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UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP

PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL

Modulação da resposta inflamatória por preparações

homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na

leishmaniose experimental murina

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação

em Patologia Ambiental e Experimental da

Universidade Paulista – UNIP para obtenção do título de

mestre em Patologia Ambiental e Experimental.

FABIANA RODRIGUES DE SANTANA

SÃO PAULO

2013

UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP

PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL







mestre em Patologia Ambiental e Experimental, sob

orientação da Profa. Dra. Leoni Villano Bonamin


SÃO PAULO

2013

Santana, Fabiana Rodrigues de.

Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopática

de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina /

Fabiana Rodrigues de Santana - 2013.

59 f. : il. color. + CD-ROM.

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista, São Paulo,

2013.

Área de Concentração: Patologia Experimental.

Orientadora: Profª. Dra. Leoni Villano Bonamin.

1. Leishmania (L) amazonensis. 2. Timulina. 3. Antimonium crudum.

4. Homeopatia. 5. Modelo experimental. I. Título. II. Bonamin, Leoni

(orientadora).








mestre em Patologia Ambiental e Experimental.

Aprovada em:

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________ ___/___/___/

Professora Dra. Leoni Villano Bonamin

_________________________________________________ ___/___/___/

Professora Dra. Cidéli Coelho

_________________________________________________ ___/___/___/

Professora Dra. Anete Lallo

DEDICATÓRIA

À minha família, pela dedicação excepcional e apoio em todos os momentos.

Aos meus pais, Esperança e João, e à minha irmã Carla, a minha base.

À minha tia Lourdes e à minha prima Priscila, pelo auxílio em tudo.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Prof. Dra. Leoni Villano Bonamin, pela oportunidade e ricos

ensinamentos como profissional e ser humano.

À Prof. Dra. Elisabeth Cristina Perez Hurtado, pelo aprendizado e dedicação com as

técnicas de citometria de fluxo no Laboratório de Imunologia da Unifesp.

À Prof. Dra. Márcia Dalastra Laurenti, pela oportunidade de estágio no Laboratório de

Patologia de Moléstias Infecciosas (LIM-50) do Departamento de Patologia da FMUSP,

contribuindo com seu amplo conhecimento na área de leishmanioses.

À Universidade Paulista, por colocar à disposição o laboratório e apoio financeiro

fornecido pela CAPES-PROSPUP em todo o período do mestrado, além de apoio financeiro

da Fapesp.

Aos funcionários do laboratório de Biologia Molecular da UNIP, pelo incondicional

apoio e amizade: Ph. D. Fabiana Toshie de Camargo Konno, Suzana Bezerra e Cleide

Santana. Aos funcionários do biotério, Wilton Pereira dos Santos, Michelle Sanchez e

Claudemir Duran. Além dos funcionários de limpeza e portaria, especialmente à Marlene

Maria de Jesus.

Aos colegas do curso de mestrado: Renata Iovine, Tatiana Paixão, Ana Lúcia

Aldrovandi, Maria Flávia Guerra e Andreza Santos. À Cidéli Coelho, pela colaboração neste

projeto. Enfim, a todos os que auxiliaram de alguma maneira o meu aprendizado profissional

e pessoal.

RESUMO

A leishmaniose é uma zoonose causada por protozoários intracelulares do sistema

fagocítico mononuclear. A modulação da atividade dessas células pode impactar a relação

hospedeiro/parasita e o prognóstico da doença. O presente trabalho avaliou a atividade dos

medicamentos homeopáticos Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH na infecção

experimental por Leishmania (L.) amazonensis. Camundongos Balb/c, machos, foram

inoculados com 2x106 promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no coxim plantar e,

após 60 dias, foi feita a análise de citometria de fluxo das células do lavado peritoneal e do

baço, além da colheita da pata com lesão, do linfonodo local e do baço, para análise

histológica. Camundongos tratados com Timulina 5 cH apresentaram aumento de células B-1

no peritôneo e baço (X2, p=0.0001). Além disso, observando-se as lesões plantares coradas

pelo método Giemsa, a quantidade de formas amastigotas diminuiu nos animais tratados com

Timulina 5 cH. No grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH houve redução da resposta

inflamatória local, evidenciada histologicamente, sem alteração no número de parasitas na

lesão. A imuno-histoquímica seguida de histometria do coxim plantar evidenciou redução de

células CD3+, C45RA+ e CD11b+ nesses animais. Portanto, os medicamentos homeopáticos

Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH alteram o perfil de células inflamatórias

envolvidas na resposta cutânea à Leishmania sp., interferindo na relação hospedeiro/parasita

por mecanismos distintos, ora modulando a resposta imune, ora reduzindo a inflamação local

e os sintomas da doença.

Palavras-chave: Leishmania (L.) amazonensis, Timulina, Antimonium crudum, homeopatia,

modelo experimental.

ABSTRACT

Leishmaniasis is a zoonosis caused by an intracellular protozoan that invades the

mononuclear phagocytic system, modulating the activity of these cells, causing impact in the

host/parasite relation and in disease prognosis. This study evaluated the activity of

homeopathic medicines Thymulin 5 cH and Antimonium crudum 30 cH on Leishmania (L.)

amazonensis experimental infection. Balb/c mice were inoculated with 2x106 promastigotes

of Leishmania (L.) amazonensis in the footpad and after 60 days. A flow cytometric analysis

of peritoneal fluid and spleen was made. The footpad with injury, the local lymph node and

the spleen were harvested for histological analysis. Thymulin 5 cH-treated mice showed

increased B-1 cells in the peritoneum and spleen (X2, p=0.0001). Furthermore, observing the

plantar lesions stained with Giemsa, the number of amastigotes in treated animals decreased

after Thymulin 5 cH treatment. The treatment with Antimonium crudum 30 cH reduced local

inflammatory response, as evidenced histologically, and no change in the parasite number of

local lesion. Immunohistochemistry followed by histometry the footpad showed reduction of

CD3+, C45RA+ and CD11b+ these animals. Therefore, homeopathic Thymulin 5 cH and

Antimonium crudum 30 cH alter the inflammatory cells profile involved in the cutaneous

response to Leishmania sp., modulating the host/parasite relation by different mechanisms,

either by increasing the immune response against the parasite, or reducing local inflammation

and disease symptoms.

Keywords: Leishmania (L.) amazonensis, Thymulin, Antimonium crudum, homeopathy,

experimental model.

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Marcadores utilizados na imuno-histoquímica ...................................................... 24

Quadro 2 - Fotomicrografias representando cortes histológicos de patas coradas com

hematoxilina/eosina em camundongos, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.)

amazonensis. Objetiva de 10X. ................................................................................................ 40

Quadro 3 - Fotomicrografias evidenciando macrófagos com citoplasma vacuolizado marcados

com anti-CD11b, após 60 dias de inoculação de Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva

10X. .......................................................................................................................................... 44

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Gráfico de dispersão obtido pelo programa flow-jo 7.6.5 para demonstração dos

diferentes gates e suas populações, a partir dos procedimentos de citometria de fluxo. Na

figura 1A tem-se a população celular do peritônio, e na figura 1B a população celular do baço,

definida em dois gates distintos denominados “linfócitos” e “linfócitos ativados”. Essas

populações foram analisadas 60 dias após a infecção experimental com Leishmania (L.)

amazonensis. ............................................................................................................................. 27

Figura 2 - Aspecto ulcerado de lesão em pata de camundongo, após 60 dias de inoculação

com Leishmania (L.) amazonensis do animal tratado com Antimonium crudum 30 cH .......... 28

Figura 3 - Diâmetro da pata (mm) utilizando micrômetro digital (Mitutoyo ®), mensurado a

cada 10 dias, após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis, no período total de 60

dias. ........................................................................................................................................... 29

Figura 4 - Gráfico representando as populações celulares do baço, avaliadas por citometria de

fluxo, comparando células B-1 e B-2 após 60 dias de inoculação dos camundongos com

Leishmania (L.) amazonensis. .................................................................................................. 32

Figura 5 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de

fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com

Leishmania (L.) amazonensis.. ................................................................................................. 32

Figura 6 - Gráfico representando as populações celulares do baço, no gate ¨linfócitos

ativados¨, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de

inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. .......................................... 33

Figura 7 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de

fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos camundongos com

Leishmania (L.) amazonensis. .................................................................................................. 33

Figura 8 - Gráfico representando as populações celulares do baço no gate de “linfócitos

ativados” avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de

inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. .......................................... 34

Figura 9 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos CD4+ e CD8+ do baço, avaliadas

por citometria de fluxo, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em

camundongos. ........................................................................................................................... 34

Figura 10 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por

citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2, após 60 dias de inoculação dos

camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. ................................................................... 35


citometria de fluxo, comparando células B-1a e B-1b após 60 dias de inoculação dos



citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos


Figura 13 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T e B de peritônio, 60 dias após

a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. ........................................ 37

Figura 14 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ de peritônio,

60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. ................... 37

Figura 15 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na lesão experimental

coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação, de camundongo tratado

com Timulina 5 cH. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por campo,

analisadas pelo software Image J. ............................................................................................ 38

Figura 16 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no tecido adiposo

adjacente a linfonodo poplíteo, de animal do grupo controle, coradas pelo método de Giemsa

(seta), após 60 dias da inoculação. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por

campo, analisadas pelo software Image J. ................................................................................ 39

Figura 17 - (A) Baço e seus folículos (polpa branca) foram delimitados após 60 dias de

inoculação com Leishmania (L.) amazonensi, esta foto representa um dos animais do grupo

tratado com Antimonium crudum 30 cH. Na figura B verifica-se o folículo no linfonodo,

dividido conforme suas regiões, de um animal do grupo tratado com Timulina 5 cH:

CG=Centro Germinativo, ZM=Zona do Manto e PR=Paracortical do grupo tratado com

Timulina 5 cH. .......................................................................................................................... 41

Figura 18 - Imuno-histoquímica para CD3 (linfócitos T) (A), contagem de linfócitos T

positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com

Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X. Na figura A pata de animal do grupo controle. 42

Figura 19 - Imuno-histoquímica para CD45RA (linfócitos B) (A), contagem de linfócitos B


Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X. Em A pata de animal do grupo tratado com

Timulina 5 cH. .......................................................................................................................... 43

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Contagem de subtipos celulares presentes no baço e peritônio de camundongos

provenientes de diferentes grupos experimentais. Os subtipos celulares foram caracterizados

fenotipicamente por citometria de fluxo, cujos valores foram compensados para 10.000

eventos do total. C=Controle, T=Timulina 5 cH, A=Antimonium crudum 30 cH, VR: valores

de referência obtidos a partir de um ¨pool¨ de amostras provenientes de três camundongos não

tratados (controle negativo). Valores expressos como média e desvio padrão.. ...................... 31

Tabela 2 - Valores referentes à média e desvio padrão (SD) de células positivas por campo

(pata) e escore (linfonodo e baço) (n=10 por grupo). C=Controle, T=Timulina 5 cH e

A=Antimonium crudum 30 cH, VR= valores de referência de total de células positivas por

campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=3 por grupo) de camundongos não tratados

(controle negativo +PBS). Os traçados indicam que a análise correspondente não foi

possível. .................................................................................................................................... 45

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 12

1. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 14

2. ARTIGO .......................................................................................................................... 19

2.1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 20

2.2. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 21

2.2.1. Animais ............................................................................................................... 21

2.2.2. Preparação dos medicamentos ............................................................................ 22

2.2.3. Tratamento .......................................................................................................... 22

2.2.4. Inoculação de Leishmania (L.) amazonensis e observação das lesões ............... 23

2.2.5. Histopatológico ................................................................................................... 23

2.2.6. Imuno-histoquímica ............................................................................................ 23

2.2.7. Histometria ......................................................................................................... 25

2.2.8. Citometria de fluxo ............................................................................................. 25

2.2.9. Bioética e conflito de interesses ......................................................................... 27

2.3. RESULTADOS ......................................................................................................... 28

2.3.1. Macroscopia........................................................................................................ 28

2.3.2. Citometria ........................................................................................................... 29

2.3.3. Histometria e imuno-histoquímica ..................................................................... 38

2.4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ................................................................................ 46

2.5. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 51

3. ANEXO ............................................................................................................................ 58

12

INTRODUÇÃO

13

INTRODUÇÃO

A leishmaniose é uma zoonose presente em diversos países. As áreas endêmicas são

divididas em Velho Mundo, que compreende África, Ásia e Europa, e Novo Mundo,

pertencente às Américas (GENARO, 2005).

Neste trabalho usou-se um modelo experimental de Leishmania sp. frente a tratamento

homeopático com enfoque na resposta imunológica e efeitos clínicos, sugerindo alternativas

para o tratamento da doença.

A leishmaniose no Brasil é um sério problema de saúde pública, em decorrência da

polêmica sobre a eutanásia de animais soropositivos e o tratamento não autorizado com

medicamentos convencionais preconizados pelos órgãos federais, como Ministério da Saúde e

Conselho Federal de Medicina Veterinária.

Além do mais, a terapêutica convencional de leishmaniose, principalmente com o uso

do Antimonial Pentavalente (Glucantime®), apresenta resistência na cura das lesões, como em

pacientes acometidos com leishmaniose cutânea difusa por Leishmania (L.) amazonensis.

Esses pacientes desenvolvem resposta imunológica anérgica, não apresentando melhora

clínica (GENARO et al., 2005; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007; SILVEIRA et al., 2009;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).

Cresce o uso de tratamentos de medicina complementar que auxiliam de maneira

adicional o paciente em diferentes enfermidades. Uma dessas opções é a homeopatia,

preconizada por Hahnemann desde 1796 (ADLER et al., 1996; TEIXEIRA, 2006). Sua

eficácia em diferentes situações clínicas e experimentais tem sido demonstrada ao longo dos

últimos anos, com diversos trabalhos publicados na área da medicina, medicina veterinária e

agricultura (PEREIRA et al., 2005; MERLINO et al., 2007; BONAMIN, 2008; RODRIGUES

DE ALMEIDA, et al., 2008; KASSAB et al., 2009; SMIT et al., 2009; RETTAGLIATI et al.,

2012; SATO et al. 2012).

Em face de tais problemas e potenciais alternativas, o presente estudo analisou a

influência dos medicamentos homeopáticos com relação à resposta imunológica, avaliando o

recrutamento celular e as características das lesões histopatológicas na infecção experimental

por leishmaniose murina.

14

1. REVISÃO DE LITERATURA

15

1. REVISÃO DE LITERATURA

As leishmanioses são consideradas grande problema de saúde pública, sendo doenças

inflamatórias crônicas da pele, das membranas mucosas ou das vísceras, causadas por

protozoários do sistema fagocítico mononuclear (KUMAR et al, 2005, MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2007).

A classificação taxonômica, o parasito pertence ao gênero Leishmania, ordem

Kinetoplastida, família Trypanossomatidae. Os hospedeiros vertebrados incluem grande

variedade de mamíferos, sendo as infecções mais comuns nos roedores, canídeos e no

homem. Como hospedeiros invertebrados, são identificadas exclusivamente fêmeas de insetos

hematófagos conhecidos como flebotomíneos, ordem Diptera, família Psychodidae,

subfamília Phlebotominae e gênero Lutzomyia (MICHALICK, 2005; GENARO et al., 2005).

Na ocorrência de leishmaniose cutânea, Brasil, Colômbia, Peru, Bolívia e Nicarágua

estão entre os 12 países do mundo que concentram 90% dos casos. Estima-se que ocorram

cerca de 1,5 milhões de casos novos a cada ano (WHO, 2012).

Ao analisar a evolução da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Brasil,

observa-se sua expansão geográfica, sendo que no início da década de 80 foram registrados

casos autóctones em 19 unidades federativas e, no ano de 2003, foi confirmada autoctonia em

todas as unidades federativas do país. No período de 1991 a 2010, a LTA apresentou média

anual de 27.374 casos registrados e coeficiente de detecção médio de 16,4 casos por 100 mil

habitantes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).

Uma das espécies causadoras da LTA é a Leishmania (L.) amazonensis, que apresenta

duas formas clínicas denominadas leishmaniose cutânea e leishmaniose cutânea difusa. A

leishmaniose cutânea caracteriza-se pela formação de úlceras únicas ou múltiplas confinadas

na derme, com a epiderme ulcerada. Na leishmaniose cutânea difusa ocorre infecção

confinada na derme, formando nódulos não ulcerados e disseminação (GENARO et al.,

2005). Adicionalmente, há registros de felinos e cães domésticos como portadores (SOUZA et

al., 2005; TOLEZANO et al., 2007).

No contexto da resposta imune, a Leishmania (L.) amazonensis induz uma resposta

imune inata e adquirida (PEREIRA et al., 2008). Em camundongos Balb/c com deficiência da

atividade do sistema complemento, no local da inoculação, há diminuição da resposta

16

inflamatória e aumento de carga parasitária na fase aguda, evidenciando o papel do

complemento no controle da propagação do parasita (LAURENTI et al., 2004). Em estudo in

vitro, com co-culturas de macrófagos infectados com Leishmania (L.) amazonensis murina e

neutrófilos, houve a destruição de formas amastigotas (CARMO et al., 2010). Em outro

experimento com L (L.) amazonensis observou-se a participação de células B e anticorpos na

infecção experimental. Comparando duas linhagens de camundongos, houve aumento na

titulação de anticorpos mais evidente em camundongo Balb/c em relação ao C3H.

Adicionalmente, a severidade da doença parasitária foi significativamente reduzida na

ausência de células B em camundongo JhD, este apresentando lesões cutâneas menores

(WANASEN et al., 2008). Na análise, avaliando os subtipos de células B, durante a infecção

experimental por Leishmania major, os camundongos Balb/c demonstraram aumento

significativo de populações de células B CD5+ e altos níveis de anticorpos naturais, sugerindo

que as células B-1 seriam ativadas em animais parasitados (BABAI et al., 1999).

Na leishmaniose cutânea há o desenvolvimento de nódulos seguidos por ulcerações no

local da infecção. Experimentos relatam que camundongos imunodeficientes (SCID)

demonstraram lesões cutâneas não ulceradas, sugerindo o envolvimento de linfócitos B e T

durante a formação da ulceração (TERABE et al., 1999; TERABE et al., 2000).

Em relação à suscetibilidade e resistência do hospedeiro, na estimulação CD4+ do tipo

Th1 há produção de IL-2, IL-12, INF-γ e TNF-α para promover a ativação do macrófago e a

eliminação do parasita. No caso de estimulação Th2, as citocinas envolvidas são IL-4, IL-5,

IL-10 e IL-13, inibindo a ativação do macrófago e contribuindo para a sobrevivência do

parasita (ABBAS et al., 2011). Contudo, a competência imunogênica se distingue nas

diferentes espécies causadoras de Leishmaniose Tegumentar Americana, como Leishmania

(L.) amazonensis e Leishmania (V.) braziliensis, apresentando características de perfil

imunológico e sintomas clínicos em humanos diferentemente. Tem-se como exemplo a

característica de hipossensibilidade de células T na infecção por Leishmania (L.) amazonensis

em casos de leishmaniose cutânea difusa anérgica (SILVEIRA et al., 2009). Além disso, os

linfócitos CD8+ possuem mecanismos efetores por INF- γ e perforina, contribuindo para uma

resposta imune protetora contra os parasitas (COLMENARES et al., 2003; RUIZ et al., 2007;

SANABRIA et al. 2007).

A homeopatia é considerada alternativa eficiente e segura ao tratamento de doenças

crônicas, aumentando a eficácia clínica quanto à qualidade de vida, diminuindo os custos e os

17

efeitos colaterais da terapêutica farmacológica convencional (TEIXEIRA, 2006). Os

medicamentos homeopáticos são preparados em doses infinitesimais e dinamizados (ADLER

et al., 1996), sendo aplicados para enfermidades parasitárias, virais, neoplásicas,

psicocomportamentais, entre outras (ULLMAN, 2003; PEREIRA et al., 2005; PILKINGTON

et al., 2005; SUNILA et al.; 2007; KASSAB et al., 2009; FERRAZ et al., 2011; SIQUEIRA

et al., 2013).

Como matéria-prima de produtos homeopáticos utilizam-se substâncias

imunomoduladoras, visando à recuperação do equilíbrio do sistema imunológico, além de

garantir a proteção do indivíduo contra vários agentes de diferentes origens (GARRITANO,

2007). Entre esses produtos, há a Timulina. A ação da Timulina no sistema imune é bem

ampla, em várias espécies. Em aves, observam-se aumento da citotoxicidade de células

Natural Killer (MERLINO et al., 2001) e da analgesia (KANAAN et al., 2002; SAFIEH-

GARABEDIAN et al., 2002; DARDENNE et al., 2006). Além disso, quando em preparações

homeopáticas na potência 5 cH, a Timulina melhora significativamente os índices

zootécnicos, potencializando a resposta linfoide esplênica e reduzindo a incidência de artrite

viral na semana pré-abate em frangos de corte (SATO et al., 2012).

O princípio de “semelhante cura semelhante” é entendido como a intercorrelação entre

os sintomas manifestados espontaneamente por um paciente e os sintomas provocados por

uma substância de acordo com seus aspectos toxicológicos e patogenéticos (BONAMIN,

2008). Baseado nesse conceito da homeopatia, o Antimonium crudum ocasiona em indivíduo

sadio fraqueza, erupções crostosas, espessas e duras na pele, onicogrifose, entre outros

(DUJANY, 1995). Sendo essa sintomatologia descrita em portadores de Leishmania sp.,

assume-se que a aplicação do princípio de similitude seja estratégia possível para o tratamento

da enfermidade.

São poucos os estudos descritos na literatura sobre o tratamento de infecções

parasitárias com homeopatia. Contudo, em estudos anteriores, o efeito de medicamentos

homeopáticos em doenças parasitárias mostrou-se benéfico em camundongos com infecção

com Trypanosoma cruzi. Nesse caso, o tratamento com Phosphorus gerou aumento no

número de monócitos no 42º dia pós-infecção e ausência de mortes (RODRIGUES DE

ALMEIDA et al., 2008). Em relato de caso, o uso do medicamento homeopático Zincum

Iodatum utilizado em cão portador de Leishmania sp. resultou em melhora clínica

(RETTAGLIATI et al., 2012).

18

O objetivo deste estudo é analisar os mecanismos imunomoduladores da Timulina 5

cH e do Antimonium crudum 30 cH na infecção experimental de camundongos Balb/c com

Leishmania (L.) amazonensis, tendo como ferramentas marcadores celulares capazes de

identificar linfócitos e os subtipos como célula B-1 e fagócitos.

19

2. ARTIGO

20

2. ARTIGO

2.1. INTRODUÇÃO

As leishmanioses são consideradas grande problema de saúde pública, sendo doenças

inflamatórias crônicas da pele, das membranas mucosas ou das vísceras, causadas por

protozoários do sistema fagocítico mononuclear (KUMAR et al, 2005, MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2007). Uma das espécies causadoras da doença cutânea é a Leishmania (L.)

amazonensis. A leishmaniose cutânea caracteriza-se pela formação de úlceras únicas ou

múltiplas confinadas na derme, com a epiderme ulcerada. Na leishmaniose cutânea difusa

ocorre infecção confinada na derme, formando nódulos não ulcerados e disseminação

(GENARO et al., 2005).

Baseando-se no princípio da similitude, o Antimonium crudum ocasiona em paciente

sadio fraqueza, erupções crostosas, espessas e duras na pele, onicogrifose, entre outros

(DUJANY, 1995). Sendo essa sintomatologia descrita também em portadores de Leishmania

sp., assume-se que a aplicação da homeopatia seja estratégia possível para o tratamento da

enfermidade, embora sejam poucos os estudos descritos na literatura sobre o tratamento de

infecções parasitárias com homeopatia. Em estudos anteriores, o efeito de medicamentos

homeopáticos em doenças parasitárias mostrou-se benéfico clinicamente, tanto em

camundongos portadores de infecção por Trypanosoma cruzi (RODRIGUES DE ALMEIDA

et al., 2008) quanto em um cão tratado portador de Leishmania sp. tratado com Zincum

Iodatum dinamizado (RETTAGLIATI et al., 2012).

Outra possível abordagem homeopática para o tratamento da leishmaniose

experimental murina é o uso de substâncias endógenas imunomoduladoras dinamizadas, como

a timulina. Estudos anteriores demonstram que, quando em preparações homeopáticas na

potência 5 cH, a timulina melhora significativamente os índices zootécnicos, potencializando

a resposta linfoide esplênica e reduzindo a incidência de artrite viral na semana pré-abate em

frangos de corte (SATO et al., 2012). Da mesma forma, a timulina 5cH também foi capaz de

reduzir a infecção murina experimental com BCG, por modular a atividade de linfócitos e

fagócitos (BONAMIN et al., 2013).

A escolha de tais medicamentos como possíveis agentes imunorreguladores na

infecção por Leishmania (L.) amazonensis tem como respaldo o fato desta induzir resposta

21

imune inata e adquirida (PEREIRA et al., 2008), em que se observa o papel do sistema

complemento (LAURENTI et al., 2004), bem como de fagócitos (macrófagos e neutrófilos),

na destruição de formas amastigotas (CARMO et al., 2010). Sabe-se que a severidade da

doença parasitária é significativamente reduzida em camundongo JhD, este deficiente em

células B e anticorpos, apresentam lesões cutâneas menores (WANASEN et al., 2008).

Avaliando os subtipos de células B, durante a infecção experimental por Leishmania major,

os camundongos Balb/c demonstraram aumento significativo de populações de células B

CD5+ e altos níveis de anticorpos naturais, sugerindo que as células B-1 seriam ativadas em

animais parasitados (BABAI et al., 1999).

Na leishmaniose cutânea há o desenvolvimento de nódulos seguidos por ulcerações no

local da infecção. Experimentos relatam que camundongos imuno-deficientes (SCID)

demonstraram lesões cutâneas não ulceradas, sugerindo o envolvimento de linfócitos B e T

durante a formação da ulceração (TERABE et al., 1999; TERABE et al., 2000). Por outro

lado, a infecção por Leishmania (L.) amazonensis em casos de leishmaniose cutânea difusa

anérgica é condicionada à deficiência de linfócitos T (SILVEIRA et al., 2009). Os linfócitos

CD8+ possuem mecanismos efetores por INF- γ e perforina, contribuindo para uma resposta

imune protetora contra os parasitas (COLMENARES et al., 2003; RUIZ et al., 2007;

SANABRIA et al. 2007).

O objetivo deste estudo, portanto, é analisar os mecanismos imunomoduladores da

Timulina 5 cH e do Antimonium crudum 30 cH na infecção experimental de camundongos

Balb/c com Leishmania (L.) amazonensis, tendo como ferramentas marcadores celulares

capazes de identificar linfócitos e os respectivos subtipos, como células B-1 e fagócitos.

2.2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.2.1. Animais

Foram utilizados camundongos de linhagem Balb/c, SPF (Specific pathogen free),

machos e adultos, provenientes do Centro de Desenvolvimento para Modelos Experimentais –

Cedeme, da Unifesp, e mantidos em microisoladores (Techniplast®), no Biotério de

Experimentação Animal - SPF do Centro de Pesquisa da UNIP, onde receberam água e ração

esterilizados ad libtum, sendo mantidos em temperatura e iluminação controlados, com

22

temperatura fixada em 22±2oC, e o período de luz em 12h, das 6h30 às 18h30. O ciclo de

trocas de ar nas caixas foi fixado em 75 ciclos/hora.

2.2.2. Preparação dos medicamentos

A Timulina 5 cH foi preparada a partir da solução estoque 4 cH (Boiron Brasil), a qual

foi obtida de peptídeo sintético livre de zinco (serum thymic factor, peso molecular =

858,85), com pureza de 98.66%, segundo dados do fornecedor. O Antimonium crudum 30 cH

foi preparado a partir de matriz adquirida de farmácia homeopática credenciada pela Anvisa,

na potência 29 cH. A última diluição de ambos os medicamentos foi realizada no momento da

administração em solução hidroalcoólica 30% e sucussionada mecanicamente com o auxílio

de braço mecânico automatizado (Autic®). Os procedimentos de preparo e estocagem

seguiram as normativas descritas na Farmacopeia Homeopática Brasileira (3ª edição). A

solução controle foi feita utilizando apenas o veículo (solução hidro-alcoólica 30%),

submetido aos mesmos procedimentos de diluição e sucussão, até a potência 5 cH.

Para garantir que não houve contaminação com zinco no momento da administração

da Timulina, amostras de Timulina 5 cH e do veículo foram encaminhadas a laboratório

certificado (CBO Análises, Brasil) para mensuração da sua concentração. Não foram

encontradas quantidades significativas de zinco em nenhuma das amostras.

2.2.3. Tratamento

Os animais foram tratados diariamente com Timulina 5 cH (grupo B), Antimonium

crudum 30 cH (grupo C) ou veículo (grupo A), via água de bebida, em cego, durante 60 dias;

0.1mL da preparação A, B ou C foi misturado diariamente a 250mL de água de bebida em

garrafa estéril, de forma que a concentração teórica final de Timulina fosse 4x10-13

M.

Para o procedimento em cego, os frascos contendo Timulina 5 cH, Antimonium

crudum 30 cH e veículo foram identificados aleatoriamente com as letras A, B e C por um

funcionário do laboratório não envolvido em nenhuma etapa do processo experimental. Os

códigos foram revelados somente após a análise estatística.

23

2.2.4. Inoculação de Leishmania (L.) amazonensis e observação das lesões

A inoculação na dose de 2x106

promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis

MHOM/BR/73/M2269 foi no coxim plantar esquerdo dos camundongos Balb/c, em volume

de 50 microlitros de inóculo total. As cepas de Leishmania (L.) amazonensis foram fornecidas

pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - FMUSP. Os parasitas provinham

de cultura mantidos em meio RPMI (10 ml), 25ºC, suplementados com 10% de soro fetal

bovino, 1% de penicilina (100U/ml) e gentamicina (0.1mg/ml).

2.2.5. Histopatológico

Aos 60 dias após a inoculação, 10 animais de cada grupo foram eutanasiados em

câmara de CO2, necropsiados e fragmentos histológicos da lesão, do linfonodo poplíteo

ipslateral e do baço foram colhidos e fixados em paraformaldeído 8%. Os fragmentos dos

tecidos foram cortados com micrótomo, desparafinizados e corados pelo método Giemsa e

pela imuno-histoquímica.

2.2.6. Imuno-histoquímica

Para preparar os cortes histológicos para a imuno-histoquímica, todas as amostras de

tecido subcutâneo de pata esquerda, local onde foram inoculadas formas prosmatigotas de

Leishmania (L.) amazonensis, foram preparadas de forma a obter cortes de 5 microns de

tecido incluído em parafina.

Para remover a parafina, foram feitas duas lavagens de aproximadamente 2 minutos

cada, com xilol absoluto, seguidas de duas passagens em álcool absoluto por 3minutos cada.

Os cortes foram então lavados em água corrente. Para o desmascaramento antigênico por

calor úmido foi utilizado tampão citrato próprio para essa finalidade (DAKO), preparado

segundo as instruções do fornecedor. As lâminas foram incubadas em panela elétrica aquecida

a 80ºC (PANASONIC) por 30 minutos, lavadas em PBS, pH = 7.2 (SIGMA), durante 5

minutos em agitação, secas com papel fino, e as amostras de tecido foram delimitadas com

Pap-pen (AbCAM).

24

A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação das lâminas com

H2O2 5% em metanol, durante 15 minutos. Após nova lavagem com PBS, pH = 7.2 (SIGMA),

os cortes histológicos foram incubados com soro heterólogo de equino (VECTOR) durante 20

minutos, para bloqueio dos sítios inespecíficos. Os tecidos foram imediatamente tratados com

os anticorpos primários anti-IgG de rato cujas diluições, feitas em diluente próprio para

redução de fundo (DAKO), estão descritas no Quadro 1. Essa incubação foi realizada em 4oC,

durante toda noite, em câmara úmida. O controle negativo das reações foi feito pela

substituição do anticorpo primário pelo diluente.

No dia seguinte, os cortes foram lavados em PBS, pH = 7.2 (SIGMA) por 5 minutos e

tratados por 30 minutos com anticorpo secundário (anti-IgG de rato) conjugado a polímero

(VECTOR). Após nova lavagem em PBS, pH = 7.2 (SIGMA) por 5 minutos, os cortes foram

incubados com DAB (DAKO) por alguns segundos. As lâminas foram lavadas em água

corrente, contracoradas com hematoxilina de Harris, lavadas novamente e montadas com

lamínula e resina (VECTOR).

As observações referentes à atribuição de escores para a análise dos cortes

histopatológicos marcados com anti-CD3, CD45RA e CD11b por imuno-histoquímica foram

feitas por dois observadores diferentes, a fim de evitar vieses de interpretação de positividade.

Quadro 1 - Marcadores utilizados na imuno-histoquímica

Marcador Célula Fabricante Alvo Clone Espécies de

origem e alvo Diluição

Anti-CD3

Linfócitos T

Serotec

CD 3

CD3 -12

Rato-

camundongo

1:40

Anti-CD11b

Fagócitos

Serotec

CD11b

M1/70.15

Rato-

camundongo

10%

Anti-CD45RA

Linfócitos B

apenas

Serotec

LCA

(proteína de

superfície)

RA3-6B2 Rato-

camundongo 0,5%

25

2.2.7. Histometria

A quantificação das células marcadas foi feita pela determinação do número de células

positivas por campo microscópico, sendo avaliados 5 campos por corte. O grau de infecção de

fagócitos corados pelo método Giemsa foi determinado por escores, sendo dois observadores

diferentes, para evitar vieses de interpretação. A proporção entre parênquima e folículo, nos

órgãos linfoides, foi determinada em pixels pelo software Image J. Por se tratar de célula

majoritária, a quantificação dos fagócitos CD11b+ no baço e linfonodo foi feita por escores

de zero a três. No coxim plantar, a incidência destas células foi avaliada de forma descritiva.

2.2.8. Citometria de fluxo

Dos camundongos eutanasiados após 60 dias de inoculação houve a retirada de lavado

peritoneal e a suspensão de células do baço. Assim, 5ml de PBS, pH = 7.2 (SIGMA),

adicionados a 1% de soro fetal bovino foi injetado na cavidade peritoneal, seguido de leve

massagem para permitir o desprendimento celular. O lavado peritoneal foi colhido usando

pipeta Pasteur de plástico, sendo transferido para tubos plásticos de Falcon imersos em gelo.

Cada tubo correspondeu ao lavado de dois animais (pool), sendo analisados três tubos por

grupo (N=6). A cavidade peritoneal foi aberta e o baço retirado, sendo macerado em solução

de PBS, pH = 7.2 (SIGMA) adicionado a 1% de soro fetal bovino para produzir uma

suspensão celular homogênea, a qual foi igualmente transferida para tubos de Falcon imersos

em gelo. Ambas as amostras (peritônio e baço) seguiram as mesmas etapas definidas a seguir.

Com os tubos de Falcon imersos em gelo, os mesmos foram centrifugados em 2000

rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em

tampão hemolítico (GIBCO®). Novamente essas células foram centrifugadas e suspensas em

PBS (GIBCO®) a 4oC. O número de células viáveis foi avaliado pelo Azul de Tripan e

contado em câmara de Neubauer modificada (HAUSSER SCIENTIFIC). Após nova

centrifugação (2000 rpm, 5 min.), as células foram suspendidas em 100µl de PBS adicionados

a 10µl de anticorpo antimouse CD16/CD32 (INVITROGEN) 1:100, para bloqueio de Fcγ II e

III, sendo incubadas a 4oC por 30 minutos. Após nova lavagem das células em PBS, as

amostras foram suspendidas em 200µl de 1% PBS/BSA e divididas igualmente em três

microtubos, um sem anticorpos, outro contendo 1% anti-CD19 PE Cy5.5, anti-CD23 FITC,

anti-CD5 PE e anti-CD11b PB (INVITROGEN) e um terceiro tubo contendo 1% anti-CD25

26

AF488, anti-CD4 PE, anti-CD19 PE Cy5.5 e anti-CD8 AF 405, sendo todos incubados por

cerca de 40 minutos a 4oC. A última centrifugação foi realizada e as células fixadas em 400µl

de paraformaldeído 1% misturados em 100µl de PBS, sendo mantidas a 4oC até o momento

da leitura em citômetro, não mais que 48h depois do processamento. No momento da leitura,

as amostras sofreram nova centrifugação, foram suspendidas em 1ml de PBS e transferidas

para tubos FACS (BD). A leitura das amostras foi feita em citômetro FACS CANTO (BD)

realizado no laboratório de Imunologia da Unifesp – São Paulo.

A análise dos dados foi feita utilizando o software Flow Jo 7.6.5. Na análise dos

dados, inicialmente o tamanho e a granulosidade das células foram selecionados para

determinar as populações celulares de linfócitos. A fluorescência obtida pelos marcadores foi

usada para estabelecer os gates de células positivas. As amostras de baço apresentaram duas

populações distintas de linfócitos, sendo uma delas de linfócitos ativados. As amostras de

lavado peritoneal apresentaram uma única população homogênea dessas células (Figura 1).

As subpopulações foram determinadas no gate de linfócitos pela expressão ou não de

CD19 PE Cy5.5 (INVITROGEN), sendo as células positivas caracterizadas como linfócitos B

e as células negativas caracterizadas como linfócitos T. A partir da população de linfócitos B,

aquelas tidas como duplo-positivas (CD19 PE Cy5.5 + e CD11b PB +) foram consideradas

como células B-1, e aquelas positivas apenas para CD19 PE Cy5.5 foram consideradas como

B-2. Para analisar as subpopulações de B-1, B-1a e B-1b, utilizou-se a expressão de CD5

como critério, sendo as positivas B-1a e as negativas B-1b. As células positivas apenas para

CD11b foram consideradas como fagócitos. A partir da população de células T (CD19 PE

Cy5.5 negativas), identificaram-se as subpopulações de células CD4+ e CD8+.

A compensação de cada fluorocromo foi realizada pela marcação simples para cada

anticorpo utilizado. A positividade e negatividade de cada marcador foram determinadas a

partir da fluorescência natural das células não expostas aos anticorpos.

A transposição de dados para análise estatística foi feita para os softwares EXCEL

2007, INSTAT 3.0 e PRISM 5.04.

27

Figura 1 - Gráfico de dispersão obtido pelo programa flow-jo 7.6.5 para demonstração

dos diferentes gates e suas populações, a partir dos procedimentos de citometria de

fluxo. Na figura 1A tem-se a população celular do peritônio, e na figura 1B a população

celular do baço, definida em dois gates distintos denominados “linfócitos” e “linfócitos

ativados”. Essas populações foram analisadas 60 dias após a infecção experimental com

Leishmania (L.) amazonensis.

2.2.9. Bioética e conflito de interesses

Este projeto foi autorizado pelo Comitê de Ética de Pesquisa da Universidade Paulista

- UNIP, conforme legislação vigente de proteção aos animais, com o protocolo nº 026/11

CEP/ICS/UNIP. Não há conflitos de interesses relacionados a este trabalho de pesquisa.

A B

28

2.3. RESULTADOS

2.3.1. Macroscopia

A evolução macroscópica da lesão foi feita pela medida da espessura da pata,

utilizando um micrômetro digital (Mitutoyo ®). As medidas foram feitas antes da inoculação

e a cada 10 dias, durante 60 dias. Nesse período, os coxins já apresentavam sinais de necrose

(Figura 2).

Figura 2 - Aspecto ulcerado de lesão em pata de camundongo, após 60 dias de

inoculação com Leishmania (L.) amazonensis do animal tratado com Antimonium

crudum 30 cH

Os animais do grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH apresentaram aumento

na espessura da pata 60 dias após a inoculação do parasita (Figura 3). Dado que a análise

histológica revelou redução no número de células e maior dispersão das estruturas, atribui-se

esse efeito à evolução da lesão para edema tardio (Quadro 2).

29

Figura 3 - Diâmetro da pata (mm) utilizando micrômetro digital (Mitutoyo ®),

mensurado a cada 10 dias, após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis, no

período total de 60 dias.

2.3.2. Citometria

Análise das células do baço

As análises celulares do baço foram definidas em 2 gates, como demonstrado na

Figura 1B. Os gráficos do gate de “linfócitos” e “linfócitos ativados” foram ainda divididos

nas populações celulares de linfócitos B (CD19+), linfócitos T (CD19-) e fagócitos

(CD11b+). Apenas traços de células B-1b (CD5-) foram identificados, o que impossibilitou a

análise estatística. As amostras para a análise de citometria foram provenientes de um “pool”

de 2 animais, essas amostras foram adicionadas em um tubo de Falcon identificados de

acordo com o grupo, controle, Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH, respectivamente.

Um resumo dessa análise por fluxo de citometria foi demonstrado na tabela 1.

A análise do número médio de células e sua comparação entre os grupos (ANOVA)

não demonstraram significância estatística; contudo, os desvios de proporções entre subtipos

30

celulares mostraram haver predomínio de linfócitos B-1 em ambos os grupos experimentais

em relação ao controle (Figuras 4 a 9).

Comparando-se as populações celulares de B-1 e B-2 houve aumento de B-1 nos

grupos tratados com Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH em relação ao controle

(Figura 4); contudo, essa diferença não foi observada no gate de linfócitos ativados. Por outro

lado, os animais tratados com Timulina 5 cH apresentaram aumento da população de

fagócitos (CD11b + / CD19 -) em relação à população de linfócitos B (CD11b- / CD19+)

(Figuras 5 e 6).

A análise das populações de linfóficos T e B e suas proporções nos diferentes grupos

mostrou aumento na proporção de linfócitos B em relação aos linfócitos T nos animais

tratados com Antimonium crudum 30 cH, nos dos dois gates (linfócitos e linfócitos ativados).

Nos animais tratados com Timulina 5 cH esse aumento foi significativo apenas na população

de linfócitos ativados (Figuras 7 e 8, respectivamente). A comparação das proporções entre

células T CD4+ e CD8+ mostrou desvio para CD8+ nos animais tratados com Timulina 5 cH

(Figura 9).

31

Tabela 1 - Contagem de subtipos celulares presentes no baço e peritônio de

camundongos provenientes de diferentes grupos experimentais. Os subtipos celulares

foram caracterizados fenotipicamente por citometria de fluxo, cujos valores foram

compensados para 10.000 eventos do total. C=Controle, T=Timulina 5 cH,

A=Antimonium crudum 30 cH, VR: valores de referência obtidos a partir de um ¨pool¨

de amostras provenientes de três camundongos não tratados (controle negativo). Valores

expressos como média e desvio padrão. ANOVA.

Baço

Gate

Linfócitos

Baço

Gate

Linfócitos ativados

Peritônio

Célula C T A C T A VR C T A VR

B total Média

SD

2707,6 910,2

2466,5 520,3

2399,7 335,2

3847 719,6

4298 1357,4

4249 900,3

5197,5 101,1

6254,5 638,1

4592,3 1576,1

5366,3 853,6

4497,5 50,2

B-1 Média

SD

41,6

28,6

117,5

76,9

88,7

112,4

45

34,5

67,2

48,8

35,5

32,3

37

11,3

1703,7

1316,8

1458

1052,9

1686,3

1021,1

1323

790,5

B-1a Média

SD

11,6

18,4

53

33,5

44,5

62,8

14,6

22

36,2

26,5

14

18,6

16

0,0

16

12,6

229,6

224,1

110

182,7

396

411,5

B-1b Média

SD

traços traços Traços traços traços traços 19 9,8

1409 1054,7

1014,6 698,7

1373 708,7

866 335,1

B-2 Média

SD

1008,3

427,6

948,5

183,6

1013,5

312,7

2105,6

722,9

2452,7

1399,5

2374,2

870,2

1571

639,2

2364,2

458,2

1054

510,8

1948,3

757,5

2109,5

163,34

T total Média

SD

1204

417,7

934,6

362,6

824

285,1

1114

563,8

1190

402,4

1069

317,5

6734,5

509,82

1327

309,1

1283,3

832,8

764

324,2

5638

391,7

CD4+ Média

SD

569 162,4

499,3 151,9

446,7 81,9

446,6 198,1

585,3 284,8

611,2 149,6

1075,5 338,7

821,5 163,5

387,3 147,5

400,3 150,2

201,5 14,8

CD8+ Média

SD

363

169,5

404,6

215,5

275,2

75,3

183

115,9

229,3

151,6

231,2

91,8

433,5

111,0

153

34,3

76,3

29

102,3

44,1

107,5

13,4

Fagó-

citos

Média

SD

679

488

788

375,3

555,2

356,7

569,6

558,7

1198,2

880,1

703,2

685,6

2864

548,7

579,7

573,3

404,3

297,2

363

345,6

453,5

473,7

32

Figura 4 - Gráfico representando as populações celulares do baço, avaliadas por

citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2 após 60 dias de inoculação dos

camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo (p≤0.05)

na proporção de B-1 no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2, p=0.0001) e Antimonium

crudum 30 cH (X2, p=0.0001).

Figura 5 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por


camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na

proporção de fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2, p=0.0001).

4%

96%

Cont (baço)

B1

B2

11%

89%

Thym (baço)

B1

B2

X2, p=0.0001 rel cont

8%

92%

A crud (baço)

B1

B2

X2, p=0.0001

80%

20%

Cont (baço)

B

FAGO

76%

24%

Thym (baço)

B

FAGO

X2, p=0.0001 rel. cont

81%

19%

A crud (baço)

B

FAGO

33

Figura 6 - Gráfico representando as populações celulares do baço, no gate ¨linfócitos

ativados¨, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60

dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento

significativo na proporção de fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2,

p=0.0001).

Figura 7 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por

citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos


proporção de células B em relação às células T no grupo tratado com Antimonium

crudum 30 cH, comparado ao grupo controle (X2, p=0,01).

87%

13%

Cont (ativ)

B

FAGO

78%

22%

Thym (ativ)

B

FAGO


86%

14%

A crud (ativ)

B

FAGO

31%

69%

Cont (baço)

LINF T

LINF B

27%

73%

Thym (baço)

LINF T

LINF B

26%

74%

A crudum (baço)

LINF T

LINF B

X2, p=0.001

34

Figura 8 - Gráfico representando as populações celulares do baço no gate de “linfócitos

ativados” avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de

inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Os dados apresentaram

aumento significativo da população de linfócitos B em relação aos linfócitos T, nos

grupos de animais tratados com Timulina 5 cH e com Antimonium crudum 30 cH (X2,

p=0,001).

Figura 9 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos CD4+ e CD8+ do baço,

avaliadas por citometria de fluxo, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.)

amazonensis em camundongos. Os dados apresentaram aumento significativo de células

CD8+ em relação às células CD4+ nos grupos de animais tratados com Timulina 5 cH

(Fisher, p=0,01).

61%

39%

Cont (ativ)

LINF T

LINF B

47%

53%

Thym (ativ)

LINF T

LINF B

X2, p=0.001

54%

46%

A crudum (ativ)

LINF T

LINF B

X2, p=0.001

61%

39%

Cont (baço)

CD4

CD8 55%

45%

Thym (baço)

CD4

CD8

Fisher, p=0.01

62%

38%

A crudum (baço)

CD4

CD8

35

Análise das células do peritônio

O resultado global da análise da média das populações celulares do peritônio está

expresso na Tabela 1.

Considerando-se o balanço entre as diferentes subpopulações, observa-se que os

animais tratados com Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH apresentam predomínio de

células B-1 peritoneais em relação às células B-2 (Figura 10), em especial células B-1a, (12 a

18%) é constatado em ambos os grupos tratados (Figura 11).

Os animais tratados com Antimonium crudum 30 cH igualmente apresentaram

predomínio de linfócitos B totais em relação aos fagócitos (Figura 12). Houve aumento de

linfócitos T no grupo tratado com Timulina 5 cH e aumento de linfócitos B no grupo tratado

com Antimonium crudum 30 cH (Figura 13). Dentre as células T, nota-se predomínio de

linfócitos CD8+ nos animais desse grupo (Figura 14).


citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2, após 60 dias de inoculação dos


proporção B-1/B-2 no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2, p=0.0001) e Antimonium

crudum 30 cH (X2, p=0.0001) em relação ao controle.

42%

58%

Cont (perit)

B1

B2 58%

42%

Thym (per)

B1

B2


46%

54%

A crud (per)

B1

B2


36


citometria de fluxo, comparando células B-1a e B-1b após 60 dias de inoculação dos


proporção células B-1a (CD5+)/B-1b (CD5-) nos grupos tratados com Timulina 5 cH e

Antimonium crudum 30 cH (X2, p=0.0001).




proporção células B (CD19+)/fagócitos (CD11b+) no grupo tratado com Antimonium

crudum 30 cH (X2, p=0.0001).

1%

99%

B1a

B1b

Contr (perit)

18%

82%

B1a

B1b

Thym (perit)

X2, p=0,0001 rel cont

12%

88%

B1a

B1b


A crudum (perit)

92%

8%

Cont (perit)

B

FAGO

92%

8%

Thym (perit)

B

FAGO

94%

6%

A crud (perit)

B

FAGO


37

Figura 13 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T e B de peritônio, 60 dias

após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. Os dados

apresentaram aumento de linfócitos T (X2, p=0.0001) no grupo tratado com Timulina 5

cH comparado aos demais grupos. Houve aumento de linfócitos B (X2, p=0.0001) no

grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH em relação ao grupo tratado com

Timulina 5 cH e Controle.

Figura 14 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ de

peritônio, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos.

Os dados apresentaram aumento significativo de CD8+ em relação ao CD4+ no grupo de

animais tratados com Antimonium crudum 30 cH (Fisher, p=0,03).

82%

18%

LINF B

LINF T

Contr (perit)

78%

22%

LINF B

LINF T

Thym (perit)


88%

12%

LINF B

LINF T

A crudum (perit)


84%

16%

Cont (perit)

CD4

CD8 84%

16%

Thym (perit)

CD4

CD8 80%

20%

A crudum (perit)

CD4

CD8

Fisher test, p=0,03 rel controle

38

2.3.3. Histometria e imuno-histoquímica

Análise de formas amastigotas de pata e linfonodo

Na histometria foram analisadas de maneira quantitativa e semi-quantitativa a resposta

inflamatória e a carga parasitária dos fagócitos. Em relação à carga parasitária da pata,

verificou-se diminuição de formas amastigotas intracelulares dos fagócitos no grupo tratado

com Timulina 5 cH comparado aos demais grupos, avaliado 60 dias após a inoculação do

parasita (Figura 15). Dados similares foram apresentados no linfonodo poplíteo ipsilateral

(Figura 16). Não foram avaliadas formas amastigotas no baço, por causa de a Leishmania (L.)

amazonensis apresentar apenas comprometimento cutâneo.

Figura 15 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na lesão

experimental coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação, de

camundongo tratado com Timulina 5 cH. Objetiva 100X. (B) Número de formas

amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J. ANOVA, * p=0.05.

A phago

B

39

Figura 16 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no tecido adiposo

adjacente a linfonodo poplíteo, de animal do grupo controle, coradas pelo método de

Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação. Objetiva 100X. (B) Número de formas

amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J. ANOVA, **p<0.01,

***p<0.001.

Coloração hematoxilina/eosina

Em uma segunda análise, cortes histológicos de pata, baço e linfonodo foram corados

pelo método hematoxilina/eosina. No grupo controle, observou-se infiltrado inflamatório

predominantemente mononuclear, apresentando intensa vacuolização citoplasmática e

distribuição difusa no subcutâneo, com grande concentração de células na intersecção derme-

epiderme. Diferentemente, o grupo tratado com Timulina 5 cH apresentou células

inflamatórias vacuolizadas e organizadas em camadas no tecido subcutâneo, concentrando-se

na derme profunda. O grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH mostrou reduzido

recrutamento celular e edema subcutâneo (Quadro 2).

A phago

B

40

Quadro 2 - Fotomicrografias representando cortes histológicos de patas coradas com

hematoxilina/eosina em camundongos, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.)

amazonensis. Objetiva de 10X.

Grupo descrição fotomicrografia

Controle Processo inflamatório difuso

com a presença de vacúolos

citoplasmáticos.

Timulina 5 cH Infiltrado inflamatório

evidente na derme profunda,

com células vacuolizadas e

organização em camadas no

tecido subcutâneo.

Antimonium

crudum 30 cH

Processo inflamatório

discreto, com evidência de

planos profundos de camada

muscular. Notar dispersão

das estruturas vasculares e

nervosas no tecido

subcutâneo (edema).

musculatura

41

Diâmetro de área folicular e total de baço e linfonodo

A razão entre a área folicular sobre a área total de linfonodo e baço foi calculada em

pixels, pelo software Image J, porém sem resultados significativos entre os grupos, conforme

Tabela 2. A figura 17 (A) representa um corte histológico de baço, sendo circundada a área de

polpa branca; em B nota-se um folículo de linfonodo e suas respectivas áreas: CG=centro

germinativo, ZM=zona do manto e região paracortical.

Figura 17 - (A) Baço e seus folículos (polpa branca) foram delimitados após 60 dias de

inoculação com Leishmania (L.) amazonensi, esta foto representa um dos animais do

grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH. Na figura B verifica-se o folículo no

linfonodo, dividido conforme suas regiões, de um animal do grupo tratado com Timulina

5 cH: CG=Centro Germinativo, ZM=Zona do Manto e PR=Paracortical do grupo

tratado com Timulina 5 cH.

A phago

B

B

42

Imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica confirmou os dados estabelecidos no Quadro 2, com

diminuição de células positivas para CD3, CD45RA e CD11b por campo nas patas dos

camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis no grupo tratado

com Antimonium crudum 30 cH, conforme resultados mostrados nas figuras 18 e 19, e

Quadro 3. A contagem de macrófagos por campo não foi possível em função do número

incontável de células por campo.

Figura 18 - Imuno-histoquímica para CD3 (linfócitos T) (A), contagem de linfócitos T


Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X (** p<0.01), em relação aos demais grupos.

Na figura A pata de animal do grupo controle.

A phago

B

B

43

Figura 19 - Imuno-histoquímica para CD45RA (linfócitos B) (A), contagem de linfócitos

B positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com

Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X (*** p<0.01, em relação aos demais grupos).

Em A pata de animal do grupo tratado com Timulina 5 cH.

A phago

B

B

44

Quadro 3 - Fotomicrografias evidenciando macrófagos com citoplasma vacuolizado

marcados com anti-CD11b. Notar o grande número dessas células na derme e junção

derme-epiderme na pata, após 60 dias de inoculação de Leishmania (L.) amazonensis.

Objetiva 10X.

Grupo descrição fotomicrografia

Controle Macrófagos apresentando

vacúolos citoplasmáticos.

Note o grande número dessas

células na derme e junção

derme-epiderme

Timulina 5 cH Macrófagos apresentando

vacúolos citoplasmáticos.

Note o grande número dessas

células na derme e junção

derme-epiderme

Antimonium

crudum 30 cH

Processo inflamatório com

poucas células positivas para

CD11b quando comparado

aos demais grupos.

Foram ainda marcados baço e linfonodo para CD3, CD45RA e CD11b por meio de

escores predeterminados, com valores de 0-3. Não houve diferença estatística entre os grupos

para todos os marcadores, de acordo com a mediana. Duas pessoas observaram a positividade

celular independentemente (Tabela 2).

musculatura

45

Tabela 2 - Valores referentes à média e desvio padrão (SD) de células positivas por

campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=10 por grupo). C=Controle, T=Timulina 5

cH e A=Antimonium crudum 30 cH, VR= valores de referência de total de células

positivas por campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=3 por grupo) de camundongos

não tratados (controle negativo +PBS). Os traçados indicam que a análise

correspondente não foi possível. * ANOVA em CD3, (** p<0.01), em CD45R (***p<0.01)

indicam diminuição celular de ambos em pata. Em relação à coloração Giemsa no

linfonodo (**p<0.01 diminuição de amastigotas comparando o controle com o

Antimonium crudum 30 cH), (***p<0.001 diminuição de amastigotas entre Timulina 5

cH e Antimonium crudum 30 cH), e na pata (*p=0.05 diminuição de amastigotas no

grupo tratado com Timulina 5 cH relacionado aos demais grupos).

Me= Mediana, M=Média e SD=desvio padrão.

Baço

Linf Pata

Células C T A VR C T A VR C T A VR

CD3+ Me 1000

2000

2000

2000

1000

1000

1000

1000

M

SD

7,41

3,82

7,37

4,03

5,55*

3,31

3,28

2,08

CD45RA Me 1000

2000

2000

3000

1000

1000

1000

2000

M

SD

8,16

5,79

9,74

7,92

3,45*

2,35

5,15

3,49

CD11B Me 2000

1000

2000

3000

1000

1000

1000

2000 M

SD

____

____

______

______

_____

_____

_____

_____

Área

folículo/

órgão

M

SD

0,32

0,18

0,24

0,05

0,35

0,12

0,30

0,07

0,15

0,05

0,20

0,12

0,17

0,05

0,45

0,16

M

SD

____

____

______

_____

_____

_____

__________

GIEMSA M

SD

________

________

__________

________

48,46

25,89

44,48

19,02

61,35*

30,13

________

M

SD 74,7

65,51

51,55*

44,77

63,69

66,67

__________

46

2.4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

De acordo com a teoria de Khuda-Bukhsh (2009), foi proposto que os medicamentos

homeopáticos carregam sinais específicos que agiriam como gatilho para “ligar” ou “desligar”

alguns genes relevantes, iniciando uma cascata de ação gênica para alterar, balancear ou

corrigir a expressão de genes, que estaria alterada em certas condições patológicas. Assim, a

administração de medicamentos homeopáticos poderia modular o sinal das proteínas,

aumentando ou diminuindo a regulação de tais sinais no âmbito das funções celulares (DE

OLIVEIRA et al., 2008).

No presente trabalho correlacionou-se o uso de medicamentos homeopáticos frente à

infecção por Leishmania (L.) amazonensis, procurando entender a cinética celular que

envolve a relação hospedeiro/parasita, com ou sem a intervenção de tais medicamentos.

De acordo com o princípio de similitude proposto por Hahnemann em 1796, ao

administrar aos indivíduos enfermos substâncias que causaram sintomas semelhantes em

indivíduos sadios, estimula-se reação homeostática curativa contra a enfermidade, induzindo

o organismo a reagir contra os próprios sintomas (TEIXEIRA, 2006). Baseado nessa teoria e

referindo à matéria médica homeopática, utilizou-se o Antimonium crudum 30 cH. Por outro

lado, sabe-se que moléculas endógenas que exercem efeitos na regulação do sistema imune

são, do mesmo modo, biologicamente ativas em preparações homeopáticas (DOUCET-

JABOEUF et al., 1985; DAURAT et al., 1986; BASTIDE et al., 1987; BASTIDE et al.,

1995). Entre estes imunomoduladores está a Timulina (SATO et al., 2012; BONAMIN et al.,

2013).

A Timulina é hormônio tímico de ação anti-inflamatória (LUNIN et al., 2010; LUNIN

et al., 2011), dentre outras. Em infecções parasitárias, os níveis de Timulina séricos podem

diminuir, conforme demonstrado em infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos

(SAVINO et al., 1989). Em outro relato, demonstrou-se que o tratamento diário com

Timulina modularia a hiperalgesia induzida pela leishmaniose cutânea em camundongos

Balb/c, infectados com Leishmania major. Nesses casos, baixos níveis de IL-1β e NGF (fator

de crescimento neuronal) séricos foram observados (KANAAN et al., 2002, DARDENNE et

al., 2006).

47

Experimentos que demonstram a ação de medicamentos homeopáticos em doenças

parasitárias são descritos na literatura (PEREIRA et al., 2005; SMIT et al., 2009; FERRAZ et

al., 2011). O medicamento Canova® (que compreende os medicamentos Aconitum napellus

11 dH, Arsenicum album 19 dH, Bryonia alba 18 dH, Lachesis muta 18 dH e Thuya

occidentalis 19 dH) tem efeito anti-inflamatório conhecido em animais infectados com

Leishmania (L.) amazonensis. Há ainda diminuição da carga parasitária em linfonodo poplíteo

e baço de animais tratados. Além disso, resultado in vitro demonstrou aumento nos níveis de

óxido nítrico (NO) na cultura de macrófagos (PEREIRA et al., 2005).

Em relação aos subtipos de células B, em nosso experimento avaliamos B-1 e B-2. As

células B-1 provenientes de camundongo Balb/c apresentam características morfológicas

distintas de células B-2, como demonstrado por Abrahão e colaboradores (2003), como o

grande número de mitocôndrias, sugerindo um intenso metabolismo celular. As células B-1

são subdivididas em B-1a e B-1b, sendo as células B-1a (CD5+) derivadas de progenitores do

omento e fígado fetal, e as células B-1b (CD5-), além de progenitores fetais, derivam-se da

medula óssea em adultos (HAYAKAWA et al., 1985; KANTOR et al., 1993; HAYAKAWA

et al., 2000). Essas células se localizam no peritônio e mucosa, secretam espontaneamente

IgM, que reagem com polissacarídios e lipídios microbianos (HAYAKAWA et al., 2000;

ABBAS, 2011).

Com relação à dinâmica das células do sistema imune em infecção experimental, o

aumento de linfócitos B em lesões primárias e linfonodos em linhagens de camundongo

suscetível C57BL/10 e parcialmente resistente CBA, mostrou a relação desse aumento celular

com a piora no prognóstico para leishmaniose, principalmente 90 e 120 dias após a infecção,

indicando que o desvio de resposta Th1 para Th2 impactaria o curso da infecção (CARDOSO

et al., 2010).

No presente trabalho, a progressão foi similar, com aumento de linfócitos B quando

comparado aos linfócitos T no baço, após 60 dias de infecção; porém, esses efeitos foram

potencializados nos animais tratados com Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH, com a

ressalva de que o predomínio foi de células B-1, as quais podem diferenciar-se em fagócitos.

Este parece ser o ponto mais crítico da modulação da infecção e da relação entre o parasita e o

hospedeiro, pois a Leishmania (L) amazonensis é parasita intracelular obrigatório de

macrófagos. No caso do tratamento com Timulina 5 cH, esse aumento de células B-1 no baço

foi predominante no gate de linfócitos ativados, onde havia ainda aumento de fagócitos,

48

provavelmente derivados das próprias células B-1. Talvez a modulação de tal direcionamento

das células B-1 para fagócitos no baço tenha a participação concomitante de linfócitos T, pois

houve aumento de células CD8+ nos animais tratados com Timulina 5 cH. O aumento na

proporção de linfócitos T em relação aos linfócitos B no peritônio dos animais desse grupo

reforça a hipótese.

Nas infecções por Leishmania major, há aumento de células B-1a (CD5+) no peritônio

e produção de altos níveis de anticorpos naturais (BABAI et al., 1999). Dados similares foram

relatados por Buza e colaboradores (1997), em que houve maior produção de IgM nas

populações de células B-1a (CD5+) provenientes de baço de bovinos infectados com

Trypanosoma congolense.

Os resultados relatados neste trabalho demonstraram aumento de proporção de células

B-1 de peritônio em relação a B-2, nos animais tratados com Timulina 5 cH e Antimonium

crudum 30 cH, em comparação ao grupo controle. Dessa população celular, houve aumento

mais expressivo de células B1-a (CD5+), sendo resultado condizente com a literatura. O papel

que as células dispensam no processo ainda poderá ser objeto de estudos futuros.

Foi investigada a interação de células B-1 na infecção por Leishmania major em

Balb/c, constatando-se que após a irradiação letal, havendo depleção de células B-1

peritoneais, os animais apresentaram piora, quando comparados ao controle. Porém, a

expansão de células B-1 foi secundária para a progressão da doença e o desenvolvimento de

uma resposta Th2 (BABAI et al., 1999).

Dados similares foram obtidos em experimento anterior, demonstrando que

camundongos Balb/c infectados por Leishmania major foram caracterizados por resposta Th2;

porém esse perfil de resposta é alterado para Th1 em camundongo Balb/c Xid deficiente em

célula B-1 (HOERAUF et al., 1994). Em outro experimento, realizado pelo mesmo por

Hoerauf e coautores (1995) verificou que camundongos Balb/Xid infectados com Leishmania

major apresentaram piora da infecção em relação a outras linhagens B-1+.

Considerando que esse perfil de resposta Th2 está associado à produção de citocinas

como IL- 4 e IL-10, as células B e B-1 são as principais fontes de IL-10 (O’ GARRA et al.,

1992). Em estudo em infecção por Leishmania major em camundongo Balb/c houve aumento

de células B-1 esplênicas, mas não houve esse aumento em camundongo Balb/c Xid.

Adicionalmente, esse subtipo de célula B aumentou os níveis de IL-10 in vitro em resposta à

49

estimulação com extrato solúvel de leishmania (PALANIVEL et al., 1996). Sugere-se que as

diferentes linhagens de camundongos interferem na resposta de células B-1, mas a função das

células na patogênese na infecção por Leishmania sp. ainda permanece controversa.

Em outro experimento, camundongos infectados com protozoários Trypanosoma cruzi

apresentaram mudança na cinética de células B-1 e B-2. Em análise quantitativa, as células B-

1 diminuíram significantemente a partir do 15º dia, permanecendo em níveis baixos até 65

dias após a infecção. As células B-2 diminuíram após o 4° dia, mas aumentaram a partir do

23º dia, voltando a valores normais em 65 dias (MERINO et al., 2010). A comparação dos

diferentes relatos descritos na literatura para diferentes parasitas e a importância das células

B-1 nessas infecções revelam que a interação das células com hospedeiro/parasita.

Com relação à dinâmica e função efetora de como essas células influenciariam a

infecção causada por Leishmania (L.) amazonensis, seria oportuno considerar que as células

B-1 migrariam da cavidade peritoneal e pleural para o foco inflamatório, diferenciando-se em

fagócitos ativos. Em trabalho relatado por Moon e colaboradores (2011), houve a migração de

células B-1 para fora da cavidade peritoneal, sobre a estimulação por LPS, acompanhada de

aumento de CXCR4 e CXCL12. Esta hipótese, no caso do presente estudo, também serve de

estímulo para estudos futuros centrados na atividade dos fagócitos presentes na lesão.

Além da migração de célula B-1, relata-se a diferenciação desse tipo celular em

células fenotipicamente similares a fagócito mononuclear in vitro e in vivo (ALMEIDA et

al.,2001; POPI et al., 2008; POPI et al., 2012). Recentes estudos indicam a capacidade

microbicida e fagocítica de fagócitos derivados de células B-1, como por exemplo, em

experimento observou-se a capacidade microbicida dessas células em modelo de infecção por

Coxiella burnetii in vitro (POPI et al., 2008), e estudo realizado por MUSSALEM e

colaboradores (2012) relataram um aumento da atividade fagocítica dos fagócitos derivados

de B-1 após estimulação com Propionibacterium acnes.

Outra hipótese que se levanta, portanto, é a possível atuação das células B-1 como

apresentadoras de antígenos (APC), conforme demonstrado em (MOHAN et al., 2006). Nesse

caso, há aumento de coexpressão de proteínas B7-1 e B7-2 (moléculas coestimuladoras) em

células B-1a de camundongos NZM 2410, suscetíveis ao lúpus. Outros experimentos que

demonstram a propriedade de células B-1 como APC envolvendo infecção por

50

Paracoccidioides brasiliensis in vitro são descritos em (VIGNA et al., 2002; LOPES et al.,

2009).

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, houve diminuição da carga

parasitária nos fagócitos alojados na pata infectada com concomitante aumento de fagócitos

provenientes do gate de células B-1 no baço e peritônio de animais tratados com Timulina 5

cH, conforme avaliado por meio de citometria de fluxo. Em face dos dados, sugerimos que

essas células estejam migrando e se diferenciando em fagócitos, contribuindo de alguma

maneira para o controle do parasita. Curiosamente, além da redução da carga parasitária local,

observou-se maior organização do exsudato celular no coxim inoculado, em animais tratados

com Timulina 5 cH. Esse achado, embora descritivo, tem respaldo em estudos recentes

desenvolvidos pelo nosso grupo, que mostram o papel da Timulina 5 cH na atividade de

lesões granulomatosas (SATO et al., 2011; BONAMIN et al., 2013). Já foi relatada por Vigna

e colaboradores (2006) a evidência de que as células B-1 participam da formação de

granuloma in vitro em fagócitos parasitados por Paracoccidioides brasiliensis. A organização

do tecido inflamatório no sítio da infecção é relevante no caso da Leishmania (L)

amazonensis, pois alterações de matriz extracelular, com áreas extensas de necrose e redução

de fibras de colágeno, são descritas em pata de camundongo Balb/c, 60 dias após a infecção

com esse parasita (SILVA-ALMEIDA et al., 2012).

Ao contrário, no linfonodo poplíteo houve contagem superior de formas amastigotas

do grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH quando comparado aos demais grupos.

Contudo, a maior concentração de parasita foi vista no tecido adiposo da adventícia desse

órgão, sugerindo disseminação da infecção para além do coxim no qual os parasitas foram

inoculados. A redução da celularidade na lesão inflamatória associada à redução de fagócitos

com aumento de células B em relação às células T no peritônio nesse grupo reforça tal

hipótese, considerando-se os dados indicados na literatura (CARDOSO et al, 2010).

Tradicionalmente, tais efeitos são relatados na literatura homeopática como “supressão

homeopática”.

Conclui-se, portanto, que os medicamentos homeopáticos Timulina 5 cH e

Antimonium crudum 30 cH alteram o perfil de células inflamatórias envolvidas na resposta

cutânea à Leishmania sp., interferindo na relação hospedeiro/parasita por mecanismos

distintos, ora aumentando a resposta imune contra o parasita, ora reduzindo a inflamação local

e os sintomas da doença.

51

2.5. REFERÊNCIAS

ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular. 7 ed.

Rio de Janeiro: Revinter, 2011.

ABRAHÃO, T. B.; FREYMULLER, E.; MORTARA, R. A.; LOPES, J. D.; MARIANO, M.

Morphological characterization of mouse B-1 cells. Immunobiology, v. 208, p. 401-411,

2003.

ADLER, U. C.; AMBROSIO, E. ANELLI, M.; CAPPELLO, E.; DE TOLEDO CESAR, E;

GUIMARÃES, E. C. A strict definition of homeopathy according to Hahnemann. British

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ALMEIDA, S. R.; AROREIRA, L. S.; FRYMULLER, E.; DIAS, M. A. A.; BOGSAN, C. S.

B.; LOPES, J. D.; MARIANO, M. Mouse B-1 cell-derived mononuclear phagocyte, a novel

cellular component of acute non-specific inflammatory exudate. International Immunology.

v. 13, p. 1193-1201, 2001.

BABAI, B.; LOUZIR, H.; CAZENAVE, P. A.; DELLAGI, K.; Depletion of peritoneal CD5+

B cells has no effect on the course of Leishmania major infection in susceptible and resistant

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BASTIDE, M. BOUDARD, F. Na alternative concepto f immunomodulation. Forum on

immunomodulatorys, p. 303-16, 1995.

BASTIDE, M.; DAURAT, V.; DOUCET-JABOEUF, M. PÉLEGRIN, A.; DORFMAN, P.

Immunomodulatory activity of very low doses of tthymulin in mice. Int. J. Immunother., v.

3, p. 191-200, 1987.

BONAMIN, L. V. Signals and Images. Contributions and Contradictions about High

Dilution Research. Dordrecht: Springer. p. 3-22. 2008.

BONAMIN, L.V.; SATO, C.; ZALLA NETO, R.; MORANTE, G.; CARDOSO, T.N.;

SANTANA, F.R. COELHO, C.P.; OSUGUI, L.; POPI, A.F.; HURTADO, E.C.P.;

MARIANO, M. Immunomodulation of homeopathic Thymulin 5CH in a BCG-induced

granuloma model. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, v. 2013, 15

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3. ANEXO

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3. ANEXO

universidade paulista - unip · universidade paulista – unip para obtenção do título de mestre...

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