uso da radiação ionizante como ferramenta no estudo de...

Uso da radiação ionizante como

ferramenta no estudo de amostras

biológicas:

de câncer a minicérebros

Simone Cardoso

IF/UFRJ

• O que é a Física Médica?

– Curso da UFRJ

• Projetos de pesquisa

– Hospitalar

– Pesquisador

AIEA

“Física Médica é um ramo da Física que

compreende a aplicação de conceitos, leis,

técnicas e métodos da Física para a prevenção,

diagnósticos e tratamento de enfermidades.”

ORGANISMO INTERNACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA. El Físico Médico: Criterios y Recomendaciones para su

Formación Académica, Entrenamiento Clínico y Certificación en América Latina. Austria: Viena, 2010.

O que é a Física Médica?

Multidisciplinar

Física

Ciências Biomédicas

Engenharia

Matemática

IF/UFRJ

Periodização do Curso de Física Médica da

UFRJ

1o Período 2o Período 3o Período 4o Período 5o Período 6o Período 7o Período 8o Período

Cálculo I Cálculo II Cálculo III Métodos de

Física Teórica I

Física das Radiações I

Conceitos de Mecânica

Quânt. Ultra-som RNM

Física I Física II Física III Física IV Estágio IEN Física das

Radiações II EstatísticaAplicada

Trabalho de fim de curso

Física Exp. I Física Exp. II Física Exp. III Física Exp.

IV Radiobiologia e Fotobiologia

Estágio IRD I Estágio HU I Estágio INCA

Top Fís Geral I

Fundamentos de Biologia Celular e

Molecular I

Fundamentos de Biologia Celular e

Molecular II

Física Moderna I

Termodinâmica e Física

Estatística

Estágio IRD II

Estágio HU II

(Med. Nuclear)

Computação Aplicada à

Med.

AnatomiaMédico

Aplicada

Métodos Computacionais

em Física I Biofísica

FisiologiaHumana

Estágio IRD III

O que faz um físico médico?

Físico médico

Hospitalar

Pesquisador

Mercado de trabalho

• Serviço clínico

• Consultoria

• Pesquisa e desenvolvimento

• Ensino

http://www.aapm.org/

http://www.aapm.org/

Simone C. Cardoso

Métodos em Física Médica

»Experimental

»Monte Carlo

»Clínica

Pesquisa

Problema FerramentasMultidiscipinar• Biologia

• Medicina

Física das Radiações

Espalhamento:

Compton ou elástico

Nenhuma interação

Efeito fotoelétrico

Interação fóton-átomo

e

e

E2

E3

E1e

A radiação emitida pelo processo é particular de cada elemento,

permitindo sua identificação.

3

h

ZC

n

a

Aspectos físicos: Interação fóton-átomo

Espectroscopia de Raios-X

• Amostras sólidas e líquidas podem ser medidas diretamente

• Não-destrutiva

• Sem preparação da amostra

• ppm

–Seção de choque dependente

do ângulo de espalhamento

–Seção de choque diferencial

varia com o quadrado de Z

222 cos)(xfrd

do

Rayleigh

)(s in398.12

2)s in()(.

3*

2

1

Ex

drrxr

xrx

ies fers imetr ia

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f

fFZ

i

i

rk.r

–Seção de choque

dependente do ângulo de

espalhamento

–Seção de choque diferencial

varia com o número atomico

2

o

c

c

if

2

i

f

f

i

i

f

2

0

KN

KNCom pt on

F1)q(S

A0243.0

)cos1(398.12E

1

E

1

)sinE

E

E

E(

E

E

2

r

d

d

Sd

d

d

d

• Maior dose de radiação ao volume irradiado

• Danificando o mínimo possível os tecidos sadios

Dose absorvida varia com:

• profundidade

• tipo de tecido

• energia do feixe

• tamanho de campo

• distância da fonte e sistema de colimação do feixe

Radioterapia

• Heterogeneidades

– Mudanças na distribuição de dose

• tipo da heterogeneidade

• energia da radiação

• tamanho de campo de irradiação

Somente 10 % dos hospitais do mundo tratam o corpo humano como um meioheterogêneo.

• Pulmão;

• Tumores de cabeça e pescoço: ossos e cavidade de Ar;

• Próteses metálicas

Variações na absorção do feixe primário e fótons espalhados

Variações na fluência dos elétrons

Radioterapia

Heterogeneidade pulmonar

Heterogeneidade óssea na cabeça

Estudos demonstram que a radioterapia pós-mastectomia

possui benefícios associados a sobrevida da paciente.

- Maior tempo de vida;

- Menores chances de reincidiva;

MASTECTOMIA + RADIOTERAPIA

Heterogeneidade metálica

Radioterapia pós-mastectomia

• - Reconstrução mamária

-Tumores com diâmetro ≥ 5cm

- Pele comprometida

- Dissecação inadequada da axila

-Margem comprometida

- Quatro ou mais linfonodos comprometidos

Falha na reconstrução: 40%

Radioterapia pós-mastectomia

Braquiterapia de próstata

27

Braquiterapia de próstata

Implante planejado para entregar uma dose mínima.

Problemas:

Edema pós-implante pode favorecer a redução da dose entregue.

Edema tipicamente aumenta o volume da próstata de 40 a 50%.

Cálculo das distribuições de dose via sistema de planejamento

- fontes pontuais.

- paciente é considerado um meio homogêneo.

- efeito entre as sementes é desprezado.

- desprezar a orientação exata das sementes pode

alterar a distribuição das doses.

Caracterização de tecidos neoplásicos

Câncer: 20 doença que mais leva a óbitos.

O câncer de mama é o segundo mais incidente entre apopulação feminina.

Mais causa mortes entre as mulheres.

400.000/ano de casos novos.

Sociedade Americana de Cancerologia: 1/10mulheres


Average Spectra (Fe)

0

200

400

600

800

1000

6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8

Energy(keV)

Re

lati

ve

Co

un

ts

Tumours

Normals


0

200

400

600

800

1000

6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8

Energy(keV)

Re

lati

ve

Co

un

ts

Tumours

Normals

Average Spectra (Zn)

0

500

1000

1500

2000

8 8.2 8.4 8.6 8.8 9 9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.

2

10.

4

Energy (keV)

Rela

tive C

ou

nts

TumoursNormals



0

200

400

600

800

1000

6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8

Energy(keV)

Re

lati

ve

Co

un

ts

Tumours

Normals

Average Spectra (Zn)

0

500

1000

1500

2000

8 8.2 8.4 8.6 8.8 9 9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.

2

10.

4

Energy (keV)

Rela

tive C

ou

nts

TumoursNormals

Average Spectra (Cu)

10

15

20

25

30

35

40

45

50

7.6 7.8 8 8.2 8.4Energy keV

Re

lati

ve

Co

un

ts

Tumours

Normals


Evolução de tumores primários à metástase através do mapeamento

multi-elementar utilizando a técnica de Fluorescência de Raios-X

Transição epitélio-mesenquimal



Identificar elementos presentes em cortes de amostras de modelo animal

de 0, 1, 3 e 5 semanas:

Tumor primário

carcinoma de pulmão

Sítios metastáticos

derivados do tumor primário

Órgão controle

Caracterização da formação de nichos

pré-metastáticos


pré-metastáticos

Fe Zn

Mn


pré-metastáticos

Paciente era homem, 72 anos, adenocarcinoma de cólon já com metástase.

Amostras com manganês:

-biópsia

-mucosa sadia

-mucosa adjacente

-tumor primário

-linfonodo metastático

Amostra sem manganês:

-linfonodo sadio

*todas as amostras apresentaram ferro e zinco

Video

Novas ferramentas

• Radiação ionizante

• É aquela capaz de arrancar elétrons de átomos ou moléculas, produzindo íons

• Ex: Raios-X, Gama, elétrons, nêutrons...

• Nível atômico

• Células-tronco:

• Nível embrionário

O que são células-tronco?

Células não diferenciadas que tem a capacidade de formar qualquer célula

adulta.

- coração, fígado, nervosas, da pele…

• 1980: CTE, derivada da massa interna de embrião de camundongos, foram isoladas

pela primeira vez;

• Diferenciação in vitro

• geração de proles com carga genética da CTE injetada

• 1990: CTE humanas

• teratomas (prova que as células injetadas são realmente pluripotentes, isto é,

capazes de formar qualquer tecido).

Pluripotência

Capacidade de diferenciação de todos os tipos de células

Embrionárias Adultas

John Gurdon e Shinya Yamanaka

Células maduras podem ser reprogramadas para se tornarem pluripotentes, ou

seja, capazes de dar origem a qualquer tipo de tecido do corpo.

Prêmio Nobel 2012

Gurdon demonstrou ser possível clonar

um vertebrado inteiro a partir das

informações genéticas de uma célula

adulta.

1958: transplantou o núcleo de uma

célula da pele de uma rã africana em

um ovo recém-fertilizado de outra rã da

mesma espécie, cujo núcleo fora

previamente removido.

Clonou a rã e demonstrou que o

genoma de uma célula somática pode

ser reprogramado.Quase desistiu da carreira, ao ser desencorajado por uma professora de ciências

quando só tinha 15 anos.

O japonês Shinya Yamanaka é um médico de formação que optou pela carreira científica tão logo percebeu sua pouca habilidade como cirurgião

ortopédico. Teve que passar por seleções para 50 laboratórios até ser aceito no Instituto Gladstone dos Estados Unidos para um pós-doutoramento

que durou três anos.

Prêmio Nobel 2012

Células-tronco adultas podiam ser

reprogramadas e voltar a ter características

semelhantes às CTE.

A partir de células da pele, ativando alguns

genes, conseguiu que células já

diferenciadas voltassem a um estágio “pré-

diferenciado” e passassem a comportar-se

como células-tronco pluripotentes (IPS -

induced pluripotent stem-cells)

Capazes de formar qualquer linhagem

celular, inclusive neurônios, uma

característica que não existe nas células-

tronco adultas.

Pluripotência

• 2008

As pesquisas com CTE foram definitivamente aprovadas pelo Supremo Tribunal

Federal (STF), em um julgamento histórico.

Naquela época os opositores às pesquisas com CTE já defendiam que as células IPS

iriam substituí-las.

Não seria mais necessário destruir embriões, afirmavam eles.

Base legal para o estudo

Essas células poderiam ser usadas para terapia celular?

O que mostram as pesquisas?

• Setembro de 2010: Guardam uma “memória” de onde foram retiradas e “preferem” se

diferenciar naquele tecido (George Daley).

• Nature Cell Biology, maio de 2011: confirmaram esse achado e por isso brincam que

elas “perdoam, mas não esquecem”. Isto é, se elas foram retiradas do fígado, por

exemplo, irão diferenciar-se preferencialmente em células hepáticas, um comportamento

diferente das CTE.

• Nature, liderada pelo Dr. Xu: células IPS retiradas de camundongos foram rejeitadas

quando reimplantadas em animais com a mesma constituição genética.

• Normalmente as verdadeiras células-tronco embrionárias, quando injetadas em

camundongos formam um tipo especial de tumor, chamado de teratoma.

O que mostram as pesquisas?

Qual foi então o grande achado de Yamanaka?

• Estudar todos os tecidos de um paciente, sem usar nenhum método invasivo.

•As células (cobaias) passam a ser o paciente.

• Comparar diferentes tecidos de uma mesma pessoa e verificar como se

expressam os genes nas diferentes células

• Porque um tecido é afetado e outro não?

• Porque pessoas com a mesma mutação genética podem ter quadros

clínicos totalmente discordantes?

• Possibilidade de testar diferentes estratégias e drogas para corrigir um

defeito genético e observar o efeito diretamente.

Motivação

• Mecanismos de reparação em organismos adulto;

• Conhecimento sobre o desenvolvimento de uma única célula;

• Base da Terapia celular;

• Medicina regenerativa.

http://jpphysiology.blogspot.com/

Pesquisadores chineses conseguiram

gerar células progenitoras de

neurônios a partir de células

presentes na urina humana

NATURE | LETTER

Nature 475, 386–389

Published online 11 May 2011

Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse

fibroblasts by defined factors

Huang et al

Células reprogramadas de espécies em risco de extinção

Nature Methods:

Scripps produziu células iPS de duas espécies

ameaçadas de extinção: o macaco mandril

(parente do babuíno) e o rinoceronte-branco-

do-norte, que atualmente possui apenas oito

exemplares vivos.

As células-tronco reprogramadas poderão ser utilizadas na geração de gametas

funcionais para a reprodução assistida dessas espécies.

http://www.natureasia.com/en/research/index/highlight/id/1409/

Pluripotência

Apesar…

Os mecanismos relacionados com a pluripotência não são conhecidos:

•Sobrevivência celular;

•Morte;

•Processo de diferenciação

• dinâmica;

• comportamento

•Medicina Regenerativa;

•Terapia

Objetivo

Descrever a transição do estado de pluripotência à diferenciação neural através

da SR-µXRF

•Células tronco embrionárias humanas e murinas

humanas

murinas

iPS

100mm.

Metodologia

• Murinas

• Humanas

• iPS

Metodologia

Amostra não é alterada pela radiação de alto fluxo!

Resultados

Resultados: CTE murina

Resultados: CTE humana

Diferenciação espontânea x neural:

• S and P

• Ácidos nucleicos

• composição de proteínas

• Cu and Zn.

Resultados

Modelagem de doenças neurais por espectroscopia de

Raios-X utilizando Células-tronco de pluripotência induzida para aplicação

em Medicina Personalizada

• Doenças do cérebro e distúrbios mentais são pouco compreendidas

– Diferentes origens

• Doença de Huntington: alterações genéticas

• Alzheimer: acúmulo de monômeros de Aβ e genes relacionados

• Outras desordens: perfil pouco padronizado em termos de alterações fisiológicas.

– Dificuldade de acesso

• Reduzam os custos de testes de eficiência de fármacos;

• Permitam o estudo de doenças que ocorram nos estágios embrionários.




• Modelo

– Animal

» Útil na modelagem de doenças que se sabe qual o tipo de

alteração ocorre.

» Apesar de termos de levar em consideração as diferenças entre o

organismo

» Alzheimer: camundongos apresentam acúmulo de Aβ, mas

não apresentam os sinais de degeneração neural.

» Ainda, existem desordens em que não se sabe precisamente

quais alterações são relativas ao organismo, e quais são

relativas ao ambiente ou ao histórico de vida, de modo que

a modelagem em animais é complicada e pode ser muito

diferente do que ocorre no corpo humano.




• Modelo :

– Cérebros post-mortem

» Biópsias: estágio final da doença

– iPS

» linhagens derivadas de pacientes, quando comparadas às de

indivíduos saudáveis podem ressaltar fenômenos precoces do

estabelecimento da doença.

» Personalizada!

Esquizofrenia

• Acomete 1/100 indivíduos

• Alta morbidade, mortalidade, incapacitação pessoal e custo socioeconômico

• Diagnosticada na adolescência mas gerada durante o desenvolvimento do

sistema nervoso

• Pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos e bioquímicos que levam à

doença

• Síndrome clínica x única doença

• Inexistência de tratamentos satisfatórios!!!

• 20-30 % são resistentes ao tratamento com antipsocóticos clássicos

– Efeitos adversos

• Consenso : novos fármacos antipsicóticos com melhor eficácia e segurança.

Doenças neurais a nível atômico e embrionário: esquizofrenia

• Esquizofrenia

– Reprogramação das células

– iPS saudáveis

– iPS esquizofrênicas

– Células-tronco embrionária

• Neuroesferas

– Um modelo experimental para estudos da potencialidade das células-tronco neurais

– Agregados celulares que crescem em suspensão na presença de fatores de crescimento,

como FGF-2 ( crescimento, como FGF-2 (fifi broblast growth factor-2 broblast growth

factor-2) e EGF (epidermal growth factor);

– Podem diferenciar-se nos três tipos celulares do SNC: neurônios, astrócitos e

oligodendrócitos

– Cada neuroesfera é derivada de uma única célula-tronco


• Hipótese:

Variações espacias e de concentração de alguns elementos químicos destas

células tenham relação com erros na diferenciação dos neurônios

• Impacto na origem de doenças neurais


0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

H9 FN EZQ 2

K - lio

colônia

neuroesfera

Tratar as neuroesferas com fármacos:

Ácido valproico (VPA): diminui o ROS.

Clozapina: medicamento clássico da esquizofrenia


• Organização atômica também nas neurosferas, com especificidades próprias às

CTEs e às iPS.

• Neurosferas derivadas de FN e EZQs

• K e Zn

• relevantes na patologia da doença

•trarão mais clareza no entendimento do desenvolvimento da

esquizofrenia.

• VPA

• Possibilidade de testar fármacos de forma individualizada

• síndrome clínica

• Viabilidade do método

• Novos fármacos

• Medicina personalizada

• Outras doenças neurais

Empresas farmacêuticas criaram plataformas para triagem de medicamentos e toxicidade

baseadas em células-tronco.

• Retigabina (originalmente usado em epilepsia) sendo testada em pacientes com ELA

• novos candidatos para Alzheimer

• células do coração (criadas a partir de iPS) para testes de toxicidade de fármacos.

Minicérebros

09/02/2015

[email protected]

mailto:[email protected]

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