresentaram variao. Para LAP e HK no foi detectada atividade. No entanto, foi verificado polimorfismo para esterase em 51,92% colnias. Pelo Teste XX2 a hetorogeneidade dessas populaes demonstrou semelhana quanto s freqncias allicas desta enzima. Para o desenvolvimento dos experimentos desta tese, as colnias de meliponneos foram submetidas a tcnicas de manejo especficas para populaes de locais com poucas floradas. Aspectos de manejo, como alimentao artificial e manipulao para a manuteno das colnias em boas condies, tambm foram descritos neste trabalho.

1. INTRODUO1.1. MELIPONNEOS E ECOSSISTEMAUma populao vegetal torna-se mais sensvel s variaes ambientais, principalmente epidemias, pragas e variaes climticas, com o desenvolvimento da uniformidade gentica ocasionada pelos cruzamentos consangneos (HOYT, 1992), quer seja pela estrutura da flor ou pela coleta de um ou poucos exemplares da natureza para produo de sementes. Isso aplicvel tambm s populaes animais. O cruzamento entre plantas diicas promove a manuteno da variabilidade gentica e este sucesso reprodutivo depende em grande parte de insetos polinizadores (KERR, 1994a). As abelhas nativas so parte integrante deste mecanismo de reproduo vegetal, aumentando a produtividade das plantas cultivadas e a fertilidade dos vegetais que dependem da polinizao cruzada para sobreviverem (GIMENES & MARQUES, 1996; MATEUS et al., 1996; HOFFMANN & PEREIRA, 1996; CAMILLO, 1996). Especificamente sobre o papel dos meliponneos na polinizao, os trabalhos de KERR et al. (1995) e KERR (1997 e 1998) destacam a importncia das abelhas nativas para a manuteno da diversidade vegetal nos trpicos. ABSY & KERR (1997) estudaram a Melipona seminigra merrillae em Manaus, AM, e mostraram as vrias espcies vegetais visitadas pela jandara alaranjada de Manaus. ABSY et al. (1980 e 1984) discutiram a associao inseto-planta, especificamente com meliponneos e vegetais nativos na regio de Manaus, AM. A extino de espcies de abelhas nativas implica na possibilidade da extino de espcies vegetais e desequilbrio no ecossistema (KERR et al., 1978 e 1994a; ROUBIK, 1989). A manuteno dos recursos genticos das plantas cultivadas, originadas dos seus parentes silvestres, base para a sobrevivncia da humanidade. Os vegetais usados na alimentao humana, como os encontrados em pomares, hortalias, condimentos e ervas medicinais, so polinizados por abelhas nativas e essas abelhas enxergam cores de flores que as abelhas africanizadas no reconhecem, podendo polinizar espcies vegetais especficas (GODI, 1989). Com o aumento populacional da espcie humana, o incremento na produo de alimentos um prrequisito passivo de controvrsias. As variaes no ambiente exigem das plantas domesticadas grande flexibilidade em seu genoma para suportarem esta heterogeneidade. A diversidade gentica das populaes vegetais locais e dos seus parentes silvestres recurso para a manuteno do vigor hbrido dos cultivares domesticados e utilizados em nossa alimentao e economia agrcola (HOYT, 1992). Para a manuteno da fauna e flora nativa essencial no destruir as mais de trezentas espcies de abelhas sociais brasileiras. O entendimento dos aspectos biolgicos que compreendem os mecanismos de reproduo das abelhas nativas est associado a todos os esforos que esto sendo executados, nos ltimos 50 anos, para a possvel manuteno de algumas espcies geograficamente mais prximas do homem. As espcies ainda no classificadas e aquelas razoavelmente conhecidas esto sendo extintas com a destruio de seu habitat natural devido acelerada ocupao irracional de novas reas pela espcie humana (FALK, 1991; KERR, 1994, 1997 e 1998; KERR et al. 1994; AIDAR, 1997a, 1997b-Ibama, 1997c). A organizao da colnia dos insetos sociais, sua manuteno e o sucesso ecolgico das vrias espcies, relacionam-se aos mecanismos de reproduo desenvolvidos por estes insetos durante sua evoluo (HAMILTON, 1972 e 1994; PAGE & METCALF, 1982). O comportamento geral do grupo ou da colnia de abelhas influenciado pela maioria dos mecanismos das associaes genotpicas caractersticas de cada espcie (PAGE et al., 1983; HAMILTON, 1994; YOKOYAMA & NEI, 1979). O comportamento do grupo, por sua vez, conseqncia dos mecanismos etolgicos de reproduo que promovem maior hibridao e capacidade de defesa contra vrias doenas e variaes ambientais (HAMILTON, 1994).

3No Brasil so conhecidas mais de 300 espcies de abelhas nativas (Meliponinae) (KERR & MAULE, 1964), 7 espcies de mamangavas (Bombinae) (MOURE & SAKAGAMI, 1962), muitas de abelha-dasorqudeas ou mamangavinhas coloridas (Euglossini) e conservativamente, mais de 5.000 espcies de abelhas solitrias. A cada ano que passa, essas estimativas variam conforme as novas descobertas e pesquisas concludas e os nmeros talvez possam ser multiplicados por 10 (KERR, c.p.).. Com auxlio de um mapa SOARES (1994) relata a distribuio de locais com criaes de abelhas nativas na Amrica Latina e tribos indgenas que cultivam meliponneos para uso dos seus subprodutos na alimentao. O autor tambm tem preocupao com a preservao das espcies que esto em processo de extino, propondo estratgias para amenisar o problema. AIDAR (1998a) vm desenvolvendo tcnicas para melhorar o manejo de meliponneos em experimentao, principalmente no que se refere transferncia das colnias dos troncos de rvores para as colmeias racionais, proporcionando melhores cuidados com as mesmas durante os experimentos e evitando morte de colnias. A grande variao no tamanho dos indivduos entre as espcies de abelhas proporciona eficincia na polinizao e no ciclo reprodutivo dos vegetais tropicais (ROUBIK, 1989). Na Amaznia, 80% das rvores so bissexuais ou auto estreis e dependem, em 90% dos casos, de abelhas para gerarem sementes frteis com a polinizao (MICHENER, 1961, 1974 e 1979; ROUBIK, 1989; KERR et al., 1994 e 1994b). A maioria dos meliponneos fundam seus ninhos em ocos, nos troncos de rvores (IHERING, 1932) e esta interao est associada existncia de rvores com dimetro maior ou igual a 10cm, o que corresponde a 32% das rvores na regio prxima a Manaus, AM (RIDRIGUES & VALLE, 1964; WALKER, 1991) e 27% nos campos e cerrados (KERR et al., 1978 e 1994a). As pesquisas aplicadas gentica, biologia e manejo de meliponneos, estruturam conhecimentos que permitiro a interferncia do homem na manuteno ou multiplicao de colnias de abelhas nativas para tentar recuperar e manter os ecossistemas tropicais onde esto a maioria das matrias primas usadas pelo homem na medicina, indstria e alimentao em geral, assegurando a qualidade de vida da espcie humana.

1.2. CONSIDERAES SOBRE AS ESPCIES ESTUDADAS 1.2.1. Tetragonisca angustulaA jata uma das mais comuns entre as espcies de meliponneos. So conhecidas pelo menos duas subespcies: Tetragonisca angustula angustula Latreille e Tetragonisca angustula fiebrigi Schwarz. Apresentam distribuio neotropical e utilizam como substrato os mais variados locais para nidificao, desde cavidades em troncos de rvores at caixas metlicas com relgios para medir consumo de energia em residncias, tambm podem ser encontradas colnias em blocos de concreto ou cermica, muros, alicerces, tubos de pvc e mesmo em cavidades subterrneas superficiais (AIDAR, 1999). Isto promoveu sua adaptao inclusive ao ambiente das cidades, o que no ocorreu com a maioria das espcies de abelhas nativas que so exclusivas nidificadoras de ocos em troncos de rvores. A facilidade que a abelha jata tem para ocupar lugares variados para nidificao, adaptando-se s grandes cidades, influencia positivamente o sucesso evolutivo da espcie, mesmo com os grandes desmatamentos e as queimadas constantes nas florestas naturais do Brasil. KERR (c.p.) encontrou 80 ninhos em 96.000 m2 na cidade de Ribeiro Preto, SP a 1 km do Meliponrio-A. A jata um dos meliponneos encontrados em maior numero de pases, distribuindo-se na regio neotropical desde a Argentina at o Mxico e ocorre em todo o territrio brasileiro (NOGUEIRA-NETO, 1970; FOWLER, 1979; ROUBIK, 1983 e 1989; CAMARGO & POSEY, 1990; IMPERATRIZ-FONSECA et al., 1984; CORTOPASSI-LAURINO & GELLI, 1991; FERREIRA, 1993). O mel de Tetragonisca angustula conhecido popularmente pelas suas propriedades teraputicas e novos estudos vm comprovando o seu efeito benfico para a sade humana (IWAMA & MELHEM, 1979; IMPERATRIZ-FONSECA et al., 1984). Foi comprovado que o mel de jata apresenta ao bactericida quando foram realizados testes de difuso em agar com Escherichia coli e Staphylococcus aureus (BAZLEN, 1997). Em centros urbanos, grande a quantidade de colnias que podem ser encontradas, demonstrando ampla adaptao aos vrios ecossistemas, mesmo sendo uma espcie com abelhas pequenas e com raio de ao em torno de 600 a 750 m (WILLE, 1983; AIDAR, 1996a). Suas colnias podem conter at 1500 abelhas e algumas delas com um litro de mel armazenado em potes esfricos feitos de cera escura (NOGUEIRA-NETO, 1997). Populaes de jata estudadas por CASTANHEIRA & CONTEL (1995), apresentaram excesso de homozigose com relao a alelos relacionados enzima hexoquinase. Os autores mencionam que as colnias de Tetragonisca angustula formam grupos ("clusters") distantes um do outro, o que pode explicar a

4homogeneidade allica encontrada entre as colnias de um mesmo grupo. Meliponicultores que criam abelhas jata em Ribeiro Preto tambm notificaram esses "clusters" na cidade. BARDASSI (c.p.), meliponicultor na cidade de Ribeiro Preto, SP, conta que quando encontra um ninho de abelha jata sempre consegue coletar outros cinco ou seis ninhos no mesmo quarteiro (10.000m2), sendo raras as vezes que encontrou um s ninho nesta mesma rea. AIDAR (1998b) encontrou 6 colnias por hectare em mata nativa do municpio de Miranda, MS, equivalendo a 882 colnias nessa rea de reproduo (KERR & VENCOVSKY, 1982). Por outro lado, muitas colnias marcadas no estavam no local aps 1 ano, indicando que existe uma dinmica de migrao ou morte de colnias numa mesma rea de reproduo. Os ocos marcados e que no continham abelhas no foram abertos para saber se a colnia morreu ou abandonou o local. Todos os ninhos marcados estavam em rvores vivas. Mesmo sendo uma espcie cosmopolita nos trpicos, muito ainda est por ser estudado para caracterizao da biologia, gentica e etologia da abelha jata.

1.2.2. Melipona quadrifasciataNo gnero Melipona, a mandaaia a espcie de abelha mais usada nos laboratrios para estudos de biologia, gentica e manejo de meliponneos. a espcie mais freqente em todas as universidades que trabalham com meliponneos. A Melipona quadrifasciata distribui-se ao longo da costa brasileira desde a Paraba at o Rio Grande do Sul (MOURE & KERR, 1950; KERR, 1951). Apresenta duas subespcies: Melipona quadrifasciata anthidioides Lep. e Melipona quadrifasciata quadrifasciata Lep. A primeira tem bandas tergais descontnuas em machos e operrias e a segunda tem bandas tergais contnuas nas duas castas (SCHWARTZ, 1932; MELO & CAMPOS, 1987). A Melipona quadrifasciata quadrifasciata pode ser encontrada no Sul de So Paulo, Paran e Santa Catarina, principalmente em regies mais altas e frias. No Sul de Minas Gerais ocorre em altitudes acima de 1.500 m. Na Serra da Bocaina, Serra do Mar, Litoral Norte de So Paulo e em altitudes superiores a 1.600 m, tambm foram encontrados ninhos desta subespcie (MOURE, 1975). A Melipona quadrifasciata anthidioides tem distribuio geogrfica mais ao norte, como em Minas Gerais e Rio de Janeiro. Portanto, subespcie de climas mais quentes. Colnias foram encontradas em locais com elevadas altitudes, como em Petrpolis, RJ e em Minas Gerais, em altitudes superiores a 1.500 m (MELO & CAMPOS, 1987). Em regies do estado de So Paulo e Sul de Minas Gerais existe uma zona de hibridao entre as duas subespcies onde so encontrados hbridos contendo vrios padres na distribuio das bandas amarelas nos tergitos abdominais (MOURE & KERR, 1950; KERR, 1951; MOURE, 1975).

1.3. NMERO DE ALELOS SEXUAIS NAS POPULAES DAS ESPCIES ESTUDADASO estudo do nmero de alelos sexuais na mesma rea de reproduo de uma espcie de abelhas pode ser realizado com a observao da produo de machos diplides na cria de cada nova rainha que inicia postura. Por exemplo, aps cada diviso da colnia ou aps orfanao de uma colnia, podem ser observados os gonstilos das pupas de olho-rosa quando desopercula-se as clulas pela parte inferior do favo com 40-50 dias. A proporo 1:1 de machos e fmeas indica a presena de machos diplides nos favos (ADAMS et al., 1977; KERR, 1987). A diploidia dos machos pode ser confirmada com contagem dos cromossomos pelo mtodo de IMAI et al. (1977). WHITING (1940, 1943) mostrou que Bracon hebetor produz 50% de machos diplides quando h cruzamento entre irmos devido a uma srie de 8 alelos mltiplos xo1, xo2 a xo8. MACKENSEN (1951) ao cruzar rainhas de Apis mellifera com seus irmos ou filhos, obteve 50% de esterilidade. O mesmo autor (1955), encontrou 11 heteroalelos, xo1 a xo11, numa populao de Apis mellifera. Trabalhando com a mesma espcie de abelhas, 12 alelos foram encontrados por LAIDLAW et al. (1956). Em 1963, WOYKE concluiu que as operrias comiam as larvas de machos diplides de Apis mellifera ocasionando 50% de sobrevivncia da cria. Criando esses machos diplides em estufa, para que no fossem mortos pelas operrias, Woyke constatou que 50% eram machos diplides. Usando a mesma tcnica CHAUDNETO (1980a, 1980b) conseguiu cruz-los com rainhas normais e obter operrias triplides. O nmero de alelos sexuais numa populao de abelhas africanizadas (Apis mellifera) foi estudado por ADAMS et al. (1977). Este nmero foi estimado em 18,9 pela determinao da porcentagem de machos diplides em 90 colnias de uma populao de 500 colnias. PAGE et al. (1983) estudaram a distribuio dos alelos xo em populaes fechadas de Apis mellifera. KERR et al. (1978) sugerem que a determinao do sexo em abelhas ocorre em duas fases: a primeira fase, poucas horas aps a postura e a segunda fase, no final da fase de pr-pupa, anteriormente determinao

5de todos os discos imaginais. Existindo um equilbrio entre os genes reguladores que atuam sobre um conjunto de genes aditivos (no compensados) determinadores do sexo feminino e sobre genes parcialmente no aditivos ou no aditivos (compensados), determinadores de masculinidade. Com relao origem dos alelos xo na Ordem Hymenoptera, KERR et al. (1988) seguem o modelo de HARTL & BROWN (1970), fundamentando-se no fato de que todas as espcies de ordens conhecidas e geneticamente prximas aos Hymenoptera tm fmeas XX (Strepsiptera, Coleoptera, Diptera, Megaloptera e Siphonaptera). Os grupos haplodiplides conhecidos e os parentes haplodiplides filogeneticamente mais prximos, tm fmeas XX: Micromelthas depilis (Coleoptera) e Acarina; Coccoidea e Aleyroidea, prximos de Hemiptera, apresentam fmeas XX (KERR, 1996). KERR (1996) sugere que o gene em questo seja curto (poucos nucleotdeos), visto que o nmero de heteroalelos encontrado foi entre 7 a 24. Em Apis mellifera MACKENSEN (1955), LAIDLAW et al. (1956) e ADAMS et al. (1977) encontraram 11; 12 e 18,4 alelos xo, respectivamente. KERR (1987b) encontrou 20 alelos em Melipona compressipes fasciculata. CARVALHO et al. (1995) encontraram de 7 a 24 alelos em Melipona scutellaris. As experincias de WOYKE (1976) demonstram que uma populao com menos de 6 alelos xo, isto , menos de 44 colnias, pode ser extinta em cerca de 15 geraes (YOKOYAMA & NEI; KERR, 1996). Em Apis mellifera as larvas de zanges com 2 a 3 dias de vida so comidas pelas operrias (WOYKE, 1963). Em Melipona quadrifascita, Melipona compressipes e Melipona scutellaris, os machos diplides chegam fase adulta ou imago e ento so mortos pelas operrias, bem como as rainhas que os produzem (CAMARGO, 1982; KERR,1987; CARVALHO et al., 1995). Desta forma, deve-se manter mais de 44 colnias numa mesma rea de reproduo (YOKOYAMA & NEI, 1979) para que a populao no seja extinta em 15 geraes. A manuteno de populaes pequenas com menos de 44 colnias da mesma espcie, promove a diminuio do nmero de alelos sexuais xo induzindo a produo de machos diplides (KERR & VENCOVSKY, 1982). Quando h produo de machos diplides numa colnia de meliponneo, a rainha eliminada pelas operrias e a colnia tende a morrer por falta de operrias e de rainha (CAMARGO, 1982; KERR 1987). Em regies onde o nmero de colnias baixo, elas tendem a desaparecer devido formao de alelos xo em homozigose e isto ocorre com freqncia nas pequenas reservas de matas primrias que so conservadas (AIDAR, 1996a, 1997b) e nos criadouros que tenham poucas colnias. Nos insetos, a capacidade de explorao dos recursos alimentares, de encontrar parceiros reprodutivos e, conseqentemente, o sucesso ecolgico das espcies esto intimamente relacionados distribuio geogrfica dos indivduos no seu habitat natural (PRICE, 1984; ROUBIK, 1989). A distncia de vo das espcies de abelhas fornece dados que auxiliam o estudo da rea de reproduo e de distribuio da populao geneticamente ativa da regio estudada. Em reas onde os desmatamentos so freqentes, esses dados permitem-nos avaliar as possibilidades de homozigose dos alelos xo e de endogamia das espcies, bem como a disponibilidade de alimento prximo s colnias (ROUBIK, 1989). GARY (1992) cita que M.J.E. Spitzner, em 1788, descreveu pela primeira vez a dana das operrias para comunicar a fonte de nctar. FRISCH (1984) estudou os mecanismos de orientao existentes em abelhas e concluiu que a posio do sol, as paisagens locais e os odores das fontes de alimento (floradas) auxiliam na navegao das abelhas. LINDAUER (1971) demonstrou que as operrias de Apis mellifera conseguem compensar o movimento do sol em sua informao. KERR (1994b) demonstrou que o mesmo ocorre com Trigona spinipes. KERR (1959) fez experimentos empregando alimentador coletivo com xarope de acar deslocando-o a distncias cada vez maiores para avaliar a distncia de vo de vrias espcies e obteve os seguintes resultados: Melipona quadrifasciata coletou xarope at 2000 m; Trigona spinipes, at 840 m; Plebeia droryana, at 540 m; Trigona amalthea, at 980 m; Apis mellifera, at 2800 m. KERR (1987a) treinou Melipona compressipes fasciculata Lep. a buscar xarope num alimentador coletivo e conseguiu afastar operrias distncia de 2470 m. O autor cita que a florada de siriba (Avicennia nitida) impediu a continuidade dos experimentos, pois as abelhas deixaram o alimento artificial para coletar nctar das suas flores. As espcies Trigona iridipennis, Apis cerana indica e Apis florea voam at 120, 700 e 400 m, respectivamente (LINDAUER, 1971). ROUBIK & ALUJA (1983) mostraram que Cephalotrigona capitata e Melipona fasciata voltam de 1650 e 2400 m, respectivamente. O raio de ao das castas reprodutivas (zanges e rainhas) pode determinar se a populao est isolada reprodutivamente de outras populaes e assim pode-se determinar o grau de consanginidade dessa populao e saber se ela est em equilbrio e livre de ser extinta. Durante o vo para acasalamento, as rainhas e zanges atingem distncias maiores do que as operrias. WILLE (1983) cita que a distncia de vo de operrias de Tetragonisca angustula em torno de 600 m. KERR (c.p.) prope que operrias desta espcie explora os recursos florais at uma distncia de 80 m.

6 1.4. POLIMORFISMO ENZIMTICO EM POPULAO DE Melipona quadrifasciata.Pouco se conhece sobre variabilidade proteica em Melipona quadrifasciata Lep. Os primeiros trabalhos sobre sistemas polimrficos em Melipona foram de CONTEL (1972) e CONTEL & MESTRINER (1974), que estudaram 54 colnias de Melipona subnitida Ducke, empregando a tcnica de eletroforese. Foram identificados 3 tipos de esterases, esterase 1, esterase 2 e esterase 3, com controle gentico independente e foi observado polimorfismo em 2 locos (EST-2 e EST-3). A maior parte dos estudos relacionados a enzimas de abelhas foram realizados tendo como material biolgico abelhas do gnero Apis (LIMA, 1978). FALCO (1984) estudou 10 espcies de meliponneos e encontrou polimorfismo para a malato desidrogenase e isocitrato desidrogenase em 3 espcies. A mesma autora detectou polimorfismo para uma forma de esterase em 4 espcies. YONG (1986) tambm encontrou polimorfismo nos meliponneos com relao a malato desidrogenase (MDH) e isocitrato desidrogenase (IDH). CONTEL (1980) analisando 51 meliponneos do Amazonas encontrou 4 espcies com polimorfismo para MDH. KERR & KRAUSE (1950) e CONTEL & KERR (1976) mostraram que em Melipona os acasalamentos ocorreram com apenas um zango. FALCO & CONTEL (1991a) no encontraram variabilidade gentica ao estudarem a enzima mlica em 9 espcies de meliponneos. As mesmas autoras, estudando 3 colnias de Plebeia droryana de Londrina, PR, sugeriram que as rainhas copulam em 11% com mais de um zango ou existe mais de uma rainha fisogstrica numa mesma colnia (hiptese considerada menos provvel) porque a segregao para MDH e PGM foi de dois tipos de homozigotos em adio ao heterozigoto. FALCO & CONTEL (1991b) estudando 10 espcies de abelhas brasileiras sem ferro: Melipona compressipes Fabricius; Melipona marginata marginata Lepeletier; Melipona quadrifasciata anthidioides Lepeletier; Plebeia droryana; Friesella schrottkyi Friese; Partamona helleri; Scaptotrigona bipunctata; Scaptorigona postica postica; Tetragonisca angustula Latreille Nannotrigona testaceicornis testaceicornis Lepeletier, mostraram que apenas Melipona quadrifasciata anthidioides. apresentou polimorfismo para a enzima SOD. CONTEL (1972) e CONTEL & MESTRINER (1974) propuseram que ocorre monomorfismo em esterases de Melipona quadrifasciata. Neste trabalho foi investigado polimorfismo enzimtico em populaes de Melipona quadrifasciata Lep. por meio da eletroforese em gel de amido para avaliao da variabilidade gentica com relao s enzimas esterase (EST), isocitrato desidrogenase (IDH), enzima mlica (ME), fosfoglicomutase (PGM), superxidodismutase (SOD), -glicerofosfato desidrogenase (PGD), malato desidrogenase (MDH), leucina aminopeptidase (LAP), hexoquinase (HK) e fosfoglicoisomerase (PGI).

1.5. Manuteno das Colnias EXPERIMENTAISEste item no poderia deixar de ser includo, pois a prtica da meliponicultura compreende trabalho exaustivo que envolve tcnicas apuradas de manejo e muitas horas de trabalho (NOGUEIRA-NETO, 1948, 1970; AIDAR, 1994, 1995a, b, 1996a; AIDAR et al. 1995; KERR et al., 1996). Sem manejo adequado, no existe a possibilidade da manuteno de colnias de meliponneos em bom estado por longos perodos, principalmente colnias que esto sendo submetidas a estresse e revises freqentes para coleta de dados. Quando lidamos com espcies extintas em algumas regies e de difcil aquisio de colnias para experimentao, como o caso da mandaaia (Melipona quadrifasciata), p-de-pau (Melipona bicolor Lep.) e uruu-amarelo (Melipona rufiventris), na regio de Ribeiro Preto, SP, a manuteno e diviso de matrizes a nica forma racional para aquisio de material biolgico para os experimentos (AIDAR, 1995b). Quando ainda havia florestas nativas nessa regio, a mandaaia, a p-de-pau, a manduri, a mandaguari e a uruu-amarelo eram espcies encontradas naturalmente nas matas. Por no existirem rvores perto dos laboratrios, apenas com manejo adequado e tcnicas de alimentao e formao artificial de novas colnias (AIDAR & CAMPOS, 1994; AIDAR, 1994 e 1995a e b), que existe a possibilidade de manter colnias fortes de mandaaia para estudos cientficos. O Meliponrio-A, onde a maioria dos esperimentos foi realizada, compreende uma populao de 70 colnias de mandaaia, 30 de Tetragonisca angustula, e outras espcies com menor nmero de colnias, teve incio por volta de 1980 com 3 colnias de jata e uma colnia de mandaaia proveniente do municpio de Orlndia, SP, que fra encontrada em tronco de Psidium sp (goiabeira brava) derrubada por lenhadores da regio. Outras colnias, bem como rainhas fisogstricas, de outras regies do pas foram introduzidas ano a ano para manter o nmero de alelos sexuais e evitar a consanginidade na populao de abelhas do meliponrio. As abelhas, como todos os organismos, requerem protenas, carboidratos, sais minerais, vitaminas e lipdios para um desenvolvimento orgnico compatvel com o seu potencial gentico. O nctar fornece os carboidratos; o plen, fornece os aminocidos, os lipdios, os minerais e as vitaminas (HEBERT Jr., 1992).

7Mesmo havendo disponibilidade de flores com bom nctar e bom plen, as colnias fracas no apresentam nmero de campeiras suficiente para a execuo de forrageamento intenso, o que retarda o desenvolvimento da colnia. Com alimentao extra, o desenvolvimento destas colnias pode ser acelerado (AIDAR & CAMPOS, 1994). A elaborao do alimento artificial para abelhas exige conhecimento das necessidades nutricionais desses insetos e cuidado com algumas substncias txicas, como a lactose, por exemplo (BARKER & LEHNER, 1972b). WALLER (1972) e FRISH (1934) demonstraram que operrias de Apis mellifera preferem a sacarose a outros acares como fonte de energia, alm de apresentar alto valor nutritivo quando comparado aos outros acares estudados (BARKER & LEHNER, 1972a). A alimentao artificial para meliponneos necessria devido falta de flores como fonte de nctar e plen, e tambm quando o nmero de colnias superior capacidade de suporte local. Neste ltimo caso esto includos os meliponrios de produo e experimentais (ZUCOLOTO, 1994; AIDAR, 1995). Desta forma, vrias composies de propores diferentes de gua e acar (NOGUEIRA-NETO, 1970), plen, mel de meliponneos e de Apis, bem como suplementos vitamnicos (KERR, 1987; AIDAR, 1994), so citados em literatura e utilizados com sucesso. CAMARGO (1974) desenvolveu uma dieta semi-artificial para meliponneos por meio da fermentao natural do plen de Thypha dominguensis (taba), acrescentando 30 ml de mel e uma amostra de plen da espcie que se deseja fornecer este alimento semi-artificial para fermentao. Aps 30-40 dias o alimento est pronto para ser fornecido s abelhas. Rainhas de Melipona, recm-fecundadas, confinadas com operrias que receberam apenas essa dieta semi-artificial, desenvolveram ovrio e iniciaram postura, demonstrando no estarem com deficincia nutricional que afetasse as funes orgnicas observadas. A mesma autora demonstra que a tcnica pode ser utilizada para Scaptotrigona sp. O levedo de cerveja, o plen de outras espcies de abelhas e o sal comum, como fonte de sdio e cloro foram objeto de estudos de ZUCOLOTO (1994), mostrando que outros nutrientes tambm so requeridos pelas abelhas. O fornecimento de plen "in natura" para mandaaias pode ser de duas formas: Internamente nas colmeias, em potes artificiais (AIDAR & CAMPOS, 1994 e AIDAR, 1995b) ou naturais e externamente s colmeias, em alimentador coletivo (AIDAR, 1996b).

2. OBJETIVOSEstimar nmero de alelos xo na populao de Melipona quadrifasciata Lep. e a sua variao antes e aps a introduo de rainhas acasaladas com zanges de outras populaes. Verificar possveis acasalamentos com mais de um zango em Melipona quadrifasciata Lep. Neste caso, deveriam aparecer 25% de machos diplides. Estudar a variabilidade gentica na populao de Melipona quadrifasciata por anlises isoenzimticas. Estimar a populao de alelos xo em populao de Tetragonisca angustula Lat. Determinar a diploidia dos zanges das colnias que produzem 50% de machos e 50% de fmeas por meio da eletroforese. Desenvolver metodologia para a manuteno da variabilidade gentica e manuteno de meliponrios em reas urbanas.

3. MATERIAL E MTODOS3.1. Nmero de alelos xo na populao de Melipona quadrifasciata.Os experimentos foram realizados no Meliponrio-A, localizado em rea urbana, na Rua Jos da Silva, 868, Jardim Paulista, Ribeiro Preto, SP. O meliponrio constitudo por 80 colnias de Melipona quadrifasciata Lepeletier; 11 de Melipona favosa orbignyi Guerin; 23 de Tetragonisca angustula Latraille; entre outras colnias de trigonas como Scaptotrigona sp, Friesella schrottkyi Friese e Plebeia sp. As divises de colnias para contagem de machos diplides foram executadas sempre em pocas de boas floradas, ou seja, para as condies de Ribeiro Preto, SP, de setembro a maro. poca em que esto sendo produzidos zanges com maior freqncia. As colnias de mandaaia foram iniciadas com 2 favos nascentes, contendo 100 clulas cada um, em mdia; alimento (Xarope-A e plen); 80 a 100 abelhas campeiras e 50 a 80 abelhas jovens, no mnimo. O nmero de indivduos de cada idade empregado na formao das colnias pode variar de acordo com a disponibilidade, mas nunca este nmero deve ser inferior a 50, pois isso evita a perda da colnia por falta de operrias. Normalmente, o nmero de campeiras ou operrias adultas foi maior, ou seja, de 100 a 120 abelhas.

8Todas as colnias foram formadas em orfandade seguindo o Mtodo 2 desenvolvido por AIDAR (1995a). As colmias utilizadas foram do tipo cbicas medindo 20cm internamente e paredes com espessura maior do que 2 cm. Em sua fase inicial, a colnia foi alimentada com Xarope-A de 2 em 2 dias na quantidade mxima de 30 ml por alimentao, podendo variar conforme o consumo da colnia. O plen de abelhas africanizadas foi previamente fermentado usando como inoculante inicial 5% de plen de Scaptotrigona sp (mandaguari) mais gua, at a mistura estar com textura de pasta. O tempo de fermentao variou de 28 a 40 dias. O plen fermentado foi ministrado em potes de cera fechados para evitar ataque de fordeos (AIDAR, 1995a). Cada colnia inicial recebeu o equivalente a 1 pote natural de plen a cada 15 dias, conforme as condies de floradas da poca. Nos meses de maio a agosto, poca sem muitas floradas na regio urbana de Ribeiro Preto, mais potes foram fornecidos conforme o consumo da colnia. Os clculos para determinao do nmero de alelos xo na populao foram feitos com base nos estudos de LAIDLAW et al. (1956) e metodologia de KERR (1987b), onde: n=2(n+1)/(H+1) e S=n2(n-2)/2(N+2) Sendo n o nmero de alelos xo; H o nmero de colmias experimentais com 50% de machos diplides; N o nmero total de colmias experimentais e S o erro padro. Pupas-olho-claro de operrias e machos das colnias que apresentaram 50% de machos e fmeas foram analisadas microscopicamente para contagem de cromossomos seguindo o mtodo de IMAI et al. (1977) e IMAI, et al. (1988). Foram retirados os testculos das pupas e o material preparado em lmina foi corado com giemsa mais tampo fosfato 1:30. A contagem do nmero de cromossomos foi feita sob microscpio ptico com lente de imerso. Normalmente, as colnias apresentam 100% de crias fmeas e raramente 100% de machos. Este segundo caso, somente ocorre quando a rainha no foi inseminada. O aparecimento de 50% de machos e 50% de fmeas, indica que os machos so diplides, devido ao acasalamento entre parentes. WOYKE (1963 e 1967) demonstrou que em Apis mellifera, 50% da cria de uma rainha fecundada por um nico macho seu irmo, morria devido eliminao das larvas machos (machos diplides) pelas operrias. Em Melipona a proporo de 1:1 entre machos e fmeas indica que a rainha que os produziu acasalou-se com zango parente e os seus filhos so diplides (CAMARGO 1976 e KERR, 1987). Desta forma, de acordo com a bibliografia estudada, sempre que houveram propores de 1:1 entre machos e fmeas, considerou-se que os machos eram diplides. A observao do primeiro favo da colnia filha foi feita com auxlio de estereomicroscpio Zeiss (40x) 40 a 45 dias aps iniciada a postura pela rainha fisogstrica. As clulas dos favos foram abertas inferiormente de forma a expor a extremidade posterior do abdome das pupas e foram observados a presena dos gonstilos nestas crias, o que caracterstica dos machos. Os favos no muito danificados pela manipulao e aqueles que no apresentaram 50% de machos, foram devolvidos s colnias aps a contagem de fmeas e machos para no prejudicar o desenvolvimento das colnias.

3.1.1. Seleo das colnias para cruzamento com populaes do Esprito Santo.De 78 colnias de Melipona quadrifasciata do Meliponrio-A, foram selecionadas 10 para serem orfanadas e levadas a 3 diferentes meliponrios do Esprito Santo, para que as novas rainhas acasalassem com machos no aparentados e de populaes diferentes. As colnias selecionadas foram: 7, 15, 20, 25, 40, 53, 60, 62, 71 e 74. O critrio de seleo das colnias foi a condio de terem no mnimo 4 favos de crias e potes de alimento de reserva suficiente para que as abelhas suportassem o estresse da orfandade, transporte e mudana de local. Estas colnias foram orfanadas 2 dias antes de serem levadas para o Esprito Santo. As rainhas retiradas das colnias mes foram guardadas em gaiolas para transporte contendo alimento e abelhas jovens. As gaiolas foram dispostas em maleta para transporte at a introduo em colnias iniciais do Meliponrio-A. A coleta das rainhas fisogstricas foi mediante o uso de tubo plstico transparente, aberto nas duas extremidades medindo 4 x 2 cm. Este tubo foi colocado verticalmente em cima da rainha de forma a aprision-la quando caminhava sobre os favos de crias. Assim que a rainha comeava a subir dentro do tubo, este era retirado e tampado nas duas extremidades. Algumas rainhas foram coletadas manualmente, com o dedo indicador e polegar sem a utilizao de instrumentos. As pinas so desaconselhadas por poderem causar ferimentos ou mortes das rainhas. As colnias rfs foram alimentadas com Xarope-A, em potes artificiais feitos com cera de abelhas africanizadas (AIDAR, 1995b), um dia antes de serem fechadas e levadas para os locais de fecundao. Na noite

9anterior ao transporte, os orifcios de entrada das colmias foram fechados com tela metlica de malha fina que fora presa com auxlio de fita adesiva. Os recipientes plsticos utilizados para armazenar xarope foram lavados e esterilizados em forno microondas (LATIMER & MATSEN, 1977; SANBORN et al., 1982) para evitar o crescimento de microorganismos que pudessem promover reaes qumicas como a fermentao. Isto comum em recipientes com solues aucaradas e vitaminadas como o Xarope-A. As colnias foram transportadas em veculo de passeio (Gol-S1.6 a lcool, 1984) at os locais de fecundao. O transporte foi realizado durante a noite para evitar o calor excessivo e possveis mortes de crias e abelhas adultas, j que a distncia percorrida foi de aproximadamente 1.000 km, com durao de 10 horas.

3.1.2. Distribuio das colnias nos Meliponrios do Esprito SantoChegando ao local de fecundao, municpios de So Paulo do Ara e Domingos Martins, ES, algumas colnias foram colocadas em cavaletes coletivos de ferro e outras foram dispostas conforme as condies locais. Em alguns lugares no foram utilizados cavaletes de metal por apresentarem local adequado acomodao das colmias de forma segura e prtica. As colmias permaneceram no Esprito Santo para fecundao durante 10 dias, de 2/4/97 a 12/4/97. Aps este perodo, as colmias foram transferidas para o Meliponrio-A, em Ribeiro Preto, SP, pelo mesmo processo de transporte citado anteriormente. Dez dias foi o tempo estimado para que as rainhas virgens fossem aceitas pelas colnias e fecundadas por machos da regio ao realizarem o vo nupcial. Durante este perodo, as colnias foram alimentadas duas vezes em revises rpidas procurando evitar estresse excessivo colnia. Aps o perodo de dez dias, as colnias foram levadas ao Meliponrio-A e dispostas no mesmo local que ocupavam anteriormente. Foram monitoradas at os primeiros favos de crias atingirem idade de 40 dias para contagem da proporo de machos e fmeas pelo mesmo mtodo descrito no tem 3.1. para avaliao de acasalamentos consangneos.

3.1.3. Colnias rfs acasaladas no Esprito Santo e diviso no Meliponrio - A.Aps a contagem da proporo de machos e fmeas, as colnias com rainhas acasaladas com zanges do Esprito Santo foram manejadas conforme AIDAR (1996a) at atingirem desenvolvimento para serem divididas (nota 7,0). Neste estgio, as colnias foram orfanadas e a nova rainha acasalada com zanges do Meliponrio-A. Suas crias foram monitoradas para avaliao da proporo de machos e fmeas. Para pegar a rainha utilizou-se o tubo plstico. Quando a rainha era avistada o tubo foi colocado sobre ela de maneira a deix-la presa e possibilitada de subir nas paredes internas do mesmo. Neste momento o tubo foi retirado da colmia e vedado nas duas extremidades com a rainha em seu interior. Depois de estar fechada, a colmia ficou em repouso durante 15 dias para que o processo de substituio de rainha no fosse interrompido. Aps este perodo a colmia foi aberta para observao da presena de favos novos, o que indica a presena de rainha fisogstrica. Aps 40 dias, os primeiros favos de crias foram avaliados quanto proporo de machos e fmeas para averiguao de possveis acasalamentos consangneos pela contagem da proporo de machos e fmeas. Utilizando o Mtodo 1 para formao de colnias (AIDAR, 1996a), novas colnias foram formadas com as rainhas acasaladas no Esprito Santo e mantidas na mesma rea de reproduo do Meliponrio-A. Novas colnias foram formadas para monitoramento do nmero de alelos xo no Meliponrio-A depois da introduo de rainhas acasaladas com populaes diferentes.

3.2. Nmero de alelos sexuais xo na populao de Tetragonisca angustula .O mtodo utilizado para determinar o nmero de alelos sexuais na populao de Tetragonica angustula no Meliponrio-A foi o mesmo utilizado para estimar o nmero de alelos na populao de Melipona quadrifasciata. Com a espcie Tetragonisca angustula, o mtodo para formao de novas colnias consistiu em dividir as colnias matrizes deixando a colnia filha com 4 a 5 favos de crias nascentes ou pupas ainda em desenvolvimento e campeiras. Para a aquisio de campeiras a colnia filha foi colocada no local da colnia matriz e esta afastada de 10 a 500 m de distncia, conforme a disponibilidade de local para acomodao das colmeias.

10Coletou-se as abelhas jovens por meio de aspirador de insetos e colocando-as nas colnias filhas. Estas abelhas so facilmente reconhecidas por apresentarem colorao mais clara que as adultas e quase sempre, quando se retira um favo nascente de jata, muitas abelhas jovens esto aderidas aos favos. Desta forma, as abelhas jovens tambm podem ser transferidas para a nova colnia e so caracterizadas pela colorao esbranquiada que possuem nos primeiros 5 dias de vida. Favos de plen e mel foram coletados, ou da colnia matriz ou de outras colnias com mais reservas, para suprir de alimento a colnia recm formada. Os potes de plen e de mel que foram danificados ou abertos durante a manipulao, no foram colocados na colnia filha antes de serem bem lavados e secos, para evitar o ataque de fordeos, formigas e outros predadores. Quando os favos de crias nascentes colocados nas colnias filhas no apresentavam realeiras, estas foram coletadas de outras colnias. Preferencialmente, as realeiras estavam em estgio final de desenvolvimento para que a colnia filha no ficasse muitos dias sem rainha promovendo crescimento mais rpido da colnia formada. A colorao clara das realeiras caracteriza este estgio. Aps alguns dias a nova rainha realizava o vo nupcial e iniciava postura. Estes favos novos foram observados aps 35 dias, fase do desenvolvimento em que as crias esto no estgio de pupa com olho rosa. A observao do primeiro favo da colnia filha foi feita com auxlio de estereomicroscpio Zeiss (40x). As clulas dos favos foram abertas pela parte inferior, de forma a expor a extremidade posterior do abdome das pupas. Foram observados a presena dos gonstilos nestas crias seguindo a mesma metodologia usada no experimento com mandaaias. Foram colocados am cada colnia experimental vidros para observao do desenvolvimento do ninho. Este vidro foi disposto entre a tampa e a colmia e apresentava 4 mm de espessura. Normalmente, as colnias apresentam 100% de crias fmeas e raramente 100% de machos. Este segundo caso ocorre quando a rainha no foi inseminada ou fecundada., podendo tambm, aparecer 50% de machos e 50% de fmeas que, segundo a literatura, representa acasalamento consangneo com a produo de machos diplides. Em geral, todas as colnias filhas foram formadas entre os meses de setembro a maro. poca em que no h carncia de floradas e existe uma produo contnua de machos desta epcie na regio de Ribeiro Preto, SP, onde foram realizados os experimentos.

3.3. Polimorfismo enzimtico em populao de Melipona quadrifasciata.Cinqenta e duas colnias do Meliponrio-A foram amostradas e foram coletadas 8 operrias de cada uma para serem submetidas a anlises por eletroforese em gel de amido ou de penetrose, conforme a disponibilidade do material no momento. A tcnica empregada para IDH, MDH, EST, ME e LAP foi a mesma de CASTANHEIRA & CONTEL (1995); HK, PGI, PDH, SOD e PGM foram analisadas segundo SANCHEZ (1996). Aps a anlise de 8 indivduos por colnia em 12 colnias e no sendo encontrado polimorfismo, foram feitas amostragens das outras colnias onde foram analisados 4 indivduos para cada sistema no polimrfico. As operrias foram coletadas mediante aspirador de insetos ou com auxilio de vidro de boca larga (450 ml). No primeiro caso, a colmeia foi aberta e as operrias aspiradas. No segundo caso, o vidro foi colocado na entrada da colmeia e com o formo apcola ou um pedao de madeira, bateu-se ritimadamente na parede da colmeia at a sada de 10 operrias. Esta operao demora 30 segundos, aproximadamente, para as colnias com notas acima de 6,0 (AIDAR, 1996a). As abelhas foram examinadas sob lupa para confirmao do sexo antes de serem submetidas eletroforese. A confirmao do sexo das abelhas coletadas foi feita mediante a observao das unhas do inseto, ou seja, unhas duplas referem-se a machos e unhas simples a fmeas. Os sexos tambm foram diferenciados por meio da observao da presena do tufo de plos localizados na extremidade posterior do abdome dos machos. Vrias so as caractersticas morfolgicas que podem ser usadas para diferenciar machos de fmeas nas abelhas, mas a unha dupla e a presena do tufo de plos foram as duas diferenas usadas por serem mais aparentes e rpidas. As estimativas das freqncias gnicas foram feitas utilizando-se o programa FREGEN do pacote GENIOC (CABELLO & KRIEGER, 1997). O XX2 de heterogeneidade foi usado na comparao entre as 3 populaes de Melipona quadrifasciata analisadas, isto , na populao do Meliponrio-A, em Ribeiro Preto, SP; na populao do Esprito Santo e na populao hbrida.

11 3.4. Manuteno das colnias experimentais. 3.4.1. Alimentao proticaNaturalmente, operrias de mandaaia no coletam alimento slido em alimentadores coletivos. Isto nos levou a utilizar uma metodologia que pudesse estimular as campeiras a coletar plen fora do estame floral, ou seja, em alimentadores coletivos. Foram usados alimentadores coletivos com 10 cm de dimetro por 2,5 cm de altura, para Xarope-A, o qual foi denominado Alimentador 1. O Alimentador 2 media 20 x 10 x 2,5cm, e foi usado para PCA (85% de plen em p, 10% de canela em p e 5% de acar cristal). A canela, o plen e o acar foram misturados em liquidificador domstico para homogeneizao da mistura. O plen utilizado foi coletado das corbculas de campeiras de abelhas africanizadas com auxlio de coletor de plen ou comprado em casas especializadas que coletam-no pela mesma metodologia. Este plen foi desidratado e modo em liquidificador antes de ser misturado canela e ao acar. A esta mistura deu-se o nome de PCA. Inicialmente, foi fornecido Xarope-A durante 3 dias seguidos no Alimentador 1 a 5 metros da periferia do meliponrio e a mesma hora do dia. Aps este perodo de condicionamento das campeiras foi colocado o Alimentador 2 junto ao Alimentador 1, de forma a ficarem encostados. O Alimentador 2 foi disposto sob o trajeto de vo das campeiras que deixavam o Alimentador 1. Quando as campeiras retornam para a colmia, realizam trajetria retilnea. Assim, grande nmero de campeiras caam ou andavam sobre o PCA no Alimentador 2 e voltavam para as colnias impregnadas com o p. A exposio dos alimentadores para as abelhas foi de 3 horas a cada dia e durante o perodo da tarde, horas mais quentes do dia e que no h atividade intensa de coleta de plen nas flores, para a espcie Melipona quadrifasciata. No final da exposio dos alimentadores coletivos, estes eram esvaziados, lavados e secos para uso posterior. Para as abelhas no se afogarem no xarope foi colocado uma placa de madeira fina circular, com mais ou menos 3 mm de espessura e 2 a 3 mm menor do que o dimetro do alimentador. A madeira foi perfurada para aumentar a rea de contacto das abelhas com o xarope.

3.4.2. Controle do principal predador: O Fordeo Pseudohypocera sp.O fordeo um dptero que se alimenta de material orgnico em decomposio (frutas, principalmente). A fase larval adaptou-se muito bem ao consumo de plen. Quando dentro da colnia de meliponneo, seus ovos so postos preferencialmente no plen armazenado pelas abelhas e suas larvas se alimentam deste plen causando srios danos colnia. Esta, quase sempre morre aps alguns dias de invaso, caso no haja interveno do meliponicultor no sentido de eliminar o parasita. Cada postura pode originar at 70 indivduos adultos aps 3 dias. Trs fases compreendem o ataque de fordeos a uma colnia de meliponneo e a partir desta diviso foram empregados os mtodos para controle. A. Fase inicial A.1. Diagnstico: Alguns fordeos caminham pelas paredes internas da colmia (5-10), podendo haver larvas na lixeira mas no nos potes de alimento. A.2. Tratamento. A.2.1. Levar a colmia para dentro de um cmodo fechado e assoprar vrias vezes por entre os potes de alimento e pelo invlucro do ninho, at sarem todos os fordeos. A.2.2. Cobrir a lixeira com uma camada de sal comum de 0,5cm de altura e levar a colmia para seu local de origem. A.2.3. Matar os fordeos que ficaram presos no cmodo; a maioria pousa no teto e so fceis de serem mortos. A.2.4. Repetir a operao 1.2.2. duas vezes ao dia durante 3 a 4 dias. B. Fase intermediria B.1. Diagnstico: muitos fordeos (+ de 20) caminham nas paredes internas da colmia; larvas no piso, parede e lixeira da colmia; podendo haver casulos de fordeos; no h larvas nos potes de alimento. B.2.Tratamento. B.2.1. Levar a colmia para dentro de um cmodo fechado e assoprar vrias vezes por entre os potes de alimento e pelo invlucro do ninho, at sarem todos os fordeos. B.2.2. Realizar limpeza no piso da colmia e esmagar todos os casulos e larvas.

12B.2.3. Cobrir o piso da colmia com camada de sal de 0,3cm de altura. B.2.4. Repetir a operao 1.2.2. duas vezes ao dia durante 4 ou mais dias, at desaparecerem os fordeos. C. Fase terminal C.1. Diagnstico: muitos fordeos (+ de 50) dentro da colmia, principalmente na face interna da tampa; larvas e casulos espalhados; potes de alimentos infestados por larvas e alguns com aparncia mida na regio externa; a rainha cessa a postura. C.2. Tratamento. C.2.1. Preparar uma nova colmia para receber a colnia infestada que ser desmembrada e transferida de colmia. C.2.2. Levar as duas colmias para um cmodo fechado. C.2.3. Transferir para a nova colmia apenas os favos de crias claros (nascentes), rainha e abelhas. Alimentar com xarope, em potes artificiais apenas para o suprimento dirio da colnia que ser alimentada diariamente at o desaparecimento de todos os fordeos. C.2.4. A antiga colmia dever ser desinfetada com fogo (flambar com lcool ou com maarico) e os fordeos restantes no cmodo fechado devero ser mortos. D. Profilaxia D.1. Nunca abrir uma colmia infestada por fordeos ao ar livre ou nas imediaes do meliponrio para no contaminar o ambiente. D.2. Manter o meliponrio sempre limpo, livre de material em decomposio e restos de colnias mortas ou colmias desabitadas com restos de colnias: cera, potes de alimento vazios, etc. D.3. As colnias iniciais devero estar sempre populosas (mais de 180 campeiras) e sem potes de plen. D.4. No danificar potes de plen durante as revises. D.5. A alimentao artificial deve ser progressiva (AIDAR, 1996a) para evitar excesso de alimento dentro da colmia. D.6. O prprio meliponicultor pode proporciona condies favorveis aos fordeos quando no adota hbitos de higiene com relao aos resduos de colnias mortas ou manipuladas. Restos de cera e colmias velhas abandonadas so abrigos para os fordeos.

4. RESULTADOS E DISCUSSO4.1. Alelos sexuais xo em populao de Melipona quadrifasciataAntes da introduo das colnias acasaladas no Esprito Santo na populao de Melipona quadrifasciata, 15 colnias foram formadas e 3 colnias apresentaram machos diplides (Tabela 1). Desta forma, 8 alelos xo (s=0,58) foram encontrados na populao original. Mostrando estabilidade da populao com relao ao Efeito Yokoyama e Nei (YOKOYAMA & NEI, 1979), j que, o mnimo estabelecido por KERR & VENCOVSKY (1982) so 6 alelos para a populao estar em equilbrio.TABELA 1. Colnias de mandaaia formadas antes da introduo de colnias do Esprito Santo Nmero da Data Incio de Dias p/ Data de Nmero de Machos n Machos 2n Colnia Inicial Postura Postura Contagem Fmeas 56 26/09/96 10/11/96 45 23/12/96 19 0 0 57 26/09/96 02/11/96 37 20/12/96 21 0 0 59 26/09/96 11/11/96 46 20/12/96 23 0 0 61 29/09/96 07/11/96 40 23/12/96 20 2 0 62 29/09/96 30/10/96 32 20/12/96 19 0 16 64 02/11/96 12/11/96 20 22/12/96 15 0 0 65 19/02/97 10/03/97 19 23/04/97 15 2 0 66 07/01/97 15/01/97 18 25/02/97 16 0 0 67 02/11/96 03/12/96 31 18/01/97 18 0 0 69 20/12/96 10/01/97 21 25/02/97 22 0 0 70 04/11/96 28/11/96 24 12/01/97 17 1 0 72 06/11/96 06/12/96 30 10/01/97 16 0 15 73 07/01/97 15/02/97 38 25/03/97 18 0 0 76 16/01/97 05/02/97 20 25/03/97 27 0 29 77 18/02/97 04/03/97 14 14/04/97 21 0 0 N=15 H=3 n=8 S=3,36

13Onde: N o nmero total de colmias experimentais; H o nmero de colmias experimentais com 50% de machos diplides; n o nmero de alelos xo e S o erro padro. Aps a introduo de 9 colnias contendo rainhas acasaladas com zanges de populaes do Esprito Santo (Tabela 2), 25 colnias filhas foram formadas e 2 apresentaram machos diplides (Tabela 3), indicando que o nmero de alelos xo subiu para 17,33 (s=1,25). Nesta tabela vemos tambm que a mdia de dias entre a orfanao e o incio da postura da rainha foi de 19,7 dias (s=4,85) com amplitude de 14 a 32 dias.TABELA 2. Colnias de mandaaia do Meliponrio - A orfanadas e levadas ao Esprito Santo. Colnia Data de N1 Incio de Dias p/ N2 Data de N3 Fmeas Machos Machos Orfanao Postura Postura Contagem n 2n 7 29/03/97 5,3 16/04/97 18 3,9 22/05/97 5,3 30 0 0 15 29/03/97 5,5 17/04/97 19 4 22/05/97 6 31 0 0 20 29/03/97 6 17/04/97 19 5 25/05/97 5,8 28 0 0 25 29/03/97 5 18/04/97 20 4 26/05/97 6 27 0 0 40 29/03/97 6 19/04/97 21 4,5 22/05/97 5,3 19 0 0 53 29/03/97 5 30/04/97 32 2,8 05/06/97 4 32 0 0 60 29/03/97 4,2 19/04/97 21 4 22/05/97 4,8 35 0 0 62 29/03/97 4,2 15/04/97 17 4 22/05/97 4,5 26 0 0 71 29/03/97 5 12/04/97 14 5,5 22/05/97 5,8 29 0 0 74 29/03/97 5,5 14/04/97 16 5 22/05/97 6 24 0 0

Onde: N1 a nota da colnia no momento da orfanao; N2 a nota da colnia no momento de incio de postura e N3 a nota da colnia no momento da contagem da proporo dos sexos.TABELA 3. Colnias de mandaaia formadas aps a introduo das colnias do Esprito Santo. Colnia Data inicial Incio de Dias p/ Data de Nmero de Machos Machos ou Orf/o Postura Postura Contagem Fmeas n 2n 3 20/03/98 10/04/98 21 21/05/98 18 1 0 9 17/04/98 20/05/98 33 30/06/98 21 0 0 15(ES)orf. 31/01/98 22/02/98 22 30/03/98 23 0 0 20(ES)orf. 27/03/98 08/04/98 12 20/05/98 17 0 0 25(ES)orf. 05/09/97 15/09/97 10 24/10/97 22 0 0 30 17/03/98 15/04/98 29 29/05/98 23 0 0 40(ES)orf. 05/09/97 25/09/97 20 29/10/97 24 0 0 43orf. 22/04/98 30/04/98 8 13/06/98 19 2 0 51 26/10/97 10/11/97 15 15/12/97 20 0 0 71(ES)orf. 17/04/98 28/04/98 11 12/06/98 26 0 0 74(ES)orf. 05/09/97 17/09/97 12 20/10/97 20 0 19 60(ES)orf. 02/04/98 21/04/98 19 05/06/98 21 3 0 62(ES)orf. 01/10/97 15/10/97 14 24/11/97 23 0 0 80 10/01/98 29/01/98 19 10/03/98 20 0 18 85 10/01/98 28/01/98 18 12/03/98 26 2 0 88 10/11/97 28/11/97 18 13/01/98 29 0 0 89 27/10/97 03/12/97 37 06/01/98 27 0 0 90 07/10/97 27/10/97 20 01/12/97 18 0 0 91 05/10/97 23/10/97 18 13/12/97 22 1 0 92 20/11/97 11/12/97 21 13/01/98 24 0 0 93 30/10/97 05/12/97 36 13/01/98 26 1 0 95 30/10/97 02/12/97 33 13/01/97 18 0 0 96 27/11/97 12/01/98 46 13/02/98 25 0 0 98 12/01/98 17/02/98 36 28/03/98 21 0 0 99 06/03/98 30/03/98 24 10/05/98 16 0 0 n=17,33 H=2 N=25 s=9,23

Onde: N o nmero total de colmias experimentais; H o nmero de colmias experimentais com 50% de machos diplides; n o nmero de alelos xo e S o erro padro. As colnias acasaladas com zanges de populaes do Esprito Santo no produziram machos diplides e em apenas uma a rainha no realizou postura devido ao ataque de fordeos, enfraquecendo acentuadamente sem condies de recuperao. Esta colnia foi considerada morta para o experimento em questo. Porm, seus elementos foram empregados na formao de outras colnias. Sendo assim, 90% das colnias apresentaram resultados positivos com relao ao acasalamento fora do Meliponrio-A (Tabela 2).

14Os dados demonstram que para a manuteno de meliponrios experimentais ou comerciais deve-se manter a variabilidade gentica da populao introduzindo novas rainhas ou colnias com rainhas acasaladas com populaes diferentes para evitar que o nmero de alelos xo na populao fique abaixo de 6. YOKOYAMA & NEI (1979) sugeriram que uma populao poder ser extinta em 15 geraes; logo se tivermos menos de 4 alelos ou o nmero de colnias da mesma espcie for inferior a 44, ela sofrer o mesmo efeito. As rainhas virgens de Melipona quadrifasciata das colnias formadas e orfanadas demoraram 22,5 (s=2,12) e 18,0 (s=5,65) dias para fecundar e iniciar postura, respectivamente (Tabela 4). No primeiro caso, a colnia formada passa por um perodo de reorganizao (AIDAR, 1996a) e estruturao dos elementos que a compem para depois iniciar os trabalhos normais de coleta de alimento no campo e aceitao de uma rainha virgem para efetuar o vo nupcial e iniciar postura. Por outro lado, quando a colnia no formada e apenas orfanada, esta se apresenta estruturada e organizada, pronta para aceitao de uma nova rainha. Isto pode explicar o menor perodo que as colnias orfanadas levam para apresentarem postura da nova rainha fisogstrica. TABELA 4. Tempo que as colnias formadas e orfanadas demoraram para formarem rainha fisogstrica e iniciarem postura.Colnias formadas Dias p/ postura 3 9 30 51 56 57 59 61 62 64 65 66 67 69 70 72 73 76 77 80 85 88 89 90 91 92 93 95 96 98 99 31 21 33 29 15 45 37 46 40 32 20 19 18 31 21 24 30 38 20 14 19 18 18 37 20 18 21 36 33 46 36 24 22,5 2,12 Colnias orfanadas 15(ES)orf. 20(ES)orf. 25(ES)orf. 40(ES)orf. 43orf. 71(ES)orf. 74(ES)orf. 60(ES)orf. 62(ES)orf. Dias p/ postura 22 12 10 20 8 11 12 19 14

Total (n) Mdia s

9 -

18 5,65

Onde: s o desvio padro. Mesmo a colnia 74, aps ter sido orfanada no Meliponrio-A, tendo apresentado sinais de acasalamento consangneo, isto , 50% de machos, em nenhum momento apresentou sinais de enfraquecimento. Permaneceu sempre forte at a troca de rainha. Em condies naturais, no campo sem estresse de revises, este fato pode mostrar que uma colnia de meliponneo supera com facilidade a primeira troca de

15rainha. Mas a colnia morre se estiver fraca ou se os acasalamentos consangneos se repetirem consecutivamente. At 17/4/97, 70% das colnias formaram rainha fisogstrica e nenhuma delas apresentou machos diplides. Todas foram colnias vigorosas e tiveram desenvolvimento mais acelerado quando comparadas com as colnias do Meliponrio-A. Isto pode explicar parte do problema que a consanginidade pode causar em populaes finitas de meliponneos ou mesmo demonstrar a diferena existente entre ectipos de regies distintas. A maioria das colnias do Meliponrio-A so parentes entre si e as colnias acasaladas no Esprito Santo tm maior variabilidade gentica porque suas rainhas acasalaram com zanges de populaes com maior variabilidade gentica. O vigor hbrido de populaes vegetais e animais sempre demonstrou melhor adaptabilidade ao meio e maiores produes em geral.

4.1.1. Diferenas entre as colnias do Esprito Santo e do Meliponrio-A.As formas morfolgicas ou fisiologicamente diferentes de animais ou plantas de uma mesma espcie que ocupam o mesmo nicho ecolgico, so chamadas ectipos. As freqncias allicas podem diferir de uma populao a outra quando so feitos estudos de variaes morfolgicas entre diferentes populaes e a eletroforese de enzimas representa ferramenta fundamental para estimar o grau de divergncia nas freqncias allicas. Quanto menor o fluxo gnico entre as populaes, mais diferenas podero ser adquiridas ao longo do tempo evolutivo (FUTUYMA, 1992). Nas populaes de Melipona quadrifasciata de Ribeiro Preto, SP e do Esprito Santo, algumas diferenas entre as colnias foram notadas mediante observao direta das colnias. Com relao cera, as colnias do Esprito Santo apresentaram cera mais escura, mais malevel (elstica) e o aroma mais acentuado (perfumada). As operrias das colnias do Esprito Santo so maiores do que as operrias das colnias do Meliponrio-A e operrias de colnias da regio sul do pas. O nmero de abelhas nas colnias foram relativamente iguais. Os favos de crias so maiores para as colnias do Esprito Santo. Tambm foi observado que essas diferenas no so devidas s influncias ambientais porque as colnias do Esprito Santo trazidas para Ribeiro Preto continuaram apresentando as mesmas caractersticas depois de alguns meses, mesmo estando em colmias semelhantes e mesmo ambiente das colnias do Meliponrio-A. Neste caso, estamos lidando com duas populaes de Melipona quadrifasciata que podem ser classificadas como aloptricas (FUTUYMA, 1992). material biolgico precioso para estudo de evoluo, podendo apresentar bases genticas distintas devido ao isolamento geogrfico que existe entre as duas populaes.

4.1.2. Tempo para as rainhas das colnias rfs iniciarem postura.A mdia de dias para incio de postura nas colnias iniciais de T. angustula e M. quadrifasciata foi semelhante. Isto indica que o processo de substituio de rainhas foi estatisticamente igual, tanto para mandaaia (20,25 dias) como para jata (20,9 dias). As colnias orfanadas iniciaram postura mais cedo do que as colnias formadas. O tempo que a colnia recm formada leva para ter seus elementos (I ,FN ,P ,C , O, etc.) organizados proporcionando condies de produo de clulas de crias e manuteno da temperatura das mesmas maior quando comparado s colnias orfanadas, que tm todos os elementos organizados (AIDAR, 1995) e esto prontas a aceitarem rainha virgem para posterior vo nupcial e iniciar postura.

4.2. Polimorfismo enzimtico em populao de Melipona quadrifasciata.Foi detectado polimorfismo das isoenzimas analisadas em um loco de esterase, o que complementando os estudos de CONTEL (1972) e CONTEL & MESTRINER (1974) que encontraram monomorfismo para esta enzima na populao de Melipona quadrifasciata Lep. estudada. O loco para esterase apresentou 2 alelos segregantes, 51,92% para o Est-S, das colnias (Figura 1). A anlise estatstica dos dados indicou que as 3 populaes de mandaaia possuem freqncias que esto de acordo com o esperado pelo Equilbrio de Hardy-Weinberg (Tabela 5), sendo que aps o teste de XX2 de heterogeneidade (XX2=1,046; gl=1; p=0,3064) foi possvel considerar as 3 populaes como sendo estatisticamente semelhantes ou homogneas FIGURA 1. Perfil eletrofortico das isozimas de esterase de operrias de Melipona quadrifasciata Lep. Representao dos alelos F (superior) e S (inferior) em gel de penetrose 13%.

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TABELA 5. Freqncias allicas (Est-F e Est-S) e genotpicas para um loco de esterase em Melipona quadrifasciata nas populaes de Ribeiro Preto (RP), Esprito Santo (ES) e Hbridos (RP + ES).Populao Total SS SF FF S F XX2 GL p

RP ES x RP ES

346 40 17

232 102 12 0,817917+0,014594 29 11 0 0,862507+0,042004 14 3 0 0,911763+0,051174

0,182081 0,036 0,137493 1,017 0,088237 0,067

1 1 1

0,8495 0,3132 0,7958

Foram encontradas operrias homozigotas e heterozigotas, filhas de uma mesma rainha, para esse loco de esterase. Se a rainha copulou com um s macho, isto mostra que ela obrigatoriamente heterozigota. Caso as operrias da colnia fossem todas homozigotas, certo que a rainha copulou com um ou mais zanges com mesmo alelo seu. Sendo todas as operrias heterozigotas, a rainha acasalou com um ou mais zanges com alelo diferente do seu. Nos cruzamentos onde foi obtida uma descendncia de operrias homozigotas e heterozigotas, a questo era saber se a rainha apresentava homozigose para o mesmo alelo. Caso isso acontecesse, poderia ser afirmado que esta rainha acasalou com mais de um zango, sendo pelo menos um deles portador de alelo distinto aos seus. A verificao desta hiptese implicaria no sacrifcio das rainhas, o que no constituiu metodologia racional para indivduos desta espcie. Desta forma, foi proposto que o assunto ser solucionado por meio de metodologia de anlise de DNA da hemolinfa dessas rainhas, o que no promoveria a morte delas. Quando a rainha acasala-se com um s macho e produz filhas heterozigotas e homozigotas, podemos inferir que esta rainha heterozigota, independente do gentipo do zango. Por outro lado, caso a rainha tenha copulado com vrios machos e apresenta filhas heterozigotas e filhas homozigotas, nada se pode afirmar quanto ao gentipo desta rainha, ou seja, no confirma heterozigose da rainha. KERR & KRAUSE (1950) e CONTEL & KERR (1976) demonstraram que as rainhas de Melipona se acasalam apenas uma vez e com um s zango. Porm, FALCO & CONTEL (1991b) encontraram segregao semelhante em P. droryana para as enzimas MDH e PGM e sugeriram que, ou as colnias desta espcie podem conter mais de uma rainha em atividade de postura (poliginia) ou a mltipla fertilizao ocorre nessas abelhas. A poliginia nunca foi descrita em Melipona quadrifasciata e tambm durante 15 anos de trabalho com Melipona quadrifasciata, nunca observei mais de uma rainha fisogstrica numa mesma colnia. Seria mais provvel o acasalamento com mais de um zango e no mnimo dois deles com alelos distintos. Pelos dados apresentados na Tabela 5 pode-se verificar que o loco codificador dessa esterase polimrfico, sendo que a freqncia do alelo mais raro (F) variou de 8,8 a 18% nas populaes estudadas. Das 52 colnias amostradas, 26 apresentaram operrias nas quais foram observados os dois alelos.

4.3. Alelos sexuais xo em populao de Tetragonisca angustula.Na populao de Tetragonisca angustula foram formadas 33 colnias filhas e nenhuma apresentou 50% de machos diplides (Tabela 6). Seis colnias no foram consideradas colnias experimentais (N) porque no foi observada postura. De acordo com os mtodos de KERR (1987b), estima-se que o nmero de 56 alelos sexuais foram encontrados nessa populao (s=54,03). Isto pode indicar que: A) O nmero de alelos xo muito grande; B) Que a rainha evita machos com alelos iguais aos seus; C) Que as operrias eliminam os machos com xo igual ao seus ou D) Que h fecundao com mais de um macho. TABELA 6. Colnias de jata do Meliponrio-A formadas para estimar o nmero de alelos xo na populao.Nmero Colnia 1 2 da Data Inicial 02/12/96 14/01/96 Incio de Dias p/ Postura Postura 15/12/96 13 01/02/96 18 Data de Contagem 19/01/97 12/03/97 Nmero de Machos Fmeas n 0 42 30 0 Machos 2n 0 0

173 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 14a(orf.) 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 61 69 70 n=56 H=0 14/01/96 17/03/96 08/01/97 09/01/97 21/02/97 19/03/97 10/10/95 20/09/95 14/01/96 27/08/96 27/08/96 29/08/96 13/03/98 27/08/96 27/08/96 25/03/97 09/10/97 02/12/97 21/12/95 27/08/96 04/03/96 24/08/95 20/08/97 25/11/97 05/12/97 06/04/96 29/08/96 05/04/98 19/02/98 19/02/98 15/02/98 N=27 s=54,03 03/02/96 12/04/96 30/01/97 02/02/97 05/03/97 07/04/97 20/10/95 20/10/95 01/02/96 15/09/96 16/09/96 16/09/96 25/03/98 17/09/96 22/09/96 10/04/97 30/10/97 15/12/97 08/01/96 20/09/96 30/03/96 20/09/95 05/09/97 07/12/97 12/01/98 14/05/96 21/09/96 02/05/98 13/03/98 11/03/98 25/02/98 20 26 22 34 12 19 10 30 18 19 20 18 12 21 26 16 21 13 18 24 26 27 16 12 38 38 23 27 22 20 10 689 x=20,9 08/03/96 05/05/96 21/02/97 28/02/97 10/04/97 18/05/97 30/11/95 24/11/95 24/03/96 18/10/96 20/10/96 18/10/96 28/04/94 19/10/96 25/10/96 21/05/97 02/12/97 20/01/97 20/02/96 12/10/96 06/05/96 20/10/95 09/10/97 12/01/98 20/02/98 22/06/96 23/10/96 10/06/98 15/04/98 12/04/98 30/03/98 25 20 0 17 16 34 65 47 39 43 41 38 0 60 28 42 18 29 32 57 38 60 0 33 45 48 33 28 0 0 25 0 1 23 0 0 0 0 3 0 2 12 6 31 0 1 3 1 0 0 0 3 0 28 0 0 0 0 0 26 31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Onde: N o nmero total de colmias experimentais; H o nmero de colmias experimentais com 50% de machos diplides; n o nmero de alelos xo e S o erro padro. Considerando que as colnias 13 e 14 produziram 25% de machos diplides, ento: n=18,66; N=27; H=2 e S=10,00. Esta situao s possvel se a rainha acasalou com zango parente seu. Sendo uma populao que est ocupando as cidades, a espcie Tetragonisca angustula adapta-se bem s condies urbanas, e seria esperado que haveria um equilbrio com relao aos alelos xo. Caso contrrio a jata no seria encontrada nos grandes centros urbanos. Um fato que acelera a morte de colnias de abelhas nativas na rea urbana o crescente uso de inseticidas pulverizados sem controle entomolgico adequado, matando todas as espcies de insetos urbanos, mesmo aqueles benficos ao homem. A atual prtica de controle do mosquito transmissor da dengue, que vem sendo utilizada na maioria dos municpios agrava o problema. Sabe-se que este controle no extermina a fase larval do mosquito, que em menos de 3 dias torna-se adulto e o princpio ativo do veneno pulverizado na atmosfera j no tem mais efeito, j que este inseticida tem atividade de 8 horas apenas. Para o extermnio do mosquito da dengue com pulverizaes nas ruas s mesmo realizando a aplicao na atmosfera de dois em dois dias durante semanas, o que inviabiliza este sistema de controle, tanto para custos como para a sade pblica. Algumas administraes municipais mais preocupadas com a sade pblica no efetuam as pulverizaes de inseticidas na atmosfera, o caso de Campo Grande, por exemplo. As colnias 1, 5, 14a, 24, 61 e 69 produziram apenas machos nos seus favos iniciais (Tabela 6). Neste caso as rainhas no se acasalaram e iniciaram postura de vulos sem espermatozides ou as operrias dessas colnias realizaram postura antes da rainha ter sido fecundada e iniciado postura. SILVA (1973) verificou que as operrias de Meliponinae podem realizar postura quando a rainha fisogstrica jovem. CAMARGO (1976) cita que a produo de machos haplides pela rainha fisogstrica de M. quadrifasciata ocorre somente quando ela velha, o que desconsidera a hiptese de a rainha ter feito postura de ovos no fecundados. As colnias 1 e 61, mesmo apresentando s machos em seus favos iniciais, tornaram-se colnias com postura normal e prosperaram. As outras colnias pereceram. Sugerindo que estas (12,1%) tornaram-se zanganeiras e as outras duas colnias a rainha iniciou postura depois.

18] A anlise de polimorfismo por microssatlites seria indicada neste caso (PAXTON, 1998). Poder-seia utilizar os mesmos primers usados para seres humanos (DANI, 1998 c.p.). Para as colnias 7, 9, 19, 25 e 70 que iniciaram postura 12, 10, 13, 12 e 10 dias aps sua formao, respectivamente, considera-se que as pupas nas realeiras estavam em estado final de desenvolvimento (farato) quando a colnia foi formada porque neste curto espao de tempo no haveria possibilidade de desenvolvimento completo das pupas contidas nas realeiras para nascimento de uma rainha virgem se as pupas estivessem em fase de olho preto ou anterior. Talvez as rainhas das colnias 13 e 14 tenham sido fecundadas por 2 zanges (n=18,66). As colnias filhas de Tetragonisca angustula demoraram 20,9 dias para que a rainha virgem acasalasse e iniciasse a postura (Tabela 6).

4.3.1. Estabilidade da populao de Tetragonisca angustula.Considero a espcie Tetragonisca angustula um tanto atpica no que se refere estabilidade da sua populao de colnias quando comparamos com a populao de colnias de Melipona quadrifasciata e outras espcies de abelhas sem ferro. Alguns comportamentos so muito distintos, como por exemplo a permanncia da colnia no local de nidificao. Muitas colnias desaparecem e aparecem no mesmo local ou substrato de nidificao ao longo do tempo. Quando foram marcadas vinte colnias de Tetragonisca angustula em mata nativa de Aquidauana, MS, foi visto que o tronco pode ser abandonado ou a colnia morre. Em dezembro de 1996, 40 colnias foram mapeadas e aps quatro meses 6 colnias (30%) no estavam no lugar, ou seja, o tronco no continha nenhum enxame de jata, apenas a marca de identificao e o orifcio de entrada da colnia. Isto pode mostrar que a populao de colnias de jata menos estvel do que em meliponas quando comparada populao de colnias de Melipona quadrifasciata do Meliponrio-A, havendo flutuao devida a morte de colnias ou migrao das mesmas. Uma das razes pode ser o ataque por Lestrimellita limao. Todavia, no Meliponrio-A ocorre a mesma flutuao populacional e no h o ataque da abelha-limo. No Meliponrio-A, notou-se que colmias abandonadas por enxames de jata ou que tiveram a colnia morta por qualquer motivo, casualmente foram habitadas por outros enxames sem origem conhecida. Popularmente, diz-se que as abelhas jatas vo embora, abandonando sua morada, e depois retornam ao mesmo substrato, ocupando-o com nmero de abelhas elevado. No se sabe se a colnia morre ou migra com rainha virgem. de se supor que em trigonas (Plebeia droryana e Tetragonisca angustula) a substituio de rainhas seja mais freqente do que em meliponas (Melipona quadrifasciata). CONTEL (1980) citou que de 13 colnias experimentais 8 substituram rainhas em 2 anos, indicando que o tempo de vida frtil dessas rainhas no ultrapassa 2 anos. KERR et al. (1962) encontraram 108.260 espermatozides por mm 3 de smen na espermateca de rainha de Tetragonisca angustula recm fecundada. Porm este dado pode estar subestimado (KERR c.p.). CAMARGO (1976), estudando Melipona quadrifasciata, encontrou 1,3 milhes/mm3. Isso mostra que em jata a troca de rainhas mais freqente e os riscos da colnia ficar sem rainha e morrer so maiores. Estes dados podem explicar a maior flutuao da populao das colnias de Tetragonisca angustula com relao flutuao da populao de Melipona quadrifasciata. Portanto, o estudo do nmero de alelos sexuais xo numa populao de Tetragonisca angustula, dependendo do tempo que os experimentos durarem, deve levar em considerao essa flutuao quando avaliase o nmero de colnias numa determinada rea.

5. CONCLUSESO nmero de alelos sexuais xo na populao de Melipona quadrifasciata do Meliponrio-A antes da introduo de colnias com rainhas acasaladas com zanges de populaes do Esprito Santo foi: n = 8 (S = 3,36). Aps a introduo de 9 colnias com rainhas acasaladas com zanges de populaes do Esprito Santo, o nmero de alelos sexuais xo no Meliponrio-A aumentou para n = 17,33 (S = 9,23). Este mtodo mais apropriado para os meliponicultores que no gostam de trocar rainhas ou colnias, Para evitar a morte de colnias de meliponneos devida produo de machos diplides quando as rainhas acasalam com zanges parentes, a introduo de colnias com rainhas acasaladas com zanges de populaes diferentes, ou seja, com zanges no parentes no meliponrio, manejo indicado para a manuteno da variabilidade gentica da populao geneticamente ativa do meliponrio. A determinao da diploidia dos machos das colnias que apresentaram proporo dos sexos 1:1 pela segregao de Est-S e Est-F em heterozigose no foi possvel por no termos encontrado uma colnia com a proporo 1:1 de Est-S e Est-F.

19Foi encontrado polimorfismo apenas para um gene de esterase, sendo 51,92% de Est-F das colnias de Melipona quadrifasciata analisadas. O XX2 de heterogenidade demonstrou que as 3 populaes de mandaaia estudadas so estatisticamente semelhantes. No foi confirmado que em Melipona quadrifasciata as rainhas se acasalam com mais de um zango, mas sugeriu-se experimentos que definiro esta dvida por intermdio de exames de paternidade utilizando as mesmas tcnicas empregadas para humanos. A populao de Tetragonisca angustula do Meliponrio-A no apresentou indcios de estar sob o efeito Yokoyama & Nei porque nenhuma colnia formada ou orfanada apresentou 50% de machos e 50% de fmeas. Indicando que a populao tem um nmero grande de alelos xo, isto , superior a 56 (s=54,03). Todavia, se as rainhas virgens das colnias 13 e 14 foram inseminadas por mais de um zango, ento o nmero de alelos xo ser 18,66. Durante a captura das rainhas, o procedimento que menos causou estresse colnia consistiu em abrir a colmia e procur-la sem remover os favos de crias. Caso a rainha fisogstrica no tenha sido encontrada, deixou-se a parte superior do invlucro do ninho removida, de maneira a ficar exposto o favo de crias novas. Pois so nestes favos que a rainha fisogstrica se encontra com mais freqncia. Aps a remoo das placas de cera da parte superior do invlucro do ninho, a colmia foi fechada e novamente aberta de 30 em 30 minutos, at que a rainha fosse capturada. A acomodao de um vidro superior na colmia e observao constante at encontrar a rainha tambm deu bons resultados, porm este mtodo interrompeu por mais tempo as atividades normais das operrias que passaram a trabalhar na vedao das frestas entre o vidro e as paredes laterais da colmia.

As colnias de Melipona quadrifasciata formadas demoraram 4,5 dias a mais que as colnias orfanadas. Estas demoraram 18 dias para terem rainha fecundada realizando postura. As colnias de Tetragonisca angustula formadas e orfanadas demoraram 20,9 dias para obterem rainha fisogstrica.

APNDICE1. Alimentao artificial para colnias de abelhas do gnero Melipona. a) Internamente s colnias. Quando a administrao de plen for dentro da colmia, o plen pode ser seco ou fermentado. No primeiro caso, a quantidade a ser fornecida deve ser no mximo 3g a cada 10 dias para colnias mdias e fortes (Notas acima de 6,0). Mais do que isso, este nutriente acumula dentro da colnia sem que seja devidamente manipulado e consumido pelas operrias. O plen j fermentado o mais indicado e pode ser usado o plen de Scaptotrigona sp (mandaguari) ou o plen de taboa (Camargo, 1976). Foram obtido bons resultados com o plen de mandaguari fornecido a uma quantidade de 5 a 7g em potes artificiais (AIDAR & CAMPOS, 1994 e AIDAR, 1995) e a intervalos de 25 a 30 dias para colnias de mandaaia mdias a fortes. Com relao s colnias fracas, preciso muito cuidado quando fornece-se plen fermentado pois o ataque de fordeos uma constante. Nestes casos, reduzir a quantidade e observar de 2 em 2 dias para ver se no houve postura de fordeos uma forma de preveno contra o ataque deste predador. Preferencialmente, o plen fornecido s colnias novas deve ser fermentado para uso imediato pelas operrias aprovisionadoras de clulas de crias. Assim, a postura da rainha fisogstrica ocorrer normalmente, sem interrupo e a colnia ter um desenvolvimento timo. O excesso de plen dentro da colnia permite a entrada de fordeos atrados pelo cheiro que este alimento possui. O plen de mandaguari apresenta aroma muito forte e adocicado, o que proporciona maior atrao de fordeos. sempre bom ter algumas colnias de mandaguari para servir de fonte de plen para colnias fracas de mandaaia. b) Externamente s colmias. Esta forma de fornecimento de plen s funciona quando o plen est na forma slida e bem pulverizado. Para isto, o plen em bolotas dever passar por um processo de triturao dos seus grnulos normais, podendo ser utilizado um liquidificador comum com lminas bem afiadas. O plen em bolotas as campeiras no conseguem coletar (AIDAR, 1996b). Mistura-se o p com canela e acar cristal, tambm por meio de liquidificador para homogeneizar bem os ingredientes. Esta mistura foi denominada de PCA (85 % de plen, 10% de canela em p e 5% de acar), (AIDAR, 1996b). Essncias vegetais naturais, como por exemplo, essncia ou ptalas de rosas, podem ser utilizadas para atrair mais rapidamente as campeiras. Quando as ptalas de rosas so vermelhas, obtm-se melhores resultados (AIDAR, c.p.). Com um bom treinamento das abelhas, apenas o PCA fornece bons resultados.

20Os meliponneos, em geral, raramente coletam alimento slido em alimentadores coletivos, dificultando o aumento da atividade de postura da rainha em pocas de escassez de floradas. Isto impede o aumento da populao geneticamente ativa e a estao de floradas fica restrita ao fortalecimento das colnias e no diviso das mesmas, como preciso acontecer em regies onde espcies esto sob o efeito da homozigose dos alelos xo. Tendo como base estas duas tcnicas de alimentao de meliponneos, alimentao interna e externa em alimentadores coletivos, obteve-se a manuteno das colnias em condies ideais para o desenvolvimento dos experimentos.

ndiceRESUMO..................................................................................................................................................1 1. INTRODUO....................................................................................................................................2 1.1. MELIPONNEOS E ECOSSISTEMA..........................................................................................2 1.2. CONSIDERAES SOBRE AS ESPCIES ESTUDADAS.......................................................3 1.2.1. Tetragonisca angustula............................................................................................................3 1.2.2. Melipona quadrifasciata..........................................................................................................4 1.3. NMERO DE ALELOS SEXUAIS NAS POPULAES DAS ESPCIES ESTUDADAS.....4 1.4. POLIMORFISMO ENZIMTICO EM POPULAO DE Melipona quadrifasciata..................6 1.5. Manuteno das Colnias EXPERIMENTAIS............................................................................6 2. OBJETIVOS..........................................................................................................................................7 3. MATERIAL E MTODOS..................................................................................................................7 3.1. Nmero de alelos xo na populao de Melipona quadrifasciata....................................................7 3.1.1. Seleo das colnias para cruzamento com populaes do Esprito Santo.............................8 3.1.2. Distribuio das colnias nos Meliponrios do Esprito Santo...............................................9 3.1.3. Colnias rfs acasaladas no Esprito Santo e diviso no Meliponrio - A............................9 3.2. Nmero de alelos sexuais xo na populao de Tetragonisca angustula ........................................9 3.3. Polimorfismo enzimtico em populao de Melipona quadrifasciata.........................................10 3.4. Manuteno das colnias experimentais......................................................................................11 3.4.1. Alimentao protica.............................................................................................................11 3.4.2. Controle do principal predador: O Fordeo Pseudohypocera sp...........................................11 4. RESULTADOS E DISCUSSO........................................................................................................12 4.1. Alelos sexuais xo em populao de Melipona quadrifasciata......................................................12 4.1.1. Diferenas entre as colnias do Esprito Santo e do Meliponrio-A....................................15 4.1.2. Tempo para as rainhas das colnias rfs iniciarem postura................................................15 4.2. Polimorfismo enzimtico em populao de Melipona quadrifasciata.........................................15 4.3. Alelos sexuais xo em populao de Tetragonisca angustula........................................................16 4.3.1. Estabilidade da populao de Tetragonisca angustula..........................................................18 5. CONCLUSES...................................................................................................................................18 APNDICE.............................................................................................................................................19