uso de painel de genes para sequenciamento de próxima...

Isadora Portelinha Moreira Carneiro

Uso de painel de genes para sequenciamento de próxima

geração no diagnóstico molecular de osteogênese imperfeita

Brasília

2017

Isadora Portelinha Moreira Carneiro



Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao

Departamento de Odontologia da Faculdade de

Ciências da Saúde da Universidade de Brasília,

como requisito parcial para a conclusão do curso

de Graduação em Odontologia.

Orientador: Profa. Dra. Ana Carolina de Acevedo-

Poppe

Co-orientador: Profa. Dra. Pollyanna Almeida

Costa dos Santos

Brasília

2017

Àos meus pais Tânia e Ronaldo e ao Paulo Henrique.

AGRADECIMENTOS

Ao concluir este trabalho um turbilhão de emoções

invadiu o meu sentir, recordei do que me motivou a cursar uma

nova graduação e de todas as pessoas que me ajudaram nessa

decisão. Agradeço especialmente ao Paulo Henrique que foi

fundamental para realização desse sonho. Você soube dizer as

palavras certas quando pensei em desistir de fazer o vestibular.

Impossível não recordar desse momento, sempre confiante em

mim, até mesmo quando me falta essa confiança. A distância

esteve muitas vezes presente, mas ela nunca foi empecilho para

nós. Essa foi apenas uma etapa das muitas que iremos

conquistar juntos. Muito obrigada meu Amor por incentivar os

meus sonhos e por me fazer feliz todos os dias.

Agradeço minha mãe Tânia e meu pai Ronaldo por todo o

incentivo e apoio que me deram durante a realização do curso,

mesmo com toda dificuldade vocês fizeram de tudo para que eu

conseguisse concluir e nos momentos de desespero me

acalmava dizendo que tudo terminaria bem. Vocês não tinham

nenhuma obrigação de me ajudar em uma nova graduação, mas

agarraram a oportunidade como se fossem de vocês e fizeram

desse sonho realidade. Vejo o orgulho que sentem de mim em

seus olhos e poder proporcionar essa felicidade é o meu maior

estímulo para ser cada dia uma pessoa e uma profissional

melhor que faça diferença na vida das pessoas. Obrigada por

serem exemplos de superação, amo vocês infinitamente.

Aos meus irmãos Gustavo e César muito obrigada por

me ajudarem, vocês foram fundamentais para a conclusão desse

sonho. Amo vocês!

Obrigada Cibele e Clarivaldo por me acolher como uma

filha, vocês ocupam um lugar especial na minha vida e no meu

coração, foram afetuosos e sempre presentes com pequenas

atenções, lanchinhos gostosos para estudar, chá para dormir e

até companhia durante a madrugada para fazer os provisórios de

prótese fixa. Agradeço a oportundade de poder fazer parte dessa

família tão especial. Joyce, João Paulo, Ariela e a minha querida

Clarinha muito obrigada pelos momentos felizes compartilhados.

À minha família, tios, tias e primos obrigada por vocês

serem parte da minha história. Obrigada especial ao meu

padrinho Tio Chico que me incentivou e orientou a fazer

odontologia e a Tia Débora de quem sempre irei recordar com

alegria e carinho, você faz muita falta.

Agradeço todos os meus professores pelos

conhecimentos compartilhados. Aos professores Liliana e

Rodrigo, vocês são exemplos para mim, são profissionais

competentes com uma família linda, aprendi com vocês que é

possível ter a vida profissional e a pessoal em harmonia. Ao

professor Lucas Tabata por sempre estar disposto a ajudar no

que precisei durante a graduação, até mesmo para conversar

sobre a profissão. Aos professores Leandro Hilgert e Soraya Leal

por me inspirarem através do exemplo de profissionais

competentes que vocês são. Ao professor Paulo Galvão por todo

encentivo e também por me mostrar que com a odontologia

também podemos ajudar de uma forma diferente os que mais

precisam. Em especial a minha querida orientadora Ana Carolina

que me acolheu com muito carinho em um momento de

desespero no meu primeiro ano de graduação, com quem criei

um vínculo muito especial. Obrigada por sua paciência, por suas

palavras docentes e por acreditar que eu seria capaz de um

desafio tão grande como esse projeto.

Dr. Paulo Yamagutti muito obrigada por compartilhar o

seu conhecimento de uma forma tão especial. Você é exemplo

de dedicação, de competência e de humanidade, um profissional

em quem me espelho. Espero um dia ser um pouquinho do que

você é para esses pacientes.

Obrigada muito especial a minha co-orientadora e amiga

Pollyanna pela ajuda em todos os momentos: tanto nas horas de

realizar os experimentos, analisar os resultados e corrigir o

trabalho, como nas horas de conversas alegres. Que bom que

tive a feliz oportunidade de conhecê-la.

Agradeço aos componentes do laboratório de

Histopatologia Bucal, nele pude aprender muito e fazer muitas

amizades. São pessoas queridas que tive o privilégio de conviver

durante 4 anos. Agradeço especialmente à Lídia e ao Luan pela

participação nas extrações de DNA; a Thaís pelas conversas

divertidas e a querida Ana Luiza pelo carinho, boa vontade e

companhia na Clínica de Anomalias Dentárias. Agradeço aos

pacientes com osteogênese imperfeita que aceitaram participar

dessa pesquisa, sem eles este estudo não seria possível.

A minha querida turma 65 de Odontologia agradeço por

todos os momentos que compartilhamos nesses anos, vocês

estiveram presente em todos os meus dias e contribuíram para

ser uma jornada mais alegre e divertida. Sentirei falta de todos

vocês.

Muito obrigada Tainara, Jéssica, Lucas e Ygor, vocês são

amigos que a odontologia me presenteou para a vida.

A minha querida companheira de atendimentos clínicos

Nathália Maria muito obrigada por ser minha parceira em tudo,

você foi fundamental para que a graduação fosse alegre,

divertida e leve. Sentirei saudade de tê-la todos os dias comigo.

Você é uma pessoa muito especial, com um grande coração.

Sou grata por tudo que compartilhamos e pela amizade que

criamos.

Agradeço aos meus amigos, aos que estão longe e aos

que fiz em Brasília, vocês permitem que a vida não seja feita

apenas de trabalho, mas também de felicidade e bem-estar.

Por fim, agradeço a Deus por me permitir estar em

constante evolução.

Muito Obrigada!

EPÍGRAFE

“Para tudo há soluções, mas é necessário encontrar as mais

felizes. E as mais felizes não podem ser outras do que as que

permitem a mudança em nós mesmos.”

Carlos Gonzáles Pecoche

RESUMO

CARNEIRO, Isadora Portelinha Moreira. Uso de painel de genes

para sequenciamento de próxima geração no diagnóstico

molecular de osteogênese imperfeita. 2017. Trabalho de

Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) –

Departamento de Odontologia da Faculdade de Ciências da

Saúde da Universidade de Brasília.

A osteogênese imperfeita (OI) é um grupo de condições

genéticas heterogêneas, caracterizadas principalmente pela

fragilidade óssea. A OI é considerada um transtorno relacionado

à síntese e estrutura do colágeno e a maioria dos casos (80-

90%) está relacionada a mutações dominantes no COL1A1 e

COL1A2, genes que codificam as cadeias de colágeno tipo 1

(COL1). Na última década, foram relatadas mutações em pelo

menos 16 outros genes associados a casos de OI autossômico

recessivo e um ligado ao cromossomo X. Clinicamente, a OI é

caracterizada por apresentar alterações esqueléticas e extra-

esqueléticas. A dentinogênese imperfeita (DGI), uma alteração

na formação da dentina dentinária, está presente em

aproximadamente 50% dos casos de OI dos tipos I a IV. O

objetivo desse estudo foi identificar, pelo método de

sequenciamento de nova geração (NGS), mutações patológicas

em 33 pacientes diagnosticados com OI e caracterizar as

alterações dentárias clínicas e radiográficas dos pacientes

diagnosticados com DGI, em tratamento com bisfosfonato e em

atendimento na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias

de Desenvolvimento Dentário do Hospital Universitário de

Brasília. Com a finalidade de caracterizar as manifestações

dentárias, os prontuários desses pacientes foram analisados. A

avaliação genética foi realizada por meio do desenvolvimento de

um painel de NGS, composto de 14 genes associados à OI e a

sua análise foi realizada utilizando a plataforma Ion AmpliSeq™.

Por meio do NGS foi possível identificar 22 mutações patológicas

em 33 pacientes diagnosticados com OI, apresentando ou não

DGI. Um total de 18 mutações em heterozigose nos genes

COL1A1 e COL1A2 foram identificadas neste estudo, sendo 9

mutações em COL1A1 previamente relatadas na literatura (7

missense, 1 nonsense e 1 frameshift), e 9 mutações missense

em COL1A2 (6 já descrita anteriormente na literatura e 4 não

relatadas, mas consideradas patogênicas de acordo com as

análises in silico). Em quatro pacientes com história de

consanguinidade foram identificadas mutações missense

homozigóticas nos genes SERPINF1, P3H1 e CRTAP. Não

foram encontradas mutações patogênicas nos genes estudados

em 11 pacientes. Dos pacientes estudados, 21 apresentaram

DGI. Alterações nos genes COL1A1 e COLA1A2 foram as mais

frequentes, concordando com a literatura. Sete mutações não

foram previamente relatas na literatura sugerindo serem

mutações novas. A caracterização clínica revelou que todos os

pacientes com DGI foram do tipo moderada. O estudo permitiu

aos participantes um diagnóstico molecular através da técnica de

NGS, podendo proporcionar para esses pacientes um

aconselhamento genético adequado assim como um

acompanhamento terapêutico mais preciso.

ABSTRACT

CARNEIRO, Isadora Portelinha Moreira. Use of gene panel for next generation sequencing in the molecular diagnosis of imperfect osteogenesis. 2017. Undergraduate Course Final Monograph (Undergraduate Course in Dentistry) – Department of Dentistry, School of Health Sciences, University of Brasília.

Osteogenesis imperfecta (OI) is a group of heterogeneous

genetic conditions characterized mainly by bone fragility. OI is

considered an related disorder and collagen structure and most

cases (80-90%) are related to dominant mutations in COL1A1

and COL1A2, the genes encoding the collagen chains type 1

(COL1). In the last decade, mutations have been reported in at

least 16 other genes associated with cases of autosomal

recessive OI and one associated with chromosome X. Clinically,

OI is characterized by skeletal and extra-skeletal disorder. The

dentinogenesis imperfecta (DGI) is characterize bay dentin

formation anomaly, and it is present in approximately 50% of

cases of OI of types I to IV. The objective of this study was to

identify pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI

and to characterize the clinical and radiographic dental alterations

of the patients diagnosed with DGI in treatment with

bisphosphonate and in the Clinical Patients with Dental

Developmental Anomalies of the University Hospital of Brasília. In

order to characterize the dental manifestations, the medical

records of these patients were analyzed. Genetic evaluation was

performed through the development of NGS panel composed of

14 OI associated genes and analyzed using the Ion AmpliSeq ™

platform. Through the NGS it was possible to identify 22

pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI,

presenting or not with DGI. A total of 18 heterozygous mutations

in the COL1A1 and COL1A2 genes were identified in this study,

with 9 mutations in COL1A1 previously reported in the literature

(7 missense, 1 nonsense and 1 frameshift), and 9 missense

mutations in COL1A2 (6 previously described in the literature and

4 not reported but considered pathogenic according to in silico

analyzes). In four patients with a history of consanguinity,

homozygous missense mutations were identified in the

SERPINF1, P3H1 and CRTAP genes. No pathogenic mutations

were found in the genes studied in 11 patients. Of the patients

studied, 21 presented with DGI. Changes in the COL1A1 and

COL1A2 genes were the most frequent, in concordance with the

literature. Seven mutations have not previously been reported in

the literature suggesting they are new mutations. Clinical

characterization revealed that all patients with DGI were of the

moderate type. The study allowed the participants a molecular

diagnosis through the NGS technique. Molecular diagnosis will

allow adequate genetic counseling as well as more precise

therapeutic follow-up.

SUMÁRIO

Artigo Científico ........................................................................... 19 Folha de Título ........................................................................ 21 Lista de Abreviaturas .............................................................. 22 Resumo ................................................................................... 24 Abstract ................................................................................... 27 Introdução ............................................................................... 29 Materiais e Métodos ................................................................ 35 Resultados .............................................................................. 38 Discussão ................................................................................ 46 Conclusão................................................................................ 49

Referências ............................................................................. 51

Anexos ......................................................................................... 58

Termo de consentimento livre e esclarecido .......................... 58 Normas da Revista .................................................................. 59

19

ARTIGO CIENTÍFICO

Este trabalho de Conclusão de Curso é baseado no artigo

científico:

CARNEIRO, Isadora Portelinha Moreira; SANTOS, Pollyanna

Almeida Costa; Acevedo-Poppe, Ana Carolina.



Apresentado sob as normas de publicação da revista BONE

21

FOLHA DE TÍTULO



Use of gene panel for next generation sequencing in the molecular diagnosis of imperfect osteogenesis

Isadora Portelinha Moreira Carneiro1,4

Pollyanna Almeida Costa dos Santos2

Ana Carolina Acevedo-Poppe3,4

1Aluna de Graduação em Odontologia da Universidade de

Brasília (UnB). 2Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas

(UNCISAL) 3Laboratório de Histopatologia Bucal, Departamento de

Odontologia, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de

Brasília (UnB). 4Clínica de Atendimento a pacientes portadores de anomalias

dentárias.

Correspondência: Profa. Dra. Ana Carolina Acevedo Poppe

Campus Universitário Darcy Ribeiro - UnB - Faculdade de

Ciências da Saúde - Departamento de Odontologia - CEP:

70910-900 - Asa Norte - Brasília - DF

E-mail: [email protected] / Telefone: (61) 31071977.

22

LISTA DE ABREVIATURAS

AD Autossômico dominante

AR Autossômico recessive

BMP1 Proteína morfogenética óssea 1

COL1A1 Colágeno tipo 1 cadeia alfa 1

COL1A2 Colágeno tipo 1 cadeia alfa 1

CREB3L1 Proteína de ligação ao elemento responsivo a cAMP 3 como 1

CRTAP Proteína associada à cartilagem

DGI Dentinogênese imperfeita

FKBP10 Proteína de ligação a FK206

HUB Hospital universitário de Brasília

IFITM5 Proteína transmembranar induzida por interferão 5

LEPRE1 Proteoglicano enriquecido com prolina de leucina 1

MBTPS2 Fator de transcrição ligado à membrana peptidase local 2

NGS Sequenciamento de nova geração

OI Osteogênese imperfeita

P3H1 Prolil 3-hidroxilase 1

P4HB Prolil 4-hidroxilase beta

PLOD2 Procollagen-lisina, 2 oxoglutarato 5-dioxigenase 2

PLS3 Plastin 3

23

PPIB Peptidilprolyl isomerase B

SCN9A Subunidade alfa de canal de tensão de sódio 9

SEC24D SEC24 homólogo D, COPII componente de revestimento complexo

SERPINF1 Serpin família F membro 1

SERPINH1 Serpin família H membro 1

SLC2A2 Família transportadora de soluto 2

SP7 Fator de transcrição 7

SPARC proteína secretada ácida rica em cisteína

TMEM38B Proteína transmembrana 38B

UnB Universidade de Brasília

WNT1 Família de sítios de integração MMTV, membro 1

24

RESUMO



A osteogênese imperfeita (OI) é um grupo de condições

genéticas heterogêneas e caracterizadas principalmente pela

fragilidade óssea. A OI é considerada um transtorno relacionado

à síntese e estrutura do colágeno e a maioria dos casos (80-

90%) está relacionada a mutações dominantes no COL1A1 e

COL1A2, genes que codificam as cadeias de colágeno tipo 1

(COL1). Na última década, foram relatadas mutações em pelo

menos 16 outros genes associados a casos de OI autossômico

recessivo e um ligado ao cromossomo X. Clinicamente, a OI é

caracterizada por apresentar alterações esqueléticas e extra-

esqueléticas. A dentinogênese imperfeita (DGI), uma alteração

na formação da dentina dentinária, está presente em

aproximadamente 50% dos casos de OI dos tipos I a IV. O

objetivo desse estudo foi identificar, pelo método de

sequenciamento de nova geração (NGS), mutações patológicas

em 33 pacientes diagnosticados com OI e caracterizar as

alterações dentárias clínicas e radiográficas dos pacientes

diagnosticados com DGI, em tratamento com bisfosfonato e em

atendimento na Clínica de Pacientes Portadores de Anomalias

de Desenvolvimento Dentário do Hospital Universitário de

Brasília. Com a finalidade de caracterizar as manifestações

dentárias, os prontuários desses pacientes foram analisados. A

avaliação genética foi realizada por meio do desenvolvimento de

um painel de NGS, composto de 14 genes associados à OI e a

sua análise foi realizada utilizando a plataforma Ion AmpliSeq™.

Por meio do NGS foi possível identificar 22 mutações patológicas

em 33 pacientes diagnosticados com OI, apresentando ou não

DGI. Um total de 18 mutações em heterozigose nos genes

25

COL1A1 e COL1A2 foram identificadas neste estudo, sendo 9

mutações em COL1A1 previamente relatadas na literatura (7

missense, 1 nonsense e 1 frameshift), e 9 mutações missense

em COL1A2 (6 já descrita anteriormente na literatura e 4 não


análises in silico). Em quatro pacientes com história de

consanguinidade foram identificadas mutações missense

homozigóticas nos genes SERPINF1, P3H1 e CRTAP. Não

foram encontradas mutações patogênicas nos genes estudados

em 11 pacientes. Dos pacientes estudados, 21 apresentaram

DGI. Alterações nos genes COL1A1 e COLA1A2 foram as mais

frequentes, concordando com a literatura. Sete mutações não

foram previamente relatas na literatura sugerindo serem

mutações novas. A caracterização clínica revelou que todos os

pacientes com DGI foram do tipo moderada. O estudo permitiu

aos participantes um diagnóstico molecular através da técnica de

NGS, podendo proporcionar para esses pacientes um

aconselhamento genético adequado assim como um

acompanhamento terapêutico mais preciso.

Palavras-chave

Osteogênese Imperfeita; Dentinogênese Imperfeita; COL1A1;

COL1A2; Sequenciamento de Nova Geração.

Relevância Clínica

Apesar dos avanços nos estudos de biologia molecular, o

diagnóstico de OI ainda é eminentemente clínico. Entretanto, os

dados moleculares são de suma importância para permitir a

classificação do tipo de OI dos pacientes com mais precisão. O

conhecimento do gene envolvido na doença pode auxiliar na

indicação do melhor acompanhamento odontológico. Além disso,

o conhecimento das bases moleculares permite um maior

26

entendimento do padrão de herança da OI na população e

melhor aconselhamento genético à família.

27

ABSTRACT Use of gene panel for next generation sequencing in the molecular diagnosis of imperfect osteogenesis

Osteogenesis imperfecta (OI) is a group of heterogeneous

genetic conditions characterized mainly by bone fragility. OI is

considered an related disorder and collagen structure and most

cases (80-90%) are related to dominant mutations in COL1A1

and COL1A2, the genes encoding the collagen chains type 1

(COL1). In the last decade, mutations have been reported in at

least 16 other genes associated with cases of autosomal

recessive OI and one associated with chromosome X. Clinically,

OI is characterized by skeletal and extra-skeletal disorder. The

dentinogenesis imperfecta (DGI) is characterize bay dentin

formation anomaly, and it is present in approximately 50% of

cases of OI of types I to IV. The objective of this study was to

identify pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI

and to characterize the clinical and radiographic dental alterations

of the patients diagnosed with DGI in treatment with

bisphosphonate and in the Clinical Patients with Dental

Developmental Anomalies of the University Hospital of Brasília. In

order to characterize the dental manifestations, the medical

records of these patients were analyzed. Genetic evaluation was

performed through the development of NGS panel composed of

14 OI associated genes and analyzed using the Ion AmpliSeq ™

platform. Through the NGS it was possible to identify 22

pathological mutations in 33 patients diagnosed with OI,

presenting or not with DGI. A total of 18 heterozygous mutations

in the COL1A1 and COL1A2 genes were identified in this study,

with 9 mutations in COL1A1 previously reported in the literature

(7 missense, 1 nonsense and 1 frameshift), and 9 missense

mutations in COL1A2 (6 previously described in the literature and

28

4 not reported but considered pathogenic according to in silico

analyzes). In four patients with a history of consanguinity,

homozygous missense mutations were identified in the

SERPINF1, P3H1 and CRTAP genes. No pathogenic mutations

were found in the genes studied in 11 patients. Of the patients

studied, 21 presented with DGI. Changes in the COL1A1 and

COL1A2 genes were the most frequent, in concordance with the

literature. Seven mutations have not previously been reported in

the literature suggesting they are new mutations. Clinical

characterization revealed that all patients with DGI were of the

moderate type. The study allowed the participants a molecular

diagnosis through the NGS technique. Molecular diagnosis will

allow adequate genetic counseling as well as more precise

therapeutic follow-up.

Keywords

Osteogenesis Imperfecta; Dentinogenesis Imperfecta; COL1A1; COL1A2; New Generation Sequencing.

Clinical Relevance:

Despite advances in molecular biology, the diagnosis of OI and

DGI is still eminently clinical. However, molecular data are of

great importance in order to better classify patients OI type.

Knowledge of the molecular alterations involved in the disease

can assist in the indication of the best dental management. In

addition, knowledge of the molecular basis allows a better

understanding of the inheritance pattern of OI in the population

and better genetic counseling to the family.

29

1.1 INTRODUÇÃO

A Osteogênese Imperfeita (OI) é um grupo de desordens

genéticas raras (1:15.000 a 1:20.000 nascimentos) com grau

variável de alterações congênitas no tecido conjuntivo resultando

em fragilidade e deformidades óssea. As alterações esqueléticas

incluem fragilidade ósseas, deformidades esqueléticas e ossos

wormianos. Além disso, alterações extra-esqueléticas tais como

esclera azulada, frouxidão ligamentar, hipotonia muscular, surdez

precoce e dentinogênese imperfeita (DGI) são observadas em

pacientes com OI. As manifestações clínicas da OI variam de

casos leves com poucas fraturas e estatura normal a casos

graves com letalidade perinatal. Os padrões de herança

autossômico dominante (AD) e recessivo (AR) tem sido

relatados, e mais recentemente herança ligada ao X, sendo o

modo de herança autossômico dominante o mais frequente (90%

AD, 10% AR) [1–3].

Em 1979 Sillence propôs uma classificação baseada nas

características clínicas, radiológicas, hereditárias e na gravidade

da doença em quatro tipos: o tipo I (OMIM # 166200) de OI é a

forma mais leve e a mais comum da doença, geralmente não é

detectada no nascimento, possui deformidades esqueléticas

leves, pode apresentar esclera azulada e perda auditiva. O tipo II

(OMIM # 166210) é letal no período perinatal ou sobrevivem por

alguns meses. O tipo III (OMIM # 259420) é a forma mais grave

dos que sobrevivem o período neonatal, é progressivamente

deformante, possuem múltiplas fraturas, baixa estatura, face

triangular, pode apresentar esclera azulada e DGI. O tipo IV

(OMIM # 16620) apresenta deformidades de moderada a grave,

a DGI pode ou não estar associada, e a esclera azulada podem

estar presentes na infância desaparecendo com o decorrer dos

anos [4].

A classificação de Sillence incluía apenas os casos com

modo de herança autossômico dominante. Dessa forma, Em

30

2004 Rauch e Glorieux diagnosticaram novos tipos de OI e

adicionaram os tipos V (OMIM # 610967), VI (OMIM # 613982) e

VII (OMIM # 610682) à classificação. A partir desses achados,

outros estudos moleculares foram realizados e novos genes com

modo de herança AR foram descobertos e incluídos na

classificação da OI. Esses novos tipos não são causados por

mutações nos genes COL1A1 (OMIM # 120150) e COL1A2

(OMIM # 120160). Na tabela 1 encontram-se todas as formas

descritas, até o momento, de OI, com a forma de herança, genes

envolvidos, fenótipo e características clínicas [5–7].

As evidências dos estudos moleculares tem demonstrado

que os tipos de I a IV estão relacionados a mutações AD em

genes que codificam as cadeias alfa 1 e alfa 2 do colágeno tipo 1

(COL1A1 e COL1A2) [8]. Variantes dominantes em IFITM5

(OMIM # 614757) e P4HB (OMIM # 176790) também foram

descritas em alguns indivíduos afetados com herança

autossômica dominante [1,9,10]. Na última década, foram

relatadas mutações AR nos genes CRTAP (OMIM # 605497),

LEPRE1 (OMIM # 610339), PPIB (OMIM # 123841), FKBP10

(OMIM # 607063), SERPINH1 (OMIM # 600943), PLOD2 (OMIM

# 601865), SEC24D (OMIM # 607186), BMP1 (OMIM # 112264)

e TMEM38B (OMIM # 611236) cujos produtos proteicos

interagem e interferem na síntese do colágeno tipo 1 e no

desenvolvimento ósseo, predispondo a distintos padrões de

fragilidade óssea e evolução clínica [5,11]. Foram descritas

também alterações em outros genes que não estão diretamente

ligados à síntese do colágeno tipo 1, mas atuam na

mineralização ou no desenvolvimento dos osteoblastos, entre

esse grupo de genes estão CREB3L1 (OMIM # 616215),

SERPINF1 (OMIM # 172860), SP7 (OMIM # 606633), SPARC

(OMIM # 182120) e WNT1 (OMIM # 164820). Recentemente, um

estudo identificou mais três mutações relacionadas à OI nos

genes SCN9A (OMIM # 603415), NTRK1 (OMIM # 191315) e

31

SLC2A2 (OMIM # 138160) [2]. Variantes patológicas em PLS3

(OMIM # 300131) e MBTPS2 (OMIM # 300294) com modo de

herança ligada ao X também foram relacionadas à OI [12].

Tabela 1. Tipos de OI, modo de herança, genes afetados características

clínicas e presença de DGI.

Tipo de OI

Herança Gene

afetado DGI

Fenótipo ósseo

Característica clínica

I AD COL1A1/ COL1A2

+/- Leve Poucas deformidades,

esclera azul, perda auditiva

II AD COL1A1/ COL1A2

- Grave Letal no período neonatal

III AD COL1A1/ COL1A2

+ Moderado

a grave

Deformação óssea progressiva, esclera azul

na infância

IV AD COL1A1/ COL1A2

+/- Moderado/

grave Estatura baixa,

deformações ósseas

V AD IFITM5 - Moderado Calo ósseo, esclera azul

VI AR SERPINF1 - Moderado/

grave Alteração no osso lamelar

VII AR CRTAP - Grave Osteocondrodisplasia, rizomelia, alteração no

crescimento

VIII AR LEPRE1/

P3H1 - Grave

Displasia óssea grave, rizomelia

IX AR PPIB - Grave Displasia óssea

moderada a grave

X AR SERPINH1 +/- Grave Macrocefalia, esclera

azul, hipotonia generalizada

XI AR FKBP10 - Grave Ossos wormianos,

cifoescoliose, esclera azul, Coxa vara

XII AR BMP1 - Moderado/

grave Alta quantidade de massa óssea, ossos wormianos

XIII AR SP7 - Moderado/

grave

Micrognatia, curvatura dos membros superiores

e inferiores

XIV AR WNT1 - Moderado/

grave Escoliose, curvatura de

ossos longos e wormiano

32

XV AR TMEM38B - Moderado Costelas finas, ossos

wormianos

XVI AR CREB3L1 - Grave Costelas frisadas,

múltiplas fraturas no período neonatal

Adaptado de Forlino e Marini 2016. AR: Autossômico recessivo; AD: Autossômico dominante; (+): presente; (-): ausente

Manifestações extra-esqueléticas são relatadas nos

estudos da OI, entre essas manifestações, a dentinogênese

imperfeita (DGI) é uma das principais, estando presente em 50%

dos pacientes que possuem OI dos tipos I a IV [13].

A DGI é um grupo de condições hereditárias,

caracterizadas por uma estrutura anormal da dentina devido a

distúrbios na formação, composição ou organização da matriz

dentinária, apresenta modo de herança autossômico dominante e

pode estar ou não associada à OI. A classificação de Shields

(1979) estratificava as condições hereditárias da dentina em DGI

tipo I, II, e III, e displasia dentinária em tipo I e II. Atualmente,

uma classificação mais utilizada propõe que a DGI seja

classificada em forma sindrômica e não-sindrômica [13,14].

A forma sindrômica de DGI está associada à OI, e pode

manifestar-se de forma leve, moderada ou grave. As formas não-

sindrômicas também se manifestam de forma leve a grave e

correspondem, respectivamente, à displasia dentinária tipo II,

DGI tipos II e III de Shields. Apesar dos tipos sindrômicos e não-

sindrômicos de DGI serem geneticamente distintos as

manifestações clínicas observadas na dentina são similares [14–

16].

As dentições decídua e permanente podem ser afetadas,

sendo a dentição decídua mais gravemente atingida. Alguns

estudos mostram que mesmo que a dentição decídua tenha sido

afetada, a permanente pode não apresentar DGI [13,14].

33

Clinicamente a DGI é caracterizada por apresentar

coloração coronária opalescente variando entre cinza, marrom e

amarelo, geralmente com atrições e desprendimento de esmalte.

Radiograficamente, as coroas podem apresentar constrição

cervical, coroas bulbosas, dismorfia da câmara pulpar

(calcificação pulpar, obliteração ou câmara pulpar ampla),

alterações na morfologia radicular (calcificação dos condutos

radiculares, obliteração dos canais ou condutos radiculares

amplos), sendo essas características consideradas

patognomônicas para o diagnóstico de DGI. Essas

características clínicas e radiográficas da DGI podem manifestar-

se de forma leve à grave [13,14].

Na maioria dos casos, a DGI é diagnosticada através de

exames clínicos e radiográficos, entretanto, a ausência de

manifestações clínicas e radiográficas não exclui a sua presença.

Nestes casos, estudos demonstraram que a DGI pode ser

diagnosticada por exames histológicos [17].

Variações no metabolismo do colágeno podem interferir

no desenvolvimento dos ossos faciais alterando o

desenvolvimento craniofacial desses pacientes, podendo

apresentar desde face triangular com testa alargada a

macrocefalia, bem como alterações no tamanho dos maxilares,

resultando em maloclusões como mordida aberta anterior e

posterior, mordida cruzada anterior e posterior, erupção ectópica

e dentes impactados [15,18].

Um estudo realizado por O'Connell e Marini (1999)

relatou que 70% de seus pacientes apresentaram maloclusão de

classe III de Angle, provavelmente uma combinação de

alterações esqueléticas com dentoalveolares. Dentre os

pacientes, 32,5% apresentaram erupção ectópica de molares e

10% agenesia dentária. Recentemente Malmgres e

colaboradores (2017) identificaram em 179 pacientes com OI

34

uma prevalência de 17% de agenesia dentária, sendo os pré-

molares os dentes mais acometidos em 91% dos casos [19].

As abordagens terapêuticas para a OI devem envolver

um tratamento multidisciplinar que possibilite uma melhor

inserção do paciente na sociedade. O ideal é combinar

tratamentos não cirúrgicos para fortalecer a musculatura;

cirúrgicos quando necessários para corrigir posicionamentos

ósseos e prevenir fraturas; e a administração farmacológica de

bisfosfonatos para aumentar a resistência mecânica dos ossos e

diminuir o número de fraturas.

O tratamento farmacológico da OI está relacionado com a

gravidade da doença. Pacientes que apresentam a forma leve,

na maioria dos casos, não necessitam realizar a infusão cíclica

intravenosa de bisfosfonatos. Entretanto, nos casos de moderado

a grave o tratamento padrão é a administração intravenosa de

pamidronato dissódico, uma droga da classe dos bisfosfonatos

introduzido na década de 90 como abordagem terapêutica para a

OI. Este fármaco promove a inibição da reabsorção óssea,

induzindo a apoptose dos osteoclastos. Esta terapia auxilia no

aumento da densidade mineral óssea, reduzindo o número de

fraturas e também melhora a força muscular, além de diminuir as

dores ósseas e aumentar a resistência desses pacientes [3,8].

A portaria 2305/GM de 19 de dezembro de 2001, do

Ministério da Saúde do Brasil (BRASIL, M. D. S. D. Portaria n°

2305/GM), em 19 de dezembro de 2001

(http://dtr2001.saude.gov.br/sas/PORTARIAS/Port2001/GM/GM-

2305.htm) designou à Fundação Universidade de Brasília/

Hospital Universitário de Brasília (FUB/HUB) como um dos

Centros Nacionais de Referência para o tratamento da OI com

administração do pamidronato dissódico. A partir de então, a

equipe médica do Setor de Endocrinologia Pediátrica da Área da

Medicina da Criança e do Adolescente da Faculdade de Medicina

da Universidade de Brasília (FM/UnB/HUB), com o suporte das

http://dtr2001.saude.gov.br/sas/PORTARIAS/Port2001/GM/

35

equipes de genética, otorrinolaringologia e odontologia do HUB e

as equipes de genética e ortopedia da Rede Sarah Kubitschek de

Hospitais, vêm acompanhando crianças e adolescentes

portadores de OI que residem no Distrito Federal e em outros

Estados da Federação referidos para este centro. Desde 2002,

todos os pacientes tratados com infusão cíclica intravenosa de

pamidronato são encaminhados para o Projeto de Extensão de

Ação Continuada "Atendimento a Pacientes Portadores de

Anomalias de Desenvolvimento Dentário", na Divisão de

Odontologia do HUB.

Apesar dos avanços nos estudos moleculares, o

diagnóstico de OI e DGI ainda é eminentemente clínico.

Entretanto, os dados moleculares são de suma importância para

permitir a classificação do tipo de OI dos pacientes com maior

precisão. O conhecimento do gene envolvido na doença pode

influenciar sobremaneira, na indicação do melhor

acompanhamento odontológico, assim como na previsibilidade

de sua evolução. Além disso, o conhecimento das bases

moleculares permite saber o padrão de herança da OI em cada

população e permite também, um melhor aconselhamento

genético à família.

O objetivo do estudo foi identificar, pelo método de

sequenciamento de nova geração, variantes patológicas em

pacientes diagnosticados com OI e caracterizar as alterações

dentárias clínicas e radiográficas dos pacientes diagnosticados

com dentinogênese imperfeita (DGI), em tratamento com

bisfosfonato e em atendimento no Clinica de Anomalias

Dentárias do Hospital Universitário de Brasília.

1.2 MATERIAIS E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pelo comitê de Ética de

Pesquisa em seres humanos (CEP/FS 1.324.282). O Termo de

36

Consentimento Livre e Esclarecido foi apresentado a todos os

sujeitos da pesquisa e assinado por seus responsáveis legais.

Entre os anos de 2002-2016 foram acompanhados 128

pacientes com OI no HUB. Atualmente 63 desses pacientes com

diagnóstico de osteogênese imperfeita, apresentando ou não

dentinogênese imperfeita, em tratamento com pamidronato

dissódico no Serviço de Endocrinologia Pediátrica do HUB são

acompanhados pelo Projeto de Extensão de Ação Continuada

“Atendimento a Pacientes Portadores de Anomalias de

Desenvolvimento Dentário”, na unidade de Saúde Bucal do HUB.

O acompanhamento odontológico é realizado no período

da internação desses pacientes no HUB para o tratamento com

bisfosfonato, que ocorre regularmente a cada 2, 3 ou 4 meses de

acordo com a idade. Informações referentes ao exame físico

(extra e intrabucal), exames complementares (fotografias e

radiografias panorâmicas e periapicais) foram coletadas de seus

prontuários.

Dados referentes à idade do paciente, sexo, tipo de OI, e

manifestações bucais que caracterizam a DGI como: alterações

de cor coronária, atrição, dismorfia da câmara pulpar, alterações

morfológicas radiculares e lesões periapicais foram registradas a

fim de caracterizar o fenótipo dentário daqueles pacientes com

DGI.

Durante a internação para infusão do pamidronato

dissódico amostras de sangue venoso periférico de 63 pacientes

foram coletadas e armazenadas em tubos contendo EDTA e

encaminhadas para o Laboratório de Histopatologia Bucal, onde

foi realizada a extração de DNA genômico pelo método salting

out – Método Puregene, seguida da sua quantificação no

Nanovue Plus (GE®).

Para extração de DNA, as células sanguíneas foram

submetidas à centrifugação e incubadas com dois tampões de

37

lise celular. Após a incubação, as proteínas foram removidas por

precipitação com 7.5M de acetato de amônia. O DNA foi

precipitado com isopropanol, secado ao ar livre e ressuspendido

em tampão de TE (10 mM Tris pH 7.8 e 1 mM EDTA). A

concentração de DNA de cada amostra foi determinada,

invidualmente, por espectrofotômetro (Nanovue Plus, GE

Healthcare Life Sciences, USA).

Um painel de genes por meio de sequenciamento de

nova geração (NGS) foi feito para 14 genes associados à OI até

o momento inicial da pesquisa. (Ion Personal Machine, Life

Technologies) (Tabela 2).

Tabela 2. Genes presentes no NGS, sua localização genômica.

Gene Localização genômica

COL1A1 17q21.33

COL1A2 7q21.3

CRTAP 3p22.3

LEPRE1 1p34.2

PPIB 15q22.31

FKBP10 17q21.2

SERPINF1 17p13.3

SERPINH1 11q13.5

SP7 12q13.13

IFITM5 11p12.5

BMP1 8p21.3

TMEM38B 9q31.2

WNT1 12q13.12

DSPP 4q22.1

38

Um total de 10 ng de DNA por amostra foi usado para

enriquecimento por PCR multiplex. Os amplicons foram ligados

aos adaptadores de sequenciamento com “barcodes” que

permitem misturar as amostras para as etapas subsequentes. As

bibliotecas das amostras com código de barras equalizadas

foram reunidas. O pool de bibliotecas e o sequenciamento

seguiram o protocolo do fabricante. Utilizou-se um Chip Ion

316v2 para sequenciamento das amostras. A realização deste

experimento ocorreu na Universidade Católica de Brasília.

Os dados do sequenciamento do painel foram analisados

usando o programa Torrent Suite (version 5.0.4; Life

Technologies) para as chamadas, alinhamentos e variantes

usando a sequência genômica de referência (hg19) para os

genes alvo. As chamadas de variantes foram anotadas usando

Ion Reporter (version 4.0), que mostrou alterações de acordo

com a localização, tipo de variante, dBSNPs e resultados de

programas “in silico” (Polyphen and SIFT). As variantes foram

filtradas de acordo com os critérios: baixa qualidade da corrida,

regiões homopolímeras de inserções/deleções, e desbalanço

alélico na proporção maior que 80:20. Mutações patogênicas

foram também testadas pelas análises in silico MutationTaster,

Poyphen e SIFT. As regiões sequenciadas tiveram uma

cobertura de 98%.

1.3 RESULTADOS

O sequenciamento de nova geração (NGS) foi realizado

em 33 pacientes, em virtude de ser um experimento com alto

custo e não dispormos de financiamento, no momento, para

realizar em todos os pacientes. A distribuição de acordo com

idade, tipo de OI e presença de DGI dos pacientes que

participaram do NGS está resumida na Tabela 3.

39

Tabela 3. Distribuição dos pacientes de acordo com tipo de OI,

idade e presença de DGI.

Tipo de OI Faixa etária (anos) DGI Total

0-6 7-12 13-18 >18

I 1 2 3 0 2 6

II 1 0 0 0 NR 1

III 5 8 9 0 16 22

IV 1 2 0 1 3 4

Total 8 12 12 1 21 33

NR: dado não relatado

As análises das amostras foram divididas em três

experimentos separados. No primeiro experimento foram

sequenciadas 16 amostras, no segundo foram dez amostras, e

no terceiro experimento foram analisadas 12 amostras,

totalizando 38 amostras. O número maior de amostras enviadas

para análise foi devido ao fato de que cinco pacientes tiveram

suas análises repetidas.

Alterações no gene COLA1 foram identificadas em nove

pacientes, sendo oito mutações já relatadas na literatura e uma

alteração frameshift não relatada na literatura, mas considerada

patogênica de acordo com SIFT, POLYPHEN 2 e Mutation

Taster. (Tabela 4)

No gene COL1A2 foram identificadas nove alterações,

sendo que seis possuem relatos na literatura e três não foram


análises in silico nos programas SIFT, POLYPHEN 2 e Mutation

Taster. (Tabela 5)

Nos genes com modo de herança AR foram identificadas

quatro alterações das quais duas não apresentam relatos na

literatura, mas foram consideradas patogênicas de acordo com

40

as análises in silico nos programas SIFT, POLYPHEN 2 e

Mutation Taster. (Tabela 6)

Em onze pacientes não foram encontradas mutações

patogênicas envolvidas com OI, ou por falha técnica ou por

limitações do painel de genes. Desses, em sete pacientes não foi

possível identificar a mutação causadora da doença por falha da

técnica, uma vez que as mesmas impediram a análise dos dados

por apresentarem baixa cobertura, e em quatro pacientes não

foram encontradas alterações nos genes estudados.

Do total de 33 pacientes testados, 21 apresentaram

características clínicas e radiográficas de DGI, e uma paciente

que foi a óbito aos três meses de idade não foi possível avaliar a

presença de DGI. As alterações dentinárias clínicas e

radiográficas da dentição decídua e permanente dos pacientes

com OI/DGI que participaram do estudo molecular estão

resumida na Tabela 7A e 7B respectivamente.

41

Tabela 4. Mutações identificadas de pacientes com alterações no gene COL1A1 atendidos na Clínica de

Pacientes Portadores de Anomalias Dentárias do HUB.

Paciente Tipo OI DGI Exon DNA dbSNP Proteína Referência

1 III + 17 c.1121G>C NR p.Gly374Ala [5]

2 III + 45 c.3226G>A rs67394386 p.Gly1076Ser [6,9,20–23]


4 I + 45 c.3226G>A rs67394386 p.Gly1076Ser [6,9,20–23]

5 I - 11 c.757C>T rs72645318 p.Arg253Ter [6,24–26]

6 III - 8 c.642+1G>A rs67364703 NR [20,27,28]

7 III + 33 c.2299G>A rs72651658 p.Gly767Ser [20,24,26,29,30]

8 IV - 26 c.1821+1G>A rs66555264 NR [6,20,31–33]

9* III - 3 C.299_300delAG Rs193922154 p.Glu100fs NR

*paciente com efeito da mutação frameshift. (-) ausência de DGI; (+) presença de DGI; NR: não relatado

42

Tabela 5. Mutações identificadas de pacientes com alterações no gene COL1A2 atendidos na Clínica de

Pacientes Portadores de Anomalias Dentárias do HUB.

Paciente

Tipo OI

DGI Exon DNA dbSNP Proteína Referências

10 III + 49 c.3269G>A rs267606742 p.Gly1090Asp [34]

11 IV + 26 c.1549G>A rs72658126 p.Gly517Ser [20]



14 III + 28 c.1657G>T NR p.Gly553Cys NR

15 III + 46 c.3034G>A rs72659319 p.Gly1012Ser [5,6,20,35,38–40]

16 III + 47 c.3142G>A NR p.Gly1048Ser NR

17 IV + 28 c.1612G>A NR p.Gly538Ser NR

18 I - 12 c.577G>C NR p.Gly193Arg NR

(-) ausência de DGI; (+) presença de DGI; NR: não relatado.

43

Tabela 6. Mutações AR identificadas nos pacientes com OI atendidos na Clínica de Pacientes Portadores

de Anomalias Dentárias do HUB.

Paciente Tipo OI

DGI Gene Exon DNA dbSNP Proteína Referências

19 III - P3H1 5 c.1080+1G>T rs72659351 NR [45-47]

20 I - SERPINF1 3 c.283+2T>C NR NR NR

21 III - CRTAP 1 c.471+2C>A rs137853943 NR [41, 47]

22 III - CRTAP 1 c.452T>C NR p.Leu151Pro NR

(-) ausência de DGI; (+) presença de DGI; NR não relatado

44

Tabela 7A: Avalição das características clínicas e radiográficas da dentição decídua dos pacientes com OI/DGI que participaram do estudo molecular.

Paciente Idade Alteração da cor coronária

Coroa bulbosa/ constrição

cervical Atrição

Dismorfia da camara pulpar

Alteração na morfologia radicular

Lesão periapical

1 6 + + + + + -

2 12 + + - + + -

3 7 + + + + + - 4 10 + + + - - -

5 10 + + + + + -

6 18 + + + + + -

7 6 + + - + + - 8 10 + + + + + - 9 16 + + + + + -

10 4 + NR - NR NR -

11 4 + + + + + -

12 2 + + + + + - 13 15 + + - + + - 14 1 + NR + NR NR -

15 9 + + + - + -

16 12 + + + + + -

17 17 + + + + + - 18 14 + + + + + -

19 16 + + - - + -

20 18 + + + + + -

21 9 + + - + + -

NR: não relatado, paciente na dentição decídua. (+) presença; (-) Ausência

45

Tabela 7B: Avalição das características clínicas e radiográficas da dentição permanente dos pacientes com OI/DGI que participaram do estudo molecular.

Paciente Idade Alteração da cor coronária

Coroa bulbosa/ constrição

cervical Atrição

Dismorfia da camara pulpar

Alteração na morfologia radicular

Lesão periapical

1 6 NR NR NR NR NR NR 2 12 + + + - + - 3 7 + - - - + -

4 10 + + + - + -

5 10 - + - + - - 6 18 + + + + + - 7 6 NR NR NR NR NR NR

8 10 - + - + + -

9 16 + + - + + -

10 4 NR NR NR NR NR NR 11 4 NR NR NR NR NR NR

12 2 NR NR NR NR NR NR

13 15 + + - + + -

14 1 NR NR NR NR NR NR 15 9 + - - - + - 16 12 - + - + + - 17 17 + + - - - -

18 14 + + + + + -

19 16 + - - - - -

20 18 + + - - - - 21 9 + + - - + -

NR: não relatado, paciente na dentição decídua. (+) presença; (-) Ausência

46

1.4 DISCUSSÃO

No presente trabalho foram analisados, por meio do

sequenciamento de nova geração, amostras de 33 pacientes

diagnosticados com OI em acompanhamento no Projeto de

Extensão de Ação Continuada Atendimento a Pacientes

Portadores de Anomalias de Desenvolvimento Dentário, na

divisão de Odontologia do HUB entre os anos de 2002-2016.

No HUB, todos os pacientes com OI em tratamento com

bisfosfonato, são encaminhados do serviço de endocrinologia

pediátrica para acompanhamento na clínica de odontologia. O

acompanhamento odontológico acontece durante o período de

internação para administração do bisfosfonato, que geralmente

ocorre a cada dois, três ou quadro meses de acordo com a idade

dos paciente. Os atendimentos foram realizados em função da

necessidade desses pacientes, os procedimentos mais

realizados foram: profilaxias, orientações sobre a dieta e higiene

oral, adequação do meio bucal e restaurações.

A amostra desse estudo é principalmente de pacientes

com OI do tipo grave ou moderado (tipo III ou IV), isso ocorre por

serem os tipos que mais necessitam de tratamento com o

bisfosfonato.

Nesse estudo, 21 dos pacientes possuem DGI,

entretanto, alguns autores sugerem que a falta de alterações

clínicas e radiográficas da DGI não determina a sua ausência,

pois exames histológicos podem diagnosticar a presença da DGI.

[17]. Para esse estudo, a avaliação foi exclusivamente clínica e

radiográfica e revelou que os pacientes com DGI possuíam

alterações do tipo moderada, com coloração coronária

opalescente, coroas bulbosas e curtas, atrição com

47

desprendimento de esmalte, raízes mais curtas e finas com

obliteração parcial ou total da polpa. Não foi observada presença

de lesões periapicais descritas anteriormente nos casos de DGI

do tipo grave [16]. Os resultados revelaram também que a

dentição decídua dos pacientes foi mais gravemente afetada em

relação à dentição permanente, os dentes decíduos

apresentaram características clínicas e radiográficas com

alterações de moderada a grave, enquanto que os dentes

permanentes apresentaram alterações de leve a grave,

concordando com o descrito na literatura [14–16]. Os casos leves

apresentaram uma discreta alteração na coloração dos dentes,

pouca ou nenhuma atrição e radiograficamente apresentaram

alterações leves ou ausentes.

Numerosos estudos tem demonstrado que diversos

genes estão envolvidos na patogênese da OI. Até o momento,

variantes patogênicas em COL1A1, COL1A2, CRTAP, LEPRE1,

PPIB, FKBP10, SERPINF1, SERPINH1, SP7, IFITM5, BMP1,

TMEM38B e WNT1 tem sido relatados na literatura. Mutações

nos genes COL1A1 e COL1A2 estão associadas a 85-90% dos

casos de OI, sendo estas de herança autossômica dominante

[10]. Variantes dominantes em IFITM5 também têm sido

descritas em alguns indivíduos afetados [1,9,10]. Outro grupo de

genes que não estão implicados diretamente na biossíntese de

colágeno tipo 1, no entanto, são genes importantes nas vias de

mineralização ou desenvolvimento de osteoblastos, como

CREB3L1 e SPARC foram recentemente associados à OI [12,

41]. Mutações em PLS3 e MBTPS2 têm sido associadas a

formas distantes de herança ligada ao X [12,41]. Um estudo

recente ainda identificou mais três mutações relacionadas à OI,

sendo elas nos genes SCN9A, NTRK1 e SLC2A2 [2]. Essas

novas variações foram relatadas na literatura após a elaboração

do painel de genes utilizado nesse estudo.

48

O colágeno tipo 1 consiste em duas cadeias α1 e uma

cadeia α2. Após a tradução, as cadeias pro-α1 e as cadeias pro-

α2 são processadas no retículo endoplasmático rugoso. Estas

cadeias têm de se alinhar para iniciar o processo de dobragem

do pro-colágeno tipo I numa tripla hélice, seguindo do

alinhamento das três cadeias para iniciar a conformação em uma

estrutura helicoidal tripla. Cada cadeia α contém pro-peptídeos

N- (amino) e C- (carboxi) terminais e um domínio central

constituído por 338 repetições. A glicina, como o menor

aminoácido, é o único resíduo que pode ocupar a posição axial

da tripla hélice, de modo que qualquer alteração num resíduo de

glicina resultará na ruptura da estrutura helicoidal do

colágeno. Mutações nos genes COL1A1 e COL1A2 alteram a

estrutura ou a quantidade de colágeno tipo 1, resultando em um

fenótipo esquelético que varia de leve a letal. Quando há uma

substituição da glicina na cadeia α1, o fenótipo dependerá da

posição da substituição: as substituições C-terminais resultam

em fenótipo de doença grave, e as substituições N-terminais

produzem fenótipos mais leves [1,3,42].

As mutações em CO1A1 e COLIA2 encontradas nesse

estudo são quase todas, substituição do aminoácido glicina por

outro, sendo a serina a mais frequente (Tabela 4 e 5). Segundo

Marini (2007) a substituição do aminoácido glicina por outro

aminoácido geralmente causam OI grave ou moderada

resultando em efeito qualitativo. Os resultados desse estudo

estão de acordo com o relatado na literatura, 10 pacientes

apresentaram substituição de glicina por serina, sendo pacientes

portadores dos tipos mais graves de OI (tipo III e IV).

Recentemente, dois estudos foram publicados relatando

os genes SERPINF1, seguido do CRTAP como os genes mais

frequentemente alterados em OI com modo de herança AR.

Nesse estudo foram encontradas mutações AR nos genes

CRTAP (exon1 c.452T>C; exon1 c.471+2C>A) e SERPINF1

49

(exon3 c. 283+2T>C) em três pacientes com histórico de

consanguinidade (Tabela 6), corroborando com os achados da

literatura [2,43]. Inicialmente esses casos foram classificados em

tipo I e III de acordo Sillence. O NGS permitiu redefinir o

diagnóstico para esses pacientes de acordo com Forlino e Marini

(2016) em tipo VII para as alterações em CRTAP e tipo VI para a

variação em SERPINF1.

Devido ao experimento ter um alto custo, não foi possível

analisar os 63 pacientes, os outros 30 pacientes serão

analisados no âmbito do mestrado. Uma vez que a cobertura do

painel de genes para sequenciamento de nova geração possuiu

uma cobertura de 98%, os pacientes que ficaram sem

diagnóstico molecular podem ter alguma alteração nesta região

que não foi contemplada pela técnica utilizada. Uma estratégia

para resolver esta questão seria sequenciar por Sanger apenas

as regiões não cobertas (2%), e verificar a presença ou não de

mutação de ponto. Outra hipótese seria de que esses pacientes

apresentam mutações em outros genes não investigados nesse

estudo e associados recentemente na literatura a mutações

potencialmente causadoras da OI.

1.5 CONCLUSÃO

O presente estudo mostrou que a maioria dos pacientes

atendidos na Clínica de Portadores de Anomalias do

desenvolvimento Dentário entre os anos de 2002-2016 possuíam

OI do tipo III. Por meio do sequenciamento de nova geração foi

possível identificar vinte e duas mutações patológicas em trinta e

três pacientes diagnosticados com OI, sendo que para seis

mutações não foram encontrados relatos na literatura sugerindo

serem mutações novas, entretanto, as outras mutações

encontradas estão de acordo com o relatado na literatura. Foi

possível também caracterizar as alterações clínicas e

50

radiográficas dos pacientes que participaram do NGS mostrando

que 21 pacientes possuíam manifestações clínicas e

radiográficas de DGI e em um paciente não foi possível

identificar clinicamente devido ao seu óbito precoce. A

caracterização revelou também que a amostra estudada é

predominantemente de DGI do tipo moderada, sendo a dentição

decídua mais gravemente afetada em relação a dentição

permanente. A importância de descobrir essas variantes

possibilita tornar o diagnóstico molecular um método mais

sensível e preciso para esses pacientes. Será necessário

investigar as regiões não sequenciadas no painel pelo método

Sanger assim como serão relacionados os sequenciamentos dos

pacientes sem diagnóstico molecular até o presente.

51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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58

ANEXOS

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ANEXOS

59

NORMAS DA REVISTA

BONE - GUIDE FOR AUTHORS

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3) Review

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7) Technical Note

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10) Announcements

60

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• Ensure all figure and table citations in the text match the files

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• Relevant declarations of interest have been made

• Journal policies detailed in this guide have been reviewed

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humans; Uniform Requirements for manuscripts submitted to

Biomedical journals. Authors should include a statement in the

manuscript that informed consent was obtained for

experimentation with human subjects. The privacy rights of

human subjects must always be observed.

62

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guidelines and should be carried out in accordance with the U.K.

Animals (Scientific Procedures) Act, 1986 and associated

guidelines, EU Directive 2010/63/EU for animal experiments, or

the National Institutes of Health guide for the care and use of

Laboratory animals (NIH Publications No. 8023, revised 1978)

and the authors should clearly indicate in the manuscript that

such guidelines have been followed.

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relationships with other people or organizations that could

inappropriately influence (bias) their work. Examples of potential

conflicts of interest include employment, consultancies, stock

ownership, honoraria, paid expert testimony, patent applications/

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publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by

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that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same

form, in English or in any other language, including electronically

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drafting the article or revising it critically for important intellectual

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Changes to authorship

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the definitive list of authors at the time of the original submission.

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highlighted at proof stage for the author to correct.

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etc. (the abstract is not included in section numbering). Use this

numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to

'the text'. Any subsection may be given a brief heading. Each

heading should appear on its own separate line.

Introduction

State the objectives of the work and provide an adequate

background, avoiding a detailed literature survey or a summary of

the results.

Material and Methods

Provide sufficient detail to allow the work to be

reproduced. Methods already published should be indicated by a

reference: only relevant modifications should be described. Since

there are significant differences in skeletal structure and

remodeling between the sexes and strains, it is essential that all

animal studies report the age, sex, and strain (e.g., C57BL/6) of

animals used.

71

Theory/calculation

A Theory section should extend, not repeat, the

background to the article already dealt with in the Introduction

and lay the foundation for further work. In contrast, a Calculation

section represents a practical development from a theoretical

basis.

Results

Results should be clear and concise.

Discussion

This should explore the significance of the results of the

work, not repeat them. A combined Results and Discussion

section is often appropriate. Avoid extensive citations and

discussion of published literature.

Conclusions

The main conclusions of the study may be presented in a

short Conclusions section, which may stand alone or form a

subsection of a Discussion or Results and Discussion section.

Essential title page information

• Title. Concise and informative. Titles are often used in

information-retrieval systems. Avoid abbreviations and formulae

where possible.

• Author names and affiliations. Please clearly indicate the

given name(s) and family name(s) of each author and check that

all names are accurately spelled. Present the authors' affiliation

72

addresses (where the actual work was done) below the names.

Indicate all affiliations with a lowercase superscript letter

immediately after the author's name and in front of the

appropriate address. Provide the full postal address of each

affiliation, including the country name and, if available, the e-mail

address of each author.

• Corresponding author. Clearly indicate who will handle

correspondence at all stages of refereeing and publication, also

post-publication. Ensure that the e-mail address is given and that

contact details are kept up to date by the corresponding author.

• Present/permanent address. If an author has moved since the

work described in the article was done, or was visiting at the time,

a 'Present address' (or 'Permanent address') may be indicated as

a footnote to that author's name. The address at which the author

actually did the work must be retained as the main, affiliation

address. Superscript Arabic numerals are used for such

footnotes.

Abstract

A concise and factual abstract is required. The abstract

should state briefly the purpose of the research, the principal

results and major conclusions. An abstract is often presented

separately from the article, so it must be able to stand alone. For

this reason, References should be avoided, but if essential, then

cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or uncommon

abbreviations should be avoided, but if essential they must be

defined at their first mention in the abstract itself.

Graphical abstract

73

Although a graphical abstract is optional, its use is

encouraged as it draws more attention to the online article. The

graphical abstract should summarize the contents of the article in

a concise, pictorial form designed to capture the attention of a

wide readership. Graphical abstracts should be submitted as a

separate file in the online submission system. Image size: Please

provide an image with a minimum of 531 × 1328 pixels (h × w) or

proportionally more. The image should be readable at a size of 5

× 13 cm using a regular screen resolution of 96 dpi. Preferred file

types: TIFF, EPS, PDF or MS Office files. You can view Example

Graphical Abstracts on our information site. Authors can make

use of Elsevier's Illustration and Enhancement service to ensure

the best presentation of their images and in accordance with all

technical requirements: Illustration Service.

Highlights

Highlights are mandatory for this journal. They consist of

a short collection of bullet points that convey the core findings of

the article and should be submitted in a separate file in the online

submission system. Please use Highlights in the file name and

include 3 to 5 bullet points (maximum 20 words per bullet point).

See http://www.elsevier.com/highlights for examples.

Keywords

Immediately after the abstract, provide a maximum of 6

keywords, using American spelling and avoiding general and

plural terms and multiple concepts (avoid, for example, 'and', 'of').

Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly

established in the field may be eligible. These keywords will be

used for indexing purposes.

74

Abbreviations: Define abbreviations that are not standard in this

field in a footnote to be placed on the first page of the article.

Such abbreviations that are unavoidable in the abstract must be

defined at their first mention there, as well as in the footnote.

Ensure consistency of abbreviations throughout the article.

Acknowledgements: Collate acknowledgements in a separate

section at the end of the article before the references and do not,

therefore, include them on the title page, as a footnote to the title

or otherwise. List here those individuals who provided help during

the research (e.g., providing language help, writing assistance or

proof reading the article, etc.).

Formatting of funding sources: List funding sources in this

standard way to facilitate compliance to funder's requirements:

Funding: This work was supported by the National Institutes of

Health [grant numbers xxxx, yyyy]; the Bill & Melinda Gates

Foundation, Seattle, WA [grant number zzzz]; and the United

States Institutes of Peace [grant number aaaa].

It is not necessary to include detailed descriptions on the

program or type of grants and awards. When funding is from a

block grant or other resources available to a university, college, or

other research institution, submit the name of the institute or

organization that provided the funding.

If no funding has been provided for the research, please

include the following sentence: This research did not receive any

specific grant from funding agencies in the public, commercial, or

not-for-profit sectors.

Genbank

75

Footnotes: should be used sparingly. Number them consecutively

throughout the article. Many word processors build footnotes into

the text, and this feature may be used. Should this not be the

case, indicate the position of footnotes in the text and present the

footnotes themselves separately at the end of the article.

Electronic artwork General points:

• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original

artwork. • Preferred fonts: Arial (or Helvetica), Times New Roman

(or Times), Symbol, Courier.

• Number the illustrations according to their sequence in the text.

• Use a logical naming convention for your artwork files.

• Indicate per figure if it is a single, 1.5 or 2-column fitting image.

• For Word submissions only, you may still provide figures and

their captions, and tables within a single file at the revision stage.

• Please note that individual figure files larger than 10 MB must

be provided in separate source files. A detailed guide on

electronic artwork is available. You are urged to visit this site;

some excerpts from the detailed information are given here.

Formats

Regardless of the application used, when your electronic

artwork is finalized, please 'save as' or convert the images to one

of the following formats (note the resolution requirements for line

drawings, halftones, and line/halftone combinations given below):

EPS (or PDF): Vector drawings. Embed the font or save the text

as 'graphics'. TIFF (or JPG): Color or grayscale photographs

76

(halftones): always use a minimum of 300 dpi. TIFF (or JPG):

Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi. TIFF (or

JPG): Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale):

a minimum of 500 dpi is required. Please do not:

• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP,

PICT, WPG); the resolution is too low.

• Supply files that are too low in resolution.

• Submit graphics that are disproportionately large for the content.

Color artwork

Please make sure that artwork files are in an acceptable

format (TIFF (or JPEG), EPS (or PDF), or MS Office files) and

with the correct resolution. If, together with your accepted article,

you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no

additional charge, that these figures will appear in color online

(e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not

these illustrations are reproduced in color in the printed version.

For color reproduction in print, you will receive information

regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted

article. Please indicate your preference for color: in print or online

only. Further information on the preparation of electronic artwork.

Illustration services

Elsevier's WebShop offers Illustration Services to authors

preparing to submit a manuscript but concerned about the quality

of the images accompanying their article. Elsevier's expert

illustrators can produce scientific, technical and medical-style

images, as well as a full range of charts, tables and graphs.

Image 'polishing' is also available, where our illustrators take your

77

image(s) and improve them to a professional standard. Please

visit the website to find out more.

Figure captions

Ensure that each illustration has a caption. A caption

should comprise a brief title (not on the figure itself) and a

description of the illustration. Keep text in the illustrations

themselves to a minimum but explain all symbols and

abbreviations used.

Tables

Please submit tables as editable text and not as images.

Tables can be placed either next to the relevant text in the article,

or on separate page(s) at the end. Number tables consecutively

in accordance with their appearance in the text and place any

table notes below the table body. Be sparing in the use of tables

and ensure that the data presented in them do not duplicate

results described elsewhere in the article. Please avoid using

vertical rules and shading in table cells.

References

Citation in text

Please ensure that every reference cited in the text is also

present in the reference list (and vice versa). Any references cited

in the abstract must be given in full. Unpublished results and

personal communications are not recommended in the reference

list, but may be mentioned in the text. If these references are

included in the reference list they should follow the standard

reference style of the journal and should include a substitution of

the publication date with either 'Unpublished results' or 'Personal

78

communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that

the item has been accepted for publication.

Reference links

Increased discoverability of research and high quality

peer review are ensured by online links to the sources cited. In

order to allow us to create links to abstracting and indexing

services, such as Scopus, CrossRef and PubMed, please ensure

that data provided in the references are correct. Please note that

incorrect surnames, journal/book titles, publication year and

pagination may prevent link creation. When copying references,

please be careful as they may already contain errors. Use of the

DOI is encouraged.

A DOI can be used to cite and link to electronic articles

where an article is in-press and full citation details are not yet

known, but the article is available online. A DOI is guaranteed

never to change, so you can use it as a permanent link to any

electronic article. An example of a citation using DOI for an article

not yet in an issue is: VanDecar J.C., Russo R.M., James D.E.,

Ambeh W.B., Franke M. (2003). Aseismic continuation of the

Lesser Antilles slab beneath northeastern Venezuela. Journal of

Geophysical Research, https://doi.org/10.1029/2001JB000884.

Please note the format of such citations should be in the same

style as all other references in the paper.

Web references

As a minimum, the full URL should be given and the date

when the reference was last accessed. Any further information, if

known (DOI, author names, dates, reference to a source

publication, etc.), should also be given. Web references can be

79

listed separately (e.g., after the reference list) under a different

heading if desired, or can be included in the reference list.

Data references

This journal encourages you to cite underlying or relevant

datasets in your manuscript by citing them in your text and

including a data reference in your Reference List. Data

references should include the following elements: author

name(s), dataset title, data repository, version (where available),

year, and global persistent identifier. Add [dataset] immediately

before the reference so we can properly identify it as a data

reference. The [dataset] identifier will not appear in your

published article.

References in a special issue

Please ensure that the words 'this issue' are added to any

references in the list (and any citations in the text) to other articles

in the same Special Issue.

Reference management software

Most Elsevier journals have their reference template

available in many of the most popular reference management

software products. These include all products that support

Citation Style Language styles, such as Mendeley and Zotero, as

well as EndNote. Using the word processor plug-ins from these

products, authors only need to select the appropriate journal

template when preparing their article, after which citations and

bibliographies will be automatically formatted in the journal's style.

If no template is yet available for this journal, please follow the

format of the sample references and citations as shown in this

Guide. Users of Mendeley Desktop can easily install the

80

reference style for this journal by clicking the following link:

http://open.mendeley.com/use-citation-style/bone When

preparing your manuscript, you will then be able to select this

style using the Mendeley plugins for Microsoft Word or

LibreOffice.

Reference formatting

There are no strict requirements on reference formatting

at submission. References can be in any style or format as long

as the style is consistent. Where applicable, author(s) name(s),

journal title/book title, chapter title/article title, year of publication,

volume number/book chapter and the pagination must be

present. Use of DOI is highly encouraged. The reference style

used by the journal will be applied to the accepted article by

Elsevier at the proof stage. Note that missing data will be

highlighted at proof stage for the author to correct. If you do wish

to format the references yourself they should be arranged

according to the following examples:

Reference style Text: Indicate references by number(s) in

square brackets in line with the text. The actual authors can be

referred to, but the reference number(s) must always be given.

Example: '..... as demonstrated [3,6]. Barnaby and Jones [8]

obtained a different result ....' List: Number the references

(numbers in square brackets) in the list in the order in which they

appear in the text. Examples: Reference to a journal publication:

[1] J. van der Geer, J.A.J. Hanraads, R.A. Lupton, The art of

writing a scientific article, J. Sci. Commun. 163 (2010) 51–59.

Reference to a book: [2] W. Strunk Jr., E.B. White, The Elements

of Style, fourth ed., Longman, New York, 2000. Reference to a

chapter in an edited book: [3] G.R. Mettam, L.B. Adams, How to

prepare an electronic version of your article, in: B.S. Jones, R.Z.

Smith (Eds.), Introduction to the Electronic Age, E-Publishing Inc.,

81

New York, 2009, pp. 281–304. Reference to a website: [4]

Cancer Research UK, Cancer statistics reports for the UK.

http://www.cancerresearchuk.org/

aboutcancer/statistics/cancerstatsreport/, 2003 (accessed

13.03.03). Reference to a dataset: [dataset] [5] M. Oguro, S.

Imahiro, S. Saito, T. Nakashizuka, Mortality data for Japanese

oak wilt disease and surrounding forest compositions, Mendeley

Data, v1, 2015. https://doi.org/10.17632/ xwj98nb39r.1. Journal

abbreviations source Journal names should be abbreviated

according to the List of Title Word Abbreviations.

Video

Elsevier accepts video material and animation sequences

to support and enhance your scientific research. Authors who

have video or animation files that they wish to submit with their

article are strongly encouraged to include links to these within the

body of the article. This can be done in the same way as a figure

or table by referring to the video or animation content and noting

in the body text where it should be placed. All submitted files

should be properly labeled so that they directly relate to the video

file's content. In order to ensure that your video or animation

material is directly usable, please provide the files in one of our

recommended file formats with a preferred maximum size of 150

MB. Video and animation files supplied will be published online in

the electronic version of your article in Elsevier Web products,

including ScienceDirect. Please supply 'stills' with your files: you

can choose any frame from the video or animation or make a

separate image. These will be used instead of standard icons and

will personalize the link to your video data. For more detailed

instructions please visit our video instruction pages. Note: since

video and animation cannot be embedded in the print version of

the journal, please provide text for both the electronic and the

82

print version for the portions of the article that refer to this

content.

Supplementary material

Supplementary material such as applications, images

and sound clips, can be published with your article to enhance it.

Submitted supplementary items are published exactly as they are

received (Excel or PowerPoint files will appear as such online).

Please submit your material together with the article and supply a

concise, descriptive caption for each supplementary file. If you

wish to make changes to supplementary material during any

stage of the process, please make sure to provide an updated

file. Do not annotate any corrections on a previous version.

Please switch off the 'Track Changes' option in Microsoft Office

files as these will appear in the published version.

Data linking

If you have made your research data available in a data

repository, you can link your article directly to the dataset.

Elsevier collaborates with a number of repositories to link articles

on ScienceDirect with relevant repositories, giving readers access

to underlying data that give them a better understanding of the

research described. There are different ways to link your datasets

to your article. When available, you can directly link your dataset

to your article by providing the relevant information in the

submission system. For more information, visit the database

linking page. For supported data repositories a repository banner

will automatically appear next to your published article on

ScienceDirect. In addition, you can link to relevant data or entities

through identifiers within the text of your manuscript, using the

following format: Database: xxxx (e.g., TAIR: AT1G01020;

CCDC: 734053; PDB: 1XFN).

83

ARTICLE ENRICHMENTS

AudioSlides

The journal encourages authors to create an AudioSlides

presentation with their published article. AudioSlides are brief,

webinar-style presentations that are shown next to the online

article on ScienceDirect. This gives authors the opportunity to

summarize their research in their own words and to help readers

understand what the paper is about. More information and

examples are available. Authors of this journal will automatically

receive an invitation e-mail to create an AudioSlides presentation

after acceptance of their paper.

3D radiological data

You can enrich your online article by providing 3D

radiological data in DICOM format. Radiological data will be

visualized for readers using the interactive viewer embedded

within your article, and will enable them to: browse through

available radiological datasets; explore radiological data as 2D

series, 2D orthogonal MPR, 3D volume rendering and 3D MIP;

zoom, rotate and pan 3D reconstructions; cut through the volume;

change opacity and threshold level; and download the data.

Multiple datasets can be submitted. Each dataset will have to be

zipped and uploaded to the online submission system via the '3D

radiological data' submission category. The recommended size of

a single uncompressed dataset is 200 MB or less. Please provide

a short informative description for each dataset by filling in the

'Description' field when uploading each ZIP file. Note: all datasets

will be available for download from the online article on

ScienceDirect. So please ensure that all DICOM files are

anonymized prior to submission.

84

Interactive plots

This journal enables you to show an Interactive Plot with

your article by simply submitting a data file. Full instructions.

AFTER ACCEPTANCE

Online proof correction

Corresponding authors will receive an e-mail with a link

to our online proofing system, allowing annotation and correction

of proofs online. The environment is similar to MS Word: in

addition to editing text, you can also comment on figures/tables

and answer questions from the Copy Editor. Web-based proofing

provides a faster and less error-prone process by allowing you to

directly type your corrections, eliminating the potential

introduction of errors. If preferred, you can still choose to

annotate and upload your edits on the PDF version. All

instructions for proofing will be given in the e-mail we send to

authors, including alternative methods to the online version and

PDF. We will do everything possible to get your article published

quickly and accurately. Please use this proof only for checking

the typesetting, editing, completeness and correctness of the text,

tables and figures. Significant changes to the article as accepted

for publication will only be considered at this stage with

permission from the Editor. It is important to ensure that all

corrections are sent back to us in one communication. Please

check carefully before replying, as inclusion of any subsequent

corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your

responsibility.

Offprints

85

The corresponding author will, at no cost, receive a

customized Share Link providing 50 days free access to the final

published version of the article on ScienceDirect. The Share Link

can be used for sharing the article via any communication

channel, including email and social media. For an extra charge,

paper offprints can be ordered via the offprint order form which is

sent once the article is accepted for publication. Both

corresponding and co-authors may order offprints at any time via

Elsevier's Webshop. Corresponding authors who have published

their article open access do not receive a Share Link as their final

published version of the article is available open access on

ScienceDirect and can be shared through the article DOI link.

AUTHOR INQUIRIES

Visit the Elsevier Support Center to find the answers you

need. Here you will find everything from Frequently Asked

Questions to ways to get in touch. You can also check the status

of your submitted article or find out when your accepted article

will be published.

uso de painel de genes para sequenciamento de próxima...

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