uvas

108 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Encarte Especial

UVAS SEM SEMENTES

Uso da biotecnologia na busca de novas cultivares apirênicas 1

AGRICULTURA

Adriane Leite do AmaralEng.-Agr., M.Sc., Bolsista do CNPq/BIOEX.

Umberto Almeida CamargoEng.-Agr., M.Sc., Embrapa Uva e Vinho.

Paulo Ricardo Dias de OliveiraEng.-Agr., Dr., Embrapa Uva e Vinho,Caixa Postal 130, CEP 95700-000Bento Gonçalves, RS.

Fotos cedidas pelos autores

Figura 1: Cultura in vitro desementes-traço

1 . O CARÁTER APIRENIA NA UVAE O MELHORAMENTO GENÉTICO

O mercado de uvas in natura apre-senta tendência de aumento do consu-mo de uvas sem sementes, substituindoas tradicionais uvas com sementes. NosEstados Unidos as uvas apirênicas jádominaram o mercado e na Europa écrescente a demanda por uvas semsementes. Certamente em outros mer-cados, como o brasileiro, os consumi-dores estão susceptíveis a mudanças dehábito de consumo, dando preferênciaàs uvas apirênicas, consideradas demelhor qualidade.

Consonante com as demandas domercado, atualmente a criação de cul-tivares de uvas de mesa sem sementesé uma das grandes prioridades dosprogramas de melhoramento da videiraem todo o mundo.

Existem dois sis-temas com determi-nação genética paraapirenia, a parteno-carpia e a estenoes-permocarpia. A par-tenocarpia se carac-teriza pela ausênciatotal de sementes.Neste caso não ocor-re fecundação. O fru-to é desenvolvido ex-clusivamente a par-tir de tecidos mater-nos. Na estenoesper-mocarpia ocorre afecundação para aformação do fruto,seguida de aborto doembrião ainda imaturo devido à ausên-

cia ou má formação do endosperma.Desse processo, originam-se frutos ma-duros com sementes-traço pouco de-senvolvidas e macias, imperceptíveis aoconsumidor (STOUT, 1936). Na maioriados casos, o aborto do embrião ocorredepois de 8 semanas da fecundação(EMERSHAD et al., 1989, POMMER, etal., 1995) mas, também pode se dar de2 a 10 semanas após a polinização(STOUT, 1936; NITSH et al., 1960; EMER-SHAD et al., 1989).

A herança do caráter estenoesper-mocarpia ainda não está claramentedefinida e muitos são os modelos deherança sugeridos (PERL et al., 1998).

A necessidade de ampliação da va-riabilidade genética, através de cruza-mentos para a seleção de indivíduosapirênicos superiores, determinou oabandono da partenocarpia e a adoçãoda estenoespermocarpia por todos os

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Figura 2: Corte da semente-traçocom endosperma (esquerda) eembrião (direita). Aumento 40X

Figura 3: Seqüência de germina-ção do embrião

programas de melhoramento empenha-dos na obtenção de cultivares de uvasapirênicas.

A estenoespermocarpia vem sendoutilizada desde o século passado emcruzamentos incluindo genitor femini-no pirênico e masculino apirênico (LE-DBETTER & RAMMING, 1989). Estemodelo de cruzamento é consideradode baixa eficiência porque não se podeesperar que mais de 25% da progênieseja portadora de apirenia (RAMMING,1990). Diante desta baixa freqüência,torna-se essencial a formação de gran-des populações para aumentar as chan-ces de seleção de um indivíduo apirêni-co. Por outro lado, também exige maiortempo uma vez que um mínimo de 8anos são necessários para reunir ascaracterísticas de dois genitores apirêni-cos. Isto decorre de duas gerações decruzamentos, com 4 anos para cadageração, onde se depende de genitorpirênico para garantir aprodução de sementes.Considerando-se ainda otempo médio necessáriopara as demais etapas doprocesso de seleção, acriação de uma nova cul-tivar pode exigir um perí-odo total de 20 anos. Umsegundo modelo, utilizan-do cruzamentos entre ge-nitores apirênicos segui-do da técnica de resgatede embriões in vitro, éconsiderado de alta efici-ência porque permitecombinar característicasde dois genitores sem se-mentes em uma única geração, e resultanuma alta freqüência de indivíduos api-rênicos na progênie (mais de 80%).Utilizando-se este modelo a primeira

seleção é feita, emmédia, quatroanos após a reali-zação do cruza-mento, permitin-do abreviar paraaté 10 anos o tem-po de obtençãode uma nova cul-tivar. Além disso,também há maiorfacilidade de com-binar caracterescomplementares,sem os inconve-nientes da presença de genes do genitorpirênico.

Apesar da recente história da culturade tecidos em Vitis sp., com apenascinqüenta e quatro anos de estudosdocumentados, o resgate de embriõesnas hibridações entre genótipos apirê-nicos pode ser considerado como a

mais significativa contribuição para omelhoramento da videira (MULLINS,1990). Resultados mais importantes daaplicação da técnica de resgate de em-

briões imaturos de uvas semsementes começaram a serpublicados somente emmeados da década de 80nos Estados Unidos (CAINet al., 1983; EMERSHAD &RAMMING, 1984; EMER-SHAD et al., 1989) e emIsrael (SPIEGEL-ROY et. al.,1985). Com base nesses tra-balhos, o resgate de embri-ões passou a ser utilizadonos programas de melho-ramento da videira em di-versos países, como Aus-trália (BARLASS et al., 1988),Bulgária (TSOLOVA, 1990),França (BOUQUET & DA-

VIS, 1989), África do Sul (BURGUER &TRAUTMAN, 1998), Argentina (PONCE,et al., 1998) e Espanha (GARCIA et al.,1998). No Brasil, a técnica vem sendo

Uva Centennial Seedless Uva Centennial Seedless Uva Crimson Seedless Uva Flame Seedless


Figura 4: Poliembrionia em Vitis sp.

Figura 5: Desenvolvimento seqüencialdas plantas na fase de aclimatação

utilizada desde o início da década de1990 (PASSOS, et al., 1992; OLIVEIRA &CAMARGO, 1993; OLIVEIRA et al., 1994;POMMER et al., 1995; AMARAL et al.,1997; AMARAL et al., 1998; CAMARGO,1998).

2 . OBTENÇÃO DE PLANTAS PELORESGATE DE EMBRIÕES

Na seqüência deste trabalho é des-crita a rotina estabelecida no âmbito doprograma de melhoramento de uvas demesa conduzido pela Embrapa Uva eVinho, visando a obtenção de novascultivares a partir de cruzamentos entregenitores apirênicos.2.1- Cultivo das sementes-traço - Naprimeira etapa, as sementes-traço, pro-venientes de cruzamentos controladosentre genitores apirênicos, são retiradasdas bagas imaturas para o cultivo invitro. Os cachos devem ser colhidos de6 a 8 semanas após a polinização, mo-mento antes do aborto do embrião. Asbagas são separadas dos cachos, desin-festadas sob agitação constante em ál-cool etílico 70% por um minuto, e emsolução comercial de hipoclorito desódio, com 2,5% de cloro ativo, por 5

minutos, seguidos de três enxágüesem água destilada esterilizada. Con-cluída a desinfestação, as sementes-traço são extraídas das bagas em ca-pela de fluxo laminar, com auxílio deinstrumentos cirúrgicos esterilizados(pinças e bisturi) (Figura 1). A culturadas sementes-traço é feita em meio ER(EMERSHAD & RAMMING, 1984) com0,65% de ágar, 6 % de sacarose e 0,3%carvão ativado, em uma sala de cres-cimento sob as condições de escuro ecom temperatura de 26±2°C, por umperíodo de dois meses. Este tempo ésuficiente para completar o desenvol-vimento dos embriões desde simplesestruturas de 4-50 células, fase em queocorreria o aborto, até atingirem umtamanho aproximado de 1mm, quan-do estarão aptos a germinar e desen-volver plantas (BARLASS et al., 1988).2.2 - Resgate do embrião - As se-mentes-traço são dissecadas em cape-la de fluxo laminar, com auxílio deinstrumentos cirúrgicos e microscó-pio estereoscópico, uma vez que oembrião pode medir frações de milí-metro (Figura 2). Imediatamente asua extração, o embrião é cultivadoem tubos-de-ensaio (100x15mm) commeio-de-cultura Woody Plant (WP)

(LLOYD & McCOWN, 1986). Este meiofoi adaptado para resgate de embriõesde videira por RAMMING & EMERSHAD(não publicado) e testado por POMMERet al. (1995). O meio WP foi elaboradocom 0,65% de ágar, 3% de sacarose,0,3% de carvão ativado, e suplementa-

do com 2 ml de uma solução 1µM deBAP, para cada litro de meio-de-cultura.Neste meio-de-cultura e sob iluminaçãode 400 W/m2, com fotoperíodo de 16horas de luz, a germinação ocorre geral-mente em 15 dias (Figura 3). Passados30 dias após a germinação, as plantasapresentam desenvolvimento suficien-te para iniciar o processo de aclimata-ção

Tomando-se as medidas profiláti-cas, citadas anteriormente, raras são ascontaminações. Se necessário, os em-briões podem ser imersos em uma solu-

Uva Flame Seedless

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Figura 6: Rotina de obtenção deplantas oriundas de cruzamentosentre genitores apirênicos

ção 5% do biocida comercialPPM(PLANT CELL TECHNOLOGY,Inc.) por 5 minutos. A imersão pode serrepetida semanalmente, dependendoda reincidência da contaminação.

A formação de um banco para repo-sição de plantas pode ser usado comomedida de segurança. Para obtenção deduplicatas realiza-se a repicagem e cul-tivo de segmentos com dois nós, emtubos-de-ensaio (200 x 25 mm), emmeio sólido de GALZY (1964), própriopara multiplicação da videira. Convémsalientar que este banco de reposiçãoencarece o processo e torna-se dispen-sável quando não ocorrem perdas nasetapas de aclimatação.

Em alguns cruzamentos, tem se ob-servado uma freqüência de poliembrio-nia superior àquela de 0,5% documen-tada na literatura (BOUQUET, 1978)(Figura 4). Embora a poliembrionia emVitis sp. ainda seja pouco explorada,representa um potencial para uso datransformação genética, onde a inser-ção de genes favoráveis em embriõeszigóticos múltiplos pode significar umgrande avanço do germoplasma de umprograma de melhoramento (EMER-SHAD & RAMMING, 1994).2.3. Aclimatação - É a fase de adapta-ção das plantas, desde a saída da condi-ção in vitro até estarem aptas para ocultivo em condições normais de cam-po (Figura 5). As plantas com desen-volvimento mínimo de cinco folhas, evigoroso sistema radicular, estão aptaspara iniciar o processo de aclimatação.Elas são retiradas dos tubos-de-ensaio eplantadas em copos plásticos contendoum substrato composto por solo corri-gido (pH=6,0), vermiculita e substratocomercial (PLANTMAX) na propor-ção 1:2:1. A mistura é esterilizada emautoclave por 60 minutos a 1200C.2.3.1. Sala de aclimatação - Nestaetapa, as plantas são muito sensíveis àscondições do ambiente, como tempera-tura e umidade. Devem ser corretamen-te protegidas para evitar perdas pordesidratação e ressecamento. A infesta-ção por patógenos também pode resul-tar em perdas se não forem tomadas asdevidas precauções. Cada planta é man-tida em câmara úmida individual, den-tro de uma sala asséptica com tempera-tura entre 25 e 30°C, sob luminosidadeconstante (400 W/m2). Nos primeiros 4dias a umidade relativa é mantida emtorno de 80%, pela cobertura com co-pos plásticos transparentes. A umidadedeve ser reduzida pela abertura gradual

da cobertura plástica até a sua retiradapor completo, o que ocorre, em média,15 dias após o plantio. Ao final desteperíodo, as plantas devem ser transferi-das para a casa-de-vegetação para com-pletar o processo de aclimatação.2.3.2. Casa-de-vegetação - Duranteesta fase a temperatura deve ser manti-da entre 20 e 30ºC, a umidade do ar deveser superior a 60% e a luminosidade emtorno de 400W/m2. Nestas condições,em cerca de 10 a 15 dias as plantasatingem o tamanho necessário para otransplante para sacos plásticos conten-do 1 kg do substrato já citado. Logoapós o transplante e para assegurar umbom desenvolvimento das plantas, sãofeitas aspersões com solução Anti-stress2000 (POLYMER AG), e adubaçõescom solução nutritiva própria para avideira (EPSTEIN, 1975). Em aproxima-damente 15 a 20 dias após o transplanteas plantas já podem ir para o telado.2.3.3. Telado - Na terceira etapa deaclimatação, as plantas são mantidas,durante 15 dias, sob telado, com 40% desombreamento, em condições naturais

de temperatura e de umidade relativado ar. Acompanhamento com fertirri-gações semanais e eventuais aspersõescom solução anti-stress, sempre quenecessárias, devem ser feitas até o mo-mento do plantio no campo.

A rotina do processo para obtençãode plantas apirênicas exige um períodovariável de 6 a 10 meses, desde ashibridações até a obtenção de plantasem condições para plantio no campo,incluindo todas as etapas descritas nes-te trabalho (Figura 6).

3. RESULTADOS E PERSPECTIVAS

Em oito safras foram obtidas 2183plantas de cruzamentos entre genitoresapirênicos, utilizando-se a técnica deresgate e cultivo de embriões in vitro.Cabe salientar que 97% das plantasforam obtidas, nos dois últimos anos,como conseqüência dos ajustes e apri-moramentos da técnica. Do total de 151cruzamentos foram cultivados in vitromais de 17 mil sementes-traço e resga-tados em torno de 4000 embriões ima-turos. Atualmente, as plantas obtidasestão em processo de seleção no cam-po.

Considerando-se o domínio atualdas técnicas para obtenção de plantasapirênicas no laboratório da EmbrapaUva e Vinho, é possível atingir a produ-ção de 1500 plantas por ciclo de cruza-mentos, com o trabalho de apenas doislaboratoristas. Como as condições sub-tropicais e tropicais do Brasil proporci-onam a colheita de uvas em qualquerépoca do ano, estão sendo feitos trêsciclos anuais de cruzamentos, em Ben-to Gonçalves - RS, em Jales - SP e emPetrolina - PE. Isto permitiu triplicar acapacidade do laboratório, obtendo-seentre 4000 e 5000 plantas de resgate deembriões por ano. Este fluxo pode sermantido sem ampliação da área paraavaliação de populações, devido aorápido desenvolvimento das plantasem climas quentes, onde a primeiraseleção, para a grande maioria daspopulações, pode ser feita em tempoinferior a 18 meses após o plantio nocampo.

Dessa forma, o programa de melho-ramento de uvas sem sementes daEmbrapa Uva e Vinho deverá atender àgrande demanda do setor produtivocom lançamento de novas cultivares deuvas apirênicas, adaptadas às diferen-tes regiões vitícolas do país e com aqualidade desejada pelo mercado.


4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1 Projeto executado em parceria com aValexport e Cooperativa Jales Ltda.,com apoio do Sebrae e do CNPq/BIO-EX.

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