universidadefederalruraldosemi-Árido

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA

DYONATAN FONSECA SILVA

INVESTIGAÇÃO IN SILICO E IN VITRO DO EFEITO ANTIPARASITÁRIO DA

DROGA FEBRIFUGINA EM Trypanosoma cruzi

MOSSORÓ

2020




Monografia apresentada a UniversidadeFederal Rural do Semi-Árido como requisitopara obtenção do título de Bacharel emBiotecnologia.

Orientador: Prof. Ms. Taffarel Melo Torres.

MOSSORÓ

2020

©Todos os direitos estão reservados à Universidade Federal Rural do Semi-Árido.O conteúdodesta obra é de inteira responsabilidade do (a) autor (a), sendo o mesmo, passível de sançõesadministrativas ou penais, caso sejam infringidas as leis que regulamentam a PropriedadeIntelectual, respectivamente, Patentes: Lei nº 9.279/1996, e Direitos Autorais: Lei nº9.610/1998. O conteúdo desta obra tornar-se-á de domínio público após a data de defesa ehomologação da sua respectiva ata, exceto as pesquisas que estejam vinculas ao processo depatenteamento. Esta investigação será base literária para novas pesquisas, desde que a obra eseu (a) respectivo (a) autor (a) seja devidamente citado e mencionado os seus créditosbibliográficos.

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Bibliotecasda Universidade Federal Rural do Semi-Árido, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

O serviço de Geração Automática de Ficha Catalográfica para Trabalhos de Conclusão de Curso (TCC´s) foi desenvolvidopelo Instituto de Ciências Matemáticas e de Computação da Universidade de São Paulo (USP) e gentilmente cedido para oSistema de Bibliotecas da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (SISBI-UFERSA), sendo customizado pelaSuperintendência de Tecnologia da Informação e Comunicação (SUTIC) sob orientação dos bibliotecários da instituição paraser adaptado às necessidades dos alunos dos Cursos de Graduação e Programas de Pós-Graduação da Universidade.




Monografia apresentada a UniversidadeFederal Rural do Semi-Árido como requisitopara obtenção do título de Bacharel emBiotecnologia.

Defendida em: 07 / 02 / 2020.

BANCA EXAMINADORA

AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha família, pelo apoio financeiro e emocional. Em especial a minha

mãe, que mesmo longe, fazia-se presente em meus momentos de dificuldade e sonhava com o

momento da minha formatura, a meu pai que me apoiou e disciplinou, e a minha família por

parte de mãe, que me ajudou com praticamente qualquer dificuldade escolar que surgisse

durante a graduação e me proporcionava um mínimo de vida social fora da UFERSA.

Agradeço ao meu Orientador, Taffarel Melo Torres, por ter paciência e compreensão,

ter o conhecimento que precisei e me ajudou a superar vários obstáculos quando resolvi

adentrar nessa área da biotecnologia, me mostrou caminhos a seguir para além da graduação e

me incentivou a buscar sempre mais.

Agradeço a Banca Examinadora pelo auxílio com a promoção da minha formação

através das dicas, do incentivo e do apoio moral dado a mim em prol do meu

desenvolvimento como profissional.

Agradeço ao CENAPAD-SP pela colaboração com o uso de suas máquinas para a

realização deste estudo.

Agradeço a minha turma de biotec (2016.1) pelos carinhos e infinitas ajudas ao longo

da graduação, simplesmente a melhor turma que eu poderia ter.

Existem muitas hipóteses em ciência que estão

erradas. Isso é perfeitamente aceitável, eles

são a abertura para achar as que estão certas.

Carl Sagan

RESUMO

A doença de Chagas é uma tripanossomíase causada pelo parasito Trypanosoma cruzique afeta todo o continente americano e que se difundiu até a Europa e Ásia, trazendo váriasmortes por ano, danos à economia do país endêmico e infectando cada vez mais pessoas porvias de transmissão alternativas. Várias alternativas para buscar por novas drogas para ocombate de doenças parasitárias vem sendo almejadas nos últimos anos e o reposicionamentode fármacos aliado a estudos in silico vem mostrando ser uma estratégia promissora, porpermitir predizer se dado fármaco tem ou não potencial atividade biológica. Devido às váriassemelhanças biológicas entre T. cruzi e Leishmania sp., estudos in silico com resultadospositivos envolvendo o uso de análogos da febrifugina (FFG) contra a enzima tripanotionaredutase (TR) de L. donovani levantaram a hipótese de que talvez a molécula natural pudesseser capaz de exibir atividade antiparasitária in vitro e que também pudesse ser capaz de ligar-se ao sitio de ligação da TR. Para a realização do teste in vitro, os parasitos de T. cruzi foramcultivados em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) suplementado com 10% de soro fetalbovino e 10 IU/ml de penicilina/estreptomicina e mantidos a 28 ºC. Em seguida foi aplicado otratamento com FFG e o controle positivo com benzonidazol, ambos em cinco concentrações(1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM e 62,5 μM) e o controle negativo para cada tratamento.Para ensaio in silico, foi usada a estrutura proteica foi recuperada, limpa de ligantes nãoproteicos e submetida ao docking com a FFG. Para a simulação molecular foi usada a cadeiaA isolada da TR, o dímero sem a FFG e o dímero ligado a FFG obtido no docking. Asanálises in silico apontaram a existência de várias conformações estáveis para a caixa dedocking da FFG, sendo a escolhida (-7,4 kcal/mol) usada para a simulação e resultou em umaligação estável no sítio de ligação da interface da enzima. As análises do efeito da FFG invitro mostraram que a mesma exerceu atividade antiparasitária nas concentrações de 500 μMe 62,5 μM, porém apenas após dois dias decorridos do tratamento.

Palavras-chave: dinâmica molecular, mecanismo de ação, viabilidade parasitária.

ABSTRACT

Chagas disease is a trypanosomiasis caused by the Trypanosoma cruzi parasite thataffects the entire American continent and has spread to Europe and Asia, causing severaldeaths a year, damage to the economy of the endemic country and infecting more and morepeople through transmission routes alternatives. Several alternatives to search for new drugsfor the control of parasitic diseases have been sought in recent years and the repositioning ofdrugs combined with in silico studies has shown to be a promising strategy, as it allows topredict whether or not a given drug has potential biological activity. Due to the variousbiological similarities between T. cruzi and Leishmania sp., in silico studies with positiveresults involving the use of febrifugin (FFG) analogs against L. donovani's trypanothionereductase (TR) enzyme raised the hypothesis that perhaps the molecule natural could be ableto exhibit antiparasitic activity in vitro and that could also be able to bind to the binding siteof TR. For the in vitro test, T. cruzi parasites were cultured in LIT (Liver Infusion Tryptose)medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 10 IU/ml of penicillin/streptomycinand kept at 28 ºC. Then, the treatment with FFG and the positive control with benzonidazolewere applied, both in five concentrations (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM and 62.5 μM) andthe negative control for each treatment. For in silico testing, the protein structure was used,recovered, cleaned of non-protein binders and subjected to docking with the FFG. For themolecular simulation, the isolated A chain of TR was used, the dimer without the FFG and thedimer linked to the FFG obtained in the docking. The in silico analyzes showed the existenceof several stable conformations for the FFG docking box, the chosen one (-7.4 kcal / mol)being used for the simulation and resulted in a stable bonding in the binding site of theenzyme interface. Analyzes of the effect of FFG in vitro showed that it exerted antiparasiticactivity at concentrations of 500 μM and 62.5 μM, but only after two days after treatment.

Keywords: molecular dynamics, mechanism of action, parasitic viability .

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Mapa representativo da distribuição geográfica da doença de Chagas no

mundo …...................................………….………………………………… 17

Figura 2 – Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi, passando pelo hospedeiro intermediário

e definitivo …..................................................……………………………… 18

Figura 3 – O papel da glutationa e tripanotiona na ação e metabolismo da droga

antichagásica nifurtimox e benzonidazol. O grupo nitro de ambas drogas

chagásicas são reduzidos para radicais livres ou metabólitos eletrofílicos pelas

nitroredutases relacionadas ao citocromo P450 do T. cruzi. Os radicais livres

derivados do nifurtimox talvez passe por um ciclo redox com o oxigênio e há a

produção de H2O2 e a posterior ação da superóxido dismutase (SOD). O

oxigênio produzido a partir dos radicais livres e metabólitos eletrofílicos liga-

se a macromoléculas intracelulares causando danos a elas. No parasita,

tripanotiona (T(SH)2) e glutationa (GSH) neutralizam os metabólitos

derivados do nifurtimox e benzonidazol por conjugação, produzindo drogas-

tiol conjugadas que irão ser posteriormente metabolizadas a mercapturatos nas

células mamíferas. Radicais livres são neutralizados por oxidação da GSH ou

T(SH)2 reduzida. A tripanotiona redutase (EC 1.8.1.12) reduz a tripanotiona

oxidada (T(S)2) .…….............................................………………………... 21

Figura 4 – Estrutura 2D da febrifugina com a numeração posicional dos átomos de sua

molécula ……….........................…………………………………….. 24

Figura 5 Imagem representativa do docking gerado pelo programa AutoDock Vina no

UCSF Chimera para todas as conformações obtidas da febrifugina na interface

do dímero da tripanotiona redutase. A cadeia A está em verde e a cadeia B em

azu l . . . . . . . . . . . . . . . …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .……….. . . . . .……30

Figura 6 – Representação em 2D dos sítios de interação da febrifugina (FFG) com a

interface da cadeia AB da tripanotiona redutase realizada pelo software

Ligplot. Os carbonos estão coloridos em preto, os nitrogênios em azul e os

oxigênios em vermelho na forma de esferas. As ligações do ligante está em

roxo, as ligações não-ligantes estão em marrom claro e as ligações de

hidrogênio são linhas tracejadas verdes. O semicírculo vermelho com raios

radiantes representa interações hidrofóbicas entre resíduos de ligantes e não-

ligantes ...........................................................................................................30

Figura 7 – Análise do RMSD da estrutura proteica da TR através das cadeias separadas,

da estrutura completa e do monômero da cadeia A. Em A) tem-se representado

o RMSD da cadeia A da TR ligada a FFG; em B) tem-se representado o

RMSD da cadeia B da TR sem estar ligada a FFG; em C) tem-se representado

o RMSD da cadeia B da TR ligada a FFG; em D) tem-se representado o

RMSD da cadeia B da TR sem estar ligada a FFG; em E) tem-se representado

o RMSD apenas do dímero proteico quanto ligado a FFG; em F) tem-se

representado o RMSD apenas do dímero proteico quando não ligado a FFG;

em G) tem-se representado o RMSD do monômero da cadeia A da TR ........32

Figura 8 – Análise do RMSD do sítio de ligação da TR ao longo de 100 nanossegundos.

Em A) está representado o RMSD dos resíduos que compõem o sítio de

ligação quando ligados a FFG e em B) está representado o RMSD dos

resíduos sem estarem ligados a FFG .............................................................33

Figura 9 – Análise do RMSD da FFG quando ligada no sítio de ligação da TR ao longo

de 100 nanossegundos ...................................................................................34

Figura 10 – Análise da distância mínima entre a FFG e os resíduos do sítio de ligação ao

longo de 100 nanossegundos ......................................................................34

Figura 11 – Estrutura do sítio de ativo da FFG nos momentos de ligação A) 25

nanossegundos, B) 62,5 nanossegundos, C) 77,5 nanossegundos e D) 95

nanossegundos ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35

Figura 12 – Análise do RMSF da estrutura proteica da TR através das cadeias separadas,

da estrutura completa e do monômero da cadeia A. Em A) tem-se representado

o RMSF da cadeia A da TR ligada a FFG; em B) tem-se representado o RMSF

da cadeia B da TR sem estar ligada a FFG; em C) tem-se representado o

RMSF da cadeia B da TR ligada a FFG; em D) tem-se representado o RMSF

da cadeia B da TR sem estar ligada a FFG; em E) tem-se representado o

RMSF do monômero da cadeia A da TR .......................................................36

Figura 13 – Análise do raio de giro (Rg) do dímero com e sem FFG e do monômero da

cadeia A da TR ao longo de 100 nanossegundos. Em A) está representada a

variação do raio de giro para o dímero da TR ligada a FFG; em B está

representada a variação do raio de giro para o dímero da TR sem estar ligada a

FFG; e em C) está representada a variação do raio de giro para o monômero da

cadeia A da TR ................................................................................................37

Figura 14 – Número de pontes de hidrogênio presentes nas estruturas proteicas do A)

dímero da TR com FFG, B) dímero da TR sem FFG e do C) monômero da

cadeia A da TR, ao longo de 100 nanossegundos .........................................38

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Análise da contagem de parasitos viáveis apenas para o mesmo tratamento

nas diferentes concentrações aplicadas no teste de viabilidade parasitária in

vitro após 1 dia para a febrifugina (FFG) e o benzonidazol (BNZ), e 2 dias

(somente para a febrifugina) de aplicação do fármaco. Barra de erros acima

do gráfico indicam o desvio padrão. Letras diferentes indicam significância

estatística para o mesmo fármaco (mesma cor) em diferentes concentrações

(p<0,05) calculada pela ANOVA one way associada ao pós-teste de Tukey

(α = 0,05).. ………...........................................…….….......................…… 39

Gráfico 2 – Análise da contagem de parasitos viáveis apenas dentro da concentração

estudada para os diferentes tratamentos no teste de viabilidade parasitária in

vitro após 1 dia para a febrifugina (FFG) e o benzonidazol (BNZ) e 2 dias

(somente para a febrifugina) de aplicação do fármaco. Barra de erros acima

do gráfico indicam o desvio padrão. Letras diferentes indicam significância

estatística dentro da mesma concentração (p<0,05) calculada pela ANOVA

one way associada ao pós-teste de Tukey (α = 0,05).......................……40

Gráfico 3 – Porcentagem de sobrevivência parasitária aproximada para as diferentes

concentrações e tratamentos testados. Cada valor de porcentagem de cada

tratamento tomou como base a média do número de parasitas sobreviventes

para dada concentração dividido pela média do seu controle negativo

correspondente. FFG = Febrifugina e BNZ = Benzonidazol..……....…... 41

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Drogas como o Celecoxib, Eflornitina e Finasteride são exemplos de drogas

reposicionadas ..........................................................................…...…… 23

Quadro 2 – Parâmetros da caixa de docking da febrifugina usados no programa UCSF

Chimera. Os centros correspondem à posição do ponto central da caixa no

momento inicial e o diâmetro diz respeito aos limites de movimentação da

febrifugina dentro da caixa ...................................................................27

Quadro 3 – Quadro com conformações de docking rígido para a febrifugina com a

tripanotiona redutase, indicando os modelos e suas respectivas energias de

ligação (em kcal/mol), sendo a conformação 1 a escolhida para a dinâmica

molecular (-7,4 kcal/mol).......................................... ……............ 29

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DNDi DRUGS FOR NEGLECTED DISEASES INITIATIVE

FDA Food and Drug Administration

FFG Febrifugina

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

TR Tripanotiona redutase

WHO World Health Organization

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 15

2 REFERENCIAL TEÓRICO....................................................................... 17

2.1 OCORRÊNCIA DA DOENÇA DE CHAGAS NO BRASIL E NO

MUNDO ........................................................................................................

17

2.2 O CICLO DE VIDA DO Trypanosoma cruzi ................................... 18

2.3 FASES DA DOENÇA DE CHAGAS............................................................. 19

2.3.1 Fase aguda .................................................................................................... 19

2.3.2 Fase crônica................................................................................................... 19

2.4 TRATAMENTOS PARA A DOENÇA DE CHAGAS................................ 19

2.4.1 Benzonidazol............................................................................................... 20

2.4.2 Nifurtimox..................................................................................................... 21

2.5 O REPOSICIONAMENTO DE FÁRMACOS PARA O TRATAMENTO

DE DOENÇAS...........................................................................................

22

2.6 FEBRIFUGINA E A TRIPANOTIONA REDUTASE................................ 23

3 OBJETIVOS DA PESQUISA….....……………………………………... 25

3.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................... 25

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................ 25

4 MATERIAL E MÉTODOS ……………………………………………... 26

4.1 OBTENÇÃO DOS FÁRMACOS................................................................ 26

4.2 CULTIVO E MANUTENÇÃO DOS PARASITOS ................................ 26

4.3 ESTUDOS IN SILICO DA ESTRUTURA E DOCKING................. 26

4.4 DINÂMICA MOLECULAR................................................................ 27

4.5 TRATAMENTO IN VITRO COM A FEBRIFUGINA............................. 28

4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................. 28

5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO ……………………………………... 29

5.1 DOCKING E DINÂMICA MOLECULAR DA FEBRIFUGINA COM A

TRIPANOTIONA REDUTASE ............................................................

29

5.2 VIABILIDADE PARASITÁRIA .......................................................... 38

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................... 42

REFERÊNCIAS......................................................................................... 43

15

1. INTRODUÇÃO

O parasito Trypanosoma cruzi é um protozoário monoflagelado que, por ser o agente

causador da doença de Chagas, é responsável por infectar cerca de 6 a 7 milhões de pessoas

ao redor do mundo, causando mais de 10 mil mortes anuais e cerca de 70 milhões estão em

risco de contrair a doença, estando a maioria das pessoas infectadas na América Latina

(STANAWAY; ROTH, 2015; WHO, 2018). A doença possui uma fase aguda e crônica, com

a fase aguda sendo caracterizada pela presença do parasito no estágio tripomastigota no

sangue, podendo ser visto através do esfregaço do sangue fresco do paciente ou diretamente

através de um microscópio óptico, podendo ou não manifestar sintomas. Já a fase crônica

ocorre com 3 a 4 meses após a infecção e cerca de dois terços das pessoas infectadas não

apresentam sintomas (TEIXEIRA et al., 2006; MONCAYO; SILVEIRA, 2017)

Segundo Teixeira e colaboradores (2006), existem pelo menos 40 espécies de insetos

vetores capazes de transmitir a doença de Chagas. Triatoma sp. é o principal gênero de insetos

vetores responsáveis pela disseminação da doença em ambientes domiciliares. Além da forma

tradicional de transmissão através do vetor, há outras formas de transmissão que se dão

através da transfusão sanguínea, oralmente e através da transmissão pela placenta (DOS

SANTOS et al., 2019). Formas de transmissão secundárias são as menos frequentes e se dão

por acidentes laboratoriais, manipulação de animais infectados, transplante de órgãos etc.

(COURA; DE CASTRO, 2002; COURA, 2007; MONCAYO; SILVEIRA, 2017).

Embora considerada como mecanismo secundário no ciclo humano, a transmissão oral

é considerada um mecanismo primário no ciclo silvestre (DIAS; NETO, 2011) e, desde o

controle da transmissão vetorial do Triatoma infestans no Brasil em 2006, a forma de

transmissão oral do T. cruzi vem mostrado prevalência em relação a transmissão vetorial,

sendo causada principalmente devido a alimentos contaminados com triatomíneos ou suas

fezes os quais devem conter o parasito (DOS SANTOS et al., 2019).

Os tratamentos disponíveis envolvem o uso dos medicamentos benzonidazol e

nifurtimox que apresentam bons resultados na fase aguda porém tem eficácia reduzida

progressivamente a medida que ocorre cronicidade da patologia (TEIXEIRA et al., 2006).

Tais tratamentos, embora forneçam uma alta chance de cura na fase aguda, podem resultar em

efeitos colaterais como polineuropatia periférica, dermatopatia alérgica, depressão da medula

óssea, que podem afetar a permanência do paciente no tratamento (FERREIRA et al., 2019).

Associado a resistência, limitações de uso dependente da idade ou região do paciente,

16

heterogeneidade humana que acarreta uma diferente susceptibilidade ao tratamento, a dose e a

duração do tratamento (MADY et al., 1994; PITA; PASCUTTI, 2011).

Os tripanosomatídeos, como T. cruzi e Leishmania spp., são responsáveis por milhares

de mortes anualmente causadas por parasitas e compartilham várias similaridades

morfológicas, bioquímicas e genéticas, estando dentre elas: ambos serem transmitidos por

insetos vetores, presença de moléculas tiol de baixo peso molecular, como a glutationa,

glutationilespermidina, tripanotiona e ovotiol A, e enzimas responsáveis pela sua via de

biossíntese e de defesa contra o estresse oxidativo (BARRET et al., 2003; KRAUTH-SIEGEL;

COMINI, 2008; MYLER; FASEL, 2008).

Para obter novos fármacos úteis para o combate de doenças, o seu desenvolvimento

passa por 4 fases: a de pesquisa básica, a fase pré-clinica, fase clínica ou de desenvolvimento

e pela aprovação da agência Food and Drug Administration (FDA) do país interessado, para

a então passagem ao mercado consumidor (MOHS; GREIG, 2017). Como alternativa a esse

processo, surgiu o reposicionamento de fármacos já conhecidos para o uso em outras

patologias, sendo assim capaz de reduzir o custo e o tempo necessário para a chegada do

mesmo no mercado de consumo (HURLE et al., 2013; NOVAC, 2013).

Em estudos in silico realizados por Pandey e colaboradores (2017) em busca de novas

drogas para combater a leishmaniose avaliando a intensidade da interação de análogos da

febrifugina, uma molécula natural extraída da planta Dichroa febrífuga Lour, com a enzima

tripanotiona redutase (TR) de L. donovani, identificou vários análogos como inibidores,

porém nenhum teste in vitro foi realizado, o que abriu questionamentos sobre se a molécula

na sua forma natural poderia ter algum efeito in vitro e/ou in silico contra a TR de uma

espécie próxima e com pequenas diferenças estruturais, o parasito T. cruzi.

O objetivo do presente estudo foi realizar o reposicionamento do fármaco febrifugina

para avaliar in vitro se a interação com a droga afeta a sobrevivência do parasito e investigar

in silico se a mesma é capaz de se ligar na enzima TR do T. cruzi.

17

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 OCORRÊNCIA DADOENÇADE CHAGAS NO BRASIL E NO MUNDO

A ocorrência da doença de Chagas se instaura principalmente nas Américas (Figura 1),

sendo também relatado casos na Europa, na Austrália e no Japão (COURA; VIÑAS, 2010;

WHO, 2010; ALBAJAR-VIÑAS; JANNIN, 2011). Segundo Figueira e colaboradores (2019),

acredita-se que a incidência da doença de Chagas nas américas esteja diretamente relacionada

com o alto número de espécies da família Triatominae, o principal vetor do parasito. No

Brasil, entre 2000 e 2013 foram registrados 1570 novos casos de doença de Chagas aguda,

ocorrendo principalmente através da transmissão oral, havendo em média 112,1 casos por ano

e uma incidência média anual/100.000 habitantes de 0,061, estando a maioria dos casos nos

estados Pará e Amapá (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). Dentre as possíveis razões

apontadas pelo ministério da saúde para o destaque desses estados está a ingestão de

alimentos contaminados, como açaí e caldo de cana (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).

Figura 1 - Mapa representativo da distribuição geográfica da doença de Chagas no mundo.

Fonte: adaptado do site do DNDi1, 2018.

Por causar sintomas que inviabilizam o trabalho do cidadão na fase crônica da doença,

como por lesões cardíacas e digestivas, megaesôfago e/ou megacólon, a expectativa de vida

do trabalhador é diminuída significativamente e os gastos com cirurgias corretivas e implantes

1 - Disponível em: <https://www.dndial.org/doencas/doenca-chagas/>. Acesso em 13 Feveireiro 2020.

18

de marcapasso geram alto custo, quando somados, na economia do país onde a doença é

endêmica (DIAS; COURA, 1997; MONCAYO; SILVEIRA, 2017). Além disso, o

absenteísmo das pessoas acometida pela doença de Chagas acaba por acarretar perdas de

produtividade, que alcançaram a casa dos 5,6 milhões de dólares no Brasil em 2010 (WHO,

2010).

2.2 O CICLO DE VIDA DO TRYPANOSOMA CRUZI

O parasito possui um ciclo de vida heteroxeno (Figura 2), que se caracteriza

inicialmente pela hospedagem do parasito por um animal, o qual servirá de fonte de alimento

para o inseto vetor que, ao fazer o repasto sanguíneo, suga o parasito juntamente com o

sangue do animal e a partir de então o parasito modifica sua forma para a forma infectante.

Figura 2 – Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi, passando pelo hospedeiro intermediário efinal.

Fonte: Adaptado do site do CDC2, 2019.

Estando na forma infectante dentro do inseto, o parasito aguarda o inseto defecar ao

passo em o mesmo faz o repasto sanguíneo, podendo em animais silvestres ou em humanos, e

o ato de esfregar a ferida causada pelo inseto por parte do animal, acaba por inserir o parasito

na corrente sanguínea. O parasito então se multiplica nas células do hospedeiro final e pode

2 - Disponível em: <Adaptado de: <https://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.htm>. Acesso em 13 Fevereiro2020.

19

ser novamente ingerido pelo inseto vetor em um novo repasto sanguíneo (COURA; DE

CASTRO, 2002; TEIXEIRA, 2006; SIQUEIRA-BATISTA et al., 2008; RASSI JR; RASSI;

MARIN-NETO, 2010; PITA; PASCUTTI, 2011;).

2.3 FASES DA DOENÇA DE CHAGAS

2.3.1 Fase aguda

A fase aguda é caracterizada pelo período que compreende desde o momento da

entrada do parasito na corrente sanguínea do hospedeiro até cerca de 3 a 4 meses (TEIXEIRA

et al., 2006), possuindo o sangue uma alta carga parasitária que pode ser diagnóstico pelo

exame direto do sangue periférico (MENDES; SILVA; MARTINS, 2017; ).

A fase aguda pode ser sintomática ou assintomática. Quando a fase aguda for

sintomática, os sintomas decorrentes da infecção com o parasito aparecerão após 8 a 10 dias e

incluem o Sinal de Romanã, febre, astenia, inapetência e cefaleia, podendo os sintomas

desaparecerem dentro de 4 a 8 semanas (SIMIONI et al., 2019). Após esse período, o paciente

continua apresentando positividade sorológica mas sem apresentar sintomas, entrando no

período indeterminado da doença (RASSI JR; RASSI; DE REZENDE, 2012).

2.3.2 Fase crônica

A fase crônica, assim como a aguda, pode ser dividida de acordo com a presença ou

não de sintomas em sintomática ou assintomática (também chamada de indeterminada),

respectivamente (JUNIOR et al., 2017). Quando o paciente sai da forma aguda para a forma

crônica, significa que o parasito já saiu da corrente sanguínea e migrou pra os músculos,

principalmente cardíacos e digestivos (TORRES et al., 2017).

Inicialmente o parasito se instala nos músculos e o paciente entra na forma

indeterminada ou assintomática da doença, na qual o parasito fica em uma forma latente onde

não provoca sintomas, e cerca de 20% a 40% dos pacientes podem entrar posteriormente na

forma sintomática, onde há o desenvolvimento de doenças cardíacas e digestivas

(DUMONTEIL; HERRERA, 2017).

2.4 TRATAMENTOS PARA A DOENÇA DE CHAGAS

20

O tratamento da doença pode ser realizado com dois medicamentos, o nifurtimox e o

benzonidazol. O nifurtimox teve sua comercialização descontinuada desde 1980 no Brasil,

Argentina, Chile e Uruguai devido aos seus efeitos colaterais mais severos (COURA; DE

CASTRO, 2002; FONSÊCA et al., 2018) e o Benzonidazol, que possui uma maior

tolerabilidade, penetração tecidual e possível maior eficácia, é a primeira opção de tratamento

(PÉREZ-MOLINA; NORMAN; LÓPEZ-VÉLEZ, 2012; FERREIRA et al., 2019).

2.4.1 Benzonidazol

O mecanismo de ação do benzonidazol está associado a sua catálise pelas enzimas

nitroredutases tripanosomais tipo I (Figura 3), onde a ausência dessa enzima foi relacionada a

resistência dos parasitos a droga (HALL; WILKINSON, 2012; KEENAN et al., 2015). A

presença com a capacidade de gerar radicais livre ou compostos eletrofílicos que causam

danos celulares no parasito, causando a inibição da síntese de RNA e proteínas (POLAK E

RICHLE, 1978). Algumas reações adversas do medicamento incluem de reações de

hipersensibilidade, anorexia e perda de peso, náusea, neuropatia periférica e depressão da

medula óssea (BERN, 2015).

21

Figura 3 - O papel da glutationa e tripanotiona na ação e metabolismo da droga antichagásica

nifurtimox e benzonidazol. O grupo nitro de ambas drogas chagásicas são reduzidos para

radicais livres ou metabólitos eletrofílicos pelas nitroredutases relacionadas ao citocromo

P450 do T. cruzi. Os radicais livres derivados do nifurtimox talvez passe por um ciclo redox

com o oxigênio e há a produção de H2O2 e a posterior ação da superóxido dismutase (SOD).

O oxigênio produzido a partir dos radicais livres e metabólitos eletrofílicos liga-se a

macromoléculas intracelulares causando danos a elas. No parasita, tripanotiona (T(SH)2) e

glutationa (GSH) neutralizam os metabólitos derivados do nifurtimox e benzonidazol por

conjugação, produzindo drogas-tiol conjugadas que irão ser posteriormente metabolizadas a

mercapturatos nas células mamíferas. Radicais livres são neutralizados por oxidação da GSH

ou T(SH)2 reduzida. A tripanotiona redutase (EC 1.8.1.12) reduz a tripanotiona oxidada

(T(S)2).

Fonte: adaptado de Maya et al., 2007.

2.4.2 Nifurtimox

No mecanismo de ação do nifurtimox, um derivado do nitrofurano, há produção de

radicais livres (Figura 3), que reagem com as estruturam celulares e as modificam

(OLIVEIRA et al., 2008). O nifurtimox parece agir principalmente através do metabolismo de

uma espécie de trinitrila reativa e diferentes linhagens de T. cruzi mostram diferenças

significativas na suscetibilidade, possivelmente por causa da variação dos níveis de expressão

de enzimas nitroredutases necessárias para ativação (BARRET; CROFT, 2012). Os efeitos

22

adversos do nifurtimox incluem efeitos gastrointestinais como anorexia, perda de peso, náusea

e vômito em 70% dos pacientes, podendo também haver efeitos neurotóxicos como

irritabilidade, insônia, desorientação, tremores e até casos mais graves e raros com neuropatia

periférica (BERN, 2015).

Apesar da boa eficiência relatada na fase aguda, o tratamento de pacientes em estado

crônico fornece poucas chances de cura e, no Brasil, predominam casos crônicos de

tripanossomíase decorrentes de infecções via vetor (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015), sendo

até mesmo considerada a doença que mais gera custo econômico na América Latina devido a

sua cronicidade e os sintomas relacionados a essa fase da doença (FERNANDES et al., 2018).

2.5 O REPOSICIONAMENTO DE FÁRMACOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS

O reposicionamento de fármacos é uma estratégia de desenvolvimento que requer

menos tempo para venda no mercado, passando em média de 10-17 anos para 3-12 anos para

ser liberado, assim como possui menos riscos quando comparado a uma droga recém-

descoberta pelo fato dos fármacos reposicionados já serem conhecidos devido aos testes

clínicos realizados para a criação de um medicamento desenvolvido do início (ASHBURN;

THOR, 2004; HURLE et al., 2013). Alguns fármacos reposicionados com sucesso incluem

Celecoxib, antes utilizado no tratamento de osteoartrite e agora para câncer de mama

(HUANG et al., 2017; LI et al., 2018), anfotericina B que era usada contra infecções fúngicas

e foi reposicionada para leishmaniose visceral e mucocutânea (YARDLEY; CROFT, 1997),

além de outros (Quadro 1).

23

Quadro 1 – Drogas como o Celecoxib, Eflornitina e Finasteride são exemplos de drogasreposicionadas.

Genérico

(mecanismo de ação)

Indicação original

(nome comercial;

criador)

Nova indicação

(nome comercial;

reposicionador)

Celecoxib

(inibição da cicloxigenase-2)

Osteoartrite e artrite

reumatoide adulta

(Celebrex. Pfizer)

Polipose adenomatosa

familiar, cólon e

câncer de mama

(Celebrex; Pfizer)

Eflornitina

(inibição da ornitina

descarboxilase)

Anti-infeccionso

(Não aplicável; Bristol-

Myers Squibb)

Redução de cabelos

faciais indesejados

(Vaniga; Women First

HeathCare)

Finasteride

(inibição da 5-α-redutase)

Hiperplasia prostática

benigna

(Proscar, Merck)

Queda de cabelo

(Propecia; Merck)

Fonte: Adaptado de Ashburn & Thor, 2004.

Dos métodos empregados para o descobrimento de possíveis fármacos em um banco

de dados de moléculas e a sua forma de interação com o ligante estão o docking e a realização

da dinâmica molecular (TROTT; OLSON, 2010; SEELIGER; DE GROOT, 2010). Os

receptores macromoleculares utilizados nas simulações com as drogas candidatas são

oriundos principalmente de métodos experimentais e de modelagem computacional por

homologia (MANDAL; MOUDGIL; MANDAL, 2009).

2.6 FEBRIFUGINA E A TRIPANOTIONA REDUTASE

A febrifugina (Figura 4) é um composto alcaloide extraído da planta Dichroa febrífuga

Lour e Hydrangea umbellata Rehder e usado a mais de 2 mil anos na China, no tratamento

da malária (KELLER et al., 2012). Por ter sido usada por muito tempo pela medicina

tradicional chinesa, o fármaco se torna interessante de ser estudado pelo fato do parasito

Plasmodium sp. não ser relatado como resistente contra essa molécula e possuir um rápido

efeito após administrado (ZHU et al., 2012; TAKAYA et al., 1999). Como razões para o

desuso dessa molécula, está a existência de efeitos colaterais como vômitos e danos ao trato

24

gastrointestinal e fígado e a incapacidade de impedir o recrudescimento do parasito após

cessar o tratamento, mesmo que tenha sido observado que em camundongos, após o

recrudescimento, uma recuperação dos camundongos e eliminação do parasito, dispensando o

tratamento (JIANG et al., 2005). Para superar os problemas enfrentados pelo composto

natural, foram desenvolvidos derivados com melhor ou igual capacidade antiparasitária a da

febrifugina ao passo que reduziria os efeitos colaterais da molécula no hospedeiro (ZHU et al.,

2006).

Figura 4 - Estrutura 2D da febrifugina com a numeração posicional dos átomos de suamolécula.

Fonte: Adaptado de ZHU et al., 2006.

Por estar ausente em humanos, a tripanotiona redutase (TR) mostrou-se um possível

alvo para atuação de fármacos inibidores (MEIERING, 2005). Estudos realizados por Dumas

e colaboradores (1997), silenciaram o gene da tripanotiona redutase em L. donovani e L.

major, e revelaram que tanto a infectividade quanto a capacidade de sobrevivência dentro de

macrófagos do parasito foram atenuadas. Krieger e colaboradores (2000) realizaram o mesmo

experimento com T. brucei deficiente em TR e foi observado que o parasito se tornou mais

sensível ao estresse oxidativo e que sua infectividade foi atenuada.

No estudo de Pandey e colaboradores (2017), foram realizados testes in silico com

uma série de análogos da febrifugina contra a enzima tripanotiona redutase de L. donovani. O

estudo observou que, o derivado FFG13 era um possível inibidor da TR e que possuía baixa

toxicidade quando comparado a clomipramina, uma droga usada como um inibidor de

referência para a TR.

25

3. OBJETIVOS DA PESQUISA

3.1 OBJETIVO GERAL

Verificar a presença de atividade antiparasitária in silico e/ou in vitro da febrifugina

contra Trypanosoma cruzi.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Observar e registrar in silico os mecanismos de interação da febrifugina com a

enzima tripanotiona redutase de T. cruzi;

• Testar in vitro se há efeito na viabilidade parasitária pela aplicação da febrifugina em

T. cruzi.

26

4. MATERIALE MÉTODOS

4.1 OBTENÇÃO DOS FÁRMACOS

O benzonidazol foi fornecido pelo Laboratório de Engenharia Genética, Genômica e

Proteômica (LEGPRO) da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA) e a

febrifugina foi adquirida a partir do site da Sigma-Aldrich Brasil Lmtd.

(https://www.sigmaaldrich.com/brazil.html). Soluções estoque de 10 mM foram preparadas

para ambos os fármacos e foram usadas para obter as diluições do ensaio in vitro.

4.2 CULTIVO E MANUTENÇÃO DOS PARASITOS

As culturas de cepas Y de Trypanosoma cruzi oriundas de xenodiagnóstico do trabalho

de Ribeiro (2010) foram gentilmente cedidas para este trabalho e foram mantidas com meio

LIT (Liver Infusion Tryptose) em tubos graduados do tipo Falcon com capacidade para 50 mL.

O meio de cultura foi mantido com suplemento de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 10 mL

de antibiótico formado por penicilina/estreptomicina 100 U/mL (CAMARO et al., 1964;

RIBEIRO, 2010).

A manutenção e repique da cultura foi realizada quinzenalmente e visou manter os

parasitos em fase log (exponencial ou de crescimento), ideais para execução do experimento e

aplicação do tratamento.

4.3 ESTUDOS IN SILICO DAESTRUTURAE DOCKING

Para realizar a montagem in silico da estrutura tridimensional proteica da tripanotiona

redutase foi utilizada como base a estrutura proteica depositada no PDB (Protein Data Bank -

https://www.rcsb.org/).

A estrutura da tripanotiona redutase foi recuperada do banco de dados do PDB com o

código 1AOG (https://www.rcsb.org/structure/1AOG). A TR de T. cruzi usada nesse estudo é

um homodímero constituído de 966 aminoácidos. Para a realização do docking, foram

removidos os íons, ligantes e a água presente na estrutura cristalizada. Com a estrutura da

proteína contendo apenas os aminoácidos, foi então realizado o docking da febrifugina com a

mesma através do uso do programa AutoDock Vina (TROTT et al., 2010) e UCSF

27

CHIMERA v.1.1.4 (PETTERSEN et al., 2004) e as imagens em 2D foram construídas

utilizando o software LigPlot v4.5.3 (WALLACE et al., 1995).

Os detalhes da caixa utilizada para o docking da febrifugina podem ser visualizados

no Quadro 2 e tomou como base os estudos de Pandey et al. (2017) e Verma et al. (2012), o

qual afirma haver um sítio de ligação na interface das cadeias A e B da tripanotiona redutase

do parasito Leishmania donovani.

Quadro 2 - Parâmetros da caixa de docking da febrifugina usados no programa UCSF

Chimera. Os centros correspondem à posição do ponto central da caixa no momento inicial e

o diâmetro diz respeito aos limites de movimentação da febrifugina dentro da caixa.

Centro X Centro Y Centro Z

56.749 1.613 2.28

Diâmetro X (Å) Diâmetro Y (Å) Diâmetro Z (Å)

22.5 22.5 22.5

Fonte: acervo do autor

4.4 DINÂMICAMOLECULAR

As simulações de dinâmica molecular foram realizadas com o auxílio do programa

software GROMACS 2018 (PRONK et al., 2013) em campo de força GROMOS 54A7

(SCHMID et al., 2011). Além disso, serão aplicadas a pressão constante de 1 bar e

temperatura de 300 K. O método PME (Particle Mesh Ewald) será levado em consideração,

pois ele visa limitar as interações eletrostáticas de longo alcance para estabelecer um ponto de

corte de 1,2 nanômetros. Interações de Coulomb e van der Waals serão mantidas em 1,0

nanômetros para um limite de curto alcance. As simulações serão conduzidas em caixa cúbica,

contendo água e íons para equilibrar as cargas. A topologia do ligante febrifugina foi gerada a

partir do servidor Automated force field Topology Builder (MALDE et al., 2011). Para

realizar as simulações, os supercomputadores do Centro Nacional de Processamento de Alto

Desempenho de São Paulo (CENAPAD-SP) foram utilizados.

Os parâmetros moleculares são definidos pelas informações geradas na dinâmica

molecular e são responsáveis por definir o comportamento da proteína e do ligante ao longo

do tempo (VAN GUNSTEREN et al., 2018). A movimentação geral das proteínas será

analisada principalmente pelos seguintes dados: RMSD (Root Mean Square Deviation ou

Raiz do Desvio Quadrático Médio), onde será realizada a comparação da estrutura final à

28

estrutura de partida, calculando a média de movimentação do conjunto de átomos; RMFD

(Root Mean Square Flutuation ou Raiz da Flutuação Quadrática Média) que calcula o valor

médio de movimentação para cada átomo, não dependendo da geometria molecular de partida,

dessa forma, descreve a variação da posição dos átomos durante a Simulação e indicará a

flexibilidade do sistema; Raio de Giro (Radius of Gyration), que realizará uma medida

indireta da densidade proteica; Pontes de hidrogênio (Hbonds), cuja função será verificar a

formação ou rompimento de pontes de hidrogênio entre os aminoácidos. As análises serão

padronizadas à quantificação em 100 nanossegundos e poderão ser visualizadas com o

software Visual Molecular Dynamics (VMD) (HUMPHREY et al., 1996).

4.5 TRATAMENTO IN VITRO COMA FEBRIFUGINA

Para a análise do efeito in vitro da febrifugina sobre o parasito T. cruzi, os tratamentos

foram estruturados três grupos: (1) um grupo controle negativo, onde não havia a presença de

nenhum tratamento, apenas a diluição do parasito em meio LIT (Liver Infusion Tryptose)

numa proporção de 1x10-E6 para a contagem de parasitos viáveis em microscópio de campo

claro; (2) o segundo grupo consistiu em um controle positivo, neste caso o Benzonidazol, em

cinco concentrações (1 mM; 500 μM; 250 μM; 125 μM e 62,5 μM) e, por fim; (3) o

tratamento realizado com febrifugina, aplicado nas mesmas concentrações do benzonidazol.

As contagens foram efetuadas em câmara de Neubauer espelhada com o auxílio de um

microscópio óptico de campo claro, sendo que para o tratamento com febrifugina foram

efetuadas contagens em dois momentos, inicialmente após 24 horas juntamente com o

benzonidazol e posteriormente após 48 horas para verificar um possível efeito ao longo do

tempo, sendo contabilizados apenas os parasitos viáveis (que exibem movimentação mínima).

4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram incluídos

em planilhas eletrônicas e gráficos. Os dados foram submetidos ao programa PAST (v. 3.22)3

para realização do teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Para dados paramétricos, seria

aplicado o teste ANOVA associado ao pós-teste T de Tukey aos dados; caso fossem não-

paramétricos, serria aplicado o Teste de Kruskal-Wallis associado ao teste de Mann-Whitney.

Todos os dados foram analisados considerando o nível de significância igual a 5% (α=0,05).

3 Disponível em: <https://folk.uio.no/ohammer/past/>. Acesso em 14 Fevereiro 2020.

29

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 DOCKING E DINÂMICA MOLECULAR DA FEBRIFUGINA COM A

TRIPANOTIONA REDUTASE

O resultado do docking da febrifugina com a tripanotiona reductase gerou 9

conformações, sendo a escolhida para a simulação a que possuísse menor energia potencial

quando ligada à proteína e possuísse uma conformação que interagisse com os aminoácidos já

relatados na literatura para essa molécula (JIANG et al., 2019), resultando na escolha do

modelo 1 (Figura 5). O modelo apresentou uma baixa energia de afinidade (Quadro 1), assim

como também interagia com os resíduos esperados a uma distância de até 4 Å (Figura 6), que

seriam Val-59, Lys-62, Leu-63 da cadeia B e Phe-396, Pro-398, Leu-399, Met-400, His-461,

Pro-462, Thr-463, Glu-466 e Glu-467, comparável a de outros ligantes obtidos no estudo de

Verma e colaboradores (2012) e Meiering e colaboradores (2005). Então esse modelo

prosseguiu para o uso na a próxima etapa que seria a execução da dinâmica molecular.

Quadro 3 - Quadro com conformações de docking rígido para a febrifugina com a

tripanotiona redutase, indicando os modelos e suas respectivas energias de ligação (em

kcal/mol), sendo a conformação 1 a escolhida para a dinâmica molecular (-7,4 kcal/mol).

Modelo Afinidade (kcal/mol)

1 -7.4

2 -7.3

3 -7.2

4 -7.1

5 -7.1

6 -7.1

7 -7.0

8 -7.0

9 -7.0

Fonte: acervo do autor.

30

Figura 5 - Imagem representativa do docking gerado pelo programa AutoDock Vina no

UCSF Chimera para todas as conformações obtidas da febrifugina na interface do dímero da

tripanotiona redutase. A cadeia A está em verde e a cadeia B em azul.


Figura 6 - Representação em 2D dos sítios de interação da febrifugina (FFG) com a interface

da cadeia AB da tripanotiona redutase realizada pelo software Ligplot. Os carbonos estão

coloridos em preto, os nitrogênios em azul e os oxigênios em vermelho na forma de esferas.

As ligações de hidrogênio são linhas tracejadas verdes. O semicírculos vermelhos com raios

radiantes representa interações hidrofóbicas entre resíduos de ligantes e não-ligantes.


31

O objetivo do estudo da dinâmica ou simulação molecular foi avaliar o comportamento

da febrifugina ao longo de 100 nanossegundos após submetida à interação com a enzima TR

partindo da posição obtida pelo docking. Para a avaliação da interação, foram obtidos o

RMSD das duas cadeias (A e B) e do conjunto proteico com e sem FFG e do monômero

(Figura 7), o RMSD do sítio de ligação presente no dímero da TR (Figura 8), o RMSD da

FFG quando ligada ao sítio de ligação (Figura 9), a distância mínima de interação entre o sítio

de ligação e o ligante (Figura 10), o RMSF das duas cadeias com e sem FFG e do monômero

(Figura 12), o raio de giro das proteínas (Figura 13), e o número de pontes de hidrogênio

existentes nas estruturas proteicas (Figura 14).

A avaliação do RMSF para as estruturas monoméricas, diméricas sem ligante e

diméricas com ligante podem ser vistas na figura 12. Constatou-se que a estrutura dimérica

com o ligante adquiriu estabilidade com o tempo, enquanto que a estrutura sem a FFG

apresentou baixa variação no RMSD, indicando maior estabilidade.

32

Figura 7 - Análise do RMSD da estrutura proteica da TR através das cadeias separadas, da

estrutura completa e do monômero da cadeia A. Em A) tem-se representado o RMSD da

cadeia A da TR ligada a FFG; em B) tem-se representado o RMSD da cadeia B da TR sem

estar ligada a FFG; em C) tem-se representado o RMSD da cadeia B da TR ligada a FFG; em

D) tem-se representado o RMSD da cadeia B da TR sem estar ligada a FFG; em E) tem-se

representado o RMSD apenas do dímero proteico quanto ligado a FFG; em F) tem-se

representado o RMSD apenas do dímero proteico quando não ligado a FFG; em G) tem-se

representado o RMSD do monômero da cadeia A da TR.


33

Ao averiguar o RMSD dos resíduos que compões o sítio de ligação observado na

figura 6, pode-se observar um relativo incremento na estabilidade deles quando se encontram

ligados a FFG após decorridos 90 nanossegundos após o início da simulação (Figura 8).

Outros indícios da obtenção da estabilidade entre a FFG e o sítio de ligação podes ser

observados na figura 9 e 10, onde após decorridos aproximadamente 55 nanossegundos, o

RMSD da FFG reduziu-se drasticamente e a distância existente entre a FFG e o seu sítio de

ligação, demonstrando uma maior estabilidade da mesma no sítio de ligação estudado. A

figura 11 representa as posições obtidas para a FFG nos momentos iniciais, no início da

redução do RMSD observado na figura 9, no final do decréscimo do RMSD e depois da

molécula se estabilizar aos 95 nanossegundos. É perceptível que no instante após o início da

simulação houve uma mudança do aminoácido com o qual a FFG fazia uma ponte de

hidrogênio, trocando a Leu-399 (A) pela Glu-467 (A), ocorrendo a partir do nanossegundo

62,5 o encontro de uma posição mais estável e interna ao sítio de ligação, havendo a quebra

da ligação de hidrogênio no segundo 77,5 e sua reposição com o consequente escaixamento

estrutural da FFG no sítio de ligação (Figura 11).

Figura 8 - Análise do RMSD do sítio de ligação da TR ao longo de 100 nanossegundos. Em

A) está representado o RMSD dos resíduos que compõem o sítio de ligação quando ligados a

FFG e em B) está representado o RMSD dos resíduos sem estarem ligados a FFG.


34

Figura 9 - Análise do RMSD da FFG quando ligada no sítio de ligação da TR ao longo de

100 nanossegundos.


Figura 10 - Análise da distância mínima entre a FFG e os resíduos do sítio de ligação ao

longo de 100 nanossegundos.


35

Figura 11 - Estrutura do sítio de ligação da FFG nos momentos de ligação A) 25

nanossegundos, B) 62,5 nanossegundos, C) 77,5 nanossegundos e D) 95 nanossegundos.


O RMSF, por representar de modo geral a variação na posição de cada átomo ou

resíduo da macromolécula, foi calculado com o intuito de identificar possíveis regiões com

altas variações médias em suas posições ao longo do tempo. Grandes variações foram

encontradas entre o monômero e o dímero, explicável por sua instabilidade ser devido a seu

funcionamento só ocorrer na forma de dímero. Já entre entre as cadeias com e sem a FFG, foi

possível observar algumas diferenças pontuais entre os resíduos componentes de ambas as

cadeias do dímero, sendo a FFG responsável por provocar uma variação na posição dos

resíduos da TR (Figura 12).

36

Figura 12 - Análise do RMSF da estrutura proteica da TR através das cadeias separadas, da

estrutura completa e do monômero da cadeia A. Em A) tem-se representado o RMSF da

cadeia A da TR ligada a FFG; em B) tem-se representado o RMSF da cadeia B da TR sem

estar ligada a FFG; em C) tem-se representado o RMSF da cadeia B da TR ligada a FFG; em

D) tem-se representado o RMSF da cadeia B da TR sem estar ligada a FFG; em E) tem-se

representado o RMSF do monômero da cadeia A da TR.


A avaliação do raio de giro tem sua importância dada ao potencial de avaliar a

compactação da proteína ao longo do tempo, ao passo que caso haja alterações muito bruscas,

será um forte indício de que a proteína esteja desenovelando ou fora de seu estado nativo

(XIANG et al., 2016). Dado o exposto, não foram observadas mudanças drásticas na

37

compactação proteica entre os dímeros, mantendo-se a proteína como um todo estável após os

20 primeiros nanossegundos (Figura 13). As pontes de hidrogênio presentes na estrutura

proteica também aparentaram existir em quantidades semelhantes entre os dímeros com e sem

FFG, diferindo esses apenas do monômero devido ao mesmo possuir apenas metade dos

aminoácidos do dímero (Figura 14).

Figura 13 - Análise do raio de giro (Rg) do dímero com e sem FFG e do monômero da cadeia

A da TR ao longo de 100 nanossegundos. Em A) está representada a variação do raio de giro

para o dímero da TR ligada a FFG; em B está representada a variação do raio de giro para o

dímero da TR sem estar ligada a FFG; e em C) está representada a variação do raio de giro

para o monômero da cadeia A da TR.


38

Figura 14 - Número de pontes de hidrogênio presentes nas estruturas proteicas do A) dímero

da TR com FFG, B) dímero da TR sem FFG e do C) monômero da cadeia A da TR, ao longo

de 100 nanossegundos.


5.2 VIABILIDADE PARASITÁRIA

Após a aplicação do fármaco e a contagem passadas 24 horas para a febrifugina e o

benzonidazol e após 48 horas apenas para a febrifugina, foram obtidos os números de

parasitos em média para cada tratamento e concentração que estão representados no Gráfico 1.

Observou-se que de modo geral que a febrifugina não mostrou qualquer atividade

antiparasitária ao longo de 24 horas, não apresentando diferença significativa entre as

diferentes concentrações testadas, e no dia 2 foi possível observar diferença significativa nas

concentrações de 500 μM e 62,5 μM em relação ao grupo controle (Gráfico 1), o qual poderia

39

ser um indício de efeito inibitório sobre a reprodução dos parasitos, pois é possível observar

que a febrifugina no dia 1 não afetou a sobrevivência dos parasitos mas no dia 2 a quantidade

de parasitos no grupo controle aumentou em cerca de 90% e a das concentrações de 500 μM e

62,5 μM permaneceram constantes em relação ao dia 1 (Gráfico 2).

Gráfico 1 - Análise da contagem de parasitos viáveis apenas para o mesmo tratamento nas

diferentes concentrações aplicadas no teste de viabilidade parasitária in vitro após 1 dia para a

febrifugina (FFG) e o benzonidazol (BNZ), e 2 dias (somente para a febrifugina) de aplicação

do fármaco. Barra de erros acima do gráfico indicam o desvio padrão. Letras diferentes

indicam significância estatística para o mesmo fármaco (mesma cor) em diferentes

concentrações (p<0,05) calculada pela ANOVA one way associada ao pós-teste de Tukey (α =

0,05).


40

Gráfico 2 - Análise da contagem de parasitos viáveis apenas dentro da concentração estudada

para os diferentes tratamentos no teste de viabilidade parasitária in vitro após 1 dia para a

febrifugina (FFG) e o benzonidazol (BNZ) e 2 dias (somente para a febrifugina) de aplicação

do fármaco. Barra de erros acima do gráfico indicam o desvio padrão. Letras diferentes

indicam significância estatística dentro da mesma concentração (p<0,05) calculada pela

ANOVA one way associada ao pós-teste de Tukey (α = 0,05).


Por meio da análise estatística, foi possível avaliar se há diferença entre os tratamentos

dentro de cada concentração (Gráfico 1). Constatou-se que após o primeiro dia, o tratamento

com febrifugina manteve-se igual ao com benzonidazol nas concentrações de 62,5 μM e 125

μM. Nas concentrações de 250 μM, 500 μM e 1 mM, o benzonidazol apresentou uma maior

taxa de mortalidade que a FFG em ambos os dias de contagem, sendo o benzonidazol, na

concentração de 1 mM, capaz de eliminar aproximadamente 98% dos parasitos (Gráfico 3).

41

Gráfico 3 - Porcentagem de sobrevivência parasitária aproximada para as diferentes

concentrações e tratamentos testados. Cada valor de porcentagem de cada tratamento tomou

como base a média do número de parasitas sobreviventes para dada concentração dividido

pela média do seu controle negativo correspondente. FFG = Febrifugina e BNZ =

Benzonidazol.


Ao analisar a diferença entre o efeito da febrifugina e o do benzonidazol, é importante

ressaltar que o mecanismo de ação do benzonidazol é conhecido pelo aumento de metabólitos

eletrofílicos pelas nitroredutases do tipo I do parasito que reagem com as macromoléculas

celulares, como proteínas e ácidos nucleicos, causando a quebra de duplas fitas de DNA e

danos ao RNA (WILKINSON et al., 2008; RAJÃO et al., 2014). Já o mecanismo de ação da

febrifugina é conhecido pelo efeito antiparasitário decorrente da existência estrutural do anel

na porção 4-quinazolinona, o nitrogênio do anel de piperidina e o grupo hidroxila (CHIEN;

CHENG, 1970; FISHMAN; CRUICKSHANK, 1970).

Dado o exposto, com os resultados obtidos in silico é comprovada a existência de

afinidade e estabilidade da febrifugina com o sítio de ligação da TR. Já através dos resultados

in vitro é possível confirmar uma relação inibitória do crescimento do parasito após 48 horas

quando a FFG é aplicada, podendo se dar pela interação com a enzima TR, como apresentado

nesse estudo.

42

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Através dos estudos in silico foi possível observar que a interação entre a febrifugina e

a tripanotiona redutase apresenta-se como uma ligação estável, porém os testes in vitro

apontaram uma eficiência inferior quando comparado ao tratamento convencional com

benzonidazol. Foi observado que apenas após 48 horas da aplicação da febrifugina, duas das

cinco concentrações testadas, 62,5 μM e 500 μM, foram capazes de exercer um efeito

inibitório sobre o parasita. Dessa forma, conclui-se que a febrifugina possui efeito inibitório

sobre a sobrevivência parasitária, embora inferior ao benzonidazol, e que in silico há a

formação de ligações estáveis entre esse ligante e a enzima TR em seu sítio de ligação na

interface entre as cadeias A e B. Tal fato indica que são necessários estudos in silico e in vitro

para validar o reposicionamento de um fármaco, logo os resultados obtidos.

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REFERÊNCIAS

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