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PAULA JIMENA DINIZ SACHS
USO DE SOFTWARE EM ANÁLISES DE INTERESSE AGRONÔMICO: DETERMINAÇÃO DE DIMENSÕES E
CORES
Londrina 2007
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PAULA JIMENA DINIZ SACHS USO DE SOFTWARE EM ANÁLISES DE INTERESSE AGRONÔMICO: DETERMINAÇÃO DE DIMENSÕES E
CORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade Estadual de Londrina. Orientadora: Drª Carmen S. V. J. Neves Co-orientador Dr. Marcelo G. Canteri
Londrina 2007
PAULA JIMENA DINIZ SACHS
USO DE SOFTWARE EM ANÁLISES DE INTERESSE AGRONÔMICO: DETERMINAÇÃO DE DIMENSÕES E
CORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade Estadual de Londrina.
Aprovada em: 28/02/2007
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Giovanetti Canteri UEL
Prof. Dr. Fabio Yamashita TAM/UEL
Profª. Drª. Sandra Helena Prudencio Ferreira TAM/UEL
Profª. Drª. Maria de Fátima Guimarães UEL
Profª. Drª. Débora Cristina Santiago UEL
____________________________________ Profª. Drª. Carmen S. V. J. Neves
Orientadora Universidade Estadual de Londrina
"O conhecimento é uma ilha em um
oceano de mistério. Prefiro o
oceano..."
Ludwig J. J. Wittgenstein
AGRADECIMENTOS
Agradeço:
À minha orientadora Profª Drª Carmen S. V. J. Neves
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Marcelo G. Canteri
Ao Prof. Dr. Luís Guilherme Sachs (FALM/UENP)
Aos Professores do programa de pós-graduação em Agronomia - UEL
Às Instituições: UEL, FALM/UENP, CAPES.
SACHS, Paula Diniz Sachs. Uso de Software em Análises de Interesse Agronômico: Determinação de Dimensões e Cores. 2007. 72 f. Dissertação de Mestrado em Agronomia-Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2007.
RESUMO
O processamento digital de imagens é útil na resolução de vários problemas de interesse
agronômico, permitindo o reconhecimento, dimensionamento e quantificação dos elementos
da imagem, como cor, textura e área. Os objetivos desse trabalho foram: a) desenvolver um
método para avaliar a cor de açúcar; b) elaborar e validar uma escala diagramática para
quantificação da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho; c) avaliar o software SFP na
determinação de áreas foliares e lesionadas em folhas. Com o método alternativo para
determinar cor de açúcar obteve-se r2 = 0,974 para a regressão linear comparada com o
método oficial ICUMSA. A escala diagramática elaborada para mancha foliar de
Phaeosphaeria melhorou a precisão, exatidão (acurácia) e reprodutibilidade das estimativas,
independente da experiência do avaliador. O software SFP apresentou boa precisão e exatidão
nas quantificações de áreas foliar e lesionada.
Palavras-chave: RGB, pixel, processamento de imagens, escala diagramática, cor ICUMSA.
SACHS, Paula Diniz Sachs. Software Use in Analyses of Agronomic Interest: Determination of Dimensions and Colors. 2007. 72 f. Dissertação de Mestrado em Agronomia-Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2007.
ABSTRACT
The digital processing of images is useful in the resolution of some problems of agronomic
interest, allowing the recognition, sizing and quantification of the picture elements, as color,
texture and area. The objectives of this work were a) to develop a method for evaluation of
sugar color; b) to elaborate and to validate a diagrammatic scale for evaluation Phaeosphaeria
leaf spot in maize; c) to evaluate the software SFP for determination of leaf and injury area in
leaves. With the alternative method to determine sugar color the r2 was 0,974 for the linear
regression in comparison with official method ICUMSA. The elaborated diagrammatic scale
for leaf spot in maize improved the precision, accuracy and reproductibility of the estimates,
independent of the rater experience. The software SFP presented good precision and accuracy
in the quantification of leaf and injury areas.
Key-words: RGB, pixel, picture processing, diagrammatic scale, ICUMSA color.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1 2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................2
2.1. Avaliações por Meio de Análises de Imagens .................................................................2 2.2. A Cor e sua Importância em Análises da Qualidade de Alimentos.................................4
2.2.1. Avaliação da cor de açúcar .......................................................................................8 2.3. Quantificação de Doenças de Plantas ..............................................................................9
2.3.1. Avaliação a campo..................................................................................................10 2.3.1.1. Uso de software para treinamento de avaliadores............................................12
2.3.2. Avaliação em laboratório........................................................................................13 2.4. Tratamento de Imagens..................................................................................................14
3. ARTIGO A: MÉTODO ALTERNATIVO PARA DETERMINAR COR DE AÇÚCAR
3.1. Resumo ..........................................................................................................................16 3.2. Abstract ..........................................................................................................................17 3.3. Introdução ......................................................................................................................18 3.4. Material e Métodos ........................................................................................................20 3.5. Resultados e Discussão ..................................................................................................21 3.6. Conclusão.......................................................................................................................29 3.7. Sugestão para Novos Ensaios ........................................................................................29
4. ARTIGO B: ESCALA DIAGRAMÁTICA PARA AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE
DA MANCHA FOLIAR DE PHAEOSPHAERIA EM MILHO 4.1. Resumo ..........................................................................................................................30 4.2. Abstract ..........................................................................................................................31 4.3. Introdução ......................................................................................................................32 4.4. Material e Métodos ........................................................................................................34 4.5. Resultados e Discussão ..................................................................................................35 4.6. Conclusão.......................................................................................................................44
5. ARTIGO C: AVALIAÇÃO DE SOFTWARE PARA ESTIMAR ÁREAS FOLIARES
E LESIONADAS 5.1. Resumo ..........................................................................................................................45 5.2. Abstract ..........................................................................................................................46 5.3. Introdução ......................................................................................................................47 5.4. Material e Métodos ........................................................................................................48 5.5. Resultados e Discussão ..................................................................................................50 5.6. Conclusão.......................................................................................................................55
6. CONCLUSÕES GERAIS...................................................................................................56 REFERÊNCIAS ......................................................................................................................57
1
1. INTRODUÇÃO
O processamento digital de imagens tem se destacado como um dos campos
de maior desenvolvimento e significância na resolução de problemas m diversas áreas da
ciência, seja no melhoramento de imagens ou na medição e análise de grandezas. Isso se
tornou possível graças à evolução da informática, através do aprimoramento dos sistemas de
hardwares e softwares e o surgimento de periféri ar
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Avaliações por Meio de Análises de Imagens
Uma imagem digital pode ser definida como uma função bidimensional da
intensidade de luz refletida ou emitida por um objeto, na forma I(x,y); onde os valores de I
representam a intensidade da imagem de cada coordenada espacial (x,y). Essas intensidades
são representadas por um valor inteiro, não-negativo e finito. Cada ponto captado pelos
sensores, corresponde a uma área mínima denominada "pixel" (picture element), que é
identificado por uma coordenada espacial (x,y), e para o qual são registrados valores digitais
relacionados à intensidade de energia refletida em faixas bem definidas do espectro
eletromagnético. O processo de digitalização de uma imagem não-digital ("imagem
contínua") corresponde a uma discretização (ou amostragem) da cena em observação, através
da superposição de uma malha hipotética e uma atribuição de valores a cada ponto dessa
malha (processo chamado de quantização) (INPE, 2005).
As imagens digitais representam ponto a ponto as cores da cena analisada
(Ferreira et al., 1999). A resolução de uma imagem é dada pelo número de linhas e colunas
(ou de pixels) que a formam. A resolução indica a quantidade de detalhe presente em uma
imagem dentro de uma determinada região. Com resolução de 300dpi (pontos por polegada)
consegue-se obter “qualidade fotográfica”, pois esse é o limiar da percepção do observador.
No entanto, mesmo a 300dpi, uma análise pormenorizada de uma imagem revelará suas
limitações. Desta forma, quanto maior for a resolução, mais detalhes podem ser obtidos da
imagem (Fonseca, 2006). Para um observador com acuidade visual normal, as cores dos
objetos (ou imagens) são o resultado da combinação das cores de áreas com diâmetro da
ordem de 10-4 m, que corresponde a um ângulo de visão de 1’ para a visão escotópica e 4’
para a visão fotópica, sendo esta última a que distingue as cores, resultando em uma sensação
visual em cor da área em questão (Bicas, 2002; Paleta e Brito, 2006).
As cores da imagem digital são geradas pela transformação de informações
analógicas dos sinais digitais, em cada pixel, através de um processo de digitalização do sinal
3
analógico. Essas informações já quantizadas em níveis digitais são alocadas para cada pixel.
Quanto maior o nível digital melhor será a representação da informação analógica. Porém,
será necessário um número maior de bits para representar a imagem e portanto necessitará de
mais memória (virtual e real) para armazenar essa imagem. Assim, para se armazenar as
informações de cores de uma cena, cada pixel da imagem é associado a um valor que
identifica a cor digital do pixel. A quantidade de combinações digitais possíveis, para cada
pixel de uma cena, é determinada pelo número de bits usados para codificação da imagem
(geralmente 8 bits ou 256 níveis digitais), que em um sistema de 3 canais (R G B 24 bits) é
possível 16,7 milhões de combinações de cores. Para se determinar a cor desse pixel é
necessário que exista uma tabela de cores que associe cada uma das cores com as intensidades
de R G B que formam o pixel (INPE, 2005).
O sistema R G B de cores primárias é um sistema aditivo que está baseado
na teoria dos três estímulos (Tristimulus Color Theory). Segundo essa teoria, o olho humano
percebe a cor através da estimulação dos três pigmentos visuais presentes nos cones da retina.
Os picos de sensibilidades do olho humano se aproximam dos valores de comprimentos de
onda usados em cada canal de cor do sistema R G B: 630 nm (Vermelho-Red), 530 nm
(Verde-Green) e 450 nm (Azul-Blue). Esse sistema pode ser representado graficamente
através do cubo unitário definido sobre os eixos R G B, como ilustrado na Figura 2.1. A
origem representa a cor preta, o vértice de coordenadas (1, 1, 1) representa a cor branca, os
vértices que estão sobre os eixos representam as cores primárias e os demais vértices
representam o complemento de cada cor primária. Cada ponto no interior do cubo
corresponde a uma cor que pode ser representada pela tripla (R G B), com os valores R G B
variando de 0 a 1. No sistema de formação de imagens em monitores de tubo de raio catódico
(CRT) ou digital de cristal líquido (LCD), em sistema de 8 bits, é possível estabelecer 256
níveis de intensidade luminosa para cada canal de cor. Os tons de cinza são representados ao
longo da diagonal principal do cubo, que vai da origem (ponto correspondente a cor preta) até
o vértice que corresponde à cor branca. Cada tom ao longo dessa diagonal é formado por
contribuições iguais de cada primária. Logo, um tom de cinza médio entre o branco e o preto
é representado por (0.5, 0.5, 0.5) (Scuri, 1999; Traina e Oliveira, 2004)
4
Figura 2.1 - Cubo de cor R G B
O processamento das imagens digitais para obtenção das informações de
cores armazenadas no sistema R G B, tornou-se possível graças à evolução dos sistemas de
hardware e software (Gonzalez e Woods, 2000). Com o uso dos recursos da informática é
possível reduzir o tempo e custo das análises convencionais. A implementação desses
recursos na análise de imagens, aplicada à pesquisa, permite a obtenção de informações
complementares às obtidas com técnicas tradicionais. Em diversos estudos, nas diferentes
áreas da ciência como engenharia, medicina e agropecuária dentre outras, as análises por meio
de imagens são usadas para resolução de problemas, na identificação de fenômenos e na
quantificação de grandeza (Jorge, 1996) tais como: na avaliação de cor em análises de
qualidade de produtos agropecuários, quantificação de doenças em plantas, dentre outras
avaliações.
2.2. A Cor e sua Importância em Análises da Qualidade de Alimentos
A maioria das informações que o homem recebe é percebida por meio da
visão. A cor é uma sensação produzida nos cones da retina por ondas de luz de diferentes
comprimentos (Ferreira et al., 1999). Na parte central da retina existem aproximadamente 7
milhões de células do tipo cones, que são sensíveis às cores e apresentam atividade em
condições de luminosidade elevada (visão fotópica). Outras 100 milhões de células, do tipo
5
bastonetes, cobrem toda a parte periférica e são sensíveis à luz, mesmo em condições de baixa
luminosidade, porém não distinguem cores (visão escotópica) (Farina, 1999).
Os cones da retina, responsáveis pela visão fotópica, apresentam três tipos
de fotopigmentos capazes de receber e transmitir três sensações (tri-estímulos) e reagem,
portanto, de forma distinta às diferentes freqüências de ondas eletromagnéticas na banda da
luz visível, como pode ser visto na Figura 2.2. Os fotopigmentos azuis (B) sensíveis aos
comprimentos de ondas curtas sensibilizam-se com ondas de até 529 nm, e apresentam
máxima resposta a 445 nm. Os outros tipos de fotopigmentos são mais sensíveis aos
comprimentos de 535 nm e 575 nm, entretanto, ao contrário dos azuis, cobrem também outras
regiões do espectro visível, e são conhecidos como fotopigmentos verdes (G) e vermelhos (R)
respectivamente, apesar dos fotopigmentos vermelho terem máxima sensibilidade na zona do
amarelo, 575 nm. Já a visão escotópica, pelos bastonestes, é sensível à luz, mas não às cores.
O fotopigmento responsável por esta visão é a rodopsina, substância mais sensível aos
comprimentos de ondas por volta de 505 nm (Roberts e Ford, 1995; Santos, 2003).
Figura 2.2 - Sensibilidade relativa dos fotopigmentos azuis (B) verdes (G) e vermelhos (R)
A Figura 2.3 apresenta a resposta relativa dos cones e bastonetes ao
estímulo luminoso para um observador padrão. A combinação das visões fotópica e
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escotópica, apresenta máxima sensibilidade próxima aos 560 nm, reduzindo, tanto para as
ondas curtas e quanto para as longas (Manzano, 2000; Looney, 2001).
Os fenômenos luminosos são usados para análise e julgamento de matérias
primas, produtos e processos. Neste campo, os estímulos visuais têm grande importância na
avaliação, principalmente na classificação e escolha do alimento, bem como em outras áreas
da ciência e tecnologia (Hyvarinen et al., 1998). A cor tem sido destacada como um atributo
importante na avaliação sensorial dos alimentos e matérias primas utilizadas na sua
elaboração. Os aspectos visuais dos alimentos (tamanho, cor, presença de defeitos ou
manchas) podem afetar a aceitação dos produtos e resultar em perdas econômicas, por não
atenderem às exigências dos padrões de qualidade e de atratividade ao consumidor (Cardello
et al., 2000; Santana et al., 2004; Carneiro et al., 2005; ICUMSA, 2005; Rueda-Lugo et al.,
2006). Assim, o estímulo visual provocado pelo alimento, mesmo que não apresente qualquer
correlação com seu valor nutritivo, sabor, aroma e sanidade, influenciam na aceitação do
produto (Sachs, 2002).
Figura 2.3 - Sensibilidade relativa da visão para observador e iluminação padrões
A cor de um alimento não é fácil de ser avaliada, pois, as várias tonalidades
de cores presentes nas amostras, formam textura, dificultando a avaliação sensorial. Nuances
de matiz, de saturação ou de brilho também são difíceis de serem percebidas por um
observador (Sachs, 2002). Estas dificuldades podem fazer com que um avaliador treinado e
com boa acuidade visual tome amostras diferentes como idênticas. A memorização da cor não
7
é confiável, daí a necessidade de se estabelecer padrões para determinação por comparação
(Ferreira et al., 1999).
Outro fator que dificulta os processos analíticos de avaliação de cor (que
devem ser fiéis e unívocos) é a simplificação de modelos. Em aplicações tecnológicas, as
amostras são comparadas a padrões construídos em uma amplitude estreita, o que leva em
consideração funções lineares dos parâmetros de quantificação quando as relações verdadeiras
não o são (Sachs, 2002).
Métodos precisos podem ser aceitos para medidas relativas, ainda que
apresentem baixa exatidão. Em certas situações, o espectro abreviado já é satisfatório, pois
simplifica o uso, possibilitando o emprego em linha de produção, em tempo real para o
controle de qualidade (Kopola et al., 1993).
Existem diversos métodos perceptuais e não perceptuais para a medida de
cor. Com o progresso tecnológico, surgiram os digitalizadores de imagens que tornaram
possível o processamento da luz em sistema aditivo (R G B) ou como "luz" impressa em
sistema subtrativo (CMYK). Os métodos perceptuais já possuíam algoritmos, que
incorporados à tecnologia digital, possibilitaram o uso desses modelos no estabelecimento da
cor digital (Roberts e Ford, 1998). Esses padrões de cores podem ser empregados no
estabelecimento da cor de alimentos, combinando a facilidade oferecida pela informática com
o baixo custo e acessibilidade desta tecnologia (Sachs, 2002).
O espaço de cor R G B se baseia na teoria do tri-estímulo, que relaciona a
cor a um primeiro estágio do processo de visão na retina (Mathias e Conci, 1997). Os recursos
de software e hardware que utilizam o sistema R G B, bem como os sistemas derivados deste,
já foram utilizados no controle de qualidade de alimentos tais como no estabelecimento da
qualidade da cor de pigmentos, farinha de girassol, miolo de pães, sobremesas, açúcar, dentre
outros (Sachs et al., 2001; Sachs, 2002; Prudencio-Ferreira et al., 2002; Oliveira et al., 2003;
Portugal et al., 2003).
8
2.2.1. Avaliação da cor de açúcar
A determinação de cor de açúcar é empregada para avaliar e classificar a
qualidade do produto industrial para propósitos comerciais (INMETRO, 1999). A maior parte
do açúcar comercializado no mercado internacional não é refinada. Entretanto, a intensidade
da cor do açúcar é um parâmetro importante na sua avaliação, pois, açúcares com índice de
cor maior têm menor valor no mercado, em conseqüência do aumento do custo de refinação
(Jackson et al., 2006). A coloração do açúcar está relacionada: à quantidade de partículas
carbonizadas presentes, que podem ocorrer em conseqüência do processo de fabricação e
falha na limpeza dos equipamentos; ao tamanho dessas partículas, ou seja, quanto menores as
partículas, mais branco é o açúcar; à presença de folhas e outras impurezas vindas junto com a
cana durante a moagem; e ao processo de clarificação do caldo (CEE, 1999; INMETRO,
1999; Bovi e Serra, 2001).
Fatores genéticos e a adubação também podem influenciar a cor do açúcar,
pois, a presença de compostos nitrogenados no caldo pode desencadear a produção de
compostos coloridos durante o processo de fabricação (Jackson et al., 2006).
A coloração representa ainda uma questão visual que pode influenciar na
decisão do consumidor na escolha do produto. A cor é um parâmetro adotado
internacionalmente para classificação do açúcar. Alguns métodos sensoriais e instrumentais
foram propostos para determinação da cor de açúcares, xaropes e méis (Saliba, 1999; Becari
et al., 2001; Prudencio-Ferreira et al., 2002). Entretanto, a ICUMSA (International
Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis) adota a espectrofotometria como
metodologia oficial para determinação da cor do açúcar, que é realizado através da
determinação da absorvância da solução açucarada (ICUMSA, 1979; 2005; CEE, 1999;
INMETRO, 1999; Bovi e Serra, 2001).
O procedimento recomendado pela ICUMSA tem como principal
inconveniente o passo de filtração requerido. Tal procedimento, por ser lento, limita a
velocidade que a indústria moderna precisa para executar o controle de qualidade (Guchardi et
al., 1996; Nguyen et al., 1997; INMETRO, 1999; Guchardi, 2000; Eggleston et al., 2000;
Baunsgaard, 2001). Métodos alternativos, que dispensam a etapa de filtração e apresentam
boa correlação com o método oficial ICUMSA, já foram propostos para a determinação da cor
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de açúcar na sua forma sólida. Saliba (1999) propôs a determinação do índice de cor através
da espectrofotometria de reflectância difusa multicanal e Prudencio-Ferreira et al. (2002)
propuseram uma metodologia que avalia a cor de cristais de açúcar por meio da análise de
imagens digitais, através da avaliação da intensidade de cor dos canais R G B de imagens
escaneadas.
O espectrofotômetro possui uma rede de difração que separa a luz branca
(policromática) nas suas componentes de cor, em bandas da ordem de 1 nm (Vogel, 1989). Os
escâneres e câmaras digitais utilizados na captura de imagens dispõem de um processo
semelhante de separação dos componentes da luz. Primeiramente a luz é separada por uma
rede de difração em suas componentes e posteriormente agrupada em três canais de cor
(R G B). Portanto, a diferença entre um espectrofotômetro e os digitalizadores de imagens é a
forma de apresentação do resultado (Adobe, 2004; Fonseca, 2006). No espectrofotômetro o
resultado é um número e nos digitalizadores é uma imagem em bitmap contendo as
informações dos canais R G B para cada pixel, que não deixa de ser um conjunto de números
(Sachs, 2002).
2.3. Quantificação de Doenças de Plantas
A quantificação de doenças ou fitopatometria é uma das mais importantes
áreas da fitopatologia. Sua importância pode ser comparada à diagnose, pois, de nada adianta
conhecer o agente causal de uma doença se não for possível quantificar a extensão dos seus
danos no hospedeiro (James, 1974; Amorim, 1995). Dentre os métodos diretos de avaliação
de doenças encontram-se a estimativa dos parâmetros incidência e severidade. O primeiro
refere-se à porcentagem de plantas doentes ou partes de plantas doentes em uma amostra ou
população, já o segundo, trata-se da porcentagem da área ou do volume do tecido coberto por
sintomas. A quantificação de uma doença por incidência é mais fácil precisa e simples. No
caso de doenças foliares, a severidade retrata melhor que a incidência a intensidade da doença
(Amorim, 1995).
10
A quantificação da severidade de doenças realizada a campo é necessária
para o estudo de medidas de controle, na determinação da eficiência de um fungicida, na
caracterização da resistência varietal, e para a epidemiologia, na construção de curvas de
progresso da doença e estimativas de danos (Amorim, 1995). Entretanto, em alguns estudos,
há a necessidade da realização das análises em laboratório, para determinação da severidade
da doença por métodos mais precisos e menos subjetivos.
2.3.1. Avaliação a campo
A avaliação da severidade de doenças é, normalmente, feita de forma
subjetiva por meio de análises visuais (Godoy et al., 1997), exigindo a adoção de chaves
descritivas ou escalas diagramáticas para auxiliar o avaliador nas análises a campo (Amorim,
1995).
As chaves descritivas são compostas de escalas arbitrárias, com um número
variável de graus ou classes que são usados na quantificação de doenças. Por serem
arbitrárias, baseia-se na experiência que o desenvolvedor tem com a doença e podem ser não
apenas descritivas, mas considerar também diagramas. Embora as classes da chave possam
ser de qualquer tipo (símbolos, letras, números ou expressões), o uso de classes numéricas é
muito conveniente. Ao contrário das escalas diagramáticas, as unidades amostrais avaliadas
com chaves descritivas são classificadas nos graus da chave. É importante frisar que a criação
dessas chaves deve ser criteriosa, pois em essência são imprecisas. Deve-se, por exemplo,
abolir expressões subjetivas como moderado, severo, intenso, levemente. Esse tipo de
expressão, além de não descrever os sintomas de maneira adequada, ainda inibe o uso da
chave por outros grupos de pesquisa. Ao contrário das escalas diagramáticas, é muito difícil
treinar avaliadores e padronizar o que se quer como severo ou equivalentes. As classes de
descrições podem ser definidas, por exemplo em: 0 Ausência de sintomas; 1 Folhas com
sintomas pontuais; 2 Coalescência de lesões foliares; 3 Desfolha; 4 Sintomas sistêmicos
(Laranjeira, 2005)
11
Escalas diagramáticas são representações ilustradas de uma série de plantas
ou partes de plantas com sintomas em diferentes níveis de severidade. A primeira escala
diagramática descrita na literatura foi proposta por Cobb em 1892, para avaliação da ferrugem
do trigo. Esta famosa escala apresenta o diagrama de cinco seções de folhas de trigo com 1, 5,
10, 20 e 50% de área foliar atacada. Cobb conseguiu diferenciar quantitativamente plantas de
trigo resistentes de plantas susceptíveis à ferrugem. Sua utilização permite a distinção clara
dos cinco níveis de doença representados. Embora a escala de Coob tenha sido elaborada
empiricamente, ela satisfaz à lei de Weber e Fechner, que determina que a acuidade visual é
proporcional ao logaritmo da intensidade do estímulo (Amorim, 1995). Horsfall e Barrat
(1945) após tomarem conhecimento da lei de Weber e Fechner, propuseram uma escala para
avaliação da ferrugem do trigo, com 12 níveis seguidos de severidade. Esses níveis são
indicados como porcentagem de tecido doente e, em função da acuidade visual humana,
seguem uma escala logarítmica, também conhecida por escala de Horsfall & Barratt. Segundo
Godoy et al. (1997), os incrementos nos níveis intermediários das escalas são responsáveis
pela fácil interpolação nas estimativas de severidade.
As escalas diagramáticas constituem-se atualmente na principal ferramenta
para avaliação da severidade de doenças (Amorim, 1995). Entre as características de uma boa
escala estão: a facilidade de uso, a sua aplicabilidade sob ampla extensão de condições com
resultados reprodutíveis e a existência de intervalos que representem todos os estádios de
desenvolvimento da doença (Berger, 1980). Assim alguns critérios importantes devem ser
considerados na sua elaboração, como: a) os limites superior e inferior da escala devem
corresponder, respectivamente, à máxima e mínima intensidade de doença observada no
campo; b) as imagens da escala devem ser representativas dos sintomas observados sob
infecção natural; e c) nos níveis intermediários de doença devem ser consideradas as
limitações da acuidade visual humana, definidas pela lei de estímulo-resposta de Weber-
Fechner (Horsfall e Barrat, 1945; Amorim, 1995). Além disto, as escalas devem ser validadas
antes de serem propostas como um método padrão de quantificação de doenças e, no caso de
produzirem resultados insatisfatórios, devem ser corrigidas (Martins et al., 2004).
Respeitando-se estes critérios, muitas escalas têm sido elaboradas para a
avaliação da severidade de doenças como clorose variegada dos citros (Amorim et al., 1993),
complexo broca-podridões em cana-de-açúcar (Giglioti e Canteri, 1995), mancha de
Alternaria em girassol (Leite et al., 2002), complexo de doenças foliares de final de ciclo em
soja (Martins et al., 2004), cancro bacteriano da videira (Nascimento et al., 2005), cancro
12
cítrico (Belasque Júnior et al., 2005), mancha foliar do eucalipto (Andrade et al., 2005),
ferrugem da soja (Godoy et al., 2006).
2.3.1.1. Uso de software para treinamento de avaliadores.
Para que as escalas possibilitem melhora na eficiência das estimativas são
necessários avaliadores com boa acuidade visual e que executem avaliações precisas. Assim,
o avaliador deve ser treinado previamente, pois freqüentemente a vista humana superestima a
quantidade de doença. Atualmente, além de escalas, o treinamento conta com recursos
computacionais que permitem a “aferição” da vista do avaliador em curto prazo (Amorim,
1995).
O uso de softwares para treinamento de avaliadores é uma alternativa viável
e de fácil aplicação para incrementar a acurácia e a precisão em avaliações de severidade de
doenças. Além disso, o treinamento pelo computador também permite a comparação entre
diferentes avaliadores, possibilitando a seleção daqueles com melhor desempenho (Canteri et
al., 1998). Alguns dos programas destinados especificamente ao treinamento de avaliadores
são: Areagram (Shane et al., 1985), em que o programa gera um diagrama de área padrão para
doença e formato de lesão; Distrain (Tomerlin et al., 1988) para várias doenças de cereais de
inverno; Disease.Pro (Nutter Junior et al., 1989) para estimativas da proporção de doenças em
amendoim; Estimate (Weber et al., 1991) para doenças de cereais de inverno ou de macieira;
Combro (Canteri et al., 1998) para ferrugem ou complexo broca-podridões em cana-de-
açúcar.
13
2.3.2. Avaliação em laboratório
No processo de elaboração e validação da escala para a quantificação de
severidade de doenças é essencial a obtenção da severidade real das imagens das folhas
lesionadas, tanto para a determinação dos limites mínimo e máximo de severidade quanto
para a comparação com os valores de severidade estimados pelos avaliadores, com o uso da
escala (Martins et al., 2004; Belasque Júnior et al., 2005). Desta forma, é fundamental o uso
de métodos não subjetivos e de alta precisão para a quantificação da severidade da doença.
Quantificar precisamente a área foliar doente é uma tarefa extremamente
laboriosa. A contagem de lesões com posterior medida de seu comprimento e largura, para
determinação da área, são atividades que só podem ser realizadas em trabalhos experimentais.
Mesmo assim, quando o número de amostras é elevado e quando as lesões são numerosas e
irregulares, este trabalho torna-se praticamente impossível (Amorim, 1995).
Hoje os métodos mais utilizados para quantificações precisas da severidade
são: medidor de área foliar e softwares para análises de imagens.
Para a utilização do medidor de área foliar (LICOR LI-3000) as lesões
foliares são desenhadas em plástico transparente, o qual é submetido ao equipamento para
determinação da área lesionada (Leite et al., 2002; Martins et al., 2004). Entretanto, este
equipamento não faz a captura da imagem da amostra. Desta forma, em trabalho de
elaboração de escala diagramática, as imagens das folhas coletadas têm que ser obtidas, para
uso na validação, devido à dificuldade de manter as folhas bem conservadas por longo
período de tempo (Miranda, 2004).
Os avanços da informática nos últimos anos permitiram a agilização de uma
série de operações que até então eram realizadas manualmente. A geração e análise de
imagens de cores e formas diferentes, com determinação de sua área e perímetro, estão entre
as operações que são facilmente realizadas por computadores (Lindow, 1983). Há algumas
décadas este sistema consistia na obtenção da imagem de uma amostra com câmera de vídeo,
transferência desta imagem para um microcomputador através de um conversor e avaliação
das áreas sadias e doentes (Amorim, 1995). A popularização de equipamentos digitais como
escâneres e câmeras fotográficas permitiram a aquisição de imagens de alta resolução a baixo
custo. A obtenção de imagens digitais e a existência de softwares capazes de instruir o
14
computador a reconhecer certas áreas na imagem, tornam essa metodologia viável para
explorar, no tempo e no espaço, as lesões em tecido foliar causadas por fitopatógenos. Assim,
a análise de imagens apresenta grande potencial para quantificar a área foliar afetada por
doenças de plantas (Thomé et al., 1997; Prates et al., 2001). Hoje existem vários programas,
como Image Tool, Auto CAD, APS Assess, Quant, Scion Image e AreaScan, para
quantificação precisa da severidade de doenças, que já foram utilizados em trabalhos visando
a elaboração e validação de escalas diagramáticas para diversas doenças (Téliz-Ortíz et al.,
2003; Nascimento et al., 2005; Belasque Júnior et al., 2005; Andrade et al., 2005; Godoy et al.
2006) e avaliação da taxa de expansão de lesões (Prates et al., 2001).
Apesar da alta eficiência, o sistema de análise de imagens geradas no
microcomputador tem algumas limitações como: a) na obtenção da imagem a luminosidade
deve ser bem controlada para que o contraste entre o tecido sadio e doente seja o maior
possível; b) o material a ser analisado deve, portanto, ser transportado do campo ao
laboratório, conseqüentemente, todas as amostra são do tipo destrutiva, o que pode ser
indesejado em muitos ensaios, além disso, algumas plantas não resistem ao transporte,
deformando-se rapidamente, o que impede sua posterior avaliação; c) a acurácia do sistema é
inversamente proporcional ao tamanho da amostra, pois, análise de folhas individualizadas
tem grande acurácia, o que não acontece com plantas inteiras; d) esta técnica aplica-se
unicamente para aquelas doenças que deixam a folha com o tecido lesionado bem contrastado
do tecido sadio, enquanto que diferenças sutis de coloração entre o tecido sadio e doente, em
geral, não são captadas (Amorim, 1995).
2.4. Tratamento de Imagens
O tratamento de imagens pode ser utilizado para melhorar as condições das
imagens digitais de modo a se obter as informações desejadas. Os tratamentos incluem, dentre
outras, as técnicas de realce, restauração, transformações dos atributos espectrais ou das cores
e segmentação (Adami, 2003). A técnica de realce pode ser utilizada com a finalidade de
melhorar a definição dos elementos das imagens através do aumento do contraste. O realce
consiste em alterar os valores de cada canal do espaço de cor R G B, deslocando aos valores
15
maiores (mais claros) para próximo de 255 e os menores (mais escuros) para próximo de zero
(Moreira, 2001). Já a restauração de imagens é feita quando houve falha durante a captura
analógica ou digital do sinal. Essas falhas normalmente se caracterizam por ruídos que podem
ser eliminados por filtragem, melhorando a resolução da imagem (Fonseca, 1988). Uma outra
forma de tratamento das imagens é através das transformações dos atributos espectrais ou das
cores. Os atributos espectrais ou das cores podem ser transformados no espaço de cor HSI
(Matiz 'Hue', Saturação e Intensidade), alternativo ao espaço de cor R G B, que, ao contrário
deste, onde as cores estão intrinsecamente ligadas, no espaço HSI, as cores podem ser
manipuladas e analisadas separadamente para cada atributo. O espaço HSI se assemelha à
forma como as cores são percebidas pelo olho humano, desta forma sua percepção torna-se
mais intuitiva. Este espaço de cor é representado graficamente por um cone onde cada cor é
definida por coordenadas cilíndricas polares, ao invés de coordenadas cartesianas. O eixo
central (I) é o eixo acromático e a intensidade aumenta em sentido contrário ao vértice, indo
do preto ao branco. As seções circular do cone apresentam a variação do matiz (H) ao redor
do perímetro, sendo que a saturação (S) aumenta do centro para as bordas do cone, indo do
cinza (centro) até os matizes espectrais puros (periferia) (Adami, 2003; Sousa, 2005). A
segmentação de imagem é o processo de partição em regiões homogêneas, que seleciona
pixels similares. Os algoritmos de segmentação baseiam-se em padrões de descontinuidade e
similaridade. A detecção de descontinuidade se dá pela comparação de um grupo de pixels
semelhantes que são separados de outro grupo através de variações abruptas nas
características dos grupos (INPE, 2005).
16
3. ARTIGO A: MÉTODO ALTERNATIVO PARA DETERMINAR COR DE AÇÚCAR
3.1. Resumo
O índice de cor do açúcar é um importante parâmetro na classificação de açúcar tanto para o
mercado interno quanto para exportação. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um
método que possibilite o uso de escâner para determinação do índice de cor ICUMSA (UI) do
açúcar e verificar a possibilidade de eliminação da etapa de filtração. Foram preparadas
amostras de soluções de açúcar misturando solução matriz 44,4 UI com solução de açúcar
mascavo, obtendo índice de cor entre 44,4 a 1692 UI. O canal de cor R G B que melhor se
correlacionou com a cor ICUMSA foi o canal B. A faixa de trabalho com o canal B foi até
1300 UI (r2=0,974 pt<0,01) e a faixa linear de trabalho foi de 39 a 900 UI, a sensibilidade
foi de 7,43 x 10-4 unidades de absorvância B (AB)/UI. Os limites de detecção e quantificação
foram 16 UI e 39 UI respectivamente, e a exatidão (acurácia) foi de 17 UI. A precisão
(coeficiente de variação) foi de 6 % para a repetitividade e 6 % para a intermediária (inter-
dia). Considerando os limites de interpretação em função das classes de açúcar (45, 80, 120,
150, 230, 480 e 760 UI) o método alternativo apresentou-se adequado. Comparando as
absorvâncias das soluções filtradas obtidas por espectrofotômetro e por imagens escaneadas
(canal B) com as das mesmas soluções antes da filtração (canal B), os coeficientes de
determinação foram 0,81(pGWG�������H������SGWG�������UHVSHFWLYDPHQWH�� Palavras-chave: pixel, R G B, escâner, colorimetria, cor ICUMSA.
17
3.2. Abstract
AN ALTERNATIVE METHOD TO DETERMINE SUGAR COLOR. The sugar color index
is an important parameter in the classification of sugar for the domestic market and for
exportation. The objective of this work was to develop a method that makes possible the use
of scanner for determination of the index of ICUMSA color (UI) of the sugar and to verify the
possibility of elimination of the filtration stage. Samples of sugar solutions had been prepared
by mixing matrix solution 44.4 UI with brown sugar solution, getting color index of 44.4 up
to 1692 UI. The R G B color canal that better was correlated with ICUMSA color was
B canal. The work band with B canal was up to 1300 UI (r2=0.974 pGWG�������DQG�WKH�OLQHDU�work band was of 39 up to 900 UI, sensitivity was 7.43 x 10-4 units of absorbance B (AB)/UI.
The detection and quantification limits had been 16 UI and 39 UI respectively, and the
accuracy was 17 UI. The precision (variation coefficient) was 6 % for repeatability and 6 %
for the intermediate (Inter-day). Considering the interpretation limits in function of the sugar
class (45, 80, 120, 150, 230, 480 and 760 UI) the alternative method was adequate.
Comparing the absorbance of filtered solutions obtained by spectrophotometer or scanned
images (B canal) with the same solutions before the filtration (B canal), the determination
coefficients were 0.81 (pGWG�������DQG�������SGWG�������UHVSHFWLYHO\� Key-words: pixel, R G B, scanner, colorimetry, ICUMSA color.
18
3.3. Introdução
A cor do açúcar é parâmetro importante na classificação e comercialização
do produto para consumo, fins industriais, ou exportação. O método oficial para determinação
da cor de açúcar adotado internacionalmente é o da Comissão Internacional para
Uniformização dos Métodos de Analise de Açúcar - ICUMSA (CEE, 1999). O método
atualmente em vigor no Brasil está descrito na norma da ABNT NBR9724:1987 (ABNT,
1987). É um método colorimétrico que se baseia no princípio da absorção da luz, em
comprimentos de ondas específicos, pelas impurezas presentes na solução de açúcar. n
19
imagem. Uma vez estabelecidos branco e padrões, as informações sobre a qualidade da cor
podem assim ser obtidas (Sachs, 2002). Com os digitalizadores de imagens é possível obter,
além do resultado analítico, também a Figura do material analisado. Essa imagem pode fazer
parte do laudo e ser arquivada para posterior verificação (Sachs, 2004), sendo útil em uma
eventual confrontação de laudos.
Os açúcares destinados ao consumo interno e à exportação devem atender a
uma série de requisitos. Um desses requisitos utilizados na avaliação da qualidade de açúcares
é a medida do índice de cor ICUMSA. Quanto mais escuro for o açúcar, maior será o valor
numérico do índice de cor ICUMSA (CEE, 1999). A cor do açúcar é devida à umidade,
resíduos minerais (cinzas) e resíduos orgânicos, que são incorporados durante o processo
cristalização, e substâncias coloridas formadas durante o armazenamento do açúcar em
condições inadequadas. Esses resíduos podem atingir até 4% da massa dos cristais (Saliba,
1999).
Os métodos da ICUMSA para determinar cor de soluções, usados na
classificação de açúcar, são aceitos e reconhecidos mundialmente. Entretanto, apresentam
alguns inconvenientes. São demorados, o que reduz sua utilidade para medidas no controle na
linha de produção. Têm custos com produtos químicos e filtros, e envolvem o trabalho
manual de pessoal qualificado. Conseqüentemente não é possível realizar grande número de
medidas em tempo real, como é exigido em linha de produção. Em decorrência disso, a
maioria das indústrias açucareiras funcionam em sistema “safe side”, produzindo açúcar mais
claro (purificado) que o necessário para a classe desejada. Isso implica em aumento do
consumo de produtos químicos e energia, má utilização da capacidade de produção industrial
e maior perda de sacarose no melaço na etapa de centrifugação (Nielsen, 2004).
Este trabalho teve por objetivo desenvolver um método que possibilite o uso
de escâner na determinação do índice de Cor ICUMSA, através da análise de imagens digitais
de soluções de açúcar e, verificar a possibilidade da eliminação da etapa de filtração para
determinação do índice de cor ICUMSA.
20
3.4. Material e Métodos
O trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica e Tecnologia de
Produtos Agropecuários do Departamento de Biologia e Tecnologia das Faculdades Luiz
Meneghel - Universidade Estadual do Norte do Paraná - FALM/UENP, Bandeirantes - PR.
Foram utilizadas soluções de açúcar de confeiteiro Glaçucar-União a
50+0,1ºBrix (solução matriz) e de açúcar mascavo Doce Brasil da Indústria e Comércio de
Produtos Alimentícios Zambon Ltda - Itambaracá - PR (solução mascavo) com 50+0,1ºBrix.
A partir destas soluções foram preparadas soluções para leitura em
espectrofotômetro e escâner que continham de 0,0 a 2,5 % v/v de solução de açúcar mascavo
misturadas à solução matriz, variando de 0,1 em 0,1 %. As soluções foram filtradas com filtro
de porosidade 0,45 µm para remoção de impurezas insolúveis. Foram feitas 9 repetições para
cada concentração.
A determinação espectrofotométrica foi realizada com espectrofotômetro
(B&L Spectronic 88) de acordo com a metodologia proposta pela ICUMSA (ICUMSA,
2005). Os comprimentos de ondas utilizados foram 420, 560 e 720 nm.
As mesmas soluções foram escaneadas para obtenção de imagens digitais. O
escâner foi previamente calibrado com dióxido de titânio-TiO2 (TiPure DuPont) como
referência para o branco e negro de fumo (Degussa do Brasil Ltda) para o preto (Sachs, 2002).
As amostras foram transferidas para embalagens plásticas retangulares com dimensões
internas de 1,3 cm x 3,5 cm x 5,8 cm e espessura de 0,2 cm, preenchendo até 2/3 do volume
do recipiente. Estas amostras foram escaneadas em escâner Plustec OpticPro P12, com
resolução óptica de 300 dpi e 24 bits de precisão, e os dados foram armazenados como
bitmaps (Sachs, 2004). Para escanear as soluções foi necessário inclinar o escâner a 45º, para
evitar vazamento, já que as embalagens não foram vedadas.
As cores médias das amostras foram obtidas com a seleção de áreas das
imagens de aproximadamente 5,0x104 pixels (3,2 cm2). Calcularam-se os valores das cores
médias dos pixels em parâmetros R G B 24 bits, com o software SH 2.0 (Sachs, 2002). Com
esses valores foram feitas as curvas de regressão dos canais de cores R, G e B em 8 bits (256
níveis de precisão), para correlacionar os valores das leituras obtidas de cada um dos canais
21
de cor com os comprimentos de onda. Os resultados obtidos com o escâner foram comparados
com os obtidos com o espectrofotômetro.
Os dados foram tratados estatisticamente conforme orientações para ensaios
químicos constante do DOQ-CGCRE-008 (INMETRO, 2003), que compreendem: faixa de
trabalho, faixa linear de trabalho, linearidade, sensibilidade, limite de detecção, limite de
quantificação, exatidão, precisão (repetitividade e precisão intermediária). A precisão
intermediária (inter-dia) foi realizada em triplicata em três dias.
A medida da dispersão dos dados para verificação de valores “outliers” foi
feita pelo teste de Grubbs e a homogeneidade das variâncias em diferentes concentrações do
analito foi verificada pelo teste de Cochran (Bandeira et al, 2003; Santos et al, 2003)
Para verificar a possibilidade da realização da análise sem o procedimento
da etapa de filtração, foram separadas amostras nas mesmas concentrações, porém sem
filtração, e medida a absorvância do canal B (escâner) e comparadas com os resultados das
absorvâncias das amostras filtradas, que foram obtidas em espectrofotômetro-420nm.
3.5. Resultados e Discussão
A partir da conversão de cada canal R G B dos pixels das imagens
escaneadas de soluções de açúcar (Índice de cor ICUMSA entre 44,4 e 1692) em cor média,
foram obtidos os pontos de intensidade de sinal dos canais R G B em função do Índice de cor
ICUMSA. Pôde-se observar que o comportamento das curvas é similar ao que ocorre em
espectrofotometria para a percentagem de transmitância (%T) em função de concentrações de
soluções (Vogel 1989) ou no caso, com o Índice de cor ICUMSA (Figura 3.1).
22
Figura 3.1 - Intensidade do sinal analítico dos canais R G B (8 bits por canal) obtidos com escâner em função do Índice de cor ICUMSA de solução de açúcar.
Com a comparação entre os sinais do escâner com os do espectrofotômetro,
para as mesmas soluções de açúcar, verificou-se tendência linear (0,82<r2<0,92; pGWG�������entre os valores da intensidade dos canais R G B e da % de transmitância. Essa relação com
os canais R G B foram lineares a partir de 15 %T, onde se observam inflexões. A maior
correlação foi com o canal B e a menor com o canal R (Figura 3.2). O maior coeficiente de
correlação entre a % T a 420 nm com o canal B, era o esperado, pois esse canal representa as
ondas curta na faixa do azul, incluindo o comprimento de onda de 420 nm. Além disso, as
impurezas encontradas normalmente no açúcar (amarelo-laranja), absorvem mais as ondas na
faixa do azul no espectro visível. O azul é a cor complementara do amarelo-laranja, sendo a
cor mais absorvida (Owen, 1996; Senese, 2005). O canal B, por conter as ondas de pico, da
curva espectral da impureza do açúcar, é o que sofre maior atenuação no sinal com o aumento
da concentração de impurezas na amostra.
23
Figura 3.2 - Intensidade do sinal analítico dos canais R Ga t 9 0 T d ( i ) 6 j 0 T c 3 . 7 1 9 9 2 T w ( o d o ) T j 0 ( 2 3 ) T j 9 9 0 T d 1 . 3 0 8 T w ( s ) T j - 0 . 0 4 8 T c 9 0 T d ( a ) T j 0 T c 5 . 2 7 9 6 o 0 T d ( a ) T j 0 6 5 . 2 7 9 6 9 0 T d 1 . m T d ( l í t i ) T j - 0 . 0 4 4 8 c 3 . 3 5 9 7 7 0 T d d o lítican 3.2 lítia 3.2 -n
24
variação de cor das soluções de açúcar, pois apresentou maior coeficiente angular que os
demais canais de cor (Figura 3.3). Este canal capta mais as ondas curtas do espectro visível,
que representa a cor absorvida com maior intensidade pelas impurezas presentes nas soluções
de açúcar. Segundo Owen (1996) e Senese (2005), a máxima absorção de ondas ocorre na
faixa espectral da cor complementar da substância.
Comparando as amplitudes das absorvâncias dos comprimentos de onda
recomendados pela ICUMSA (420; 560 e 720 nm), o canal 420 nm foi o que apresentou
maior sensibilidade à variação do teor de impurezas presentes no açúcar (Figura 3.3).
Figura 3.3 - Absorvâncias dos canais R G B [AR, G ou B=log(sinal do branco/sinal da amostra)] e Absorvância [A=log(100/%T)] medidas a 420 (a), 560 (b) e 720 nm (c) para as soluções de açúcar .
Assim, com os valores do canal B (escâner) comparado aos do canal 420 nm
(espectrofotômetro) realizaram-se análises para verificar outliers, homocedasticidade, faixa
linear de trabalho, linearidade, sensibilidade, limite de detecção, limite de quantificação,
exatidão (acurácia) e precisão (repetitividade e precisão intermediária) do método alternativo.
Na verificação de “outliers” (pontos fora da curva) através do teste de
Grubbs, observou-se que nenhum dos valores na faixa de cor ICUMSA avaliada atingiu o
valor crítico. O maior Gcalculado (2,02) foi menor que o valor crítico (2,03) e valor de rejeição
(2,22). Desta forma, nenhum valor foi considerado como "outliers" para o canal B.
Para testar a homocedasticidade/heterocedasticidade do método, utilizou-se
o teste de Cochran. A maior variância absoluta não ultrapassou o valor crítico
(Ccalculado<Ctabelado), mesmo considerando a ampla faixa de cor ICUMSA testada. A maior
25
variância apresentou Ccalc=0,13 contra os Ctab. 0,13 e 0,15 para níveis de significância de 95 e
99 %, respectivamente. Como os valores das variâncias não ultrapassaram o valor crítico, o
método foi qualificado como homocedástico, ou seja, as variâncias foram uniformes
independentemente da faixa de cor do açúcar.
A regressão linear da absorvância do canal B em função da cor ICUMSA
apresentou coeficiente de determinação de 0,974 (pt<0,01), o que demonstra boa
linearidade entre os valores. A sensibilidade do canal azul (B) foi de 7,43 x 10-4 unidades
absorvância do canal B (AB) por unidade no índice de cor ICUMSA. Já a sensibilidade
observada no espectrofotômetro foi de 1,25 x 10-3 unidade de absorvância a 420 nm por
unidade no índice de cor ICUMSA (Figura 3.4). Este valor é aproximadamente 70% superior
que o obtido com o canal B do escâner. A maior sensibilidade do espectrofotômetro pode ser
explicada pela sua menor amplitude da faixa espectral selecionada. Enquanto o canal B do
escâner capta faixa mais larga, cobrindo todo o espectro do azul, a faixa captada pelo
espectrofotômetro é específica, no caso 420 nm. Este comprimento de onda é muito próximo
das máximas absorvâncias das impurezas comumente encontradas no açúcar (curva espectral).
As sensibilidades dos canais G e R foram respectivamente 2,7 e 4,0 vezes menores que a
observada pelo canal 420 nm do espectrofotômetro.
A distribuição aleatória dos erros mostra que não houve tendência, que
segundo Downing; Clark, (1999), é indicativo de uma boa qualidade no ajuste do modelo
adotado. Apesar de os erros relativos serem maiores para os valores menores da escala de cor
do açúcar (Figura 3.5).
Figura 3.4 - Índice de cor ICUMSA em função da Absorvância a 420 nm e Absorvância do canal B [AB=log(sinal do branco/sinal da amostra)] para as soluções de açúcar.
26
A faixa de trabalho do método alternativo, nas condições do ensaio, foi até
1300 unidades de cor ICUMSA. Para concentrações maiores, ocorreu desvio da lei Lambert-
Beer. O limite de detecção do método foi de 16 unidades de cor ICUMSA e o limite de
quantificação de 39 unidades de cor ICUMSA. Utilizando o limite de quantificação como o
menor teor da faixa linear de trabalho, esta faixa fica compreendida entre 39 a 900 unidades
de cor ICUMSA. A exatidão (acurácia) tratada como a raiz quadrada do erro médio
quadrático (RMSE) da previsão foi de 17 unidades de cor ICUMSA. A precisão do método
alternativo, tratada como coeficiente de variação percentual foi de 6 % para a repetitividade e
de 6 % para a precisão intermediária (inter-dia). Considerando os limites de interpretação em
função dos tipos de açúcar comercializado (Tabela 3.1), o método alternativo apresentou
adequada acurácia, precisão e limite de quantificação.
Figura 3.5 - Dispersão dos erros relativos entre a cor ICUMSA obtidas por espectrofotometria a 420 nm e a cor estimada pela regressão da Absorvância do canal B (AB) com escâner.
27
Tabela 3.1 - Índice de cor ICUMSA para as diferentes classes de açúcar
Tipo Índice de cor ICUMSA*
Demerara > 760
Cristal standard < 760
Cristal superior < 480
Cristal especial < 230
Cristal extra especial < 150
Refinado amordo 2ª < 120
Refinado amorfo 1ª < 80
Refinado granulado < 45
*Fontes: ANVISA (2006); Saliba (1999).
Comparado com o método oficial da ICUMSA por análise
espectrofotométrica da intensidade de cor do açúcar, o método utilizando os canais de cor de
imagens escaneadas apresentaram maiores variações dos índices de cor. Dentre os fatores que
podem ter contribuído para que isso ocorresse estão: a) amplitude da faixa espectral abrangida
por cada canal de cor R G B, comparado com um comprimento de onda específico do
espectrofotômetro; b) a existência de inúmeros tipos de substâncias presentes na solução e que
conferem cor ao açúcar. Cada uma dessas substâncias apresenta uma curva espectral singular,
com um máximo de absorção em comprimentos específicos do espectro; c) limitações do
instrumental usado no método alternativo (escâner e cubetas para leitura das soluções), que
não foram desenvolvidos pensando em usá-los em análises físico-químicas. Contudo, já existe
viabilidade técnica para produzi-los com esse objetivo.
Uma questão a ser levantada, é o impacto provocado na cor pelas impurezas
insolúveis. Essas impurezas são removidas na etapa de filtração e assim suas contribuições na
cor real do açúcar não são captadas pelo índice de cor ICUMSA.
Métodos que dispensam a etapa da filtração já foram propostos (Saliba,
1999; Prudêncio-Ferreira et al., 2002), entretanto, essas análises são feitas com o açúcar na
forma de cristais. Isso pode ser um aspecto limitante, já que a granulometria é um dos fatores
28
que influencia o resultado da coloração de uma amostra (Sachs, 2002). Assim, cristais mais
finos de uma mesma amostra de açúcar apresentam-se mais claros que cristais maiores, para
um mesmo índice de cor ICUMSA da solução.
A absrovância do canal B obtida com as soluções de açúcar, antes da
filtração em função da absrovância 420 nm, apresentou coeficiente de determinação
0,81(pGWG�������� LQGLFDQGR�H[LVWência de uma forte tendência a uma correlação linear, esse
valor está distante do que se espera para confiabilidade do resultado (Figura 3.6). Apesar
dessa correlação não ter sido boa, não se sabe o quanto as impurezas insolúveis contribuem na
cor do açúcar. De acordo com Saliba (1999), a filtração usada no método ICUMSA remove
praticamente todo o material insolúvel presente na solução, sendo apontada como a
responsável pela baixa correlação observada entre o método oficial ICUMSA e o método que
utilizava a espectroscopia para analisar a cor de cristais de açúcar.
A análise da cor de uma solução de açúcar, sem filtração, pode representar
melhor a contribuição na cor final de produto em que o açúcar entra como ingrediente. As
indústrias normalmente usam o açúcar diretamente em suas formulações, sem qualquer
filtração. E mesmo quando são filtrados, obviamente não o são em filtros com porosidade de
0,45 µm, como é o recomendado no método oficial ICUMSA.
Figura 3.6 - Absorvâncias obtidas de soluções de açúcar com índice de cor ICUMSA entre 44 a 1300 obtida por espectrofotometria a 420 nm (soluções filtradas) e as Absorvâncias .27969 0 Td0.156 Tw67Q1 0 Td(c)Tj09e s, es filtr
29
Uma possível vantagem do método alternativo é a possibilidade de se
avaliar a cor da solução de açúcar sem a filtração, já que as impurezas removidas na etapa de
filtração (requerida no método oficial da ICUMSA) também podem influenciar na coloração
do produto onde o açúcar é empregado.
3.6. Conclusão
O método desenvolvido para determinação da cor, através de análise de
imagens de solução de açúcar, apresentou precisão e exatidão (acurácia) inferior às do método
oficial ICUMSA, entretanto, mostrou precisão e exatidão suficientes para diferenciar a cor de
açúcares de diferentes classes de cor. Sendo o canal B de cor R G B o que melhor se
correlacionou com o Índice de cor ICUMSA.
A análise das imagens das soluções de açúcar não filtradas apresentaram
baixa correlação com o índice de cor ICUMSA.
3.7. Sugestão para Novos Ensaios
Apesar do método de determinação de cor através da análise de imagens de
soluções de açúcar (sem filtração) não ter apresentado boa correlação com o método oficial da
ICUMSA, sugere-se a realização de ensaios com sistemas alimentares (Ex: pães e molhos
brancos), incorporando soluções filtradas e não filtradas de açúcares de diferentes classes de
cor, e verificar suas contribuições nas cores finais desses sistemas. Comparar a cor do
alimento com os índices de cor obtidos pelo método oficial e alternativo e verificar se as
impurezas removidas na filtração influenciam ou não a cor do produto final.
30
4. ARTIGO B: ESCALA DIAGRAMÁTICA PARA AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE DA MANCHA FOLIAR DE PHAEOSPHAERIA EM MILHO
4.1. Resumo
Escalas diagramáticas são importantes ferramentas para padronizar as estimativas da
severidade de doenças em plantas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma
escala diagramática para avaliação da severidade da mancha foliar de Phaeosphaeria em
folhas de milho. Folhas com severidade em diferentes níveis foram coletadas a campo para
determinação dos limites mínimos e máximos de severidade e os níveis intermediários foram
determinados de acordo com a "Lei do estímulo visual de Webber-Fechner". A escala
proposta apresentou os níveis de 1; 3; 6; 13; 25; 43; 63 e 79 % de severidade no terço médio
de imagens de folhas de milho. A validação da escala foi realizada com o auxílio de dez
avaliadores (cinco sem experiência e cinco com experiência), os quais estimaram a severidade
da doença em 50 folhas de milho com sintomas da mancha de Phaeosphaeria, com e sem a
utilização da escala. Análises de regressão foram utilizadas para avaliar a precisão, acurácia e
a reprodutibilidade das estimativas. A avaliação da acurácia indicou que sem o uso da escala
sete avaliadores apresentaram desvios sistemáticos nas estimativas, enquanto que com o uso
da escala foram apenas dois avaliadores. A precisão representada pelo coeficiente de
determinação (r2) das regressões, variou de 0,86 a 0,95 para os avaliadores inexperientes sem
escala e 0,91 a 0,98 com escala. Os avaliadores experientes apresentaram r2 variando de 0,91 a
0,95 sem escala e 0,94 e 0,98 com escala. A avaliação da reprodutibilidade, entre os
avaliadores combinados aos pares, indicou que sem a escala o índice foi satisfatório( r2>0,90)
para 53% dos casos, enquanto que com o auxílio da escala este valor subiu para 87%. A
escala diagramática proposta melhorou a precisão, a acurácia e a reprodutibilidade das
estimativas, independente da experiência do avaliador.
Palavras-chave: estímulo visual, Webber-Fechner, Zea mays.
31
4.2. Abstract
DIAGRAMMATIC SCALE FOR ASSESSMENT OF THE PHAEOSPHAERIA LEAF SPOT
SEVERITY IN MAIZE. The Diagrammatic scales are important tools to standardize the
severity assessments of plant diseases. The objective of this work was to develop and to
validate a diagrammatic scale for severity assessment of leaves spot Phaeosphaeria on maize.
Leaves with different levels of severity were collected in the field for determination of the
minimum and maximum severity limits and intermediate levels were determined according to
“Weber-Fechner’s stimulus-response law”. The proposed scale had the levels of 1; 3; 6; 13,
25; 43; 63 and 79% of severity in the third medium part of the maize leaf. Scale validation
was performed by ten raters (five inexperienced and five experienced), who estimated the
severity disease in 50 maize leafs showing Phaeosphaeria leaf spot symptoms, with and
without the use of the scale. Analyses of regression was used to evaluate the precision,
accuracy and the reproductibility of the estimates. The evaluation of the accuracy indicated
that without the use of the scale seven raters had presented systematic shunting lines in the
estimates, whereas with the use of the scale they was only two raters. The precision
represented for coefficient of determination (r2) of the regressions, varied of 0.86 the 0.95 for
the inexperienced raters without scale and 0.91 the 0.98 with scale. The evaluation of the
reproductibility, between the agreed raters to the pairs, indicated that without the scale the
index was satisfactory (r2>0.90) for 53% of the cases, whereas with the aid of the scale this
value went up for 87%. The proposal diagrammatic scale improved the precision, accuracy
and reproductibility of the estimates, independent of the experience of the raters.
Key-words:visual stimulus, Webber-Fechner, Zea mays.
32
4.3. Introdução
A mancha foliar de Phaeosphaeria é uma doença de distribuição
generalizada pelas áreas produtoras de milho. Os primeiros trabalhos apontam o fungo
Phaeosphaeria maydis como agente causal. Entretanto, trabalhos recentes sugerem que, ao
menos no Brasil, a mancha é causada por um complexo microbiano, uma vez que mais de um
patógeno pode causar sintomas semelhantes. Entre estes encontram-se a bactéria Pantoea
ananas e os fungos Sclerophthora, Phyllosticta sp., Phoma sorghina e Sporormmiella sp.
(Pereira et al., 2005). De acordo com Paccola-Meirelles et al. (2001) a bactéria Pantoea
ananas é um dos principais agentes etiológicos envolvidos no estágio inicial da doença, sendo
os fungos de ocorrência e infecção secundária.
No Brasil a mancha foliar de Phaeosphaeria foi relatada no início dos anos
80, no Oeste do Paraná (Reis e Casa, 1996). Ela ocorre praticamente em todas as regiões onde
se cultiva o milho, embora em alguns estados sua ocorrência seja mais problemática como em
Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paraná, São Paulo, Santa Catarina e Minas Gerais
(Buiati, 2000), principalmente em áreas tropicais com altitudes acima de 600 m (Pereira et al.,
2005). À semelhança de outras doenças, a severidade é maior na época de florescimento. Em
plantios tardios a severidade é maior que em plantios iniciais (Buiati, 2000).
As perdas por mancha foliar de Phaeosphaeria na produção de milho
podem ser superiores a 60% em determinadas situações (Embrapa, 2000). O aumento da área
de cultivo, aliado a algumas práticas culturais como sistema de plantio direto e o cultivo de
duas safras ao ano têm favorecido o surgimento da doença e determinado um incremento na
severidade (Pegoraro et al., 2001). Os danos econômicos são dependentes das condições
ambientais e do estádio de desenvolvimento no qual a planta é infectada. Plantas infectadas
precocemente podem ter a sua produtividade reduzida se a umidade relativa for elevada e as
temperaturas moderadas (Pereira et al., 2005).
A doença não ocorre nos primeiros estádios de desenvolvimento das plantas,
mas em condições favoráveis pode se tornar visível já aos 60 dias após o plantio (Buiati,
2000). Os sintomas iniciam-se, em geral, com pequenas manchas levemente cloróticas
tornando-se maiores, com até 2 cm, arredondadas a ablongas. As lesões são aquosas de
coloração esbranquiçada e com os bordos escuros (Pereira et al., 2005). Em cultivares
33
suscetíveis, essas lesões multiplicam-se rapidamente nas folhas inferiores e passam, em
seguida, para as folhas acima da espiga. Em grande número, as lesões juntam-se e causam
requeima das folhas, que cessam a fotossíntese na fase de enchimento dos grãos (Colorado,
1996).
Estudos epidemiológicos e de medidas de controle de doenças de plantas
requerem métodos confiáveis, precisos e que apresentem resultados reprodutíveis (Bergamim
filho et al., 1996). Tais medidas são essenciais na quantificação da doença no espaço e no
tempo (Zadoks, 1972). O método de avaliação varia com o agente etiológico e com a
característica espacial da doença (Gaunt, 1995). No caso de doenças foliares, a severidade é a
variável mais utilizada, sendo que sua avaliação é, normalmente, feita de forma subjetiva por
meio de análises visuais e, por conseguinte, as escalas diagramáticas tornam-se ferramentas
fundamentais em tais estudos (Godoy et al., 1997). Entre as características de uma boa escala
diagramática estão: a facilidade de uso, a sua aplicabilidade sob ampla extensão de condições
com resultados reproduzíveis e a existência de intervalos que representem todos os estádios de
desenvolvimento da doença (Berger, 1980). Assim, na construção de uma escala, alguns
aspectos importantes devem ser considerados, como: a) os limites superiores e inferiores da
escala devem corresponder, respectivamente, à máxima e mínima intensidade da doença
observada no campo; b) os sintomas devem ser os mais próximos possíveis dos observados
em plantas e; c) nos níveis intermediários de doença devem ser consideradas as limitações de
acuidade do olho humano definidas pela lei de estímulos-resposta de Weber-Fechner, na qual
a acuidade visual é proporcional ao logarítmo da intensidade do estímulo (Horsfall e Barrat,
1945; Horsfall e Cowling, 1978; Nutter e Schultz, 1995). Além disto, as escalas diagramáticas
devem ser testadas (validadas) antes de serem propostas como um método padrão de
quantificação de doenças e, no caso de produzirem resultados insatisfatórios, estas devem ser
corrigidas (Martins et al., 2004).
Em adição às recomendações para sua preparação, o sucesso na utilização
das escalas diagramáticas depende da experiência e acuidade visual de cada avaliador.
Softwares específicos podem ser usados para treinamento de avaliadores para melhorar sua
habilidade na avaliação visual de doenças, reduzindo a subjetividade (Tomerlin e Howel,
1988; Nutter Jr. e Schultz, 1995; Canteri e Giglioti, 1998).
Estudos têm demonstrado que há grande variação na habilidade das pessoas
para avaliar a severidade de doenças com precisão. A qualidade da estimativa da doença, além
de ser influenciada por estímulos e respostas psicológicas, pode ser afetada por fatores como
34
complexidade da unidade amostral, tamanho e forma das lesões, cor e número de lesões na
unidade amostral, fadiga e dificuldade de concentração na tarefa (Kranz, 1988; Sherwood et
al., 1983).
A proposta de estabelecer um sistema padronizado para orientar a avaliação
da severidade de determinada doença é de grande responsabilidade, pois, caso o sistema seja
deficiente, o custo de sua utilização pode ser maior do que os benefícios alcançados com seu
uso (Nutter Jr. e Schultz, 1995; Leite e Amorim, 2002). No entanto, a padronização é
altamente desejável, pois a uniformização da metodologia de avaliação de doenças permite
comparações entre os resultados obtidos em diferentes instituições e localidades (Bergamin
Filho e Amorim, 1996).
Uma escala diagramática para avaliação da severidade da mancha foliar de
Phaeosphaeria foi proposta pela Agroceres (1996). Nessa escala, as notas correspondem a
diferentes porcentagens de área foliar afetada: 1: altamente resistente (0%); 2: resistente (1%);
3: resistente (10%); 4: medianamente resistente (20%); 5: medianamente suscetível (30%);
6: medianamente suscetível (40%); 7: suscetível (60%); 8: suscetível (80%); 9: altamente
suscetível (>80%) (Agroceres, 1996). A escala representa a planta toda, e é muito utilizada
para avaliação da resistência de híbridos de milho (Souza e Duarte, 2002; Santos et al., 2002).
Entretanto, quando se deseja avaliar o progresso da doença, uma escala que avalia a folha
individualmente é mais apropriada.
Os objetivos do presente trabalho foram a elaboração e a validação de uma
escala diagramática para avaliação da severidade da mancha foliar de Phaeosphaeria em
milho.
4.4. Material e Métodos
Foram coletadas 100 folhas de milho, aleatoriamente, com diferentes níveis
de severidade da mancha de Phaeosphaeria. O terço médio de cada folha foi escaneado
individualmente utilizando-se escâner (Plustec OpticPro P12) em imagens com resolução de
300 dpi. Em seguida, cada folha foi analisada em computador quanto à proporção de área
35
lesionada, utilizando-se o programa APS Assess, software para a quantificação de doenças em
plantas através da análise de imagens digitais (Lamari, 2002), obtendo-se assim a severidade
real da doença em termos percentuais.
Para o desenvolvimento da escala determinou-se o limite mínimo (menor
quantidade de doença observada visualmente) e máximo (quantidade de doença em que
ocorre senescência). Os níveis intermediários de severidade foram determinados de acordo
com a lei de Weber-Fechner de acuidade visual. A partir dos valores obtidos e respeitando a
forma, distribuição e frequência das lesões, estabeleceu-se uma escala diagramática com 8
níveis de severidade.
A validação da escala foi realizada através de avaliações de severidade
feitas por dez pessoas, sendo cinco experientes e cinco inexperientes. Cada avaliador analisou
50 imagens de folhas com diferentes níveis de severidade da doença em sessões.
Foi determinado o desempenho dos avaliadores quanto à precisão, acurácia
e variância dos erros absolutos. A precisão e a exatidão (acurácia) das estimativas visuais de
cada avaliador foram determinadas por meio de análise de regressão linear, considerando a
severidade real como variável independente e a severidade estimada pelo avaliador como
variável dependente. A precisão das estimativas foi avaliada pelo coeficiente de determinação
da regressão linear simples (r2) e pela variância dos erros absolutos (severidade estimada
menos severidade real). A acurácia de cada avaliador foi determinada por meio do teste t
aplicado ao coeficiente angular da reta (a) e ao coeficiente linear da reta (b), ambos obtidos
pela regressão linear (severidade real x severidade estimada) (Martins et al., 2004). A
reprodutibilidade das estimativas das estimativas foi determinada pelos valores de r2 obtidos
de regressões lineares entre as severidades estimadas por diferentes avaliadores, combinados
em pares, como proposto por Nutter Jr. et al. (1993) e Nutter e Schultz (1995) .
4.5. Resultados e Discussão
A escala diagramática elaborada apresentou oito níveis de severidade e teve
como limite inferior e superior os valores de 1% e 79% de área lesionada, respectivamente.
36
Os níveis intermediários, seguindo-se a lei de Weber-Fechner, foram ajustados para 3, 6, 13,
25, 43, 63% de severidade (Figura 4.1). Valores de severidade acima de 79% não foram
incluídos na escala, pois estes não foram observados a campo.
Figura 4.1 - Escala diagramática para avaliação da severidade da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho. Percentagem da área foliar lesionada.
A acurácia, definida como a exatidão de uma medida isenta de erros
sistemáticos (Bergamin Filho e Amorim, 1996) revela o quanto a severidade real está próxima
da estimativa média realizada pelo avaliador. Sua quantificação pode ser feita pela observação
dos valores da interseção da reta (a) e do coeficiente angular (b) obtidos nos cálculos de
regressão linear entre as severidades real e estimada (Nutter Jr. et al., 1991). As avaliações
acuradas mostram proximidade entre a estimativa e a realidade. Assim, o intercepto e a
inclinação da regressão linear entre valores reais e estimados não devem diferir de 0 e 1,
respectivamente (Nutter Jr. et al., 1993).
Na validação da escala diagramática, sem a sua utilização os valores do
intercepto relacionados aos avaliadores C, D, E e H diferiram significativamente de zero
37
(p�������� LQGLFDQGR� D� SUHVHQoD� GH� GHVYLRV� FRQVWDQWHV� �7DEHOD� ����� )LJXUD� ������ (VVHV�avaliadores superestimaram consistentemente (p<0,01) a severidade da mancha de
Phaeospraeria, indicando a presença de desvios positivos constantes para todos os níveis de
severidade da doença. Com a utilização da escala, os valores do intercepto dos avaliadores C e
E diferiram significativamente de zero (p<0,01), todos com desvios positivos constantes.
Entretanto ocorreu decréscimo na superestimativa desses avaliadores (Tabela 4.1, Figura 4.3).
Folhas onde severidades semelhantes são representadas por diferentes números e,
conseqüentemente, tamanhos de lesões, freqüentemente geram diferentes estimativas, e a
tendência é para superestimativa quando o número de lesões é alto e seu tamanho pequeno
(Sherwood et al., 1993; Godoy et al.,1997). Em relação aos valores do coeficiente angular da
reta, a maioria dos avaliadores (sete) apresentaram valores significativamente diferentes de 1
(p<0,01) sem a utilização da escala diagramática, indicando a presença de desvios
sistemáticos (Tabela 4.1, Figura 4.2). Com o uso da escala, somente os avaliadores A e J
apresentaram coeficientes angulares significativamente diferentes de 1 (p<0,01) (Tabela 4.1,
Figura 4.3).
Tabela 4.1 - Intercepto (a), coeficiente angular da reta (b) e coeficiente de determinação (r2) de equações de regressão linear simples para a severidade estimada da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho com e sem auxílio de escala diagramática.
Sem auxílio de escala Com auxílio de escala Avaliadores
a b r2 a b r2
A 0,26 1,18* 0,945 1,37 0,92* 0,975
B -0,93 1,36* 0,939 -0,73 1,02 0,959
C 17,60* 1,13 0,862 7,60* 1,05 0,909
D 5,56* 1,19* 0,929 1,03 1,02 0,956
E 18,91* 1,08 0,868 2,72* 1,02 0,972 Inex
peri
ente
s
Regr. Geral 8,28* 1,19* 0,868 2,4* 1,01 0,934
F -1,55 1,20* 0,923 1,43 1,03 0,945
G -1,27 1,25* 0,952 1,01 1,00 0,962
H 4,70* 0,91* 0,943 0,35 0,96 0,973
I 1,87 0,98 0,944 -0,19 1,00 0,980
J 1,75 0,84* 0,954 1,17 0,87* 0,962 Exp
erie
ntes
Regr. Geral 1,10 1,04 0,910 0,76 0,97 0,957
*situações nas quais as hipóteses a = 0 e b = 1, foram rejeitadas pelo teste t (p<0,01).
38
Figura 4.2 - Severidade estimada da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho sem auxílio de escala diagramática (�) e linha de regressão obtida entre a severidade estimada em função da severidade real (linha cheia). A linha pontilhada representa a situação ideal com severidade estimada igual à real. Avaliadores inexperientes (A a E) e experientes (F a J).
39
Figura 4.3 - Severidade estimada da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho com auxílio de escala diagramática (�) e linha de regressão obtida entre a severidade estimada em função da severidade real (linha cheia). A linha pontilhada representa a situação ideal com severidade estimada igual à real. Avaliadores inexperientes (A a E) e experientes (F a J).
40
Precisão é a medida de confiabilidade nas avaliações, podendo ser
quantificada pelo coeficiente de determinação de regressões lineares (r2) estabelecidas entre o
valor real e o estimado, e pela variação dos erros absolutos (severidade estimada menos
severidade real) (Nutter Jr. et al., 1991). A precisão foi alta com e sem o uso da escala
diagramática para ambos, avaliadores experientes e inexperientes (Tabela 4.1, Figuras 4.2 e
4.3). O valor de r2 dos avaliadores inexperientes variou de 0,86 a 0,95 sem escala e 0,91 a
0,98 com escala, ao passo que para os avaliadores experientes o r2 variou de 0,91 a 0,95 sem
escala e de 0,94 a 0,98 com escala. Para as avaliações visuais da mancha foliar de
Phaeosphaeria, realizadas com o auxílio da escala diagramática, a maioria dos avaliadores
obtiveram valores (r2) de precisão superiores a 95% considerados desejáveis por Kranz
(1988), superiores aos níveis verificados em outros estudos utilizando escalas diagramáticas
(Nutter et al., 1993; Michereff et al., 2000; Díaz et al., 2001; Rodrigues et al., 2002; Andrade
et al., 2005���
Sem o uso da escala 95% dos erros absolutos (m ± 2 desvios padrão) dos
avaliadores inexperientes ficaram concentrados entre -12 a +39% e dos avaliadores
experientes entre -15 a +19% (Figura 4.4). Quando a escala foi utilizada a variação decresceu,
ficando os erros concentrados entre -11 a +16% para os avaliadores inexperientes e entre -11 a
+11% para os experientes (Figura 4.5). De acordo com Nutter (1989), para que um avaliador
possa ser considerado excelente, o erro de suas estimativas deve estar dentro de um intervalo
de ± 5% do valor real, e bom quando não ultrapassar a ± 10%. Nesse sentido, tanto os
avaliadores experientes quanto os inexperientes, com o uso da escala, foram considerados
bons na avaliação da severidade da mancha foliar de Phaeosphaeria. É importante ressaltar
que a presença de certo nível de erro absoluto nas mensurações pode ser compensada pela
rapidez e padronização quando se utiliza escala diagramática (Stonehouse, 1994). Além disso,
como na maioria dos métodos de quantificação de severidade de doenças o uso de escalas está
sujeito a um certo grau de subjetividade, o que pode ser minimizado com o treinamento dos
avaliadores (Nutter Jr. e Schultz, 1995). Alguns estudos demonstraram que o treinamento de
avaliadores tem influência positiva principalmente sobre a precisão das estimativas (Nutter e
Schultz, 1995; Michereff et al., 2000; Belasque Jr. et al., 2005; Andrade et al., 2005).
41
Figura 4.4 - Erros absolutos (% severidade estimada menos % severidade real) para a mancha foliar de Phaeosphaeria em milho sem auxílio de escala diagramática. Avaliadores inexperientes (A a E) e experientes (F a J).
42
Figura 4.5 - Erros absolutos (severidade estimada menos severidade real) para a mancha foliar de Phaeosphaeria em milho com auxílio de escala diagramática. Avaliadores inexperientes (A a E) e experientes (F a J).
43
Além da acurácia e da precisão, outro indicador da eficiência da escala
diagramática desenvolvida é a reprodutibilidade das avaliações entre os avaliadores (Berger,
1980). A reprodutibilidade das avaliações, entre os avaliadores combinados aos pares,
também pode ser utilizada como um indicativo de precisão de um método de avaliação de
doenças (Nutter Jr. et al., 1993). Diferentes avaliadores, utilizando a mesma escala para a
avaliação do mesmo material, devem estimar os mesmos valores de severidade (Nutter e
Schultz, 1995). As regressões lineares entre as severidades estimadas pelos 10 avaliadores,
quando não utilizaram a escala diagramática, produziram coeficientes de determinação (r2)
variando de 80 a 96%, sendo que somente 53% dos casos foi �� ���� �7DEHla 4.2).Com a
utilização da escala, nas avaliações os valores de r2 foram mais elevados, variando entre 85 a
97%, sendo ������HP�����GRV�FDVRV� �7DEHOD�������3RUWDQWR��TXDQGR�D�HVFDOD�GLDJUDPiWLFD�para mancha foliar de Phaeosphaeria em milho foi utilizada, os dados estimados pelos
diferentes avaliadores estiveram próximos a uma concordância perfeita, indicando boa
reprodutibilidade.
Tabela 4.2 - Coeficientes de determinação (r2) de equações de regressão linear simples relacionando as estimativas das severidades da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho entre os avaliadores, sem auxílio de escala diagramática. Avaliadores inexperientes (A a E) e experientes (F a J).
Avaliadores A B C D E F G H I
B 0,92
C 0,85 0,84
D 0,86 0,88 0,82
E 0,80 0,81 0,84 0,86
F 0,93 0,93 0,82 0,89 0,83
G 0,96 0,90 0,84 0,87 0,80 0,93
H 0,92 0,90 0,81 0,91 0,80 0,93 0,95
I 0,93 0,89 0,82 0,89 0,81 0,92 0,94 0,93
J 0,94 0,93 0,83 0,91 0,82 0,94 0,94 0,94 0,95
O teste t aplicado aos dados pareados dos coeficientes de determinação (r2)
entre os avaliadores, sem e com o uso da escala diagramática, demonstrou que os coeficientes
de determinação médios 0,80 (sem escala) (Tabela 4.2) e 0,93 (com escala) (Tabela 4.3) são
estatisticamente diferentes (p=1,03x10-6), o que retrata melhora da precisão dos avaliadores
quando utilizaram escala.
44
Tabela 4.3 - Coeficientes de determinação (r2) de equações de regressão linear simples relacionando as estimativas das severidades da mancha foliar de Phaeosphaeria em milho entre os avaliadores, com auxílio de escala diagramática. Avaliadores inexperientes (A a E) e experientes (F a J).
Avaliadores A B C D E F G H I
B 0,93
C 0,92 0,86
D 0,93 0,96 0,85
E 0,97 0,93 0,94 0,94
F 0,91 0,90 0,90 0,90 0,95
G 0,93 0,92 0,88 0,89 0,93 0,96
H 0,94 0,95 0,88 0,94 0,95 0,92 0,95
I 0,97 0,94 0,91 0,92 0,96 0,92 0,94 0,96
J 0,95 0,91 0,89 0,93 0,94 0,94 0,93 0,94 0,94
4.6. Conclusão
Os resultados deste estudo permitem concluir que o uso da escala
diagramática proposta para quantificação da severidade da mancha foliar de Phaeosphaeria
em milho melhora a precisão, acurácia e reprodutibilidade das estimativas, independente da
experiência do avaliador, que a torna uma ferramenta útil e adequada na avaliação da doença
para reduzir a subjetividade das estimativas visuais.
45
5. ARTIGO C: AVALIAÇÃO DE SOFTWARE PARA ESTIMAR ÁREAS FOLIARES E LESIONADAS
5.1. Resumo
Estimativas de área foliar e lesionada por injúrias são importantes em pesquisas, controle
fitossanitário e aspectos comerciais em culturas agrícolas. O objetivo deste trabalho foi testar
o software SFP em análise de imagens digitais na quantificação de áreas foliares e lesionadas.
Para determinação da área foliar foram utilizadas folhas de mangueira, morangueiro e jaqueira
e para determinação de área lesionada foi utilizado o terço médio de folhas de milho com
mancha de Phaeosphaeria. O software SFP foi comparado com o método gravimétrico para
área foliar e com o software APS Assess para área foliar e lesionada. O software SFP
apresentou boa precisão e exatidão (acurácia) nas quantificações de áreas foliar e lesionada.
Palavras-chave: morangueiro, jaqueira, mangueira, milho, Phaeosphaeria, software.
46
5.2. Abstract
SOFTWARE EVALUATION TO ESTIMATE THE LEAF AND INJURY AREA. The
estimate of the areas leaf and injury is important in research, phytosanitary control and
commercial aspects. The objective of this work was to test software SFP in analysis of digital
images for the leaf and injury area estimate. Strawberry, jackfruit and mango leaves were
used to estimate leaf area. The third medium part of the maize leaf with Phaeosphaeria spot
was used for injury estimate. SFP Software was compared with the gravimetrical method for
foliar area and with APS Assess software for foliar and injury area. The software SFP has
good precision and accuracy for the leaf and injury area estimate.
Key-words: strawberry, jackfruit, mango, maize, Phaeosphaeria, software.
47
5.3. Introdução
A área foliar é uma importante medida para avaliar a eficiência da
fotossíntese, estimar a produção e a necessidade hídrica de uma cultura. Avaliações desta
variável durante o ciclo da planta, também são úteis para modelar o crescimento e o
desenvolvimento (Nascimento et al., 2002) e assim estimar produtividade .
Os métodos usados para medir área foliar são classificados em destrutivos e
não-destrutivos, diretos e indiretos. A vantagem dos métodos não destrutivos é que esses
permitem acompanhar o crescimento e a expansão foliar da mesma planta, até o final do ciclo
ou do ensaio. Assim, a área foliar pode ser estimada utilizando-se parâmetros dimensionais de
folhas. O método não destrutivo mais utilizado é o que emprega equações de regressão,
comparando a área foliar real às medidas lineares das folhas. Este método já foi utilizado em
diversas plantas cultivadas e ervas invasoras (Bianco et al., 2003; Bianco et al., 2004).
Apesar das medidas das dimensões das folhas fornecerem, em muitos casos,
dados confiáveis às equações para estimar áreas foliares, essas equações são específicas para
cada espécie vegetal, mesmo para diferentes variedades de uma mesma espécie. Por exemplo,
Potdar e Pawar (1991) obtiveram equações de regressão diferentes para a relação entre a área
foliar e o produto (comprimento x largura) das folhas de dois cultivares de banana.
Um método preciso e acurado para medida de área foliar é o gravimétrico.
Nesse método as folhas são fotocopiadas em papel de gramatura conhecida, as imagens são
recortadas, as massas dos recortes são obtidas em balança analítica e comparadas com massas
de áreas conhecidas do mesmo papel (Mielke et al., 1995; Araujo et al., 2005).
Além da área foliar, também é importante se conhecer a área lesionada da
folha. As estimativas de áreas lesionadas têm importância nos aspectos fitossanitários e
comerciais. Essas medidas são úteis para avaliar a extensão de danos causados em tecidos
vegetais, devido a ataques de pragas, doenças, deficiências nutricionais e injúrias mecânicas.
Lobo et al. (2005) determinaram áreas lesionadas através da medida de comprimento e
largura, e contagem do número de lesões.
Um outro método para dimensionar lesões em folhas é a medida indireta das
lesões em medidor de área foliar. As áreas lesionadas são desenhadas em plástico
transparente, e estes submetidos ao medidor de área foliar para determinação das áreas
lesionada (Souza et al., 2003; Martins et al., 2004).
48
Os avanços da informática nos últimos anos permitiram a agilização de uma
série de operações que até então eram realizadas manualmente. A geração e análise de
imagens de cores e formas diferentes, com determinação de sua área e perímetro, estão entre
as operações que podem ser realizadas por computadores (Lindow, 1983).
A existência de softwares com algoritmos adequados, capazes de instruir o
computador a reconhecer certas áreas na imagem, torna essa metodologia viável para
quantificar lesões em tecido foliar causadas por fitopatógenos. Assim, a análise de imagens
apresenta grande potencial para quantificação da área foliar afetada por doenças de plantas
(Thomé et al., 1997; Prates et al., 2001).
O uso de softwares pode facilitar o trabalho da determinação de área foliar e
de lesões, inclusive determinando simultaneamente essas áreas. Com o uso de softwares,
Tavares-Jr. et al. (2002), determinaram a área foliar de cafeeiro de maneira mais precisa e
acurada que por outros métodos.
O objetivo deste ensaio foi testar a versão alfa do software SFP na
determinação de áreas foliares e lesionadas de folhas de diferentes espécies vegetais, através
da análise de imagens digitais.
5.4. Material e Métodos
O trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica e Tecnologia de
Produtos Agropecuários do Departamento de Biologia e Tecnologia das Faculdades Luiz
Meneghel - Universidade Estadual do Norte do Paraná - FALM/UENP, Bandeirantes - PR.
Para determinação de área foliar foram utilizados 30 folíolos de
morangueiro (Fragaria vesca L.), 30 folhas de jaqueira (Artocarpus integrifolia L.) e 30
folhas de mangueira (Mangifera indica L. cv, 'Haden'), coletadas aleatoriamente. Para as
determinações das áreas foliares foram usados os métodos: a) gravimétrico, descrito por
Mielke et al. (1995); b) software APS Assess - Image analise software for plant disease
quantification (Lamari, 2002); c) versão alfa do software SFP para medição de área foliar
(software desenvolvido no Dep. de Biologia e Tecnologia da FALM/UENP). Os resultados
49
obtidos com o software SFP foram comparados com os resultados obtidos pelo método
gravimétrico e com o software APS Assess.
A determinação da área pelo método gravimétrico foi realizada através da
obtenção das massas (em balança analítica), de recortes das imagens das folhas fotocopiadas
em papel sulfite (gramatura 75 g/m2). As massas das imagens foram comparadas com massas
padrões das fotocópias, de áreas conhecidas (figuras geométricas). As determinações de áreas
com os softwares APS Assess e SFP, foram avaliadas através da análise de imagens
escaneadas das folhas. As folhas foram pré-digitalizadas em 24 bits e resolução óptica de
300 dpi. Os pixels que atenderam às condições pré-estabelecidas foram contados e a cada um
foi atribuída a área de 7,1684 x 10-5 cm2.
O mesmo método usado para estimar a área foliar foi usado para estimar a
área lesionada. A determinação da percentagem de área lesionada foi feita no terço médio de
50 folhas de milho (Zea mays L.) com diferentes níveis de lesões de mancha de
Phaeosphaeria. Para essa determinação foram utilizados os softwares APS Assess e SFP,
dada à dificuldade operacional de se utilizar o método gravimétrico para esse fim.
Para verificar a exatidão do método com o software SFP, foram ajustados
modelos de regressão linear simples sem interceptação, relacionando-se os valores de área
foliar ou lesionadas obtidas pelos métodos gravimétrico ou software APS Assess, por meio
de:
Yi = βXi + εi
Onde: Yi representa cada área da folha obtida pelo software SFP; β, representa a inclinação
(coeficiente angular); Xi corresponde a cada área da folha obtida pelo método gravimétrico o
como o software APS Assess; εi, erro estimado pelo método dos mínimos quadrados.
Testou-se a hipótese β = 1, que indica se as medidas de área foliar são
equivalentes quando comparado o método SFP com os demais métodos e determinou-se o
intervalo de confiança (p<0,05). Calcularam-se também o coeficiente de determinação
simples (r2), de cada regressão linear sem intercepto e a Raiz Quadrada do Erro Quadrático
Médio (RMSE) dos erros relativos, entre as áreas obtidas com software SFP e as obtidas com
os outros métodos. As significâncias dos coeficientes de determinação foram provadas pelo
teste t.
50
A avaliação de possíveis tendências, não captadas pelo r2 e RMSE, foi
analisada por análise subjetiva dos gráficos com os padrões das dispersões dos erros relativos
de cada regressão.
5.5. Resultados e Discussão
Na comparação das áreas foliares de mangueira, morangueiro e jaqueira,
estimadas com o método gravimétrico e com o software SFP, o coeficiente de determinação
das regressões lineares sem intercepto (r2) variou de 0,986 a 0,996 (Tabela 5.1), indicando que
houve boa precisão das estimativas com o software SFP em relação ao método gravimétrico.
O intervalo de confiança para os coeficientes angulares ficou entre 0,992 e 1,010, o maior
erro-padrão foi de 0,003 (Tabela 5.1). A distribuição aleatória dos erros (Figura 5.1) indicou
que não houve tendências e que o modelo linear de regressão foi adequado. Em estudos
comparativos entre método gravimétrico com equações do produto do comprimento da
nervura central x larguras do limbo foliar com a área foliar, foram observados erros relativos
médios de 3,4% para folíolos de morangueiro (Zapparoli et al., 2006), 3,0% para folhas de
jaqueira (Venturelli et al., 2006a) e 3,8% para folhas de mangueira (Venturelli et al., 2006b).
Estes valores foram muito superiores aos obtidos nesse ensaio para o RMSE, que foram de
1,80% para morangueiro, 1,56% para jaqueira e 1,31% para mangueira (Tabela 5.1). É muito
difícil obter de maneira direta a área de figuras não geométrica, como é caso de folhas.
Entretanto, o método gravimétrico, a partir de reproduções em fotocópias, apesar de indireto,
é considerado preciso e exato (acurado) para determinação de áreas foliares (Mielke et al.,
1995). Os valores das estimativas dos coeficientes angulares (β) muito próximos da unidade é
um indicativo de que por ambos os métodos (gravimétrico e SFP) obtêm-se igual resultado
para a área foliar a partir de uma mesma amostra de folha.
51
Tabela 5.1 - Estimativas dos coeficientes angulares (β) dos modelos de regressão linear sem intercepto para área foliar estimadas pelo método gravimétrico e software SFP, erros-padrão, intervalos de confiança de 95%, Raízes Quadradas dos Erros Quadráticos Médios (RMSE) e coeficiente de determinação simples (r2) das regressões.
β Intervalo de confiança Folha
Estimativa Erro-padrão inferior superior r2 RMSE %
Jaqueira 0,999 0,003 0,994 1,006 0,991* 1,56
Morangueiro 1,003 0,003 0,997 1,010 0,986* 1,80
Mangueira 0,996 0,002 0,992 1,001 0,996* 1,31
*Probabilidade no teste t < 0,01
Figura 5.1 - Modelos das regressões lineares das estimativas de área foliar obtidas pelo método gravimétrico e com o software SFP, e respectivos gráficos de dispersão dos erros relativos de cada regressão linear.
52
Na comparação das avaliações realizadas com o software APS Assess e o
software SFP também foram observados valores das estimativas dos coeficientes angulares
(β) muito próximos da unidade (Tabela 5.2), novamente indicando que os dois métodos
testados apresentaram igual resultado para a área foliar a partir de uma mesma amostra de
folha. O intervalo de confiança para os coeficientes angulares ficaram entre 0,992 e 1,003, o
maior erro-padrão foi de 0,001 (Tabela 5.2). Na comparação das áreas foliares de mangueira,
morangueiro e jaqueira, estimadas com os softwares APS Assess e SFP, o coeficiente de
determinação das regressões lineares sem intercepto (r2) variou de 0,997 a 0,998 (Tabela 5.2),
indicando que houve boa precisão das estimativas com o software SFP em relação ao APS
Assess. Analisando os gráficos dos resíduos, observou-se que a distribuição foi aleatória, não
havendo tendências, o que confirmou que os modelos lineares adotados para as regressões
foram adequados (Figura 5.2). Para todos os parâmetros analisados, observa-se que as áreas
foliares obtidas com o software SFP foram mais próximas das obtidas com o Software APS
Assess. Entretanto, não houve diferenças significativas para as áreas foliares obtidas por
qualquer dos métodos testados. Tavares-Jr. et al. (2002), na determinação de área foliar de
cafeeiro, obtiveram coeficiente de determinação de 0,965 a 0,976, quando utilizaram método
com o medidor de área foliar (método de referência), comparado com o método que utilizava
um software para leitura a partir de imagens escaneadas. Observaram ainda que o método que
utilizava o software não apresentou tendências com relação ao método de referência.
Tabela 5.2 - Estimativas dos coeficientes angulares (β) dos modelos de regressão linear sem intercepto para área foliar estimadas pelos softwares APS-Assess e SFP, erros-padrão, intervalos de confiança de 95%, Raízes Quadradas dos Erros Quadráticos Médios (RMSE) e coeficiente de determinação simples (r2) das regressões.
β Intervalo de confiança Folha
Estimativa Erro-padrão inferior superior r2 RMSE %
Jaqueira 0,999 0,001 0,997 1,002 0,998* 0,64
Morangueiro 1,001 0,001 0,998 1,003 0,998* 0,68
Mangueira 0,995 0,001 0,992 0,998 0,997* 0,88
*Probabilidade no teste t < 0,01
53
Figura 5.2 - Modelos das regressões lineares das estimativas de área foliar obtidas com os softwares APS Assess e SFP, e respectivos gráficos de dispersão dos erros relativos de cada regressão linear.
Assim com para a determinação das áreas foliares, não foram observadas
diferenças significativas das estimativas para a percentagem da área foliar de milho com
mancha de Phaeosphaeria, entre os valores obtidos com os softwares APS Assess e SFP. O
coeficiente angular (β) de 1,002 e erro-padrão de 0,001 confirmam a exatidão das avaliações
com o software SFP (Tabela 5.3). Quanto à precisão, o coeficiente de determinação simples
(r2) de 0,999 mostra que há um excelente ajuste de regressão (Tabela 5.3). O padrão da
dispersão do erro foi aleatório, indicando não haver tendências (Figura 5.3). A RMSE foi de
0,84% (Tabela 5.3), o que é um erro pequeno para as estimativas de áreas lesionadas em
54
plantas. O erro relativo médio relatado por Tavares-Jr et al., (2002) para medidas de áreas
foliares na comparação da análise com software e medidor de área foliar, foi de 2,49%.
Figura 5.3 - Modelo da regressão linear da estimativa das percentagens de áreas de folhas de milho (terço médio) com mancha de Phaeosphaeria, obtidas com os softwares APS Assess e SFP, e respectivo gráfico de dispersão dos erros relativos da regressão linear.
Tabela 5.3 - Estimativa do coeficiente angular (β) do modelo de regressão linear sem intercepto para a % da área foliar de milho com mancha de Phaeosphaeria, erros-padrão, intervalos de confiança de 95%, Raízes Quadradas dos Erros Quadráticos Médios (RMSE) e coeficiente de determinação simples (r2) das regressões.
*Probabilidade no teste t < 0,01
Foram considerados apenas os terços médios das folhas de milho para a avaliação.
A regressão foi a partir dos resultados obtidos com os softwares APS-Assess e SFP
Estimativa para β 1,002
Erro-padrão para β 0,001
Intervalo de confiança para β (inferior) 0,999
Intervalo de confiança para β (superior) 1,005
r2 0,999*
RMSE 0,84%
55
5.6. Conclusão
O software SFP apresentou adequada precisão e exatidão (acurácia) para
determinação de área foliar de mangueira, morangueiro e jaqueira e área afetada por mancha
de Phaeosphaeria em folhas de milho.
56
6. CONCLUSÕES GERAIS
O método desenvolvido para determinação cor de açúcar apresenta precisão
e exatidão (acurácia) inferior às do método oficial ICUMSA, entretanto, mostrou-se precisão
e exatidão suficiente para diferenciar a cor de açúcares de diferentes classes de cor.
O uso da escala diagramática melhora a precisão, acurácia e
reprodutibilidade das estimativas, independente da experiência do avaliador.
O software SFP apresenta adequada precisão e exatidão (acurácia) para
determinação de área foliar e área lesionada.
57
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