variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi

analisada por marcadores ISSR

Raul Ferreira de Miranda Mendes

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Piauí como parte das exigências

do Programa de Pós-graduação em

Genética e Melhoramento, área de

concentração em Genética e Melhoramento,

para obtenção do título de “Mestre”.

TERESINA

2014

Raul Ferreira de Miranda Mendes

Biólogo

Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi analisada por

marcadores ISSR

Orientador:

Dr. Paulo Sarmanho da Costa Lima

Coorientador

Dr. Francisco Rodrigues Freire Filho

Dissertação apresentada à Universidade Federal

do Piauí como parte das exigências do Programa

de Pós-graduação em Genética e Melhoramento,

área de concentração em Genética e

Melhoramento, para obtenção do título de

“Mestre”.

Teresina

2014

À minha mãe,

Marlucia Ferreira de Miranda Mendes

DEDICO

AGRADECIMENTOS

Precipuamente quero agradecer a Deus pela saúde, pela garra, família, amigos,

profissionais de qualidade que fazem ou fizeram parte dessa caminhada. Não vejo a

finalização de um trabalho como este sem a benção de Deus e a ajuda de todos.

Á minha mãe, Marlucia Ferreira de Miranda Mendes, que para agradecer tudo que

recebo e recebi dessa admirável genitora seriam necessárias muitas folhas. Mas

quero deixar meu imenso agradecimento, admiração e respeito por tudo, pois o que

sou, penso, faço é baseado nos seus ensinamentos.

Ao meu pai, o pedagogo José Mendes do Vale (em memória), que apesar da curta

presença foi essencial e gratificante, e nos permitiu (a mim e meus irmãos)

educação familiar e escolar de qualidade.

À minha Tia, Maria Eunice, que a chamo carinhosamente de “Melo” por sua

dedicação, apoio, carinho e amor desde quando ainda arrastava a merendeira para

ir à pré-escola.

Aos meus irmãos, Ramon, Renê e Renata pelo apoio, companheirismo e

simplesmente por existir em minha vida.

À minha namorada Monalisa Ravena, que sempre me fez feliz com seu jeito de ser

(único e autêntico), permitindo que sempre continuasse e atingisse os meus

objetivos e sonhos.

Ao Dr. Paulo Sarmanho da Costa Lima por ensinar tudo que sei hoje sobre

pesquisa, pois me orientou desde o 4º bloco do meu curso de graduação. Já vai

completar seis anos de convivência. Relação esta que não tenho nada a reclamar,

pois sempre fui prontamente atendido e guiado com muito esmero e dedicação

desse grande pesquisador.

Ao pessoal do Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia da Embrapa Meio-

Norte pelos ensinamentos, apoio, solidariedade e força que nunca faltou naquele

ambiente de trabalho. Valeu mesmo Michelli, Isis, Geice, Suly, Leonardo, Jailson e

“Seu” Manoel do caupi.

Ao Dr. Freire pela concessão do material vegetal e pelo apoio e ensinamentos que

recebi desse admirável pesquisador, não só pela sua brilhante carreira, mas também

pela sua imensa humildade, que dificilmente se ver numa caminhada como esta.

À Embrapa Meio-Norte pelo financiamento de todo o trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de Mestrado.

À Dra. Angela Celis que nos acolhe como uma mãe no Programa de Pós-graduação

em Genética e Melhoramento. Tem um coração enorme que a torna muito solidária.

A meu ver deveria ser coorientadora em todas as dissertações que por ali passou.

Ao Dr. Fábio Barros Britto e Dr. Paulo Fernando de Melo Jorge Vieira por aceitar e

contribuir no presente trabalho.

E a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse

trabalho.

SUMÁRIO

RESUMO .......................................................................................................... V

ABSTRACT ....................................................................................................... VI

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 7

2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 9

2.1 Feijão-caupi ................................................................................................. 9

2.2 Diversidade genética ................................................................................... 11

2.3 Análise fingerprinting ................................................................................... 13

2.4 Marcadores moleculares ............................................................................. 14

2.4.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) .................................................... 15

2.5 Análises populacionais ............................................................................... 17

3 MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................19

3.1 Material vegetal ........................................................................................... 19

3.2 Extração e quantificação de DNA ............................................................... 21

3.3 Seleção de primers e reação em cadeia de polimerase ............................. 21

3.4 Análise de dados ISSR ............................................................................... 23

3.4.1 Dendrograma ........................................................................................... 23

3.4.2 Análise populacional ................................................................................ 23

4 RESULTADOS................................................................................................ 24

4.1 Análise da divergência genética .................................................................. 24

4.2 Análise de agrupamento .............................................................................. 25

4.3 Estrutura genética ........................................................................................ 29

5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 30

6 CONCLUSÕES ............................................................................................... 34

7 REFERÊNCIAS ............................................................................................... 35

V

RESUMO

MENDES, R. F. M. Variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi

analisada por marcadores ISSR. 2014. 42 p. Dissertação (Mestrado em Genética e

Melhoramento) – UFPI, Teresina-PI, 2014.

A disponibilidade de água na região semiárida do nordeste do Brasil é severamente

limitada. Assim é grande a busca por cultivares mais produtivas e tolerantes a

estresse hídrico. Nessa busca a compreensão da variabilidade genética de uma

espécie torna-se importante conhecimento primário para orientar a seleção e

aperfeiçoamento em programas de melhoramento. Nessa perspectiva o feijão-caupi

possui grande variabilidade genética que o torna versátil, sendo usado em diversos

sistemas de produção. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho estimar a

variabilidade de genótipos crioulos de feijão-caupi coletados no Rio Grande do Norte

através de marcadores ISSR. Foram caracterizados 64 genótipos, sendo 60 crioulos

e quatro cultivares comerciais de feijão-caupi pertencentes à Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária (Embrapa). Os 60 genótipos crioulos foram coletados em 13

microrregiões do Estado do Rio Grande do Norte. O conjunto de 13 primers

selecionados para avaliação gerou 257 locos ISSR, dos quais 247 foram

polimórficos (96,11%). O tamanho dos fragmentos variou de 200 a 2000 pb. O

dendrograma (UPGMA) formou três grupos. Não houve relação entre a distância

genética e a distância geográfica. Para melhor análise dos agrupamentos foi usado

o programa Structure, baseado na estatística Bayesiana. Houve diferenciação

genética entre as 14 populações de feijão-caupi na análise de variância molecular

(AMOVA), sendo a diversidade genética total dividida em 8,18% entre as populações

e 91,82% dentro das populações. O índice de fixação (FST) foi de 0,0818. Diante dos

resultados é possível cruzamentos entre genótipos com coeficiente de similaridade

menor que 25%.

Palavras – chaves: Vigna unguiculata, Diversidade genética, Melhoramento

genético, estresse hídrico.

7

ABSTRACT

MENDES, R. F. M. Genetic variability of Creoles of cowpea genotypes analyzed by ISSR. 2012. 42p. Dissertation (Master in Genetics and Breeding) – Federal University of Piauí, Teresina, 2014.

Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] is cultivated widely by small farmers in the

semiarid region of northeastern Brazil for subsistence purposes and to complement

the family income. However, owing to the limited availability of water in this region,

there is an urgent need for novel highly productive drought-tolerant cultivars. The aim

of the present study was to establish the genetic variability of 14 cowpea populations

(60 indigenous genotypes from 13 microregions of Rio Grande do Norte and 4

domesticated cultivars produced by Embrapa) using inter-simple sequence repeats

(ISSR) markers. The set of 13 selected primers generated a total of 257 loci, 247

(96.11%) of which were polymorphic, with sizes ranging between 200 and 2000 bp.

Genetic similarities between accessions were estimated from Jaccard coefficients

and genetic relationships were determined from the dendrogram constructed using

the unweighted pair group method with arithmetic average (UPGMA) technique.

Bayesian statistics coupled with the Markov chain Monte Carlo technique was

applied to determine population structure, while the genetic variability was

established by analysis of molecular variance. UPGMA analysis allowed the

separation of the genotypes into three groups, but no relationship between the

genetic and geographical distances was observed. The fixation index was considered

intermediary (FST = 0.0818), the average heterozygosity was low (HS = 0.39) and the

coefficient of endogamy was high (f = 92.6%). The results showed the presence of

genetic diversity among the studied populations and revealed that such variability

could be attributed mainly to intra-population variability (91.82%).

Keywords Vigna unguiculata • Genetic diversity • Plant improvement • Drought

stress

8

1 INTRODUÇÃO

A disponibilidade de água na região semiárida do nordeste do Brasil é

severamente limitada por causa da precipitação escassa e irregular e às

temperaturas elevadas. Segundo Barteko et al. (2010) a temperatura e as chuvas

são os elementos climáticos que mais influenciam na produção de feijão. Assim é

grande a busca por cultivares mais produtivas e tolerantes a estresse hídrico para

serem recomendadas aos agricultores estabelecidos em regiões com baixa

precipitação pluviométrica, como é o caso do Estado do Rio Grande do Norte, local

de coleta dos acessos do presente trabalho.

Nessa busca o feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) torna-se uma grande

alternativa, pois possui grande variabilidade genética que o torna versátil, sendo

usado para várias finalidades e em diversos sistemas de produção (FREIRE FILHO

et al., 2005). Além dessa espécie constituir uma das principais fontes proteicas das

populações, principalmente, das regiões Norte e Nordeste do Brasil onde é uma

alternativa de renda para pequenos produtores com pouco ou nenhum acesso a

tecnologias de produção.

A compreensão da variabilidade genética de uma espécie, ou seja, a

proximidade e diversidade de genótipos dentro da mesma espécie representa

importante conhecimento primário para orientar a seleção e aperfeiçoamento em

programas de melhoramento. Dessa forma podem-se identificar genótipos

divergentes e complementares que possam ser utilizados como progenitores em

programas de melhoramento e assim aumentar as chances de seleção de genótipos

superiores nas gerações segregantes (CRUZ e REGAZZI, 2001).

Como esses produtores trabalham na maioria das vezes com cultivares

crioulas, há uma conservação dos recursos genéticos da espécie, e existe a

possibilidade desta variabilidade genética ser explorada pelos programas de

melhoramento da cultura do feijão. Mesmo porque é possível a transferência de

características genéticas desejáveis das espécies crioulas às cultivares comercial.

Para estimar a variabilidade de uma espécie tem se observado uma grande

contribuição dos marcadores moleculares, e entre estes marcadores, os ISSR - Inter

Simple Sequence Repeats (ZIETKIEWICZ et al., 1994) têm sido amplamente

utilizados devido à sua repetibilidade e reprodutividade (GOMES et al., 2012;

9

MENDES et al., 2012) bem como à simplicidade na execução. Muitos trabalhos com

feijão-caupi têm utilizado os marcadores ISSR (GHALMI et al. 2010; SILVA et al.

2010; SANTOS et al. 2013). Diante disso estes marcadores constituem-se em uma

ferramenta para caracterização molecular de genótipos de feijão-caupi. Então se

objetivou com esse trabalho estimar a variabilidade de genótipos crioulos de feijão-

caupi coletados no Rio Grande do Norte através de marcadores ISSR.

10

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Feijão-caupi

O gênero Vigna constitui-se um grande e heterogêneo grupo distribuído nos

trópicos e subtrópicos na África, América Central e do Sul e Ásia (BA et al., 2004;

MAYOR et al., 2009). Este gênero contém várias importantes espécies cultivadas,

incluindo o feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp), o bambara amendoim (V.

subterrânea L. Verdc.), feijão-mungo (V. radiata (L.) Wilczeck), grão-preto (V. Mungo

(L.) Hepper), feijão-azuqui (V. angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi) e feijão-arroz (V.

umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi). Entre estes, o feijão-caupi é o de maior

importância econômica (WETZEL e FAIAD, 2001). A cultura do feijão-caupi tem

fundamental importância socioeconômica para o Nordeste e Norte do Brasil,

constituindo-se uma das principais fontes proteicas das populações dessas regiões.

(SINGH et al., 2002; FREIRE FILHO et al., 2004; ZILLI et al., 2009).

A produção mundial de feijão, incluindo o feijão-comum e o feijão-caupi,

aumentou 59,1% no período compreendido entre 1961 e 2005 (BOVESPA, 2012).

Países como os Estados Unidos, Perú, Brasil, Níger, Mali, Burkina Faso, Benin,

Chade, Camarões, Myanmar e Tailândia são os principais exportadores de feijão-

caupi. Já os maiores importadores são Estados Unidos, Canadá, Portugal, Espanha,

Grécia, Reino Unido, Bélgica, Argélia,

Egito, Nigéria, Gana, Costa do Marfim, Togo, Gabão, Emirados Árabes Unidos,

Israel, Índia e Turquia (FREIRE FILHO et al., 2011b).

É uma espécie autógama, que apresenta cleistogamia, ou seja, a polinização

do estigma ocorre antes da abertura do botão floral ou antese (BESPALHOK et al.,

2007a). Reproduz-se preferencialmente por autofecundação, com a ocorrência de

baixa taxa de cruzamento natural, geralmente abaixo de 1% (EHLERS e HALL,

1997). É uma dicotiledônea pertencente à ordem Fabales, família Fabaceae,

subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolinea, gênero Vigna, secção

Catiang e espécie Vigna unguiculata (Verdecourt, 1970; Maréchal et al., 1978;

Padulosi e Ng, 1997).

O feijão-caupi, também conhecido como feijão de macassar, feijão da colônia,

feijão de praia e feijão-miúdo é uma leguminosa comestível, dotada de alto conteúdo

proteico, boa capacidade de fixar nitrogênio. É menos exigente em nutrientes,

11

fertilidade do solo e quantidades de adubo em comparação à soja e ao feijão-comum

(SAMPAIO e BRASIL, 2009). Exibe ainda reconhecida capacidade de adaptação a

estresses hídrico, térmico e salino (ZILLI et al., 2009; FREIRE FILHO et al., 2004).

Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento - CONAB (2011) não

existe divisão entre os dados estatísticos do feijão comum (Phaseolus vulgares L.) e

os do feijão-caupi. Para fins de preços mínimos de garantia, a CONAB (2011)

classifica em duas tipificações: feijão anão (Phaseolus vulgaris) e feijão macassar

(Vigna unguiculata). O feijão anão é cultivado em todo o território nacional (SEAB,

2012) já o cultivo do feijão macassar, ou caupi, está localizado principalmente na

região do Nordeste brasileiro, mas vem se expandindo para outras regiões do Brasil,

principalmente para o Centro-Oeste, em razão da sua ampla adaptabilidade às

condições tropicais, precocidade e ao baixo custo de produção, e em decorrência do

intenso trabalho de melhoramento aplicado à cultura nos últimos 20 anos (FREIRE

FILHO et al., 2011a)

De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2009),

o consumo alimentar da população brasileira combina a tradicional dieta à base de

arroz e feijão com alimentos com poucos nutrientes e muitas calorias. Estudos

encomendados pelo IBGE em parceria com o Ministério da Saúde - Pesquisa de

Orçamentos Familiares (POF) 2008-2009 indicam um consumo alimentar médio de

feijão per capita de 182,9 g/dia. No entanto, essa pesquisa não diferenciou o

consumo entre as espécies de feijão.

Tanto a produtividade nordestina como a brasileira está aquém do potencial

produtivo do feijão-caupi. De acordo com Mousinho et al. (2008), a sensibilidade do

feijão-caupi à escassez de água no solo, juntamente com as incertezas climáticas,

principalmente relacionadas à distribuição irregular de chuvas a partir de um ano

para outro e de um região para outra, determinam a oscilação na safra anual da

produção no Piauí.

No entanto, Lima (2008) analisou respostas fisiológicas de cultivares de feijão

comum e caupi submetidas à deficiência hídrica, e concluiu que as cultivares de

feijão-caupi submetidas à deficiência hídrica apresentaram melhor desempenho no

que concerne à eficiência instantânea de transpiração e à eficiência intrínseca do

uso da água quando comparadas com a cultivar de feijão-comum.

No mercado brasileiro podem-se identificar três segmentos: grãos secos,

feijão-verde (vagem verde ou grão verde debulhado) e sementes. No mercado dos

12

grãos secos, nas regiões Norte e Nordeste, o feijão-comum e o feijão-caupi embora

não competindo no campo, competem por mercado e sempre que há uma queda na

oferta de feijão-caupi o mercado é suprido por feijão-comum de outras regiões do

País e, às vezes, importado (FREIRE FILHO et al., 2011a).

No Brasil, os programas de melhoramento de feijão-caupi buscam o aumento

da produtividade e melhoria da qualidade visual, culinária e nutricional dos grãos,

aumento da adaptabilidade e estabilidade; tolerância a estresse hídrico; arquitetura

adequada ao cultivo mecanizado e à agricultura familiar; incorporação de resistência

a doenças e pragas; desenvolvimento de cultivares com grãos de cor verde

persistente à secagem para enlatamento e congelamento; desenvolvimento de

variedades com características para o processamento industrial, utilizados na

produção de farinha e sopa pré-cozida (FREIRE FILHO et al., 2005).

Diante dessa busca os genótipos crioulos de feijão podem ser uma

alternativa, pois apresentam variabilidade genética inter e intrapopulacional, que se

pode traduzir fenotipicamente tanto nas características da semente como da planta.

Isso é devido aos diversos ambientes a que são submetidas (MATOS et al., 2013). É

considerado cultivar crioula, a veriedade que não seja oriunda de manipulação por

engenharia genética nem outros processos de desenvolvimento industrial ou

manipulação em laboratório, não contenha transgenes e não envolva processos de

hibridação (MINISTÉRIO DO DESENVOLVIMENTO AGRÁRIO, 2007).

2.2 Diversidade Genética

A divergência genética existe na natureza, e pode ser quantificada tanto por

marcadores moleculares como por técnicas multivariadas, além de estar associada à

heterose. As análises de variabilidade genética podem ser úteis para obter a relação

entre os genótipos, caracterizar grupos heteróticos, predizer preliminarmente

cruzamentos que otimizem a heterose, viabilizando a obtenção de genótipos

superiores nas gerações segregantes. Desse modo, o estudo da diversidade entre e

dentro de populações fornece as bases para a identificação de indivíduos

divergentes, auxiliando o melhorista na seleção de combinações mais promissoras e

favoráveis aos cruzamentos (MELCHINGER, 1999; FALEIRO et al., 2011).

A estimativa de distância genética entre genótipos possibilita a obtenção de

informações a respeito de organização de germoplasma, aumento na eficiência da

amostragem de genótipos, auxílio na definição de cruzamentos artificiais, a

13

incorporação de genes de germoplasma exótico e até na indicação de cultivares

para determinada região, quando o objetivo é aumentar a base genética das

cultivares (MOHAMMADI e PRASANNA, 2003).

Soares (2012) utilizou setenta cultivares crioulas coletadas no Estado do Rio

Grande do Norte, quatro cultivares melhoradas e três linhagens procedentes do

International Institute of Tropical Agriculture (IITA) para avaliar a resistência de

genótipos de feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp.) ao ataque do caruncho

Callosobruchus maculatus (Fabr.). As cultivares AM-63-3-Lizão Carioquinha ou Lizão

e AM-1-2-Quarentinha destacaram-se dentre as cultivares crioulas em resistência

por antibiose.

Antunes et al. (2007) também realizaram um estudo com genótipos crioulos

de feijão-comum (P. vulgaris), introduzidos do estado do Rio Grande do Sul.

Coletaram 32 progênies de plantas individuais selecionadas em 17 populações de

feijão, quanto ao seu potencial de produtividade, resistência às doenças

naturalmente ocorrentes em campo e uniformidade de grãos. A estratégia adotada

pelo autor implica em que, vindo a ser alguma das progênies selecionadas

consideradas como apta a constituir uma nova cultivar, prioritariamente deverá esta,

ser encaminhada à comunidade de produtores de onde proveio a população original.

Xavier et al. (2005) analisaram genótipos de feijão-caupi do Brasil, EUA e

Nigéria. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética em 45

genótipos de feijão-caupi por meio de marcadores RAPD. Estes se agruparam em

razão de suas respectivas origens (Brasil, EUA e Nigéria).

Na mesma linha de pesquisa Oliveira et al. (2003) analisaram a divergência

genética entre 16 genótipos de feijão-caupi coletados no Brasil e na Nigéria e

empregou-se as técnicas multivariadas, conforme Cruz e Regazzi (1997). Na

aplicação da técnica de agrupamento dos genótipos, foi adotada a distância

generalizada de Mahalanobis (1936), como medida de dissimilaridade por levar em

consideração o grau de dependência entre as variáveis estudadas. O máximo valor

de divergência genética (D2 = 253,04) foi obtido para os pares V-4 Alagoas e TVx-

337-3F, de origem geográfica diferente (Brasil e Nigéria, respectivamente), o que

pode ter contribuído para a maior dissimilaridade observada. Os menores valores de

D2 foram apresentados pelos pares TVx-337-3F com Vita-4 (TVu 1977-OD) e V-4

Alagoas com Bengala, de mesma origem geográfica, respectivamente, 5,06 e 5,62,

significando maior similaridade entre os caracteres considerados.

14

Souframanien e Gopalakrishna (2004) analisaram a diversidade genética

comparativa em 18 genótipos de Vigna mungo, usaram 25 primers RAPD e 16 ISSR

e obtendo 42,7% de polimorfismo nos fragmentos amplificados pelos iniciadores

RAPD e 57,5% quando amplificados por iniciadores ISSR. Os dendrogramas não

indicaram qualquer padrão claro de aglomeração de acordo com o local em que elas

foram coletadas. Resultados semelhantes foram obtidos em feijão-azuqui (YEE et

al., 1999) e em amendoim (DWIVEDI et al., 2001).

A distância geográfica como indicadora de divergência genética já foi foco de

críticas, pelo fato de nem sempre quantificar a divergência entre as populações, e

que, em muitos casos não se verifica relação entre diversidade genética e distância

geográfica (CRUZ, 1990; CRUZ e CARNEIRO, 2003). Vidal et al., (2006) justifica

esse mesmo problema, em seu trabalho, em razão de que nem sempre a região de

coleta é a região de origem.

2.3 Análise fingerprinting

Cada genótipo possui uma sequência de nucleotídeos que compõe seu DNA.

A detecção de diferenças entre essas sequências revela um padrão único, ou seja,

uma impressão digital genética (genetic fingerprinting) que pode ser utilizada na

identificação de indivíduos e também para testes de paternidade. Essas impressões

digitais podem ser detectadas através de marcadores moleculares, medindo a

distância genética entre os genótipos em estudo (SOUZA, 2001; OLIVEIRA et al.,

2007).

A correta identificação de um genótipo em um banco de germoplasma é

essencial. No entanto podem ocorrer erros nessa localização de genótipos. Isso

pode ser causado devido a problemas de homonímia (o mesmo nome para

diferentes genótipos), sinonímia (diferentes nomes para os mesmo genótipos) e até

devido ao controle inadequado da coleção. A análise de fingerprinting de DNA é uma

ferramenta poderosa na identificação desses erros. Praticamente todos os

marcadores moleculares de DNA podem ser utilizados na identificação de genótipos

por fingerprinting (FALEIRO, 2007; SAJIB et al., 2012).

Essa ferramenta também pode auxiliar os melhoristas na identificação de

prováveis parentais de híbridos, cuja origem é desconhecida, bem como na

estruturação da variabilidade genética no sentido de direcionar cruzamentos entre

grupos que favoreça a heterose. Estas aplicações podem ser ilustradas pelo

15

trabalho de Tantasawat et al. (2010) que analisaram a diversidade e a relação

genética de vinte e três genótipos de feijão-chicote (Vigna unguiculata spp.

sesquipedalis ) e sete acessos de um híbrido entre feijão-caupi (V. unguiculata spp.

unguiculata ) e feijão-chicote, na Tailândia. Foram usados caracteres morfológicos e

marcadores moleculares SSR e ISSR, obtendo-se 90,91% e 91,03% de polimorfismo

com os marcadores SSR e ISSR respectivamente.

Silva (2011) utilizou 12 locos microssatélites para estimar a diversidade

genética de 192 genótipos de feijão-fava (Phaseolus lunatus L.) O número de alelos

por loco foi elevado, variando de 5 (Bm155) a 15 (Bm170), com média igual a 8,33,

resultando em um total de 100 alelos. A heterozigosidade esperada (He), com média

igual a 0,68, foi alta e a heterozigosidade observada (Ho), com valor médio de 0,025,

foi significativamente menor, indicando alta endogamia nas subamostras estudadas,

verificada pelos valores índices de fixação ( f ).

2.4 Marcadores Moleculares

Entende-se por marcadores moleculares as diferenças genéticas entre dois

ou mais indivíduos e que são herdadas de parentais, correspondendo a regiões

expressas ou não do genoma. Essas regiões são segmentos específicos de DNA,

cuja sequência básica difere para diferentes genótipos (polimorfismo) e, portanto,

permite diferenciá-los (ZIMMER et al., 2005). Diferenças genéticas no DNA

significam, na maioria das vezes, diferenças fenotípicas (FALEIRO, 2007).

Os marcadores moleculares possuem vantagens com relação aos

marcadores morfológicos. Eles não sofrem influências ambientais, obtém um número

praticamente ilimitado de polimorfismos genéticos e a possibilidade de detecção de

tais polimorfismos em qualquer estágio do desenvolvimento da planta (XU, 2010).

Existem duas classes de marcadores moleculares. Aqueles baseados em hibridação

(RFLP e minissatélites) e os que são baseados em PCR (Polymerase Chain

Reaction), que inclui RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA); Microssatélites –

SSR (Simple Sequence Repeats); AFLP (Amplified Fragment Length

Polymorphism); ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) e os marcadores SNPs

(Single Nucleotide Polymorphism).

De acordo com Faleiro (2007) o uso de um ou de outro marcador vai

depender, entre outros fatores, do objetivo do trabalho, da infraestrutura, dos

16

recursos financeiros disponíveis, da disponibilidade dos recursos humanos e da

espécie a ser estudada.

As metodologias para detectar e analisar a variabilidade genética em nível

molecular oferecem informações adicionais a outros estudos relativos à conservação

e ao uso de bancos de germoplasma (SAJIB et al., 2012; FALEIRO, 2007). Os

marcadores moleculares são utilizados com sucesso na definição de grupos

heteróticos em várias espécies vegetais, na caracterização de acessos de

germoplasma e nos retrocruzamentos, auxilia na seleção para o genitor recorrente e

aumenta a eficiência do processo (RUMIN, 2005).

A avaliação da diversidade genética promove o uso eficiente de variações

genéticas em programa de melhoramento (ROCHA et al., 2003; SINGH, 2007).

Marcadores de DNA proporcionam uma oportunidade para caracterizar genótipos e

para medir relações genéticas precisas com relação a outros marcadores.

(BECKMANN e SOLLER, 1983; FALEIRO, 2007).

Marcadores moleculares vêm sendo utilizados para a identificação de

cultivares e para avaliar a diversidade genética entre genótipos de feijão, como Silva

et al. (2013) que utilizou 62 primers SSR para análise molecular em feijão-caupi;

Assunção Filho (2012) também utilizou marcadores SSR e marcadores morfológicos

para caracterizar populações da variedade crioula Boca de Moça de feijão-fava

(Phaseolus lunatus); Marçal et al. (2011) caracterizaram 500 genótipos de feijão

comum (Phaseolus vulgaris) com marcadores SSRs; Nkongolo (2003) e Xavier et al.

(2005) utilizaram RAPD para caracterizar geneticamente genótipos de V.

unguiculata. Já Coulibaly et al. (2002) analisaram a diversidade genética em Vigna

unguiculata com marcadores AFLP; com o mesmo objetivo Gillaspie et al. (2005)

utilizaram AFLP e SSR (microssatélites); Com marcadores ISSR Ajibade et al.

(2000) analisaram a relação genética entre diferentes espécies do gênero Vigna.

2.4.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

É uma técnica baseada em PCR, que envolve a amplificação de sequências

de DNA presente numa região de distância amplificável entre duas regiões repetidas

idênticas de microssatélites orientadas em direções opostas. A técnica utiliza

microssatélites, geralmente 16-25 pb de comprimento, como primers em uma reação

de PCR para amplificar principalmente as sequências inter-SSR de diferentes

tamanhos. Os produtos amplificados são usualmente 200-2.000 pb de comprimento

17

e passíveis de detecção tanto na eletroforese em gel de agarose como em gel de

poliacrilamida (REDDY et al., 2002).

As repetições de microssatélites utilizadas como primers podem ser di-

nucleotídico, tri-nucleotídico, tetra-nucleotídico ou penta-nucleotídico. Os primers

utilizados podem ser ou não ancorados (MEYER et al., 1993; GUPTA et al., 1994).

Marcadores ISSRs têm alta reprodutibilidade e repetibilidade (MENDES et al., 2012;

GOMES et al., 2012), possivelmente, devido à utilização de iniciadores mais longos

(16-25 pb) que permite a utilização de alta temperatura de anelamento (45–60ºC),

proporcionou maior especificidade em comparação com primers RAPD (que têm em

média 10 pb).

Os estudos sobre a reprodutibilidade mostra que apenas as bandas mais

fracas não são reproduzíveis. Mendes et al. (2012) obtiveram média de 83,3% de

reprodutibilidade quando usaram marcadores ISSR em pinhão manso (Jatropha

curcas L.), mesmo com o uso de termocicladores com diferentes curvas de rampa de

temperatura. Também se constatou que os padrões de amplificação dos diferentes

acessos e primers, não tiveram grandes diferenças quanto à intensidade das

bandas.

A taxa evolutiva de mudança dentro de microssatélites é consideravelmente

mais elevada do que a maioria dos outros tipos de DNA, assim a probabilidade de

polimorfismo nestas sequências é maior. A fonte de variabilidade nos ISSRs pode

ser atribuída ao deslizamento da DNA polimerase durante a replicação do DNA e

falha em reparar erros no pareamento das bases nitrogenadas, isso é considerado

como um mecanismo de criação, e hipervariabilidade SSRs (AGA, 2005; LEVINSON

e GUTMAN, 1987).

Dependendo do evento de inserção/deleção dentro da região SSR ou na

região amplificada pode resultar na ausência de um produto ou polimorfismo de

comprimento, dependendo da amplificação do tamanho do fragmento resultante. O

grau de polimorfismo também varia de acordo com o natureza do primer (que pode

ser não ancorado, 3'-ancorado, ou 5'-ancorado) e com a sequência das repetições

(motivo) no primer empregado. Uma vez que o primer é uma sequência SSR, a

frequência e a distribuição dos microssatélites repetidos em diferentes espécies

também influencia o padrão de bandas (REDDY et al., 2002).

Por ser uma técnica simples, rápida e eficiente, os marcadores ISSR vêm

sendo utilizados com sucesso para estimar o grau de diversidade genética em níveis

18

inter e intra-específico em uma ampla gama de espécies de plantas, que incluem

mulungu (GONÇALVES, 2014), pinhão-manso (GOMES, 2013), batata-doce

(MOULIN et al., 2012), abacaxi (AMARAL et al., 2011), milho (OLIVEIRA, 2010).

O uso em feijão também é amplo, Ghalmi et al. (2010) avaliaram vinte

variedades crioulas de feijão-caupi da Argélia com marcadores ISSR e RAPD;

Muthusamy et al. (2008) analisaram a variação genética entre 10 populações

crioulas de feijão-arroz (Vigna umbellata), utilizando marcadores RAPD e ISSR; El-

Hady et al. (2010) também avaliaram as variações genéticas em algumas espécies

do gênero Vigna por marcadores RAPD e ISSR; Silva et al. (2010) avaliaram a

variabilidade genética em quarenta e seis acessos de feijão-caupi de porte ereto e

ciclo precoce por meio de marcadores ISSR.

2.5 Análises populacionais

A maioria das populações é agrupada em subpopulações menores, nas quais

geralmente ocorrem os cruzamentos. Esse agrupamento é chamado de estrutura

populacional. A análise genética de populações tem como objetivos, dentre outros,

melhoria no desempenho de animais domésticos e plantas cultivadas; interpretação

de diferenças nas sequências de nucleotídeos de genes entre membros da mesma

espécie ou de espécies proximamente relacionadas. Também tem como objetivo a

análise de genes e genomas entre diversas espécies para determinar as suas

relações evolutivas e para testar hipóteses sobre o processo evolutivo (HARTL e

CLARK, 2010).

A abordagem genética e evolutiva procura quantificar a variabilidade

morfológica e quantitativa existente entre os indivíduos, seu sistema reprodutivo,

fluxo gênico, e as adaptações aos ambientes locais. São estas, em conjunto, as

principais características da estrutura de uma população local (PRITCHARD e

ROSENBERG 1999).

Muitos softwares estimam as estatísticas F a partir de marcadores

codominantes e a partir de dados de marcadores dominantes. Essas estatísticas são

utilizadas para quantificar o efeito de endocruzamento da subdivisão populacional,

que tem sido denominado índice de fixação. Esse índice é um útil indicador de

diferenciação genética, pois permite uma comparação objetiva do efeito geral da

estrutura populacional entre diferentes organismos (HARTL e CLARK, 2010).

19

Segundo Hartl e Clark (2010) o símbolo genético para o índice de fixação é F,

acrescido de subscritos que denotam os níveis hierárquicos a serem comparados:

FSR (Fixação das subpopulações relativas aos agregados regionais)

HS: É a heterozigosidade média, supondo EHW (equilíbrio de Hardy-Weinberg) entre

os organismos dentro das subpopulações de cruzamento aleatório;

HR: É a heterozigosidade média, supondo EHW entre os organismos dentro das

regiões;

HT: É a heterozigosidade média, supondo EHW (equilíbrio de Hardy-Weinberg) entre

os organismos dentro das subpopulações de cruzamento aleatório.

FRT (redução proporcional da heterozigosidade dos agregados regionais, em

relação à população combinada total)

FST (mede todos os efeitos da estrutura populacional combinada)

F = SR

H - HR S

HR

F = RT

H - HT R

HT

F = ST

H - HT S

HT

20

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

Foram caracterizados 64 genótipos, sendo 60 crioulos e 4 cultivares

comerciais de feijão-caupi pertencentes à Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária (Embrapa). Os 60 genótipos crioulos foram coletados em 13

microrregiões do Estado do Rio Grande do Norte (Figura 1), distribuídas nas quatro

mesorregiões do estado (Tabela 1). O estudo foi desenvolvido no Laboratório de

Biotecnologia e Biologia Molecular, da Embrapa Meio-Norte, em Teresina, PI.

1 2

3

4

5

6

8

7

9

11

1213

10

1 - Serra de São Miguel (4) 6 – Macau (3) 11 – Macaíba (3)

2 - Pau dos Ferros (5) 7 – Angicos (7) 12 – Agreste Potiguar (14)

3 - Chapada do Apodi (2) 8 - Serra de Santana (3) 13 - Litoral Sul (2)

4 – Mossoró (5) 9 – Borborema Potiguar (8)

5 - Vale do Açú (2) 10 – Baixa Verde (2)

Figura 1 - Localização das microrregiões do Rio Grande do Norte indicando os locais de procedência dos genótipos. O número de indivíduos de cada população está entre parênteses.

Tabela 1 - Genótipos de feijão-caupi, com a respectiva procedência quanto à mesorregião e microrregião do Estado do Rio Grande do Norte.

Microrregião Código da amostra

Mesorregião

Chapada do Apodi 22-1 Oeste Potiguar

Chapada do Apodi 61-1 Oeste Potiguar

Mossoró 14-1 Oeste Potiguar


Mossoró 31-1-2 Oeste Potiguar



Pau dos Ferros 20-1 Oeste Potiguar





Serra de São Miguel 24-1 Oeste Potiguar

21

Continuação Tabela 1 Tabela 1 - Genótipos de feijão-caupi, com a respectiva procedência quanto à mesorregião e microrregião do Estado do Rio Grande do Norte.


Mesorregião




Vale do Açú 23-1 Oeste Potiguar

Vale do Açú 30-1 Oeste Potiguar

Angicos 10-1 Central Potiguar







Macau 63-1 Central Potiguar



Serra de Santana 33-1 Central Potiguar



Agreste Potiguar 1-1 Agreste Potiguar









Agreste Potiguar 25-1-1 Agreste Potiguar





Baixa Verde 42-1 Agreste Potiguar

Baixa Verde 49-1 Agreste Potiguar

Borborema Potiguar 3-1 Agreste Potiguar








Litoral Sul 7-1 Leste Potiguar

Litoral Sul 7-2 Leste Potiguar

Macaíba 37-1 Leste Potiguar



Testemunha BR17-GURGUÉIA Testemunha

22

Continuação Tabela 1 Tabela 1 - Genótipos de feijão-caupi, com a respectiva procedência quanto à mesorregião e microrregião do Estado do Rio Grande do Norte.


Mesorregião

Testemunha BRS-GUARIBA Testemunha

Testemunha BRS-MARATAOÃ Testemunha

Testemunha BRS-NOVA ERA Testemunha

3.2 Extração e quantificação de DNA

As extrações de DNA genômico foram realizadas a partir de folhas jovens

coletadas na fase ativa de crescimento das plantas. As amostras foram

acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados e armazenados em

isopor com gelo, sendo transportados até o Laboratório de Biotecnologia e Biologia

Molecular da Embrapa Meio-Norte, onde foram mantidas em freezer até o início da

extração que foi realizado conforme recomendações do Kit de purificação Invitek

(INVISORB, 2008). A quantificação do DNA extraído foi verificada em gel de agarose

a 0,8%, preparado em tampão TBE 0,5X (Tris-Borato-EDTA), corado com GelRed-

Biotium® 10.000X (adicionou-se 0,4 µl de GelRed 10.000X para cada 100 ml de gel

de agarose) e comparado a resolução do DNA das amostras com o DNA-λ diluído na

concentração de 50 e 100 ng. A qualidade e quantidade de DNA extraído também foi

verificada através do espectrofotômetro NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo

Scientific). O DNA foi diluído à concentração de 7,0 ng/μL e estocado à -20ºC.

3.3 Seleção de primers e reação em cadeia de polimerase

Foram avaliados 40 primers desenvolvidos pela University of British Columbia

(UBC), Vancouver, Canadá, em cinco genótipos de feijão-caupi com a finalidade de

selecionar aqueles com maior polimorfismo, maior número e melhor resolução de

bandas para serem utilizados na caracterização molecular dos 64 genótipos (Tabela

2).

23

Tabela 2 - Primers utilizados na caracterização molecular, temperatura de melting (Tm), temperatura de anelamento (Ta), sequência e percentual de GC.

Primers Tm (ºC) Ta (ºC) Sequência 5'-------3'a % GC

UBC 810 45,40 50,00 GAG AGA GAG AGA GAG AT 47,06

UBC 811 46,80 49,00 GAG AGA GAG AGA GAG AC 52,94

UBC 816 50,01 49,00 CAC ACA CAC ACA CAC TA 47,06

UBC 822 47,00 47,00 TCT CTC TCT CTC TCT CA 47,06

UBC 826 52,80 54,00 ACA CAC ACA CAC ACA CC 52,94

UBC 827 53,00 57,00 ACA CAC ACA CAC ACA CG 52,94

UBC 828 51,30 50,00 TGT GTG TGT GTG TGT GA 47,06

UBC 834 49,20 53,00 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 50,00

UBC 840 47,40 49,00 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 50,00

UBC 846 51,80 55,00 CAC ACA CAC ACA CAC ART 50,00

UBC 857 54,30 55,00 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 55,55

UBC 880 47,90 52,00 GGA GAG GAG AGG AGA 60,00

UBC 885 48,30 55,00 BHB GAG AGA GAG AGA GA 58,82

a Y- (C,T); B- (C,G, T); H- (A, G, T); R- (A,G)

O programa do termociclador (eppendorf) e a composição das reações foram

obtidos a partir do trabalho realizado por Silva et al. (2010). As reações foram

realizadas em volume final de 10 µL, contendo os seguintes componentes: tampão

1,0x [20 mM Tris HCl, pH 8,0; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% (v/v) glicerol], MgCl2 a

2,0 mM, 0,8 mM de dNTP, 0,8 µM do primer, 1 U de Taq DNA polimerase

(Invitrogen) e 0,5 µL de DNA genômico (7 ng/µl).

As amplificações foram realizadas em termociclador de capacidade para 96

amostras, com uma fase inicial de desnaturação a 94 ºC por 4 minutos, seguidas de

40 ciclos nas seguintes condições: 1 minuto para desnaturação a 94 ºC; 1 minuto

para anelamento à temperatura de acordo com o primer e 1 minuto para extensão a

72 ºC. A extensão final foi realizada a 72 ºC por cinco minutos. Os produtos das

amplificações foram separados por eletroforese horizontal, com tampão TBE 0,5X,

em gel de agarose a 1,5% e corado com GelRed™. Em seguida, foram visualizados

em transluminador UV e fotodocumentados, sendo o tamanho dos fragmentos

amplificados calculados por comparação com os padrões de peso molecular

(Ladder) 100 pb e 1 Kb (Invitrogen).

24

3.4 A análise de dados ISSR

3.4.1 Dendrograma

A análise do padrão de bandas gerada por cada primer possibilitou a

montagem da matriz binária, em que foi conferido o valor (1) para a presença da

banda e (0) para a ausência. Todos os genótipos geraram amplificações de loci em

todos os primers. A partir desses dados, foi estimada a similaridade genética entre

os genótipos das diferentes populações, utilizando-se o coeficiente de similaridade

de Jaccard (sgij), conforme a expressão de Rohlf (1992) calculado pelo programa

PAST v. 1. 34 (HAMMER et al., 2001).

Em seguida, foi realizada a análise de agrupamento pelo método de Ligação

Média entre Grupos (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean -

UPGMA). O coeficiente de correlação cofenético (r) foi calculado pelo ajuste da

matriz de similaridade e do dendrograma gerado. O índice de confiabilidade de

bootstrap foi calculado a partir de 1.000 permutações.

3.4.2 Análise populacional

Uma segunda análise foi realizada no programa Structure 2.3.4 (PRITCHARD

et al., 2000), que se fundamenta no modelo bayesiano e gera uma distribuição

posterior com base na cadeia de Markov que identifica a presença de estrutura na

população, bem como a proporção do genoma de cada genótipo advindo de outros

grupos. Para essa análise, foi considerado o modelo de informação a priori da

população para a definição dos grupos. Considerou-se, em todas as análises

efetuadas, um número fixo de 300 mil iterações MCMC (“Monte Carlo Markov

Chain”) com descarte (“burn-in”) das 50 mil iterações, com 10 arquivos de

parâmetros contendo valores de K=1 a K= 14 e três corridas para cada valor de K. O

modelo utilizado foi com mistura (admixture model).

A determinação do número K mais provável em relação aos propostos foi

realizada utilizando-se valores de ΔK (EVANNO et al., 2005). A partir do valor do k

selecionado, foi gerado um gráfico utilizando o programa Structure.

Os componentes de variância, atribuídos às diferenças entre as 14

populações (microrregiões), entre locais dentro de microrregiões e entre indivíduos

dentro de locais, foram estimados pelo programa Arlequin v.3.0 (EXCOFFIER et al.,

1992). As significâncias dos componentes de variâncias foram obtidas por meio de

1000 permutações.

25

4 RESULTADOS

4.1 Análise da diversidade genética

O conjunto de 13 primers selecionados para avaliação de 64 genótipos gerou

257 locos ISSR, dos quais 247 foram polimórficos, correspondendo a 96,11% de

polimorfismo, obtendo-se média de 19,77 marcadores por primer, cujo tamanho dos

fragmentos variou de 200 a 2.000 pb (Tabela 3).

Tabela 3 - Locos amplificados e polimórficos gerados por 13 primers ISSR.

Primers Total de Locos Locos

polimórficos Polimorfismo %

Tamanho dos fragmentos (pb)*

810 25 25 100 270 - 1850

811 24 22 91,67 320 - 1750

816 10 9 90 400 - 1450

822 15 15 100 490 - 1650

826 10 5 50 500 - 1350

827 12 12 100 300 - 1300

828 12 12 100 400 - 1650

834 27 27 100 200 - 1825

840 26 26 100 200 - 1950

846 22 21 95,45 300 - 2000

857 22 22 100 300 - 2000

880 24 24 100 250 - 2000

885 28 27 96,43 200 - 1200

TOTAL 257 247 94,12

*pb: pares de bases

Os primers 810, 822, 827, 828, 834 (Figura 2), 840, 857 e 880 produziram

todos os locos polimórficos. Já o primer 826 foi o menos polimórfico, com 50% de

polimorfismo.

26

Figura 2 - Perfil de amplificação do primer UBC 834 em 17 genótipos de feijão-caupi. B é o

controle.

4.2 Análise de agrupamento

As similaridades genéticas entre os genótipos de cada população de feijão-

caupi calculadas com base no coeficiente de Jaccard variaram de 0,203 a 0,796. No

dendrograma (método UPGMA) (Figura 3) obtido a partir dos 257 locos amplificados

foi definido o ponto de corte pela média de similaridade entre os genótipos, que foi

de 0,40. Nas 14 populações avaliadas os marcadores ISSR possibilitaram a

discriminação de diferentes genótipos sendo capaz de formar três grupos.

O desempenho da análise do agrupamento, com base nos dados

moleculares, foi revelado através do coeficiente de correlação cofenético, que

apresentou um valor elevado (r= 0,92). Isso mostra estreita relação entre o

dendrograma e a matriz de similaridade.

27

Figura 3 - Dendrograma de similaridade genética a partir do coeficiente de Jaccard com agrupamento

pelo método UPGMA entre 64 genótipos de Vigna unguiculata (L.) Walp. oriundos do Estado do Rio

Grande do Norte. O número entre parênteses de cada genótipo indica o local de coleta.

28

O grupo I reuniu populações de todas as 13 microrregiões do Estado do Rio

Grande do Norte e as testemunhas. Isso evidência a proximidade e uma possível

complementaridade entre os genótipos crioulos e as testemunhas. Isso também

pode evidenciar as trocas de sementes entre os pequenos agricultores do Estado do

Rio Grande do Norte. O grupo II reuniu genótipos de cinco microrregiões: Pau dos

Ferros, Chapada do Apodi, Mossoró, Borborema Potiguar e do Agreste Potiguar, que

são distantes uma da outra, que chega atingir o máximo aproximado de 400 km.

Finalmente o grupo III reuniu genótipos das microrregiões de Angicos, Borborema

Potiguar, Agreste Potiguar e Litoral Sul. Neste grupo foi observada a maior relação

entre distância genética e distância geográfica, pois essas microrregiões são

próximas geograficamente.

A maior similaridade foi observada entre os genótipos de Serra de São Miguel

(39-1) e de Baixa Verde (42-1) com valor igual a 0,796, cujos municípios de coleta

ficam a uma distância de aproximadamente 380 km. Isso pode ser mais uma

evidência que houve troca entre materiais de feijão-caupi, prática que é muito

comum entre os pequenos agricultores. Já a menor similaridade foi registrada entre

os genótipos 1-1 (Agreste Potiguar) e 50-1 (Pau dos Ferros) com 0,203, cuja

distância de coleta é de 441 km.

Para melhor entendimento dos agrupamentos foi utilizado o programa

Structure, baseado na estatística bayesiana, que permitiu entender melhor os grupos

formados no dendrograma, pois os resultados do Structure mostraram uma mistura

entre os genótipos, como também mostrou o dendrograma. Dos 64 indivíduos

avaliados, cinco possuem ancestral em outras populações, pois possuem cores

diferentes no mesmo indivíduo (Figura 4). Os resultados também permitiram a

identificação de relações de parentescos entre os indivíduos avaliados.

Entre os valores de K testados verificou-se que o valor ótimo é k=2 (Figura 5).

29

Figura 4. Estrutura genética das populações de feijão-caupi (Vigna unguiculata), com as microrregiões de coleta. Os genótipos estão representados no eixo X por barras verticais, cujo tamanho é proporcional (eixo Y) à população a que pertence. A mesma cor em genótipos diferentes indica que eles pertencem ao mesmo grupo. Cores diferentes no mesmo indivíduo indicam a porcentagem do genoma compartilhado com cada grupo.

Figura 5. Valores de Δk para cada valor de k, calculado de acordo com o proposto por Evanno et al. (2005). O maior valor de k corresponde ao k ótimo.

30

As microrregiões de Serra de São Miguel, Vale do Açú, Macau, Baixa Verde,

Macaíba agruparam com as testemunhas como ocorreu no dendrograma. Todas as

outras microrregiões indicaram porcentagem do genoma compartilhado pelos dois

grupos formados.

4.3 Estrutura genética

Também foi verificada a estrutura genética, que foi avaliada utilizando-se a

metodologia de Excoffier et al. (1992). Houve diferenciação genética entre as 14

populações de feijão-caupi, sendo a diversidade genética total dividida em 8,18%

entre as populações e 91,82% dentro das populações (Tabela 6). O índice de

fixação (FST) foi de 0,0818 e todos os valores foram positivos nas 14 populações.

Tabela 4 - Análise de variância molecular (AMOVA) em 14 populações de feijão-caupi.

Fonte de

variação GL SQ

Componentes

de variância

Variação

(%) FST Pa

Entre populações

13 584,703 2, 87746 8,18 0,0818 0,001

Dentro das populações

50 1615,61 32,31219 91,82 - -

Total 63 2200,312 35,18965 100 - -

aTestes significantes depois de 1000 permutações; GL: grau de liberdade; SQ: soma dos quadrados;

FST: índice de fixação.

31

5 DISCUSSÃO

Conforme Grativol et al. (2011), a eficiência de um marcador molecular pode

ser medida pela quantidade de polimorfismo que o mesmo é capaz de detectar. Tal

eficiência foi evidenciada por Muthusamy et al. (2008), que usaram todos os primers

do presente trabalho (com exceção do 822) em seu estudo de diversidade genética

em feijão-arroz (Vigna umbellate), no qual quatro primers ISSR obtiveram 100% de

bandas polimórficas, registrando polimorfismo de 61,79%.

Silva et al. (2010) utilizaram oito primers ISSR para avaliar a variabilidade

genética em 46 genótipos de feijão-caupi de porte ereto e ciclo precoce, produzindo

62 locos, destes 49 foram polimórficos (79,04%) com 6,12 marcadores por primer.

No presente trabalho obteve-se uma média de 19,77 marcadores por primer. Isso

indica que os dados gerados por esses iniciadores pode explicar melhor a

diversidade genética entre os genótipos analisados. Visto que amplificaram um

número bem superior de marcadores ISSR.

O alto polimorfismo apresentado (96,11%) pelos 64 genótipos de feijão-caupi

também é devido principalmente aos genótipos crioulos, pois não sofreram nenhuma

seleção anterior. Quando uma espécie é domesticada, alelos de caracteres de

interesse aumentam na frequência, até serem fixados. Dessa forma, quando a

seleção é fortemente exercida sobre uma espécie, a diversidade genética é

drasticamente reduzida (WANG et al., 1999). A seleção é uma das principais

ferramentas do melhorista independente do tipo de método de melhoramento

utilizado. Para o uso dessa técnica ou método deve se ter populações com

variabilidade genética (diferentes genótipos), como as variedades crioulas,

(BESPALHOK et al., 2007b) o que é observado no presente estudo.

Assim a riqueza genética desses genótipos de feijão-caupi pode ser utilizada

para as mais diversas aplicações, tanto no estudo de genética como no

melhoramento da espécie, pois o cruzamento entre genitores mais divergentes pode

maximizar a heterose, que aumenta a possibilidade de lançamento de cultivares com

novas características de interesse no mercado de feijão.

A maioria dos genótipos (46), oriundos das 14 populações, incluindo as

cultivares domesticadas, se reuniu em um único grupo (I). Esse agrupamento pode

levantar várias dúvidas quanto à proximidade genética entre os indivíduos. Mas se

levar em consideração que esses genótipos foram coletados em pequenas

32

plantações de subsistência, onde há grande troca de sementes entre os agricultores,

esclarece-se esse agrupamento.

Diante desses dados percebe-se que as cultivares domesticadas tem relação

estreita com esses genótipos crioulos do Rio Grande do Norte. Por consequência,

um cruzamento entre estes genótipos poderia haver uma transferência de caracteres

de interesse. Já que os genótipos crioulos podem ter uma característica importante

no cultivo de feijão-caupi que não se apresenta nas cultivares melhoradas.

Como foi observado por Soares (2012), que identificou uma cultivar crioula

(AM-63-3-Lizão carioquinha ou Lizão) com o maior nível de resistência (antibiose) ao

Caruncho Callosobruchus maculatus (FABR.) (Coleoptera: Crysomelidae) dentre o

grupo de cultivares analisadas. Enquanto que as cultivares melhoradas

apresentaram baixa resistência. Essa cultivar crioula foi coletada na mesma

microrregião (Macau) que algumas cultivares crioulas do presente trabalho.

O grupo II reuniu genótipos, como o 20-1 (coletado no município de Itaú) e o

12-1 (coletado no município de Passa e Fica) que possuem uma distância

aproximada de 400 km entre elas. Mas também agrupou genótipos, como o 20-1 e

21-1, coletados respectivamente nos municípios de Itaú e Severino Melo, que distam

em aproximadamente 13 km. Evidenciado que os pequenos agricultores estariam

cultivando sementes de diversas origens na mesma área geográfica.

Esse genótipo (20-1) apresentou, segundo Soares (2012), resistência

moderada ao Caruncho (C. maculatus). Diante disso pode-se sugerir um cruzamento

entre esse genótipo e umas das cultivares melhoradas, pois a similaridade do 20-1

em relação a cada uma das cultivares melhoradas foi inferior a 30%.

Em diversos trabalhos observa-se que nem sempre há relação entre a

distância genética e a distância geográfica. Oliveira et al. (2003) analisaram a

divergência genética entre 16 genótipos de feijão-caupi oriundos do Brasil e da

Nigéria e concluiu que genótipos de mesma origem geográfica corresponderam a

maior distância genética. Resultados semelhantes foram obtidos por Bezerra (1997)

também com feijão-caupi. Vidal et al. (2006) justificam esse mesmo problema, em

seu trabalho, afirmam que nem sempre a região de coleta é a região de origem.

A distância geográfica como indicadora de divergência genética tem recebido

críticas, pelo fato de nem sempre quantificar a divergência entre as populações, e

que, em muitos casos não se verifica relação entre diversidade genética e distância

geográfica (CRUZ, 1990; CRUZ e CARNEIRO, 2003).

33

Para um melhor entendimento das distâncias genéticas entre os genótipos de

feijão-caupi usou-se o programa Structure. Inúmeros estudos tem usado esse

software para verificar a formação dos grupos gerados pelos dendrogramas em

feijão (BLAIR et al., 2007; BURLE et al., 2010; SILVA, 2011). Os resultados obtidos

podem ser de grande valia para a identificação de genitores, que quando cruzados,

aumentam as chances de seleção de genótipos superiores nas gerações

segregantes (CRUZ e REGAZZI, 2001).

Em contraste com o dendrograma o valor ótimo de k foi igual a dois, ou seja,

o programa Structure sugeriu a formação de apenas dois grupos. No entanto os

genótipos que se reuniram nos grupos II e III do dendrograma agruparam no mesmo

grupo segundo os resultados do Structure. São os genótipos que tem como

predominância a cor laranja (Figura 4). Dessa forma apesar de o dendrograma

indicar a separação entre os genótipos dos grupos II e III observa-se que na verdade

eles são bem próximos, podendo formar apenas um grupo. Isso indica congruência

nos resultados do dendrograma e do Structure.

As cultivares domesticadas mostraram-se com alta taxa de dissimilaridade

com genótipos de algumas microrregiões. Assim, essas cultivares já domesticadas

podem ser utilizadas em cruzamentos com genótipos crioulos diferentes

geneticamente e que tenham características de interesse (como rendimento, porte,

resistência a estresses bióticos e abióticos e boa qualidade dos grãos) para o

desenvolvimento de novas variedades de feijão-caupi.

Diante disso e baseado na matrix de similaridade podem ser sugeridos

cruzamentos entre os seguintes genótipos: 1-1 (Agreste Potiguar) e 50-1 (Pau dos

Ferros); 21-1 (Pau dos Ferros) e Guariba; Marataoã e 21-1 (Pau dos Ferros); Nova

era e 4-1 (Agreste Potiguar); 24-1 (Serra de São Miguel) e 10-1 (Angicos); 20-1 e

Marataoã. Já que possuem respectivamente os seguintes coeficientes de

similaridade: 0,203; 0,221; 0,227; 0,239; 0,240 e 0,230 (dados não mostrados).

Quanto aos resultados da estrutura genética, houve diferenciação genética

entre as 14 populações de feijão-caupi, sendo a maior parte da diversidade genética

dentro das populações (91,82%). Essa elevada diferenciação entre os indivíduos da

mesma população pode ser explicada pelo tamanho de quatro populações (Chapada

do Apodi, Vale do Açú, Baixa Verde e Litoral Sul) que só foi possível obter dois

genótipos de cada uma dessas populações. Assim tomam-se dois indivíduos ao

34

acaso pode se ter grande diferença entre esses dois, o que pode ter influenciado

nos resultados.

A divergência entre populações (FST), que foi de 8,18%, também pode ter sido

subestimada devido ao pequeno número de indivíduos em algumas populações,

pois não se esperava um valor tão baixo. Tendo em vista o modo de reprodução da

espécie, que é predominantemente autógama, pois apresenta cleistogamia, ou seja,

a polinização do estigma ocorre antes da abertura do botão floral ou antese

(BESPALHOK et al., 2007), como também ocorrência de baixa taxa de cruzamento

natural, geralmente abaixo de 1% (EHLERS e HALL, 1997). Segundo Carvalho

(2009) os padrões de distribuição da variabilidade genética estão correlacionados

com os sistemas reprodutivos.

Assim esperava-se divergência maior entre populações, como ocorreu no

estudo de Ghalmi et al. (2010), que encontraram a maior parte (71,50%) da

diversidade genética entre as populações crioulas de feijão-caupi da Argélia e

28,50% dentro das populações, também com marcadores ISSR.

No entanto a dissimilaridade genética mostrou-se mediana. Mesmo que o

FST tenha um valor mínimo teórico de zero (indicando nenhuma divergência

genética) e um máximo teórico de 1 (indicando fixação de alelos alternativos em

diferentes subpopulações), o máximo observado geralmente é muito menor do que 1

(HARTL e CLARK, 2010). Segundo Wright (1978) uma amplitude de 0,05 a 0,15

pode ser considerada indicativa de moderada diferenciação genética, como foi

observado nas populações de feijão-caupi avaliadas.

A análise estatística dos valores do FST mostrou-se significativa, o que

evidencia a diferença genética existente nas populações estudadas. Neste estudo, o

uso dos marcadores ISSR foi bastante eficiente na busca pela melhor compreensão

da diversidade e estruturação genética das populações de feijão-caupi oriundas do

Estado do Rio Grande do Norte e das testemunhas, sendo capaz de detectar a

existência de variabilidade entre os genótipos analisados.

35

6 CONCLUSÕES

A maior variabilidade genética está presente dentro das populações e não

houve relação entre a distância genética e a distância geográfica;

Os cruzamentos seguintes genótipos: 1-1 (Agreste Potiguar) e 50-1 (Pau dos

Ferros); 21-1 (Pau dos Ferros) e Guariba; Marataoã e 21-1 (Pau dos Ferros);

Nova era e 4-1 (Agreste Potiguar); 24-1 (Serra de São Miguel) e 10-1

(Angicos); 20-1 e Marataoã constituem a melhor combinação para programas

de melhoramento;

A divergência entre populações (FST) foi bem abaixo do esperado,

possivelmente devido ao compartilhamento das sementes entre os pequenos

agricultores do estado do Rio Grande do Norte. Já que os genótipos em

análise foram coletados em pequenas propriedades.

Observou-se moderada diferenciação genética entre as 14 populações

avaliadas.

Pode-se sugerir uma futura análise morfológica dessas cultivares para avaliar

as diferenças detectadas na análise molecular, e assim confirmar ou não os

cruzamentos sugeridos no presente trabalho.

36

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variabilidade genética de genótipos crioulos de feijão-caupi

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