variabilidade genÉtica em cana-de- aÇÚcar … · genética em genótipos de cana-de-açúcar,...
TRANSCRIPT
VARIABILIDADE GENÉTICA EM CANA-DE-AÇÚCAR BASEADA EM MARCADORES
MOLECULARES RAPDJoão de Andrade Dutra Filho1; Marília Gabriela de Santa Costa2; Gerson Quirino Bastos3; Luciane Vilela Resende4;
Luiz José Oliveira Tavares de Melo5; Júlio da Silva Correa de Oliveira Andrade6; Soraya de Lima e Silva7
________________1. Primeiro Autor é Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Melhoramento Genético de Plantas do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]. Segundo Autor é Graduando em Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: 3. Terceiro Autor é Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]. Quarto Autor é Professor Associado do Departamento de Agricultura, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, CEP 37200-000. E-mail: [email protected]. Quinto Autor é Pesquisador da Estação Experimental de Cana-de-açúcar do Carpina da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]. Sexto Autor é Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Melhoramento Genético de Plantas do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 521-900. E-mail: [email protected]. Sétimo Autor é Graduando em Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
Introdução
Em cana-de-açúcar a variabilidade genética disponível para seleção provém de cruzamentos realizados entre genitores de interesse que já apresentam um conjunto de genes relacionados a caracteres tidos como importantes componentes de produção [1]. Entre os cruzamentos mais utilizados pelos melhoristas destacam-se os cruzamentos biparentais e os policruzamentos, no primeiro dois genitores conhecidos são selecionados e intercruzados, no segundo um grande número de genitores são selecionados e intercruzados, entretanto não se conhece a fonte de origem do pólen [1]. De acordo com Ramalho et al.[2] o conhecimento da variabilidade proveniente das diferenças genéticas, permite ao melhorista conhecer o potencial da população para seleção de bons genótipos. Estabelecer quais genitores deverão ser cruzados é uma das etapas mais importantes de um programa de melhoramento, sobretudo quando se trata de genitores divergentes, aumentando assim a possibilidade de indivíduos desejáveis com excelente potencial heterótico. A divergência genética pode ser estimada com base em descritores morfo-agronômicos, entretanto, se sabe que os mesmos possuem a limitação de serem facilmente influenciados pelo ambiente [3]. A utilização de marcadores moleculares, para estimativa da divergência genética, é altamente recomendável, pois os mesmos apresentam a vantagem de não serem influenciados pelo ambiente e podem estar ligados a
locos que determinam cacterísticas de interesse, além de serem usados em qualquer estágio de desenvolvimento da planta acelerando a obtenção de indivíduos desejáveis [4]. Com este trabalho objetivou-se avaliar a variabildade genética em genótipos de cana-de-açúcar, por meio de marcadores RAPD, e indicar os mais divergentes a serem utilizados como genitores num programa de melhoramento por hibridação.
Material e métodos
Os genótipos avaliados, identificados na Tabela 1, foram provenientes da autofecundação das variedades comerciais RB863129, RB867515 e RB 943365 selecionadas dentro de uma população elite na Estação Experimental de Cana de açúcar de Carpina da Universidade Federal Rural de Pernambuco (EECAC/UFRPE). Os colmos desses indivíduos foram cortados em mini-toletes e enviados ao Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras (UFLA) para a caracterização molecular, onde foram plantados em bandejas, em casa de vegetação e após o brotamento foram coletadas folhas jovens para extração de DNA. A extração de DNA seguiu a metodologia CTAB modificada para cana-de-açúcar [5]. Foram utilizados 12marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) da Operon Technologies: OPN, OPAX, OPAW e OPAL. As reações de amplificação tiveram uma concentração final de 12,01µl, contendo: 4,49µl de água, 2,25µl de DNA (10ng.ml-1), 0,66 de dNTP, 2,25µl (0,4mM) de um oligonucleotídeo iniciador, 1,0µl de tampão de reação e 0,4 unidades da enzima Taq polimerase. Em seguida as reações foram amplificadas em termociclador Eppendorf
MasterCycler Gradiente 5331. Cada ciclo deamplificação correspondeu a: desnaturação a 94ºC por dois minutos, anelamento a 37ºC por 15 segundos e elongação a 72º C, por um minuto. Após 40 ciclos, procedeu-se a extensão final por dois minutos a 72°C. Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% imerso em tampão TBE (0,45 M de tris-borato, 0,01M de EDTA pH 8,0) a 50 volts, durante 6 horas. Decorrido este tempo os géis foram tratados com solução de brometo de etídio a 0,5µg.ml-1
por vinte minutos, visualizados em transluminador de luz ultravioleta e fotografados em câmara fotográfica EDA – 290, da Kodak. Os dados provenientes da análise molecular foram processados com o auxílio do programa estatístico Genes [6]. Os fragmentos gerados pelas amplificações foram analisados quanto à presença (1) ou ausência (0) de bandas construindo-se assim uma matriz binária, para a estimativa de dissimilaridade genética utilizou-se o coeficiente de Jaccard, obtido por meio da expressão: a /(a+b+c), e para elaboração do dendrograma utilizou-se o método hierárquico do tipo UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetical Averages), [7].
Resultados e Discussão
Os iniciadores OPAX 02, OPAX 09, OPAX 10, OPAX 11, OPAX 12, OPAX 16, OPAX 17, OPAX 18, OPAX 19, OPAW 12, OPN 20 e OPAL 09 mostraram-se eficientes na caracterização molecular dos genótipos avaliados. O dendrograma obtido pelo método UPGMA (Figura 1) possibilitou a formação de dois grupos distintos. O primeiro grupo formado pelos genótipos 11, 15, 4, 8, 5, 12, 9, 14, 1, 10, 7, 13 e 2 e o segundo pelos genótipos 3 e 6. Observa-se ainda que o primeiro grupo pode ser dividido em dois subgrupos. O subgrupo 1.A formado pelos genótipos 11, 15, 4, 8, 5 e 12 e subgrupo 1.B formado pelos genótipos 9, 14, 1, 10, 7, 13 e 2. Os genótipos 1 e 3 mostraram-se mais divergentes tendo uma distância estimada e torno de 50601.84 (100%). Divergência genética satisfatória pode ser observada também entre os genótipos 1 e 4 cuja distância foi estimada em 43229.85 (85%). Para uma maior possibilidade de obtenção de indivíduos desejáveis, o fitomelhorista deve direcionar seu trabalho na exploração dos cruzamentos envolvendo os genótipos 1, 10, 7, 13 e 2 com os genotipos 3 e 6. Deve-se salientar que apesar dos marcadores RAPD,utilizados no presente trabalho, apresentarem reprodutibilidade satisfatória, nas reações de amplificação, os mesmos apresentam como característica básica a dominância não sendo capazes de distinguir os indivíduos homozigotos dos heterozigotos [8]. Em se tratando da cana-de-açúcar que é uma espécie que apresenta níveis diferentes de ploidia e múltiplos alelos segregando num mesmo loco, a utilização de
marcadores co-dominantes, a exemplo dos microssatélites, torna-se fundamental para distinção de indivíduos homozigotos dos heterozigotos e assim estimar com maior eficiência a divergência genética nos genótipos avaliados gerando consequentemente maior consistência nos resultados.
Agradecimentos
A Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Estação Experimental de Cana-de-açúcar do Carpina (EECAC), Usina São José, Rede Interuniversitária de Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (RIDESA) pelo apoio concedido e viabilização da pesquisa e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos.
Referências[1] MATSUOKA, S.; GARCIA, A.A.F.; ARIZONO, H. 2005.
Melhoramento de cana-de-açúcar. In: BORÉM, A. (Ed.). Melhoramento de Espécies Cultivadas. 2 ed. Viçosa: UFV. p. 225-274.
[2] RAMALHO, M.A.P,; SANTOS, J.B; PINTO, C.A.B.P. 2001. Genética na agropecuária. 2.ed. Lavras: Editora UFLA. 472p.
[3] BORÉM, A. 2001. Melhoramento de Plantas. 3.ed. Viçosa: UFV. 500 p.
[4] ALZATE-MARIN, A.L.; CERVIGNI, G.D.L.; MOREIRA, M.A.; BARROS, E.G. 2005. Seleção Assistida por marcadores moleculares visando ao desenvolvimento de plantas resistentes a doenças, com ênfase em feijoeiro e soja. Fitopatologia Brasileira,Brasília, 30: 222-342.
[5] PEREIRA, H.S.; SANTOS, J.B. dos.; ABREU, A. de F.B de.; KOUTO, K.R. 2007. Informações fenotípicas e marcadores microssatélites de QTL na escolha de populações segregantes de feijoeiro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 42: 707-713.
[6] CRUZ, C.D. 2006. Programa GENES: aplicativo computacional em genética e estatística. Viçosa: UFV. p. 442p
[7] SOKAL, R.R.; MICHENER, D. 1958. A statistical method for evaluation systematic relationships. University of Kansas Scientific Bulletin, Kansas, 38: 1409-1438.
[8] CAIXETA, E.T.; OLIVEIRA, A.C.B.; BRITO, G.G.; SAKYIAMA, N.S. 2006. Tipos de marcadores moleculares. In: BORÈM, A.; CAIXETA, E.T. (Eds.). Marcadores Moleculares. Viçosa: UFV. p. 23-25.
Tabela 1. Genótipos avaliados na análise molecular por meio de marcadores RAPD.
GENÓTIPOS1. RB867515 6. RB943365 11. RB863129
2. S1.1 7. S2.1 12. S3. 13. S1.2 8. S2.2 13. S3.24. S1.3 9. S2.3 14. S3.35. S1.4 10. S2.4 15. S3.4
Nota: S1.1 a S1.4 Indivíduos provenientes da autofecundação da variedade RB867515. S2.1 a S2.4 Indivíduos provenientes da autofecundação da variedade RB943365. S3.1 a S3.4 Indivíduos provenientes da autofecundação da variedade RB863129.
Tabela 2. Marcadores RAPD, com suas respectivas sequencias, utilizados na análise molecular em genótipos de cana-
de-açúcar.
Figura 1 – Dendrograma representativo da divergência genética obtido pela método de agrupamento das médias das
distâncias (UPGMA), baseado no coeficiente de Jaccard, considerando doze marcadores RAPD em 15 genótipos de
cana-de-açúcar.
Oligonucleotídeos iniciadores Sequencias
OPAL 09 TCGCTGGTGT
OPAN 20 GAGTCCTCAAC
OPAX 02 TTCCGCCACC
OPAX 09 GGTCTGGTTG
OPAX 11 GGAGCCTCAG
OPAX 12 TCGCCAGCCA
OPAX 16 CTCTGTTCGG
OPAX 17 GACACGGACC
OPAX 18 GACTAGGTGG
OPAX 19 TGGCAAGGCA
OPAW 12 TGGGCGAAAG