INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO SUL

DE MINAS GERAIS

CAMPUS MUZAMBINHO

Curso Superior de Tecnologia em Cafeicultura

VANDELINO DIAS JUNIOR

USO DE N-ACETILCISTEÍNA NO CONTROLE DA MANCHA AUREOLADA EM

MUDAS DE CAFEEIRO

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Curso Superior de

Tecnologia em Cafeicultura, do Instituto

Federal de Educação, Ciência e Tecnologia

do Sul de Minas Gerais, Campus

Muzambinho, como requisito para a

obtenção do título de Tecnólogo em

Cafeicultura. Elaborado conforme as

normas da Revista Coffee Science.

Orientador: Prof.ª D.Sc. Roseli dos Reis

Goulart

MUZAMBINHO

2014

COMISSÃO EXAMINADORA

_________________________________

Prof.ª D.Sc Roseli dos Reis Goulart (Orientadora)

__________________________________

Prof.a D.Sc Anna Lygia de Rezende Maciel

___________________________________

Prof. D.Sc Felipe Campos Figueiredo

Muzambinho, 15 de agosto de 2014.

USO DE N-ACETILCISTEÍNA NO CONTROLE DA MANCHA AUREOLADA EM

MUDAS DE CAFEEIRO

Vandelino Dias Junior1, Roseli dos Reis Goulart

1, Leônidas Leoni Belan

2, Helvécio D.

Coletta Filho3, Alessandra A. de Souza

3

1 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais - IFSULDEMINAS – Campus

Muzambinho (MG). vandelinodias@hotmail.com; goulartrr@yahoo.com.br 2

Universidade Federal de Lavras - UFLA, Departamento de Fitopatologia. Lavras (MG).

leonidas_agronomia@yahoo.com.br 3 Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico, Cordeirópolis (SP).

helvecio@centrodecitricultura.br; alessandra@centrodecitricultura.br

RESUMO: A mancha aureolada do cafeeiro é uma doença causada pela bactéria

Pseudomonas syringae pv garcae. O controle desta doença tem se mostrado ineficaz e

inviável, por isso o estudo de novas alternativas que efetivamente reduzam a severidade da

doença e sejam menos tóxicos se faz necessário. Objetivou-se neste trabalho avaliar o

efeito de diferentes concentrações de N-Acetilcisteína (NAC) na incidência da mancha

aureolada em mudas de cafeeiro da variedade Catuaí Vermelho IAC 144. Antes das mudas

serem inoculadas com a bactéria, as plantas foram acondicionadas em câmara úmida, a

qual foi confeccionada com saco plástico transparente, para abertura dos estômatos e

melhor penetração da bactéria. Após dez dias da inoculação quando as plantas

apresentavam os sintomas típicos da doença, distribuídos de maneira uniforme, foi

realizada a primeira pulverização e após 20 dias foi realizada a segunda pulverização. O

uso do N-Acetilcisteína para o controle da mancha aureolada do cafeeiro, de maneira

curativa e via foliar não se apresentou eficiente. As doses de NAC 160, 320, 480 e 540 mg

L agua-1

, assim como a casugamicina 2% na dose de 3 ml L agua-1

não foram capazes de

diminuir a progressão da doença.

Termos para indexação: Pseudomonas syringae pv garcae, bactéria, NAC

USE OF N-ACETYLCYSTEINE IN CONTROLLING THE BACTERIAL BLIGHT

OF COFFEE SEEDLINGS

ABSTRACT: The bacterial blight of coffee is a disease caused by the bacterium

Pseudomonas syringae pv garcae. Control of this disease is inefficient and impractical, so

the study of new alternatives that effectively reduce the severity of the disease and are less

toxic if necessary. The aim of this study was to evaluate the effect of different

concentrations of N-Acetylcysteine on the incidence of bacterial blight of coffee seedlings

Catuaí Vermelho IAC 144. Before the seedlings were inoculated with the bacteria, the

plants were placed in a moist chamber, which was made with transparent plastic bag, for

opening the stomata and better penetration of bacteria. Ten days after inoculation when

plants showed typical symptoms of the disease, spread evenly, the first spraying was

performed and 20 days after the second spraying was performed. The use of N-

acetylcysteine to control the bacterial blight of coffee seedlings, curative foliar way and

did not appear efficient. NAC doses of 160, 320, 480 and 540 mg L water-1

, as well as

casugamicina 2% at a dose of 3 ml L water-1

were not able to slow the progression of the

disease.

Index terms: Pseudomonas syringae pv garcae, bacterium, NAC

1. INTRODUÇÃO

A mancha aureolada do cafeeiro é uma doença causada pela bactéria Pseudomonas

syringae pv garcae, constatada pela primeira vez em 1955 na região de Garça, no Estado

de São Paulo (GODOY et al., 1997; MACIEL et al., 2012; PATRICIO et al., 2004). Outras

fitobactérias já foram identificadas causando doenças no café (Coffea arabica L.), porém a

Pseudomonas syringae pv. garcae é a mais comum (DESTÉFANO et al., 2010; MACIEL

et al., 2011).

A mancha aureolada ataca o cafeeiro tanto nas fases de formação como de

produção, a doença é favorecida por ventos frios, temperaturas amenas e umidade alta. Na

planta do cafeeiro esta bacteriose ataca folhas, rosetas, chumbinhos e ramos. Os sintomas

são mais severos nas lavouras novas, com 3 a 4 anos, e nas mudas, podendo resultar em

morte do ponteiro ou das plantas (GODOY et al., 1997; MACIEL et al., 2012; PATRICIO

et al., 2004).

Os sintomas desta doença bacteriana são manchas de cores pardas, circundadas por

um halo amarelado, semelhante a uma aureola, por isso o nome mancha aureolada. Quando

as lesões são nas bordas das folhas, estas se desprendem do limbo foliar dando um aspecto

rendilhado (PATRICIO, 2004; POZZA et al., 2010).

A bactéria é considerada oportunista, pois aproveita de lesões presentes nas plantas

para se instalar. Estas lesões podem ser oriundas de chuva de granizo, danos causados pela

colheita ou por ventos frios. Em lavouras implantadas nos locais de maior altitude e sem

quebra ventos ela aparece com maior intensidade (GODOY et al., 1997; MACIEL et al.,

2012; PATRICIO et al., 2004).

Em muitas literaturas a mancha aureolada do cafeeiro é tratada como uma doença

secundária, já que desde o seu primeiro relato, a doença vem causando danos esporádicos e

localizados (CARVALHO et al., 2010). No entanto, nas ultimas safras a mancha aureolada

do cafeeiro ocorreu com grande frequência nas regiões produtoras de café. As epidemias

da doença foram severas nas lavouras situadas em locais de altitudes elevadas, embora a

doença também seja encontrada em locais de menores altitudes (PATRICIO et al., 2012).

Esta maior severidade e danos que vem sendo causados, podem estar relacionadas à

redução do uso de fungicidas cúpricos (MATIELLO et al., 2010), já que o cobre tem

ligeira reposta favorável como bactericida (COSTA & SILVA, 1960). Outro fator pode ser

pela falta de quebra ventos, já que muitos cafeicultores abrem mão desta prática para

facilitar no manejo mecanizado, tendo em vista que o custo com mão de obra está cada dia

mais elevado.

Costa e Silva (1960) realizaram estudo sobre o controle da mancha aureolada do

cafeeiro, utilizando produtos a base de cobre, mancozeb e agrimicina com intervalos curtos

de pulverização e com a reaplicação após as chuvas. Mesmo assim, os autores observaram

que em condições climáticas favoráveis, pouco sucesso se obteve com os tratamentos.

O hidróxido de cobre proporciona redução na severidade da mancha aureolada do

cafeeiro, no entanto, não possui efeito curativo, desta forma, o cobre tem sido utilizado em

mistura com alguns fungicidas, fosfitos e acido salicílico, mas também sem muito sucesso

(DIAS JUNIOR & GOULART, 2013; PATRICIO et al., 2004, 2012). Para mudas ainda no

viveiro, a casugamicina pode ser utilizada (BRASIL, 2003) e tem sido uma das

ferramentas para o manejo desta bacteriose. Após as mudas instaladas no campo a melhor

recomendação é o uso de quebra ventos e poda das partes contaminadas.

O controle da mancha aureolada do cafeeiro tem se mostrado ineficaz e inviável,

por isso o estudo de novas alternativas que efetivamente reduzam a severidade da doença e

sejam menos tóxicas se faz necessário, como por exemplo, o trabalho realizado por Botrel

(2013), onde foi pesquisado o uso de fungos sapróbios no controle desta bactéria.

O análogo do aminoácido cisteína, N-acetilcisteína (NAC), produto não tóxico a

humanos, já é utilizado na medicina para destruição de biofilme de bactérias patogênicas a

humanos. Estas bactérias formam biofilme provocando doenças no trato respiratório e

placas bacterianas nos dentes (SOUZA et al., 2012). O NAC atua como agente mucolítico

através da quebra das ligações dissulfeto das mucoproteínas, diminuindo a aderência das

secreções tendo assim ação antibacteriana (MURANAKA, 2010; NAKAIE, 1983).

O NAC tem apresentado efeito no controle da bactéria Xylella fastidiosa causadora

do amarelinho ou clorose variegada dos citros (CVC) na cultura do citros (SOUZA et al.,

2012). No caso do CVC, o mecanismo de patogenicidade está associado a sua capacidade

de colonizar e formar um biofilme no xilema das plantas hospedeiras (MURANAKA,

2010; MURANAKA et al. 2013). O biofilme é formado pela multiplicação e crescimento

da bactéria de forma agregada (SOUZA et al., 2012), isto ocorre porque as bactérias

produzem ao seu redor uma cápsula composta por exopolissacarídeos, que ajuda na adesão

da bactéria nas superfícies e a protege contra condições adversas do ambiente (ROMEIRO,

2005).

O uso do NAC em doses acima de 1 mg mL-1

, foi capaz de desestruturar o biofilme

feito por Xylella fastidiosa, reduziu a quantidade de exopolissacarídeo capsular, além

disso, apresentou efeito antimicrobiano (MURANAKA et al.,2013).

Em outro trabalho, plantas de laranja pêra enxertadas e infectadas pela bactéria

Xylella fastidiosa receberam, via solução hidropônica, diferentes concentrações de NAC.

Após três meses as plantas que receberam 120 e 600 mg de NAC apresentaram supressão

dos sintomas (MURANAKA et al. 2013).

Embora o NAC tenha poucos estudos no controle de bacterioses de plantas é um

produto que apresenta potencial para o uso na agricultura. Pois, mostrou-se promissor no

controle de bactérias do citros e, além disso, é uma molécula pequena e segura para o

homem e para os animais (MURANAKA et al., 2013; SOUZA et al., 2012).

Neste intuito, é possível que o NAC aplicado através de pulverização, tenha

resultados positivos no controle da mancha aureolada do cafeeiro. Por isso, objetivou neste

trabalho avaliar o efeito de diferentes concentrações de NAC na incidência da mancha

aureolada em mudas de cafeeiro.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento foi conduzido em casa de vegetação no IFSULDEMINAS, Campus

Muzambinho, local com altitude de 1022 metros, latitude 21º 21’ 05,11’’ e longitude 46º

31’ 16,28’’. Para tal, mudas de cafeeiro da variedade Catuaí Vermelho IAC 144 com 6

pares de folhas, foram transplantadas para vasos plásticos com capacidade de 3 L,

contendo substrato padrão para produção de mudas de cafeeiro em viveiro conforme

recomendado por Matiello et al. (2010). Após a emissão do primeiro par de ramos o

experimento foi instalado no delineamento experimental em blocos casualizados (DBC),

contendo 4 blocos e 7 tratamentos (Tabela 1). Cada parcela experimental foi composta por

2 plantas, totalizando 28 parcelas.

TABELA 1 – Tratamentos, e doses utilizadas para controle da mancha aureolada do

cafeeiro.

Tratamentos Dose

Testemunha (sem aplicação de produto). 0

NAC 160 mg L agua-1

NAC 320 mg L agua-1

NAC 480 mg L agua-1

NAC 540 mg L agua-1

Casugamicina 2% 3 mL L agua-1

Solução salina (NaCl) 0,85%

O preparo da suspensão bacteriana para a inoculação das mudas foi realizado no

laboratório de Bacteriologia e Epidemiologia e Controle de Doenças de Plantas, do

Departamento de Fitopatologia (DFP) da UFLA. Foi feito o semeio do patógeno em meio

523 de Kado & Heskett (1970). Após 48 horas, as células bacterianas foram suspendidas

em solução salina estéril (NaCl a 0,85%) e a concentração bacteriana determinada em

espectrofotômetro a 600 nm (OD600), conforme descrito por Oliveira e Romeiro (1990).

Por meio de diluição em solução salina estéril, foi preparada suspensão de células

bacterianas com concentração de 1,0 × 107 UFC/mL (absorbância 0,2).

Antes da inoculação, as plantas foram acondicionadas em câmara úmida, a qual foi

confeccionada com saco plástico transparente de dimensões, 40 cm x 60 cm, onde as

mudas foram tutoradas por estacas de madeira, como descrito por Corrêa et al. (2009),

evitando assim o contato das folhas com o saco plástico. Antes dos vasos serem revestidos

pelo saco plástico as mudas foram bem irrigadas e aspergidas com água, após isso o saco

plástico foi colocado e amarrado para manter alta umidade na folha, durante 24 horas. Esta

etapa objetivou promover um ambiente saturado de umidade para que a planta mantivesse

seus estômatos abertos e facilitasse a entrada das bactérias.

Após este período, os sacos plásticos foram retirados, e as mudas foram inoculadas,

por meio da aspersão da suspensão bacteriana nas folhas, logo em seguida as plantas

voltaram para a câmara úmida, permanecendo por mais 24 horas, conforme realizado por

Mohan et al. (1978) e Zoccoli et al. (2011).

No tratamento com solução salina, as plantas não foram inoculadas com a bactéria,

uma vez, que o objetivo deste tratamento foi verificar a possível presença de queimaduras

no tecido da folha, uma vez que a solução salina poderia provocar estas queimaduras, o

que poderia ser confundido com os sintomas da bacteriose.

Após 10 dias da inoculação quando as plantas apresentavam os sintomas típicos da

doença, distribuídos de maneira uniforme, foi realizada a primeira pulverização (PP) com

os tratamentos descritos na Tabela 1. Após 20 dias da PP foi realizada a segunda

pulverização (SP).

As avaliações foram realizadas nos 3 primeiros pares de folhas do ápice para a base

da planta, ou seja, 6 folhas por planta, determinando-se a incidência da doença nas folhas

(IDF). Todas as avaliações foram realizadas com intervalos de 4 dias, sendo realizadas 5

avaliações após a PP e 5 avaliações após a SP, de forma que o experimento foi conduzido e

avaliado durante 40 dias, iniciando as avaliações em 21/04/2014 até 31/05/2014.

Os dados de IDF foram utilizados no cálculo da Área Abaixo da Curva de

Progresso da Incidência (AACPI). Estes dados foram submetidos ao teste de Tukey (p<

0,05). Os dados de AACPI referente aos tratamentos com NAC foram submetidos ao teste

de regressão no programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 2011).

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Após 11 dias da inoculação das mudas, e antes da aplicação dos tratamentos, todas

as parcelas apresentavam sintomas da doença (Tabela 2), exceto na parcela que recebeu

somente a solução salina. A IDF variou de 25 a 48% nos três pares de folhas avaliados.

TABELA 2 - Incidência de mancha aureolada em mudas de cafeeiro onze dias após a

inoculação.

Tratamento IDF (%) *

Testemunha 41,50 (b)

NAC 160 mg L agua-1

48,00 (b)

NAC 320 mg L agua-1

31,50 (b)

NAC 480 mg L agua-1

25,00 (b)

NAC 540 mg L agua-1

27,00 (b)

Casugamicina 2% 31,25 (b)

Solução salina (NaCl) 0,00 (a)

CV (%) 53,20

As médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a

5%. * Média das seis folhas avaliadas por planta.

Observando-se os dados médios de incidência da doença antes da aplicação dos

tratamentos e após a aplicação (Tabela 3) observa-se que de 0 para 4 dias após a

inoculação houve um crescimento significativo da IDF. No entanto, de um modo geral,

verifica-se que a doença aumentou com o passar dos dias até os 40 dias após a inoculação.

Ou seja, as diferentes concentrações de NAC, assim como a casugamicina 2%, não tiveram

efeito na paralisação da doença. O NAC 160 mg L agua-1

em algumas avaliações se

destacou dos demais com maior incidência da doença.

TABELA 3 – Incidência de mancha aureolada em mudas de cafeeiro em 11 avaliações com intervalos de 4 dias.

Tratamento

Dias após a inoculação

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

IDF (%) *

Testemunha 41,50(b) 45,75(b) 52,00(b) 54,00(b) 56,00(b) 60,25(b) 66,50(b) 68,75(b) 68,75(b) 68,75(b) 73,00(b)

NAC 160 mg L agua-1

48,00(b) 72,75(c) 72,75(c) 75,00(b) 75,00(b) 79,25(b) 83,25(b) 85,25(b) 87,50(b) 89,50(b) 91,75(c)

NAC 320 mg L agua-1

31,50(b) 54,00(b) 58,25(b) 60,50(b) 60,50(b) 64,75(b) 71,00(b) 71,00(b) 73,00(b) 75,00(b) 75,00(b)

NAC 480 mg L agua-1

25,00(b) 52,25(b) 52,25(b) 52,25(b) 52,25(b) 54,25(b) 58,50(b) 58,50(b) 60,50(b) 60,50(b) 66,75(b)

NAC 540 mg L agua-1

27,00(b) 54,00(b) 54,25(b) 60,50(b) 60,50(b) 62,50(b) 64,75(b) 64,75(b) 64,75(b) 64,75(b) 69,00(b)

Casugamicina 2% 31,25(b) 50,00(b) 54,25(b) 64,75(b) 66,75(b) 66,75(b) 66,75(b) 68,75(b) 68,75(b) 75,00(b) 83,25(c)

Solução salina (NaCl) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a) 0,00(a)

CV (%) 53,20 24,60 21,10 19,69 20,31 19,42 19,12 19,96 20,68 20,20 16,91

As médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5%. * Média das seis folhas avaliadas por planta.

Quanto à taxa de crescimento da incidência da mancha aureolada ao longo do

tempo (Figura 1) observa-se que a doença cresceu a uma mesma taxa nos diferentes

tratamentos. Somente diferiu das plantas que não foram inoculadas com a bactéria.

FIGURA 1 – Taxa de crescimento da incidência de mancha aureolada em mudas de café.

Com relação à AACPI, calculada a partir da incidência (Tabela 4), observa-se que

os tratamentos com NAC e casugamicina 2% obtiveram resultados semelhantes, com

exceção do NAC 160 mg L agua-1

que foi o tratamento com pior desempenho, com uma

AACPI superior até mesmo ao NAC 0 mg L agua-1

, que foi a testemunha absoluta. A razão

do NAC 160 mg L agua-1

ter este comportamento pode ser pelo fato do mesmo ter

apresentado uma incidência superior aos demais tratamentos inicialmente, já que o NAC é

dose-dependente e está relacionado à quantidade do inóculo (MURANAK et al., 2010).

Mas esta hipótese carece de mais estudos. Nenhum dos tratamentos se mostrou capaz de

parar a progressão da doença.

b b b

b b

b

a 0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

Testemunha 160 mg . Lagua-1

320 mg . Lagua-1

480 mg . Lagua-1

540 mg . Lagua-1

Kasugamicina2%

Soluçãosalina (NaCl)

Taxa

de

cres

cim

ento

da

IDF

TABELA 4 – Área abaixo da curva de progressão da incidência de diferentes tratamentos

com NAC em 11 avaliações com intervalos de 4 dias.

Tratamento AACPI *

Testemunha 23.958 (b)

160 mg L agua-1

31.625 (c)

320 mg L agua-1

25.625 (b)

480 mg L agua-1

21.833 (b)

540 mg L agua-1

23.920 (b)

Casugamicina 2% 25.543 (b)

Solução salina (NaCl) 0,000 (a)

CV (%) 16,40

As médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a

5%. * Média das seis folhas avaliadas por planta.

Na regressão, analisando somente as diferentes concentrações de NAC, embora

tenha dado efeito significativo para os tratamentos, nenhum modelo se ajustou aos dados.

Muranka et al. (2013) mostrou através do método HPLC que o NAC é absorvido

pelas raízes das plantas através de solução hidropônica, o mesmo não foi observado via

foliar em cafeeiro.

Apesar de este trabalho sugerir que o NAC não é apropriado para aplicação curativa

via folha, o uso do NAC via foliar foi testado por Picchi & Souza (2013), no controle do

cancaro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, neste trabalho, o

NAC foi associado ao cobre e esta combinação resultou na morte total da bactéria e

propiciou uma redução na concentração de cobre.

4. CONCLUSÕES

O uso do NAC para o controle da mancha aureolada do cafeeiro, de maneira

curativa e via foliar não se apresentou eficiente.

As doses de NAC 160, 320, 480 e 540 mg L agua-1

, assim como a casugamicina

2% na dose de 3 ml L agua-1

não foram capazes de curar ou pelo menos diminuir a

progressão da doença.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Estudos posteriores deveriam ser realizados com NAC no cafeeiro. Seja em

associação com outros produtos, ou mesmo em aplicações preventivas via foliar, ou ainda

na modalidade de aplicação via solo.

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