utilização de polimorfismos em análises forenses luciana otero lima - março/2006-

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  • Utilizao de Polimorfismos em Anlises Forenses Luciana Otero Lima - Maro/2006-
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  • Relembrando... Polimorfismo Gentico a coexistncia de alelos mltiplos em um lcus cromossmico; regies do genoma nas quais existem variaes entre as pessoas. Polimorfismo Gentico a coexistncia de alelos mltiplos em um lcus cromossmico; regies do genoma nas quais existem variaes entre as pessoas. Polimorfismo de stio de restrio (RFLP) Polimorfismo de stio de restrio (RFLP) Polimorfismo de nucleotdeo nico (SNP) Polimorfismo de nucleotdeo nico (SNP) Polimorfismos de insero/deleo (indels) Polimorfismos de insero/deleo (indels) Polimorfismos de minissatlites (VNTR) Polimorfismos de minissatlites (VNTR) Polimorfismos de microssatlites (STR) Polimorfismos de microssatlites (STR)
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  • Qual a importncia desses polimorfismos? Fonte de variabilidade; Permitem construir um perfil gentico indivduo-especfco DNA fingerprint; importante em Medicina Forense
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  • Por que analisar tais polimorfismos no DNA? Determinao de paternidade; Determinao de paternidade; Resoluo de casos criminais envolvendo: Resoluo de casos criminais envolvendo: Estupro; Estupro; Homicdio; Homicdio; Rapto; Rapto; Troca ou abandono de crianas. Troca ou abandono de crianas.
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  • De onde pode ser extrado o DNA? Sangue padro-ouro; Sangue padro-ouro; clulas epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...; clulas epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...; Plos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar); Plos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar); Unhas; Unhas; Esfregaos; Esfregaos;
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  • De onde pode ser extrado o DNA? Manchas de material biolgico: lquido seminal, urina, saliva, sangue; Manchas de material biolgico: lquido seminal, urina, saliva, sangue; Tecidos de bipsias cirrgicas; Tecidos de bipsias cirrgicas; Ossadas (carbonizadas ou no); Ossadas (carbonizadas ou no); Tecidos mumificados ou congelados; Tecidos mumificados ou congelados; Clulas deixadas por impresso digital; Clulas deixadas por impresso digital; Dentes; Dentes; outras outras
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  • Como extrair o DNA? Tcnicas especficas para cada tipo de amostra; Tcnicas especficas para cada tipo de amostra; CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extrado CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extrado
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  • Mtodos disponveis para utilizao: VNTRs estudados com sondas multilocais; VNTRs estudados com sondas multilocais; STRs estudados com PCR; STRs estudados com PCR; DNA mitocondrial (mtDNA); DNA mitocondrial (mtDNA); STRs do Cromossomo Y; STRs do Cromossomo Y; Tcnicas mais recentes. Tcnicas mais recentes.
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  • VNTRs estudados com sondas multilocais Princpio do mtodo: aps clivagem por endonucleases, cada indivduo tem um padro de bandas especfico com tamanhos determinados pela presena, ou no, do stio da enzima e pela quantidade de repeties em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqncia invarivel. Princpio do mtodo: aps clivagem por endonucleases, cada indivduo tem um padro de bandas especfico com tamanhos determinados pela presena, ou no, do stio da enzima e pela quantidade de repeties em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqncia invarivel.
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  • VNTRs estudados com sondas multilocais
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  • Tcnica de custo razovel; Tcnica de custo razovel; DNA no degradado; DNA no degradado; Quantidade suficiente de DNA; Quantidade suficiente de DNA; Vrias dificuldades inerentes tcnica. Vrias dificuldades inerentes tcnica. VNTRs estudados com sondas multilocais
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  • Teste de paternidade: Teste de paternidade: VNTRs estudados com sondas multilocais
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  • Identificao de um criminoso: Identificao de um criminoso:
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  • STRs estudados com PCR Princpio do mtodo: Reao de PCR utilizada para copiar extensivamente vrias regies de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqenciamento Princpio do mtodo: Reao de PCR utilizada para copiar extensivamente vrias regies de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqenciamento
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  • STRs estudados com PCR
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  • Recuperao de DNA em amostras de tecidos e fluidos Amostra (tecidos e fluidos) Quantidade recuperada Anlise de RFLP Anlise de STR 1mL de sangue 20 a 40 g SIMSIM Manchas de sangue seco de 1cm 3 200ngNOSIM Smen 150 a 300 g por mL SIMSIM Smen (esfregao vaginal ps-coito) 0 a 3 g (DNA dos espermatozides) SIMSIM Cabelo com raiz (contendo bulbo capilar) 1 a 750ng por fio NOSIM Saliva 1 a 10 gpor mL SIMSIM Retirado de Os exames de DNA nos Tribunais, Revista Cincia Hoje (vol. 29, n 169 - maro/2001)
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  • Vantagem sobre a tcnica de VNTR: como o DNA amplificado, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor. Vantagem sobre a tcnica de VNTR: como o DNA amplificado, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor. Mesmo existindo contaminao por DNA de outras espcies, a tcnica de PCR especfica o suficiente para amplificar apenas o DNA humano Mesmo existindo contaminao por DNA de outras espcies, a tcnica de PCR especfica o suficiente para amplificar apenas o DNA humano STRs estudados com PCR
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  • OBS: Quantas regies so necessrias? OBS: Quantas regies so necessrias?
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  • mtDNA Caractersticas importantes: Caractersticas importantes: Tambm contm regies polimrficas que permitem a individualizao; Tambm contm regies polimrficas que permitem a individualizao; Descendentes recebem apenas da me permite traar a linhagem materna de uma pessoa; Descendentes recebem apenas da me permite traar a linhagem materna de uma pessoa; mais resistente degradao que o DNA nuclear. mais resistente degradao que o DNA nuclear. taxa mutacional do mtDNA 5-10 vezes maior que a do DNA nuclear poucos mecanismos de reparo permitem que as variaes nos nucleotdeos sejam acumuladas taxa mutacional do mtDNA 5-10 vezes maior que a do DNA nuclear poucos mecanismos de reparo permitem que as variaes nos nucleotdeos sejam acumuladas
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  • Princpio do mtodo: Reao de PCR com o objetivo de copiar extensivamente regies polimrficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento Princpio do mtodo: Reao de PCR com o objetivo de copiar extensivamente regies polimrficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento mtDNA
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  • mtDNA
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  • Utilizado quando a amostra em questo tem uma quantidade pequena ou no tem DNA nuclear; Utilizado quando a amostra em questo tem uma quantidade pequena ou no tem DNA nuclear; mtDNA
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  • Utilizado na identificao de corpos em grandes desastres comparar a seqncia de interesse com a obtida nos possveis irmos ou ascendentes maternos; Utilizado na identificao de corpos em grandes desastres comparar a seqncia de interesse com a obtida nos possveis irmos ou ascendentes maternos; Identificao de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas) Identificao de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas) No identifica um indivduo especfico; No identifica um indivduo especfico; Estudos histricos ou evolutivos. Estudos histricos ou evolutivos. mtDNA
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  • STRs crY Caractersticas importantes: Caractersticas importantes: Tambm contm regies polimrficas que permitem a individualizao; Tambm contm regies polimrficas que permitem a individualizao; Homens recebem apenas do pai permite traar a linhagem paterna de um homem; Homens recebem apenas do pai permite traar a linhagem paterna de um homem; Crossing-over com o crX em regies homlogas entre os 2 cromossomos. Crossing-over com o crX em regies homlogas entre os 2 cromossomos.
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  • STRs crY
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  • Identificao de paternidade sem o pai (p/ filhos); Identificao de paternidade sem o pai (p/ filhos); Elucidao de estupro (mistura de DNA); Elucidao de estupro (mistura de DNA); No identifica um indivduo especfico; No identifica um indivduo especfico; Estudos histricos ou evolutivos; Estudos histricos ou evolutivos;
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  • Tcnicas mais recentes SNPs SNPs Minisseqenciamento; Minisseqenciamento; So muito numerosos; So muito numerosos; Baixa taxa de mutao; Baixa taxa de mutao; Requer maior n de marcadores; Requer maior n de marcadores; Indels Indels Estudados em produtos de amplificao muito curtos (50pb ou menos) vantagem sobre STRs em estudos de DNA extremamente degradado (ex: cadver em estado avanado de decomposio ou carbonizado)
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  • E no futuro... Bancos completos de perfil de criminosos OBS: Bancos completos de perfil de criminosos OBS: Inglaterra Inglaterra CODIS Combined DNA Index System (1994) CODIS Combined DNA Index System